Идентификация представленных hla-а2 т-клеточных эпитопов, полученных из раково-эмбрионального антиген-незрелого рецепторного белка ламинина и их применение

Номер патента: 13598

Опубликовано: 30.06.2010

Автор: Цайс Маттиас

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Опухолеассоциированный пептид, который выбран из группы пептидов, имеющих по меньшей мере одну последовательность в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 либо их вариант, при условии, что пептид не является интактным человеческим опухолеассоциированным полипептидом.

2. Опухолеассоциированный пептид по п.1, где указанный пептид обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами.

3. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1, 2, имеющий аминокислотные последовательности в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

4. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-3, имеющий способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I, в особенности с HLA-А*0201.

5. Опухолеассоциированный пептид по п.4, в случае, когда он связан с HLA-А*0201, пептидная связь способна вызывать продуцирование цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), которые распознают клетку, которая экспрессирует полипептид, включающий данную аминокислотную последовательность.

6. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-4, имеющий способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса II, в особенности с HLA-DRB1.

7. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-6, где пептид включает непептидные связи.

8. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-7, где пептид является слитым белком.

9. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по любому из пп.1-8.

10. Нуклеиновая кислота по п.9, которая является ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинациями.

11. Вектор экспрессии, способный экспрессировать нуклеиновую кислоту по любому из пп.9 или 10.

12. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по любому из пп.9 или 10 или вектор экспрессии по п.11.

13. Способ получения опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-8, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п.12 и выделение пептида из клетки-хозяина или ее культуральной среды.

14. Фармацевтическая композиция, содержащая опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.

15. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп.9 или 10 или вектор экспрессии по п.11 и фармацевтически приемлемый носитель.

16. Применение опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-8 в медицине.

17. Применение нуклеиновой кислоты по п.9 или 10 или вектора экспрессии по п.11 в медицине.

18. Вакцина против рака, включающая опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-8.

19. Вакцина против рака, включающая нуклеиновую кислоту п.9 или 10 или вектор экспрессии по п.11.

20. Применение опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-8 для получения медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, экспрессирующих полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в пп.1-8.

21. Применение вектора экспрессии по п.11 для получения медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, экспрессирующих полипептид, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в пп.1-8.

22. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) in vitro, предусматривающий контактирование ЦТЛ in vitro с нагруженными антигеном молекулами человека МНС класса I или II, экспрессированными на поверхности подходящей антиген-презентирующей клетки в течение периода времени, достаточного для активации антиген-специфическим образом указанных ЦТЛ, где антиген является пептидом по любому из пп.1-8.

23. Способ по п.22, где антиген нагружен на молекулы МНС класса I или II, экспрессированные на поверхности подходящей антиген-презентирующей клетки при контактировании достаточного количества антигена с антиген-презентирующей клеткой.

24. Способ по п.22, где антиген-презентирующая клетка включает вектор экспрессии по п.11.

25. Способ в соответствии с любым из пп.22-24, где молекула МНС класса I является HLA-A*0201.

26. Способ по любому по пп.22-24, где молекула МНС класса II является HLA-DRB1.

27. Активированные цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), полученные с помощью способа по пп.22-26, которые селективно распознают клетку, которая экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в любом из пп.1-8.

28. Т-клеточный рецептор (ТКР), который распознает клетку, которая экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в любом из пп.1-8, получаемый из цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) по п.27, или молекула, функционально эквивалентная ТКР.

29. Нуклеиновая кислота, кодирующая Т-клеточный рецептор (ТКР) по п.28.

30. Вектор экспрессии, способный экспрессировать Т-клеточный рецептор (ТКР), кодируемый нуклеиновой кислотой по п.29.

31. Применение цитотоксических Т-лимфоцитов по п.27 для получения медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, которые экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в любом из пп.1-8.

