Способ, вызывающий т-клеточный ответ

012066 Перекрестная ссылка на родственные заявки на выдачу патента Заявка на данное изобретение, согласно параграфу 35 Свода законов США 119(e), претендует на приоритет заявок на выдачу патента США с регистрационным номером 60/510086, поданной 10.10.2003 г., 60/526571, поданной 04.12.2003 г., и 60/567771, поданной 05.05.2004 г., которые включены в данное описание в виде ссылки. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу, вызывающему иммунный ответ. Уровень техники Способы вакцинации описаны в данной области, например, см. Prayaga et al. 1997). Vaccine, 15(1213): 1349-1352), Kilpatrick et al. (1997), Hybridoma, 16: 381-389, Kilpatrick et al. (1998) Hybridoma, 17: 569575, Pertmer et al. (1995), Vaccine, 13: 1427-1430 и Olsen et al. (1997), Vaccine, 15: 1149-1156. Однако сохраняется необходимость в оптимизации схем введения нуклеиновых кислот, включая схемы, которые специфически индуцируют опосредованный клетками усиленный иммунный ответ (CMI). Это было бы очень полезно для профилактики и лечения широкого круга иммунных, воспалительных и инфекционных заболеваний и расстройств. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к способу, вызывающему (или усиливающему) CMI-ответ invivo. B частности, способ вызывает (или усиливает) T-клеточный ответ in vivo. Согласно изобретению предложен способ, вызывающий иммунный ответ против T-клеточного эпитопа у субъекта, которым является млекопитающее-хозяин, при этом указанный способ включает в себя:(i) первую иммунизацию, состоящую по меньшей мере из двух введений, которые осуществляют субъекту с интервалом от 1 до 14 дней, при этом каждое введение заключается во введении представляющей интерес нуклеотидной последовательности (NOI), кодирующей T-клеточный эпитоп, и необязательно(ii) вторую иммунизацию, которая состоит по меньшей мере из одного введения субъекту (a) NOI,кодирующей T-клеточный эпитоп, или (b) белка, содержащего T-клеточный эпитоп, при этом период между первым введением при первой иммунизации и первым введением при второй иммунизации составляет от 21 до 365 дней. Аспекты изобретения В приведенном ниже описании обсуждаются последовательности, такие как эпитоп или антиген,которые кодируются вводимыми NOI. Понятно, что вместо такой NOI в случае второй и последующих иммунизаций можно вводить белок, содержащий тот же самый эпитоп или антиген. Изобретение относится к способу, вызывающему T-клеточный ответ против представляющего интерес T-клеточного эпитопа (EOI). Как указано выше, способ включает в себя введение NOI, которая кодирует EOI. В способе можно вводить по меньшей мере 2, 4, 6, 10 или 20 или более (например, вплоть до 40 включительно) разных NOI, при этом каждая из NOI кодирует один и тот же эпитоп. Альтернативно,при каждом введении NOI можно вводить ту же самую NOI. Сходным образом в вариантах, в которых вводят белок, содержащий EOI, понятно, что можно вводить по меньшей мере 2, 4, 10 или более (например, вплоть до 20 включительно) разных белков, которые содержат эпитоп. Альтернативно, при каждом введении белка можно вводить один и тот же белок (который содержит эпитоп). В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, вызывающему усиленный опосредованный клетками иммунный (CMI) ответ по меньшей мере против одного антигена-мишени (TA) у субъекта, которым является млекопитающее-хозяин; при этом способ включает в себя введение представляющей интерес нуклеотидной последовательности (NOI), кодирующей один или несколько представляющих интерес эпитопов (EOI) TA субъекту, которым является млекопитающее-хозяин, по меньшей мере дважды; при этом интервалы между каждыми введениями NOI составляют от примерно 48 до примерно 144 ч; и при этом способ является эффективным, обеспечивая усиленный CMI-ответ против каждого экспрессированного EOI у субъекта, которым является млекопитающее-хозяин. Изобретение может быть использовано профилактически и/или терапевтически с тем, чтобы обеспечить иммуномодуляцию CMI-ответа на один или несколько представляющих интерес эпитопов антигена-мишени. Временной ход индуцированного ответа обеспечивает разработку эффективной стратегии иммунотерапии предсуществующих опосредованных T-клетками расстройств, а также способствует широкой защите от встречающихся впоследствии антигенов. Следующее преимущество данного аспекта изобретения заключается в возможности усиливатьCMI-ответ без применения модификатора и/или адъювантов связанного биологического ответа. Способ согласно изобретению может приводить к получению активированной T-клетки. Предполагаются многочисленные возможные применения активированной T-клетки. Например, в случае терапии человека предполагается, что активированные T-клетки могут быть выделены, культивированы ex vivo и введены субъекту-хозяину для лечения опосредованных T-клетками иммунных расстройств и/или вирусных инфекций или лечения пациентов со злокачественной опухолью. T-клетки могут быть получены введением NOI in vivo и затем выделением T-клеток для размножения in vitro в присутствии подходящих модификаторов биологического ответа и/или иммуномодуляторов и/или адъювантов, таких как, без ог-1 012066 раничения, пептид, цитокины и антигенпрезентирующие клетки.NOI, которую используют в способе согласно изобретению, включает в себя, но не ограничена указанным, последовательность ДНК под контролем регуляторной последовательности, которая управляет экспрессией последовательности ДНК в клетке-хозяине млекопитающего. NOI кодирует T-клеточный эпитоп и, соответственно, обычно кодирует белок, который содержит эпитоп. Таким образом, предпочтительно NOI способна экспрессировать эпитоп (включая белок, содержащий эпитоп) в клетке субъекта. В предпочтительных вариантах T-клеточный эпитоп может быть эпитопом хелперной T-клетки и/или T-лимфоцита CD8+ (T-клетки CD8+). Таким образом, T-клеточный ответ, вызванный способом согласно изобретению, может быть ответом хелперной T-клетки и/или T-клетки CD8+. Еще более предпочтительно ответ может представлять собой ответ T-лимфоцита CD8+, такой как цитотоксический ответ. Схема введения Способ согласно изобретению включает в себя группы введений, которые называют в данном описании иммунизациями. Таким образом, способ может включать в себя 1, 2, 3, 4, 5 или более (например,до 10 включительно) таких групп иммунизаций, которые называют в данном описании первой иммунизацией, второй иммунизацией и т.д. Одно или несколько или все введения при любой из иммунизаций (например, первой и/или второй или всех иммунизациях) можно осуществлять на протяжении от 2 до 14 дней (например, первое и последнее введение при иммунизации осуществляют с интервалом от 2 до 14 дней между введениями), например, от 3 до 12 дней или от 4 до 8 дней. Предпочтительно первую иммунизацию осуществляют на протяжении от 2 до 14 дней, например, от 3 до 12 дней или от 4 до 8 дней. Одна или несколько или все иммунизации могут включать в себя от 2 до 50, например, от 5 до 40 или от 10 до 30 введений. Таким образом, обычно при одной или нескольких или всех иммунизациях можно осуществлять по меньшей мере 2, например, по меньшей мере 3, 5, 10, 30, 50 или более введений(например, до 100 введений включительно). Предпочтительно первая иммунизация (и необязательно одна или несколько последующих иммунизаций) включает в себя от 3 до 20 введений. В одном варианте способ (т.е. все иммунизации вместе) включает в себя от 3 до 50, например, от 5 до 40 или от 10 до 30 введений. В одном варианте можно осуществлять более одного введения (обычно от 2 до 5 введений) в одной и той же временной точке (например, в один и тот же день или в пределах дня друг от друга, в пределах 12 ч друг от друга, в пределах 2 ч друг от друга или в пределах 1 ч друг от друга). Как будет обсуждаться ниже, такие введения, которые осуществляют в одной и той же временной точке, можно проводить в одно и то же место или в разные места. Одна или несколько или все иммунизации могут включать в себя введения в 2-10, например, 3-5 разных временных точках, при этом такие временные точки предпочтительно выбраны в разные дни. Таким образом, одна или несколько или все иммунизации могут включать в себя введения в 2-10, например, 3-5 разных дней. Предпочтительно, чтобы при первой и второй иммунизациях введения осуществлялись в 3 или 4 разных дня. В случае одной или нескольких или всех иммунизаций 2, 3, 4 или более введений при данной иммунизации можно осуществлять с интервалом от 2 до 14 дней, например, от 3 до 10 или от 4 до 8 дней. Предпочтительно в случае одной или нескольких или всех иммунизаций 2, 3, 4 или более введений при данной иммунизации можно осуществлять с интервалом от 2 до 6 дней. Период между двумя иммунизациями определяют в данном описании как период между первыми введениями двух иммунизаций. Обычно период между первой и второй иммунизацией (и предпочтительно период между всеми иммунизациями) составляет от 21 до 365 дней, например, от 28 до 300 дней,от 50 до 250 дней или от 100 до 200 дней. В одном варианте все иммунизации в данном способе осуществляют в течение 21-365 дней, например, от 28 до 300 дней, от 50 до 250 дней или от 100 до 200 дней. В одном варианте осуществления способа согласно изобретению NOI, как правило, вводят 2-5 раз(в 2-5 разных временных точках), например, 2, 3 или 4 раза (в 2, 3 или 4 разных временных точках соответственно). Обычно такие введения осуществляют на протяжении от 2 до 14 дней, например, на протяжении от 4 до 12 или от 6 до 10 дней. В предпочтительном варианте NOI осуществляют по меньшей мере 2, 3 или 4 введения NOI, которые могут быть разделены 3 днями или меньше, например 2 днями или меньше. В одном варианте период между первым и вторым введениями составляет менее 4 дней, обычно менее 3,5 дней, например 3 дня или меньше или 2 дня или меньше. Предпочтительно NOI не вводят субъекту между введениями, которые обсуждаются в данном случае, и обычно другие продукты, которые могут стимулировать иммунный ответ (такие как полипептидный антиген) не вводят между указанными введениями NOI. В одном варианте NOI или другой продукт,который стимулирует иммунный ответ (такой как полипептидный антиген), не вводят субъекту по меньшей мере 7 дней, например, по меньшей мере 14 или по меньшей мере 28 дней перед первым введением NOI при любых схемах введения, указанных выше. В одном варианте NOI или другой продукт, который может стимулировать иммунный ответ (такой как полипептидный антиген), не вводят субъекту по меньшей мере 7 дней, например, по меньшей мере 14 или по меньшей мере 28 дней после последнего введения NOI при любых схемах введения, указанных выше.