Способ стабилизации белков

012281 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение, по существу, относится к способу получения стабилизированного исходного раствора мономерного белка приготовлением исходного материала мономерного белка в буферном растворе и добавлением определенного наполнителя(ей) к исходному раствору. Уровень техники изобретения Интерфероны являются цитокинами, т.е. растворимыми белками, которые передают сигналы между клетками и играют решающую роль в иммунной системе, способствуя уничтожению микроорганизмов,которые вызывают инфекционное заболевание, и способствуя репарации любого возникшего повреждения. Интерфероны естественным образом вырабатываются инфицированными клетками и впервые были идентифицированы в 1957 г. Свое название интерфероны получили в связи с тем, что они препятствуют вирусной репликации и продукции. Интерфероны проявляют как противовирусную, так и антипролиферативную активность. На основании биохимических и иммунологических свойств природные интерфероны человека классифицируют в три основных класса: интерферон- (лейкоцитарный), интерферон- (фибробластный) и интерферон(иммунный). В настоящее время в Соединенных Штатах и других странах разрешено применение интерферона для лечения злокачественного ретикулоэндотелиоза, остроконечных кондилом, саркомы Капоши (рака, обычно поражающего пациентов, страдающих синдромом приобретенного иммунного дефицита (AIDS; СПИД и хронических гепатитов не А, не В. Кроме того, интерфероны (IFN) представляют собой гликопротеины, продуцируемые в организме в ответ на вирусную инфекцию. Они ингибируют размножение вирусов в защитных клетках. Состоящие из низкомолекулярного белка IFN являются в высшей степени неспецифическими по своему действию, т.е.IFN, индуцируемый одним вирусом, оказывается эффективным в отношении большого разнообразия других вирусов. Однако они обладают видовой специфичностью, т.е. IFN, продуцируемый одним видом,будет стимулировать противовирусную активность только в клетках того же самого или близкородственного вида. IFN оказались первой группой цитокинов, которые стали использовать из-за их потенциальной противоопухолевой и противовирусной активности. Три основные группы IFN упоминают как IFN-, IFN- и IFN-. Упомянутые основные типы IFN первоначально классифицировали в соответствии с их клеточным источником (лейкоцит, фибробласт и Т-клетка). Однако стало ясно, что несколько разных типов IFN может вырабатываться одной клеткой. Следовательно, лейкоцитарный IFN в настоящее время называют IFN-, IFN фибробластов представляет собой IFN-, а IFN Т-клеток является IFN-. Также существует четвертый тип IFN, лимфобластоидныйIFN, продуцируемый клетками линии Намальва (линия получена из лимфомы Беркитта), которые, повидимому, вырабатывают смесь как лейкоцитарного, так и фибробластного IFN. Единица интерферона или международная единица интерферона (Ед. или МЕд. для международных единиц) установлена как мера активности IFN, определяемая как количество, необходимое, чтобы защитить 50% клеток от вирусного поражения. Исследование, применяемое для оценки биоактивности, представляет собой исследование ингибирования цитопатического действия, которое описано (Rubinstein, et а 1., 1981; Familletti, P.С, et al., 1981). В упомянутом противовирусном исследовании интерферона приблизительно 1 Ед./мл интерферона составляет количество, необходимое, чтобы вызвать 50% цитопатическое действие. Единицы устанавливают относительно международного контрольного стандарта, Hu-IFN, поставляемого Международным институтом Здоровья (Pestka, S. 1986). Каждый класс IFN содержит несколько разных типов IFN. Каждый из IFN- и IFN- представляет собой продукт индивидуального гена. Белки, классифицируемые как IFN-, являются наиболее разнообразной группой, содержащей приблизительно 15 типов белков. Имеется кластер генов IFN- на хромосоме 9, содержащий по меньшей мере 23 представителя, из которых 15 являются активными и транскрибируемыми. Зрелые IFN- не гликозилированы. Все IFN- и IFN- одинаковы по длине (165 или 166 аминокислот) и имеют сходную биологическую активность. IFN- содержат 146 аминокислот в длину и характеризуются меньшим сходством с классамии . Только IFN- могут активировать макрофаги или индуцировать созревание Т-клетоккиллеров. Описанные новые типы терапевтических средств иногда называют модификаторами биологического ответа (BRM), так как они влияют на ответ организма на опухоль, воздействуя на распознавание через иммуномодуляцию. Интерферон фибробластов человека (IFN-) проявляет противовирусную активность, а также может стимулировать природные клетки-киллеры против опухолевых клеток. IFN- представляет собой полипептид приблизительно в 20000 Да, индуцируемый вирусами или двухцепочечными РНК. Из нуклеотидной последовательности гена фибробластного интерферона, клонированного с использованием технологии рекомбинантных ДНК (Derynk et al., 1980), вывели полную аминокислотную последовательность белка. Белок содержит в длину 166 аминокислот.Shepard et al. (1981) описал мутацию по основанию 842 (CysTyr в положении 141), которая уничтожает его противовирусную активность, и вариантный клон с делецией нуклеотидов 1119-1121.Mark et al. (1984) ввели искусственную мутацию заменой основания 469 (T) посредством (А), вызывая аминокислотное переключение CysSer в положении 17. Описано, что полученный IFN- является таким же активным, как и нативный IFN-, и стабилен при длительном хранении (-70C). Ребиф (Serono - рекомбинантный интерферон- человека), наиболее поздняя разработка в терапии интерфероном рассеянного склероза (MS), представляет собой интерферон(IFN)1 а, продуцируемый линиями клеток млекопитающих. Его рекомендуемым международным непатентованным названием(INN) является интерферон 1 а. Как и в случае всех фармацевтических средств на основе белка, одним из главных препятствий, которые необходимо преодолеть при применении IFN- в качестве терапевтического средства, является потеря фармацевтической ценности, что может быть результатом его нестабильности в фармацевтических препаратах. Физическая нестабильность, которая угрожает активности и эффективности полипептида в фармацевтических препаратах, включает в себя денатурацию и образование растворимых и нерастворимых агрегатов, тогда как химическая нестабильность включает в себя гидролиз, образование имида, окисление, рацемизацию и дезамидирование. Некоторые из названных превращений, как известно, приводят к потере или снижению фармацевтической активности представляющего интерес белка. В других случаях,точное воздействие упомянутых превращений не известно, но, как полагают, полученные продукты деградации все же являются фармацевтически неприемлемыми вследствие возможных нежелательных побочных эффектов. Стабилизация полипептидов в фармацевтических композициях остается областью, в которой опыт и заблуждение играют важную роль (обсуждает Wang (1999) Int. J. Pharm. 185:129-188; Wang and Hanson(1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42:S3-S26). Наполнители, которые добавляют в полипептидные фармацевтические препараты для повышения их стабильности, включают в себя буферы, сахара, поверхностноактивные вещества, аминокислоты, полиэтиленгликоли и полимеры, но стабилизирующее действие перечисленных химических добавок варьирует в зависимости от белка. Современные технологии приготовления белковых лекарственных средств включают применение наполнителей в конечных препаратах белков. Однако названные препараты остаются частично нестабильными. Кроме того, белки, которые являются биологически активными в виде мономеров, т.е. мономерных белков, имеют тенденцию к полимеризации и агрегации при нагрузках (например, температурном стрессе). Следовательно, существует потребность в способе, который улучшает растворимость белков и повышает стабильность мономерных белков особенно в отношении агрегации и олигомеризации, таким образом, увеличивая их фармацевтическую ценность. Краткое изложение изобретения В первом аспекте в изобретении предусматривают способ приготовления стабилизированного исходного раствора мономерного белка, способ, включающий в себя стадии:a) приготовления исходного материала мономерного белка в буферном растворе иb) добавления наполнителя к исходному материалу, при этом наполнитель выбирают из группы, состоящей изxi) бактериостатического средства, антиоксиданта и поверхностно-активного вещества. Кроме того, исходный белок также можно инкубировать при определенной температуре или до, или после осуществления способа в соответствии с первым аспектом изобретения. Во втором аспекте в изобретении предусмотрено получение предварительно обработанного исходного белка, полученного способом в соответствии с первым аспектом изобретения. В третьем аспекте в изобретении представлен способ повышения и/или поддержания стабильности мономерного белка, включающий в себя способ приготовления препрепарата исходного материала белка, полученного способом в соответствии с первым аспектом изобретения. Описание чертежей Фиг. 1 - метод термической диссоциации в лабораторном масштабе. Фиг. 1 относится к методу термической диссоциации в небольшом лабораторном масштабе примера 1a, связанной с влиянием температуры инкубации и времени инкубации на стабилизацию исходного-2 012281 материала интерферона. Фиг. 1 соответствует табл. 4. Результаты SE-ВЭЖХ 0,9 мл исходных образцов после 4F/T. На фиг. 2 представлены результаты термической диссоциации в лабораторном масштабе при 29 С после циклов 4F/T примера 1b. На оси Y приведены значения в процентах. На оси X указаны определяемые формы r-h IFN1a, то есть агрегаты, димеры или мономеры. Первая колонка каждой определенной формы является контролем и соответствует исходному препрепарату, который подвергали оттаиванию при RT (комнатной температуре) в течение 2 ч, а затем хранили при -4 С. Вторая колонка каждой определенной формы соответствует исходному препрепарату, который подвергали оттаиванию при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем инкубировали при 29 С в течение 3 ч. Третья колонка каждой определенной формы соответствует исходному препрепарату, который подвергали оттаиванию при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем инкубировали при 29 С в течение 15 ч. Последняя или четвертая колонка каждой определенной формы соответствует препрепарату, который подвергали оттаиванию в бане, а затем инкубировали при 29 С в течение 15 ч. Данные фиг. 2 соответствуют табл. 11. Фиг. 3 - результаты SE-ВЭЖХ 200 мл исходных образцов после 2F/T. На фиг. 3 представлены результаты термической диссоциации в лабораторном масштабе при 29 С после циклов 2F/T примера 1b. На оси Y приведены значения в процентах. На оси X указаны определяемые формы r-h IFN1a, т.е. агрегаты, димеры или мономеры. Первая колонка каждой определенной формы является контролем и соответствует исходному препрепарату, который подвергали оттаиванию при комнатной температуре в течение 7 ч, а затем хранили при -4 С. Вторая колонка каждой определяемой формы соответствует исходному препрепарату, который подвергали оттаиванию при комнатной температуре в течение 7 ч, а затем инкубировали при 29C в течение 15 ч. Фиг. 3 соответствует табл. 12. Фиг. 4 - кинетика термической диссоциации в лабораторном масштабе F/TX1. Процент мономеров в зависимости от времени. На фиг. 4 отражен процент мономеров r-h IFNla в зависимости от времени при инкубации при 29C и следующего цикла 1 F/T. На оси Y приведены значения в процентах. На оси X указано время в часах. Результаты фиг. 4 представлены в табл. 14. Фиг. 5 - кинетика термической диссоциации в лабораторном масштабе F/TX1. Процент димеров в зависимости от времени. На фиг. 5 представлен процент димеров r-h IFN1a в зависимости от времени при инкубации при 29C и следующего цикла 1 F/T. Ha оси Y отложены величины в процентах. На оси X отложено время в часах. Результаты, изображенные на фиг. 5, представлены в табл. 14. Фиг. 6 - кинетика термической диссоциации в лабораторном масштабе F/TX1. Процент агрегатов в зависимости от времени. На фиг. 6 приведен процент агрегатов r-h IFN1a в зависимости от времени при инкубации при 29 С и следующего цикла 1 F/T. Ha оси Y отложены проценты. На оси X отложено время в часах. Результаты, показанные на фиг. 6, представлены в табл. 14. Фиг. 7 - схема приготовления препрепарата для примера 2. На фиг. 7 представлена схема примера 2, которая связана с минимизацией олигомеризации r-h IFN-1a во время стадий обработки от фракции SEC-EL до хранения конечной лекарственной формы (FDF),с тем, чтобы получить стабилизированный исходный интерферон-. Схема также описана в разделе 6.2 примера 2. Фиг. 8 - схема исследования препрепарата примера 3. На фиг. 8 представлена схема исследования препрепарата примера 3, которое направлено на минимизацию олигомеризации r-h IFN1a и в котором используют два различных способа, скоростное ультрацентрифугирование и SE-ВЭЖХ, для оценки уровня мономера r-h IFN1a после стабилизации исходного IFN-. Схема описана также в разделах 6.1 и 6.2 примера 3. Подробное описание изобретения Данное изобретение относится к способу приготовления стабилизированного исходного раствора мономерного белка, включающему в себя стадии:a) приготовления исходного материала мономерного белка в буферном растворе иb) добавления наполнителя к исходному материалу, при этом наполнитель выбирают из группы состоящей изxi) бактериостатического средства, антиоксиданта и поверхностно-активного вещества. В действительности установлено, что если стабилизацию осуществляют путем добавления к исходному белку одного или более наполнителей, что описано подробно в патентной заявке, стабильность приобретается от момента, когда добавляют один или более наполнителей к исходному белку, до конечной утилизации препарата, содержащего белок, например конечного потребления пациентом. Таким образом, стабилизация имеет место не только на стадии хранения, но и на всех стадиях в процессе жизнедеятельности белка до его утилизации, т.