Текст

Смотреть все

013598 Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим методам, молекулам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака, в частности к нескольким опухолевым формам, включающим гематологические злокачественные опухоли. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к опухолеассоциированным эпитопам пептидов Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, настоящее изобретение относится к двум новым пептидным последовательностям, полученным из молекул HLA класса I или II человеческого раково-эмбрионального антиген-незрелого рецептора ламинина (OFA/iLR), который может быть использован в вакцине или других фармацевтических композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки. Уровень техники Стимуляция иммунных ответов находится под воздействием присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной,так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака. Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухолевых клеток или из периферийной крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака (Cheever et al., Annals N.Y. Sci. Acad. Sci. 1993, 690:101-112;Rosenberg S.A. Shedding light on immunotherapy for cancer. N. Engl. J. Med. 2004 Apr 1; 350(14):1461-3). В частности, CD8+ Т-клетки (TCD8+), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС), с пептидами, имеющими 8-10 остатков, образованных из белков, находящихся в ядре или цитозоли, или из дефектных рибосомальных белков (DRIPs), играют важную роль в этом ответе. DRIPs являются необходимым источником для пептидов и формируют продукты дефектной трансляции в рибосомах и были впервые описаны группой авторов J. Yewdell's (Schubert U., Anton L.C., Gibbs J.,Norbury C.C., Yewdell J.W., Bennink J.R. Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteinsby proteasomes. Nature. 2000 Apr 13; 404(6779):770-4). Молекулы МНС человека называются также лейкоцитарными антигенами человека (HLA). Существуют два основных класса молекул МНС, которые могут быть распознаны Т-клетками, несущими Т-клеточные рецепторы: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться в большинстве клеток, имеющих ядро, которые представляют пептиды, образующиеся из протеолитического расщепления эндогенных белков и крупных пептидов. Молекулы МНС класса II могут встречаться на профессиональных антиген-представляющих клетках (АПК), таких как макрофаги, дендритные клетки, на Вклетках, на эндотелиальных клетках и на измененных клетках опухолей и опухолевой строме, которые при нормальных условиях не экспрессируют молекулы МНС класса II на своих клеточных поверхностях,и либо представляют сдерживающие пептиды экзогенные белки, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза, или которые, в другом случае, входят в отдел МНС II класса (MIIC) и впоследствии процессируются и погружаются на комплексы МНС класса II. Комплексы пептидов и MHC-I распознаютсяCD4+-хелперными-Т-клетками (в общем описано в "Immunobiology" Charles A., Jr. Janeway, Paul Travers,Mark Walport, Mark J. Shlomchik). Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен быть связан с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 остатков в длину и содержат два зарезервированных остатка (домен) в их последовательности,которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС (см. 2-ой список,опубликованный в Immunogenetics (Rammensee H., Bachmann J., Emmerich N.P., Bachor O.A., StevanovicS. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3-4): 213-9. На данный момент имеются многочисленные примеры TCD8+ как мыши, так и человека, которые специфически распознают опухолевые клетки и обладают терапевтической активностью после адоптивного переноса, в некоторых случаях индуцирующей полную ремиссию. Тем не менее, несмотря на потенциал Т-клеток по устранению опухолей, из прогрессивного роста большинства видов рака, очевидно,что многие опухоли ускользают от распознавания TCD8+ in vivo. Хотя было установлено, что ряд опухолей является иммуногенным, было сложно продемонстрировать стимуляцию эффективного антиопухолевого иммунного ответа: последние данные показывают, что иммунизация может вести к сильным Тклеточным ответам против опухолеассоциированных пептидов (Speiser D.E., Lienard D., Rufer N., RubioGodoy V., Rimoldi D., Lejeune F., Krieg A.M., Cerottini J.C., Romero P. Rapid and strong human CD8+ T cell-1 013598 115(3):739-46. Schag K., Schmidt S.M., Muller M.R., Weinschenk T., Appel S., Weck M.M., Grunebach F.,Stevanovic S., Rammensee H.G., Brossart P. Identification of C-met oncogene as a broadly expressed tumorassociated antigen recognized by cytotoxic T-lymphocytes. Clin. Cancer. Res. 2004 Jun 1; 10(11):3658-66). Антигены, которые распознаются опухолевыми специфическими цитотоксическими Тлимфоцитами, т.е. их эпитопами, могут быть молекулами, полученными из любого класса белков, таких как энзимы, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. С полным списком пептидов, связанных с или извлеченных из молекул МНС класса I или класса II, можно ознакомиться на сайте www.syfpeithi.org. Кроме того, опухолеассоциированные антигены могут, например, также присутствовать только в опухолевых клетках, к примеру, как продукты мутировавших генов. Хорошими примерами являются лиганды МНС класса I, которые действуют как Т-клеточные эпитопы, из K-RAS, BCR-ABL и мутировавшего р 53. Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими структурами, такими как антигены СТ (раковый тестикул), которые экспрессированы в различные виды опухолей и здоровую ткань тестикул. Другие опухолеассоциированные пептиды, связывающиеся с молекулами МНС, связаны с генами, которые экспрессируются с более высоким числом копий в раковых клетках по сравнению со здоровыми клетками того же органа или ткани, а также при сравнении со здоровыми клетками других тканей. Для c-Met как пример см. Schag K., Schmidt S.M., Muller M.R., WeinschenkRes. 2004 Jun 1; 10(11):3658-66. Другие опухолеассоциированные пептиды имеют происхождение от антигенов, которые удерживаются в опухолевых клетках, а не секретируются (например, белки из семейства муциновых генов). Другими источниками могут быть аберрантные транскрипты (сдвиг рамки), пептиды с сайтов стыковки посттрансляционных соединений белок-белок. С полным списком опухолеассоциированных антигенов, описанных в научной литературе, можно ознакомиться на сайтеwww.cancerimmunity.org. Были выявлены различные опухолеассоциированные антигены. Затем, много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозиназой для меланомы, PSA (простата-специфический антиген) и PSMA (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными аномалиями, такими как bcr/abl в лимфоме. Тем не менее, многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или гены-супрессоры опухоли(обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, у Linehan W.M., Walther M.M.,Zbar В. The genetic basis of cancer of the kidney. J. Urol. 2003 Dec; 170 (6 Pt 1):2163-72), которые действительно вызывают трансформационные явления, встречаются в практически всех видах опухолей. С более общим обзором генетических причин рака человека можно ознакомиться в The Genetic Basis of HumanCancer (Bert Vogelstein, Kenneth W. Kinzler, 2002). Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р 53 (который является примером гена-супрессора опухоли), ras, c-met, myc, pRB, VHL и HER-2/neu, могут аккумулировать мутации, приводящие к повышенной регуляции экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (McCartey et al.Cancer Research, 1998, 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994, 187:198-211). Эти мутантные белки могут быть мишенью специфического иммунного ответа против опухоли при многих видах рака. Раково-эмбриональный антиген-незрелый рецепторный белок ламинина (OFA/iLRP) широко экспрессируется во многих видах опухолей человека, включая злокачественные гематопоэтические опухолиcrossprotective 44 kDa oncofetal antigen. Immunol Today. 1998; 19, 405-408. Coggin J.H. Jr, Barsoum A.L.,Rohrer J.W. 37 kiloDalton oncofetal antigen protein and immature laminin receptor protein are identical, universal T-cell inducing immunogens on primary rodent and human cancers. Anticancer Res. 1999; 19, 5535-5542),но не присутствует в нормальных взрослых дифференцированных тканях. OFA-iLRP может быть специфически распознан как Т-, так и В-лимфоцитами, превращая его в привлекательную молекулу-мишень при вакцинации против некоторых опухолевых форм. Опухолеспецифические Т-клеточные ответы против кроветворных клеток-мишеней могли быть воспроизведены in vitro и in vivo при использовании дендритных клеток (ДК), трансфецированных OFA-iLR-кодировкой РНК, (Siegel S., Wagner A., Kabelitz D. etthe oncofoetal antigen-immature laminin receptor for the treatment of hematological malignancies. Blood, 2003; 102, 4416-4423). В патенте US 6753314 описывается очищенный белковый комплекс, содержащий первый полипеп-2 013598 тид и второй полипептид, где обозначенный комплекс содержит аминокислотные последовательности первого полипептида (SMI1, SEQ ID NO: 359) и второго полипептида (BAS1, SEQ ID NO: 518), обозначенных как ProPair 267a-267b. В патенте US 4861710 раскрывается клон, содержащий рекомбинант клона кДНК для кодировки рецептора клеточной поверхности для ламинина, а также для соответствующих проб. Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического антигена и для того чтобы они были использованы в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен экспрессироваться преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в достаточно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в одном виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (например, число копий на клетку). Необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести in vitro или in vivo к Т-клеточному ответу. До сих пор было описано множество стратегий по направлению антигенов в каскад реакций по процессированию II класса. Есть возможность инкубировать антиген-представляющие клетки (АПК) с интересующим антигеном для его поглощения и процессирования Другие стратегии используют белки слияния, которые содержат лизосомные последовательностимишени. Экспрессированные в АПК, такие белки слияния направляют антигены в отдел процессирования II класса Также были разработаны специальные липосомные композиции для доставки пептидов и других активных фармацевтических ингредиентов в профессиональные АПК (Walter S., Herrgen L., Schoor O.,Jung G., Wernet D., Buhring H.J., Rammensee H.G., Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J. Immunol. 2003 Nov 15; 171(10):4974-8). Другой способ выбора представляет собой внешнюю загрузку профессиональных АПК на молекулы МНС in vitro или in vivo. В этом случае АПК инкубируются с избытком пептидов в среде клеточной культуры, что приводит к конкуренции по связыванию с молекулами МНС на поверхности АПК. Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типаTh1, поддерживают эффекторные функции CD8+ киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами,-5 013598 могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы. Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является, поэтому, выявление и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Т-хелперных эпитопов, которые могут быть распознаны CD4+ ЦТЛ. По этой причине целью настоящего изобретения является обеспечение новых аминокислотных последовательностей для таких пептидов, которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I и инициировать Т-клеточные ответы против клеток с пептидами в соединении с молекулами МНС на их клеточных поверхностях. В соответствии с настоящим изобретением данная задача была решена обеспечением опухолеассоциированного пептида, выбранного из группы пептидов, содержащих по крайней мере одну последовательность в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 из приложенного списка последовательностей, где пептид обладает способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I, содержащей, но не ограничивающейся аллелем HLA, экспрессируемым наиболее часто в кавказских популяциях, HLA-A2 (включая подвиды HLA-A2, такие как HLAA0201). Настоящее изобретение относится, кроме того, к двум новым пептидным последовательностям, полученным из молекул HLA класса I раково-эмбрионального антиген-незрелого рецепторного белка ламинина, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для провоцирования противоопухолевых иммунных ответов. Новые пептидные последовательности были выявлены новым общеприменимым способом для идентификации неизвестных естественно процессированных лигандов HLA классаI охарактеризованных - например, опухолеассоциированных - антигенов. Таким образом, изобретатели выявили два различных HLA-A0201-специфических Т-клеточных эпитопа, полученных из белкаOFA/iLR, способных вызывать специфическую реактивность Т-клетки против опухолевых клеток человека, включающих, но не ограничивающихся различными гематологическими злокачественными опухолями. Первый аспект изобретения обеспечивает пептид, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 либо их вариант, при условии, что пептид не является интактным полипептидом человека, из которого получена аминокислотная последовательность (а именно раково-эмбриональный антиген-незрелый рецепторный белок ламинина(OFA/iLRP); входной номер указан в приложенной табл. 1, внизу). Как здесь описывается в дальнейшем, оба пептида, формирующие основу настоящего изобретения,были выявлены как присутствующие в клетках МНС класса I. Таким образом, эти конкретные пептиды так же, как и другие пептиды, содержащие данную последовательность (т.