-2 012066 Обычно субъект получает от примерно 1 пг до примерно 5 мг NOI при каждом введении, при котором вводят NOI (или в каждой временной точке), предпочтительно примерно от 10 пг до 100 мкг, например от 25 пг до 1 мкг или от 50 до примерно 500 пг. Как указано выше, при второй и, если это применимо, при последующих иммунизациях может быть введен белок. Обычно вводят примерно от 0,1 мкг до 20 мг белка при каждом введении (или в каждой временной точке), предпочтительно от 1 мкг до 5 мг,например от 10 до 500 мкг. Как указано выше, в способе согласно изобретению вводят NOI и необязательно также белок. В случае некоторых вариантов NOI или белок вводят совместно с адъювантом или кодирующим его NOI. В данном варианте адъювантом предпочтительно является нетоксичная форма термолабильного энтеротоксина (LT) E.coli или холерного токсина Vibrio Cholerae (CT). Адъювант может содержать субъединицу А или В энтеротоксина LT (LTB) или B-субъединицу холерного токсина CT (CTB). Добавление адъюванта, и в частности генетического адъюванта, полезно для дополнительного усиления или модуляции CMI-ответа. Таким образом, способ усиления CMI-ответа согласно настоящему изобретению может быть улучшен добавлением адъювантов к NOI или белку (или композициям, содержащим NOI или белок), что приводит к особенно эффективным композициям и способам, вызывающим долговременный и устойчивый усиленный CMI-ответ.NOI или белок предпочтительно вводят в виде частицы. В предпочтительном варианте осуществления способа согласно настоящему изобретению NOI или белок вводят трансдермально. В еще более предпочтительном варианте частицу вводят субъекту, которым является млекопитающее-хозяин, с помощью устройства для ускорения частиц. В одном варианте после осуществления схемы введения выясняют, привела ли схема к стимуляцииCMI (такого как CTL-ответ) или не привела. Это можно осуществить, например, посредством измерения наличия или уровня T-клеток (таких как CTL) в образце от субъекта. T-клетки, которые выявляют, обычно являются специфичными в отношении эпитопа, кодируемого NOI. Другие аспекты настоящего изобретения представлены в прилагаемой формуле изобретения, и в приведенном описании, и на чертежах. Указанные аспекты представлены в разделах под отдельными заголовками. Однако необходимо понимать, что инструкции в каждом разделе не обязательно ограничены указанным конкретным заголовком раздела. Определения Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретно приведенными в качестве примера молекулами или параметрами процесса, и, конечно, таковые могут варьировать. Также следует понимать, что используемая в данном описании терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначена для ограничения. Кроме того, на практике при осуществлении настоящего изобретения, если не оговорено особо, будут применяться способы, общепринятые в вирусологии, микробиологии, молекулярной биологии, методики рекомбинантной ДНК и иммунологии, все из которых знакомы специалистам в данной области. Такие способы полно объяснены в литературе. См., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) и Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. III (B.N. Fields и D.M. Knipe, eds.). Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов, цитируемые в данном описании выше или далее, включены при этом в виде ссылки в полном объеме. Необходимо отметить, что в используемом в данном описании и прилагаемой формуле изобретения смысле формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если содержание явно не диктует иное. Все научные и технические термины, используемые в данном описании, имеют значения, обычно используемые в данной области,если не оговорено особо. В используемом в данном изобретении смысле следующие слова или фразы имеют указанные значения. Иммунный ответ. Механизм, благодаря которому иммунная система контролирует заболевание, включает в себя индукцию нейтрализующих антител посредством гуморального иммунитета и формирование T-клеточных ответов посредством клеточного иммунитета. В используемом в данном описании смысле термин иммунный ответ против антигена-мишени (включая EOI) относится к развитию у субъекта, которым является млекопитающее-хозяин, гуморального и/или клеточного иммунного ответа против данного TA. В используемом в данном описании смысле термин гуморальный иммунный ответ относится к иммунному ответу, опосредованному молекулами антител. Антитела, образованные посредством гуморального иммунитета, главным образом эффективны против внеклеточных инфекционных агентов. В используемом в данном описании смысле термин опосредованный клетками иммунный (CMI) ответ означает ответ, опосредованный T-лимфоцитами и/или другими лейкоцитами. Иммунные механизмы CMI обычно более эффективны против внутриклеточных инфекций и заболеваний, поскольку механизмы CMI примируют T-клетки так, что, когда впоследствии появляется TA, активируютсяT-клетки памяти, приводя к CMI-ответу, который разрушает клетки-мишени, которые имеют соответствующий TA или его часть на своей клеточной поверхности, и таким образом разрушают инфекционный-3 012066 патоген. CMI-ответ сфокусирован на разрушении источника инфекции, опосредованном либо эффекторными клетками, которые разрушают инфицированные клетки хозяина в результате прямого межклеточного контакта, и/или в результате высвобождения молекул, таких как цитокины, которые обладают противовирусной активностью. Таким образом, CMI-ответ, который характеризуется специфичным клеточным ответом T-лимфоцитов, является ключевым в формировании устойчивости к заболеваниям, вызванным злокачественной опухолью, вирусами, патогенными и другими внутриклеточными микроорганизмами.T-клетки, вовлеченные в CMI-ответ. По меньшей мере два типа специфичных T-клеток требуется для инициации и/или усиленияCMI-ответа и гуморального ответа. Антигенные рецепторы на особой субпопуляции T-клеток, которые экспрессируют корецептор CD4 и могут быть T-хелперными (Th) клетками или T-клетками CD4 (в дальнейшем называемыми T-хелперными клетками), узнают антигенные пептиды, связанные с молекуламиMHC класса II. В отличие от этого, антигенные рецепторы на особой субпопуляции T-клеток, которые экспрессируют корецептор CD8 и называются цитотоксическими T-лимфоцитами (CTL) или T-клеткамиCD8+ (в дальнейшем называемыми T-клетками CD8+), взаимодействуют с антигенами, обнаруживаемыми на молекулах MHC класса I. Хелперные T-клетки. Хелперные T-клетки, или клетки CD4+, можно дополнительно разделить на две функционально отличающиеся субпопуляции: Th1 и Th2, которые отличаются своим цитокином и эффекторной функцией.Th1- и Th2-ответы регулируются не только положительным, но также отрицательным образом, так что клеточные Th1-ответы усиливаются цитокинами Th1, такими как IL-2, IL-12 и IFN-, и уменьшаются цитокинами Th2, такими как IL-4 и IL-10. Напротив, гуморальные ответы усиливаются цитокинами Th2,такими как IL-4 и IL-10, но снижаются цитокинами Th1, такими как IFN- и другим цитокином IL-12,который усиливает IFN- и продуцируется моноцитами. Таким образом, классические цитокины Th1,такие как IFN-, IL-2 и IL-12, можно рассматривать в качестве иммунных кофакторов, которые индуцируют воспалительный ответ. Напротив, классические цитокины Th2, такие как IL-4 и IL-10, можно рассматривать как цитокины, которые будут подавлять сильный воспалительный ответ в некоторых ситуациях.T-клетки CD8+ могут функционировать несколькими путями. Наиболее известной функциейT-клеток CD8+ является киллинг или лизис клеток-мишеней, несущих пептидный антиген в контексте молекулы MHC класса I. Это является причиной того, почему указанные клетки часто называют цитотоксическими T-лимфоцитами (CTL). Однако другой функцией, вероятно, имеющей большее защитное значение при некоторых инфекциях, является способность T-клеток CD8+ секретировать интерферонгамма (IFN-). Соответственно, оба анализа литической активности и высвобождения IFN- имеют важное значение для измерения иммунного ответа T-клеток CD8+ (например, анализ ELISPOT, который указан ниже). Имеются данные, полученные при инфекционных заболеваниях, дающие возможность предположить, что T-клетки CD8+ могут защищать, убивая инфекционный агент, содержащий инфекционный антиген, на ранних стадиях заболевания, до того как проявятся какие-либо симптомы заболевания. Усиленный CMI-ответ. Настоящее изобретение относится к способу усиления и/или модуляции CMI-ответа у субъектахозяина против антигена-мишени. В используемом в данном описании смысле термин усиление охватывает способы улучшения во всех аспектах CMI-ответа, которые включают в себя, без ограничения,стимуляцию, и/или увеличение, и/или потенцирование, и/или повышающую регуляцию величины и/или продолжительности и/или качества CMI-ответа на многократно вводимую NOI, кодирующую EOI TA. В качестве примера CMI-ответ может быть усилен либо посредством (i) усиления активации и/или продукции, и/или пролиферации T-клеток CD8+, которые узнают антиген-мишень, и/или (ii) переключенияCMI-ответа с ответа Th2-типа на ответ Th1-типа. Указанное усиление связанных с Th1 ответов имеет особое значение при ответе на внутриклеточные инфекции, поскольку, как было отмечено выше,CMI-ответ усиливается активированными Th1-клетками (такими как, например, IFNпродуцирующие). Такой усиленный иммунный ответ в общем может характеризоваться повышенными титрамиIFN-продуцирующих T-лимфоцитов CD4+ и/или CD3+, повышенной активностью антигенспецифических T-клеток CD8+ и иммунным ответом, подобным ответу T-хелперов 1 (Th1), против представляющего интерес антигена (характеризующимся повышенными титрами антигенспецифических антител подклассов, обычно связанных с клеточным иммунитетом (таких, например, как IgG2a), как правило, с сопутствующим снижением титров антител подклассов, обычно связанных с гуморальным иммунитетом(таких, например, как IgG1) вместо иммунного ответа, подобного ответу T-хелперов 2 (Th2). Ответ, который вызывают способом согласно изобретению (например, усиление CMI-ответа), можно определить рядом хорошо известных анализов, таких как анализы лимфопролиферации (активации лимфоцитов), анализы T-клеток CD8+, или посредством анализа T-лимфоцитов, специфичных в отношении эпитопа у сенсибилизированного субъекта (см., например, Erickson et al. (1993), J. Immunol. 151:-4 012066 4189-4199 и Doe et al. (1994), Eur. J. Immunol. 