е. до, во время и после хранения. Способ согласно изобретению,таким образом, дает возможность нейтрализовать различные стрессы, которые белок или белковый препарат может претерпевать на протяжении его жизни. Таким образом, стабилизация имеет место не только при производстве, но также и при транспортировке, хранении и процессах доставки. Изобретение также охватывает стабилизированный исходный материал, полученный способом согласно изобретению, также называемый предварительно приготовленным исходным материалом. Используемый в описании термин препрепараты относится к препаратам, содержащим исходный мономерный белок. Стабильность названных препрепаратов рассматривают не только с точки зрения снижения агрегации и олигомеризации, но также обсуждают и другие типы вредных процессов, такие как окисление, дезамидирование и так далее. По существу, в данном изобретении также рассматриваются любые другие типы процессов, оказывающих влияние на стабильность мономерного белка. Термин во время хранения относится к препарату или композиции, которые сразу после их получения не вводятся пациенту. Эти препараты упаковывают для хранения либо в жидкой форме, либо в другой форме, подходящей для введения субъекту. Под термином высушенная форма подразумевают препарат или композицию, которые высушивают либо сушкой путем вымораживания, либо сушкой путем распыления, либо воздушной сушкой. Образование агрегата или олигомера мономерным белком или любыми другими структурами фармацевтического препарата может оказывать вредное влияние на биологическую активность мономерного белка,приводя к потере терапевтической эффективности фармацевтического препарата. Кроме того, образование агрегата или ологимера может вызывать другие проблемы, такие как засорение систем трубок, мембран или насосов, когда фармацевтическую композицию, содержащую мономерный белок, вводят, используя инфузионную систему. Термин стабильность относится к относительному преходящему постоянству активности белка,такой как противовирусная активность, и/или белковой структуре и имеет по необходимости функциональное определение. Термин стабильность также относится к физической, химической или конформационной стабильности препрепаратов интерферона согласно изобретению (включая поддержание биологической активности). Нестабильность белкового препрепарата может быть вызвана химической деградацией или агрегацией белковых молекул с образованием более высокомолекулярных полимеров,дегликозилирования, модификации гликозилирования, окисления или любых других структурных модификаций, которые снижают по меньшей мере одну биологическую активность мономерного белка,включенного в данное изобретение. Стабильный препрепарат представляет собой препарат, в котором степень деградации, модификации, агрегации, потери биологической активности и прочих белков, находящихся в нем, приемлемым образом контролируется и со временем не возрастает нежелательным образом. Термин стабилизированный относится к мономерному белку или препарату, содержащему мономерный белок согласно изобретению с повышенной и/или поддерживаемой стабильностью по сравнению с мономерными белками или препаратами, приготовленными в отсутствие наполнителя, описываемыми в изобретении, добавленного к исходному мономерному белку или препарату, содержащему мономерный белок. Используемый в описании термин стабилизация используют взаимозаменяемо с выражением снижение или/и предупреждение белковой агрегации, и/или снижение или/и предупреждение белковой олигомеризации, и/или снижение и/или предупреждение образования агрегатов, и/или снижение и/или предупреждение полимеризации, и/или снижение и/или предупреждение окисления, и/или снижение и/или предупреждение образования мицеллы(л), и/или снижение и/или предупреждение дезамидирования, и/или снижение и/или предупреждение вредного действия любого вида процесса в мономерном белке или препарате, содержащем мономерный белок. Термины мономер или мономерный относятся к молекуле, имеющей только одну пептидную цепь. В описании термины исходный белок, или исходный материал белка, или исходный мономерный белок, или исходный материал мономерного белка относятся к состоянию белка или мономерного белка, который уже подвергли стадиям очистки процесса обработки, но еще не подвергли конечным стадиям технологии приготовления препарата, позволяющие получить конечную лекарственную форму (FDF) или фармацевтическую композицию, которую, в конце концов, упаковывают и распространяют для сбыта. Таким образом, исходный материал рекомбинантного белка, рассматриваемый в изобретении, представляет собой продукт, полученный в конце процесса очистки, но прежде, чем полу-4 012281 ченный продукт подвергают конечным стадиям технологии приготовления препарата. Другими словами,способ согласно изобретению можно рассматривать как способ, включающий в себя стадию препрепарата, позволяющую получить предварительно обработанный исходный материал, который при последующем добавлении других наполнителей будет превращен в конечную лекарственную форму или фармацевтическую композицию. Обычно предварительно обработанный или необработанный исходный материал хранят до получения конечного препарата, но не обязательно. Если хранят в замороженном состоянии, исходный белок обычно подвергают оттаиванию, фильтруют, а затем, но не обязательно,подвергают конечным стадиям технологии приготовления препарата. В соответствии с определенным осуществлением согласно изобретению, в случае, когда белок представляет собой рекомбинантный человеческий интерферон 1a (r-hIFN1a), стабилизирующий наполнитель добавляют в элюат конечной хроматографической стадии, которая может быть, например,вытеснительной хроматографией (SEC), упоминаемый в описании как "SEC-EL" или "SEC-EL2", или перед проведением стадии фильтрования, или сразу после стадии фильтрования (см. примеры). В таком случае SEC представляет собой конечную стадию способа очистки. В других способах очистки другие хроматографические методы или методы разделения можно использовать на конечной стадии, или другие способы очистки можно применять, когда не уверены в способах разделения в качестве конечной стадии очистки; это не должно никоим образом ограничивать объект исследования согласно изобретению, который определили термином исходный белок. Поскольку стабилизирующий наполнитель добавляют после процедуры очистки, можно использовать любой способ(ы) очистки, если он включен в данное изобретение. Кроме того, упомянутые стабилизирующие наполнители в данном изобретении также можно добавлять еще к конечному препарату (FDF). Таким образом, наполнители,содержащиеся в FDF, могут соответствовать наполнителям, которые не обязательно добавляют к исходному препрепарату. Используемые в описании термины олигомерный белок или олигомер относятся к мультисубъединичному белку, имеющему две или более полипептидных цепей. Олигомерный белок иногда упоминают как белок, в котором две или более его единиц являются идентичными полипептидными цепями. Различают по меньшей мере три типа олигомеров: легко обратимые, нековалентные малые олигомеры (димер, тример, тетрамер и т.д.); необратимые, нековалентные олигомеры; ковалентные олигомеры (например, дисульфиды). Мультимерные белки соответствуют описанию белка, состоящего из нескольких субъединиц. Термин субъединица относится к одной из идентичных или неидентичных белковых молекул, которые составляют мультимерный белок. Термин олигомеризация относится к химическому процессу создания олигомеров из более крупных или более мелких молекул. Олигомеризацию также упоминают как процесс превращения мономера или смеси мономеров в олигомер. Термин олигомеризация также относится к образованию мультимеров из индивидуальных белковых молекул через нековалентное или ковалентное взаимодействие. Олигомеризация может быть обратимой или необратимой. Термин полимеризация относится к химическим реакциям, в результате которых образуются полимеры повторяемой комбинации мономеров для создания длинных или больших молекул, или к процессу превращения мономера или смеси мономеров в полимер. Термин агрегация относится к образованию высокомолекулярных видов главным образом вследствие нековалентного сцепления более мелких видов. По существу, для белков агрегация является формой денатурации, при которой неполярные поверхности вторичных структур, например поверхности спиралей и -структур, которые обычно образуют внутримолекулярные взаимодействия и спрятаны внутри белка, могут взаимодействовать межмолекулярно и образовывать мультимолекулярные формы,которые иногда являются нерастворимыми. Термины нерастворимый в сравнении с растворимым иногда употребляют как необратимый в сравнении с обратимым соответственно. Агрегаты также можно характеризовать как большие олигомерные белковые ассоциации (например, более чем 10 мерные). Агрегаты могут быть обратимыми, если они нековалентные. Данное изобретение не следует ограничивать определениями агрегация, агрегат(ы), олигомер(ы), мультимер(ы), олигомеризация, мультимеризация, мультимерный, олигомерный,полимеризация, можно использовать любые определения. Таким образом, сферу действия согласно изобретению не следует ограничивать приведенными терминами или любой теорией, близкой им. Важным фактом является то, что агрегаты и олигомеры можно отличить один от другого методами детекции (например, ВХ-ВЭЖХ), обычно по отдельным разделенным, различимым сигналам, например по отдельным пикам; каждый из пиков соответствует или агрегатам, или олигомерам. Аналогично, мономерная форма белка соответствует четкому уникальному определенному пику. Термин буфер или физиологически подходящий буфер относится к раствору соединений, которые, как известно, являются безопасными при фармацевтическом применении или применении в ветеринарных препаратах и которые поддерживают или контролируют рН препарата в диапазоне рН, тре-5 012281 буемом для данного препарата. Подходящие буферы для регулирования рН от умеренно кислого значения рН до умеренно основного рН, без ограничения, включают в себя такие соединения как фосфат, ацетат, цитрат, аргинин, трис и гистидин. Трис относится к 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиолу и к любой его фармацевтически подходящей соли. Предпочтительными буферами являются ацетатные буферы с физиологическим раствором или подходящей солью. Изотоническое средство представляет собой соединение, которое является физиологически толерантным и придает подходящий тонус препарату, чтобы предотвратить чистый ток воды через клеточные мембраны, которые находятся в контакте с препаратом. Соединения, такие как глицерин, обычно используют для этих целей в известных концентрациях. Другие подходящие изотонические средства, без ограничения, включают в себя аминокислоты или белки (например, глицин или альбумин), соли (например, хлорид натрия) и сахара (например, декстроза, маннит, сахароза и лактоза). Предпочтительным изотоническим средством является маннит. Термин антиоксидант относится к соединению, которое препятствует взаимодействию кислорода или свободных радикалов кислорода с другими веществами. Антиоксиданты относятся к ряду наполнителей, обычно добавляемых в