е. дериваты пептидов) будут,по всей вероятности, оба вызывать специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой ответ будет простимулирован, может варьироваться в зависимости от пептида. Различия, например, могут быть вызваны мутациями в обозначенных пептидах (см. ниже). Специалист данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться с целью определения силы, с которой был индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь примеры и соответствующую литературу. Предпочтительно, чтобы пептид в соответствии с настоящим изобретением состоял в основном из аминокислотной последовательности в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 либо одним из их вариантов. Состоящий в основном из подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением,помимо последовательности в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 либо одним из их вариантов, содержит дополнительно находящиеся на N- и/или С-конце фрагменты аминокислот, которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как центральная последовательность пептида, включая соединяющий элемент, и как иммуногенный Т-хелперный эпитоп. Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны в целях обеспечения эффективного введения пептида в клетки в соответствии с настоящим изобретением. Вариантом данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой HLA, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС, такой как HLA-A, и так что он,по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, как определено в аспектах изобретения. Как может быть извлечено из базы данных, как описано впоследствии, некоторые позиции связывающихся с HLA-A пептидов являются типичными доменными остатками, образующими центральную последовательность, подходящую к-6 013598 соединительному элементу HLA-связывающей бороздки. Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с рецептором Т-клетки,могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с соответствующим МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их часть либо их вариант, как дано. Известно, что пептиды, представленные МНС класса II, образованы центральной последовательностью, имеющей определенный HLA-специфический аминокислотный фрагмент и, факультативно,удлиняющие сегменты на N- и/или С-конце, которые не препятствуют функции центральной последовательности (т.е. считаются иррелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). Удлиняющие сегменты N- и/или С-концов могут иметь длину между 1 и 10 аминокислотами, соответственно. Таким образом, представленный in vivo предпочтительный пептид МНС класса II настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для загрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт получения более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше чем 100000, предпочтительно меньше чем 50000, более предпочтительно меньше чем 10000 и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков. В другом аспекте настоящего изобретения, аналогично с ситуацией, поясненной выше для молекул МНС класса II, пептиды настоящего изобретения (хотя они преимущественно связаны с МНС класса I) могут быть применены для вызывания специфического ответа МНС класса II, так как ILR1 и ILR2 могут представлять одновременно центральные или неполные последовательности молекул HLA класса II (совместимые с конкретными аллелями HLA класса II, как показано в последующих таблицах). Как указано выше, удлиняющие сегменты на N- и/или С-концах могут иметь от 1 до 10 аминокислот в длину, соответственно. Таким образом, предпочтительный пептид настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для внесения на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт получения более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды этого воплощения изобретения могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше чем 100000, предпочтительно меньше чем 50000, более предпочтительно меньше чем 10000 и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков. Таблица AILR1-Центральные последовательности, имеющие определенный HLA-специфический аминокислотный фрагмент для молекул HLA класса II. Совместимые аминокислоты обозначены курсивом. Прогнозирование было произведено компьютерными программами PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) и SYFPEITHY (http://www.syfpeithi.de).ILR2-Центральные последовательности, имеющие определенный HLA-специфический аминокислотный фрагмент для молекул HLA класса II. Совместимые аминокислоты обозначены курсивом. Прогнозирование было произведено компьютерными программами PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) и SYFPEITHY (http://www.syfpeithi.de). Если пептид, который имеет больше чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному HLA-связывающему региону, являлись теми, что, по существу, не влияют на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС или представлять пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, в особенности, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антиген-представляющими клетками. В понятие пептид изобретатели включают не только молекулы, в которых аминокислотные остатки присоединены пептидными связями (-CO-NH-), а также и молекулы, в которых пептидная связь является обратной. Такие ретрообратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано у Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, что включено сюда посредством ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, а не ориентацию боковых цепей. Meziere et al. (1997) показывают,что эти псевдопептиды пригодны, по крайней мере, для МНС класса II и Т-хелперных клеточных ответов. Ретрообратные пептиды, которые содержат связи NH-CO вместо пептидных связей CO-NH, более устойчивы к протеолизу. Типично, что пептид по изобретению является таким, который, если он экспрессирован в антигенпредставляющую клетку, может процессироваться, так что получается фрагмент, который способен связываться с адекватной молекулой МНС и может быть представлен подходящей клетке и вызывать адекватный Т-клеточный ответ. Следует понимать, что полученный из пептида фрагмент может также быть пептидом по изобретению. Целесообразно, что пептид по изобретению содержит участок, который включает данную аминокислотную последовательность или ее сегмент либо ее вариант и дальнейший участок, который обладает некоторыми желаемыми свойствами. Например, дальнейший участок может включать дальнейший Т-клеточный эпитоп (независимо от того, получен ли он из одного и того же полипептида в качестве первого участка, содержащего Т-клеточный эпитоп, или нет) или он может включать белок-носитель или пептид. Таким образом, в одном воплощении пептид по изобретению является усеченным белком человека или слитым белком белкового фрагмента и другого участка полипептида,-9 013598 при условии, что человеческий участок включает одну или более аминокислотную последовательность изобретения. В особенно предпочтительном воплощении пептид по изобретению включает аминокислотную последовательность по изобретению и по крайней мере один дальнейший Т-клеточный эпитоп, где дальнейший Т-клеточный эпитоп способен содействовать продуцированию Т-клеточного ответа, направленного на тип опухоли, который экспрессирует опухолеассоциированный антиген. Таким образом, пептиды по изобретению включают так называемые полипептиды бусины на нити, которые могут также использоваться в качестве вакцин. Из последующего следует понимать, что в некоторых случаях применения пептиды по изобретению могут быть использованы непосредственно (т.е. их не получают при экспрессии полинуклеотида в клетке пациента или в данной пациенту клетке); в случае такого применения предпочтительно, чтобы пептид имел менее чем 100 или 50 остатков. Предпочтительный пептид настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами. Предпочтительно, чтобы пептиды по изобретению были способны связываться с HLA-A2. Особенно предпочтительно, если пептиды селективно связываются с HLA-A0201. В понятие аберрантно экспрессированный изобретатели включают значение, что полипептид сверхэкспрессирован по сравнению с нормальным уровнем экспрессии, или что ген является молчащим в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Понятием сверхэкспрессирован изобретатели обозначают, что полипептид представлен на уровне, который по крайней мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно по крайней мере в 2 раза и более предпочтительно по крайней мере в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани. Пептиды (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Fmoc-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Lu et al. (1981) J. Org. Chem. 46, 3433 и в прилагающихся ссылках. Временная защита Nаминогруппы предусмотрена группой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc). Повторное расщепление этой высокощелочелабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пипиридина вN,N-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Где глутамин или аспарагин являются С-конечными остатками, для защиты боковой цепи амидо-функциональностей используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель базируется на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида(функционализирующий агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептидноситель является кислотно-лабильное производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением обратного метода соединения, опосредованного N,N-дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии проверки изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от полимерного носителя с сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи, при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% элюента. Обычно используемые поглотители - это этандитиол, фенол, анизол и вода, точный выбор зависит от составляющих аминокислот пептида при синтезе. Также возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов для синтеза пептидов (см.,например, Bruckdorfer T., Marder О., Albericio F. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr. Pharm. Biotechnol. 2004 Feb; 5(1):29-43 и приведенные ссылки). Трифторуксусная кислота удаляется выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым сложным эфиром для получения сырого пептида. Альтернативно может быть использован солевой обмен (TFAуксусная кислота) перед лиофилизацией. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая позволяет получить сырой пептид без поглотителей при лиофилизации водной фазы. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, можно заказать в Calbiochem-Novabiochem (Великобритания) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Великобритания. Очистка может быть произведена любой техникой или их комбинацией, таких как эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием градиентного разделения ацетонитрил/вода. Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза, секвенирование Эдмана и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке- 10013598 атомами (FAB), а также масс-спектрометрический анализ MALDI и ESI-Q-TOF. Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид),кодирующую пептид по изобретению. Полинуклеотид может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинациями и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Конечно, это только пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные встречающимися в природе пептидными связями,которые могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением. Был разработан ряд методов для функционального связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае присоединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК. Синтетические сшивающие агенты, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ присоединения сегмента ДНК к векторам. Сегмент ДНК, получаемый в результате расщепления эндонуклеазами рестрикции, как описывалось ранее, подвергается воздействию бактериофага Т 4 ДНК полимеразы или E.coli ДНК полимеразы I, ферментов, удаляющих выдающиеся 3'одноцепочечные концы с их 3'-5'-экзонуклеолитическими активностями, и наполняет имеющие углубления 3'-концы их полимеразными активностями. Комбинация этих активностей вследствие этого формирует фрагменты ДНК с тупыми концами. Фрагменты с тупыми концами инкубируются затем с большим молярным избытком молекул-линкеров в присутствии фермента, способного катализировать лигирование по тупым концам молекул ДНК, такого как бактериофаг Т 4 ДНК лигаза. Таким образом, продуктами реакции являются фрагменты ДНК, несущие последовательности полимерных сшивающих агентов на их концах. Затем эти фрагменты ДНК расщепляются подходящим ферментом рестрикции и связываются с вектором экспрессии, который был расщеплен ферментом, вырабатывающим концы, совместимые с концами фрагмента ДНК. Синтетические сшивающие агенты, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, США. Желаемый путь модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, - это использование цепной реакции полимеразы, как раскрыто у Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491. Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например при инженерии в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Согласно этому методу, для ферментативного амплифицирования ДНК примыкает к двум специфическим праймерам, которые, в свою очередь, внедряются в амплифицированную ДНК. Приведенные специфические праймеры могут содержать сайты узнавания рестрикционной эндонуклеазы, которые могут быть использованы для клонирования в векторы экспрессии с применением известных из уровня техники методов. Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) экспрессируется в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего соединение по изобретению. Таким образом, ДНК, кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом приведенных идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клетки-хозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают также те, что раскрыты в патентах США 4440859, выданном 3 апреля 1984 г. на имя Rutter et al.,4530901, выданном 23 июля 1985 г. на имя Weissman, 4582800, выданном 15 апреля 1986 г. на имя Crowl,4677063, выданном 30 июня 1987 г. на имя Mark et al., 4678751, выданном 7 июля 1987 г. на имя Goeddel,4704362, выданном 3 ноября 1987 г. на имя Itakura et al., 4710463, выданном 1 декабря 1987 г. на имяMurray, 4757006, выданном 12 июля 1988 г. на имя Toole, Jr. et al., 4766075, выданном 23 августа 1988 г. на имя Goeddel et al., и 4810648, выданном 7 марта 1989 г. на имя Stalker, которые все включены сюда путем ссылки. ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, требуется ли эписомальное поддержание или интеграция. Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину посредством стандартных способов. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клеткихозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, которая кодирует выбранный признак в трансформирован- 11013598 ной клетке, такой как невосприимчивость к антибиотикам. Альтернативно ген для такого выбираемого признака может находиться на другом векторе, который используется для котрансформации желаемой клетки-хозяина. Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируются затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, учитывая раскрытые здесь идеи, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть изолирован. Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е.coli и Bacillus subtilis),дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae), мицелиальные грибы (например, Aspergillus), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительно, чтобы система могла быть линией клетокAwells. Промотор является контрольным элементом экспрессии, образованным последовательностью ДНК,которая позволяет связывание РНК-полимеразы и приводит к транскрипции. Совместимые с отдельными бактериями-хозяевами последовательности-промоторы типично вводятся в плазмидные векторы, содержащие подходящие сайты рестрикции для вставки фрагмента ДНК настоящего изобретения. Типичными прокариотическими векторными плазмидами являются pUC18, pUC19, pBR322 и pBR329, имеющиеся в наличии в Biorad Laboratories, Richmond, СА, США, а также pTrc99 А и pKK223-3, имеющиеся в наличии в Pharmacia, Piscataway, NJ, США. Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих pSVL имеется в наличии в Pharmacia, Piscataway, NJ, США. Этот вектор использует поздний промотор SV40 для возбуждения экспрессии клонированных генов, наивысший уровень экспрессии был обнаружен в Т-антиген-вырабатывающих клетках,таких как клетки COS-1. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является pMSG,имеющийся также в наличии в Pharmacia. Этот вектор использует глюкокортикоид-индуцируемый промотор длинного концевого повтора опухолевого вируса молочной железы мыши для возбуждения экспрессии клонированного гена. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются pRS403-406 иpRS413-416 и, как правило, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems, La Jolla, СА 92037, США. Плазмиды pRS403, pRS404, pRS405 и pRS406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами(YIps) и включают дрожжевые селектируемые маркеры HIS3, TRP1, LEU2 и URA3. Плазмиды pRS413416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Ycps). Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники. Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной модели настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть предпочтительно прокариотическими клетками-хозяевами при некоторых условиях и типично являются штаммом Е.coli, таким как, например,Е.coli штамма DH5, имеющимся в наличии в Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, США, иRR1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур American Type Culture Collection(АТСС) of Rockville, MD, США ( АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и почечные клеточные линии. Дрожжевые клетки-хозяева включают YPH499, YPH500 и YPH501, которые, как правило, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems, La Jolla, СА 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС какCCL61, NIH эмбриональные клетки швейцарской мыши NIH/3T3, имеющиеся в наличии в АТСС какCRL 1658, почечные клетки обезьяны COS-1, имеющиеся в наличии в АТСС как CRL 1650 и клетки 293,являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки Sf9, которые могут трансфецироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии. Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения совершается при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, Cohen et al. (1972)Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается у Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Beggs) (1978) Nature 275, 104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например фосфат кальция и DEAE-декстран или липосомальные композиции, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems или Life Technologies Inc.,Gaithersburg, MD 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных. Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат модель ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными методами. Например, клетки, образующиеся в результате введения модели экспрессии настоящего изобретения, могут выращиваться для получения полипептида по изобретению. Клетки могут собираться и лизироваться, а содержимое их ДНК- 12013598 контролироваться на наличие ДНК с помощью такого способа, как описывается у Southern (1975) J. Mol.Biol. 98, 503 или у Berent et al. (1985) Biotech. 3, 208. Альтернативно наличие белка в супернатанте может выявляться с применением антител, как описывается ниже. В дополнение к непосредственному анализу на наличие рекомбинантной ДНК успешная трансформация может быть подтверждена хорошо известными иммунологическими способами, когда рекомбинантная ДНК способна управлять экспрессией белка. Например, успешно трансформированные клетки с вектором экспрессии вырабатывают белки, проявляющие адекватную антигенность. Образцы предположительно трансформированных клеток собирают и анализируют на белок, используя подходящие антитела. Таким образом, в дополнение к самим трансформированным клеткам-хозяевам настоящее изобретение сосредоточено также на культуре таких клеток, предпочтительно моноклональной (клонально гомогенной) культуре или культуре, полученной из моноклональной культуры в питательной среде. Следует понимать, что определенные клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например, бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее,другие клетки-хозяева могут быть пригодными в определенных методах лечения. Например, антигенпредставляющие клетки, такие как дендритные клетки, могут с пользой быть использованы, для экспрессирования пептидов по изобретению так, что их можно было нагружать на адекватные молекулы МНС Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения пептида для внутривенной (i.v.) инъекции, подкожной (s.с.) инъекции, внутрикожной (i.d.) инъекции, внутрибрюшной (i.p.) инъекции,внутримышечной (i.m.) инъекции. Предпочтительными видами инъекции являются s.с., i.d., i.p., i.m. и i.v. Вводиться могут дозы от 1 до 500 мг пептида или ДНК. Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ уничтожения клеток-мишеней у пациента,чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, способ, включающий введение пациенту эффективного объема пептида в соответствии с изобретением или эффективного объема полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего обозначенный пептид, где объем обозначенного пептида или объем обозначенного полинуклеотида или вектора экспрессии является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у обозначенного пациента. Клетка-мишень типично является опухолевой или раковой клеткой, в особенности клеткой лейкемии или клеткой лимфомы. Пептид или кодирующая пептид нуклеиновая кислота формирует вакцину против опухолей или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в клеточную линию человека, которые затем могут вводиться пациенту, или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки in vitro, то она может быть полезна для трансфекции клеток, чтобы коэкспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2. Пептид может быть в основном чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом, таким как Detox, или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например с липосомами. Пептид может быть также конъюгирован в подходящий носитель, такой как гемоцианин лимфы улитки (KLH) или маннан (см. WO 95/18145 и Longenecker et al. (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291). Пептид может быть также меченым или являться слитым белком или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируютCD8+ ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой CD4+ Тклетками. Таким образом, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют CD4+ Т-клетки. Стимулирующие эпитопы CD4+ хорошо известны из уровня техники и включают те, что были выявлены в столбнячном токсине. Полинуклеотид может быть в основном чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством гена-пистолета. Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть слитым белком, например, с эпитопом,который стимулирует CD8+ Т-клетки. Пептид для использования в вакцине против рака может быть любым подходящим пептидом. В особенности, он может быть подходящим 9-мерным пептидом, или подходящим 7-, или 8-, или 10-, или 11-, или 12-мерным пептидом. Более длинные пептиды могут быть также подходящими, но 9- или 10 мерные пептиды, как описано в табл. 1, являются предпочтительными. Соответственно, любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и апирогенной. Изолированная ДНК может вводиться внутримышечно или внутрикожно или подкожно. Пептиды могут вводиться внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшно, внутривенно или подкожно (см. также выше рассмотрение способа получения пептида). Предпочтительно, чтобы пептиды в качестве активных фармацевтических компонентов вводились в комбинации с адъювантом, таким как, например, ИЛ-2, ИЛ- 13013598 12, GM-CSF, неполным адъювантом Фрейнда, полным адъювантом Фрейнда или липосомальными композициями. Наиболее предпочтительные адъюванты рассматриваются, например, у Brinkman J.A., FauschFeb; 4(2):181-98. Вакцинация приводит к ответам ЦТЛ, стимулированных профессиональными антигенпредставляющими клетками; после примирования ЦТЛ может появиться преимущество по стимуляции экспрессии МНС в опухолевых клетках. Можно также с пользой направлять вакцину в специфические популяции клеток, например, в антиген-представляющие клетки, либо на месте инъекции, с использованием нацеленных векторов и систем доставки, либо при селективной очистке такой клеточной популяции у пациента и введении пептида exvivo или нуклеиновой кислоты (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается у Zhou et al. (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al. (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место. Дальнейший аспект изобретения обеспечивает, поэтому, эффективную вакцину против рака или раковых и опухолевых клеток, включающую эффективный объем пептида в соответствии с изобретением,или включающую нуклеиновую кислоту, кодирующую такой пептид. Также предпочтительно, чтобы вакцина была вакциной из нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной из нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Наиболее предпочтительной является вакцина, включающая (синтетический) пептид или пептиды (т.е. либо отдельный, либо в комбинации с 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или даже большим числом пептидов, см. также ниже). Обычно вакцина из нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть изолированный (т.е. по существу без других компонентов для введения) или она может быть доставлена в липосоме или как часть системы доставки вирусного вектора. Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида дендритными клетками может быть механизмом примирования иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки не могут быть трансфецированы, однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированные пептиды из трансфецированных клеток в ткани. Предпочтительно, если вакцина, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу. Предпочтительно также, если вакцина вводится в кожу. Вакцина из нуклеиновой кислоты может вводиться без адъюванта. Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Aquila's QS21 (Aquila Biotech, Worcester, MA,США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок, и собственно адъювантов, таких как Ribi's Detox. Также может быть использован Quil А, другой полученный из сапонина адъювант, (Superfos, Дания). Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта. Другие адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, могут также быть применены. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом. Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия против рака описывается у Conry et al.Cancer 65, 664-670; и Burchell et al. (1996) с. 309-313 В: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics,Calvo et al. (eds), John Libbey Eurotext, которые все включены в описание путем ссылки. Другой дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает применение пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) in vitro, способ, включающий контактирование ЦТЛ in vitro с нагруженными антигеном молекулами МНС класса I человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпредставляющей клетки на период времени, достаточного для активации антиген-специфическим образом обозначенных ЦТЛ, где антиген является пептидом в соответствии с изобретением. Соответственно, ЦТЛ являются хелперными клетками CD8+. Молекулы МНС класса I могут быть экспрессированы на поверхность любой подходящей клетки и предпочтительно, если клетка является такой, которая в естественных условиях не экспрессирует молекулы МНС класса I (в этом случае клетка трансфецирована для экспрессии такой молекулы), или, если она экспрессирует, то она является дефектной для каскадов реакций процессинга антигена или представления антигена. В этом случае для клетки,экспрессирующей молекулы МНС класса I, возможно, по существу, в целом примирование с выбранным пептидным антигеном до активации ЦТЛ. Антиген-представляющая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулу МНС класса I на своей поверхности и предпочтительно обычно является не способной самостоятельно нагружать вы- 14013598 бранный антиген на обозначенную молекулу МНС класса I. Как более детально описано ниже, молекула МНС класса I может быть легко нагружена выбранным антигеном in vitro. Предпочтительно в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т 2, RMA-S и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, связанный с процессингом антигена. Пептид человека, переносящий дефектную клеточную линию Т 2, имеется в наличии в AmericanType Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, США по каталогуCRL 1992; включенный сюда путем ссылки. Обычно обозначенная клетка-хозяин до трансфекции в основном не экспрессирует молекулы МНС класса I. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для Тклеточной костимуляции, такую как любая из В 7.1, В 7.2, ICAM-1 и LFA 3. Последовательности нуклеиновой кислоты многочисленных молекул МНС I класса и костимулированных молекул общедоступны в банках данных GenBank и EMBL. В дальнейшем воплощении могут быть также использованы комбинации молекул HLA, такие как,например, молекулы МНС класса II, как описано здесь в табл. А и В. Применение вакцин из рекомбинантного полиэпитопа для доставки множественных эпитопов CD8+ ЦТЛ описывается у Thomson et al.(1996) J. Immunol. 157, 822-826 и WO 96/03144, которые оба включены сюда путем ссылки. По отношению к настоящему изобретению может быть желательным включение в одну вакцину пептида (или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид), где пептид включает в любом порядке аминокислотную последовательность настоящего изобретения и другой CD8+ Т-клеточный стимулирующий эпитоп. Такая вакцина была бы особенно полезна для лечения раковых заболеваний. Такие вакцины бусины на нити являются типичными ДНК-вакцинами. Синхронное усиление МНС класса II-зависимого иммунного ответа вместе с МНС класса I-зависимым иммунным ответом имеет преимущество, которое ведет к локальной TH1-подобной Т-клеточной реакции CD4-положительных Т-клеток, чем поддерживаются МНС класса I-зависимые CD8-положительные Т-клетки. Для генерации ЦТЛ in vitro могут быть использованы многие другие способы. Например, в методах,описанных у Peoples et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 432-436 и Kawakami et al. (1992) J. Immunol. 148, 638643, при генерации ЦТЛ используются аутологичные противоопухолевые лимфоциты.Plebanski et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25, 1783-1787 для приготовления ЦТЛ пользуются аутологичными лимфоцитами периферической крови (ЛПК). Jochmus et al. (1997) J. Gen. Virol. 78, 1689-1695 описывает получение аутологичных ЦТЛ методом импульсного введения пептида или полипептида в дендритные клетки или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. Hill et al. (1995) J. Exp. Med. 181, 2221-2228 and Jerome et al. (1993) J. Immunol. 151, 1654-1662 для получения аутологичных ЦТЛ пользуется В-клетками. Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги с введенным импульсным методом пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. S. Walter et al. (Walter S., Herrgen L., Schoor O., Jung G., Wernet D., Buhring H.J., Rammensee H.G., Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibratedMHC/anti-CD28-coated microspheres. J. Immunol. 2003 Nov 15; 171 (10):4974-8) описывают примирование Т-клеток in vitro с использованием искусственных антиген-представляющих клеток, которое является также подходящим путем генерации Т-клеток против выбранного пептида. При получении ЦТЛ могут быть также использованы аллогенные клетки, и этот метод детально описывается в патенте WO 97/26328, включенном сюда путем ссылки. Например, кроме клеток дрозофилы и Т 2-клеток, для представления антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка, бакуловирус-инфецированные клетки насекомых, бактерии, дрожжи, инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные вирусы(см., например, Porta et al. (1994) Virology 202, 449-955), который описывает развитие мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивную систему для презентации чужеродных пептидов. Активированные ЦТЛ, которые направлены против пептидов изобретения, применимы в терапии. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные ЦТЛ, получаемые вышеупомянутыми методами по изобретению. Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные ЦТЛ, которые селективно распознают клетку, которая экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Предпочтительно, чтобы ЦТЛ распознавали обозначенную клетку при взаимодействии с комплексом HLA/пептид (например, соединение). ЦТЛ применимы в методе уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, где пациенту вводится эффективное число активированных ЦТЛ. ЦТЛ, которые введены пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными ЦТЛ). Альтернативно ЦТЛ получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если индивид является здоровым индивидом. Здоровым индивидом изобретатели обозначают, что индивид, в общем, имеет хорошее здоровье, предпочтительно, он имеет компетентную иммунную систему и, более предпочтительно, не страдает ни од- 15013598 ним заболеванием, которые можно легко проконтролировать и выявить. Активированные ЦТЛ экспрессируют Т-клеточный рецептор (ТКР), который участвует в распознании клеток, которые экспрессируют полипептид. Полезно, если кДНК, кодирующая ТКР, клонирована с активированными ЦТЛ и перенесена на дальнейшие ЦТЛ для экспрессии. Клетками-мишенями для CD8+ ЦТЛ in vivo в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли, лейкемии или лимфомы (которые экспрессируют МНС класса I) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС класса I). ТКР клонов ЦТЛ по изобретению, специфические для пептидов по изобретению, клонируются. Использование ТКР в клонах ЦТЛ определяется использованием специфических моноклональных антител(i) ТКР-вариабельной области и (ii) ПЦР с обратной транскрипцией с праймерами, специфическими для семейств генов Va и Vp. Библиотека кДНК изготовлена из поли-(А)-мРНК, экстрагированной из клонов ЦТЛ. Использовались праймеры, специфические для С-концового участка ТКР а и Р-цепи, а для Nконцевого участка - идентифицированные сегменты Va и Р. Вся кДНК для цепи а и b ТКР амплифицировалась высокоточной ДНК-полимеразой, и амплифицированные продукты клонировались в подходящий вектор для клонирования. Клонированные гены а и Р-цепи могут быть организованы в одну цепь ТКР с помощью метода, описанного у Chung et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658. В этой отдельной модели цепи за сегментом VaJ следует сегмент V DJ, затем сегмент Ср, затем трансмембранный и цитоплазматический сегмент цепи CD3. Эта отдельная цепь ТКР вводится затем в ретровирусный вектор экспрессии; панель векторов может быть использована на основе их способности инфицировать взрослые человеческие CD8+ Т-лимфоциты и посредничать при экспрессии генов: ретровирусная система векторов Kat является одной предпочтительной возможностью (см. Finer et al. (1994) Blood 83, 43). Насыщенный амфотропный ретровирус используется, чтобы инфицировать очищенные Т-лимфоцитыCD8+ или CD4+, изолированные из периферической крови пациентов с опухолями (следуя протоколу,опубликованному у Roberts et al. (1994) Blood 84, 2878-2889, включенному сюда путем ссылки). Антитела анти-CD3 используются, чтобы инициировать пролиферацию очищенных CD8+ Т-клеток, которая способствует ретровирусной интеграции и стабильной экспрессии отдельной цепи ТКР. Эффективность ретровирусной трансдукции определяется окрашиванием инфицированных CD8+ Т-клеток антителами,специфическими для отдельной цепи ТКР. Анализ in vitro трансдуцированных CD8+ Т-клеток устанавливает, что они проявляют такое же опухолеспецифическое уничтожение, как в случае с рестриктированным по аллотипу клоном ЦТЛ, из которого были первоначально клонированы цепи ТКР. Популяции трансдуцированных CD8+ Т-клеток с ожидаемой специфичностью могут быть использованы для адоптивной иммунотерапии для пациентов с опухолевыми заболеваниями. Для лечения пациентов можно использовать от 108 до 1011 аутологичных, трансдуцированных ЦТЛ. Другие подходящие системы для введения генов в ЦТЛ описываются в работе Moritz et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4318-4322, включенной сюда путем ссылки. Eshhar et al. (1993) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90, 720-724 и Hwu et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 описывают также трансфекцию ЦТЛ. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает ТКР, который распознает клетку,которая экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению,ТКР, полученный из активированных ЦТЛ. В дополнение к ТКР, в изобретение включены молекулы, функционально эквивалентные ТКР. Они включают любую молекулу, которая функционально эквивалентна ТКР, которая может выполнять такую же функцию, как и ТКР. В частности, такие молекулы включают полученные генетической инженерией трехдоменные одноцепные ТКР, как те, что получены методом, описанным у Chung et al. (1994) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658, включенным сюда путем ссылки и указанном выше. Изобретение включает также полинуклеотид, кодирующий ТКР или функционально эквивалентную молекулу, и вектор экспрессии, кодирующий ТКР или его функционально эквивалентную молекулу. Векторы экспрессии, которые подходят для экспрессирования ТКР по изобретению, включают те, что описаны выше в связи с пептидами по изобретению. Тем не менее, предпочтительно, чтобы векторы экспрессии являлись такими, которые способны экспрессировать ТКР в следующей за ЦТЛ трансфекции. Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, метод, включающий стадии (1) получение ЦТЛ от пациента; (2) введение в обозначенные клетки полинуклеотида, кодирующего ТКР, или функционально эквивалентной молекулы, как определено выше; и (3) введение клеток, полученных на стадии (2), пациенту. Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность,которая определена в первом или втором или третьем аспектах изобретения, метод, включающий стадии(1) извлечение антиген-представляющих клеток, таких как дендритные клетки, у обозначенного пациента;(2) контактирование обозначенных антиген-представляющих клеток с пептидом, как определено в первом или втором или третьем аспектах изобретения, или с полинуклеотидом, кодирующим таковой пептид, exvivo; и (3) введение обработанных таким образом антиген-представляющих клеток пациенту.- 16013598 Предпочтительно, чтобы антиген-представляющие клетки являлись дендритными клетками. Соответственно, дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые импульсным методом введен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим антигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток с введенными импульсным методом пептидами из опухолеассоциированного антигена раскрывается у Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380 and Tjua et al. (1997)The Prostate 32, 272-278. В дальнейшем воплощении антиген-представляющие клетки, такие как дендритные клетки, контактируют с полинуклеотидом, который кодирует пептид по изобретению. Полинуклеотид может быть любым подходящим полинуклеотидом и предпочтительно, чтобы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом, приводя к презентации пептида и индукции иммунитета. Как правило, полинуклеотид может быть включен в вирусный полинуклеотид или вирус. Например,аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антигенспецифический противоопухолевый иммунитет по отношению к MUC1 (см. Gong et al. (1997) Gene Ther. 4, 1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см.,например, Wan et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (Specht et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 и Szabolcs et al. (1997, также может быть использован опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Turing et al. (1997) Eur. J.Immunol. 