24: 2369-2376), или анализа ELISPOT T-клеток CD8+ для измерения продукции интерферона гамма (Miyahara et al. PNAS (USA) (1998) 95: 3954-3959). В одном варианте способ вызывает регуляторный или супрессорный T-клеточный ответ. Индукцию такого ответа можно использовать, например, для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания. Усиленный T-клеточный ответ. В данном описании индукция ответа часто обсуждается с точки зрения индукции CMI-ответа. Подразумевают, что индукция CMI-ответа включает в себя индукцию T-клеточного ответа. Ответ, который вызывают способом согласно изобретению, может представлять собой усиленный ответ. Можно сказать, что усиленный ответ имеет место в том случае, если ответ, вызванный способом согласно изобретению, больше, чем ответ, который вызван в случае контрольного способа, при этом в контрольном способе вводят такое же количество NOI (а также, если это применимо, такое же количество белка), которое вводят в способе согласно изобретению. Такой контрольный способ может, например, заключаться во введении NOI (а также, если это применимо, белка) в виде однократного введения. Альтернативно, контрольный способ может заключаться во введении NOI (а также, если это применимо, белка) в виде двух отдельных введений с интервалом в 28 дней. В используемом в данном описании смысле термин усиление T-клеточного ответа охватывает улучшения во всех аспектах T-клеточного ответа, которые включают в себя, без ограничения указанным,стимуляцию, и/или увеличение, и/или потенцирование, и/или повышающую регуляцию величины и/или продолжительности и/или качества T-клеточного ответа на многократно вводимую NOI, кодирующуюEOI антигена-мишени. В качестве примера T-клеточный ответ может быть усилен либо посредством усиления активации и/или продукции, и/или распределения, и/или пролиферации индуцированныхT-клетки NOI, кодирующие EOI из TA. Усиление T-клеточного ответа у субъекта-хозяина может быть связано с усилением и/или модулированием Th1-иммунного ответа у субъекта-хозяина. Усиление T-клеточного ответа можно определять, используя ряд хорошо известных анализов, таких как анализы лимфопролиферации (активации лимфоцитов), анализы цитотоксических T-клеток CD8+,или посредством анализа T-лимфоцитов, специфичных в отношении эпитопа у сенсибилизированного субъекта (см., например, Erickson et al. (1993), J. Immunol. 151: 4189-4199 и Doe et al. (1994), Eur. J.Immunol. 24: 2369-2376) или анализы ELISPOT T-клеток CD8+ для измерения продукции интерферонагамма (Miyahara et al. PNAS (USA) (1998), 95: 3954-3959). Антиген. Каждый вызывающий заболевание агент или патологическое состояние связывали с его антигеном или иммунодоминантным эпитопом на антигене, который является ключевым в иммунном узнавании и конечной элиминации или регуляции вызывающего заболевание агента или патологического состояния у хозяина. Для установления гуморального и/или клеточного иммунного ответа против конкретного заболевания иммунная система хозяина должна контактировать с антигеном или иммунодоминантным эпитопом на антигене, связанном с данным патологическим состоянием. В используемом в данном описании смысле термин антиген относится к любому агенту, обычно макромолекуле, которая может вызывать иммунологический ответ у индивидуума. Иммунологический ответ может представлять собой ответ В- и/или T-лимфоцитов. Термин может быть использован в отношении отдельной макромолекулы или гомогенной или гетерогенной популяции антигенных макромолекул. В используемом в данном описании смысле антиген используют в отношении молекулы белка или ее части, которая содержит одну или несколько антигенных детерминант или эпитопов. Антиген-мишень. В используемом в данном описании смысле термин антиген-мишень (TA) означает представляющий интерес иммуногенный пептид или белок, содержащий один или несколько эпитопов, способных индуцировать CMI-ответ на инфекционный патоген, такой как, без ограничения, бактерии, вирусы,грибы, дрожжи, паразиты и другие микроорганизмы, способные инфицировать виды млекопитающих. Антиген-мишень может включать в себя, без ограничения указанным, аутоантиген, перекрестно реагирующий антиген, аллоантиген, толероген, аллерген, гаптен, иммуноген или их части, а также их комбинации. Таким образом, EOI может быть из любых типов антигенов или белков, указанных в данном описании, или из любых конкретных антигенов или белков, указанных в данном описании. Эпитоп. В используемом в данном описании смысле термин эпитоп, как правило, относится к месту на антигене-мишени, которое узнается рецептором T-клеток и/или антителом. Предпочтительно он представляет собой короткий пептид, полученный из белкового антигена или полученный в виде части белкового антигена. Однако подразумевается, что этот термин включает в себя также пептиды с гликопептидными и углеводными эпитопами. Одна антигенная молекула может содержать несколько разных эпитопов. Термин эпитоп включает в себя также модифицированные последовательности аминокислот или углеводов, которые стимулируют ответы, которые распознаются целым организмом. Предпочтительно, если выбранный эпитоп является эпитопом инфекционного агента (такого как бактерия или вирус), который вызывает инфекционное заболевание.-5 012066 В используемом в данном описании смысле термин представляющий интерес эпитоп (EOI) относится к одному или нескольким EOI, которые могут быть использованы в способе согласно изобретению. Способ согласно изобретению, который может быть использован, вызывает T-клеточный ответ на 1, 2, 3,4, 5 до 10 или более разных эпитопов. Таким образом, способ может включать в себя введение одной или нескольких NOI, которые вместе кодируют 1, 2, 3, 4, 5 до 10 или более разных эпитопов, и/или введение одного или нескольких белков, которые вместе содержат 1, 2, 3, 4, 5 до 10 или более разных эпитопов. В одном варианте способ согласно изобретению осуществляют с тем, чтобы вызвать T-клеточный ответ на предварительно определяемый (или предварительно охарактеризованный) и/или известный эпитоп, который обычно получают из предварительно определяемого и/или известного белка. Источник эпитопов.EOI может быть создан на основании знания аминокислотной последовательности и соответствующей последовательности ДНК пептида или полипептида, а также исходя из природы конкретных аминокислот (например, размера, заряда и т.д.) и словаря кодонов без чрезмерного экспериментирования. См.,например, Ivan Roitt, Essential Immunology, 1988; Kendrew, выше; Janis Kuby, Immunology, 1992, p. 79-81. Некоторые руководства по определению того, будет ли представляющий интерес белок или эпитоп стимулировать ответ, включают в себя длину пептида: пептид должен иметь длину по меньшей мере 8 или 9 аминокислот, чтобы встраиваться в комплекс MHC класса I, и длину по меньшей мере 8-25, например, по меньшей мере 13-25 аминокислот, чтобы встраиваться в комплекс MHC класса II. Указанная длина является минимальной для пептида, чтобы связаться с комплексом MHC. Предпочтительно, чтобы пептиды были длиннее, чем указанные длины, поскольку клетки могут расщеплять пептиды. Пептид должен содержать подходящий якорный мотив, который будет обеспечивать возможность для его связывания с разными молекулами класса I или класса II с достаточно высокой специфичностью для образования иммунного ответа (см. Bocchia, M. et al., Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Pentides to HLA Class I Molecules, Blood 85:2680-2684; Englehard, V.H., Structure of peptides associated withclass I and class II MHC molecules Ann. Rev. Immunol. 12:181 (1994. Это можно осуществить без излишнего экспериментирования, сравнивая последовательность представляющего интерес белка с опубликованными структурами пептидов, связанных с молекулами MHC. Следовательно, специалист в данной области может узнать представляющий интерес эпитоп посредством сравнения последовательности белка с последовательностями, перечисленными в базе данных белков. Способ согласно настоящему изобретению в общем применим для усиления CMI-ответа противNOI, кодирующих EOI из любого источника (например, из патогена), включая EOI из широкого множества инфекционных агентов, таких как вирусы или паразиты. В качестве примера EOI может быть получен из патогенных агентов, полученных из опухолевых клеток, которые неограниченно размножаются в организме и, соответственно, могут приводить к патологическому росту. Примеры таких патогенных агентов описаны в Davis, В.D. et al. (Microbiology, 3rd ed., Harper International Edition). Эпитоп может быть из белка, не являющегося белком млекопитающего, мыши или человека. Эпитоп может быть эпитопом внутриклеточного белка или внеклеточного белка. В одном варианте эпитоп является эпитопом секретируемого белка, такого как белок, секретируемый патогеном. Эпитоп может быть эпитопом из белка субъекта или не из белка субъекта, у которого вызывают T-клеточный ответ. Эпитоп может быть из патогена, который способен инфицировать субъекта. Эпитоп может быть встречающимся в природе эпитопом или искусственным эпитопом, который не встречается в природе. Однако в предпочтительных вариантах примером изобретения является усиление CMI-ответа против компонентов семейства вирусов ВИЧ. Усиленные CMI-ответы можно генерировать против EOI, локализованных в продуктах любого вирусного гена, такого, например, как гены gag, pol, nef и env, при этом продукты генов env являются предпочтительными мишенями. Таким образом, в одном варианте способ согласно изобретению вызывает иммунный ответ против конкретных антигенов для лечения и/или профилактики ВИЧ-инфекции и/или любого состояния, которое вызвано или усилено ВИЧинфекцией, такой как СПИД.T-клеточные эпитопы. В способах или методиках согласно настоящему изобретению EOI TA может содержать один или несколько T-клеточных эпитопов. В используемом в данном описании смысле термин T-клеточный эпитоп в общем относится к таким признакам структуры пептида, которые способны индуцироватьT-клеточный ответ. В этом отношении в данной области считается, что T-клеточные эпитопы содержат линейные пептидные детерминанты, которые принимают расширенную конформацию в связывающей пептид щели молекул MHC (Unanue et al. (1987), Science 236: 551-557). В используемом в данном описании смысле T-клеточный эпитоп, как правило, является пептидом, имеющим по меньшей мере примерно 3-5 аминокислотных остатков и предпочтительно по меньшей мере 5-10 или более аминокислотных остатков, например 8-25 аминокислотных остатков. Однако в используемом в данном описании смысле термин T-клеточный эпитоп охватывает любой пептид, ограниченный MHC класса I или класса II. Способность конкретного T-клеточного эпитопа стимулировать/усиливать CMI-ответ можно определить,используя ряд хорошо известных анализов, таких как анализы лимфопролиферации (активации лимфоцитов), анализы цитотоксических T-клеток CD8+, или посредством анализа T-лимфоцитов, специфичныхT-клеток CD8+ для измерения продукции интерферона гамма (Miyahara et al. PNAS (USA) (1998), 95: 3954-3959).CD8+ T-клеточные эпитопы. Предпочтительно EOI является CD8+ T-клеточным EOI. EOI, индуцирующий T-клетки CD8+, представляет собой эпитоп, способный стимулировать образование или увеличение активности специфичныхT-клеток CD8+ после их введения субъекту-хозяину. CD8+ T-клеточные эпитопы могут быть представлены множеством различных форм, таких как рекомбинантная цепь одного или двух или более эпитопов.CD8+ T-клеточные эпитопы для многих различных заболеваний идентифицированы и их можно найти в литературе. Можно конструировать