фармацевтические системы, чтобы повысить физическую и химическую стабильность. Антиоксиданты добавляют, чтобы минимизировать или замедлить окислительные процессы, которые происходят с некоторыми лекарственными средствами или наполнителями при экспозиции с кислородом или в присутствии свободных радикалов. Упомянутые процессы часто могут катализироваться излучением, температурой, концентрацией водорода, в присутствии следов металлов или перекисями. Сульфиты, бисульфиты, тиомочевину, метионин, соли этилендиаминтетрауксусной кислоты(EDTA), бутилированный гидрокситолуол (BHT) и бутилированный гидроксианизол (BHA) часто используют как антиоксиданты в лекарственных средствах. Установлено, что натрий-EDTA повышает активность антиоксидантов в результате образования хелатных комплексов с ионами металлов, которые иным образом будут катализировать реакцию окисления. Наиболее предпочтительным антиоксидантом является метионин. В описании антиоксиданты также называют стабилизаторами. Метионин может присутствовать или в виде свободного основания, или в солевой форме. Любой стереоизомер метионина (то есть изомер L, D или DL) можно использовать в данном способе или препарате согласно изобретению, пока метионин присутствует в виде свободного основания или в виде соли. Предпочтительно используют L-стереоизомер. Аналоги метионина также можно использовать в данном препарате согласно изобретению. Термин аналог метионина относится к производному природного метионина. Аналоги метионина также можно применять в данном препарате или в виде их свободного основания, или их соли. Повышенная и/или поддерживаемая стабильность при добавлении антиоксидантов (например, метионина) зависит от концентрации. То есть увеличивающиеся концентрации антиоксидантов приводят к повышенной и/или поддерживаемой стабильности препарата, содержащего интерферон- согласно изобретению, хотя такой препарат, содержащий интерферон-, обычно подвержен окислению или образованию агрегата/олигомера в отсутствие антиоксиданта. Определение количества оксиданта (например, метионина), которое следует использовать в данном препарате для того, чтобы уменьшить окисление или образование олигомера/агрегата, легко можно осуществить без чрезмерного экспериментирования, используя способы, в основном известные любому специалисту. Термин бактериостатическое средство относится к соединению или композициям, добавленным к препарату, которые действуют как противобактериальное средство. Консервированный, интерферонсодержащий препарат согласно изобретению предпочтительно отвечает требованиям установленных или регламентированных стандартов для фиксированной эффективности, которой должен обладать коммерчески жизнеспособный продукт многоразового применения. Примеры бактериостатических средств включают в себя фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил, этил, пропил, бутил и пр.), хлорид бензалкония, хлорид бензетония, дегидроацетат натрия и тимерозал. Предпочтительным бактериостатическим средством является бензиловый спирт. Бензиловый спирт в описании также упоминают как стабилизатор. Термин поверхностно-активное вещество относится к растворимому соединению, которое снижает поверхностное натяжение жидкостей или уменьшает межфазное натяжение между двумя жидкостями или жидкостью и твердым веществом, поверхностное натяжение является силой, действующей на поверхности жидкости, стремящейся минимизировать площадь поверхности. Поверхностно-активные вещества иногда используют в фармацевтических препаратах, включая средство доставки низкомолекулярных лекарственных средств и полипептидов, чтобы модифицировать абсорбцию лекарственного средства или средства его доставки в тканях-мишенях. Предпочтительно поверхностно-активным веществом является Твин 20 или полоксамер. Более предпочтительно поверхностно-активным веществом является полоксамер 188. Еще более предпочтительным поверхностно-активным веществом является Твин 20. Термин аминокислота относится к аминокислоте или комбинации аминокислот, при этом любая-6 012281 данная аминокислота присутствует или в виде свободного основания, или в виде соли. Когда используют комбинацию аминокислот, все аминокислоты могут присутствовать в виде их свободных оснований, все могут присутствовать в виде их солей, или некоторые могут присутствовать в виде свободных оснований, тогда как другие присутствуют в виде солей. Предпочтительными аминокислотами для применения в данном способе или препарате согласно изобретению являются аминокислоты, несущие заряженную боковую цепь, такие как аргинин, лизин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. Более предпочтительно аминокислоты представляют собой лизин и аргинин. Еще более предпочтительно аминокислота представляет собой лизин. Любой стереоизомер (т.е. изомер L, D или DL) определенной аминокислоты или комбинации этих стереоизомеров можно использовать в данном способе или препарате согласно изобретению, пока определенная аминокислота присутствует в виде свободного основания или в виде ее соли. Предпочтительно используют L-стереоизомер. Аналоги указанных предпочтительных аминокислот также можно использовать в данном способе или препарате согласно изобретению. Термин аналог аминокислоты относится к производному природной аминокислоты. Подходящие аналоги аргинина включают в себя, например, аминогуанидин и N-моноэтил-L-аргинин. Так же как и предпочтительные аминокислоты, аналоги аминокислот используют в данном способе или препарате или в виде свободных оснований или в виде их солей. Аминокислоты в описании также называют стабилизаторами. Аминокислота(ы), используемая в данном способе или препарате согласно изобретению, защищает терапевтически активный полипептид от различных стрессов, таким образом повышая или/и поддерживая стабильность мономерного белка или препарата, содержащего мономерный белок, в течение периода жизни мономерного белка (до, во время и после хранения). Следовательно, термин стресс включает в себя нагревание, замораживание, рН, излучение, перемешивание, окисление, дегидратацию, поверхности, сдвиг, замораживание/оттаивание, давление, тяжелые металлы, соединения фенола, денатурирующие средства и так далее, без ограничения перечисленным. Термин стресс охватывает любой фактор,который изменяет (т.е. снижает, поддерживает или увеличивает) стабильность (мономерного) белка или препарата, содержащего (мономерный) белок. Повышенная и/или поддерживаемая стабильность при добавлении аминокислоты зависит от концентрации аминокислоты. То есть увеличивающиеся концентрации аминокислоты приводят к повышенной и/или поддерживаемой стабильности мономерного белка или препарата, содержащего мономерный белок согласно изобретению, когда такой мономерный белок или препарат, содержащий мономерный белок, обычно агрегирует или образует олигомер в отсутствие аминокислоты. Определение количества отдельной аминокислоты, которое следует использовать в данном способе или препарате согласно изобретению, чтобы уменьшить образование олигомера или агрегата, увеличивая, таким образом, стабильность мономерного белка и повышая стабильность препарата в течение всего периода жизни мономерного белка, можно легко установить для любого отдельного, представляющего интерес мономерного белка, без чрезмерного экспериментирования, используя способы,обычно известные любому специалисту в данной области. Хранение в замороженном состоянии относится к замораживанию и сохранению ранее водного препарата мономерного белка при температуре ниже 0C, предпочтительно -20C или ниже, более предпочтительно -70C. Термин циклы замораживания/оттаивания или обработка замораживанием/оттаиванием относится к известным способам использования белкового образца при хранении в замороженном состоянии,при этом температуру образца повышают до уровня, при котором восстанавливается его водное состояние в течение достаточного периода времени, чтобы иметь возможность применить Rampie, с последующим охлаждением до температуры ниже 0C и возвращением к хранению в замороженном состоянии, предпочтительно при температуре -20C или ниже, более предпочтительно -70C. Цель согласно изобретению заключается в нейтрализации, по меньшей мере, как процессов агрегации, так и олигомеризации (изобретение не ограничено названными процессами) не только мономерного белка, а также других средств, ингредиентов или соединений, которые также добавляют к исходному белку, согласно данному изобретению. Таким образом, данное изобретение способно придавать стабильность (например, уменьшение и/или ингибирование образования олигомеров, а также агрегатов) всем соединениям, средствам (например, бактериостатическим средствам, изотоническим средствам), белкам,поверхностно-активным веществам, наполнителям, которые добавляют к исходному материалу, согласно данному изобретению, и которые будут включены в конечную лекарственную форму или фармацевтическую композицию обсуждаемого белка. Другими словами, происходит стабилизация не только (мономерного) белка, но также целого препарата, содержащего (мономерный) белок. Агрегация может не только нарушать биологическую активность, но также приводить к местным реакциям на инъекцию и иммуногенности в результате выработки нейтрализующих антител (NAbs). Представленные примеры четко показывают, что добавление определенных наполнителей к препарату исходного мономерного белка может значительно повышать стабильность и растворимость препарата мономерного белка предотвращением и/или ингибированием образования полипептидных агрегатов или олигомеров во время хранения в замороженном состоянии или/и повторных циклов замораживание/оттаивание. Кроме того, в данном изобретении демонстрируют, что термическая диссоциация оказы-7 012281 вается эффективной при стабилизации (мономерного) белка или препарата, содержащего (мономерный) белок. Используемый в описании термин термическая диссоциация относится к процессу, в результате которого белки, которые находятся в виде мультимеров, превращаются или диссоциируют до уменьшенных мультимерных форм или до мономеров под действием температуры (например, димеры белка превращаются в мономеры, когда их подвергают действию определенной температуры). Белок в препарате присутствует в многочисленных мультимерных формах (димеры, тримеры и так далее). Термическая диссоциация, таким образом, оказывает эффективное действие на превращение или диссоциацию всех мультимерных форм до уменьшенных мультимерных форм или мономерных форм. В данном изобретении показано, что существует корреляция между температурой и диссоциацией мультимеров. Как только препарат подвергают термической диссоциации, он будет содержать меньше мультимерных форм и повышенное количество мономерных форм по сравнению с препаратом, который не подвергают термической диссоциации. Предпочтительно термическая диссоциация превращает все мультимерные формы в мономерные формы. Температуру можно устанавливать сразу в виде фиксированной температуры или постепенно повышать до тех пор, пока не будет достигнута определенная температура. Кроме того, в данном изобретении демонстрируют, что продолжительность термической диссоциации оказывает эффективное влияние на стабилизацию (мономерного) белка или препарата, содержащего (мономерный) белок. В данном изобретении показывают, что имеется корреляция между продолжительностью термической диссоциации и диссоциацией указанных форм. Примеры указывают, что термическая диссоциация наиболее эффективна во время первых часов термической диссоциации до достижения определенной точки, когда продолжительность становится неэффективной. Термическая диссоциация является белокспецифической. Установление адекватных параметров, подобных температуре и продолжительности для определенного белка, чтобы достигнуть оптимальной термической диссоциации, легко может осуществить специалист в данной области, используя общепринятые способы. Специалисту в данной области известны многочисленные аналитические способы для определения продуктов деструкции, такой как агрегация, окисление, дезамидирование, расщепление, поверхностная адсорбция, поверхностная денатурация, образование циклических имидов, усечение и так далее. Способы, указывающие на стабильность, без ограничения, включают в себя высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC; ВЭЖХ), вытеснительную ВЭЖХ (SEC; SEC-ВЭЖХ) с денатурирующими веществами, такими как SDS (додецилсульфат натрия), гуанидин HCl, или органическими растворителями в образце или в подвижной фазе или без перечисленных веществ, ВЭЖХ с обращенной фазой (RP; ОФВЭЖХ), ионообменную