Пептид насекомых, обладающий противогрибковой и/или антибактериальной активностью, и способы его применения

012569 Область техники Настоящее изобретение относится к противогрибковым пептидам, в особенности к противогрибковым пептидам, выделенным из организма насекомых, в частности, таких как чешуекрылые. Настоящее изобретение также относится к способам использования указанных противогрибковых пептидов для лечения и профилактики грибкового роста для различных целей, таких как защита растений от грибковых инфекций, лечение грибковых заболеваний у животных, в особенности у людей, и предотвращение порчи пищи. Предпосылки создания изобретения Грибы представляют собой организмы, состоящие из эукариотических клеток, которые могут репродуцироваться как половым, так и бесполым способом и являются бифазными, то есть могут существовать в одной форме в природе, и в другой в организме инфицированного хозяина. Грибковые инфекции растений и животных являются серьезной проблемой для агрономии, медицины, а также для приготовления и хранения продуктов питания. Грибковые инфекции привлекают к себе повышенное внимание по целому ряду причин, включая ограниченное количество доступных противогрибковых препаратов,увеличение числа организмов, резистентных к известным противогрибковым препаратам и увеличение в общей популяции числа пациентов с иммунодефицитными состояниями и повышенным риском развития оппортунистических грибковых инфекций. Грибковые заболевания человека определяют термином микозы. Некоторые микозы являются эндемичными, то есть встречаются в определенных географических регионах, которые являются естественной средой обитания грибов, вызывающих данное конкретное заболевание. Такие эндемичные микозы обычно являются самоограничивающимися и сопровождаются минимальной симптоматикой. Некоторые микозы являются исключительно оппортунистическими и возникают у пациентов с иммунодефицитными состояниями, например у пациентов после трансплантации органов, пациентов с онкологическими заболеваниями, получающих химиотерапевтическое лечение, пациентов ожоговых центров, пациентов с ВИЧ-инфекцией или пациентов с диабетическим кетоацидозом. Грибы могут являться причиной многих заболеваний растений, таких как (без ограничений указанными) ложномучнистая роса, гниль, ржавчина злаков, вилт т.д. Например, почвенный грибковый фитопатоген является причиной огромных экономических потерь в сельском и садоводческом хозяйстве. Например, Rhizoctonia solani является одним из наиболее сильных грибковых фитопатогенов, обладающим высокой патогенностью; он ассоциирован с заболеваниями сеянцев и листьев растений, такими, как гниль сеянцев, корневая гниль, гниль листвы и стеблей многих видов растений, что приводит к значительным экономическим потерям. Другим примером является Phytophthora capsici, грибок, широко распространенный в природе, являющийся сильным почвенным фитопатогеном, который вызывает корневую гниль и гниль корневой шейки, а также заболевание листьев, плодов и стеблей перцев (Capsicumannuum L.), характеризующееся увяданием, гниением и прекращением роста. Грибковые инфекции растений являются отдельной проблемой в условиях влажного климата и могут потребовать повышенного внимания при хранении урожая. Растения приобрели определенную степень природной устойчивости к грибковым патогенам; однако, современные способы культивирования,сбора урожая и хранения часто способствуют созданию благоприятных условий для развития патогенов растений. К противогрибковым агентам относятся полиеновые производные, такие как амфотерицин В и структурно-родственные соединения - нистатин и пимарицин. Кроме того, противогрибковые пептиды к настоящему времени были выделены из множества природных источников (DeLucca and Walsh, 1999). Тем не менее существует необходимость индентификации дополнительных соединений с противогрибковой активностью для контроля и/или профилактики грибкового роста в таких сферах человеческой деятельности, как медицина, агрономия и сельское хозяйство. Краткое описание изобретения Заявители выделили и охарактеризовали новые антимикробные, в частности противогрибковые пептиды. Соответственно, первый аспект настоящего изобретения относится к полностью очищенному пептиду, который имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,ii) аминокислотную последовательность, по крайней мере на 60% идентичную SEQ ID NO: 4,iii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5,iv) аминокислотную последовательность, по крайней мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 5,v) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48,vi) аминокислотную последовательность, по крайней мере на 70% идентичную SEQ ID NO: 48,vii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53,viii) аминокислотную последовательность, по крайней мере на 70% идентичную SEQ ID NO: 53,ix) биологически активный фрагмент любой последовательности i)-viii), и х) предшественник, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп. i)ix), при этом пептид или его фрагмент обладает противогрибковой и/или антибактериальной активностью.-1 012569 Согласно предпочтительному варианту осуществления первого аспекта настоящего изобретения,заявленный пептид по крайней мере на 65%, более предпочтительно по крайней мере на 70%, еще более предпочтительно по крайней мере на 75%, более предпочтительно по крайней мере на 80%, еще более предпочтительно по крайней мере на 85%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, еще более предпочтительно по крайней мере на 95%, более предпочтительно на 97% и еще более предпочтительно по крайней мере на 99% идентичен последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 48 илиNO: 2, предшественник SEQ ID NO: 5 представляет собой SEQ ID NO: 3, предшественник SEQ ID NO: 48 представляет собой SEQ ID NO: 47, и предшественник SEQ ID NO: 53 представляет собой SEQ ID NO: 52. Предпочтительно, пептид может быть выделен из организма насекомого. Более предпочтительно,пептид может быть выделен из организма чешуекрылых насекомых (бабочек). Еще более предпочтительно, пептид может быть выделен из организма чешуекрылых, относящихся к семейству Pyralidae. Еще более предпочтительно, пептид может быть выделен из организма Galleria sp. Еще более предпочтительно, пептид может быть выделен из организма Galleria mellonella. Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид может быть выделен из организма насекомого, перенесшего грибковую или бактериальную инфекцию. В случае чешуекрылых, является предпочтительным, чтобы пептид был выделен из организма на последней стадии развития, то есть из организма гусеницы, которую предварительно обрабатывают бактериями, такими, как Escherichia coli и/или Micrococcus luteaus. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, является предпочтительным,чтобы пептид имел молекулярную массу в пределах от 4,5 до 3,3 кДа. Более предпочтительно, чтобы пептид имел молекулярную массу около 4,3 кДа, или около 4.0 кДа, или около 3.6 кДа. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид имеет в своем составе N-концевой амфипатический участок (по крайней мере родственный С-концевому), который включает спиральную структуру, С-концевой гидрофобный (по крайней мере, родственный N-концевому) участок, который также включает спиральную структуру и кислый аминокислотный остаток, и заряженный С-концевой хвост. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид имеет в своем составе аминокислотную последовательность;His или отсутствует. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, лизин в положении 17 последовательности SEQ ID NO: 62 может быть замещен остатком треонина. Предпочтительно пептид (или его фрагмент) обладает противогрибковой активностью. Более предпочтительно, пептид обладает противогрибковой активностью в отношении семейства грибов, выбранных из группы, включающей (без ограничений указанными): Nectriaceae, Pleosporaceae, Mycosphaerellaceae, Phyllachoraceae, Leptosphaeria и Trichocomaceae. Более предпочтительно пептид обладает противогрибковой активностью в отношении грибов рода, выбранного из группы, включающей (без ограничений указанными): Fusarium (также известен в литературе как Gibberella), Alternaria, Ascochyta, Colletotrichum,Leptosphaeria и Aspergillus. Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид обладает противогрибковой активностью в отношении грибов, относящихся к группе, включающей Alternaria, Ascochyta, Botrytis, Cercospora, Colletotrichum, Diplodia, Erysiphe, Fusarium,Gaeumanomyces, Ilelminthosporium, Leptosphaeria, Macrophomina, Nectria, Peronospora, Phoma, Phymatotrichum, Phytophthora, Plasmopara, Podosphaera, Puccinia, Puthium, Pyrenophora, Pyricularia, Pythium,Rhizoctonia, Scerotium, Septoria, Thielaviopsis, Uncinula, Venturia и Verticillium. Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид обладает противогрибковой активностью в отношении грибов, выбранных из группы, включающей Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Ascochyta rabiei, Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis,Cryptococcus neoformans и Leptosphaeria maculans. Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится в пептиду, заявленному в соответствии с настоящим изобретением, который слит по крайней мере с одной другой полипептидной/пептидной последовательностью. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, указанная по крайней мере одна полипептидная/пептидная последовательность выбрана из группы, включающей: полипептид/пептид, который усиливает стабильность пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, полипептид/пептид, который способствует очищению белка слияния, полипептид/пептид,который способствует высвобождению пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением,из клетки (в особенности, из растительной клетки), и пептид/полипептид, который делает белок слияния нетоксичным для грибов и бактерий, но который может процессироваться, например, путем протеолитического расщепления, с образованием противогрибкового пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Согласно еще одному аспекту, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду,полинуклеотиду, имеющему в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:ix) последовательность, кодирующую пептид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением; х) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 66% идентична SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12;xi) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 71% идентична SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13;xii) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 62% идентична SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51;xiii) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 62% идентична SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 56;(i)-(viii) при строго определенных условиях. Предпочтительно полинуклеотид кодирует пептид с противогрибковой и/или антибактериальной активностью. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, заявленный полинуклеотид по крайней мере на 65%, более предпочтительно по крайней мере на 70%, еще более предпочтительно по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 85%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, еще более предпочтительно по крайней мере на 95%, более предпочтительно по крайней мере на 97%, еще более предпочтительно по крайней мере на 99% идентичен SEQ IDNO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51,SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 56. Предпочтительно, полинуклеотид может быть выделен из организма насекомого. Более предпочтительно, полинуклеотид может быть выделен из организма чешуекрылого насекомого. Еще более предпочтительно полинуклеотид может быть выделен из организма чешуекрылых, относящихся к семействуPyralidae. Более предпочтительно полинуклеотид может быть выделен из организма Galleria sp. Еще более предпочтительно, полинуклеотид может быть выделен из организма Galleria mellonella. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, полинуклеотид имеет в своем составе последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 49 или SEQ ID NO: 54. Кроме того, настоящее изобретение относится к подходящему вектору для репликации и/или экспрессии полинуклеотида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением. Векторы могут представлять собой, например, плазмиды, вирусы, транспозоны или фаговые векторы, имеющие сайт инициации репликации и, предпочтительно, промотор для экспрессии полинуклеотида, а также, что не является обязательным, регулятор промотора. Вектор может иметь в своем составе один или несколько выборочных маркеров, например ген устойчивости к ампициллину для бактериальной плазмиды или ген устойчивости к неомицину в случае вектора экспрессии млекопитающих. Вектор может использоваться in vitro, например, для продукции РНК или для трансфекции или трансформации клетки-хозяина. Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вектор или полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой животную, дрожжевую, бактериальную или растительную клетку. Более предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой растительную клетку. Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу получения пептида, заявленного согласно первому аспекту настоящего изобретения, который заключается в культивировании клетки-хозяина, заявленной в соответствии с настоящим изобретением, в условиях, способствующих экспрессии полинуклеотида, кодирующего пептид, с последующим высвобождением экспрессируемого пептида. Настоящее изобретение также относится к пептидам, получаемым с помощью способа, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пептид,полинуклеотид, вектор, антитело или клетку-хозяин, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, а также один или несколько доступных носителей. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для применения в ветеринарии и агрономии. Согласно еще одному аспекту, настоящее изобретение относится к способу ликвидации грибковой-4 012569 инфекции и/или к способу ингибирования грибкового роста, который заключается в применении пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Специалистам в данной области очевидно, что воздействовать на грибковые организмы можно любым из известных способов. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения,грибы обрабатывают композицией, содержащей указанный пептид. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, грибы подвергают воздействию клетки-хозяина, продуцирующей пептид. Для получения растений и животных (не человека), устойчивых к грибковым инфекциям, можно ввести полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением в организм растения или животного, в результате чего трансгенный организм начинает продуцировать пептид. Соответственно, согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к трансгенному растению, которое было трансформировано полинуклеотидом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, при этом указанное растение продуцирует пептид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением. Трансгенное растение может представлять собой растение любого вида, однако, является предпочтительным, чтобы это растение относилось к сельскохозяйственным культурам. Примерами таких растений являются (без ограничений указанными): пшеница, ячмень, рис, турецкий горох, горох огородный и им подобные. Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу контролирования грибковых инфекций культурных растений, который заключается в культивировании трансгенных культурных растений, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, согласно еще одному аспекту, настоящее изобретение относится к трансгенному животному (не человеку), животному, которые было трансформировано полинуклеотидом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, при этом в организме животного образуется пептид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением. Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики грибковой инфекции у пациентов, который заключается во введении пациенту пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, для создания лекарственного средства, предназначенного для лечения и профилактики грибковой инфекции у пациентов. Также настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с пептидом, заявленным согласно первому аспекту. Такие антитела могут быть полезными в качестве маркеров продукции пептида трансгенными системами, такими как трансгенные растения. Кроме того, указанные антитела могут успешно использоваться для очистки пептидов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, от лизатов насекомых и/или рекомбинантных систем экспрессии. Заявители утверждают, что пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, обладают также антибактериальной активностью. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу ликвидации бактерий и/или к способу ингибирования роста и/или репликации бактерий, который заключается в обработке бактерий пептидом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением. Бактерии могут быть как грам-положительными, так и грам-отрицательными. Для специалистов в данной области является очевидным, что воздействовать на бактерии можно любым из известных способов. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения,бактерии обрабатывают композицией, содержащей пептид. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, бактерии подвергают воздействию клетки-хозяина, продуцирующей пептид. Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу контролирования бактериальных инфекций сельскохозяйственных растений, который заключается в культивировании сельскохозяйственных трансгенных растений, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики бактериальных инфекций у пациентов, который заключается во введении пациенту пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, для создания лекарственного средства для лечения и профилактики бактериальных инфекции у растений. Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу ликвидации грибов и/или ингибированию их роста и/или размножения, заключающемуся в обработке грибов пептидом, который имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:NO: 15,iv) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 75% идентична любой последовательности i)-iii),v) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-66 последовательности SEQ IDNO: 18,vi) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности v), иvii) биологически активный фрагмент любой последовательности i)-vi). Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, заявленный пептид по крайней мере на 60%, предпочтительно по крайней мере на 65%, более предпочтительно по крайней мере на 70%, еще более предпочтительно по крайней мере на 75%, более предпочтительно по крайней мере на 80%, предпочтительно по крайней мере на 85%, еще более предпочтительно по крайней мере на 92%, еще более предпочтительно по крайней мере на 95%, еще более предпочтительно, по крайней мере на 97% и, особенно предпочтительно по крайней мере на 99% идентичен любой из последовательностейi)-iii) или v). Структура филогенетического дерева, основанная на ClustalW системе, используемой для обозначения зрелых пептидных последовательностей (фиг. 9), свидетельствует о том, что Gm-морицин А, Gmморицин С 1, Gm-морицин C2 и Bm-морицин-Х являются близкими по структуре и могут быть объединены в кластер в виде подсемейства морицинов. Тестирование противогрибковой активности двух членов этого семейства (синтетического Gm-морицина А и Gm-морицина С 2) позволило предположить, что указанная группа пептидов обладает более высокой противогрибковой активностью, чем синтетический В.mori морицин. Следовательно, согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:NO: 18,ii) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности i), иiii) биологически активный фрагмент последовательности i) или ii). Предпочтительно пептид должен быть выделен из организма насекомого. Более предпочтительно пептид может быть выделен из организма чешуекрылых. Еще более предпочтительно пептид может быть выделен их организма чешуекрылых, относящихся к семейству, выбранному из группы, включающей:Pyralidae, Noctuidae, Bombycidae и Sphingidae. Согласно одному из вариантов настоящее изобретение относится к пептиду, представляющему собой предшественник, такой как SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 18, которые процессируются с образованием биологически активного пептида. Специалисту в данной области очевидно, что воздействовать на грибы можно любым из известных способов. Согласно одному варианту осуществления изобретения грибы подвергают воздействию композиции, содержащей пептид. Согласно другому варианту грибы подвергают воздействию клетки-хозяина,продуцирующей пептид. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, грибы подвергают воздействию трансгенного растения, продуцирующего пептид. Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу контролирования грибковых инфекций злаковых растений, который заключается в культивировании злаковых трансгенных растений,которые продуцируют пептид, который имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:NO: 15,v) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 75% идентична любой последовательности i)-iv),vi) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-66 последовательности SEQ IDNO: 18,vii) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности iv), иviii) биологически активный фрагмент любой из последовательностей i)-vii). Предпочтительно, пептид имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:NO: 18,ii) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности i), иiii) биологически активный фрагмент последовательности i) или ii). Согласно предпочтительному варианту осуществления описанного выше аспекта настоящего изобретения, пептид не является SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, или их фрагментом с противогрибковой активностью. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид не имеет аланинового остатка в положении 32 (положение, соответствующее положению, представленному в SEQ ID NO: 62). Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу лечения и профилактики грибковой инфекции у пациента, заключающемуся во введении пациенту пептида, который имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:NO: 15,iv) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 75% идентична любой из последовательностей i)-iii),v) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-66 последовательности SEQ IDNO: 18,vi) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности v), иvii) биологически активный фрагмент любой из последовательностей i)-vi). Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию пептида, включающего последовательность, выбранную из группы, включающей:NO: 15,iv) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 75% идентична любой из последовательностей i)-iii),v) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-66 последовательности SEQ IDNO: 18,vi) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности v), иvii) биологически активный фрагмент любой из последовательностей i)-vi) для создания лекарственного средства, предназначенного для лечения и профилактики грибковых инфекций у пациентов. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, включающему пептид, полинуклеотид,вектор, клетку-хозяин, антитело или композицию, заявленные в соответствии с настоящим изобретением. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, указанный набор включает также другие противомикробные соединения, такие как представлены в виде SEQ ID NO's 14-18, или 5761, или их биологически активные фрагменты. Предпочтительно указанный набор также включает информацию и/или инструкцию, касающуюся его применения. Очевидно, что предпочтительные варианты осуществления и характеристики одного из аспектов настоящего изобретения могут быть применены и по отношению к другим его аспектам. С учетом специфики настоящего изобретения, термин "включать" и его варианты, такие как "включает" или "включающий" обозначают наличие определенного элемента, целого или этапа, или группы элементов, целых или этапов, но никак не отсутствие любого другого элемента, целого или этапа, или группы элементов, целых или этапов. Настоящее изобретение описывается здесь с помощью приведенных ниже примеров, не имеющих ограничений, а также с помощью прилагаемых иллюстраций. Краткое описание рисунков Рисунок 1. Сопоставление двух нуклеотидных последовательностей кДНК клонов Gm-морицинАа(GmmoriAe - SEQ ID NO: 6; GmmoriAc - SEQ ID NO: 7). Последовательность GmmoriAe аналогична последовательностям GmmoriAa и GmmoriAd, однако, две последние последовательности оказались короче на 5' конце. Неконсервативные нуклеотиды подчеркнуты, с мутациями, приводящими к аминокислотным заменам в предполагаемом предшественнике Gm-морицин-А белка, которые выделены двойным подчеркиванием.-7 012569 Рисунок 2. Сопоставление установленных белковых последовательностей двух кДНК клонов Gmморинина A (GmmoriAe - SEQ ID NO: 1, GmmoriAc - SEQ ID NO: 2). Неконсервативные остатки в клонеGmmoriAc подчеркнуты. Рисунок 3. Нуклеотидная последовательность и установленная пре-про пептидная последовательность кДНК клона pGmmoriAa G. mellonella Gm-морицина A (SEQ ID NO's 29 и 1, соответственно). Установленная пептидная последовательность начинается с первого остатка метионина в рамке считывания. Предположительный сигнальный пептид секреции выделен курсивом, а зрелый пептид Gm-морицин А выделен жирным шрифтом. Пептидная последовательность очищенного пептида Gm-морицина А, полученная с помощью секвенирования по Эдману, подчеркнута. Возможный сайт расщепления (SignalP) сигнального пептида представлен ниже пептидной последовательности и отмечен стрелкой, а возможный сайт расщепления для получения зрелого пептида отмечен парой стрелок. Рисунок 4. Нуклеотидная последовательность и установленная пре-про пептидная последовательность кДНК Gm-морицина В G. mellonella (SEQ ID NO's 8 и 3, соответственно). В установленной пептидной последовательности в первой позиции в рамке считывания находится остаток метионина. Предположительный сигнальный пептид секреции выделен курсивом, а зрелый пептид Gm-морицин В выделен жирным шрифтом. Пептидная последовательность очищенного пептида Gm-морицин В, полученная с помощью секвенирования по Эдману, подчеркнута. Возможный сайт расщепления (SignalP) сигнального пептида представлен ниже пептидной последовательности и отмечен стрелкой, а возможный сайт расщепления для получения зрелого пептида отмечен парой стрелок. Рисунок 5. Нуклеотидная последовательность и установленная пре-про пептидная последовательность кДНК клона Gm3-01ae Gm-морицина C1 G. mellonella (SEQ ID NO's 49 и 47, соответственно). Установленная пептидная последовательность начинается с остатка метионина в рамке считывания. Предположительный сигнальный пептид секреции выделен курсивом, а зрелый пептид Gm-морицин С 1 выделен жирным шрифтом. Пептидная последовательность очищенного пептида Gm-морицина С 1, полученная с помощью секвенирования по Эдману, подчеркнута. Возможный сайт расщепления (SignalP) сигнального пептида представлен ниже пептидной последовательности и отмечен стрелкой, а возможный сайт расщепления для получения зрелого пептида отмечен парой стрелок. Три неконсервативных нуклеотида также подчеркнуты, с мутацией в открытой рамке считывания, которая приводит к аминокислотным заменам, которые выделены двойным подчеркиванием. Единичная замена аминокислоты, которая является результатом указанной нуклеотидной замены, представлена ниже аминокислотной последовательности и выделена курсивом. Рисунок 6. Нуклеотидная последовательность и установленная пре-про пептидная последовательность кДНК клона Gm3-03 Gm-морицина С 2 G. mellonalla (SEQ ID NO's 54 и 52, соответственно). Установленная пептидная последовательность начинается с остатка метионина в рамке считывания. Предположительный сигнальный пептид секреции выделен курсивом, а зрелый пептид Gm-морицин С 2 выделен жирным шрифтом. Пептидная последовательность очищенного пептида Gm-морицина С 2, полученная с помощью секвенирования по Эдману, подчеркнута. Возможный сайт расщепления (SignalP) сигнального пептида представлен ниже пептидной последовательности и отмечен стрелкой, а возможный сайт расщепления для получения зрелого пептида отмечен парой стрелок. Возможный сигнальный сайт для полиА выделен прерывистой линией. Рисунок 7. Сопоставление последовательностей кДНК клонов Gm-морицина C1 (Gm3-01ae - SEQID NO: 49) и Gm-морицина С 2 (Gm3-03 - SEQ ID NO: 54). Старт-кодон и стоп-кодон выделены жирным шрифтом. Нуклеотиды в 19 положении в открытой рамке считывания, который отличается у Gmморицина С 2 и Gm-морицина С 1, подчеркнуты, с мутациями, приводящими к аминокислотным заменам,которые выделены двойным подчеркиванием. Рисунок 8. Сопоставление установленных пептидных последовательностей Gm-морицина C1 (SEQID NO: 47) и Gm-морицина С 2 (SEQ ID NO: 52). Неконсервативные аминокислотные остатки выделены подчеркиванием. Необходимо отметить, что аллельный вариант Gm-морицина С 1 имеет остаток Val в положении 13. Рисунок 9. ClustalW сопоставление противогрибковых пептидов, выделенных из организма G. mellonella (GmmoriA - SEQ ID NO: 1, GmmoriB - SEQ ID NO: 3, GmmoriC1 -SEQ ID NO: 47 и GmmoriC2 SEQ ID NO: 52), с родственными пептидами, выделенными из организма чешуекрылых Bobyx moriillioneus (CiP1646, CiP1647, CiP1648 - SEQ ID NO's 59, 60 и 61, соответственно). Последовательности пептидов, выделенных из организма G. mellonella, соответствуют транслируемым открытым рамкам считывания последовательностей кДНК. Пояснения к списку последовательностейSEQ ID NO: 1 - Пре-Gm-морицин А, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 3 - Пре-Gm-морицин В, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 4 - Gm-морицин А, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 5 - Gm-морицин В, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 6 - кДНК, кодирующая пре-Gm-морицин А, выделенный из организма Galleria mellonella, и включающая известные 5' и 3' нетранслируемые последовательности.SEQ ID NO: 7 - кДНК, кодирующая аллельный вариант (GmmoriAc) пре-Gm-морицин А, выделенный из организма Galleria mellonella, и включающая известные 5' и 3' нетранслируемые последовательности.SEQ ID NO: 8 - кДНК, кодирующая пре-Gm-морицин В, выделенный из организма Galleria mellonella, и включающая известные 5' и 3' нетранслируемые последовательности.SEQ ID NO: 9 - кДНК, кодирующая пре-Gm-морицин А, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 10 - кДНК, кодирующая аллельный вариант (GmmoricAc) пре-Gm-морицин А, выделенного из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 11 - кДНК, кодирующая пре-Gm-морицин В, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 12 - кДНК, кодирующая Gm-морицин А, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 13 - кДНК, кодирующая Gm-морицин В, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 14 - подобный морицину пре-пептид, выделенный из организма Sporodoptera lituraSEQ ID NO: 15 - подобный морицину пре-пептид, выделенный из организма Manduca sextra (предположительный пептид из Genbank Accession No. A0074637).SEQ ID NO: 16 - преморицин, выделенный из организма Bombyx mori (Нага и Yamakawa (1995) иSEQ ID NO: 17 - виресцеин (подобный морицину пептид), выделенный из организма Heliothis virescens (предположительный пептид из Genbank Accession No. BAC79440).SEQ ID NO: 18 - морицин-Х, выделенный из организма Bombyx mori (кодируемый в Genbank Accession BP125548).SEQ ID NO: 29 - полинуклеотидная последовательность клона GmmoriAa.SEQ ID NO: 47 - пре-Gm-морицин С 1, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 48 - Gm-морицин С 1, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 49 - кДНК, кодирующая пре-Gm-морицин C1, выделенный из организма Galleria mellonella, включая известные 5' и 3' нетранслируемые последовательности.SEQ ID NO: 50 - кДНК, кодирующая пре-Gm-морицин С 1, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 51 - кДНК, кодирующая Gm-морицин C1, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 52 - пре-Gm-морицин C2, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 53 - Gm-морицин C2, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 54 - кДНК, кодирующая пре-Gm-морицин