Применение диметилсульфоксида (дмсо) для стабилизации гастрина, холецистокинина, секретина и способ стабилизации указанных пептидов

011863 В общем, настоящее изобретение относится к области стабилизации температурно-чувствительных веществ, определяемых при анализе (аналитов), особенно белков и пептидов, включая гормоны и ферменты, от разложения в биологических образцах, таких как образцы плазмы или сыворотки млекопитающих. Уровень техники изобретения Одна проблема, существующая в связи с анализом аналитов в биологических образцах, особенно в образцах сыворотки и плазмы, относится к плохой стабильности некоторых белков и пептидов. Малые пептиды особенно чувствительны к разложению ферментами. Плохая стабильность требует, чтобы образец тестировался немедленно или сохранялся в холодной окружающей среде, такой как среда холодильника. Однако даже при холодном хранении стабильность часто недостаточна. Если такие образцы должны храниться многие дни, они должны быть помещены в сухой лед. Естественно, это является значительным неудобством. Гастрин-17 - это пептидный гормон, который секретируется G-клетками полости желудка при возбуждении. Возбуждение - это результат расщепления белков после приема пищи, богатой белками. Растяжение желудка также дает начало секреции гастрина, особенно гастрина-17. Гастриновые пептиды образуются из одной молекулы прогастрина. Большинство пептидных гормонов синтезируют протеолитическим расщеплением и ферментативными модификациями прогормонов. Процессинг гастринов может быть разделен на три категории: прогастрины, производные, удлиненные глицином и карбоксиамидированные гастрины. Несколько других биологически активных форм гастрина могут быть выделены из желудка человека, из которых самыми важными являются гастрин-34 и гастрин-17. Кроме того, из плазмы был выделен гастрин-71, который является самым большим биологически активным гастрином, так же как гастрин-52 и гастрин-14. Гастрин-17 - самый сильный стимулятор соляной кислоты. Гастрин-17 присутствует в двух формах: в несульфонированной форме (гастрин I) и в сульфонированной форме, в которой сульфонирован тирозин (гастрин II). Обе эти формы одинаково эффективны. Активная форма гастрина-17 - это амидированный гастрин-17, в котором последняя аминокислота, фенилаланин пептида, содержит дополнительную амидную группу. Неактивной формой является так называемый гастрин-17, удлиненный глицином. Известны различные методы и комплекты для определения состояния слизистой мембраны желудка человека. На основе таких измерений можно определить, в том числе, риск человека заболеть раком желудка. Примеры таких методов описаны, например, в следующих патентах и заявках на патент: EP 804737, EP 990992, EP 02716100 и PCT/FI03/000653 настоящего заявителя. В этих методах обычно определяют, по меньшей мере, следующие аналиты или маркеры из образца, такого как образец сыворотки или плазмы человека: пепсиноген I, гастрин-17 и маркер инфекцииHelicobacter pylori, и, кроме того, часто пепсиноген II. В связи с указанными определениями и манипуляциями показано, что плохая стабильность гастрина-17 является проблемой вследствие того, что он быстро разлагается в образце. После трех часов концентрация гастрина-17 в образце сыворотки начинает отчетливо уменьшаться, и через день он полностью разрушается в условиях охлаждения. Это - в отличие от пепсиногена I и II, которые сохраняют свою активность при комнатной температуре в течение многих дней, и антител к Helicobacter pylori, которые выживают в течение, по меньшей мере, трех дней в условиях холодильника. Ранее гастрин-17 был получен как так называемый холодный образец, который представляет собой продукт коагуляции образца сыворотки на ледяной бане. Поставка или отправка образца, длящаяся в течение многих дней, выполняются в замороженной форме. Из-за проблем, обусловленных неудовлетворительной стабильностью не только пептидов типа гастрин, но также ряда других белков и пептидов, включая гормоны и ферменты, были предприняты усилия для обнаружения средства стабилизации этих чувствительных аналитов. Минимальным требованием для удовлетворительной стабилизации с целью приемлемых лабораторных процедур является стабильность в течение по меньшей мере трех дней при комнатной или окружающей температуре и температуре холодильника, т.е. в температурном диапазоне приблизительно от +4 до 25 С. Сущность изобретения Согласно изобретению обнаружено, что диметилсульфоксид (ДМСО) является очень эффективным стабилизатором для белков и пептидов, особенно гастрина и родственных ему пептидов в биологическом образце млекопитающего, особенно в образце сыворотки или плазмы, обеспечивая стабилизирующий эффект для указанных белков и пептидов, который длится по меньшей мере три дня при окружающей температуре или при температуре холодильника. Таким образом, с одной стороны, изобретение направлено на применение ДМСО для стабилизации гастрина и близких пептидов против разложения или инактивации в биологическом образце млекопитающего, таком как образец сыворотки или плазмы. С другой стороны, изобретение также направлено на способ стабилизации таких пептидов против разложения или инактивации в биологическом образце млекопитающего, таком как образец сыворотки или плазмы; согласно способу стабилизирующее количество диметилсульфоксида добавляют к образцу, содержащему упомянутый пептид, подлежащий стабилизации.