ВЭЖХ, электрофорез, хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC), аффинную хроматографию, SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), дисульфидное восстановление с восстанавливающим агентом(ами), нативный гельэлектрофорез, капиллярный электрофорез, аналитическое ультрацентрифугирование, светорассеяние,анализ помутнения и исследование концентрации белка. Изучение структура/стабильность можно проводить методом кругового дихроизма, флуоресценции (присущей и по связыванию гидрофобного зонда), УФ, FTIR и/или методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Таким образом, влияние определенного наполнителя на агрегацию или олигомеризацию мономерного белка можно определять, например, по изменению растворимого мономерного белка в растворе в течение периода времени. Для вытеснительной ВЭЖХ или SEC-ВЭЖХ, также известной как гель-хроматография или хроматография на молекулярных ситах, колонки конструируют с пористой матрицей, которая удерживает молекулы более мелкие, чем размер пор, тогда как более крупные молекулы не допускает в поры и элюирует раньше. Изократный градиент используют для большинства применений. Данное изобретение далее описывают соответственно его различным аспектам. В первом аспекте в изобретении представляют способ приготовления стабилизированного исходного раствора мономерного белка, способ включает в себя стадии:a) приготовления исходного материала мономерного белка в буферном растворе иb) добавления наполнителя к исходному материалу, при этом наполнитель выбирают из группы, состоящей изxi) бактериостатического средства, антиоксиданта и поверхностно-активного вещества. Наполнители и их комбинации можно еще добавлять в конечный препарат (FDF), а не только к ис-8 012281 ходному материалу мономерного белка. Другими словами, наполнители можно добавлять на разных стадиях подготовки исходного материала мономерного белка, а также на конечных стадиях производственного процесса, но по меньшей мере один раз к исходному материалу мономерного белка. Предпочтительно мономерный белок представляет собой интерферон. Более предпочтительно интерферон представляет собой IFN-. Наиболее предпочтительно IFN- представляет собой человеческий рекомбинантный IFN-. Предпочтительно белок стабилизируют против агрегации или олигомеризации. Предпочтительно бактериостатическим средством является бензиловый спирт, поверхностноактивное вещество представляет собой Твин 20, изотоническим средством является маннит, аминокислоту выбирают из группы, состоящей из лизина или аргинина, а антиоксидант представляет собой метионин. Предпочтительные комбинации наполнителей. 1. Изотоническое средство представляет собой маннит, а антиоксидатом является метионин. 2. Изотоническое средство представляет собой маннит, антиоксидатом является метионин, а аминокислота представляет собой лизин. 3. Аминокислота представляет собой лизин и антиоксидант - метионин. 4. Аминокислота представляет собой лизин, антиоксидант - метионин, а поверхностно-активное вещество представляет собой Твин 20. 5. Бактериостатическим средством является бензиловый спирт и антиоксидантом является метионин. 6. Бактериостатическим средством является бензиловый спирт, антиоксидантом является метионин,а поверхностно-активным веществом является Твин 20. Кроме того, исходный белок можно инкубировать при определенных температурах, которые способствуют термической диссоциации исходного мономерного белка. Предпочтительно температурный диапазон составляет от 27 до 31 С. Наиболее предпочтительно температуру устанавливают до 29 С. Альтернативно, допускают постепенное повышение температуры до достижения определенных температур, упомянутых выше. Предпочтительно инкубацию проводят в течение по меньшей мере 3 ч или в течение периода от 6 до 40 ч. Более предпочтительно инкубацию проводят в течение периода от 15 до 30 ч или в течение 10,16, 18,5 или 24 ч. Наиболее предпочтительно инкубацию проводят в течение 24 ч. Инкубацию можно проводить до или после стадии приготовления препрепарата в соответствии с первым аспектом изобретения, но без ограничения этим. Мономерный белок, который стабилизировали в соответствии с первым аспектом, можно инкубировать на любой стадии процесса обработки, т.е. также на конечных стадиях приготовления препарата. Во втором аспекте изобретение связано с предварительно обработанным исходным белком, полученным способом согласно первому аспекту изобретения. В третьем аспекте изобретение связано со способом повышения и/или поддержания стабильности мономерного белка, включающим в себя приготовление препрепарата исходного материала белка в соответствии с первым аспектом изобретения. Далее изобретение будут описывать согласно его предпочтительному осуществлению в свете специального мономерного белка, интерферона и более предпочтительно IFN-. Используемый в описании термин интерферон или IFN предполагает включение любой молекулы, охарактеризованной, например, в литературе, содержащей, например, любые типы IFN, упомянутых в вышеприведенном разделе Уровень техники изобретения. В частности, IFN-, IFN- и IFNвключены в вышеприведенное определение. IFN- является предпочтительным IFN согласно данному изобретению. IFN-, подходящий в соответствии с данным изобретением, является коммерчески поставляемым препаратом, например, в виде ребифа (Serono), авонекса (Biogen) или бетаферона (Schering). Применение интерферонов человека также является предпочтительным в соответствии с данным изобретением. Используемый в описании термин интерферон предполагает включение его солей,функциональных производных, вариантов, аналогов и активных фрагментов. Используемый в описании термин интерферон- (IFN-) предполагает включение интерферона фибробластов, в особенности человека, который получают выделением из биологических жидкостей или который получают технологиями рекомбинантных ДНК из клеток прокариотического или эукариотического хозяина, а также его солей, функциональных производных, вариантов, аналогов и активных фрагментов. Предпочтительно IFN- означает интерферон 1a. Используемый в описании термин мутеины относится к аналогам IFN, в котором один или более аминокислотных остатков природного IFN замещают другими аминокислотными остатками или уничтожают, или один или более аминокислотных остатков добавляют в природную последовательность IFN,не изменяя значительно активность полученных продуктов по сравнению с диким типом IFN. Названные мутеины получают известными способами синтеза, и/или методами сайт-направленного мутагенеза, или любым другим известным способом, подходящим для этого. Предпочтительные мутеины включают в-9 012281 себя, например, мутеины, описанные Shepard et al., (1981) или Mark et al. (1981). Любой такой мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, достаточно дуплицированных из последовательности IFN с тем, чтобы иметь, по существу, подобную или даже лучшую активность относительно IFN. Биологическая функция интерферона хорошо известна специалистам в данной области, а биологические стандарты установлены и поставляются, например, Национальным институтом биологических стандартов и контроля (http://immunology.org/links/NIBSC). Биоисследование для определения активности IFN описано. Исследование IFN можно проводить, например, как описывает Rubinstein et al., 1981. Таким образом, стандартным экспериментированием можно установить, имеет ли любой данный мутеин, по существу, подобную или даже лучшую активность, чем IFN. Мутеины IFN, которые можно использовать согласно данному изобретению, или кодирующую нуклеиновую кислоту, следовательно, включают в конечный набор в основном соответствующих последовательностей как замещенные пептиды или полинуклеотиды, которые может получать любой из специалистов в данной области без чрезмерного экспериментирования на основании рекомендаций и руководства, представленных в заявке. Предпочтительными изменениями для мутеинов в соответствии с данным изобретением являются изменения, которые известны как консервативные замещения. Консервативные аминокислотные замещения полипептидов или белков изобретения, могут включать в себя синонимические аминокислоты в пределах группы, которые имеют достаточно похожие физико-химические свойства, так что замещение между представителями группы позволит сохранить биологическую функцию молекулы. Ясно, что вставки и делеции аминокислот также можно производить в охарактеризованных выше последовательностях без изменения их функции, особенно, если вставки и делеции вовлекают только несколько аминокислот, например, меньше тридцати и, предпочтительно, меньше десяти, и не удаляют или замещают аминокислоты, которые являются существенными для функциональной конформации, например остатки цистеина. Белки и мутеины, полученные с помощью таких делеций и/или вставок, относятся к компетенции согласно изобретению. Предпочтительно группы синонимических аминокислот являются группами, представленными в табл. 1. Более предпочтительно группами синонимических аминокислот являются группы, представленные в табл. 2; и наиболее предпочтительно группами синонимических аминокислот являются группы,приведенные в табл. 3. Таблица 1 Предпочтительные группы синонимических аминокислот- 10012281 Таблица 2 Более предпочтительные группы синонимических аминокислот Таблица 3 Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот Примеры производства аминокислотных замещений в белках, которые можно использовать для по- 11012281 лучения мутеинов IFN для применения в данном изобретении, включают в себя любые известные стадии способов, такие как представлены в патентах США 4959314, 4588585 и 4737462 от Mark et al.; 5116943 отKoths et al., 4965195 от Namen et al.; 4879111 от Chong et al. и 5017691 от Lee et al.; и лизинзамещенные белки, описанные в патенте США 4904584 (Shaw et al.). Специальные мутеины IFN- описаны, например, Mark et al., 1984. Термин слитый белок относится к полипептиду, содержащему IFN или его мутеин, слитый с другим белком, который характеризуется, например, длительным временем пребывания в биологических жидкостях. IFN, таким образом, может быть слит с другим белком, полипептидом или тому подобным,например иммуноглобулином или его фрагментом. Используемый в описании термин функциональные производные охватывает производные IFN и их мутеины и слитые белки, которые можно получать при взаимодействии с функциональными группами, имеющимися в виде боковых цепей на остатках или N- или С-концевых группах, по способам, известным в данной области, и названные производные включают в изобретение, поскольку они остаются фармацевтически подходящими, т.е. они не разрушают активность белка, которая, по существу, подобна активности IFN, и не придают токсические свойства композициям, содержащим их. Названные производные могут включать в себя, например, боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут маскировать антигенные участки и делать более продолжительным пребывание IFN в биологических жидкостях. Другие производные включают в себя сложные алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп посредством реакции с аммиаком или первичными или вторичными аминами, N-ацилпроизводные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацил-фрагментами (например, группами алканоила или карбоциклического ароила), или О-ацилпроизводные свободных гидроксильных групп (например, групп остатков серила или треонила), образованные с ацил-фрагментами. В качестве активных фракций IFN или мутеинов и слитых белков, данное изобретение включает в себя любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи молекулы белка отдельно или вместе с ассоциированными молекулами или остатками, связанными с ними, например остатками сахара или фосфата, или агрегатами белковой молекулы, или самими остатками сахара при условии, что названная фракция не характеризуется никакой значительно сниженной активностью по сравнению с соответствующим IFN. Термин соли в описании относится как к солям карбоксильных групп, так и к аддитивным солям кислоты аминогрупп белков, описанных выше, или их аналогов. Соли карбоксильной группы могут быть образованы по способам, известным в данной области, и включают в себя неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и т.п., и соли с органическими основаниями, как соли, образованные, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинином или лизином, пиперидином, прокаином и т.п. Аддитивные соли кислот включают в себя, например, соли, образованные с минеральными кислотами, например, такими как хлористо-водородная кислота или серная кислота, и соли органических кислот, например, таких как уксусная кислота или щавелевая кислота. Конечно, любые такие соли должны сохранять биологическую активность белков (IFN), относящихся к данному изобретению, т.