C2, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 55 - кДНК, кодирующая Gm-морицин C2, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 56 - кДНК, кодирующая Gm-морицин C2, выделенный из организма Galleria mellonella.SEQ ID NO: 57 - подобный морицину пептид, выделенный из организма Sporodoptera exigua (предположительный пептид из Genbank Accession No.AAW21268).SEQ ID NO: 58 - подобный морицину пептид, выделенный из организма Hyblaea puera (предположительный пептид из Genbank Accession No.AAW21268).SEQ ID NO: 59 - подобный морицину пептид, выделенный из организма Caligo illioneus (CiP1646,описанный в заявке WO 2004/016650).SEQ ED NO: 60 - подобный морицину пептид, выделенный из организма Caligo illioneus (CiP1647,описанный в заявке WO 2004/016650).SEQ ID NO: 61 - подобный морицину пептид, выделенный из организма Caligo illioneus (CiP1648,описанный в заявке WO 2004/016650).SEQ ID NO: 62 - согласованная последовательность для противогрибковых пептидов, выделенных из организма Galleria. Детальное описание изобретения Общие методики и определения Если дополнительно не оговаривается иное, все технические и научные термины, используемые в-9 012569 настоящем описании, имеют общепринятое значение, понятное специалистам в данной области (например, культивировании клеток, микробиологии, молекулярной генетики, иммунологии, иммуногистохимии, белковой химии, микологии и биохимии). Если дополнительно не оговаривается иное, такие методики, как получение рекомбинантных белков, культивирование клеток, получение трансгенных растений и другие микробиологические методики,представляют собой стандартные процедуры, хорошо известные специалистам в данных областях. Указанные методики подробно описаны и разъяснены в таких источниках литературы, как J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Clonning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Clonning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B.D. Hames (editors), DNAClonning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausbel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все последние опубликованные данные), приведенных здесь в качестве ссылок. Используемый здесь термин "противогрибковый" относится к пептиду, обладающему противогрибковой активностью, например, способностью ингибировать рост грибковых клеток, или оказывающему фунгицидное действие, или же прерывающему или замедляющему клеточный цикл грибковой клетки,например, на стадии образования спор или деления клеток. Используемый здесь термин "антибактериальный" относится к пептиду, обладающему антибактериальной активностью, например, способностью ингибировать рост бактериальных клеток, или оказывающему бактерицидное действие, или же прерывающему или замедляющему клеточный цикл бактериальной клетки, например, на стадии образования спор или деления клетки. Полипептиды/белки Под термином "полностью очищенный белок" подразумевается белок, который был полностью отделен от липидов, нуклеиновых кислот, других белков и других контаминирующих молекул, окружающих его в естественной среде. Предпочтительно, полностью очищенный белок по крайней мере на 60%,более предпочтительно, по крайней мере на 75% и еще более предпочтительно, по крайней мере на 90% очищен от других компонентов, окружающих его в естественной среде. Термины "полипептид" и "белок" в общем используются в настоящем описании поочередно, то есть являются взаимозаменяемыми. Однако термин "белок" обычно используется по отношению к небольшим аминокислотным цепочкам, например 100 или менее остатков в длину. Процентная идентичность белков определяется с помощью GAP (Needleman and Wunsh, 1970) анализа (GCG программа) с штрафной функцией за открытие щели = 8, и штрафной функцией за расширение щели = 3. Запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 15 аминокислотных остатков в длину, и GAP-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 15 аминокислот. Более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 50 аминокислотных остатков в длину, и GAP-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 50 аминокислот. Более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 100 аминокислотных остатков в длину, и GAP-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 100 аминокислот. Гораздо более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 250 аминокислотных остатков в длину, и GAP-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 250 аминокислот. Используемый здесь термин "биологически активный" фрагмент относится к участку белка, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, который при этом обладает определенной активностью, свойственной полноразмерному белку. В большинстве вариантов осуществления настоящего изобретения, указанная активность представляет собой противогрибковую активность, однако, в некоторых вариантах, подразумевается антибактериальная активность. Биологически активные фрагменты могут быть любого размера, главное, чтобы они обладали определенной активностью, однако, согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, они имеют длину по крайней мере 10,более предпочтительно 15 аминокислотных остатков. Мутантная аминокислотная последовательность белка, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, может быть получена путем внесения подходящих нуклеотидных замен в нуклеиновую кислоту, заявленную в соответствии с настоящим изобретением, или путем синтеза желаемого белка invitro. К таким мутациям относятся, например, делеции, вставки или замены аминокислотных остатков в пределах аминокислотной последовательности. Комбинации делеций, вставок и замен могут производиться для получения конечного конструкта, при этом подразумевается, что конечный продукт будет обладать желаемыми характеристиками. Мутантные (измененные) белки могут быть получены с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Например, полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, может быть подвергнут мутагенезу in vitro. К таким in vitro методикам мутагенеза относятся суб-клонирование полинуклеотида в подходящий вектор, трансформация вектора в "мутаторный" штамм, такой как Е. coli XL-1 red (Stratagene) и культивирование трансформированных бактерий, чтобы они размножились до необходимого числа генераций. Согласно другому примеру, полинуклеотиды, за- 10012569 явленные в соответствии с настоящим изобретением, подвергают методике "перетасовки" ДНК, которая вкратце описана у Harayama (1998). В указанных методиках "перетасовки" ДНК могут использоваться гены, родственные тем, которые заявлены в соответствии с настоящим изобретением, такие, которые кодируют морицин, выделяемый из организма В. mori (Hara and Yamakawa, 1995). Белковые продукты,полученные на основе мутантной/измененной ДНК могут быть легко отсортированы с помощью методик, описанных здесь, на предмет наличия противогрибковой и/или антибактериальной активности. В процессе получения мутантных аминокислотных последовательностей, локализация мутантного сайта и природа мутации зависит от тех свойств, которые необходимо изменить. Сайты мутации могут быть модифицированы как по отдельности, так и по группам, например, путем (1) первичной консервативной аминокислотной замены с последующими более радикальными изменениями, в зависимости от полученного результата, (2) делеции определенного аминокислотного остатка или (3) вставки других аминокислотных остатков рядом с определенным сайтом. Делеции аминокислот обычно включают от 1 до 15 остатков, более предпочтительно от 1 до 10 остатков и обычно от 1 до 5 смежных остатков. В мутантах, полученных путем замены аминокислот, обычно по крайней мере один аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, включенным на его место. Сайты, которые представляют наибольший интерес для мутагенеза с помощью замен, называют активными сайтами. Другие сайты, вызывающие интерес, это такие сайты, в которых определенные остатки, полученные из различных штаммов или видов животных, являются идентичными. Указанные положения могут быть очень важными для биологической активности. Указанные сайты, в особенности те, которые имеют последовательность, включающую по крайней мере три других идентичных консервативных сайта,предпочтительно замещают относительно консервативным образом. Такие консервативные замены представлены в табл. 1 под заголовком "типичные замены". Таблица 1. Типичные замены В частности, как было показано раньше, морицин имеет две -спиральные структуры (Hemmi et al,2002). Учитывая, что белки, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, являются родственными белками морицин-подобным белкам (см. фиг. 5), возможно, что аналогичная структура необходима для обеспечения противогрибковой активности белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Соответственно, при создании мутантов, например, SEQ ID NO: 4, специалист, используя знания,- 11012569 касающиеся химических свойств определенных аминокислот и комбинируя их с известными методиками, позволяющими предсказать третичную структуру белка, может легко получить белки с одной или несколькими аминокислотными вариациями по сравнению с исходным белком SEQ ID NO: 4, обладающим противогрибковой активностью. Кроме того, если необходимо, синтетические аминокислоты или химические аминокислотные аналоги могут использоваться для замещения или вставки в последовательности белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. К таким аминокислотам относятся, без ограничений указанными,D-изомеры общеизвестных аминокислот, 2,4-диаминомасляная кислота, -аминоизомасляная кислота, 4 аминомасляная кислота, 2-аминомасляная кислота, 6-аминогексаноевая кислота, 2-аминоизомасляная кислота, 3-аминопропионовая кислота, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, гомоцитруллин, цистеиновая кислота, t-бутилглицин, t-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, -аланин, фторсодержащие аминокислоты, сконструированные аминокислоты, такие, как метилсодержащие аминокислоты, С-метилсодержащие аминокислоты, Na-метилсодержащие аминокислоты и другие аминокислотные аналоги. В настоящем изобретении также рассматриваются белки, которые дифференцированно модифицированы во время или после химического синтеза, например, путем биотинилирования, бензилирования,гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, получения производных с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связывания с молекулой антитела или других клеточных лигандов и т.д. Указанные модификации могут способствовать увеличению стабильности и/или биоактивности белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Белки, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены множеством способов, включая получение и восстановление природных белков, создание и восстановление рекомбинантных белков, а также химический синтез белков. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения выделенный белок, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, получают путем культивирования клеток, способных к экспрессии указанного белка при условиях, необходимых для этого, с последующим его извлечением. Предпочтительной клеткой для культивирования является рекомбинантная клетка, заявленная в соответствии с настоящим изобретением. Эффективные условия культивирования включают, без ограничений указанными: эффективную среду, биореактор, температуру, рН и степень насыщения кислородом, и способствуют образованию белка. Под эффективной средой подразумевается любая среда, в которой клетка культивируется и при этом образует белок, заявленный в соответствии с настоящим изобретением. Такая среда обычно включает водную среду, имеющую в своем составе ассимилируемые источники углерода,азота и фосфора, а также подходящие соли, минералы, металлы и другие нутриенты, такие как витамины. Клетки, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут культивироваться в традиционных биореакторах для культивирования, встряхиваемых колбах, пробирках, планшетах для микротитрования и чашках Петри. Культивирование может осуществляться при температуре, рН и содержании кислорода,подходящих для рекомбинантной клетки. Указанные условия культивирования остаются на усмотрение специалиста в данной области. Полинуклеотиды Под термином "выделенный полинуклеотид" авторы настоящего изобретения подразумевают полинуклеотид, который был полностью отделен от полинуклеотидных последовательностей, с которыми он ассоциирован или связан в естественных условиях. Предпочтительно выделенный полинуклеотид по крайней мере на 60%, более предпочтительно по крайней мере на 75% и еще более предпочтительно по крайней мере на 90% очищен от других компонентов, окружающих его в естественной среде. Кроме того, термин "полинуклеотид" в данном описании используется поочередно с термином "молекула нуклеиновой кислоты". Процентная идентичность полинуклеотидов определяется с помощью GAP (Needleman and Wunsh,1970) анализа (GCG программа) с штрафной функцией за открытие щели = 8, и штрафной функцией за расширение щели = 3. Запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 45 нуклеотидов в длину, и GAP-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 45 нуклеотидов. Более предпочтительно запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 150 нуклеотидов в длину, и GAP-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 150 нуклеотидов. Еще более предпочтительно запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 300 аминокислотных остатков в длину, и GAP-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 300 аминокислот. Полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, может быть подвергнут селективной гибридизации с полинуклеотидом, который кодирует белок, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, в строго определенных условиях. Кроме того, олигонуклеотиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, имеют последовательность, которая селективно гибридизируется в строго определенных условиях с полинуклеотидом, заявленным в соответствии с настоящим изо- 12012569 бретением. В соответствии с настоящим описанием под строго определенными условиями понимаются следующие условия:(1) низкая ионная сила и высокая температура для отмывания, например 0,015 М NaCl/0,0015 M цитрата натрия/0.1% NaDodSO4 при 50 С (об./об.);(2) использование во время гибридизации денатурирующего агента, такого как формамид, например 50% (об./об.) формамид с 0,1% альбумином бычьей сыворотки, 0,1% Ficoll, 0,1% поливинилпирролидон, 50 мМ натриевого фосфатного буфера при рН 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрата натрия при 42 С; или(3) использование 50% формамида, 5SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 раствор Денгардта, обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося (50 г/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана при 42 С в 0,2SSC и 0,1%SDS. Полинуклеотиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут иметь, при сравнении с существующими в природе молекулами, одну или более мутацию, представленную делецией,вставкой или заменой нуклеотидных остатков. Мутанты также могут быть как природными (то есть выделенными из натуральных источников) или синтетическими (например, полученными с помощью сайтнаправленного мутагенеза или "перетасовки" ДНК в нуклеиновой кислоте, как описано выше). Таким образом очевидно, что полинуклеотиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть как натуральными, так и рекомбинантными. Олигонуклеотиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой молекулы ДНК, РНК или их производные. Минимальный размер указанных олигонуклеотидов, это такой размер, который необходим для формирования стабильного гибрида между олигонуклеотидом и комплементарной последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты, заявленной в соответствии с настоящим изобретением. Настоящее изобретение включает олигонуклеотиды, которые могут использоваться, например, в качестве зондов для идентификации молекул нуклеиновой кислоты, или в качестве праймеров для амплификации молекул нуклеиновой кислоты, заявленной в соответствии с настоящим изобретением. Рекомбинантные векторы В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, который включает по крайней мере одну выделенную молекулу полинуклеотида, заявленную в соответствии с настоящим