нити эпитопов, чтобы генерировать CD8+ T-клеточный ответ против любого выбранного TA, который содержит такие CD8+ T-клеточные EOI. Преимущественно в NOI CD8+ T-клеточные EOI могут быть представлены в виде цепочки из множества EOI, которые связаны вместе без промежуточных последовательностей для того, чтобы избежать ненужного материала нуклеиновой кислоты. В одном варианте NOI также кодирует последовательность,которая может действовать в качестве сайтов расщепления протеазой, обеспечивая отщепление эпитопов от экспрессированного белка.T-хелперные эпитопы. Предпочтительно EOI является EOI для хелперного T-лимфоцита. Доступны различные способы идентификации EOI T-хелперных клеток, подходящих для применения согласно данному изобретению. Например, известно, что амфипатичность пептидной последовательности влияет на ее способность функционировать в качестве индуктора T-хелперных клеток. Полное обсуждение эпитопов, индуцирующих T-хелперные клетки, приведено в патенте США 5128319, включенном в данное описание в виде ссылки. В-клеточные эпитопы. Предпочтительно EOI представляет собой смесь CD8+ T-клеточных EOI и В-клетсчных EOI. В используемом в данном описании смысле термин В-клеточный эпитоп в общем относится к месту на TA,с которым связывается молекула специфичного антитела. Идентификацию эпитопов, которые способны вызвать гуморальный ответ, легко осуществить с использованием способов, хорошо известных в данной области. См., например, Geysen et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998-4002 (общий способ быстрого синтеза пептидов для определения положения иммуногенных эпитопов в данном антигене); патента США 4708871 (способы идентификации и химического синтеза эпитопов антигенов) и Geysen etal. (1986), Molecular Immunology, 23: 709-715 (способ идентификации пептидов с высокой аффинностью по отношению к данному антителу). Комбинация эпитопов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения EOI представляет собой смесь EOI, индуцирующего T-клетки CD8+, и EOI, индуцирующего T-хелперные клетки. Как хорошо известно в данной области, эпитопы, индуцирующие T- и В-клетки, часто отличаются друг от друга и могут содержать разные пептидные последовательности. Поэтому некоторые области пептидной цепочки белка могут иметь либо T-клеточные, либо B-клеточные эпитопы. Поэтому, кромеCD8+ T-клеточных эпитопов, может быть предпочтительным включение одного или нескольких эпитопов, узнаваемых T-хелперными клетками, чтобы усилить иммунный ответ, порождаемый CD8+T-клеточными эпитопами. Механизм усиления индуцированного CD8+ T-клеточного ответа in vivo агентами, индуцирующими T-хелперные клетки, недостаточно выяснен. Однако без связи с теорией вероятно, что усиливающий агент в силу своей способности индуцировать T-хелперные клетки будет приводить к повышенным уровням необходимых цитокинов, которые способствуют клональной экспансии и распространению специфичных T-клеток CD8+. Независимо от лежащего в основе механизма предполагается, что применение смесей EOI, индуцирующих хелперные T-клетки и T-клетки CD8+, в способах согласно настоящему изобретению будет способствовать усилению CMI-ответа. Особенно подходящими эпитопами дляT-хелперных клеток являются эпитопы, которые активны у индивидуумов с разными типами HLA, например T-хелперные эпитопы столбняка (против которого большинство индивидуумов уже будет примировано). Также может быть полезным включение В-клеточных EOI для стимуляции В-клеточных ответов и продукции антител. Также могут быть сконструированы синтетические NOI, чтобы получить два типа иммунных ответов: только T-клеточный и T-клеточный в комбинации с В-клеточным ответом. Иммунодоминантный эпитоп. В том случае, когда индивидуум иммунизируют NOI, кодирующей множественные EOI TA, во многих случаях большинство отвечающих T-лимфоцитов будут специфичными по отношению к одному или нескольким линейным EOI из данного TA и/или большинство отвечающих В-лимфоцитов будут специфичными по отношению к одному или нескольким линейным или конформационным EOI из данногоTA. В целях настоящего изобретения в таком случае указанные EOI называют иммунодоминантными эпитопами. В антигене, имеющем несколько иммунодоминантных EOI, один EOI может быть наиболее-7 012066 доминантным, исходя из управления специфичными T- или В-клеточным ответом. Предпочтительно способ или методика согласно настоящему изобретению являются эффективными в усилении CMI-ответа против одного или нескольких эпитопов HSV-2. Предпочтительно способ или методика согласно настоящему изобретению являются эффективными в усилении CMI-ответа против одного или нескольких иммунодоминантных эпитопов HSV-2. Предпочтительно способ согласно настоящему изобретению является эффективным в формировании/усилении CMI-ответа против одного или нескольких эпитопов HbsAg. Предпочтительно способ согласно настоящему изобретению является эффективным в формировании/усилении CMI-ответа против одного или нескольких иммунодоминантных эпитопов HbsAg. Как показано в примерах, усиленный CMI-ответ, полученный против обоих EOI, HSV-2 и HbsAg,свидетельствует о том, что способ согласно настоящему изобретению в общем является эффективным против EOI из разнообразных инфекционных патогенов. Кроме того, защитный эффект против контрольного заражения вирусом свидетельствует о том, что формирование сильного CD8+ T-клеточного ответа имеет важное значение для развития методик профилактической и терапевтической вакцинации. Предпочтительно способы или методики согласно настоящему изобретению являются эффективными, вызывая повышенный CMI-ответ против одного или нескольких EOI, связанных с ассоциированным с опухолью антигеном (TAA). Преимущественно EOI, полученные из ассоциированных с опухолью антигенов (TAA), могут служить в качестве мишеней для иммунной системы хозяина и вызывать ответы,которые приводят к разрушению опухоли. Примеры таких TAA включают, но не ограничены указанным,MART-1 (меланомный антиген, узнаваемый T-клетками-1) MAGE-1, MAGE-3, 5 Т 4, gp100, карциноэмбриональный антиген (CEA), специфичный для простаты антиген (PSA), муцин (MUC-1), тирозиназу. Другие TAA могут быть идентифицированы, выделены и клонированы способами, известными в данной области, такими как способы, описанные в патенте США 4514506. В предпочтительном варианте NOI кодирует по меньшей мере два антигена ВИЧ. NOI может содержать последовательность, кодирующую белок gag ВИЧ или его фрагмент, содержащий эпитоп, и один или несколько дополнительных антигенов ВИЧ или их фрагментов, содержащих эпитоп. Антигены могут происходить из любого доступного изолята ВИЧ (обычно ВИЧ-1), такого как НХВ 2. Антигены могут включать gag-антигены (или их фрагменты, которые содержат эпитоп), такие как p24gag и p55gag,а также белки, полученные из pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu и LTR-областей ВИЧ (или их фрагменты,которые содержат эпитоп). В более предпочтительном варианте NOI кодирует по меньшей мере три антигена ВИЧ, предпочтительно Gag, nef и RT (или вместо целого белка фрагмент любого из указанных белков, который содержит эпитоп). Указанные кодирующие последовательности могут располагаться в любом порядке, но предпочтительно расположены в порядке Nef-RT-Gag, RT-Nef, Gag или RT-Gag-Nef. В одном варианте эпитопы/белки ВИЧ, которые экспрессируются, являются слитыми белками, такими как слитый белок, содержащий последовательность (включая указанные выше фрагменты) из Nef,RT и Gag. В предпочтительном варианте ген gag не кодирует пептид р 6gag. Предпочтительно ген nef в NOI укорочен, чтобы удалить последовательность, кодирующую 81 N-концевую аминокислоту. Фрагменты gag или любого другого антигена ВИЧ (такого как nef или RT), которые кодируютсяNOI, обычно содержат эпитоп. Белки (включая указанные фрагменты), кодируемые NOI, обычно имеют длину по меньшей мере 8 аминокислот, например, 8-10 аминокислот или до 20, 50, 60, 70, 80, 100, 150 или 200 аминокислот в длину. Любой такой белок может быть оптимизирован по кодонам, например,так, чтобы фрагмент имел характер использования кодонов, который похож на характер использования кодонов высокоэкспрессируемого гена млекопитающих. В одном варианте NOI кодирует одну из следующих комбинаций полипептидов:I) р 17, р 24, слитый с укороченным NEF (лишенным нуклеотидов, кодирующих концевые аминокислоты 1-85);II) р 17, р 24, RT, укороченный NEF (лишенный нуклеотидов, кодирующих концевые аминокислоты 1-85);III) р 17, р 24 (оптимизированный gag), укороченный NEF (лишенный нуклеотидов, кодирующих концевые аминокислоты 1-85);IV) р 17, р 24 (оптимизированный gag), RT (оптимизированный), укороченный NEF (лишенный нуклеотидов, кодирующих концевые аминокислоты 1-85);V) р 17, р 24, RT (оптимизированный), укороченный NEF (лишенный нуклеотидов, кодирующих концевые аминокислоты 1-85). В предпочтительном варианте NOI содержит инактивированный оптимизированный по кодонамRT, укороченный Nef и часть р 17/р 24 оптимизированного по кодонам гена gag (например, как описано вWO 03/025003), необязательно оперативно связанные ниже промотора HCMV Iowa length + экзон 1 и/или выше сигнала полиаденилирования глобина кролика. Сигнал полиаденилирования может быть из гена бета-глобина кролика.-8 012066 В предпочтительном варианте NOI содержит любую одну или несколько полинуклеотидных последовательностей, показанных на фиг. 18-22, или фрагмент такой последовательности, который кодирует по меньшей мере один эпитоп (предпочтительно T-клеточный эпитоп); или гомолог любой из последовательностей, указанных на фиг. 18-22, или гомолог указанного фрагмента. Такой фрагмент или гомолог обычно имеет длину по меньшей мере 50 нуклеотидов, например, по меньшей мере 100, 200, 500 или 1000 нуклеотидов. В одном варианте NOI имеет форму плазмиды, как показано на любой из 17 или 2022, или фрагмента или производного (включая гомолог) такой плазмиды. Конструирование плазмид описано в WO 03/080112 (включенной в данное описание в виде ссылки). Оптимизированные кодоны. В предпочтительном варианте осуществления изобретения кодирующую последовательность NOI оптимизируют, чтобы она была сходной по использованию кодонов с высокоэкспрессируемыми генами в клетках млекопитающих. ДНК-код имеет 4 буквы (A, T, С и G) и использует указанные буквы для записи трехбуквенных кодонов, которые представляют аминокислоты белков, кодируемых генами организма. Линейная последовательность кодонов вдоль молекулы ДНК транслируется в линейную последовательность аминокислот в белке(ах), кодируемых данными генами. Код является в высокой степени вырожденным, при этом 61 кодон кодирует 20 природных аминокислот и 3 кодона представляют собой стопсигналы. Таким образом, большинство аминокислот кодируются более чем одним кодоном - в действительности несколько аминокислот кодируются четырьмя и более разными кодонами. В том случае, когда