27, 2702-2707); а также может быть использована РНК (Ashley et al. (1997) J. Exp. Med. 186,1177, 1182). Следует понимать, что с учетом методов уничтожения клеток-мишеней у пациента особенно предпочтительно, чтобы клетками-мишенями были раковые клетки, более предпочтительно раковыми клетками лейкемии или лимфомы. Особенно предпочтительно, если пациенты, которых лечат методами изобретения, имели тип HLAA2. Таким образом, в предпочтительном воплощении HLA-гаплотип пациента определяется до начала лечения. Гаплотипирование HLA может быть произведено при использовании любого подходящего метода; такие методы хорошо известны из уровня техники. Изобретение включает, в особенности, использование пептидов по изобретению (или кодирующих их полинуклеотидов) для активной вакцинации in vivo; для манипуляции аутологичными дендритными клетками in vitro при введении манипулированных таким образом дендритных клеток in vivo для активации ответов ЦТЛ; для активации аутологичных ЦТЛ in vitro с последующей адоптивной терапией (т.е. манипулированные таким образом ЦТЛ вводятся пациенту); и для активации ЦТЛ здоровых доноров(МНС-совместимых или несовместимых) in vitro с последующей адоптивной терапией. В предпочтительном воплощении вакцины настоящего изобретения вводятся хозяину либо отдельно, либо в комбинации с другой противораковой терапией для ингибирования или супрессии образования опухолей. Пептидная вакцина может вводиться без адъюванта. Пептидная вакцина может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Aquila'sQS21 (Aquila Biotech, Worcester, MA, США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок, и собственно адъювантов, таких как Ribi's Detox. Также может быть использован Quil А, другой, полученный из сапонина адъювант (Superfos, Дания). Также могут быть полезны другие адъюванты, такие как олигонуклеотиды CpG, стабилизированная РНК, имиквимод (имеется в продаже под названием Aldara, изготавливаемый 3 М Pharma,США), неполный адъювант Фрейнда (имеется в продаже как Montanide ISA-51, изготавливаемый SeppicS.A., Париж, Франция), липосомальные композиции или ГМ-КСФ. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом. Пептиды в соответствии с изобретением могут также быть использованы в качестве диагностических реагентов. Используя пептиды, может быть проведен анализ, присутствуют ли в популяции ЦТЛ такие ЦТЛ, которые специфически направлены против пептида или индуцированы при терапии. Кроме того, увеличение числа предшествующих Т-клеток может быть проверено теми пептидами, которые имеют реактивность против означенного пептида. Кроме того, пептид может быть использован в качестве маркера для контроля прогрессирования опухолевого заболевания, экспрессирующего обозначенный антиген, из которого образован пептид. В приложенной табл. 1 приведены пептиды, которые были использованы и идентифицированы. Помимо того, в таблице дается соответствующая позиция пептида в соответствующем белке. Инвентарный номер мышиного OFA/iLR в генофонде Национального Центра Биотехнологической ИнформацииHealth) (см. http://www.ncbi.nlm.nih.gov) - это AAD26866. Инвентарные номера человеческого OFA/iLR в генофонде Национального Центра Биотехнологической Информации Национального Института Здоровья (см. http://www.ncbi.nlm.nih.gov) - это, например, ААС 50652 или ААР 35883. В другом предпочтительном воплощении пептиды используются для окрашивания лейкоцитов, в особенности Т-лимфоцитов. Такое использование имеет особенное преимущество, если необходимо- 17013598 проверить, присутствуют ли в популяции ЦТЛ такие специфические ЦТЛ, которые направлены против пептида. Кроме того, пептид может быть использован в качестве маркера для определения прогрессирования терапии в опухолевом заболевании или нарушении. В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения пептиды используются для получения антитела. Поликлональные антитела могут быть получены по стандартному способу иммунизации животных путем инъекции пептида и последующей очистки иммуноглобулина. Моноклональные антитела могут быть получены в соответствии со стандартными протоколами, такими как описываются,например, в Methods Enzymol. (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies. Согласно дальнейшему аспекту изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит один или более упомянутых пептидов в соответствии с изобретением. Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо того, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими агентами,такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 2000,American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Композиция может использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения опухолевых заболеваний. Фармацевтический препарат, содержащий по крайней мере один из пептидов настоящего изобретения, включающих любую из последовательностей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 вводится пациенту,страдающему опухолевым заболеванием, которое ассоциировано с соответствующим пептидом или антигеном. Конкретными заболеваниями для лечения являются злокачественные опухоли, экспрессирующие OFA/iLRP, такие как лейкемия (например, ОМЛ или ХЛЛ) или миеломы (например, ММ). Тем самым может быть инициирован ЦТЛ-специфический иммунный ответ. В другом аспекте настоящего изобретения комбинация двух или нескольких пептидов в соответствии с настоящим изобретением может быть использована в качестве вакцины, либо в непосредственной комбинации, либо с аналогичной лечебной схемой. Кроме того, могут быть использованы комбинации с другими пептидами, например, с пептидами, специфическими для МНС II класса. Специалист в данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке,например, поколения Т-клеток in vitro в равной степени, как их эффективности и общего присутствия,пролиферации, аффинности и размножения определенных Т-клеток для определенных пептидов, и функциональные свойства Т-клеток, например, при анализе получения IFN- (см. также примеры ниже),ИЛ-12 или перфорина. Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются затем в качестве вакцины в соответствии с целями, описанными выше. Подходящая вакцина будет содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 различных пептидов,предпочтительно 4, 5, 6 или 7 различных пептидов и наиболее предпочтительно 6 различных пептидов. Наконец, вакцина может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения,иммунного статуса пациента и, естественно, от HLA-гаплотипа пациента. Идентификация эпитопов Т-хелперных клеток опухолеассоциированных антигенов остается важной задачей в антиопухолевой иммунотерапии. В целях идентификации связанных с Т-клетками эпитопов, образованных из белка OFA-iLR, были синтезированы 14 пептидов (см. ниже), которые были спрогнозированы компьютерными программами PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) и SYFPEITHY(http://www.syfpeithi.de) для связывания с молекулой HLA-A0201. При анализе воспроизведения in vitro с использованием ТАР (транспортер, ассоциированный с антиген-процессированием)-дефектной Т 2 клеточной линии, только два пептида (iLR1, iLR2) проявили сильную связывающую аффинность к HLAA0201 (фиг. 11 А и В), если сравнивать с Flu нуклеопротеином 58-66. В присутствии полностью зрелых ДК с введенным импульсным способом либо iLR1, или iLR2 могли быть генерированы пептидные линии ЦТЛ, полученных от здоровых доноров HLA-A0201+. Кривые титрования пептида демонстрируют, что iLR1 и iLR2-специфические ЦТЛ имели высокую аффинность к пептиду/МНС комплексу (фиг. 5 и 10). Обе линии ЦТЛ, специфические для iLR1 (фиг. 1) или iLR2 (фиг. 6) вызывали сильную цитолитическую активность против гематологических опухолевых линий HLA-A0201+, преимущественно злокачественных бластов ОМЛ (фиг. 4 А, В и 8 А, В, соответственно) и клеток ХЛЛ (фиг. 3 А, В, и 9 А, В, соответственно), но щадили HLA-A2-негативные мишени и нормальные кроветворные клетки (ibid.). Эксперименты по блокированию антител (фиг. 2 и 7) выявили рестриктированное уничтожение МНС класса I, индуцированное пептидными специфическими CD8+ Тлимфоцитами. Для определения частоты iLR1- и iLR2-специфических Т-клеток в HLA-A0201+ ОМЛ,ХЛЛ и у пациентов с множественной миеломой применялся микроанализ секреции ELISPOT IFN(табл. 3-5). У 25/50 (50%) и 20/50 (40%) пациентов HLA-A0201+ с гематологическими злокачественными заболеваниями могли быть выявлены значительные уровни пептидно-специфических Т-клеток дляiLR1 или iLR2, тогда как в пробах периферической крови здоровых индивидов не возникали спонтанные Т-клеточные ответы ни против ILR1, ни против ILR2 (табл. 2). У одного пациента с ХЛЛ и у другого с ОМЛ могли быть образованы линии аутологичных ЦТЛ, специфических как для пептидного эпитопаiLR1, так и для iLR2, с провоцированием эффективной цитотоксической активности против аутологичных и аллогенных HLA-A2-совместимых клеток-мишеней. Изобретатели предварительно показали, что OFA/iLR-специфические регуляторные клоны CD8+ Тклеток, секретирующих интерлейкин-10, могут быть идентифицированы как у мышей с опухольюOFA/iLR+ (Rohrer J.W., Rohrer S.D., Barsoum A., Coggin J.H. Jr. Differential recognition of murine tumorassociated oncofoetal transplantation antigen and individually specific tumor transplantation antigens by syngeneic cloned Balb/c and RFM mouse T cells. 1994; 152: 745-764), так и у пациентов с запущенной карциномой груди (Rohrer J.W., Barsoum A.L., Dyess D.L. et al. Human breast carcinoma patients develop clonablevaccinated with tumor RNA-transfected dendritic cells. Cancer Res. 2003; 63: 2127-2133) сообщает о реактивности Т-клетки против эпитопов из OFA/iLR, рестриктированных по МНС класса I от пациентов с метастатическим раком почек. В этом исследовании авторы сообщают также о неожиданно низкой смертности пациентов, прошедших вакцинотерапию аутологичными дендритными клетками, которые были трансфецированы РНК, кодирующей OFA/iLR и другие предполагаемые опухолевые антигены. Тем не менее, число, рестрикция по HLA и химическая идентичность эпитопов из OFA/iLR в работе Su etcarcinoma with tumor lysate-pulsed autologous dendritic cells. Clin. Cancer Res. 2002; 8: 3369-3376) показывает дальнейшую очевидность, что OFA/iLR могут быть очень полезными для иммунотерапии рака, основанной на лечебных вакцинах, стимулирующих специфические клеточные иммунные ответы. Авторы обнаружили, что 5/6 пациентов с метастатической почечно-клеточной карциномой (ПКК), которые были вакцинированы аутологичными дендритными клетками, насыщенными аутологичными или аллогенными клеточными лизатами опухоли, проявляли признаки повышенных иммунных ответов противOFA/iLR. Опять же и у Hltl et al. не был раскрыт ни один эпитоп из OFA/iLR. Что интересно, пациенты с сильнейшими иммунными ответами против OFA/iLR имели полный и частичный клинический ответ. В образованных изобретателями небольших группах пациентов с ХЛЛ на ранней стадии (Binet А) не было обнаружено релевантных ИЛ-10-секретирующих Т-клеток, специфических для пептидов iLR1 или iLR2 (данные не приводятся). Изобретатели в настоящее время проводят эксперименты для более точного выяснения возможной связи между наличием анти-OFA/iLRP-специфических Т-клеток, секретирующих IFN- или ИЛ-10, и стадией заболевания у пациентов с ХЛЛ и множественной миеломой. Итак, изобретатели впервые идентифицировали два различных HLA-А 0201-специфических пептидных эпитопа, образованных из белка OFA/iLR. Эти пептиды представляют собой полезные инструменты как для проведения иммунологических исследований, так и для стратегий вакцинации при злокачественных опухолях, экспрессирующих OFA/iLRP. Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента,чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, как дана здесь, способ, включающий введение пациенту эффективного объема пептида в соответствии с настоящим изобретением или нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением или вектора экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, где объем обозначенного пептида или объем обозначенной нуклеиновой кислоты или объем обозначенного вектора экспрессии является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у обозначенного пациента. Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента,чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность,данную в соответствии с настоящим изобретением, способ, включающий введение пациенту эффективного числа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), как определено в соответствии с настоящим изобретением. Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента,чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность,данную в соответствии с настоящим изобретением, способ, включающий стадии (1) получение цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) от пациента; (2) введение в обозначенные клетки нуклеиновой кислоты,кодирующей Т-клеточный рецептор (ТКР), или функционально эквивалентной молекулы, как определено в соответствии с настоящим изобретением; и (3) введение клеток, полученных на стадии (2), пациенту. Предпочтительно, чтобы клетки-мишени являлись раковыми клетками. Более предпочтительно,чтобы упомянутый рак являлся лейкемией или лимфомой, которая экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, какая дана в соответствии с настоящим изобретением. Должно быть понятно, что отличительные черты изобретения, раскрываемые и описываемые здесь,могут быть использованы не только в соответственной комбинации, как было показано, но и также в отдельной модели без выхода из намеченных рамок настоящего изобретения.- 19013598 Теперь изобретение будет описано более детально посредством ссылок на последующие рисунки,список последовательностей и примеры. Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрации целей и не предназначены для ограничения изобретения. Последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 демонстрируют пептидные последовательности Т-клеточного эпитопа, содержащего пептиды, которые представляются МНС класса I в соответствии с настоящим изобретением. Последовательности SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 17 демонстрируют пептидные последовательности, какие были использованы в примерах. Фиг. 1 демонстрирует распознавание различных клеточных линий ЦТЛ, специфических для ILR1. Фиг. 2 демонстрирует блокировку лизиса клеток-мишеней антителами, распознающими CD8, МНС класса I или ТКР для ILPL1. Фиг. 3 демонстрирует, что ЦТЛ, специфические для HLA-A02/ILR1, уничтожают опухолевые клетки у пациентов с ХЛЛ; (А) 1-ый эксперимент; (В) 2-ой эксперимент. Фиг. 4 демонстрирует, что ЦТЛ, специфические для HLA-AO2/ILR1, уничтожают опухолевые клетки у пациентов с ОМЛ; (А) 1-ый эксперимент; (В) 2-ой эксперимент. Фиг. 5 А демонстрирует степень зависимости клеток-мишеней Т 2 с введенными импульсным методом пептидами от лизиса в ILR1-специфических ЦТЛ. Фиг. 5 А демонстрирует ингибирование ILR1 специфических ЦТЛ немечеными мишенями (метод ингибирования немечеными клетками-мишенями). Фиг. 6 демонстрирует распознавание различных клеточных линий ЦТЛ, специфических для ILR2. Фиг. 7 демонстрирует блокировку лизиса клеток-мишеней антителами, распознающими CD8, МНС класса I или ТКР для ILR2. Фиг. 8 демонстрирует, что ЦТЛ, специфические для HLA-A02/ILR2, уничтожают опухолевые клетки у пациентов с ОМЛ; (А) 1-ый эксперимент; (В) 2-ой эксперимент. Фиг. 9 демонстрирует, что ЦТЛ, специфические для HLA-A02/ILR2, уничтожают опухолевые клетки у пациентов с ХЛЛ; (А) 1-ый эксперимент; (В) 2-ой эксперимент. Фиг. 10 А демонстрирует степень зависимости клеток-мишеней Т 2 с введенными импульсным методом пептидами от лизиса в ILR2-специфических ЦТЛ. Фиг. 10 А демонстрирует ингибирование ILR2 специфических ЦТЛ немечеными мишенями (метод ингибирования немечеными клетками-мишенями). Фиг. 11 демонстрирует анализ воспроизведения in vitro с использованием ТАР (транспортер, ассоциированный с антиген-процессированием)-дефектной Т 2 клеточной линии, только два пептида (iLR1,iLR2) проявляют сильную связывающую аффинность к HLA-A0201 (фиг. 11 А и В), если сравнивать сFlu нуклеопротеином 58-66. При сравнении с ILR3 до ILR14 и базисным пептидом вируса гриппа (Flum1),пептиды ILR1 и ILR2 проявляют хорошую связывающую аффинность к HLA-A02. Фиг. 12 демонстрирует репрезентативный тетрамерный анализ управляемого микросферами распространения A2/RPS-001 и A2/RPS-002 специфических лимфоцитов CD8+ из периферической крови. МПК, обогащенные на лунку 1106 CD8+ здорового донора HLA-A2+ HBC-065 стимулировались еженедельно в одной лунке микросферами, связанными с анти-CD28 плюс опухолевый антиген высокой плотности A0201/RPS-001 (верхняя секция) или опухолевый антиген высокой плотности A0201/RPS-002(нижняя секция), как было показано ранее [Walter, S., et al. Cutting Edge: Predetermined avidity of humanCD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J. Immunol. 171(10):4974-8, 2003] с минимальными модификациями. После трех стимуляций in vitro клетки из обеих лунок окрашивались антителом CD8 FITC плюс тетрамер A0201/RPS-001 APC и A0201/RPS-002 РЕ. Клетки высаживаются в популяцию лимфоцитов (левая и средняя секция) или в популяцию лимфоцитов CD8+ (правая секция). Числа показывают процентную концентрацию тетрамера+ внутри лимфоцитов CD8+. Клеточные линии, пробы опухоли и моноциты периферической крови (МПК). Все клеточные линии, использованные в этом исследовании, были взяты из American Type CultureCollection (Manassas, VA, США). МПК, клетки-предшественники CD34+, клетки костного мозга (КМ) и пробы опухолей были взяты у здоровых доноров, пациентов с острой миелоидной лейкемией (ОМЛ),хронической лимфоцитной лейкемией (ХЛЛ) и множественной миеломой (ММ), соответственно, после информированного согласия и одобрения Институтского наблюдательного совета. Антитела. Антитело против МАМ-6: Alexis Corp., Швейцария, полученные через фирму AXXORAELISPOT), msurv33 (LYLKNYRIA, мышиный сурвивиновый пептидный эпитоп, специфический для H2d,негативный контроль тестами по связыванию Т 2), iLR159-68 (LLAARAIVAI), iLR2146-154 (ALCNTDSPL),iLR360-68 (LAARAIVAI), iLR458-66 (LLLAARAIV), iLR57-15 (VLQMKEEDV), iLR650-58 (NLKRTWEKL),iLR766-74 (VAIENPADV), iLR8139-147 (YVNLPTIAL), iLR9177-185 (MLAREVLRM), iLR10249-257(SEGVQVPSV), iLR1118-26 (FLAAGTHLG), iLR1257-66 (KLLLAARAIV), iLR1367-76 (AIENPADVSV),iLR14173-182 (LMWWMLAREV) были куплены в Biosynthan (Berlin, Германия) с уровнем чистоты более чем 90% и анализировались высокоэффективной жидкостной хроматографией и масс-спектрометрией. Пептидный синтез и анализ. Пептиды были синтезированы в автоматическом синтезаторе пептидов EPS221 (Abimed, Langenfeld,Германия), следуя стратегии Fmoc/tBu. После отделения от смолы с помощью обработкиTFA/фенол/этандитиол/тиоанизол/вода (90/3.75/1.25/2.5/2.5 по объему) в течение 1 или 3 ч (аргининсодержащие пептиды) пептиды были осаждены из метил-трет-бутилового эфира, промыты один раз метилтрет-бутиловым эфиром и дважды диэтиловым эфиром и ресуспендированы в воде до начала лиофилизации. Продукты синтеза анализировались ВЭЖХ (Varian star, Zinsser analytics, Мюнхен, Германия) и масс-спектрометрией MALDI-TOF (future, GSG, Брухзаль, Германия). Пептиды с менее чем 80% чистоты были очищены на препаративной ВЭЖХ. Анализ связывания Т 2. Анализ по связыванию целых клеток Т 2 был проведен с использованием протокола, взятого из работы Casati et al. (Casati С., Dalerba P., Rivoltini L. et al. The apoptosis inhibitor protein survivin induces tumor-specific CD8+ and CD4+ T cells in colorectal cancer patients. Cancer Res. 2003; 63, 4507-4515). Генерация человеческих ЦТЛ. ЦТЛ, полученные от здоровых индивидов с типом HLA-A0201+, генерировались с использованием протокола, приводимого в другом месте (Zeis M., Siegel S., Schmitz M. et al. Induction of cytotoxic T lymphocytes against hematologic neoplasms by survivin RNA-transfected dendritic cells. J. Immunol. 2003; 170,5391-5397). Для индукции аутологичных OFA/iLR пептидоспецифических ЦТЛ, полученных от пациен- 21013598 тов с ОМЛ и ХЛЛ, CD8+ Т-клетки выделялись из МПК с использованием иммуномагнетических гранул(MACS, Miltenyi, Бергиш-Гладбах, Германия), культивировались аутологичными OFA/iLR, полностью зрелыми ДК с введенным импульсным методом пептидом и стимулировались заново аутологичными МПК с введенным импульсным методом пептидом в присутствии ИЛ-2 (1 нг/мл, CellConcepts, Вайскирх,Германия). После по крайней мере четырех еженедельных рестимуляций реактивность ЦТЛ определялась стандартным 4 ч анализом с хромом-51. Анализ ингибирования немечеными мишенями и эксперименты по блокировке антител производились, как описано выше (Zeis M., Siegel S., Schmitz M. et al. Induction of cytotoxic T lymphocytes against hematologic neoplasms by survivin RNA-transfected dendritic cells.J. Immunol. 2003; 170, 5391-5397). Анализ ELISPOT. Для определения частоты пептидоспецифических Т-клеток для OFA/iLR у пациентов применялись анализы ELISPOT с использованием интерферонELISPOT-Kit (Becton Dickinson, Хайдельберг, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Таблица 1 Пептиды и опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток,как определено в настоящем изобретении Во всех анализах ELISPOT цифры для IFNположительных проб даны в расчете на 10 МПК. До осуществления анализа Т-клетки пациентов и здоровых доноров культивировались в течение семи дней в присутствии интерлейкина-2 (ИЛ-2) (10 единиц/мл) и пептида (10 мкг/106 МПК/мл). Все проверенные пробы здоровых доноров имеют низкое число ЦТЛ, отвечающих на ILR1 или Изо всех исследованных проб опухолей пациентов с ХЛЛ 12/20 (60%) имеют показательные (20) ответы ЦТЛ против пептида ILR1, и 9/16 (56%) имеют ответы против пептида ILR2 при анализе IFNELISPOT. Средние числа положительно окрашенных ЦТЛ для двух пептидов, образованных из ILR,сравнимы с 55% (ILR2) и 76% (ILR1) числа ответов, полученных с помощью общего рестриктированного по HLA-A02 диагностического антигена из матричного белка вируса гриппа, против которого практически каждый взрослый человек должен был иметь ранее клеточные иммунные ответы (табл. 3). Из всех исследованных опухолевых проб пациентов с ОМЛ 6/15 (40%) имеют показательные (20) ответы ЦТЛ против пептида ILR1, и 7/15 (47%) имеют ответы против пептида ILR2 при анализе IFNELISPOT (табл. 4). Таблица 4- 23013598 Из всех исследованных опухолевых проб пациентов с миеломой 8/14 (57%) имеют показательные(20) ответы ЦТЛ против пептида ILR1, и 6/14 (43%) имеют ответы против пептида ILR2 при анализе Итак, потенциал пептидов ILR1 и -2 из OFA-ILRP для возбуждения клеточных иммунных ответов против раковых клеток, в особенности, лейкемий и лимфом, становится совершенно очевидным. Тклетки, специфические для упомянутых пептидов, проявляют эффекторные функции (секреция IFN-). Таблица 6: обобщение тетрамерного анализа стимулированного микросферой размноженияA2/RPS-001 и А 2/RPS-002-специфичеких лимфоцитов CD8+ из периферической крови. МПК, обогащенные на лунку 1106 CD8+, стимулировались, как на фиг. 12, микросферами, связанными с анти-CD28 плюс опухолевый антиген высокой плотности A0201/RPS-001 или опухолевый антиген высокой плотности A0201/RPS-002. Указано число подлежащих оценке доноров с HLA-A2+, число подлежащих оценке доноров по крайней мере с одним четко положительным ответом, число подлежащих оценке стимуляций среди всех подлежащих оценке доноров и число подлежащих оценке стимуляций с четко положительными ответами. RPS-001=LLAARAIVAI (SEQ ID NO: 1); RPS-002=ALCNTDSPL (SEQ ID NO: 2). Таблица 6 Т-клетки, распознающие пептид ILR1, тестировались на K562 [человеческая клеточная линия проэритробластической лейкимии, известная также как клеточная линия хронического миелолейкоза (ХМЛ),которая в связи с крайне низким уровнем HLA функционирует как контроль для исключения НК-клеток как эффекторных клеток], IM9 (человеческая В-лимфобластоидная клеточная линия), Karpas-422 (человеческая В-клеточная лимфома), Balm-3 (человеческая клеточная линия В-клеточной лимфомы не Беркитта), U266 (человеческая множественная миелома), REH (человеческая В-клеточная предшествующая лейкемия), МЕС-1 (человеческая хроническая В-клеточная лейкемия). Те же самые Т-клетки были использованы для проверки аутологичных и аллогенных МПК здоровых доноров в качестве контроля. Все клеточные линии, за исключением МЕС-1, которая не экспрессирует аллель HLA-A02, и K562, которая является дефектной для экспрессии гена HLA класса I вообще, распознавались ILR1-специфическими Тклетками (см. фиг. 1). Как аллогенные, так и аутологичные клетки здоровых доноров не были распознаны, указывая на то, что: 1) ILR1 экспрессируется в значительной степени на пептидном уровне только в опухолевых клетках, но не в мононуклеарных клетках крови HLA-совместимых здоровых доноров; 2) ответ не направляется против аллогенных крупных или малых антигенов комплекса гистосовместимости;- 24013598 3) пептид ILR1 распознается по HLA-рестикционной модели; 4) рестрикция является аллель-специфической (специфическая для А 02). Мишень: ОМЛ. Т-клетки, специфические для ILR1, рестриктированного по HLA-A02, проверялись на опухолевых клетках пациентов с ОМЛ (4 пациента; пробы ОМЛ-01, -02, -03, -06) (фиг. 4 А). Клетки А 02 положительных пациентов (3/4) распознавались с максимальным лизисом при соотношении Э/М (соотношение клеток-эффекторов и клеток-мишеней) 40:1 между 25,9% и 39,8%. Клетки ОМЛ А 02 отрицательных пациентов с ОМЛ-06 распознаны не были. Т-клетки, специфические для ILR1, рестриктированного по HLA-A02, проверялись на опухолевых клетках пациентов с ОМЛ во второй раз для подтверждения результатов, полученных из 1-го эксперимента (9 пациентов; пробы ОМЛ-01, -02, -04, -05, -06, -07, -09, -10, -12). Клетки А 02-положительных пациентов (5/9; ОМЛ-02, -04, -05, -09, -10) были распознаны во всех случаях. Клетки А 02 отрицательных пациентов с ОМЛ (4/9; ОМЛ-01, -06, -07, -12) распознаны не были (4/4) (фиг. 4 В). На фиг. 4 В представлены также данные о CD34-положительных клетках-предшественниках костномозгового происхождения А 02-положительных доноров (CD34-01, -02), которые не были распознаны активированными ILR1-специфическими Т-клетками, которые