изобретением, встроенную в любой вектор, способный доставить молекулу полинуклеотида в клетку-хозяин. Такой вектор содержит гетерологичные полинуклеотидные последовательности, то есть последовательности, которые в природе не ассоциированы с молекулами полинуклеотидов, заявленными в соответствии с настоящим изобретением, и, предпочтительно, выделены из организма другого вида животных, нежели полинуклеотидные молекулы. Вектор может представлять собой как РНК или ДНК вектор, так и прокариотический или эукариотический вектор и обычно является транспозоном (как, например, описано в патенте US 5792 294), вирусом или плазмидой. Рекомбинантные векторы первого типа включают полинуклеотидную молекулу, заявленную в соответствии с настоящим изобретением, оперативно связанную с вектором экспрессии. Фраза "оперативно связанная" означает, что полинуклеотидная молекула встроена в вектор экспрессии таким образом,что она может быть экспрессирована при попадании в клетку-хозяин. Согласно настоящему описанию,вектор экспрессии представляет собой ДНК или РНК вектор, способный к трансформации клеткихозяина и осуществлению экспрессии специфической полинуклеотидной молекулы. Предпочтительно,вектор экспрессии также способен реплицироваться в клетке-хозяине. Векторы экспрессии могут быть как прокариотическими, так и эукариотическими и обычно являются вирусами или плазмидами. К векторам экспрессии, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, относятся любые векторы, которые функционируют (то есть направляют экспрессию генов) в рекомбинантных клетках, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, включая бактериальные, грибковые клетки, клетки эндопаразитов, членистоногих, животных и растений. Наиболее предпочтительные векторы экспрессии, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут направлять экспрессию генов в растительных клетках. Векторы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут также использоваться для получения белка во внеклеточных системах экспрессии, которые хорошо известны специалистам в данной области. В частности, векторы экспрессии, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают регуляторные последовательности, такие как контрольные последовательности транскрипции, контрольные последовательности трансляции, репликаторы и другие регуляторные последовательности,совместимые с рекомбинантной клеткой и контролирующие экспрессию полинуклеотидных молекул,заявленных в соответствии с настоящим изобретением. В частности, рекомбинантные молекулы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением,включают контрольные последовательности транскрипции. Контрольные последовательности транскрипции представляют собой последовательности, которые регулируют инициацию, элонгацию и терминацию транскрипции. Наиболее важными контрольными последовательностями транскрипции являются последовательности, контролирующие инициацию транскрипции, такие как промоторы, энхансеры, опе- 13012569 раторные и репрессирующие последовательности. Подходящими контрольными последовательностями транскрипции являются любые контрольные последовательности транскрипции, которые способны функционировать по крайней мере в одной рекомбинантной клетке, заявленной в соответствии с указанным изобретением. Различные указанные контрольные последовательности транскрипции хорошо известны специалистам в данной области. Предпочтительными контрольными последовательностями транскрипции являются такие последовательности, которые функционируют в бактериальных, дрожжевых клетках, клетках членистоногих и млекопитающих, такие как (без ограничений указанными): tac, lac,trc, oxy-pro, omp/lpp, rrnB, бактериофаг лямбда, бактериофаг Т 7, T71ac, бактериофаг Т 3 б бактериофагSP6, бактериофаг SP01, металлотионеин, фактор альфа-спаривания, алкогольоксидаза Pichia, субгеномные промоторы альфавирусов (такие как субгеномные промоторы вируса Sindbis), ген устойчивости к антибиотикам, бакуловирус, вирус насекомых Heliothis zea, вирус коровьей оспы, герпес-вирус, вирус саркомы Рауса, белки теплового шока, фосфатные и нитратные контрольные последовательности транскрипции, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в прокариотических и эукариотических клетках. Наиболее предпочтительными контрольными последовательностями транскрипции являются промоторы, участвующие в регуляции транскрипции у растений, как конститутивно-, этапно- и/или ткане-специфические в зависимости от использования растений и их частей. К таким промоторам растений относятся, без ограничений указанными, промоторы, демонстрирующие конститутивную экспрессию, такие как промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV); промоторы, специфичные для экспрессии генов в листьях растений, такие как, например, промотор гена малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы; промоторы, специфичные для экспрессии генов в корнях растений, такие как промотор гена глутаминсинтетазы; промоторы, специфичные для экспрессии генов в семенах растений, такие как промотор круциферина А из Brassica napus, промоторы, специфичные для экспрессии генов в клубнях растений, такие как промотор пататин класса I из картофеля; и промоторы,специфичные для генной экспрессии в плодах растений, такие как промотор полигалактуроназы (PG) из томатов. Рекомбинантные молекулы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением могут также (а) включать секреторные сигнальные последовательности (то есть сигнальные сегменты последовательности нуклеиновой кислоты) для обеспечения секреции экспрессированного белка, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, из клетки, которая продуцирует белок, и/или (b) включать последовательности слияния, которые способствуют экспрессии молекул нуклеиновых кислот, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, в виде белков слияния. Примерами подходящих сигнальных сегментов являются любые сигнальные сегменты, способные обеспечивать секрецию белка, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительными сигнальными последовательностями являются, без ограничений указанными, тканевой активатор плазминогена (t-PA), интерферон, интерлейкин, гормон роста, сигнальные сегменты гликопротеина вирусной оболочки, сигнальный пептид Nicotiana nectarin (US 5939288), сигнал экстенсина вируса табака, сигнал связывающего белка олеосина сои,сигнальный белок вакуолярной хитиназы Arabidopsis thaliana, а также нативные сигнальные последовательности белка, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть присоединены к сегменту слияния, который направляет кодируемый белок на протеосому, такому, как, например, сегмент слияния убиквитина. Рекомбинантные молекулы могут также включать промежуточные и/или нетранслируемые последовательности, располагающиеся как рядом, так и в пределах последовательности нуклеиновых кислот, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Клетки-хозяева Согласно другому варианту своего осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантным клеткам, представляющим собой клетки-хозяева, трансформированные одной или более рекомбинантными молекулами, заявленными в соответствии с настоящим изобретением. Трансформация полинуклеотидной молекулы в клетку может быть осуществлена любым способом, с помощью которого полинуклеотидная молекула может быть внесена в клетку. К таким способам трансформации относятся,без ограничений указанными, трансфекция, электропорация, микроинъекция, липофекция, адсорбция и протопластическое слияние. Рекомбинантная клетка может оставаться единичной, либо формировать ткань, орган или многоклеточный организм. Трансформированные полинуклеотидные молекулы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут находиться вне хромосомы, либо встраиваться в один или более сайт хромосомы трансформированной клетки (то есть рекомбинантной) таким образом,что их способность экспрессироваться сохраняется. Несмотря на то, что белки, рассматриваемые здесь, обладают противогрибковой и антибактериальной активностью, рекомбинантные белки с нужными свойствами, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могутбыть получены из грибковых и бактериальных клеток-хозяев. В частности,белок может быть получен в виде белка слияния, который процессируется при выделении белка слияния из рекомбинантной клетки-хозяина. Пример такой системы описан у Hara и Yamakawa (1996), где морицин (SEQ ID NO: 16) выделяют в виде белка слияния из Е. coli. Белок слияния был выделен из рекомбинантных клеток-хозяев и расщеплен цианогеном или о-иодобензойной кислотой с высвобождением био- 14012569 логически активного белка - морицина. Для получения белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, аналогичная система может быть легко получена в грибковых или бактериальных клетках-хозяевах. Подходящими клетками-хозяевами для трансформации являются любые клетки, которые могут быть трансформированы полинуклеотидами, заявленными в соответствии с настоящим изобретением. Клетки-хозяева, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут продуцировать белки, заявленные согласно настоящему изобретению, как эндогенно (то есть в естественных условиях), так и после трансформации по крайней мере одной полинуклеотидной молекулой, заявленной в соответствии с настоящим изобретением. Клетки-хозяева, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой любые клетки, способные продуцировать по крайней мере один белок, заявленный согласно настоящему изобретению, и объединяют бактериальные, грибковые (включая дрожжевые), паразитарные клетки, а также клетки членистоногих, животных и растений. Примерами клеток-хозяев являются Salmonella, Escherichia, Bacillus, Listeria, Saccharomyces, Spodoptera, Mycobacteria, Trichoplusia,BHK (почечные клетки новорожденных хомячков, от англ. Baby Hamster Kidney), MDCK клетки, CRFK клетки, CV-1 клетки, COS (например, COS-7) клетки и Vero клетки. Дополнительными примерами клеток-хозяев являются: Е. coli, включая производные Е. coli K-12; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium,включая аттенуированные штаммы; Sporodoptera frugiperda; Trichoplusia ni; BHK клетки; MDCK клетки;CRFK клетки; CV-1 клетки; COS клетки; Vero клетки; и нетуморогенные миобластические мышиные клетки G8 (например, АТСС CRL 1246). К дополнительным клеткам-хозяевам млекопитающих относятся другие почечные клеточные линии, другие клеточные линии фибробластов (например, клетки яичников хомячков или эмбриональные клеточные линии фибробластов цыплят), клеточные линии миеломы,клетки яичников китайских хомячков, мышиные клетки NIH/3T3, LMTK клетки и/или клетки HeLa. Наиболее предпочтительными клетками-хозяевами являются растительные клетки, такие как, например,клетки в коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures). Технологии получения рекомбинантных молекул ДНК могут использоваться для усиления экспрессии трансформированной полинуклеотидной молекулы, например, путем манипулирования несколькими копиями полинуклеотидной молекулы в клетке-хозяине, управления эффективностью, с которой указанные полинуклеотидные молекулы транскрибируются, управления эффективностью, с которой происходит трансляция полученных транскриптов, а также управления эффективностью пост-трансляционных модификаций. Рекомбинантные методики, подходящие для усиления экспрессии полинуклеотидных молекул, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, включают, без ограничений указанными,оперативное связывание полинуклеотидных молекул с плазмидами с большим количеством копий, интеграция полинуклеотидной молекулы в одну или более хромосому клетки-хозяина, добавление в плазмиды последовательностей, стабилизирующих вектор, замены или модификации трансляционных контрольных сигналов (например, рибосом-связывающих сайтов, последовательностей Шайна-Дальгарно),модификация полинуклеотидных молекул, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, для соответствия их кодонам клетки-хозяина и делеция последовательностей, дастабилизирующих транскрипты. Трансгенные растения Термин растение объединяет все растения в целом, органы растений (например, листья, корни,стебли и т.д.), семена, растительные клетки и им подобные. Растения, подходящие для использования в соответствии с настоящим изобретением, включают как монокотиледоны, так и дикотиледоны. Предпочтительно, трансгенное растение представляет собой коммерчески используемое сельскохозяйственное растение. К таким растениям относятся, без ограничений указанными, следующие растения: злаки (пшеница, ячмень, рожь, овес, рис, сорго и родственные им злаки), свекла (сахарная свекла и кормовая свекла); косточковые фрукты и ягоды (яблоки, груши, сливы, персики, миндаль, вишня, клубника, малина и черника); бобовые растения (бобы, чечевица, горох, соя); масленичные растения (рапс, гречиха, мак,олива, подсолнечник, кокосовый орех, клещевина, бобы какао, арахис); огуречные растения (кабачки,огурцы, дыни); волокнистые растения (хлопок, лен, конопля, джут), цитрусовые фрукты (апельсины, лимоны, грейпфруты, мандарины); овощи (шпинат, латук, спаржа, капуста, морковь, лук, помидоры, картофель, перец); лавровые (авокадо, корица, камфора); или такие растения, как кукуруза, табак, орехи,кофе, сахарный тростник, чай, виноград, хмель, торф, банан и природные каучуконосные растения, а также декоративные растения (цветы, кустарники, широколиственные растения и вечнозеленые, такие,как хвойные). Наиболее предпочтительными растениями являются горох огородный, турецкий горох,пшеница и ячмень. К трансгенным растениям, с учетом контекста настоящего изобретения, относятся растения (а также все части и клетки указанных растений) и их прогены, которые были генетически модифицированы с использованием рекомбинантньгх методик для обеспечения продукции по крайней мере одного белка,заявленного в соответствии с настоящим изобретением, в нужном растении или органе растения. Трансгенные растения могут быть получены с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области, таких, как описаны, например у A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation ofWiley and Sons (2004). Полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, может экспрессироваться конститутивно в трансгенных растениях на всех стадиях их развития. В зависимости от использования растения или его органов, белки могут экспрессироваться специфично, в зависимости от стадии развития растения. Кроме того, в зависимости от использования - особенно в том случае, когда растение восприимчиво грибковой инфекции, полинуклеотиды могут экспрессироваться ткане-специфичным образом. Известные регуляторные последовательности или регуляторные последовательности, обнаруживающие способность вызывать экспрессию генов, кодирующих нужный белок, в организме растения,могут использоваться согласно настоящему изобретению. Выбор регуляторной последовательности зависит от растения-мишени и/или органа-мишени, представляющего интерес. Указанные регуляторные последовательности могут быть выделены из растений или вирусов растений, или же могут быть химически синтезированы. Указанные регуляторные последовательности хорошо известны специалистам в данной области. Другие регуляторные последовательности, такие как терминирующие последовательности и сигналы полиаденилирования, включают любые последовательности, функционирующие аналогичным образом в организме растений; выбор последовательности легко может быть осуществлен специалистом в данной области. Примерами таких последовательностей являются 3'-фланкирующие участки гена нопалинсинтетазы (nos) Agrobacterium tumefaciens. Для введения конструкта экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую нужный белок, в организм растения в настоящее время доступно несколько методик. К указанным методикам относятся, без ограничений указанными, трансформация протопластов с использованием метода кальций/полиэтиленгликоль, электропорация и микроинъекция или бомбардировка частицами. В дополнение к указанным так называемым прямым методам трансформации ДНК, также доступны системы трансформации, включающие векторы, такие как вирусные и бактериальные векторы (например, из генома Agrobacterium). После селекции и/или скринирования, протопласты, клетки или части растений,которые были трансформированы, могут быть восстановлены в целое растение с