имеется более одного кодона для кодирования заданной аминокислоты, обнаружено, что характер использования кодонов в организмах в высокой степени является неслучайным. Разные виды проявляют разное отклонение от равномерности в выборе свих кодонов, и кроме того, использование кодонов может заметно отличаться у одного вида в разных генах, которые экспрессируются на высоком и низком уровнях. Указанное отклонение от равномерности отличается у вирусов, растений,бактерий и в клетках млекопитающих, и некоторые виды проявляют более сильное отклонение от случайного выбора кодонов, чем другие. Например, у людей и других млекопитающих имеется менее сильное отклонение, чем у некоторых бактерий или вирусов. По этой причине существует значимая вероятность того, что ген млекопитающего, экспрессированный в E.coli, или вирусный ген, экспрессированный в клетках млекопитающих, будут иметь распределение кодонов, неподходящее для эффективной экспрессии. Предполагается, что присутствие гетерологичной последовательности ДНК кластеров кодонов, которые редко встречаются у хозяина, в котором должна происходить экспрессия, является прогностическим признаком низких уровней гетерологичной экспрессии у данного хозяина. В NOI картина использования кодонов может быть изменена по сравнению с использованием кодонов, встречающемся в природе, чтобы более близко соответствовать отклонению в распределении кодонов в организме-мишени, например, млекопитающем, особенно у человека. Коэффициент использования кодонов является мерой того, насколько близко картина использования кодонов в данной полинуклеотидной последовательности сходна с картиной использования кодонов у вида-мишени. Частоту кодонов можно получить из литературных источников для высокоэкспрессируемых генов многих видов (см.,например, Nakamura et. al. Nucleic Acids Research, 1996, 24:214-215). Частоты кодонов для каждого из 61 кодона (выраженные в виде количества случаев встречаемости на 1000 кодонов выбранного класса генов) нормализуют для каждой из 20 природных аминокислот так, что значение для наиболее часто используемого кодона для каждой аминокислоты выбирают равным 1, а частоты для наименее распространенных кодонов масштабируют так, чтобы они лежали между 0 и 1. Таким образом, каждый из 61 кодона принимает значение 1 или ниже для высокоэкспрессируемых генов вида-мишени. Чтобы рассчитать коэффициент использования кодонов для конкретного полинуклеотида по сравнению с высокоэкспрессируемыми генами данного вида отмечают масштабированное значение для каждого кодона конкретного полинуклеотида и берут среднее геометрическое всех указанных значений (делением суммы натуральных логарифмов указанных значений на общее количество кодонов и берут анти-log). Коэффициент будет иметь значение от нуля до 1, и чем выше коэффициент, тем больше кодонов в полинуклеотиде являются часто используемыми кодонами. Если полинуклеотидная последовательность имеет коэффициент использования кодонов 1, то все кодоны является наиболее частыми кодонами для высокоэкспрессируемых генов вида-мишени. Согласно настоящему изобретению в картине использования кодонов в NOI предпочтительно будут исключены кодоны со значением RSCU менее 0,2 в высокоэкспрессируемых генах организма-мишени. Значение относительного синонимичного использования кодонов (RSCU) является наблюдаемым количеством кодонов, деленным на ожидаемого количество, если все кодоны для данной аминокислоты использовались с равной частотой. NOI, как правило, будет иметь коэффициент использования кодонов для высокоэкспрессируемых генов человека выше 0,3, предпочтительно выше 0,4, наиболее предпочтительно выше 0,5. Таблицы использования кодонов для человека также можно найти в GenBank. В сравнении высокоэкспрессируемый ген бета-актина имеет RSCU 0,747. Таблица использования кодонов для Homo Кодирующие GC 52,51%, 1-я буква GC 56,04%, 2-я буква GC 42,35%, 3-я буква GC 59,13%. Адъюванты. Способ или методика согласно настоящему изобретению не требует присутствия адъюванта, чтобы показать усиленный CMI-ответ. Однако введение адъюванта, и в частности генетического адъюванта,может быть полезным для дополнительного усиления или модулирования CMI-ответа. Адъювант может усиливать CMI-ответ посредством усиления иммуногенности совместно вводимого иммунизируемому субъекту антигена, а также посредством индукции Th1-подобного иммунного ответа против совместно вводимого антигена, который является полезным в получаемой вакцине. Таким образом, способы или методики согласно настоящему изобретению для усиления CMIответа могут быть улучшены добавлением адъювантов к NOI или белку или композициям, содержащимNOI или белок, что приводит к особенно эффективным композициям и способам, вызывающим долговременный и устойчивый усиленный CMI-ответ. В используемом в данном описании смысле термин адъювант относится к любому материалу или композиции, способной специфично или неспецифично изменять, усиливать, направлять, изменять направление, потенцировать или инициировать антигенспецифичный иммунный ответ. Термин адъювант включает, но не ограничен указанным, бактериальный АДФ-рибозилирующий экзотоксин, биологически активный фактор, иммуномодулирующую молекулу, модификатор биологического ответа или иммуностимулирующую молекулу, такую как цитокин, интерлейкин, хемокин или лиганд или эпитоп (такой как хелперный T-клеточный эпитоп), и оптимально их комбинации, который при введении с NOI усиливает, или потенцирует, или модулирует CMI-ответ по сравнению с CMI-ответом,создаваемым при введении отдельно NOI или отдельно белка. Адъювантом может быть любой адъювант,известный в данной области, который подходит для применения на человеке или животном. Иммуномодулирующие молекулы, такие как цитокины (TNF-, IL-6, GM-CSF и IL-2) и костимулирующие и вспомогательные молекулы (В 7-1, В 7-2) могут быть использованы в качестве адъювантов во многих комбинациях. В одном варианте GM-CSF не вводят субъекту перед, во время или после схемы введения. Одновременная продукция иммуномодулирующей молекулы и EOI в месте экспрессии EOI может усиливать образование специфичных эффекторов, которые могут помогать усилению CMI-ответа. Степень усиления CMI-ответа может зависеть от используемых специфичных иммуностимулирующих молекул и/или адъювантов, поскольку различные иммуностимулирующие молекулы могут вызывать разные механизмы усиления и/или модулирования CMI-ответа. В качестве примера различные зффекторные механизмы/иммуномодулирующие молекулы включают, но не ограничиваясь указанным, увеличение хелперного сигнала (IL-2), рекрутинг профессиональных АПК (GM-CSF), увеличение концентрации T-клеток (IL-2), влияние на путь процессинга антигена и экспрессию MHC (IFN- и TNF-) и переключение иммунного ответа от Th1-ответа к Th2-ответу (LTB) (см. WO 97/02045). Олигонуклеотиды,содержащие неметилированные CpG (см. WO96/02555), также являются индукторами преимущественноTh1-ответа и подходят для применения в настоящем изобретении. Без связи с теорией введение адъюванта является предпочтительным, так как адъювант может помогать усиливать CMI-ответ на экспрессируемую NOI или белок, переключая Th2-ответ на Th1-ответ,и/или усиливать специфичные связанные с эффектором механизмы на экспрессируемый EOI с последующим формированием и поддержанием усиленного CMI-ответа (см., например, инструкции в- 10012066 Введение адъюванта с NOI или белком также предпочтительно, поскольку это может приводить к более низкой дозе или меньшему количеству доз NOI или белка, необходимых для достижения требуемого CMI-ответа у субъекта, которому вводят NOI или белок, или это может приводить к качественно и/или количественно другому иммунному ответу у субъекта. Эффективность адъюванта можно определить введением адъюванта с NOI или белком параллельно с отдельным введением NOI или белка животным и сравнением гуморального и/или опосредованного клетками иммунитета в двух группах с использованием стандартных анализов, таких как радиоиммуноанализ, ELISA, анализы T-клеток CD8+ и т.п., которые все хорошо известны в данной области. Обычно адъювант является отдельным от антигена компонентов, хотя одна молекула может иметь как адъювантные, так и антигенные свойства. В используемом в данном описании смысле термин генетический адъювант относится к адъюванту, кодируемому NOI, и адъюванту, который при введении с NOI, кодирующей EOI или белок (содержащий эпитоп), усиливает CMI-ответ по сравнению с CMI-ответом, формируемым при введении отдельно NOI или белка. В одном предпочтительном варианте генетическим адъювантом является бактериальные АДФ-рибозилирующий экзотоксин. АДФ-рибозилирующие бактериальные токсины представляют собой семейство родственных бактериальных экзотоксинов и включают дифтерийный токсин (DT), коклюшный токсин (PT), холерный токсин (CT), термолабильные токсины E.coli (LT1 и LT2), эндотоксин АPseudomonas, экзотоксин S.Pseudomonas, экзофермент В.cereus, токсин В.sphaericus, токсины С 2 и С 3 С.botulinum, экзофермент С.limosum, а также токсины из С.perfringens, C.spiriforma и C.difficile, EDINStaphylococcus aureus и мутантные АДФ-рибозилирующие бактериальные токсины, такие как CRM197,нетоксичный мутантный дифтерийный токсин (см., например, Bixler et al. (1989), Adv. Exp. Med. Biol. 251:175 и Constantino et al. (1992) Vaccine). Большинство АДФ-рибозилирующих бактериальных токсинов организовано в виде мультимера А:В, в котором субъединица А содержит активность АДФ-рибозилтрансферазы, а субъединица В действует в качестве связывающего компонента. Предпочтительные АДФ-рибозилирующие бактериальные токсины для применения в композициях согласно настоящему изобретению включают холерный токсин и термолабильные токсины E.coli. Холерный токсин (CT) и родственные термолабильные энтеротоксины E.coli (LT) являются секретируемыми продуктами соответствующих энтеротоксичных бактериальных штаммов, которые являются сильными иммуногенами и проявляют высокую токсичность при введении системно, перорально или мукозально. Известно, что как CT, так и LT дают адъювантные эффекты для антигена при введении посредством внутримышечного или перорального пути. Указанные адъювантные эффекты наблюдались при дозах ниже, чем дозы, требуемые для токсичности. Два токсина являются очень сходными молекулами и являются по меньшей мере примерно на 70-80% гомологичными на аминокислотном уровне. Предпочтительно генетическим адъювантом является холерный токсин (CT), энтеротоксигенный термолабильный токсин E.coli (LT) или производное, субъединица или фрагмент CT или LT, который сохраняет адъювантность. В еще более предпочтительном варианте генетическим адъювантом являетсяLT. В другом предпочтительном варианте генетическим адъювантом может быть CTB или LTB. Предпочтительно энтеротоксин является нетоксичным энтеротоксином. В качестве примера по меньшей мере одна из областей, кодирующих