е. способность связываться с соответствующим рецептором и инициировать рецепторную передачу сигнала. В соответствии с данным изобретением применение рекомбинантного человеческого IFN- и соединений изобретения является, кроме того, особенно предпочтительным. Недавно описали специальный вид варианта интерферона. Так называемые консенсусные интерфероны являются неприродными вариантами IFN (США 6013253). В соответствии с предпочтительным осуществлением изобретения соединения изобретения используют в комбинации с консенсусным интерфероном. Используемое в описании выражение интерферон-консенсус (IFN-con) человека будет означать неприродный полипептид, который преимущественно включает в себя те аминокислотные остатки, которые являются общими с субпопуляцией представителя IFN- большинства из последовательностей подтипа природного человеческого лейкоцитарного интерферона и которые включают в себя по одному или более из тех положений, где не имеется никакой аминокислоты, общей со всеми подтипами, аминокислоты, которая преимущественно встречается в таком положении и ни в коем случае не включает в себя любой аминокислотный остаток, который не существует в таком положении по меньшей мере в одном природном подтипе. IFN-con, без ограничения, заключает в себе аминокислотные последовательности,обозначенные IFN-con1, IFN-con2 и IFN-con3, которые описывают в патентах США 4695623, 4897471 и 5541293. Последовательности ДНК, кодирующие IFN-con, можно получать, как описывают в вышеупомянутых патентах или другими стандартными способами. В следующем предпочтительном осуществлении слитый белок содержит Ig-слияние. Слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид, который может содержать до 1-3 аминокислотных остатков по длине или длиннее, например, 13 аминокислотных остатков по длине. Названный линкер может быть трипептидом последовательности E-F-M (Glu-Phe-Met), например, или линкерной последовательностью из 13 аминокислот, содержащей Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met,- 12012281 вставленной между последовательностью IFN и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок может характеризоваться улучшенными свойствами, такими как продолжительное время пребывания в биологических жидкостях (период полувыведения), повышенная удельная активность, повышенный уровень экспрессии, или очистка слитого белка осуществляется легче. В другом предпочтительном осуществлении IFN сливают с константной областью молекулы Ig. Предпочтительно его сливают с областями тяжелых цепей, подобных, например, доменам СН 2 и СН 3IgG1 человека. Другие изоформы молекул Ig также подходят для образования слитых белков согласно данному изобретению, такие как изоформы IgG2, IgG3 или IgG4, или другие классы Ig, подобные, например, IgM или IgA. Слитые белки могут быть мономерными или мультимерными, гетеро- или гомомультимерными. В следующем предпочтительном осуществлении функциональное производное содержит по меньшей мере один фрагмент, присоединенный к одной или более функциональных групп, которые имеются в виде одной или более боковых цепей на аминокислотных остатках. Предпочтительно фрагмент представляет собой фрагмент полиэтилена (PEG; ПЭГ). Пегилирование можно проводить по известным способам, таким как способы, описанные, например, в WO 99/55377. Данное изобретение, по существу, можно применять ко всем типам интерферона, к упомянутым выше интерферонам, а также включая природный интерферон, интерферон, полученный по технологии рекомбинантных ДНК, и интерферон, полученный химическим синтезом и модификацией. К интерферону также относят неочищенный, полуочищенный и очищенный интерферон из фибробластов, лейкоцитов, лимфоцитов и любых других содержащих или продуцирующих интерферон тканей человека или любых других подходящих видов. Наиболее предпочтительно данное изобретение подходит для интерферона фибробластов человека (интерферона-). Предпочтительная концентрация IFN- в препрепарате составляет от 10 или приблизительно 10 мкг/мл до 2000 или приблизительно 2000 мкг/мл, более предпочтительно от 100 или приблизительно 100 мкг/мл до 1000 или приблизительно 1000 мкг/мл, наиболее предпочтительно 500 или приблизительно 500 мкг/мл или 810 или приблизительно 810 мкг/мл. Предпочтительно буфер присутствует в количестве, достаточном, чтобы поддерживать рН названной композиции в пределах плюс или минус 0,5 единиц определенного значения рН, где определенное значение рН составляет приблизительно от 3,5 до 5,5. Более предпочтительно рН соответствует 3,8, 4,2 или 4,7. Наиболее предпочтительно рН равно 4,7. Предпочтительно буфер присутствует в концентрации от или приблизительно от 5 мМ до или приблизительно до 500 мМ. Концентрации буфера в общем растворе могут составлять или приблизительно составлять 5, 9,5, 10, 50, 100, 150, 200, 250 и 500 мМ. Предпочтительно концентрация буфера составляет или приблизительно составляет 10 или 50 мМ. Особо предпочтительным является буфер в концентрации 50 или приблизительно 50 мМ по ацетатным ионам при рН 4,7. Предпочтительным буфером является ацетатный буфер с предпочтительными противоионами, являющимися ионами натрия или калия. Ацетатные буферы на основе физиологического раствора хорошо известны в данной области. Предпочтительно концентрация изотонического средства (например, маннита) составляет приблизительно от 0,5 приблизительно до 500 мг/мл. Более предпочтительно концентрация изотонического средства составляет 55 или приблизительно 55 мг/мл. Еще более предпочтительно концентрация изотонического средства составляет 150 или приблизительно 150 мМ, 300 или приблизительно 300 мМ или 600 или приблизительно 600 мМ. Предпочтительно концентрация поверхностно-активного вещества (то есть Твина 20) составляет приблизительно от 0,01 приблизительно до 10 мг/мл. Более предпочтительно концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,05 или приблизительно 0,05 мг/мл. Предпочтительно концентрация антиоксиданта (например, метионина) составляет приблизительно от 0,01 приблизительно до 5,0 мг/мл. Более предпочтительно концентрация антиоксиданта составляет 0,12 или приблизительно 0,12 мг/мл или 0,24 или приблизительно 0,24 мг/мл. Предпочтительной аминокислотой является лизин или аргинин. Более предпочтительной аминокислотой является лизин. Предпочтительно концентрация аминокислоты (например, лизина или аргинина) составляет приблизительно от 20 приблизительно до 200 мг/мл. Предпочтительно концентрация лизина составляет 27 или приблизительно 27 мг/мл, или 55 или приблизительно 55 мг/мл, или 82 или приблизительно 82 мг/мл, или 164 или приблизительно 164 мг/мл. Предпочтительно концентрация аргинина составляет 32 или приблизительно 32 мг/мл или 63 или приблизительно 63 мг/мл. Предпочтительно концентрация бактериостатического средства (например, бензилового спирта) составляет приблизительно от 0,01 приблизительно до 200 мг/мл. Более предпочтительно концентрация бактериостатического средства составляет 5 или приблизительно 5 мг/мл или 10 или приблизительно 10 мг/мл. Все ссылки, цитируемые в изобретении, включая журнальные статьи или рефераты, опубликованные или неопубликованные патентные заявки США или иностранные патентные заявки, полученные- 13012281 патенты США или иностранные патенты или любые другие ссылки, включены в изобретение цитированием в их полном объеме, включая все данные, таблицы, фигуры и тексты, представленные в цитируемых ссылках. Кроме того, полное содержание рекомендаций, упоминаемых в ссылках, цитируемых в изобретении, также включены цитированием в их полном объеме. Ссылка на известные стадии способа, общепринятые стадии способов, известные способы или стандартные способы никоим образом не является признанием того, что любой аспект, описание или осуществление согласно изобретению раскрыты, изложены или предполагались в соответствующей области. Предшествующее описание специальных осуществлений достаточно полно раскрывает основную сущность изобретения, что другие специалисты, применяя знания в данной области (включая содержание ссылок, цитируемых в изобретении), легко смогут модифицировать и/или адаптировать для другого применения такие специальные осуществления без чрезмерного экспериментирования, не отступая от основной концепции согласно изобретению. Поэтому такие адаптации и модификации, как полагают,должны находиться в пределах значений эквивалентов раскрытых осуществлений, на основе изложения и руководства, представленных в спецификации. Понятно, что фразеология или терминология в изобретении служит цели описания, а не ограничения так, что терминологию или фразеологию данной спецификации специалисты-профессионалы должны интерпретировать в свете изложения и рекомендаций,представленных в описании, в сочетании со знаниями любого из специалистов в данной области. Примеры Аналитические способы, используемые в следующих примерах, описывают в примере 6. Пример 1. Влияние инкубационной температуры и времени инкубации на стабилизацию исходного интерферона (термическая диссоциация). Следующие эксперименты проводили для того, чтобы оценить влияние температуры оттаивания,температуры инкубации и времени инкубации (продолжительности) на стабилизацию исходного интерферона-. Цель заключалась в эффективном и стойком снижении образования олигомеров интерферона и/или агрегатов интерферона во время процесса обработки. Следующие эксперименты первоначально проводили с исходными препаратами интерферона, хранившимися в замороженном состоянии (препараты хранили при температуре ниже 0C, например при -20 или -70C), которые сначала подвергали оттаиванию, а затем, в конце концов, инкубировали или хранили при определенной температуре и в течение определенного периода времени во время дальнейшей производственной обработки. Выводы, сделанные на основании описанных экспериментов, также можно применять к препаратам, которые хранили при температуре выше 0C (например, 2-8 С) и которые, таким образом, не подвергали стадии оттаивания(или температурным сдвигам), но которые претерпевали воздействие другого вида стрессов. Следовательно, термин период покоя относится к замороженному препарату, который подвергали оттаиванию(например, в инкубаторе, бане или другом месте), а затем хранили (например, в инкубаторе, бане или другом месте) при специальной температуре в течение определенного периода времени; термин температура периода покоя относится как к температуре оттаивания, так и к температуре инкубации; если замороженный препарат прямо помещали в инкубатор, термины температура инкубации или температура периода покоя можно использовать взаимозаменяемо; термин время периода покоя относится к сумме продолжительности оттаивания и продолжительности хранения (например, продолжительность инкубации) при определенной температуре; если замороженный препарат помещали прямо в инкубатор,термины время инкубации или время периода покоя можно использовать взаимозаменяемо. 1a. Эксперимент по термической диссоциации при различных температурах в небольшом лабораторном масштабе. В первом эксперименте исследовали влияние температуры оттаивания при каждой комнатной температуре (RT), 25, 27 или 29 С с последующей инкубацией при каждой температуре 25, 27 или 29 С в течение общего периода 16 или 24 ч. Эксперимент проводили по способу, которому не являются помехой температурные условия, которые, таким образом, поддерживали стабильно во время всей процедуры. В табл. 4, а также на фиг. 1 суммирован метод. Уровни олигомеров интерферона и агрегатов интерферона оценивали новым методом SEC-ВЭЖХ, который в описании упоминают как NEW SEC. МетодNEW SEC позволяет определять как нековалентные, так и ковалентные олигомеры как количественно,так и качественно. Цель заключалась в оптимизации термической диссоциации (TD) исходного интерферона для того,чтобы уменьшить олигомеризацию и/или агрегацию до минимальной перед получением лекарственного продукта (восстановлением нарушения) по следующим параметрам или переменным величинам: 1) влияние температуры инкубации (25, 27 и 29 С) на эффективность термической диссоциации,2) влияние продолжительности инкубации на эффективность термической диссоциации,3) сокращение продолжительности оттаивания проведением оттаивания в инкубаторе. Общее время оттаивания и инкубации составляло или 16, или 24 ч Контроль при комнатной температуре осуществляли один раз, серию 1 эксперимента проводили два раза, а серию 2 эксперимента проводили три раза. Для каждого условия использовали одну пробирку 250 мл, снабженную моделью в уменьшенном масштабе (пробирка Nunc 2 мл, заполненная 1,8 мл свежего исходного интерферона, модель вставленной пробирки. Использовали или инкубатор с водной рубашкой, или инкубатор с циркуляцией воздуха. Словарь/сокращенияAgg - агрегаты,COA - сертификат анализа,Dim - димеры,Deg - продукты деструкции,FDF - конечная лекарственная форма,F/T - замораживание и оттаивание,r-h IFN1a - рекомбинантный человеческий интерферон 1a (r-h IFN1a) из клеток CHO,r-h IFN- FDF - конечная лекарственная форма r-h IFN1a (r-h IFN- FDF),SE-HPLC - вытеснительная высокоэффективная жидкостная хроматография (SE-ВЭЖХ),SAB - 50 мМ ацетат натрия рН 3,8,Temp. - температура. 