использованием методик, хорошо известных специалистам в данной области. Выбор методики трансформации и/или регенерации не является принципиальным вопросом настоящего изобретения. Примерами трансгенных растений, экспрессирующих противогрибковые пептиды, описаны у Banzet et al. (2002) и в европейском патенте ЕР 798381. В каждом случае, экспрессия рекомбинантного противогрибкового пептида приводит к тому, что трансгенное растение приобретает устойчивость к грибковым инфекциям. Аналогичные методики, описанные в настоящем изобретении, могут использоваться для получения белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, которые обеспечивают устойчивость трансгенных животных к грибковым инфекциям. Трансгенные животные Методики для создания трансгенных животных хорошо известны специалистам в данной области. Наиболее полезной книгой по данной проблеме является книга Houdebine, "Трансгенные животные создание и использование" (Harwood Academic, 1997). Гетерологичная ДНК может быть встроена, например, в оплодотворенные яйцеклетки млекопитающих. В частности, тотипотентные или плюрипотентные стволовые клетки могут быть трансформированы путем микроинъекции, опосредованной фосфатом кальция преципитацией, липосомным слиянием,инфицированием ретровирусом или другими способами, после чего трансформированные клетки переносят в эмбрион, который затем развивается в трансгенное животное. Согласно одной предпочтительной методике развивающиеся эмбрионы инфицируют ретровирусом, содержащим нужную ДНК, в результате трансгеннные животные развиваются из инфицированного эмбриона. Согласно наиболее предпочтительной методике подходящую ДНК вводят в пронуклеус или цитоплазму клеток эмбриона, предпочтительно, в клетки на одной стадии развития, после чего эмбрион развивается в зрелое трансгенное животное. Другой способ, применяющийся для получения трансгенных животных, заключается в том, что нуклеиновую кислоту с помощью микроинъекции вводят яйцеклетки на стадии пронуклеуса. После чего такие яйцеклетки культивируют и переносят в маточные трубы мнимобеременных реципиентов. Трансгенные животные могут быть получены также с помощью методики переноса ядер. Указанная методика заключается в том, что фибробласты от животного-донора стабильно трансфицируют плазмидой, содержащей кодирующие последовательности для связывающего домена или связывающего партнера, представляющего интерес, под контролем регуляторных последовательностей. Стабильные трансфекты затем сливают с энуклеированными ооцитами и переносят их в организм реципиента женского пола. Композиции Композиции, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, содержат подходящие носители. Подходящим носителем является, предпочтительно, любое вещество, к которому организм животного, растения или животный и растительный материал, а также окружающая среда (включая твердые- 16012569 или жидкие среды), подвергающиеся обработке, имеют толерантность. Примерами таких подходящих носителей являются вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Ханка и другие водные физиологически сбалансированные солевые растворы. Также могут использоваться неводные носители, такие как фиксированные масла, кунжутное масло, этилолеат или триглицериды. Фармацевтические композиции содержат терапевтически эффективное количество противогрибкового пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Терапевтически эффективное количество противогрибкового пептида может быть легко определено с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Фармацевтические композиции приготавливают так, чтобы они содержали терапевтически эффективное количество противогрибкового пептида и фармацевтически доступный носитель, подходящий для предполагаемого пути введения композиции (местного, перорального,внутривенного, в виде аэрозоля, локальной инъекции), что хорошо известно специалистам в данной области. Композиции, предназначенные для применения в сельском хозяйстве, содержат терапевтически эффективное количество пептида, заявленного согласно настоящему изобретению, и приемлемый для использования в сельском хозяйстве носитель, подходящий для организма (например, растения), в который он будет вводиться. Фраза "фармацевтически доступный носитель" относится к молекулярным системам и композициям, которые не вызывают аллергические, токсические или другие неблагоприятные реакции при введении в организм животного, в особенности млекопитающего и, в частности, человека. Примерами подходящих фармацевтически приемлемых носителей или растворителей являются без ограничений указанными растворители, дисперсионные среды, эмульсии, стабилизаторы, защитные коллоиды, связывающие вещества, сгустители, тиксотропные агенты, вещества, усиливающие проницаемость, изолирующие агенты и изотонические и замедляющие адсорбцию агенты, которые не влияют на активность пептидов,заявленных согласно настоящему изобретению. Достаточная текучесть может быть обеспечена, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, или путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии, или же путем использования сурфактантов. В целом, пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, можно комбинировать с любым нетоксичным твердым или жидким дополнительным компонентом в соответствии с традиционными методиками изготовления фармацевтических композиций. К жидким композициям, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, относятся растворимые в воде концентраты, эмульгируемые концентраты, эмульсии, концентрированные суспензии, аэрозоли, смачиваемые порошки (или порошки для распыления), пасты и гели. Пептид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, может также использоваться в виде порошков для втирания и гранул, в частности, получаемых с помощью прессования, сжимания, импрегнации гранулирующего носителя или же путем гранулирования порошка, а также в виде шипучих таблеток или пластинок. Сурфактанты также могут входить в состав различных композиций. Сурфактант может представлять собой эмульгирующий, диспергирующий или увлажняющий агент ионного или неионного типа, а также смесь указанных агентов. Примерами являются, без ограничений указанными, соли полиакриловой кислоты, поликонденсаты этиленоксида с жирными спиртами или жирными аминами, замещенные фенолы (в особенности алкиофенолы или арилфенолы), соли сложных эфиров сульфоянтарной кислоты,производные таурина (в частности, алкил таураты), полиоксиэтилированные сложные эфиры спиртов или фенолов, сложные эфиры жирных кислот и полиолов, производные, содержащие сульфатные, сульфонатные и фосфатные функциональные группы перечисленных выше соединений. В зависимости от специфического объекта, подвергающегося обработке, и выбранного способа введения, указанные агенты могут применяться в составе фармацевтических композиций для системного или местного введения. Подходящие пути введения включают, например, пероральный, ректальный,чрескожный, вагинальный, чресслизистый или внутрикишечный путь введения; парентеральное введение, включая внутримышечные, подкожные или интрамедуллярные инъекции, а также внутритрахеальные, внутривенные или инъекции. Для композиций, применяющихся в сельском хозяйстве, могут использоваться натуральные или синтетические, органические или неорганические материалы, с которыми комбинируют активные соединения для того, чтобы усилить их поступление в организм растений, семена или почву. Указанный носитель в общем является инертным и должен быть приемлемым для использования в сельском хозяйстве, в особенности с учетом вида растения, подлежащего обработке. Носитель может быть твердым (глины,натуральные или синтетические силикаты, кварцы, камеди, воски, твердые удобрения и т.д.) или жидким(вода, спирты, в частности, бутанол, и т.д.). Воздействовать противогрибковым пептидом на патоген растении можно различными способами,например, путем обработки пептидом частей растения или почвы, или же другой среды для выращивания, окружающей корни растений, или же обрабатывать семена растений непосредственно перед их высеванием с помощью стандартных сельскохозяйственных методик, таких как распыление. Пептид может применяться в форме композиции, содержащей пептид в смеси с твердым или жидким разбавителем и,выборочно, в смеси с различными адъювантами, такими как поверхностно активные вещества; указан- 17012569 ную композицией обрабатывают само растение или среду для выращивания. Твердые композиции могут быть в форме диспергируемых порошков или гранул. Композиции, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут также применяться в составе различных продуктов, включая (без ограничений указанными) дезинфицирующее мыло для рук,гипоаллергенный крем для рук, шампунь, мыло для лица, моющие средства, средства для мытья посуды(включая жидкость для мытья стеклянной посуды), чистящие средства для ванной, стоматологические продукты (например, жидкость для полоскания рта, стоматологический клей, слюноотсосы, фильтры и т.д.) и дезодорирующие продукты. Согласно одному варианту своего осуществления настоящее изобретение относится к композиции с регулируемым поступлением активного соединения, то есть к таким композициям, из которых возможно замедленное высвобождение пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, в организме животного, растения; животном или растительном материале или в окружающей среде (включая почву и воду). Согласно настоящему описанию композиции с регулируемым поступлением активного соединения содержат пептид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, в смеси с носителем с регулируемым высвобождением. Подходящими носителями с регулируемым высвобождением являются (без ограничений указанными), биологически совместимые полимеры, другие полимерные матрицы, капсулы, микрокапсулы, микрочастицы, болюсные композиции, осмотические помпы, диффузионные устройства, липосомы, липосферы и системы для чрескожного введения. Предпочтительными композициями с регулируемым поступлением активного соединения являются биологически разлагаемые композиции. Активное соединение из композиции высвобождается, предпочтительно, в течение определенного периода времени от 1 до 12 месяцев. Наиболее предпочтительная композиция с регулируемым поступлением активного соединения, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивает эффективное высвобождение активного вещества по крайней мере в течение 1 месяца, более предпочтительно в течение 3 месяцев, еще более предпочтительно по крайней мере в течение 6 месяцев, более предпочтительно в течение 9 месяцев и еще более предпочтительно по крайней мере в течение 12 месяцев. Эффективная концентрация пептида, вектора или клетки-хозяина в составе композиции может быть легко установлена экспериментально, что очевидно специалистам в данной области. Примеры композиций, содержащих противогрибковые пептиды, приведены в патенте США US 6331522. Аналогичные композиции, содержащие пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть легко получены специалистом в данной области. Антитела Настоящее изобретение также относится к моноклональным и поликлональным антителам к пептидам, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, или к их фрагментам. Следовательно, настоящее изобретение также относится к процессу получения моноклональных или поликлональных антител к пептидам, заявленным в соответствии с настоящим изобретением. Термин "специфическое связывание" относится к способности антител связываться по крайней мере с одним белком/пептидом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, но не с другими известными подобными морицину пептидами, такими как представленными в виде SEQ ID NO's 14-17. Используемый здесь термин "эпитоп" относится к участку пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, который связывается с антителом. Эпитоп может быть введен в организм животного для получения антител к этому эпитопу, однако, антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, специфически связываются с эпитопом, входящим в состав целой молекулы пептида. Если требуется получить поликлональные антитела, выбранное млекопитающее (например, мышь,крысу, кролика, козу, лошадь и т.д.) иммунизируют иммуногенным пептидом. У иммунизированных животных собирают сыворотку, которую потом обрабатывают по стандартной методике. В том случае, если сыворотка, содержащая поликлональные антитела, также содержит антитела и к другим антигенам, поликлональные антитела можно очистить с помощью иммунноаффинной хроматографии. Методики получения и процессирования поликлональных антител хорошо известны специалистам в данной области. С учетом способа получения таких антител, настоящее изобретение также относится к пептидам или их фрагментам, гаптенизированным с другими пептидами для использования в качестве иммуногенов у животных. Моноклональные антитела к пептидам, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, могут быть легко получены с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Общая методика получения моноклональных антител с помощью гибридом хорошо известна. Бессмертные клеточные линии, продуцирующие антитела, могут быть получены путем клеточного слияния, а также с помощью других методик, таких как прямая трансформация В-лимфоцитов онкогенной ДНК, или трансфекция вирусом Эбштейн-Барр. Панели полученных моноклональных антител затем скринируют на наличие различных свойств, то есть на изотипическую и эпитопную аффинность. Альтернативная методика включает скринирующую фагово-дисплейную библиотеку, например,фаги экспрессируют scFv фрагменты на поверхности своей оболочки с большим количеством участков,- 18012569 определяющих комплементарность (CDRs). Указанная методика хорошо известна специалистам. В контексте настоящего изобретения термин "антитело", если дополнительно не оговаривается иное, относится к фрагментам целых молекул антител, которые при этом сохраняют связывающую активность по отношению к антигену-мишени. К указанным фрагментам относятся Fv, F(ab') и F(ab')2 фрагменты, а также одноцепочечные антитела (scFv). Кроме того, антитела или их фрагменты могут представлять собой гуманизированные антитела, например, как описано в ЕР-А-239400. Антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть связаны с твердой основой и/или упакованы в подходящий контейнер в составе набора, который также содержит подходящие реагенты, контроль, инструкции и тому подобное. Предпочтительно, антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, соединены с определяемой меткой. Примерами таких меток, которые позволяют напрямую измерить связывание антител, являются радиоизотопные метки, флуорофоры, красители, магнитные бусины, хемилюминесцирующие соединения, коллоидные частицы и тому подобные вещества. Примерами меток, которые способствуют непрямой индикации связывания, являются ферменты, которые при взаимодействии с субстратом приводят к образованию окрашенного или флуоресцирующего продукта. Дополнительными примерами определяемых меток являются ферменты с ковалентным связыванием, которые после добавления подходящего субстрата, способствуют образованию определяемого сигнального продукта. Примерами таких ферментов, подходящих для использования в конъюгатах, являются пероксидаза хрена, алкалинфосфатаза, малатдегидрогеназа и им подобные. Указанные конъюгаты антитело-пептид не являются коммерчески доступными, но могут быть легко получены с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Еще одним примером такой определяемой метки являются: биотин, который с высокой аффинностью связывается с авидином или стрептовидином; флуорохромы (например,фикобилипротеины, фикоэритрин и аллофикоцианины; флуоросцеин и Техасский красный), которые могут применяться в аппарате для сортировке клеток, активируемом флуоресценцией; гаптены и им подобные соединения. Предпочтительно, определяемая метка позволяет прямо измерить связывание на планшете, оснащенным прибором для индикации люминесценции; в частности, к таким меткам относится биотин. Указанные меченые антитела могут применяться для индикации пептидов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Сферы применения Пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут применяться в различных областях, в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, промышленности, изготовлении продуктов питания и