субъединицу энтеротоксина, может быть генетически модифицирована для детоксикации кодируемой ею пептидной субъединицы, например, в которой область,кодирующая укороченную субъединицу А, была генетически модифицирована, чтобы разрушить или инактивировать активность АДФ-рибозилтрансферазы в продукте экспрессии пептидной субъединицы(см. WO 03/004055). В описанных ниже примерах голотоксин LT, содержащий нативные субъединицы А и В, экспрессируемый плазмидным вектором, использовали в качестве генетического адъюванта, который вводили совместно с NOI, экспрессирующей антиген HSV-2/HbsAg, чтобы получить усиленный CMI-ответ. Результаты показывают, что введение адъюванта значительно увеличивает возможность усиливатьCMI-ответ в отношении формирования системного T-клеточного ответа по сравнению с введением NOI или белка без адъюванта. Таким образом, полученные результаты показывают, что данный генетический адъювант особенно желателен в том случае, когда требуется еще более усиленный CMI-ответ. Другие желательные генетические адъюванты включают, без ограничения, NOI, кодирующую IL-10, IL-12, IL-13, интерфероны (например, IFN-, IFN- и IFN-) и их предпочтительные комбинации. Другие такие биологически активные факторы, которые усиливают CMI-ответ, могут быть легко выбраны специалистом в данной области, и содержащий их подходящий плазмидный вектор может быть сконструирован известными способами.EOI согласно настоящему изобретению могут быть введены в виде нуклеотидных последовательностей, кодирующих EOI. В используемом в данном описании смысле термин представляющая интерес нуклеотидная последовательность (NOI) относится к одной или нескольким NOI, которые кодируют один или несколько EOI, которые используют в способе согласно настоящему изобретению. Термин представляющая интерес нуклеотидная последовательность (NOI) является синонимом термина по- 11012066 линуклеотид. NOI может представлять собой ДНК или РНК геномного, или синтетического, или рекомбинантного происхождения. NOI может быть двунитевой или однонитевой, представляя либо смысловую, либо антисмысловую нить или их комбинации. Для некоторых применений предпочтительно NOI представляет собой ДНК. Для некоторых применений предпочтительно NOI получают, используя способы рекомбинантной ДНК (например, рекомбинантную). Для некоторых применений предпочтительноNOI является кДНК. Для некоторых применений предпочтительно NOI может быть такой же, как и встречающаяся в природе форма. NOI может быть в выделенной или очищенной форме, такой как неклеточная форма. Вектор. В одном варианте осуществления настоящего изобретения NOI вводят непосредственно субъектухозяину. В другом варианте осуществления настоящего изобретения субъекту-хозяину вводят вектор,содержащий NOI. Предпочтительно NOI получают и/или вводят, используя генетический вектор. Как хорошо известно в данной области, вектор является средством, которое позволяет или облегчает перенос объекта из одной среды в другую. Согласно настоящему изобретению и в качестве примера некоторые векторы, используемые в способе рекомбинантной ДНК, позволяют переносить объекты, такие как фрагмент ДНК (такой как фрагмент гетерологичной ДНК, такой как фрагмент гетерологичной кДНК) в клетку-хозяина и/или клетку-мишень в целях репликации векторов, содержащих NOI согласно настоящему изобретению, и/или экспрессирующих EOI согласно настоящему изобретению, кодируемых NOI. Примеры векторов, используемых в способе рекомбинантной ДНК, включают, без ограничения, плазмиды, хромосомы, искусственные хромосомы или вирусы. Термин вектор включает экспрессирующие векторы и/или векторы для трансформации. Термин экспрессирующий вектор означает конструкцию, способную к экспрессии in vivo или in vitro/ex vivo. Термин вектор для трансформации означает конструкцию, которую можно переносить от одного вида к другому. В одном варианте используют вирусный промотор для управления экспрессией с NOI. Промотором может быть промотор цитомегаловируса (CMV). Предпочтительным промоторным элементом (особенно в случае, когда NOI кодирует антиген ВИЧ) является немедленный ранний (IE) промотор CMV, лишенный интрона А, но содержащий экзон 1. Таким образом, экспрессия с NOI может быть под контролем раннего промотора IE HCMV. Голая ДНК. Векторы, содержащие NOI согласно настоящему изобретению, можно вводить непосредственно в виде голой конструкции нуклеиновой кислоты, предпочтительно дополнительно содержащей фланкирующие последовательности, гомологичные геному клетки-хозяина. В используемом в данном описании смысле термин голая ДНК относится к плазмиде, содержащей NOI согласно настоящему изобретению вместе с короткой областью промотора для контроля ее продукции. Ее называют голой ДНК потому,что плазмиды не содержатся в каком-либо носителе для доставки. Когда такая плазмидная ДНК проникает в клетку-хозяина, такую как эукариотическая клетка, кодируемые ею белки транскрибируются и транслируются в клетке. Вирусные векторы. Альтернативно векторы, содержащие NOI согласно настоящему изобретению, могут быть введены в подходящие клетки-хозяева с использованием множества вирусных способов, которые известны в данной области, например, таких как инфекция рекомбинантными вирусными векторами, такими как ретровирусы, вирусы простого герпеса и аденовирусы. Вектор может представлять собой рекомбинантный вирусный вектор. Подходящие рекомбинантные вирусные векторы включают, без ограничения, аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV), векторы на основе вируса герпеса, ретровирусный вектор, лентивирусные векторы, бакуловирусные векторы, поксвирусные векторы или парвовирусные векторы (см. Kestler et al. 1999, Human Gene Ther. 10(10): 1619-32). В случае вирусных векторов введение NOI опосредовано вирусной инфекцией клетки-мишени. Направленный к мишени вектор. Термин направленный к мишени вектор относится к вектору, способность которого инфицировать, или трансфицировать, или трансдуцировать клетку, или экспрессироваться в клетке-хозяине и/или клетке-мишени ограничена определенными типа клеток у субъекта-хозяина, обычно клетками, имеющими общий или сходный фенотип. Экспрессирующмй вектор. Предпочтительно NOI согласно настоящему изобретению, которая встроена в вектор, оперативно связана с регуляторной последовательностью, которая способна обеспечивать экспрессию EOI клеткойхозяином, т.е. вектор является экспрессирующим вектором. Агент, продуцируемый клеткой-хозяином,может секретироваться или может находиться внутриклеточно в зависимости от используемых NOI и/или вектора. Как будет понятно специалистам в данной области, экспрессирующие векторы, содержащие NOI, могут быть сконструированы с сигнальными последовательностями, которые направляют секрецию EOI через мембрану конкретной прокариотической или эукариотической клетки.NOI согласно настоящему изобретению может быть экспрессирована в виде слитого белка, содержащего адъювант, и/или модификатор биологического ответа, и/или иммуномодулятор, слитый с EOI,чтобы дополнительно усилить и/или повысить получаемый CMI-ответ. Модификатор биологического ответа может действовать в качестве адъюванта в смысле обеспечения общей стимуляции CMI-ответа.EOI может быть связан либо с амино-, либо с карбоксильным концом модификатора биологического ответа. Белок, содержащий эпитоп. Последовательность белка может быть такой же, как последовательность эпитопа (т.е. без какоголибо добавления последовательности к N- или С-концу). Обычно белок находится в выделенной или очищенной форме, такой как неклеточная форма. Обычно белок имеет длину 8-400 аминокислот, например, 10-300 или 15-150 аминокислот. Введение NOI и белка.NOI или белок можно вводить либо отдельно, либо в виде части композиции множеством различных путей. Некоторые пути могут быть предпочтительными для определенных композиций, так как приводят к формированию более эффективного CMI-ответа или поскольку они менее вероятно индуцируют побочные эффекты или их легче вводить. Путь введения композиции вакцины может варьировать в зависимости от идентифицированного патогена или инфекции, которую необходимо предотвратить или лечить.NOI или белок можно вводить системным путем, или мукозальным путем, или атрансдермальным путем или его можно вводить непосредственно в конкретную ткань, такую как печень, костный мозг или в опухоль в случае терапии злокачественной опухоли. В используемом в данном описании смысле термин системное введение включает в себя, без ограничения, парентеральные пути введения. В частности, парентеральное введение включает в себя, но не ограничено указанным, подкожную, внутрибрюшинную, внутривенную, внутриартериальную, внутримышечную или внутригрудинную инъекцию,внутривенную, внутриартериальную инфузию или способы диализной инфузии почек. Предпочтительным системным парентеральным введением является внутримышечная инъекция. В одном предпочтительном варианте осуществления способа NOI или белок вводят через кожу, например, трансдермальным путем. Хотя предполагается, что можно использовать любой приемлемый способ и путь иммунизации и, тем не менее, достичь некоторых преимуществ согласно настоящему изобретению, описанные ниже примеры показывают конкретные преимущества в случае трансдермального введения NOI. В этом отношении и без связи с теорией предполагается, что трансдермальное введение является предпочтительным, поскольку он может более эффективно активировать опосредованную клетками ветвь иммунной системы. Термин трансдермальная доставка означает внутридермальное (например, в дерму и эпидерму),трансдермальное (например, чрескожное) и трансмукозальное введение, т.е. доставку в результате прохождения агента в или через кожу или слизистую ткань. См., например, Transdermal Drug Delivery:Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc.,(1987); and Transdermal Delivery of Drugs, vol. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987). Таким образом, термин охватывает доставку агента с использованием устройства для доставки частиц (например, безыгольного шприца), такого как устройства, описанные в патенте США 5630796, а также доставку с использованием устройств для опосредованной частицами доставки, таких как устройства, описанные в патенте США 5865796. В используемом в данном описании смысле термин мукозальное введение включает в себя, без ограничения, пероральное, интраназальное, внутривагинальное, внутриректальное, внутритрахеальное,кишечное и глазное введение. Мукозальные пути, особенно интраназальный, внутритрахеальный и глазной, являются предпочтительными для защиты от природного воздействия патогенов окружающей среды, таких как RSV, вирус гриппа и вирусы простуды или аллергенов, таких как пыльца трав и пыльца амброзии и клещи домашней пыли. Усиление CMI-ответа будет увеличивать защитное действие против встречаемого впоследствии антигена-мишени, такого как аллерген или микробный агент. В одном варианте осуществления способ согласно изобретению все введения при первой, и/или второй, и/или последующих иммунизациях осуществляют в места, которые дренируются одним и тем же лимфатическим узлом. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения NOI или белок можно вводить в клетки, которые были выделены из субъекта-хозяина. В данном предпочтительном варианте предпочтительно NOI, кодирующую EOI из ассоциированного с опухолью антигена (TAA), вводят в профессиональные антигенпрезентирующие клетки (АПК), такие как дендритные клетки. АПК могут быть получены от субъекта-хозяина и модифицированы ex vivo так, чтобы они экспрессировали EOI, и затем перенесены назад в организм субъекта-хозяина, чтобы индуцировать усиленный CMI-ответ противTAA с тем, чтобы вызвать противоопухолевый ответ. Предполагается, что дендритные клетки являются- 13012066 наиболее эффективными АПК для стимуляции усиленных CMI-ответов, так как экспрессированные EOI должны быть получены, процессированы и презентированы профессиональными АПК T-клеткам (какTh1-, так и Th2-хелперным клеткам, а также T-клеткам CD8+), чтобы индуцировать усиленный CMIответ. В альтернативном варианте злокачественные клетки из организма субъекта-хозяина могут быть модифицированы in situ или in vitro. Введение частиц NOI. Опосредованные частицами способы доставки препаратов NOI или белка известны в данной области. Таким образом, после приготовления и соответствующей очистки описанные выше NOI могут быть нанесены в виде покрытия на коровые частицы носителя с использованием множества способов, известных в данной области. Частицы носителя выбирают из материалов, которые имеют подходящую плотность, с размерами частиц в диапазоне, используемом для внутриклеточной доставки из устройства типа генной пушки. Оптимальный размер частиц носителя, конечно, будет зависеть от диаметра клеткимишени. Под коровым носителем понимают носитель, на который наносят в виде покрытия нуклеиновую кислоту гостя (например, ДНК, РНК), придавая определенный размер частицам, а также достаточно высокую плотность, чтобы достичь импульса, необходимого для проникновения через клеточную мембрану, так чтобы можно было доставить молекулу-гостя с использованием опосредованных частицами способов (см., например, патент США 5100792). Коровые носители обычно содержат такие материалы, как вольфрам, золото, платина, феррит, полистирол и латекс. См., например, Particle BombardmentTechnology for Gene Transfer (1994), Yang, N. ed., Oxford University Press, New York, NY, p. 10, 11. Частицы вольфрама и золота являются предпочтительными. Частицы вольфрама легко доступны со средним размером от 0,5 до 2,0 мкм в диаметре. Частицы золота или микрокристаллическое золото (например,порошок золота А 1570, доступный из Engelhard Corp., East Newark, NJ) также найдут применение согласно данному изобретению. Частицы золота обеспечивают однородность по размеру (доступны из Alpha Chemicals с размерами частиц 1-3 мкм, или доступны из Degussa, South Plainfield, NJ с диапазоном размера частиц, включающим 0,95 мкм). Микрокристаллическое золото дает разнообразное распределение частиц по размеру, обычно в диапазоне 0,5-5 мкм. Однако неравномерная площадь поверхности микрокристаллического золота обеспечивает высокоэффективное покрытие нуклеиновыми кислотами. Известны и описаны ряд способов покрытия или осаждения NOI или белков на частицы золота или вольфрама. В большинстве таких способов обычно объединяют предварительно определяемое количество золота или вольфрама с плазмидной ДНК, CaCl2 и спермидином. Полученный в результате раствор непрерывно встряхивают во время осуществления способа покрывания, чтобы обеспечить однородность реакционной смеси. После осаждения NOI покрытые частицы можно перенести на подходящие мембраны и дать возможность высохнуть перед использованием, они могут быть нанесены на поверхности модуля или кассеты для образца или загружены в кассету для доставки для применения в конкретных устройствах типа генной пушки. Под устройством для доставки частиц подразумевают устройство, которое доставляет композицию в виде частиц трансдермально без помощи обычной иглы, чтобы прокалывать кожу. Устройства для доставки частиц для применения согласно настоящему изобретению обсуждаются на протяжении данного документа. В данной области известны различные устройства для ускорения частиц, подходящие для опосредованной частицами доставки, и все они подходят для применения при практическом осуществлении изобретения. Конструкции современных устройств используют взрывную, электрическую или газовую разгрузку для приведения в движение покрытых частиц носителя по направлению к клеткаммишеням. Покрытые частицы носителя сами по себе могут быть связаны с подвижным слоем носителя с возможностью высвобождения, или связаны, хотя и с возможностью удаления, с поверхностью, вдоль которой проходит поток газа, снимающий частицы с поверхности и ускоряющий их по направлению к мишени. Пример устройства с галловой разгрузкой описан в патенте США 5204253. Устройства взрывного типа описано в патенте США 4945050. Одним примером устройства для ускорения частиц с типом разгрузки на основе гелия является устройство PowderJect XR (PowderJect Vaccines, Inc.,Madison), WI, и данное устройство описано в патенте США 5120657. Устройство с электрической разгрузкой, подходящее для применения в данном изобретении, описано в патенте США 5149655. Описание всех указанных патентов включено в виде ссылки в данное описание. Альтернативно имеющие форму частиц композиции NOI или белка можно вводить трансдермально, используя устройство безыгольного шприца. Например, имеющую форму частиц композицию, содержащую NOI согласно настоящему изобретению, можно получить, используя общепринятые фармацевтические способы, такие как простое выпаривание (кристаллизация), вакуумная сушка, распылительная сушка или лиофилизация. При желании частицы могут быть дополнительно уплотнены с использованием способов, описанных в одновременно находящейся на рассмотрении международной заявкеWO 97/48485, включенной в данное описание в виде ссылки. Затем указанные имеющие форму частиц композиции могут быть доставлены из безыгольной шприцевой системы, такой как системы, описанные в международных публикацияхWO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513 и WO 96/20022, которые все включены в данное описание в виде ссылки. Доставка частиц, содержащих антигены или аллергены,- 14012066 из указанных выше безыгольных шприцевых систем, на практике осуществляют, используя частицы,имеющие примерный размер обычно в диапазоне от 0,1 до 250 мкм, предпочтительно в диапазоне примерно 10-70 мкм. Частицы крупнее примерно 250 мкм также могут быть доставлены из устройств с верхним ограничением, представляющим собой точку, в которой размер частиц мог бы вызвать тяжелое повреждение клеток кожи. Реальное расстояние, на которое доставляемые частицы будут проникать в поверхность мишени, зависит от размера частиц (например, номинального диаметра частиц, при условии приблизительно сферической геометрии частиц), плотности частиц, начальной скорости, с которой частица ударяется о поверхность, и плотности и кинематической вязкости кожной ткани, являющейся мишенью. В этой связи оптимальные плотности частиц для применения при безыгольной инъекции обычно находятся в пределах примерно от 0,1 до 25 г/см 3, предпочтительно примерно от 0,9 до 1,5 г/см 3, и скорости инъекции обычно находятся в диапазоне примерно от 100 до 3000 м/с. При подходящем давлении газа частицы, имеющие средний диаметр 10-70 Rm, могут быть ускорены при прохождении через сопло при скоростях, приближающихся к сверхзвуковым скоростям рабочего потока газа. Имеющие форму частиц композиции или покрытые частицы вводят индивидууму способом, совместимым с дозированным препаратом, и в количестве, которое будет эффективным для целей согласно изобретению. Количество доставляемой композиции (например, примерно от 0,1 до 1 мг, более предпочтительно от 1 до 50 мкг антигена или аллергена) зависит от тестируемого индивидуума. Точное необходимое количество будет варьировать в зависимости от возраста и общего состояния индивидуума, подвергаемого лечению, и соответствующее эффективное количество легко может определить специалист в данной области после прочтения настоящего описания. Микрочастицы золота или вольфрама также можно использовать в качестве транспортирующих агентов, как описано в WO 93/17706 и Tang et al., Nature (1992), 356: 152. В данном конкретном случаеNOI осаждают на микрочастицы в присутствии хлорида кальция и спермидина и затем как целое вводят в виде высокоскоростной струи в дерму или в эпидерму, используя устройство без иглы, такое как устройства, описанные в патентах США 4945050 и 5015580, и в WO 94/24243. Количество NOI, которое можно использовать для вакцинации субъекта-хозяина, зависит от ряда факторов, например, таких как сила промотора, используемого для экспрессии антигена, иммуногенность экспрессируемого продукта,состояние млекопитающего, которому планируется введение (например, масса, возраст и общее состояние здоровья), способ введения и тип препарата. В общем подходящая доза для профилактического или терапевтического применения у взрослого человека составляет от примерно 1 пг до примерно 5 мг,предпочтительно от примерно 10 пг до примерно 1 мг, наиболее предпочтительно от примерно 25 до примерно 500 пг. Способы опосредованной частицами доставки сравнивали с другими типами введенияUSA, 91: 9519-9523. В таких исследованиях изучена опосредованная частицами доставка вакцин на основе нуклеиновой кислоты как в поверхностную кожу, так и в мышечную ткань. Одной из возможных причин заметно более хороших результатов, достигаемых с использованием генной пушки, является то,что NOI доставляют внутриклеточно, в отличие от внеклеточной доставки посредством внутримышечной инъекции. Предпочтительно интервал между введениями антигена-мишени (TA) находится в пределах примерно от 48 до 192 ч. Более предпочтительно интервал между введениями антигена-мишени (TA) находится в пределах примерно от 72 до 168 ч. Еще более предпочтительно интервалы между введениями антигена-мишени (TA) находятся в пределах примерно от 72 до 144 ч. Хозяин-млекопитающее в качестве субъекта. В используемом в данном описании смысле термин субъект, который является хозяиноммлекопитающим означает любого представителя типа Cordata, включая без ограничения человека и других приматов, включая приматов, отличных от человека, таких как шимпанзе и другие виды человекообразных обезьян и других обезьян; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашних млекопитающих, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая домашних, диких и охотничье-промысловых птиц, таких как куры, индюки и другие куриные, утки, гуси и т.