1. Оборудование и материалы метода New SEC-ВЭЖХ. Система ВЭЖХ: Waters Alliance Детектор УФ: Waters 996PDA, длина волны 214 нм Температурное условие автоматического отбора проб: 4C Колонка TosoHaas TSK G2000 SWxl Температура колонки: комнатная температура Подвижная фаза: 50 мМ ацетат натрия, рН 3,8 с 50 мМ NaCl Приготовлена растворением 5,84 г NaCl в 2 л буфера 50 мМ ацетата натрия, рН 3,8. Ацетатный буфер готовили на единицу стерильного раствора добавлением уксусной кислоты к WFI и титрованием раствора 10 M NaOH вплоть до рН 3,8. Скорость течения: 0,5 мл/мин Инъекционный объем: 200 мкл r-h IFN1a, количество 0,34-0,36 мг/мл Реагенты: Уксусная кислота, Merck код К 31358056NaCl, JT BAKER код 3627-07 2. Методика - метод проиллюстрирован на фиг. 1. 1) 1,8 мл свежего исходного материала r-h IFN1a вносили в nunc-пробирки 2 мл и замораживали при -70C внутри 250 мл пробирок, содержащих 200 мл воды. 2) Три пробирки оттаивали при комнатной температуре и инкубировали отдельно при 25, 27 и 29C в настроенных инкубаторах (стабильность фиксированных температур в течение периода времени) всего в течение 16 ч. Из пробирок отбирали образцы для исследования методом NEW SEC после оттаивания и через 16 ч (оттаивание + инкубация). 3) Три пробирки оттаивали при комнатной температуре и инкубировали отдельно при 25, 27 и 29C в установленных инкубаторах всего в течение 24 ч. Из пробирок отбирали образцы для исследования методом NEW SEC после оттаивания и через 24 ч (оттаивание + инкубация). 4) Три пробирки оттаивали и инкубировали отдельно при 25, 27 и 29 С в настроенных инкубаторах всего в течение 16 ч. Образцы из пробирок исследовали методом NEW SEC после оттаивания и через 16 ч (оттаивание + инкубация). 5) Три пробирки оттаивали и инкубировали отдельно при 25, 27 и 29 С в правильно настроенных инкубаторах всего в течение 16 ч. Из пробирок отбирали образцы для исследования методом NEW SEC через 16 ч (оттаивание + инкубация) - отбор проб после оттаивания в инкубаторе не производили. 6) Три пробирки оттаивали и инкубировали отдельно при 25, 27 и 29 в инкубаторах всего в течение- 15012281 24 ч. Образцы из пробирок исследовали методом NEW SEC через 24 ч (оттаивание + инкубация) - отбор проб после оттаивания в инкубаторе не производили. 7) Пробирку оттаивали при комнатной температуре в течение 16 ч и хранили при 2-8 С в течение вплоть до 72 ч - образец из пробирки исследовали методом NEW-SEC и рассматривали как контроль для проведенного эксперимента. 8) Для оценки влияния на молекулу эксперимент повторяли при выбранных условиях. Инкубированные образцы тестировали методом NEW-SEC, IEF, QUANT-ВЭЖХ, EC-MC, BIOASSAY, DEG/OX ВЭЖХ, CZE. Результаты сравнивали с контрольной пробой, которую оттаивали при комнатной температуре в течение 16 ч и хранили при 2-8 С. 3. Результаты: % Mon или % мономера = % мономеров r-h IFN1a.% Agg = % агрегатов r-h IFN1a. Оттаивание при комнатной температуре и инкубация в целом в течение 16 ч. Пробирки 3250 мл с вставками замораживали при -70C и оттаивали при комнатной температуре, пробирки осторожно переворачивали двадцать раз, отбирали пробы и сразу переносили в три инкубатора (25, 27 и 29 С) и инкубировали всего в течение 16 ч (оттаивание + инкубация). Образцы хранили при 2-8C до исследования методом NEW-SEC-ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 5. Таблица 5 Продолжительность инкубации - 10 ч Оттаивание при комнатной температуре и инкубация всего в течение 24 ч. Пробирки 3250 мл с вставками замораживали при -70C и оттаивали при комнатной температуре, пробирки осторожно переворачивали двадцать раз, отбирали пробы и сразу переносили в три инкубатора (25, 27 и 29 С) и инкубировали всего в течение 24 ч (оттаивание + инкубация). Образцы хранили при 2-8 С до исследования методом NEW-SEC-ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 6. Таблица 6 Продолжительность инкубации - 18,5 ч Оттаивание в инкубаторе и инкубация в течение всего 16 ч. Пробирки 3250 мл с вставками замораживали при -70C и оттаивали внутри трех инкубаторов (25, 27 и 29 С), пробирки осторожно переворачивали двадцать раз после оттаивания и инкубировали всего в течение 24 ч (оттаивание + инкубация). Образцы хранили при 2-8 С до исследования методом NEW-SEC-ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 7. Таблица 7 Продолжительность инкубации - 16 ч Оттаивание в инкубаторе и инкубация всего в течение 24 ч. Пробирки 3250 мл с вставками замораживали при -70C и оттаивали внутри трех инкубаторов (25, 27 и 29 С), пробирки осторожно переворачивали двадцать раз, отбирали образцы для NEW-SEC-ВЭЖХ и инкубировали всего в течение 24 ч(оттаивание + инкубация). Образцы хранили при 2-8 С до исследования методом NEW-SEC-ВЭЖХ. Эксперимент повторяли в отдельный день - без отбора образцов из пробирок после оттаивания. Резуль- 16012281 таты представлены в табл. 8 а и 8b. Таблица 8 а 4. Заключение. Следующие моменты из приведенных выше экспериментов можно подчеркнуть. Увеличение температуры и продолжительности инкубации повышало эффективность термической диссоциации. При оттаивании внутри инкубатора продолжительность оттаивания снижалась по сравнению с оттаиванием при комнатной температуре и поэтому возрастал уровень мономеров. Оттаивание и инкубация при 25, 27 и 29 С в течение вплоть до 24 ч не оказывали никакого негативного влияния на молекулу r-h IFN1a по данным обычных SEC-ВЭЖХ, Deg/Ox ВЭЖХ, quantВЭЖХ, EC-MC, биоисследования и CZE. Вышеприведенные примеры демонстрируют, что получены важные результаты с точки зрения уменьшения олигомеризации корректировкой температуры периода покоя и времени покоя предварительно замороженного, хранившегося исходного интерферона. Независимо от того, как размораживали препарат (например, оттаивали при комнатной температуре или оттаивали в инкубаторе), увеличение температуры периода покоя вплоть до определенной точки давало хороший результат в отношении уровня мономера интерферона. Таким образом, имеется корреляция между температурой периода покоя и уровнем мономера белка; повышение температуры периода покоя от 25 до 29C приводило к увеличению уровня мономера белка. Наилучшие результаты получали,когда исходный раствор помещали при температуре 29 С. Предпочтительно исходный раствор помещали в инкубатор при температуре инкубации 29C. При сравнительном исследовании температур инкубации увеличение мономеров на 5-6% наблюдали при повышении температуры от 25 до 29 С. Предпочтительно замороженный препарат непосредственно помещали в инкубатор, а не оттаивали при комнатной температуре перед инкубацией (таким образом, оттаивание происходило в инкубаторе). Результаты также показали, что инкубация размороженного исходного интерферона в течение 10 ч уже давала процент мономеров выше 95%. Если размораживали при комнатной температуре, исследуемые периоды продолжительности инкубации составляли или 10 или 18,5 ч. Если размораживали в инкубаторе, исследуемые периоды продолжительности инкубации составляли или 16 или 24 ч. Аналогично, время покоя также является фактором, который оказывает влияние на олигомеризацию. Независимо от условий покоя (например, оттаивали при комнатной температуре, а затем инкубировали или инкубировали сразу), существует корреляция между временем покоя и уровнем мономера; бо- 17012281 лее длительный период покоя повышает уровень белкового мономера. Самые хорошие результаты получали, если период покоя составлял 24 ч. При сравнительном исследовании временных периодов покоя прирост мономеров на 3% достигали, когда период покоя составлял от 16 до 24 ч. Предпочтительно период покоя для замороженного препарата составлял 24 ч. Более предпочтительно замороженный препарат сразу помещали в инкубатор (оттаивание происходило в инкубаторе) в течение инкубационного периода времени (время покоя) 24 ч. Комбинируя две переменные величины (время покоя и температура периода покоя) можно добиться, таким образом, увеличения уровня мономеров на -9%. Результаты оказывались еще более ошеломляющими при сравнении инкубированных препаратов с препаратами, которые не инкубировали. 77,48%Mon получали, если препарат анализировали сразу после оттаивания (не инкубировали), тогда как 97,9% мономеров получали, когда замороженный препарат сразу инкубировали в течение инкубационного периода 24 ч при инкубационной температуре 29C. Таким образом, различие 20% в уровне мономера получали оптимизацией двух переменных величин. Предпочтительно исходный интерферон помещали при температуре покоя 29C в течение периода времени покоя 24 ч. Более предпочтительно исходный интерферон инкубировали сразу при 29 С (оттаивание происходило в инкубаторе) в течение 24 ч инкубации (наилучшие результаты дали 97,9% Mon). В заключение, время покоя и температуры периода покоя и предпочтительно инкубационная температура и время инкубации являются важными факторами, которые значительно способствуют поддержанию и/или повышению стабилизации препрепарата или препарата исходного интерферона. 1b. Эксперименты по термической диссоциации при 29 С с разными циклами F/T в лабораторном масштабе. В данном сообщении оценивают влияние инкубации при 29 С на уровень димеров и агрегатов в лекарственном средстве r-h IFN1a. 1. Методика. а. Метод NEW-SEC использовали для анализа образцов исходного r-h IFN1a, которые инкубировали при 29C в течение 15 или 3 ч после оттаивания или которые подвергали разным циклам F/T, как показано в табл. 9. Исходный материал r-h IFN1a переносили в семь пробирок Corning, 15 мл (0,9 мл в каждую пробирку). Пробирки замораживали при -70C. Исходный материал IFN1a (предварительно замороженный и оттаянный) также переносили в две пробирки Corning, 250 мл (200 мл в каждую пробирку), пробирки замораживали при -70C. Таблица 9 Обработка образца для эксперимента по термической диссоциации в лабораторном масштабеb. Для оценки влияния инкубации исходного материала IFN1a на молекулу инкубированный материал (после 1F/T) исследовали следующими способами: Deg/Ox-ВЭЖХ, IEF, EC-MC, Quant-ВЭЖХ,CZE.c. Кроме того, также проводили исследование кинетики термической диссоциации при F/TX1 в ла- 18012281 бораторном масштабе. Аликвоты из исходного материала r-h IFN1a в пробирке 250 мл после F/TX1 распределяли в пробирки 15 мл и инкубировали при 29C в инкубаторе. 2. Результаты. 1) Инкубация исходного материала r-h IFN1a (1F/T) после оттаивания при комнатной температуре повышала уровень мономера от 82,8 до 97,57% и снижала уровень агрегатов от 0,7 до 0,2% (см. табл. 10). Инкубация при 29 С (инкубатор) в течение 15 ч была эффективной в отношении димера (диссоциация 2). Инкубация исходного материала r-h IFN1a после оттаивания в бане повышала уровень мономера от 82,8 до 96,7%, но увеличивала уровень агрегата от 0,7 до 1,97% (см. табл. 10). Таблица 10 Результаты SEC-ВЭЖХ образцов исходного материала 0,9 мл после 1F/T 3) Инкубация исходного материала r-h IFN1a (4FT) в течение 3 ч после оттаивания при комнатной температуре повышала уровень мономера от 82,3 до 89,5% вследствие снижения уровня димера (см. табл. 11 и фиг. 2). 4) Инкубация исходного материала r-h IFN1a в течение 15 ч (4FT) после оттаивания при комнатной температуре еще повышала уровень мономера (по сравнению с 3 ч инкубации) от 82,3 до 93,7% вследствие снижения уровня димера (см. табл. 11 и фиг. 2). 