домашнем хозяйстве, то есть везде, где необходимо уничтожать и/или предотвращать развитие бактериальных и грибковых инфекций. Например, пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться в составе фармацевтических композиций для лечения грибковых инфекций, а также бактериальных инфекций (например, инфекций, вызываемых S. mutans, P. aeruginosa или P. gingivalis). К вагинальным,респираторным, кожным, слизистым, ушным, оральным и офтальмологическим инфекциям, которые чувствительны к терапии указанными пептидами, относятся инфекции, вызываемые следующими агентами (без ограничений указанными): Candida abicans; Actinomyces actinomycetemcomitans; ActinomycesVeillonellaparvula; и Wolinella succinogenes. В сельскохозяйственных целях противогрибковый пептид может применяться для повышения устойчивости или толерантности к инфекциям у культурных растений, как во время их жизни, так и для защиты после сбора урожая. Рост патогенов после воздействия пептидов ингибируется. Противогрибковый пептид может уничтожать патоген, который уже находится в организме растения, или защищать растение от будущих атак патогена. Патогеном может быть любой грибок растущий на растении или около него. Повышенная устойчивость определяется как усиленная, по сравнению с растением дикого типа, толерантность живого растения или продуктов после сбора урожая к грибковому патогену. Устойчивость может варьировать от незначительного уменьшения проявлений инфекции, до полного уничтожения патогенного агента, что проявляется тем, что присутствие патогена не влияет на жизнедеятельность растения. Таким образом, пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут также использоваться для лечения и/или профилактики грибковых инфекций у растений. К указанным грибковым агентам, вызывающим инфекции у растений, относятся грибы следующих родов (без ограничений ука- 19012569 занными): Alternaria; Ascochyta; Botrytis; Cercospora; Colletotrichum; Diplodia; Erysiphe; Fusarium; Leptosphaeria; Gaeumanomyces; Helminthosporium; Macrophomina; Nectria; Peronospora; Phoma; Phymatotrichum; Phytophthora; Plasmopara; Podosphaera; Puccinia; Puthium; Pyrenophora; Pyricularia; Pythium;Rhizoctonia; Scerotium; Sclerotinia; Septoria; Thielaviopsis; Uncinula; Venturia и Verticillum. Специфическими примерами возбудителей грибковых инфекций растений, на которые воздействуют пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, являются: Erysiphe graminis у злаков, Erysiphetabacina у табака, или другие организмы рода Peronospora у различных культурных растений, Pseudocercosporella herpotrichoides у пшеницы и ячменя, Pyrenophera teres у ячменя, Pyricularia oryzae у риса, Phytophthora infestans у картофеля и томатов, Fusarium sp. (такая, как Fusarium oxysporum) и Verticillium sp. у различных растений, Plasmopara virticola у винограда, Alternaria sp. у фруктов и овощей, Pseudoperonospora cubensis у огурцов, Mycosphaerella fijiensis у бананов, Ascochyta sp. у турецкого гороха, Leptosphaeria sp. у канолы и Colleotrichum sp. у различных культурных растений. Противогрибковый пептид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, может также использоваться в качестве консерванта для поддержания свежести и срока хранения продуктов питания,таких как сыр, хлеб, кексы, мясо, рыба, консервы, корма для животных и т.п. Противогрибковый пептид также может использоваться для создания антибактериальных упаковок для пищевых продуктов, то есть входить в состав упаковочного пластика или полимеров, пищевых пленок или оболочек. Например, указанные пищевые пленки или оболочки могут содержать адекватное количество противогрибкового пептида (пептидов) и использоваться для хранения таких продуктов, как сыр, кондитерские изделия, сухие продукты питания и пр. Примеры Пример 1. Очистка пептидов. Материалы и методы НасекомыеGalleria mellonella (восковую огневку) выращивают на искусственном режиме питания. В организм личинки на последней стадии развития вводят 10 мкл воды, содержащей приблизительно 106 клеток каждого из видов - Е. coli и М. luteus. Для контроля в некоторые личинки вводят 10 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером. Личинки оставляют при комнатной температуре на 48 ч, после чего экстрагируют гемолимфу путем удаления ложной ножки. Гемолимфу собирают в пробирку на льду, содержащую несколько кристаллов фенилтиомочевины, центрифугируют в течение 5 мин для удаления клеточного дебриса и замораживают при температуре -80 С. Анализ противогрибковой и антибактериальной активности Образцы тестируют на противогрибковую и антибактериальную активность, используя анализ ингибирования зон на планшете. Для Escherichia coli и Micrococcus luteus планшет приготавливают, используя питательный агар (Oxoid) и клеточную плотность приблизительно 5106 клеток/мл. Для грибов планшеты приготавливают с использованием бульона YPD (10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л пептона, 40 г/л D-глюкозы), содержащего 0,8%-ную агарозу и с плотностью спор приблизительно 106 спор/мл. Для анализа активности 2 мкл интересующего образца наносят на поверхность планшета и организм выращивают в подходящих условиях ( в течение ночи при 37 С для бактерий, 1-3 дня при комнатной температуре для грибов) до тех пор, пока не станет возможным определить наличие или отсутствие чистых зон (свободных от роста). Тестируют следующие виды грибов: Fusarium graminearum, Alternaria alternata, Ascochyta rabiei, Collectotrichum gloeosporioides, Leptosphaeria maculans и Aspergillus niger. Очистка пептидов Два сырых образца гемолимфы из различных иммунизированных организмов G. mellonella подвергают С 18 твердофазной экстракции. Размороженную гемолимфу (1,4 или 4,8 мл) разводят 0,1% трифторуксусной кислотой (TFA), изготавливают образцы одинакового объема и взбалтывают их на льду в течение 30-45 мин. Образцы центрифугируют на высокой скорости в течение 10 мин и удаляют супернатант. Первый образец (из 1,4 мл гемолимфы) преципитируют смесью 20% ацетонитрил/0,05% трифторуксусная кислота и повторно центрифугируют в течение 5 мин на высокой скорости. Суперанант помещают на три картриджа для С 18 твердофазной экстракции (Maxi-Clean, 300 мг картриджи, Alltech), уравновешенные в смеси 20% ацетонитрил/0,05% TFA. Каждый картридж отмывают смесью 20% ацетонитрил/0,05% TFA и элюируют 1 мл 60% ацетонитрила/0,05% TFA. Второй образец (из 4,8 мл гемолимфы) помещают на три картриджа для С 18 твердофазной экстракции (Maxi-Clean, 900 мг картриджи, Alltech),уравновешенные 0,05% TFA. Картриджи отмывают 0,05% TFA и элюируют поэтапно сначала 3 мл смеси 20% ацетонитрил/0,05% TFA, затем 3 мл смесью 60% ацетонитрил/0,05% TFA. Образцы (1 мл) после элюции смесью 60% ацетонитрил/0,05% TFA высушивают в скоростном вакууме (Speedvac, Savant) и- 20012569 повторно суспендируют в 100 мкл воды. Образцы тестируют в отношении Е. coli, M. luteus и различных грибов, используя методику, описанную выше. Сырой образец гемолимфы очищают с помощью HPLC в системе для мониторинга адсорбции с обратной фазой Beckman Gold при 225 или 215 нм. Образец (1,4-4,8 мл) помещают на полупрепаративную колонку (Phenomenex) Jupiter C18, 5 мкм, 300 , 25010 мм, уравновешенную растворителем А (2% ацетонитрил, 0,065% TFA) и элюируют растворителем В с градиентом 0-70% (95% ацетонитрил, 0,05% TFA) в течение 70 мин при скорости 5 мл/мин. 500 мкл каждой 5 мл фракции высушивают в вакуумном ускорителе (Speedvac), повторно суспендируют в 10 мкл воды и тестируют в отношении активности против Е. coli, M. luteus и F. graminearum, как описано выше. Для Gm-морицина А интересующую фракцию разводят в эквивалентном объеме TFA и наносят на аналитическую колонку Prosphere С 18,5 мкм, 300 , 2504,6 мм (Alltech), уравновешенную 10% растворителем В для HPLC. Колонку элюируют растворителем В с градиентом 10-50%) в течение 60 мин при скорости 1 мл/мин. 200 мкл каждой 1,8 мл фракции высушивают в вакуумном ускорителе (Speedvac),повторно суспендируют в 10 мкл воды и тестируют в отношении активности против Е. coli, M. luteus и F.graminearum, как описано выше. Для Gm-морицина В интересующую фракцию разводят в эквивалентном объеме 0,05%) TFA и наносят на аналитическую колонку Prosphere C18, 5 мкм, 300 , 2504,6 мм (Alltech), уравновешенную 15% растворителем В для HPLC. Колонку элюируют растворителем В с градиентом 15-65% в течение 75 мин при скорости 1 мл/мин. 200 мкл каждой 1,8 мл фракции высушивают в вакуумном растворителе(Speedvac), повторно суспендируют в 10 мкл воды и тестируют в отношении активности против Е. coli,M. luteus и F. graminearum, как описано выше. Интересующую фракцию разводят 0,05% TFA, распределяют на равные объемы и наносят на аналитическую колонку Microsphere C8, 5 мкм, 300 , 2504,6 мм(Alltech), уравновешенную 15% растворителем В для HPLC. Колонку элюируют растворителем В с градиентом 15-55% в течение 60 мин при скорости 1 мл/мин. 200 мкл каждой 1,8 мл фракции высушивают в вакуумном ускорителе (Speedvac), повторно суспендируют в 10 мкл воды и тестируют в отношении активности против Е. coli, M. luteus и F. graminearum, как описано выше. Интересующую фракцию разводят 0.05% TFA, распределяют на равные объемы и наносят на аналитическую колонку RPC С 2/С 18, 3 мкм, 1002,1 мм (Amersham Biosciences), уравновешенную 15% растворителем А в системе SMART(Amersham Biosciences) с мониторингом при 215, 254 и 280 нм. Колонку элюируют растворителем В с градиентом 0-100% в течение 25 мин при скорости 200 мкл/мин. 50 мкл каждой 200 мкл фракции высушивают в вакуумном ускорителе (Speedvac), повторно суспендируют в 3 мкл воды и тестируют в отношении активности против F. graminearum. Для Gm-морицина С 1 интересующую фракцию разводят в эквивалентном объеме 0,05% TFA и наносят на аналитическую колонку Prosphere С 18, 5 мкм, 300 , 2504,6 мм (Alltech), уравновешенную 10% растворителем В для HPLC. Колонку элюируют растворителем В с градиентом 10-50% в течение 60 мин со скоростью 1 мл/мин. 400 мкл каждой 1,8 мл фракции высушивают в вакуумном ускорителе, повторно суспендируют в 10 мкл воды и тестируют в отношении активности против F. graminearum. Интересующие фракции объединяют, разводят в эквивалентном объеме 0.05% TFA и наносят на колонку С 2/С 18. Колонку уравновешивают растворителем А, пропускают через систему SMART и элюируют растворителем В с градиентом 0-100% в течение 25 мин при скорости 200 мкл/мин с одновременным мониторингом при 215, 254 и 280 нм. Фракции отбирают с помощью пиковой детекции и тестируют в отношении активности F. graminearum. Идентификация пептидов Фракции, представляющие интерес, анализируют на масс-спектрометре Voyager Elite MALDI-TOF(Perseptive Biosystems) с использованием 0,5 мкл образца и 0,5 мкл матрицы. Для среднего линейного спектра матрица представляет собой синапиновую кислоту, а стандарт - смесь цекропина А и миоглобина, и для среднего рефлекторного спектра матрица представляет собой -циано-4-гидроксициннаминовую кислоту, а стандарт - расщепленный трипсином альбумин бычьей сыворотки. Для секвенирования N-концевых аминокислот очищенные пептиды высушивают над дисками из стекловаты и подвергают деградации по Эдману с использованием аппарата Prosice Model 492 Protein Sequencer (Applied Biosystems), в соответствии с инструкциями производителя. Результаты и обсуждение Два различных пула сырой гемолимфы процессируют с помощью С 18 твердофазной экстракции и С 18 полупрепаративной хроматографии. Образцы, полученные после частичной очистки с помощью С 18 твердофазной экстракции, демонстрируют активность в отношении Е. coli, M. luteus, F. graminearum, A.alternate, А. rabiei, С. Gloeosporioides, L. maculans и A. niger. Дополнительная очистка образцов с помощью C18 полупрепаративной хроматографии на колонке с элюцией ацетонитрилом с градиентом 25-40% приводит к образованию фракций, активных в отношении тестируемого микроорганизма F. graminearum. Три фракции из различных порций в градиенте очищают дополнительно на С 18 аналитической колонке. Для Gm-морицина А было получено три фракции, которые обладали активностью в отношении F.graminearum. Одну из указанных фракций дополнительно очищают на С 18 аналитической колонке с по- 21012569 лучением фракции, активной в отношении F. graminearum. Она также демонстрирует активность в отношении L. maculans и A. rabiei. При анализе с помощью спектроскопии фракция имеет достаточную степень очистки, ее подвергают секвенированию по Эдману без дополнительной очистки. Для Gm-морицина В очистка на С 18 аналитической колонке привела к образованию одной фракции, которая обладает активностью в отношении F. graminearum. Указанную фракцию дополнительно очищают на С 8 аналитической колонке, что приводит к получению фракции, обладающей активностью в отношении F. graminearum. Данную фракцию еще раз очищают на колонке С 2/С 18, что приводит к образованию одной фракции, обладающей активностью в отношении F. graminearum. При анализе с помощью спектроскопии фракция имеет достаточную степень очистки, ее подвергают секвенированию по Эдману. Для Gm-морицина С 1 очистка на С 18 аналитической колонке приводит к получению двух фракций,которые обладают активностью в отношении F. graminearum. Указанные фракции объединяют и дополнительно очищают на С 2/С 18 колонке, что приводит к получению трех фракций, обладающих активностью в отношении F. graminearum. С помощью масс-спектроскопии подтверждают достаточную степень очистки одной из указанных фракций, которую затем подвергают секвенированию по Эдману. Масс-спектроскопию и секвенирование по Эдману используют для идентификации очищенных пептидов. Gm-морицин А имеет молекулярную массу 4242.9 и частичную аминокислотную последовательность KVNVNAIKKGGKAIGKGFKVISAASTAHDVYE (SEQ ID NO: 19). Для Gm-морицина В массспектрометрия выявила один основной пик (3569) и несколько меньших компонентов, следовательно установить точную молекулярную массу основного компонента не является возможным. Аминокислотная последовательность основного компонента была определена:GGQIIGKALRGrNIASTAHDIISQFKPK (SEQ ID NO: 20). Gm-морицин С 1 имеет молекулярную массу 3924.4 Да и частичную аминокислотную последовательность KVPIGAIKKGGKIIKKGLGVIGAAGTAHEVYS (SEQ ID NO: 30). Анализ баз данных с использованием BLASTP для коротких меток выявил, что указанные три пептида являются частично гомологичными известным морицинам, выделенным из организма Bombyx mori, Manduca sexta и Spodoptera litura, и виресцеину из Heliothis virescens. Пример 2. Идентификация молекул кДНК, кодирующих подобные морицину белки, выделенные из организма G.mellonella. Получение общей РНК и поли(А)+ РНК Иссекают жировую ткань из личинки G. Mellonella через 24 ч после введения клеточной суспензии Е. coli и М. luteus. Личинку, которая предварительно охлаждают на льду по крайней мере в течение 30 мин, помещают на тарелку Sylgard под ледяной PBS и вскрывают продольным разрезом вниз по дорсальной средней линии. Кишку удаляют и жировое тело собирают с помощью тонкого часового пинцета. Иссеченное жировое тело тут же промокают абсорбирующей тканью и быстро замораживают в микроцентрифужной пробирке, которая помещают в жидкий азот. Замороженные ткани хранят при -80 С. Общую РНК выделяют с помощью тризолового реагента (Astral Scientific). Вкратце, приблизительно 500 мг замороженного жирового тела повторно суспендируют в 1 мл тризолового реагента и гомогенизируют на аппарате для гомогенизации тканей Polytron. Полиаденилированную РНК выделяют с помощью двух этапов селекции на олиго(dT)-целлюлозной спиновой колонке для хроматографии с использованием набора для очистки мРНК (Amersham Bioscienses). Приблизительно 1 мг общей РНК помещают на олиго(dT)-целлюлозную спиновую колонку для хроматографии, отмывают и элюируют 1 мл слабосоленого буфера согласно с инструкциями производителя. Элюированную РНК помещают на вторую спиновую колонку, отмывают и элюируют, как описано выше до конечного объема 1 мл. мРНК преципитируют, добавляя ацетат натрия до конечной концентрации 0,1 М с 200 мкл этанола. мРНК восстанавливают с помощью центрифугирования и повторно суспендируют в 5 мкл воды, обработанной DEPC. Получение библиотеки кДНК Библиотеку кДНК получают приблизительно из 5 мг мРНК с помощью системы синтеза кДНКLambda Unizip и системы для клонирования (Stratagene). Очищенную кДНК (приблизительно 20 нг) лигируют с 1 мкг ДНК-вектора и упаковывают в упаковывающий экстракт Gigapack III Gold (Stratagene) с получением библиотеки кДНК с титром 5105 бляшкообразующих единиц на мл. Идентификация кДНК, кодирующей подобные морщину пептиды, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) Короткие, минимально вырожденные олигонуклеотиды получают с помощью обратной трансляции аминокислотных последовательностей Gm-морицин А- и Gm-морицин В пептидов из G. mellonella. Последовательности указанных олигонуклеотидов представлены в табл. 2.