были рестимулированы ILR1 в присутствии ИЛ-2 in vitro в течение 7 дней. Костно-мозговые клетки (КМ-01, -02) А 02-положительных доноров также не были распознаны этими Т-клеточными клонами. На фиг. 2 представлены эксперименты по блокировке антител для дальнейшей характеристики специфичности Т-клеточного ответа. До экспериментов с хромом-51 при постоянном соотношении Э/М 40:1, блокирующие моноклональные антитела инкубировались с человеческой В-лимфобластоидной клеточной линией IM-9 при концентрациях моноклональных антител, как указано производителем. Эксперименты по блокировке показывают, что распознавание ILR1 опосредуется: 1) клетками с Т-клеточными рецепторами (ТКР),2) распознающими их мишень в контексте МНС класса I (HLA класса I),3) механизмом взаимодействия, зависимым от корецептора CD8, но не CD4. Контрольные моноклональные антитела, специфические для нерелевантных, муциноподобных белков клеточной поверхности МАМ-6 (синонимы: СА 15-3, DF3) и HMFG-1, не воздействуют на распознавание клеток IM-9 эффекторными Т-клетками. Физиологический раствор с фосфатным буфером использовался в этих экспериментах по блокировке в качестве негативного контроля. Итак, эти две серии экспериментов подтверждают, что: 1) ILR1 является опухолеассоциированным антигеном у 100% (8/8) проверенных А 02 положительных пациентов с ОМЛ (8/13); 2) ILR1 рестриктирован по HLA-A02; 3) ILR1-специфические Т-клетки распознают естественно процессированные ILR2 на опухолевых клетках, тогда как, в то же самое время, пептид ILR1, по-видимому, отсутствует на костно-мозговых и положительных клетках-предшественниках CD34; 4) взаимодействие между мишенями и эффекторными клетками может быть специфически ингибировано моноклональными антителами против МНС класса I, ТКР или CD8. Мишень: ХЛЛ. Т-клетки, специфические для ILR1, рестриктированного по HLA-A02, проверялись на опухолевых клетках пациентов с ХЛЛ (5 пациентов; пробы ХЛЛ-01, -02, -03, -05, -06). Клетки А 02-положительных пациентов (3/5) были распознаны во всех случаях (3/3). Клетки А 02-отрицательных пациентов не были распознаны ни в одном случае (0/2) (фиг. 3 В). Эксперимент был повторен (фиг. 3 А) с 8 дальнейшими пациентами с ХЛЛ, из которых 4/8 имели положительный А 02. Клетки ХЛЛ А 02-положительных пациентов были распознаны 4/4, тогда как в случае А 02-отрицательных клеток мишеней были распознаны 0/4, эти дополнительные эксперименты подтвердили приведенные ранее результаты. Подведем итог: 1) ILR1 является опухолеассоциированным антигеном у 100% (7/7) проверенных А 02 положительных пациентов с ХЛЛ; 2) ILR1 рестриктирован по HLA-A02. Мишень: Т 2. Т 2-клетки дефектны для экспрессии ТАР, транспортера, связанного с процессингом антигена, который отвечает за перемещение коротких пептидов из цитоплазмы в эндоплазматический ретикулум(ER), где пептиды грузятся на пустые молекулы МНС класса I. Вследствие чего, молекулы МНС класса I клеток Т 2 остаются пустыми, если не были внесены пептиды (внешняя загрузка). Таким образом,клетки Т 2, экспрессирующие пустые молекулы HLA-A02 на поверхности клеток, являются оптимальными мишенями для образования кривых титрования с целью пептидно-специфического уничтожения Тклетками, рестриктированными по HLA-A02. В этом эксперименте (фиг. 5 А) Т-клетки, специфические для ILR1, были проверены на клетках Т 2 с введенными импульсным методом хорошо описанными Т-клеточными эпитопами ВИЧ или ILR1 пептидом LLAARAIVAI. Результаты: Т-клетки распознавали только клетки Т 2 с введенным импульсным ме- 25013598 тодом пептидом ILR1. Клетки Т 2 с введенным импульсным методом пептидом ВИЧ распознаны не были. Мишени Т 2 с введенным импульсным методом пептидом ILR1 лизировались по дозозависимой модели. Лизис не достиг насыщения в спектре концентраций эксперимента. Мишень: Т 2 + ILR1. Производилось ингибирование немечеными клетками-мишенями. Для проверки, вызывают лиILR1-специфические Т-клетки лизис клеток Т 2 с введенным импульсным методом пептидом ILR1 специфически и в контексте HLA-A02, производилось ингибирование немечеными клетками-мишенями следующим образом: меченые хромом-51 клетки Т 2 нагружались пептидом при концентрации в 10 мкг пептида/106 Т 2-клетки/мл. Совокупность 2105 немеченых клеток Т 2, которая нагружалась в равной степени тем же или контрольным пептидом, добавлялась затем в объеме в 50 мкл ВМЛ (вирус мозаики люцерны) в 104 клеток Т 2 с введенными импульсным методом пептидами, меченых хромом-51. Были добавлены эффекторные Т-клетки, специфические для ILR1, и производился анализ с хромом-51, как описано выше. Анализ демонстрирует, что ни иррелевантные для ILR1-специфических ЦТЛ (сурвивин иILR2) пептиды, ни незагруженные клетки Т 2, которые проявляют пустые молекулы HLA-A02 на своей клеточной поверхности, не конкурируют в лизисе мишеней, нагруженных пептидом ILR1 в случае ILR1 специфических ЦТЛ. Напротив, когда мишени с введенным импульсным методом синтетическим пептидом ILR1 или опухолевые клетки ОМЛ, естественным образом проявляющие ILR1 в контексте HLAA02, используются в качестве вторичных (немеченых) мишеней, то тогда они конкурируют с первичными клетками-мишенями (горячие Т 2 с введенным импульсным методом пептидом ILR1) при лизисе в ILR1-специфических ЦТЛ (фиг. 5 В). Дальнейшие эксперименты, касающиеся ILR2 (ALCNTDSPL). Т-клетки, распознающие пептид ILR2 (фиг. 6), тестировались на К 562 [человеческая клеточная линия про-эритробластической лейкимии, известная также как клеточная линия хронического миелолейкоза (ХМЛ), которая, в связи с крайне низким уровнем HLA, функционирует как контроль для исключения НК-клеток как эффекторных клеток], IM9 (человеческая В-лимфобластоидная клеточная линия), Karpas422 (человеческая В-клеточная лимфома), Balm-3 (человеческая клеточная линия В-клеточной лимфомы не Беркитта), U266 (человеческая множественная миелома), REH (человеческая В-клеточная предшествующая лейкемия), Ramos (синоним: RA 1; человеческая В-лимфобластная лимфома Беркитта), МЕС-1(человеческая хроническая В-клеточная лейкемия). Те же самые Т-клетки были использованы для проверки аутологичных и аллогенных МПК здоровых доноров в качестве контроля. Все клеточные линии, за исключением Ramos и МЕС-1, которые не экспрессируют аллель HLAA02, и K562, являющийся дефектным для экспрессии гена HLA класса I вообще, распознавались ILR2 специфическими Т-клетками. Как аллогенные, так и аутологичные клетки здоровых доноров не были распознаны, указывая на то, что: 1) ILR2 экспрессируется в значительной степени на пептидном уровне только в опухолевых клетках, но не в мононуклеарных клетках крови HLA-совместимых здоровых доноров; 2) ответ не направляется против аллогенных крупных или малых антигенов комплекса гистосовместимости; 3) пептид ILR2 распознается по HLA-рестикционной модели; 4) рестрикция является аллель-специфической (специфическая для А 02). Мишень: ОМЛ. Т-клетки, специфические для ILR2, рестриктированного по HLA-A02, проверялись на опухолевых клетках пациентов с ОМЛ (8 пациентов; пробы ОМЛ-01, -02, -04, -05, -06, -07, -10, -12). Клетки А 02 положительных пациентов (4/8; ОМЛ-02, -04, -05, -10) были распознаны во всех случаях (4/4). Клетки А 02-отрицательных пациентов с ОМЛ (4/8; ОМЛ-01, -06, -07, -12) не были распознаны (4/4) (фиг. 8 А). Эксперимент проводился 2-ой раз с пробами пациентов, которые не были протестированы ранее. В этом 2-ом эксперименте Т-клетки, специфические для ILR2, рестриктированного по HLA-A02, были проверены снова на опухолевых клетках пациентов с ОМЛ (4 пациента; пробы ОМЛ -01, -02, -03, -06). Клетки А 02-положительных пациентов (3/4) были распознаны во всех случаях. Клетки А 02-отрицательных пациентов (0/1) распознаны не были (фиг. 8 В). На фиг. 8 А представлены данные о CD34-положительных клетках-предшественниках костномозгового происхождения А 02-положительных доноров (CD34-01, -02), которые не были распознаны активированными ILR2-специфическими Т-клетками, которые были рестимулированы ILR2 в присутствии ИЛ-2 in vitro в течение 7 дней. Костно-мозговые клетки (КМ-01, -02) А 02-положительных доноров также не были распознаны этими Т-клеточными клонами. На фиг. 7 представлены эксперименты по блокировке антител для дальнейшей характеристики специфичности Т-клеточных ответов. До экспериментов с хромом-51 при постоянном соотношении Э/М 40:1 блокирующие моноклональные антитела инкубировались с человеческой В-лимфобластоидной клеточной линией IM-9 при концентрациях моноклональных антител, как указано производителем. Эксперименты по блокировке показывают, что распознавание ILR2 опосредуется клетками, несущими Тклеточные рецепторы (ТКР), распознающими их мишень в контексте МНС класса I (HLA класса I), при механизме взаимодействия, зависимым от корецептора CD8, но не CD4.- 26013598 Контрольные моноклональные антитела, специфические для нерелевантных, муциноподобных белков клеточной поверхности МАМ-6 (синонимы: СА 15-3, DF3) и HMFG-1, не воздействуют на распознавание клеток IM-9 эффекторными Т-клетками. Физиологический раствор с фосфатным буфером использовался в этих экспериментах по блокировке в качестве негативного контроля. Итак, эти две серии экспериментов подтверждают, что: 1) ILR2 является опухолеассоциированным антигеном у 100% (7/7) протестированных А 02 положительных пациентов с ОМЛ; 2) ILR2 рестриктирован по HLA-A02; 3) ILR2-специфические Т-клетки распознают естественно процессированные ILR2 на опухолевых клетках, тогда как, в то же самое время, пептид ILR2, по-видимому, отсутствует на костно-мозговых и положительных CD34 клетках-предшественниках; 4) взаимодействие между мишенями и эффекторными клетками может быть специфически ингибировано моноклональными антителами против МНС класса I, ТКР или CD8. Мишень: ХЛЛ. Т-клетки, специфические для ILR2, рестриктированного по HLA-A02, были протестированы на опухолевых клетках пациентов с ХЛЛ (8 пациентов; пробы ХЛЛ-01, -02, -03, -04, -05, -06, -07, -08). Клетки А 02-положительных пациентов (4/8) были распознаны во всех случаях (4/4). Клетки А 02 отрицательных пациентов не были распознаны ни в одном случае (фиг. 9 А). Эксперимент был повторен(фиг. 9 В) с 5 другими пациентами с ХЛЛ, из которых 3/5 были А 02-положительными. Клетки ХЛЛ А 02-положительных пациентов были распознаны 3/3, тогда как в случае А 02-отрицательных клетокмишеней были распознаны 0/2, эти дополнительные эксперименты подтвердили приведенные ранее результаты. Заключение и итоги: 1) ILR2 является опухолеассоциированным антигеном у 100% (7/7) проверенных А 02 положительных пациентов с ХЛЛ; 2) ILR2 рестриктирован по HLA-A02. Мишень: Т 2. Клетки Т 2 дефектны для экспрессии ТАР, транспортера, связанного с процессингом антигена,который отвечает за перемещение коротких пептидов из цитоплазмы в эндоплазматический ретикулум(ER), где пептиды грузятся на пустые молекулы МНС класса I. Вследствие чего, молекулы МНС класса I клеток Т 2 остаются пустыми, если не были внесены пептиды (внешняя загрузка). Таким образом,клетки Т 2, экспрессирующие пустые молекулы HLA-A02 на поверхности клеток, являются оптимальными мишенями для образования кривых титрования с целью пептидно-специфического уничтожения Тклетками, рестриктированными по HLA-A02. В этом эксперименте были протестированы Т-клетки,специфические для ILR2, на клетках Т 2 с хорошо описанным Т-клеточным эпитопом ВИЧ, введенным импульсным методом, либо ILR2 пептидом ALCNTDSPL. Результаты: Т-клетки распознавали только клетки Т 2 с пептидом ILR2, введенным импульсным методом. Клетки Т 2 с введенным импульсным методом пептидом ВИЧ распознаны не были. Мишени Т 2 с введенным импульсным методом пептидомILR2 лизировались по дозозависимой модели. Лизис не достиг насыщения в спектре концентраций эксперимента (фиг. 10 А). Мишень: Т 2+ILR2. Производилось ингибирование немечеными клетками-мишенями, как описывается под заголовком Т 2+ILR1 выше. Результаты этого эксперимента подтверждают, что ни иррелевантные для ILR2 специфических ЦТЛ (сурвивин и ILR1) пептиды, ни незагруженные клетки Т 2, которые проявляют пустые молекулы HLA-A02 на своей клеточной поверхности, не конкурируют в лизисе мишеней, загруженных пептидом ILR2 в случае ILR2-специфических ЦТЛ. Напротив, когда в качестве вторичных (немеченых) мишеней используются мишени с введенным импульсным методом синтетическим пептидомILR2, или опухолевые клетки ОМЛ, естественным образом проявляющие ILR2 в контексте HLA-A02,то они конкурируют с первичными клетками-мишенями (горячие Т 2 с введенным импульсным методом пептидом ILR2) в лизисе ILR2-специфических ЦТЛ (фиг. 10 В). Итак, оба изобретенных пептида из ILR являются кандидатами для разработки основанных на пептидах лечебных вакцин для раковых пациентов в целом.

МПК / Метки

МПК: A61K 39/00, C07H 21/00, C07K 14/705, C07K 14/47, A61P 35/00, C12N 15/00

Метки: раково-эмбрионального, т-клеточных, белка, рецепторного, hla-а2, применение, эпитопов, полученных, антиген-незрелого, ламинина, идентификация, представленных

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/30-13598-identifikaciya-predstavlennyh-hla-a2-t-kletochnyh-epitopov-poluchennyh-iz-rakovo-embrionalnogo-antigen-nezrelogo-receptornogo-belka-laminina-i-ih-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Идентификация представленных hla-а2 т-клеточных эпитопов, полученных из раково-эмбрионального антиген-незрелого рецепторного белка ламинина и их применение</a>

Похожие патенты