5) Инкубация исходного материала r-h IFN1a после оттаивания в бане повышала уровень мономера от 82,3 до 94,7% вследствие снижения уровня димера (см. табл. 11 и фиг. 2). Таблица 11 Результаты SEC-ВЭЖХ образцов исходного материала 0,9 мл после 4F/T- 19012281 6) Инкубация 200 мл образца исходного материала r-h IFN1a после оттаивания при комнатной температуре повышала уровень мономера от 73 до 91,2% и снижала уровень агрегата от 3,9 до 2,9% (см. табл. 12 и фиг. 3). Таблица 12 Результаты SEC-ВЭЖХ образцов исходного материала 2F/T 7) Инкубированные образцы исходного материала r-h IFN1a (0,9 мл, 1F/T) исследовали по следующим тестам вместе с контрольным образцом, который подвергали оттаиванию при комнатной температуре и хранили при 4 С (см. табл. 13):DegOx-ВЭЖХ - никакого увеличения уровня окисления не наблюдали в инкубированных образцах по сравнению с контрольным образцом (хранили при 4 С),EC-MC - никакого различия в уровне углеводородов не наблюдали в инкубированных образцах по сравнению с контрольным образцом,Quant-ВЭЖХ - никаких значительных различий в концентрации не наблюдали,CZE - получали идентичные профили электроферограмм,IEF - образец исходного материала r-h IFN1a F, который оттаивали в бане с водяной рубашкой,показал дополнительную зону около pI-7. Контрольный образец и образец, оттаянные при комнатной температуре и инкубированные в течение 15 ч, соответствовали спецификациям. Таблица 13 Влияние термической диссоциации на IFN 15 ч после оттаивания при комнатной температуре не оказывали влияние на параметры молекулыIFN1a, которые определяли методами Deg/Ox-ВЭЖХ, ES-MC, Quant-ВЭЖХ, CZE и IEF. 8) Результаты исследования кинетики термической диссоциации при F/TX1 представлены в табл. 14 и на фиг. 4-6.- 20012281 Таблица 14 Кинетика термической диссоциации при F/TX1 в эксперименте в лабораторном масштабе 3. Заключение. 1) Инкубация образцов r-h IFN1a при 29C в течение 15 ч после оттаивания при комнатной температуре значительно снижала уровень олигомеризации (главным образом димеров). 2) Инкубация образцов r-h IFN1a при 29 С в течение 15 ч после оттаивания при 29 С значительно снижала уровень олигомеризации. 3) Использование аналитических методов показало, что инкубация r-h IFN1a в течение 15 ч при 29 С после оттаивания исходного материала при комнатной температуре не оказывала негативное влияние на параметры молекулы IFN1a, которые определяли методами Deg/Ox-ВЭЖХ, EC-MC, QuantВЭЖХ, CZE и IEF. Инкубация эффективна при диссоциации нековалентных олигомеров, но не все нековалентные олигомеры диссоциировали (4% нековалентных олигомеров не диссоциировало в пробирках 250 мл). % Мономеров в пробирках 250 мл достигал 94% (9-часовая инкубация при 29 С) и 97,57% в небольших пробирках (15-часовая инкубация при 29 С). Равновесного состояния олигомеров достигали сразу после термической диссоциации (см. таблицы и фигуры). Термическая диссоциация при 29 С в пробирках 15 мл завершалась через 15 ч. В заключение, данные эксперименты (1a и 1b) продемонстрировали, что термическая диссоциация, осуществленная при специальной температуре и продолжительности (т.е. температуре периода покоя и времени покоя или времени инкубации и инкубационной температуре), является существенной для поддержания и/или повышения стабильности (мономерного) белка или препарата, содержащего (мономерный) белок. Кинетика термической диссоциации интерферона-, кроме того, показала, что термическая диссоциация при цикле 1F/T давала 90% Mon только через 3 ч, почти завершалась через 6 ч, а затем достигала плато через 15 ч. Предпочтительно термическую диссоциацию проводили в течение по меньшей мере 3 ч. Более предпочтительно продолжительность (время покоя или инкубационное время) термической диссоциации для интерферона- устанавливали в диапазоне от 6 до 40 ч. Еще более предпочтительно продолжительность термической диссоциации для интерферонаустанавливали в диапазоне от 15 до 30 ч или в течение 10, 16, 18,5 или 24 ч. Наиболее предпочтительно продолжительность термической диссоциации интерферона- составляла 24 ч. Температуру инкубации или периода покоя предпочтительно устанавливали в диапазоне от 27 до 31 С. Более предпочтительно температура была 29C. Даже если результаты по кинетике термической диссоциации получали после 1F/T, специалист в данной области, используя общепринятые методы, легко сможет определить кинетику термической диссоциации после многих циклов F/T (например, 2F/T, 4F/t или 11F/T; или после любого другого вида стресса) или даже для всего процесса обработки или любой его части любого интерферона- (например, r-h интерферон 1a) или любого мономерного белка. По существу, данное изобретение не следует ограничивать определенным временем инкубации или продолжительностью (или временем покоя). Аналогично, специалист в данной области, используя обычные методы, легко сможет определить наиболее подходящую температуру инкубации (или температуру периода покоя) после одного или более циклов F/T (или после любого другого вида стресса) или даже для полного процесса обработки или любой его части для любого интерферона- (например, интерферона 1a) или любого мономерного белка. По существу, данное изобретение не следует ограничивать определенной инкубационной температурой (или температурой периода покоя). Пример 2. Стабилизация интерферона- путем добавления наполнителя к исходному материалу интерферону. Эти эксперименты проводили для проверки защитного действия, которое оказывают некоторые наполнители, такие как аминокислоты, бактериостатические средства, поверхностно-активные вещества и изотонические средства, на исходный r-h IFN1a с точки зрения олигомеризации и агрегации. Следующие исследования проводили без добавления человеческого сывороточного альбумина (HSA) к препрепаратам исходного r-h IFN1a. Словарь/сокращенияDeg - продукты деструкции,FDF - конечная лекарственная форма,F/T - замораживание и оттаивание,r-h IFN1a - рекомбинантный человеческий интерферонla (r-h IFN1a) из клеток CHO,r-h IFN- FDF - конечная лекарственная форма r-h IFN- 1a (r-h IFN- FDF),SE-HPLC - вытеснительная высокоэффективная жидкостная хроматография (SE-ВЭЖХ),SAB - 50 мМ ацетат натрия рН 3,8,Temp. - температура. Введение. Изучение направлено на минимизацию олигомеризации r-h IFN1a во время стадий производства от фракции SEC-EL до хранения FDF для того, чтобы получить стабилизированный исходный интерферон-. Минимизацию олигомеризации, индуцированной стрессами (например, F/T), проводили следующим образом. 1. Преобработка исходного материала наполнителями и/или другими стабилизирующими средствами и без HAS. 2. Оценка влияния температуры хранения (-20, -70 С и 2-8C) на олигомеризацию предварительно приготовленного исходного материала. Образцы предварительно приготовленного исходного материала исследовали, используя SE-ВЭЖХ. 3.0. Цель/сфера действия. Минимизировать олигомеризацию r-h IFN1a во время обработки исходного материала. 4.0. Оборудование и материалы. 4.1. Оборудование. Фильтровальный элемент 0,2 мкл P/N MPGL025 Millipore Фильтр 0,2 мкл, управляемый шприцем Millex - P/N SLGV025LS Millipore Конические центрифужные пробирки 250 мл - Corning Криопробирки 1,8 млNunc 4.2. Материалы.c. Ледяная уксусная кислота 100% (код 1.00063, Merck)k. R-h IFN1a 0,48-0,5 мг/мл или 0,088 мг/мл 1. Ацетатный буфер рН 3,8 50 мМ или 10 мМ Стабилизаторы. Аминокислоты: 1. Аргинин 31,6 мг/мл 2. Лизин 27,4 мг/мл 3. Метионин 0,12 мг/мл (антиоксидант) Поверхностно-активные вещества: 1. Твин 20 0,05 мг/мл 2. Полоксамер 188 (плуроновая кислота) 0,5 мг/мл Бактериостатическое средство: 1. Бензиловый спирт 5 мг/мл Изотоническое средство: 1. Маннит 54,6 мг/мл 5.0. Методика. Для исследований использовали фракции SEC-EL2. Общая схема исследования представлена на фиг. 7. Различные условия предварительно составленной композиции (препрепарат) представлены в табл. 15 и 16. 6.1. Приготовление растворов. 6.1.1. Приготовление 1 л 50 мМ ацетата натрия рН 3,8 (SAB). К 1000 мл WFI добавляли 3,003 г ледяной уксусной кислоты и смешивали в течение 5 мин. Приблизительно 0,56 мл 10 M гидроокиси натрия добавляли для приведения рН к 3,8, раствор перемешивали в течение 5 мин, отбирали образцы для определения проводимости и фильтровали через фильтр 0,2 мкм. Полоксамер 188 (или плуроник F-68) вводили в препрепарат в количестве 0,1% (критическая концентрация мицеллообразования) для предотвращения адсорбции лекарственного вещества поверхностью контейнеров во время процесса изготовления; более высокие концентрации могут отрицательно влиять на стабильность продукта (более высокая степень окисления); более низкие концентрации могут менее эффективно ограничивать адсорбцию. 6.1.2. Готовили 1 л следующих растворов: 1. 50 мМ ацетат, рН-3,8, 10 мг/мл бензилового спирта. Так же как в 6.1.1 с введением 10 г бензилового спирта до добавления гидроокиси натрия. 2. 50 мМ ацетат, рН-3,8, 5 мг/мл бензилового спирта. Так же как в 6.1.1 с введением 5 г бензилового спирта до добавления гидроокиси натрия. 3. 50 мМ ацетат, рН-3,8, 63,2 мг/мл аргинина.- 23012281 Так же как в 6.1.1 с введением 63,2 г аргинина до добавления гидроокиси натрия. 4. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 31,6 мг/мл аргинина. Так же как в 6.1.1 с добавлением 31,6 г аргинина до добавления гидроокиси натрия. 5. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 54,8 мг/мл лизина. Так же как в 6.1.1 с введением 54,8 г лизина до добавления гидроокиси натрия. 6. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 27,4 мг/мл лизина. Так же как в 6.1.1 с введением 27,4 г лизина до добавления гидроокиси натрия. 7. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 600 мМ маннита. К 0,926 кг WFI добавляли 3,003 г ледяной уксусной кислоты, а раствор перемешивали в течение 5 мин. 100,3 г маннита добавляли к раствору и перемешивали в течение 5 мин. Приблизительно 0,56 мл 10M гидроокиси натрия добавляли для приведения к рН 3,8, раствор перемешивали в течение 5 мин, отбирали образцы для определения проводимости и фильтровали на мембране 0,2 мкл. 8. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 300 мМ маннита. К 0,966 кг WFI добавляли 3,003 г ледяной уксусной кислоты и перемешивали в течение 5 мин. 55,1 г маннита добавляли к раствору и перемешивали в течение 5 мин. Приблизительно 0,56 мл 10 M гидроокиси натрия добавляли для приведения к рН 3,8, раствор перемешивали в течение 5 мин, отбирали образцы для определения проводимости и фильтровали на фильтре 0,2 мкл. 6.1.3. Готовили 1 л следующих растворов: 1. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 5 мг/мл бензилового спирта, 12 мг/мл метионина. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина. 2. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 5 мг/мл бензилового спирта, 12 мг/мл метионина, 50 мг/мл полоксамера 188. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина и 50 г полоксамера 188. 3. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 5 мг/мл бензилового спирта, 12 мг/мл метионина, 5 мг/мл Твина 20. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина и 5 г Твина. 4. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 31,6 мг/мл аргинина, 12 мг/мл метионина. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина. 5. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 31,6 мг/мл аргинина, 12 мг/мл метионина, 50 мг/мл полоксамера 188. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина и 50 г полоксамера 188. 6. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 31,6 мг/мл аргинина, 12 мг/мл метионина, 5 мг/мл твина 20. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина и 5 г твина. 7. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 300 мМ маннита, 12 мг/мл метионина. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина. 8. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 300 мМ маннита, 12 мг/мл метионина, 5 мг/мл полоксамера 188. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина и 5 г полоксамера 188. 9. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 300 мМ маннита, 12 мг/мл метионина, 5 мг/мл твина 20. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина и 5 г твина. 10. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 27,4 мг/мл лизина, 12 мг/мл метионина. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина. 11. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 27,4 мг/мл лизина, 12 мг/мл метионина, 5 мг/мл полоксамера 188. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина и 5 г полоксамера 188. 12. 50 мМ ацетат, рН 3,8, 27,4 мг/мл лизина, 12 мг/мл метионина, 5 мг/мл твина 20. Так же как в 6.1.2 с добавлением 12 г метионина и 5 г твина. 6.2. Исходный препрепарат. Общая схема приготовления исходного препарата и композиции представлена на фиг. 7 и в табл. 15. 1-я Стадия. 6.2.1. 197 г SEC-EL разбавляли 1:1 мас./мас. SAB (натрий-ацетатным буфером), 10 мг/мл бензилового спирта. 6.2.2. 197 г SEC-EL разбавляли 1:1 мас./мас. SAB, 63,2 мг/мл аргинина. 6.2.3. 197 г SEC-EL разбавляли 1:1 мас./мас. SAB, 600 мМ маннита. 6.2.4. 197 г SEC-EL разбавляли 1:1 мас./мас. SAB, 54,8 мг/мл лизина. 6.2.5. 