- 22012569 Таблица 2. Праймеры, используемые для идентификации кДНК, кодирующей морицины G. mellonella для уменьшения избыточной вырожденности олигонуклеотидного пула в некоторых положениях использовался дезоксиинозинтрифосфат (I) Для ПЦР-амплификации фрагментов кДНК, кодирующих пептиды Gm-морицина А и Gm-морицина В, использовали каждую пару олигонуклеотидов GmAF1/GmAF2 и GmAF3/GmAF4. Приблизительно 2 нг очищенной двухнитевой кДНК, используемой для конструирования библиотеки, использовали в качестве матрицы для ПЦР. ПЦР-продукты рассчитанного размера удаляют с акриламидного геля, ДНК элюируют в ацетатаммониевом буфере и восстанавливают преципитацией этанолом. Очищенную ДНК лигируют в клонирующий вектор pGEM-Taesy (Promega) и трансфицируют с помощью электропорации в DH10B клетки Е.coli. Полученные бактериальные колонии скринируют на наличие вставок с помощью ПЦР с использованием праймеров, основанных на Т 7 и SP6 промоторных последовательностях, фланкирующих множественный сайт клонирования вектора. Для каждого продукта, Gm-морицина А и Gm-морицина В, несколько клонов, содержащих вставки рассчитанного размера, секвенируют по обеим цепям и предсказанную белковую последовательность используют для верификации клонов, содержащих кДНК Gmморицина А и Gm-морицина В. Для кДНК каждого типа морицина отбирают один репрезентативный клон для последующего использования в скринировании библиотеки. Синтез зондов Зонды синтезируют с помощью ПЦР, в которой dATP замещают dATP, меченным радиоактивной меткой. Для каждого фрагмента Gm-морицина А и Gm-морицина В из репрезентативного клона синтезируют праймеры с уникальной последовательностью (табл. 3). Зонды для гибридизации синтезируют для каждой кДНК морицина G. mellonella с использованием праймеров, представленных в табл. 3, и клонов кДНК со вставками pGmmA7 (Gm-морицин А) и pGmmB11 (Gm-морицин В) в качестве матрицы. Таблица 3. Частичные клоны и олигонуклеотидные праймеры, используемые для получения зондов для гибридизации для скринирования библиотеки Композиции для ПЦР для каждого из двух зондов представлены в табл. 4. Условия реакции включают: начальный этап денатурирования при 94 С в течение 3 мин, затем 30 циклов при 94 С по 45 с, при 53 С в течение 30 с, при 72 С в течение 45 с и конечный этап при 72 С в течение 5 мин до конца. Таблица 4. Условия реакции с мечеными зондами Невстроенные dNTPs удаляют после завершения реакции с помощью спиновой колоночной хроматографии с исключением по размеру (BioRad P30 микро био-спиновые колонки), а встраивание изотопа контролируют с помощью TLC. Скринирование бибилиотеки Библиотеку кДНК помещают на пять планшетов со слоем LB агара 15 см с плотностью 5104 БОЕ на планшет. Делают дубликаты бляшек на нитроцеллюлозных фильтрах, ДНК денатурируют и фиксируют к пластинам с помощью стандартных методик (Sambbrook et al., 1989; см. выше). В первую очередь, скринируют библиотеку с зондом для гена Gm-морицина A G. mellonella, первичные фильтры отмывают и повторно скринируют с зондом для гена Gm-морицин В G. mellonella. Фильтры помещают в колбы для гибридизации (Hybaid) и подвергают предварительной гибридизации как минимум в течение 2 ч при 60 С в 20 мл раствора, содержащего 5XSSPE, 5 Х раствор Денхардта,0.5% вес./об. SDS и 20 мкг/мл свежеденатурированной ДНК из спермы сельди. Зонд денатурируют кипячением в течение 10 мин и затем охлаждают на льду. Охлажденный раствор зонда добавляют к фильтрам и оставляют для гибридизации на ночь при 60 С. Фильтры трижды отмывают 0,5 Х SSPE, 0,1% SDS при 60 С в течение 30 мин каждый раз. Выделение и характеристика кДНК, кодирующей пептид Gm-морицина A G. mellonella Приблизительно 80 гибридизующихся фагов было идентифицировано после первичного скринирования библиотеки. Четыре из них очищают от бляшек, удаляют плазмиды и вставки кДНК секвенируют по обеим цепям с помощью окрашиваемой терминаторной последовательности с использованием ДНК Анализатора Beckman CEQ8000 и Beckman DCTS. Было идентифицировано три клона (pGmmoriAa,pGmmoriAd, pGmmoriAe), которые отличаются только по длине на 5'-конце. Четвертый клон (pGmmoriAc) представляет собой аллельный вариант того же гена, который отличается от других трех шестью нуклеотидными заменами, две из которых приводят к аминокислотным заменам в предполагаемой последовательности сигнального пептида секреции. Другие изменения являются молчащими или происходили в нестранслируемых участках мРНК. Нуклеотидные последовательности двух клонов кДНК Gmморицина А представлены на фиг. 1 в сопоставлении, а предсказанные аминокислотные последовательности представлены на фиг. 2 в сопоставлении. Нуклеотидная последовательность клона pGmmmoriAa, представляющая наиболее часто встречающийся класс клона, представлена на фиг. 3, вместе с установленной белковой последовательностью открытой рамки считывания, кодирующей пептид Gm-морицина А, начинающейся с остатка метионина. На рисунке также выделены предполагаемые сайты процессинга предшественника пептида. Выделение и характеристика кДНК, кодирующей пептид Gm-морщина В G. mellonella Более 150 гибридизующихся фагов было идентифицировано после первичного скринирования библиотеки. Три из них очищают от бляшек, удаляют плазмиды и вставки кДНК секвенируют по обеим нитям с помощью окрашиваемой терминаторной последовательности с использованием ДНК АнализатораBeckman CEQ8000 и Beckman DCTS. Было идентифицировано три клона (pGmmoriBe1, pGmmoriBe2,pGmmoriBd1), которые отличаются только по длине на 5'-конце. Нуклеотидная последовательность репрезентативного клона pGmmmoriBe1 представлена на фиг. 4 вместе с установленной белковой последовательностью открытой рамки считывания, кодирующей пептид Gm-морицина A G. mellonella, начинающейся с остатка метионина.- 24012569 Идентификация Gm-морицина С 1 и Gm-морицина С 2 с помощью ПЦР из библиотеки кДНК Аминокислотную последовательность Gm-морицина С 1, полученную с помощью белкового секвенирования, используют для получения вырожденных праймеров (Gm3-1 и Gm3-2, см. табл. 5), предназначенных для выделения гена с помощью гнездовой ПЦР из библиотеки кДНК G. mellonella. Секвенирование ПЦР-продуктов позволило идентифицировать две формы гена Gm-морицина С. Создают специфические праймеры (GmC1-F, GmC1-R, GmC2-F и Gm-C2-R, см. табл. 5), которые затем используют в ПЦР вместе с векторными праймерами, основанными на фагемиде pBluescript SK (Stratagene), что позволяет различить две формы гена. Для Gm-морицина С 1 3' фрагмент гена получают с помощью гнездовой ПЦР с использованием пары праймеров Gm3-1/M13 (обратный) и GmC1-F/Т 3, а 5' фрагмент получают с помощью гнездовой ПЦР с использованием пары праймеров Gm3-1/M13 (прямой) и GmC1-R/T7. Для Gm-морицина С 2, 3' фрагмент гена получают с помощью гнездовой ПЦР с использованием пары праймеров Gm3-1/M13 (обратный) и GmC2-F/T3, а 5'-фрагмент получают с помощью гнездовой ПЦР с использованием пары праймеров Gm3-2/M13 (прямой) и GmC2-R/T7. Полученные ПЦР-продукты секвенируют, включают в их состав последовательности с 5' и 3' нестранслируемых участков генов. Затем создают третий набор специфических праймеров (GmClutr5, GmClutr3, GmC2utr5 иGmC2utr3, см. табл. 5) для отжига 5' и 3' нетранслируемых участков двух генов. ПЦР с парами праймеровGmC1utr5/GmC1utr3 и GmC2utr5/GmC2utr3 позволяет определить полную последовательность открытых рамок считывания пептидов Gm-морицина С 1 и Gm-морицина С 2. Для Gm-морицина С 1 было секвенировано 8 клонов, которые помимо длины отличаются только тремя нуклеотидными положениями. Две из указанных замен находятся в пределах открытой рамки считывания, одна из них приводит к замене аминокислоты в предполагаемой последовательности сигнального пептида секреции (остаток 13, МЕТ или VAL). Нуклеотидная последовательность репрезентативного клона Gm-морицина C1, Gm3-01ae, представлена на фиг. 5, вместе с установленной белковой последовательностью открытой рамки считывания, начинающейся с остатка метионина. На фигуре также выделены предполагаемые сайты процессинга белкового предшественника. На рисунке также представлены три сайта в последовательности, где были обнаружены нуклеотидные замены, и выделены аминокислотные вариации в положении 13 в открытой рамке считывания пептида. Таблица 5. Праймеры, используемые для идентификации генов Gm-морицина С 1 и Gm-морицина С 2 G. Для Gm-морицина С 2 в четырех различных клонах не было выявлено нуклеотидных вариаций. Нуклеотидная последовательность репрезентативного клона Gm-морицин С 2, Gm3-03, представлена на фиг. 6, вместе с установленной белковой последовательностью открытой рамки считывания, начинающейся с первого остатка метионина. На фигуре также выделены предполагаемые сайты процессинга предшест- 25012569 венника белка. Сопоставление нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Gm-морицина С 1 и Gmморицина С 2 представлено на фиг. 7 и 8 соответственно. На уровне нуклеотидов Gm-морицин С 1 и Gmморицин С 2 отличаются по 19 нуклеотидам в открытой рамке считывания, с 3 отличиями в предполагаемом сигнальном участке, и с 2 и 14 отличиями в N- и С-концевых частях зрелого белка, соответственно(фиг. 8). На аминокислотном уровне Gm-морицин С 1 и Gm-морицин С 2 отличаются по 6 аминокислотам,включая 1-2 аминокислоты в предполагаемом сигнальном участке (в зависимости от формы Gmморицина О), и 4 аминокислоты в участке, кодирующем белок (фиг. 9). Аминокислотные отличия в кодирующем участке располагаются все на С-конце белка, то есть в том участке, где отмечается существенное различие нуклеотидных последовательностей. Структурный анализ ЯМР-анализ структуры морицина В. mori (Hemmi et al., 2002) осуществляют с помощьюDSМоделировании 1.1 (AcceIrys Inc.). Гомологичные модели Gm-морицина А и морицина X В. mori строят с использованием морицина В. mori в качестве матрицы, и нулевого фона в DSМоделировании. Предполагаемая вторичная структура была сконструирована с использованием PSIPRED (McGuffm et al.,2000). Филогенетическое дерево конструируют при помощи ClustalW (Chenna, et al., 2003) с энбоцином в качестве аномального значения. Обсуждение Для Gm-морицина А, Gm-морицина В и Gm-морицина С 1 частичные последовательности, установленные с помощью N-концевого аминокислотного секвенирования, оказались идентичными участкам транслируемых последовательностей ДНК. Это позволяет получить полные последовательности пептидов из предполагаемых открытых рамок считывания соответствующих последовательностей ДНК. Gmморицин С 2, белок, родственный Gm-морицину С 1, также был идентифицирован с помощью ПЦР на библиотеке кДНК. Установленные последовательности зрелых белков используют для поиска невыборочных баз данных с использованием программы BLASTP для коротких меток. При помощи такого поиска было установлено, что указанные белки аналогичны белкам морицину и виресцеину, которые предварительно были выделены из организма других чешуекрылых, включая Bombyx mori, Manduca sexta,Spodoptera litura and Heliothis virescens. Сопоставление с помощью программы GAP белков G. mellonella указанных четырех белков позволило определить, что идентичность их составляет 77% для активного белка. В общем, наиболее высокая идентичность была установлена для виресцеина из Н. virescens, a Gmморицин В оказался наиболее идентичным известным морицинам, чем Gmp-морицин А, Gm-морицин С 1 или Gm-морицин С 2. Сопоставление Gm-морицина А, Gm-морицина В и Gm-морицина С 2 с соответствующими белками из других видов чешуекрылых с помощью программы ClustalW представлено на фиг. 9. После анализа информации, полученной с помощью указанного сопоставления, аминокислотного секвенирования, а также на основании знаний относительно процессинга сигнальных белков для антимикробных пептидов у насекомых (Boman et al., 1989), было установлено, что зрелые белки в организме G. Mellonella обычно начинаются с 26 остатка (фиг. 9). Исключением является Gm-морицин В, для которого с помощью Nконцевого аминокислотного секвенирования и масс-спектроскопии было установлено, что активный белок, выделенный из гемолимфы G. Mellonella, начинается с 36 остатка. Основной особенностью структуры морицина В. mori по данным литературы (Hemmi et al., 2002) и дополнительного анализа с помощью программы DSМоделирование, является наличие спирали, сформированной остатками 5-36 с изгибом между остатками 22 и 23. Интересно сравнить указанную информацию с данными, полученными в результате сопоставления белковых последовательностей и представленными на фиг. 9. Указанная спираль начинается с 5 остатка (соответствующему N-концевому участку зрелого белка), сразу после остатка пролина, который присутствует в каждой последовательности морицина, за исключением Gm-морицина А. Что касается Gm-морицина А, то определение возможной вторичной структуры с помощью программы PSIPRED, позволило предположить, что спираль начинается остатка в том же положении (остаток 4), что и в других морицинах, за тем исключением, что в нем отсутствует пролин. N-концевой участок (1-22) морицина В. mori является амфипатическим, с 6 основными аминокислотами на одной стороне спирали. Другие морицины имеют 5-7 основных аминокислотных остатка в одном и том же участке, хотя положение указанных аминокислот в последовательности не является консервативным. Это позволяет предположить, что указанные аминокислоты формируют положительно заряженную сторону спирали, что является очень важной особенностью равно как и точные положения основных аминокислотных остатков в последовательности. Gm-морицин В представляет собой интересный случай, поскольку в активном белке N-концевой участок имеет гораздо меньший положительный заряд, поскольку в нем отсутствуют 10 аминокислотных остатка. Для морицина В. mori Cконцевой спиральный участок (23-36) является гидрофобным с полностью консервативным аминокислотным остатком в середине спирального участка. Gm-морицин А и морицин Р 1648 С. Illioneus представляют интерес, поскольку они имеют дополнительный аминокислотный остаток на конце указанного С-концевого спирального участка, а модель Gm-морицина А демонстрирует, что два аминокислотных остатка формируют кластер на лицевой стороне спирали. Морицин В. mori и около половины известных- 26012569 последовательностей морицина имеют остаток пролина на конце спирального участка. Спираль Gmморицина А, по-видимому, также заканчивается в той же точке, несмотря на отсутствие пролина. Для морицина В. mori С-концевой участок не структурирован. Во всех морицинах указанный концевой участок является сильно заряженным и это является особенностью всех морицинов, отличающей их от цекропинов (Hemmi et al.) Пример 3. Активность синтетических белков Gm-морицина А, Gm-морицина В и Gm-морицина С 2 в отношении различных грибов Auspep (Melbourne, Australia) было синтезировано четыре пептида морицина с помощью стандартных методик синтеза белка. Указанные пептиды представляют собой морицин В. mori (остатки 25-66 последовательности SEQ ID NO: 16), Gm-морицин A (SEQ ID NO: 4), Gmморицин В (SEQ ID NO: 5) и Gm-морицин C2 (SEQ ID NO: 53). Полученные пептиды тестируют на активность в отношении бактерий Е. coli и М. luteus, а также в отношении спор грибов F. graminearum, F.oxysporum, A. rabiei, С. gloeosporioides, L. maculans и A. niger в целом как описано в примере 1. Пептиды тестировали в следующих концентрациях: 0.1, 1, 10 и 100 мкМ и 1 мкг/мкл. Результаты, представленные в табл. 6, свидетельствуют о том, что все пептиды обладают определенной противогрибковой активностью. Синтезированные пептиды также тестируют на активность в отношении грибкового мицелия с помощью исследования зон ингибирования на планшете. Мицелий F. graminearum и F. oxysporum фрагментируют с помощью толчения мини-пестиком в стерильной воде в пробирке для микроцентрифугирования. Грибковые планшеты с помощью YPD бульона, содержащего 0,8% агарозу