-1 011863 Подробное описание изобретения Стабилизатор, который применяют согласно изобретению - это органический растворитель, диметилсульфоксид (ДМСО), хорошо известный из-за разнообразного промышленного, медицинского и лабораторного использования. Молекулярная масса ДМСО - 78,1, он смешивается с водой, имеет точку плавления 18,5 С и точку кипения 189C. Он является побочным продуктом бумажной промышленности, где он образуется из лигнина - связующего вещества деревьев. При культивировании клеток ДМСО обычно используется как 10% раствор при замораживании клеток. В этом применении ДМСО действует как защитное средство, уменьшающее осмотические повреждения, поскольку клетки очень чувствительны к образованию льда внутри клеток. ДМСО быстро проникает через мембрану клетки и заменяет там воду. Следовательно, ДМСО также быстро проникает через кожу и в состоянии легко транспортировать через кожу компонент, растворенный в нем, такой как низкомолекулярный компонент. По этой причине ДМСО используется как вспомогательное средство,промотирующее поглощение и транспортировку молекул лекарственного препарата. О диметилсульфоксиде также сообщалось как о средстве, имеющем разнообразные фармацевтические применения, включая уменьшение боли и опухоли, мышечную релаксацию, противовоспалительные и бактериостатические свойства и т.д. Согласно изобретению ДМСО рассматривают как средство для стабилизации температурночувствительных пептидов, то есть гастрина и близких пептидов, которые являются восприимчивыми к быстрому разложению в пределах периода нескольких дней, например в течение трех дней, в биологическом образце, даже когда хранятся в условиях охлаждения. Особенно полезно настоящее изобретение для стабилизации гастринов и близких пептидов, таких как холецистокинины и секретины, и особенно для стабилизации гастрина-17. Изобретение особенно применимо для использования в методе, например, при тестировании состояния желудочной слизистой оболочки, в которой гастрин-17 определяют вместе с аналитами, пепсиногеном I и необязательно пепсиногеном II, а также с маркером для Helicobacter pylori из биологического образца, такого как образец сыворотки или плазмы. В ходе экспериментов было показано, что ДМСО, добавленный к таким образцам, проявляет стабилизирующий эффект в отношении гастрина и не оказывает неблагоприятного эффекта на другие анализируемые маркеры. Количество ДМСО, который используют, чтобы получить стабилизирующий эффект, может изменяться, но обычно составляет 1-10 об.%, особенно приблизительно 4-6 об.% в расчете на тестируемый образец. В контексте изобретения температурно-чувствительный в связи с анализируемым пептидом в биологическом образце млекопитающего означает, что упомянутый пептид склонен к быстрому разложению, особенно при комнатной или окружающей температуре. Температурно-чувствительный аналит,подлежащий стабилизации согласно изобретению, является, таким образом, аналитом, который имеет время хранения меньше, чем 3 дня (72 ч) при комнатной или окружающей температуре, типично в температурном интервале приблизительно от +18 до 25C. Согласно изобретению количество DMCO, добавленного к биологическому образцу млекопитающего, обеспечивает стабильность в отношении анализируемого пептида в течение по меньшей мере трех дней (по меньшей мере 72 ч) в вышеупомянутом температурном интервале. Экспериментальная часть Эксперименты, выполненные в ходе исследований, касающихся стабильности гастрина-17 в образцах плазмы и сыворотки, показали, что гастрин-17 сохранялся в 5 об.% растворах ДМСО/сыворотка(плазма) в течение по меньшей мере трех дней даже при комнатной температуре. Это очевидно из результатов испытаний, представленных в следующих таблицах. Таблица 1 - описывают результаты тестов, в которых три образца EDTA/плазма были испытаны по отношению к стабильности гастрина-17 в течение периода времени до трех дней при добавлении 5 об.% ДМСО к указанным образцам. Сравнительные примеры не имели добавленного ДМСО. Результаты показывают улучшенную стабильность гастрина-17 после 3 дней в образцах, содержащих ДМСО, по сравнению с образцами, не содержащими ДМСО. Таблица 2 - показывает стабилизирующий эффект добавления ДМСО к пяти образцамEDTA/плазма при комнатной температуре. Эффект добавления ДМСО был проверен на пепсиногене I,пепсиногене II, антителах к Helicobacter pylori и гастрине-17. Результаты указаны на день 0 и день 3. Результаты показывают, что нет, по существу, никакого влияния на активность пепсиногенов I и II, а также антител к Helicobacter pylori, в то время как наблюдается улучшение стабильности гастрина-17 по сравнению с результатами, полученными для образцов без добавленного ДМСО. Таблица 3 - тест, соответствующий тесту табл. 2, но где эти десять испытываемых образцов были образцами сыворотки, а не плазмы. В целом, результаты показывают сохраняемую активность для гастрина-17 в образцах с добавленными 5 об.% ДМСО. Результаты также показывают, что ДМСО не имеет вредного эффекта на активности пепсиногенов и антител к H. Pylori. Таблица 4 - показывает результаты тестов стабильности образцов, где аналитом был U-INTP (ами-2 011863 нотерминальный телопептид коллаген I). Таблица показывает результаты немедленно ("немедл".) и после трех дней при комнатной температуре без и со стабилизатором, выраженным также в процентах. Для каждого образца были сделаны два параллельных теста. Таблица 1 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение ДМСО для стабилизации гастрина, холецистокинина и секретина против разложения в биологическом образце млекопитающего в количестве от 1 до 10% (об./об.) из расчета на образец. 2. Применение по п.1, в котором образец является образцом сыворотки или плазмы. 3. Применение по п.1 или 2 для стабилизации гастрина-17. 4. Способ стабилизации гастрина, холецистокинина и секретина против разложения в биологическом образце млекопитающего, согласно которому ДМСО добавляют к упомянутому образцу в количестве от 1 до 10% (об./об.) из расчета на образец. 5. Способ по п.4, в котором образцом является образец сыворотки или плазмы. 6. Способ по п.4 или 5 для стабилизации гастрина-17. 7. Способ по п.6, в котором гастрин-17 определяют в образце сыворотки или плазмы, содержащем один или более аналитов, выбранных из группы, состоящей из пепсиногена I, пепсиногена II и антител к