92 г SEC-EL разбавляли 208 г SAB, чтобы приготовить раствор, содержащий 0,5 мг/мл r-hIFN1a. После фильтрования растворы разливали в две пробирки 250 мл, содержащие 130 г исходного материала) и шесть пробирок 2 мл (содержащих 0,5 мл исходного материала). Одну пробирку 250 мл и две пробирки 2 мл замораживали и хранили при -70C. Одну пробирку 250 мл и две пробирки 2 мл замораживали при -70C, а затем переносили во 2-й холодильник для хранения при -20C. Две пробирки 2 мл хранили при 2-8 С.- 24012281 2-я Стадия. Следующие растворы готовили при концентрации r-h IFN1a 0,5 мг/мл. 6.2.6. Раствор, приготовленный в 6.2.1, разбавляли SAB, 5 мг/мл бензилового спирта. 6.2.7. Раствор, приготовленный в 6.2.2, разбавляли SAB, 31,6 мг/мл аргинина. 6.2.8. Раствор, приготовленный в 6.2.3, разбавляли SAB, 300 мМ маннита. 6.2.9. Раствор, приготовленный в 6.2.4, разбавляли SAB, 27,4 мг/мл лизина. 6.2.10. После фильтрования, полученные 4 раствора (6.2.6-6.2.9) разливали в четыре пробирки 250 мл (содержащие 130 г исходного материала) и в шесть пробирок 2 мл (содержащих 2 мл исходного материала). Всего четырнадцать пробирок 250 мл и девятнадцать пробирок 2 мл. Оставшийся объем приготовленных трех растворов подвергали дальнейшей обработке (3-я стадия). 6.2.11. Две пробирки 250 мл и две пробирки 2 мл каждого раствора замораживали и хранили при-70C. Две пробирки 250 мл и две пробирки 2 мл каждого раствора замораживали при -70C, а затем переносили во 2-й холодильник для хранения при -20C. Две пробирки 2 мл каждого раствора хранили при 2-8C. 3-я Стадия (разведение 1:100). 6.2.12. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.6, разбавляли 0,3 мл SAB, 5 мг/мл бензилового спирта, 12 мг/мл метионина. 6.2.13. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.6, разбавляли 0,3 мл SAB, 5 мг/мл бензилового спирта, 12 мг/мл метионина, 50 мг/мл плуроника. 6.2.14. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.6, разбавляли 0,3 мл SAB, 5 мг/мл бензилового спирта, 12 мг/мл метионина, 5 мг/мл твина 20. 6.2.15. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.7, разбавляли 0,3 мл SAB, 31,6 мг/мл аргинина, 12 мг/мл метионина. 6.2.16. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.7, разбавляли 0,3 мл SAB, 31,6 мг/мл аргинина, 12 мг/мл метионина, 50 мг/мл плуроника. 6.2.17. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.7, разбавляли 0,3 мл SAB, 31,6 мг/мл аргинина, 12 мг/мл метионина, 5 мг/мл твина 20. 6.2.18. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.8, разбавляли 0,3 мл SAB, 300 мМ маннита, 12 мг/мл метионина. 6.2.19. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.8, разбавляли 0,3 мл SAB, 300 мМ маннита, 12 мг/мл метионина, 50 мг/мл плуроника. 6.2.20. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.8, разбавляли 0,3 мл SAB, 300 мМ маннита, 12 мг/мл метионина, 5 мг/мл твина 20. 6.2.21. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.9, разбавляли 0,3 мл SAB, 27,4 мг/мл лизина, 12 мг/мл метионина. 6.2.22. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.9, разбавляли 0,3 мл SAB, 27,4 мг/мл лизина, 12 мг/мл метионина, 50 мг/мл плуроника. 6.2.23. 29,7 мл раствора, приготовленного в 6.2.9, разбавляли 0,3 мл SAB, 27,4 мг/мл лизина, 12 мг/мл метионина, 5 мг/мл твина 20. 6.2.24. Все растворы (6.2.12-6.2.23) фильтровали отдельно на фильтре 0,2 мкм, управляемым шприцем Millex. 6.2.25. Растворы разливали в пробирки 2 мл (по меньшей мере 6 пробирок для каждого раствора). 6.2.26. Две пробирки 2 мл каждого раствора замораживали и хранили при -70C. Две пробирки 2 мл каждого раствора замораживали и хранили при -70C, а затем переносили во 2-й холодильник для хранения при -20C. Две пробирки 2 мл каждого раствора хранили при 2-8 С. 6.3. Анализ исходного материала. По одной пробирке 2 мл, которые хранили при 2-8 С, -70 и -20C, каждого условия приготовления препрепарата анализировали методом SE-ВЭЖХ после оттаивания при комнатной температуре в течение 2 ч. Образцы, хранившиеся при -20C, снова помещали при -70C на 4 ч до оттаивания. Результаты представлены в табл. 17. По одной пробирке 250 мл, хранившимся при -70C и приготовленным по условиям 1, 5, 9, 13 и 15(см. табл. 1), анализировали методом SE-ВЭЖХ после оттаивания при комнатной температуре в течение 6 ч. Результаты представлены в табл. 18. Кроме того, исследование термической диссоциации проводили с образцами из пробирок 15 мл после цикла 1 F/T при температуре инкубации 29 С в течение 8 ч (образцы по 1 мл из пробирок 250 мл после F/T1) и анализировали методом SE-ВЭЖХ (относительно результатов см. табл. 19).- 25012281 7.0. Результаты. Таблица 17 Результаты исследования препрепаратов из пробирок Nunc (0,5 мл), хранившихся при -70, -20C и 2-8C Хранили при 2-8 С в течение 3 недель.Замораживали при -70C, хранили при -20 С в течение 16 дней и снова помещали при -70C на 4 ч. Результаты представляют собой среднюю величину данных, полученных в двух экземплярах. Исходный буфер содержал 50 мМ ацетат натрия, рН 3,8, + наполнители в различных комбинациях- 26012281 Таблица 18 Результаты исследования препрепаратов из пробирок 250 мл, хранившихся при -70C с (+INC) или без инкубации при 29 С в течение 8 ч Результаты представляют собой среднюю величину данных, полученных в двух экземплярах. Таблица 19 Термическая диссоциация в пробирках 15 мл после цикла 1 F/T 8.0. Наблюдения. Добавление наполнителя(ей) к исходному r-h интерферону 1a четко снижало процент димеров и агрегатов (таким образом, соответственно, увеличивало процент мономеров). Сравнительное исследование влияния термической диссоциации и выбранных наполнителей на r-h интерферон- показало, что при добавлении наполнителей можно получить немного более высокий уровень мономеров (более низкий уровень димеров и агрегатов). Кроме того, препрепараты, стабилизированные наполнителями, демонстрировали даже более высокие уровни мономеров, когда их подвергали еще термической диссоциации (например, инкубации при 29 С). 1. Пробирки 2 мл. При 4C. Небольшие различия в % мономера при разных условиях получали (максимальная дельта 1,3%), а образцы, содержащие маннит, демонстрировали наиболее высокий уровень мономеров (100%). При -70 С. Комбинация маннит + Твин 20 + метионин оказалась немного лучше, чем лизин. Все стабилизаторы в различных комбинациях могут давать % мономера 99. При -70 С и хранении при -20C. Наивысший % мономера получали с комбинацией лизин + Твин 20 + метионин.- 27012281 Пробирки 250 мл. При -70C. Имеется четкое преимущество лизина в снижении уровня олигомеризации по сравнению с другими тестированными наполнителями. Пример 3. Стабилизация интерферона- в результате добавления наполнителя к исходному интерферону, исследованная методами скоростного ультрацентрифугирования, SEC- и Deg/Ox-ВЭЖХ. 1.0. Словарь/сокращения.Agg - агрегаты,Dimдимеры,Deg - продукты деструкции,FDF - конечная лекарственная форма,F/T - замораживание и оттаивание,r-h IFN1a - рекомбинантный человеческий интерферон 1a (r-h IFN1a) из клеток CHO,r-h IFN- FDF - конечная лекарственная форма r-h IFN1a (r-h IFN- FDF),SE-HPLC - вытеснительная высокоэффективная жидкостная хроматография (SE-ВЭЖХ),SAB - 50 мМ ацетат натрия, рН 3,8,Temp. - температура,Введение. Изучение направлено на минимизацию олигомеризации r-h IFN1a во время стадий изготовления,начиная от фракции SEC-EL до хранения FDF, с получением стабилизированного исходного интерферона-. Минимизацию олигомеризации осуществляли путем 1) преприготовления исходного материала с наполнителями и/или другими стабилизирующими средствами до замораживания при -70C,2) преприготовления исходного материала с наполнителями и/или другими стабилизаторами без замораживания и транспортировки при 2-8 С,3) транспортировки при 2-8 С не замороженного исходного материала r-h IFN1a без предварительной обработки. Образцы предварительно обработанного исходного материала анализировали, используя методыSE-ВЭЖХ, Deg/Ox-ВЭЖХ и скоростного ультрацентрифугирования. SE-ВЭЖХ дает возможность определять только ковалентные олигомеры, тогда как с помощью скоростного ультрацентрифугирования определяют также нековалентные олигомеры как количественно, так и качественно. 3.0. Цель/сфера действия. Минимизировать олигомеризацию r-h IFN1a во время обработки исходного материала. 4.0. Оборудование и материалы. 4.1. Оборудование. Фильтровальная установка 0,2 мкм P/N MPGL025 Millipore Холодильник Revco при -70C Конические центрифужные пробирки 250 мл - Corning Криопробирки - Nunc 1,8 мл 4.2. Материалы. Фракция SEC el 2D-маннит DAB, Ph Eur, BP, USP, FCC, Е 421 (код 1.05980, Merck) Ледяная уксусная кислота 100% (код 1.00063, Merck) Гидроокись натрия 10 ML-Метионин (1.05707, Merck) Моногидрохлорид L-аргинина (код 1.01544, Merck) Лизин (код 1.05701, Merck) 5.0. Методика. Исследование проводили, используя фракцию SEC-EL2. Общая схема исследования представлена на фиг. 8. Различные условия предварительного приготовления препрепарата представлены в табл. 20. Тестировали методом quant-ВЭЖХ 6.4. Приготовление растворов. Растворы готовили согласно примеру 2. 1. Приготовление 50 мМ ацетата натрия, рН 3,8 (SAB). См. пример 2. 2. Приготовление 0,5 л 50 мМ ацетата, рН 3,8, 63,2 мг/мл аргинина.f. При измерении рН добавляли приблизительно 0,28 мл 10 M NaOH для приведения рН к 3,8.g. Из раствора отбирали образцы для исследования проводимости и рН.h. Раствор фильтровали через фильтр 0,2 мкм. 3. Приготовление 1 л 50 мМ ацетата, рН 3,8, 31,6 мг/мл аргинина.f. При измерении рН добавляли приблизительно 0,56 мл 10 M NaOH, чтобы привести рН к 3,8.g. Из раствора отбирали образцы для исследования проводимости и рН.h. Раствор фильтровали через фильтр 0,2 мкм. 4. Приготовление 1 л 50 мМ ацетата, рН 4,1, 164,4 мг/мл лизина.f. Добавляли 0,56 мл 10 M NaOH, получали рН приблизительно 4,1.g. Из раствора отбирали образцы для исследования проводимости и рН.h. Раствор фильтровали через фильтр 0,2 мкм. 5. Приготовление 1 л 50 мМ ацетата, рН 4,0, 82,2 мг/мл лизина.f. Добавляли 0,56 мл 10 M NaOH, получали рН приблизительно 4,0.g. Из раствора отбирали образцы для исследования проводимости и рН.h. Раствор фильтровали через фильтр 0,2 мкм. 6. Приготовление 1 л 50 мМ ацетата, рН 3,8, 600 мМ маннита, 0,24 мг/мл метионина.h. При измерении рН добавляли приблизительно 0,56 мл 10 M NaOH для приведения рН к 3,8.i. Из раствора отбирали образцы для исследования проводимости и рН.j. Раствор фильтровали через фильтр 0,2 мкм. 7. Приготовление 2 л 50 мМ ацетата, рН 3,8, 300 мМ маннита, 0,12 мг/мл метионина.h. При измерении рН добавляли приблизительно 1,12 мл 10 M NaOH для приведения рН к 3,8.i. Из раствора отбирали образцы для исследования проводимости и рН.j. Раствор фильтровали через фильтр 0,2 мкм. 6.1. Приготовление исходного препрепарата. Общая схема приготовления исходного пре-препарата и композиции представлена на фиг. 8 и в табл. 20. Следующее является подробным описанием препрепаратов. Количественную оценку SEC-EL производили по оптической плотности при 280 нм, концентрация составляла 1,31 мг/мл. 1-я Стадия (разбавление SEC-EL2 1:1 мас./мас. различными буферами). 6.2.1. Количество 155 г SEC-EL разбавляли 1:1 мас./мас. 155 г SAB, 164,4 мг/мл лизина. 6.2.2. Количество 78 г SEC-EL разбавляли 1:1 мас./мас. 78 г SAB, 63,2 мг/мл аргинина. 6.2.3. Количество 220 г SEC-EL разбавляли 1:1 мас./мас. 220 г SAB, 600 мМ маннита, 0,24 мг/мл метионина. 6.2.4. Количество 189 г SEC-EL разбавляли 306 г SAB, чтобы получить раствор, содержащий 0,50 мг/мл r-h IFN1a. После фильтрования полученный раствор разливали в пробирки 250 мл и пробиркиNunc 2 мл и хранили при -70C или 2-8C, пробирки 250 мл для перевозки при 2-8 С заполняли вплоть до крышки. 2-я Стадия (конечный исходный препарат разбавляли до 0,50-0,58 мг/мл r-h IFN1a). Получали следующие растворы (запланированная концентрация составляла 0,5 мг/мл r-h IFN1a). 6.2.5. 310 г раствора, приготовленного в 6.2.1, разбавляли 90 г SAB, 82,4 мг/мл лизина. 6.2.6. 156 г раствора, приготовленного в 6.2.2, разбавляли 48 г SAB, 31,6 мг/мл аргинина. 6.2.7. 440 г раствора, приготовленного в 6.2.3, разбавляли 132 г SAB, 300 мМ маннита, 0,12 мг/мл метионина. 6.2.8. После фильтрования полученные 3 раствора (от 6.2.5 до 6.2.7) разливали в пробирки 250 мл и пробирки 2 мл (содержащие 2 мл исходного раствора). 6.2.9. Пробирки 250 мл и пробирки 2 мл с растворами, содержащими лизин и аргинин, замораживали и хранили при -70C, раствор, содержащий маннит и метионин, хранили при 2-8C (пробирку 250 мл заполняли вплоть до крышки). 6.3. Обработка предварительно приготовленного исходного материала. Образцы, хранившиеся при -70C и 2-8 С, тестировали методами скоростного ультрацентрифугирования, Deg/Ox-ВЭЖХ и SE-ВЭЖХ.