и фрагментированного грибкового мицелия в определенном объеме, который дает гомогенный рост грибов. Образец, представляющий интерес, наносят на поверхность планшета (2 мкл) и организм выращивают в подходящих условиях. Результаты, представленные в табл. 6, свидетельствуют о том, что все пептиды обладают определенной противогрибковой активностью в отношении грибкового мицелия. Таблица 6. Активность синтетических пептидов морицина в отношении различных микроорганизмов. Приведенные в таблице концентрации (мкМ) представляют собой самые низкие концентрации, при которых наблюдается активность в анализе зон ингибирования, а N свидетельствует об отсутствии активности, тире - о том, что образец не был тестирован.Eco, Escherichia coli; Mlu, Micrococcus luteus; Fgr, Fusarium graminearum споры; Fgm, F. graminearum мицелий; Fox, Fusarium oxysporum споры; Fom, F. oxysporum мицелий; Ara, Ascochyta rabiei споры; Cgl,Colletotrichum gloeosporioides споры; Lma, Leptosphaeria maculans споры; Ani, Aspergillus niger споры. Синтетический Gm-морицин А также тестируют в отношении активности против шести видов дрожжей с использованием метода разведений микробульона (microbroth) NCCLS M27-A2 в Госпитале детей и матерей (Women's and Children's Hospital, Adelaide, Australia). Белки тестировали в отношении следующих видов дрожжей: Candida albicans, С. parapsilosis, С. glabrata, С. krusei, С. tropicalis и Cryptococcus neoformans. Пептид тестируют в концентрации 0,125-64 мкг/мл и дважды в отношении каждого вида дрожжей. Trays оценивают через 24, 48 или через 72 ч, как положено. Были получены следующие величины MIC90: 0,4 мкг/мл С. parapsilosis, С. tropicalis и С. neoformans, 8,0 мкг/мл для С. krusei, и 64.0 мкг/мл С. albicans и С. glabrata. Указанные результаты свидетельствуют о том, что Gm-морицин А обладает активностью в отношении дрожжей. Конструирование филогенетического дерева на основании сопоставления последовательностей зрелых пептидов с помощью программы ClustalW (фиг. 9) позволяет определить, что Gm-морицин А, Gmморицин С 1, Gm-морицин С 2 и Bm-морицинХ являются родственными и могут быть объединены вместе как подсемейство морицинов. Анализ противогрибковой активности двух членов указанного подсемейства (синтетического Gm-морицина А и Gm-морицина С 2) позволяет сделать предположение о том, что указанная группа пептидов обладает большей противогрибковой активностью, чем синтетический морицин В. mori (табл. 6). Пример 4. Экспрессия противогрибковых пептидов у Arabidopsis. Опосредованная Агробактериями трасформация Arabidopsis геном Gm-морицина A G. MellonellaCSIRO Plant Industry, Canberra, Australia). Указанный вектор конструируют путем встраивания фрагментаNotI из pART7 в pART27 (Gleave, 1992). Вектор р 277 включает промотор CaMV 35S и терминатор OCS для экспрессии в растениях, маркеры секреции антибиотиков и последовательности, необходимые для трансформации растений. Для трансформации Arabidopsis thaliana выбирают три ДНК конструкта Gmморицина А-зрелый Gm-морицин А без сигнального пептида, полноразмерный Gm-морицин, включая нативный сигнальный пептид, и белок-слияния, включающий сигнальный пептид основной вакуолярной хитиназы Arabidopsis и последовательность зрелого Gm-морицина. Указанные конструкты синтезируют с помощью ПЦР и напрямую клонируют в р 277 трансфер-плазмиде. Трансформацию штамма GV3101 Агробактерий осуществляют с помощью метода тройных серийных разведений. Он включает в себя совместное выращивание культур А. tumefasciens GV3101, Е. coli,несущих хелперную плазмиду, RK2013, и Е. coli, несущих необходимую рекомбинантную плазмиду р 211 на неселективном планшете LB. После инкубации при 28 С в течение ночи образуется смешанная культура, которую собирают и ее последующие разведения наносят на LB планшеты, отобранные для A. tumefasciens GV3101, несущих рекомбинантную плазмиду р 277. Растения вида Arabidopsis культивируют по стандартной методике при 23 С со световым периодом в 18 ч в течение дня. Трансформацию растений вида Arabidopsis осуществляют путем погружения растений в культуру бактерий. Растения выращивают в течение 3-5 недель до стадии образования цветов на разных стадиях развития. Культуру трасформированных A. tumefasciens GV3101 осаждают центрифугированием и повторно суспендируют в 5% сахарозе, содержащей увлажняющий агент Silwet-77. Цветы погружают в бактериальную суспензию и тщательно увлажняют с помощью встряхивания. Растения упаковывают в пластиковую пленку и оставляют на ночь на поверхности лабораторного стола при комнатной температуре, после чего их распаковывают и помещают обратно в комнату для выращивания при 21 С. Погружение повторяют через 1-2 недели для увеличения количества трансформированных семян. Семена собирают через 3-4 недели после обработки, высушивают в специальных конвертах для достижения подходящей длины для каждого экотипа, стерилизуют и высаживают на планшет с агаром Noble,содержащем селективные антибиотики и противогрибковый агент. Позитивные трансформанты пересаживают в контейнеры Arasystem (Betatech), выращивают до зрелых форм внутри защитной системы Aracon, после чего аккуратно собирают семена. Для подтверждения наличия и экспрессии рекомбинантного гена тридцать два трансформированных растения вида Arabidopsis (поколение Т 1) скринируют с помощью ПЦР и ПЦР с обратной транскриптазой. Геномную ДНК экстрагируют из листьев растений, трансформированных конструктом полноразмерного Gm-морицина, с помощью Extract-N-Amp ПЦР и набора реагентов Extract-N-Amp (Sigma). ПЦР на экстрактах осуществляют с помощью праймеров, специфичных для гена Gm-морицина А (LMxho5, 5'-CTCGAGAACAATGATTTTTAATGTGTTCATAGAC-3' (SEQ ID NO: 42. Для анализа с помощью ПЦР с обратной транскриптазой отбирают 8 растений, трансформированных конструктом полноразмерного Gm-морицина А. Листья указанных растений быстро замораживают и измельчают с помощью ступки и пестика в жидком азоте. РНК выделяют с помощью набора RNeasy Plant (Qiagen). Из РНК получают кДНК с помощью набор для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad). ПЦР осуществляют с использованием 1 мкл кДНК, рекомбинантной tag-полимеразы (Invitrogen) при температуре отжига 54 С при помощи специфических для Gmморицина А праймеров (LMxho5 и LMxba3). 3 мкл из каждых 25 мкл реакционной смеси для ПЦР визуализируют на 1,2% агарозном геле. Т 1 сеянцы могут быть пересажены и культивированы до образования семян; через два поколения можно в итоге выделить гомозиготные Т 3 семена. Методика инокуляции с использованием Fusarium oxysporum Штамм Fusarium oxysporum, патогенный для растений вида Arabidopsis, получают из базы J. Manners (CSIRO Plant Industry, Queensland, Australia). Грибковый изолят содержат на картофельнодекстрозном агаре (PDA, от англ. Potato Dextrose Agar) с соотношением компонентов равном 1/2. Из грибкового изолята выделяют ядра, которые засевают в 500 мл картофельно-декстрозного бульона (PDB). Колбы инкубируют в шейкере в течение 7 дней при температуре 28 С. Перед подсчетом в счетной камере инокулят пропускают через фильтр. Споры разводят стерильной дистиллированной водой и используют для инокуляции растений вида Arabidopsis. Для анализа культивируют несколько экотипов растений Arabidopsis, включая экотип Columbia 0(Col-0), Landsberg erecta (L-er) и Sg-1 (полученные на базе CSIRO Plant Industry, Canberra, Australia). Растения Arabidopsis, используемые для указанной процедуры, выращивают отдельно в "моментальных" горшках в течение приблизительно 2-3 недель. Полив растений осуществляют приблизительно за 4 дня до инфицирования. Растения Arabidopsis инокулируют путем добавления спор (5 мл 2106-1107 спор/мл) непосредственно в почву рядом со стеблями. Растения инкубируют при 25 С; признаки увядания и/или гибели оценивают приблизительно через 10-12 дней после инокуляции. Для дополнительной оценки тяжести возникших изменений в каждом специфическом генотипе, используют олигонуклеотидные праймеры (Fol8Sits-F, 5'-CGCCAGAGGACCCCTAAAC-3' (SEQ ID NO: 43)- 28012569 и Fol8Sits-R, 5'-ATCGATGCCAGAACCAAGAGA-3' (SEQ ID NO: 44 для амплификации участка 18S рРНК из F.oxysporum. Праймеры демонстрируют незначительную гомологичность или даже ее отсутствие с РНК Arabidopsis и предназначены для выявления различий в количестве РНК грибов по сравнению с РНК растений. Результаты и обсуждение У всех трех экотипов растений Arabidopsis (Co-0, L-er, Sg-1) были выявлены симптомы заболевания после инфицирования F. oxysporum. Наиболее серьезные повреждения генотипа были обнаружены у экотипа Sg-1, которые появились уже на 6 день после инфицирования. Количественная ПЦР РНК, выделенной из листьев инфицированных растений Со-0 и L-er, выявила наличие РНК F. oxysporum даже в том случае, когда внешние проявления болезни были скудными, что подтверждает тот факт, что инфицирование произошло. Растения вида Arabidopsis (экотип S-er) трансформируют тремя конструктами Gm-морицина А, а семена выращивают в присутствии канамицина с последующей селекцией. Показатели трансформации(процент полученных сеянцев Т 1 по отношению ко всем высеянным семенам) составили 0,53, 0,85 и 0.25% для зрелого Gm-морицина А без сигнального пептида, полноразмерного Gm-морицина А, включая его нативный сигнальный пептид, и белка слияния Gm-морицина А и сигнального пептида хитиназы,соответственно. ПЦР геномной ДНК, выделенной из листьев растений, трансформированных конструктом полноразмерного Gm-морицина А, выявила, что все растения содержат трансген. Дополнительный анализ 8 случайно отобранных трансформированных растений, имеющих ген полноразмерного Gmморицина А, осуществляют с помощью ПЦР с обратной транскриптазой. Транскрипты были обнаружены во всех 8 линиях, что свидетельствует об эффективной экспрессии гена Gm-морицина А. Методики, аналогичные описанным здесь, могут использоваться для экспрессии других белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, таких, как Gm-морицин В, Gm-морицин С 1 и/илиGm-морицин С 2, у растений. Пример 5. Получение и использование антисыворотки Gm-морицина A G. Mellonella. Антитела к синтетическому Gm-морицину А получают с помощью стандартных методик (см., например, Ed Harlow and David Lane (издатели) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988 for subcutaneous injection of New Zealand white rabbits at the Institute for Medical and Veterinary Science (Adelaide, Australia). Одного кролика иммунизируют по стандартной методике, с помощью первичной инъекции 1 мг пептида с последующими тремя бустер-инъекциями в дозе 0,83 мг. Второму кролику вводят 0,1 мг пептида вместе с гидроксидом алюминия с тремя последующими бустеринъекциями пептида в дозе 0,83 мг совместно с гидроксидом алюминия. После последней бустеринъекции у каждого кролика собирают приблизительно 40 мл сыворотки. Антисыворотку используют без дополнительной очистки и анализируют ее с помощью ELISA, дот-блот анализа и вестерн-блоттинга. Электрофорез белков осуществляют с использованием 10% Бис-Трис NuPAGE Novex гелей (Invitrogen) и сепарирующего буфера MES, согласно рекомендациям производителя. Вестерн-блоттинг осуществляют с использованием 0,2 мкл нитроцеллюлозной мембраны Trans-Blot (BioRad) на полусухом блоттере Novablot при 0,8 мА/см 2 в буфере для блоттинга (25 мМ Бицина, 25 мМ Бис-Трис, 1 мМ ЭДТА,рН 7.2), содержащем 20% метанол. Мембрану обрабатывают при комнатной температуре TBS, содержащем 0,1% Твин-20, с тремя отмываниями продолжительностью 5 мин между всеми этапами. Указанные этапы включают: блок в течение ночи 3% BSA, инкубацию пептидной антисывороткой в течение 1 ч(разведение 1/250-1/500) и инкубацию конъюгатом антисыворотки кролика и IgG к алкалин фосфатазе(NTB) и 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата (BCIP) (Promega) в субстратном буфере (100 мМ Трис-Сl, 5 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, рН 9.5). С помощью Вестерн-блоттинга возможно определить 50 нг, возможно меньше, Gm-морицина А на геле SDS-PAGE при разведении антисыворотки 1/250. Антисыворотка оказалась высокоспецифичной,поскольку при Вестерн-блоттинге на геле SDS-PAGE с нанесением 1 мкг синтетических пептидов был определен только Gm-морицин А, другие пептиды, такие как Gm-морицин В, морицин В. mori или неродственный контрольный пептид выявлены не были. Пример 6. Экспрессия Gm-морицина A G. mellonella в клетках насекомых.Gm-морицин А экспрессируют в клетках Sf21 с помощью рекомбинантного бакуловируса, полученного по методике GATEWAY (Invitrogen). Конструируют праймеры, включающие attB1 и attB2 участки распознавания сигнальных последовательностей, связанные с контольными последовательностями эукариот, и Gm-морицин А-специфические последовательности (Lm1attB1, 5'-attB1-TCGAAGGAGATCCTTCTGTTTTTAATGTGTTCATAGAC-3' (SEQ ID NO: 46. Указанные праймеры используют с полимеразой Pfx (Invitrogen) для амплификации ПЦР продукта Gm-морицинА-attB. ПЦР продукт (100 фмоль) с помощью встраивающего вектора pDONR201 переносят в нужный бакуловирусный вектор pDEST-8 согласно инструкциям производителя. Продукты трансформации отбирают на планшете с ампициллином, в плизмиды получают с помощью мини-набора для очистки плазмид FastPlasmid (Eppendorf). Структуру позитивных продуктов трансформации подтверждают с помощью ПЦР, расщепления с помо- 29012569 щью ферментов-рестриктаз и анализа последовательностей. ДНК плазмиду pDEST-8-Gm-морицин А переносят в компетентную клеточную линию DH10Bac(Invitrogen) с помощью метода теплового шока при 42 С в течение 45 с, охлаждают на льду в течение 2 мин и выращивают на среде SOC в течение 3 ч при 37 С при встряхивании. После инкубации в течение ночи при 37 С белые колонии собирают на планшеты LB, содержащие тетрациклин, гентамицин, канамицин, изопропилтиогалактозид (IPTG) и 5-бромо-4-хлоро-3-индолил -D-галактозид (X-gal). Бакмидную ДНК выделяют из культуры клеток, выращиваемых в течение ночи при 37 С, с помощью стандартной методики "Bac-to-Bac" (Invitrogen) и скринируют на наличие гена Gm-морицина А с помощью ПЦР с использованием М 13 прямых и обратных праймеров. Бакмидную ДНК переносят в Sf21 клетки с помощью липосомального агента для трансфекции DOTAP (Roche) и выращивают в среде BaculoGold Мах-ХР, не содержащей сыворотку (BD Biosciences), на 6-луночном планшете. Инкубация в течение приблизительно 90 ч при 27 С приводит к значительному клеточному патогенезу. Супернатант удаляют и очищают, а клеточный материал собирают путем соскабливания в свежую среду, центрифугирования и повтороного суспензирования в 50 мМ Трис с рН 68. Для анализа экстракта Sf21 клеток на наличие мРНК Gm-морицина А, РНК обрабатывают с помощью специального набора Perfect RNA (Eppendorf). ПЦР с обратной транскриптазой осуществляют с помощью набора для ПЦР Superscript II (Gibco) и праймеров Lm2attB1 и Lm2attB2. Образцы клеток и супернатанта обрабатывают с помощью С 18 твердофазовой экстракции и тестируют в отношении активности против F. graminearum (см. пример 1) и на наличие Gm-морицина А с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антисыворотки Gm-морицина А (см. пример 5). Результаты и обсуждение Анализ РНК и ПЦР с обратной транскриптазой подтвердили наличие иРНК Gm-морицина А в экстракте Sf21 клеток. Образцы клеток и супернатанта, обработанные с помощью С 18 твердофазовой экстракции, демонстрируют активность в отношении F. graminearum. Результаты Вестрен-блоттинга позволяют предположить, что полностью процессируемый Gm-морицин А образуется в клетках и секретируется в супернатант. Полученные результаты подтверждают, что бакуловирусная система обладает способностью к продукции правильно процессируемого Gm-морицина А с антигрибковой активностью. Специалисту в данной области очевидно, что в настоящее изобретение могут быть внесены различные вариации и/или модификации, согласно специфическим вариантам осуществления настоящего изобретения, без органичения его сущности. Представленные здесь варианты осуществления настоящего изобретения во всех аспектах должны рассматриваться как иллюстрирующие, а не ограничивающие. Все ссылки на публикации, включенные в настоящее описание, представлены во всей полноте. Все обсуждения документов, актов, материалов, методов, статей и т. п., включенные в описание настоящего изобретения, приведены исключительно с целью дополнительной характеристики контекста настоящего изобретения. Ссылки