п. Предпочтительные животные включают животных, используемых в спорте, таких как скаковые: лошади или лошади для конкура. Сроки не означают конкретный возраст. Таким образом, подразумевается, что включены как взрослые, так и новорожденные индивидуумы. Способ, описанный в данной публикации, предназначен для применения на любом из указанных выше видов позвоночных, так как иммунные системы всех указанных позвоночных работают сходным образом. В случае млекопитающего субъектом предпочтительно будет человек, но также может быть домашний скот, лабораторный субъект или домашний питомец. Профилактика и/или лечение. Данный способ или методика согласно настоящему изобретению широко применимы в способах вакцинации и относятся к разработке профилактических и/или терапевтических вакцин (включая иммунотерапевтические вакцины). Следует понимать, что в данном описании все ссылки на лечение включа- 15012066 ют терапевтическое, паллиативное и профилактическое лечение. В способе согласно настоящему изобретению описанные NOI или белок могут быть использованы отдельно, в виде части композиции, такой как, без ограничения, фармацевтическая композиция, или композиция вакцины, или иммунотерапевтическая композиция для профилактики и/или лечения опосредованного T-клетками иммунного расстройства. Введение NOI или белка или композиции, содержащейNOI или белок, может быть либо с профилактической, либо терапевтической целью. В используемом в данном описании смысле термин терапевтическое или лечение включает любое из нижеперечисленного: профилактику инфекции или повторной инфекции; уменьшение или исключение симптомов и уменьшение количества или полную элиминацию патогена. Лечение можно осуществлять профилактически (перед инфекцией) или терапевтически (после инфекции). Профилактика или терапия включают, без ограничения, индукцию эффективного CMI-иммунного ответа на NOI и/или ослабление, снижение, исцеление или по меньшей мере частичное купирование симптомов и/или осложнений, возникающих в результате опосредованного T-клетками иммунного расстройства. При профилактическом введении композицию согласно настоящему изобретению обычно вводят перед проявлением какого-либо симптома. Профилактическое введение NOI или композиции согласно настоящему изобретению означает предотвращение или улучшение состояния при любой последующей инфекции или заболевании. При введении терапевтически NOI или композицию согласно настоящему изобретению обычно вводят при проявлении или вскоре после проявления симптома инфекции или заболевания. Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению может быть дана либо перед ожидаемым воздействием агента, вызывающего заболевание, либо перед проявлением патологического состояния, либо после начала инфекции или заболевания. Является ли профилактическое или терапевтическое введение NOI или белка (либо отдельно, либо в виде части композиции) более подходящим, обычно будет зависеть от природы заболевания. В качестве примера иммунотерапевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть использована в протоколах иммунотерапии для активной индукции противоопухолевого иммунитета посредством вакцинации опухолевой клеткой или ее антигенными компонентами. Указанная последняя форма лечения предпочтительна, поскольку иммунитет является длительным и поскольку согласно общему мнению одним из наилучших путей элиминации опухолей была бы индукция сильного специфичного противоопухолевого CTL-ответа. С другой стороны, композицию вакцины предпочтительно будут, хотя и не обязательно, использовать профилактически, чтобы индуцировать эффективный CMI-ответ против встречающихся впоследствии антигенов или их частей (таких как эпитопы), относящихся к антигенумишени. Профилактически или терапевтически эффективное количество. Доза NOI или белка, вводимого субъекту-хозяину в контексте настоящего изобретения, должна быть достаточной, чтобы осуществить полезный профилактический или терапевтический CMI-ответ у субъекта в течение времени. В используемом в данном описании смысле термин профилактически или терапевтически эффективная доза означает дозу в количестве, достаточном, чтобы вызвать усиленный CMI-ответ на один или несколько EOI специфичных антигенов-мишеней и/или ослабить, уменьшить, излечить или, по меньшей мере частично, купировать симптомы и/или осложнения при заболевании, таком как опосредованноеT-клетками иммунное расстройство. Дозирование. Профилактику или терапию можно осуществить посредством однократного прямого введения в одной временной точке или множестве временных точек. Введение также может быть осуществлено в одно или во множество мест. Некоторые пути введения, такие как мукозальное введение глазных капель, могут требовать более высоких доз. Специалисты в данной области могут корректировать дозирование и концентрацию, чтобы они подходили для конкретного пути доставки. Преимущественно примеры показывают, что однократная доза NOI или композиции, содержащей NOI, обычно достаточна, чтобы достичь усиленного CMI-ответа. Состояния и заболевания. Поскольку способ согласно изобретению вызывает усиленный CMI-ответ, то его можно применять для защиты от последующей инфекции патогеном, таким как вирусный, бактериальный, паразитический или другой инфекционный агент. Предпочтительно антигеном-мишенью является патоген или антиген,связанный с инфекционным заболеванием, аллерген или злокачественная опухоль. Примеры инфекционного заболевания включают, но не ограничены указанным, вирусное, бактериальное, микобактериальное и паразитарное заболевание. Примеры аллергенов включают, но не ограничены указанным, пыльцу растений, белки клещей домашней пыли, перхоть животных, слюну и споры грибов. Примеры ассоциированных с опухолями антигенов (TAA) включают, но не ограничены указанным, живые или облученные опухолевые клетки, экстракты опухолевых клеток и субъединицы белков опухолевых антигенов. Антигеном также может быть белок спермы для применения в контрацепции. В некоторых вариантах антигеном является антиген окружающей среды. Примеры антигенов окружающей среды включают, но не ограничены указанным, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирусы гриппа и вирусы простуды.- 16012066 Патогены, которые вторгаются через слизистую оболочку, также включают патогены, которые вызывают состояния, вызванные респираторно-синцитиальным вирусом, грипп, другие заболевания верхних дыхательных путей, а также агенты, которые вызывают кишечные инфекции. Среди нескольких известных примеров других заболеваний, против которых важен усиленныйCMI-ответ, следующие заболевания: инфекции и заболевания, вызванные вирусами, такими как, без ограничения, ВИЧ, вирус простого герпеса, опоясывающего герпеса, гепатита С, гепатита В, гриппа, вирус Эпштейн-Барр, кори, денге, HTLV-1 и вирус папилломы человека (HPV) (например, HPV 16); заболевания, вызванные бактериями, такими как, без ограничения, Mycobacterium tuberculosis и Listeria sp,Chlamydia, Mycobacteria, Plasmodium falciparum, Legioniella и энтеропатогенные, энтеротоксикогенные,энтероинвазивные, энтерогеморрагические и энтероагрегированные E.coli, и заболевания, вызванные патогенными простейшими, к которым относятся, без ограничения, малярия, Babesia, Schistosoma,Toxiplasma и Toxocara canis или простейшими-паразитами Toxoplasma и Trypanosoma. Кроме того, предполагается, что схема введения, приведенная в данном описании, является полезной при иммунизации против форм злокачественной опухоли, при которых T-клеточные ответы играют защитную роль. Примерами злокачественных опухолей млекопитающих, которые можно лечить с применением: способа и композиций согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничены указанным, меланому, метастазы, аденокарциному, тимому, лимфому, саркому, рак легкого, рак печени, рак ободочной кишки, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, лейкозы, рак матки, рак молочной железы, рак простаты, рак яичника, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак почек, рак поджелудочной железы и тому подобные. В одном варианте злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, которая связана, например вызвана, HPV (например, HPV 16). Такой злокачественной опухолью может быть рак шейки матки. Злокачественная опухоль. В одном предпочтительном варианте применение NOI, кодирующей EOI (или белок, содержащий эпитоп) из ассоциированного с опухолью антигена-мишени (TAA), в способе согласно настоящему изобретению позволяет разработать целенаправленные антигенспецифические вакцины для терапии злокачественной опухоли. Введение NOI, кодирующей EOI из TAA, и, необязательно, NOI, кодирующей иммуномодулирующую молекулу, обеспечивает мощную систему, вызывающую специфично усиленныйCMI-ответ в плане профилактики у субъекта-хозяина с повышенным риском развития злокачественной опухоли (превентивная иммунизация), профилактики рецидива болезни после первичной хирургической операции (противометастазная вакцинация) или в качестве средства увеличения количества T-клеток invivo, таким образом повышая их эффективность в радикальном удалении диффузных опухолей (лечение установленного заболевания). Дополнительно способ согласно настоящему изобретению может быть использован для того, чтобы вызвать усиленный CMI-ответ у субъекта-хозяина посредством обработки клеток ex vivo перед их переносом назад носителю опухоли (также известный как адоптивная иммунотерапия). Способ или методика согласно настоящему изобретению могут быть использованы для введенияNOI субъекту-хозяину либо до появления какого-либо симптома злокачественных опухолей, таких как меланома (= превентивная вакцинация), либо, чтобы добиться регресса заболевания у млекопитающего,пораженного злокачественной опухолью, такой как меланома (терапевтическая или иммунотерапевтическая вакцинация). В одном варианте NOI кодирует антиген из HPV (например, HPV 16), такой как Е 6 или Е 7. Активированные T-клетки. В других аспектах настоящее изобретение относится к способу получения активированныхT-клеток. В своем наиболее общем смысле данный способ заключается во введении, предпочтительно трансдермально, NOI, кодирующей предварительно выбираемый EOI антигена-мишени, способной усиливать CMI-ответ, например усиленный T-клеточный ответ, субъекту-хозяину. Согласно данному аспекту изобретения T-клетки извлекают из лимфатических узлов хозяина для дальнейшего применения. Предполагаются многочисленные возможные применения специфично активированных T-клеток. Например, в случае терапии человека предполагается, что специфично активированные T-клетки можно культивировать ex vivo и вводить человеку для лечения вирусных инфекций или лечения пациентов со злокачественной опухолью. Согласно данному аспекту изобретения T-клетки получают в результате введения NOI in vivo и затем выделения T-клеток для размножения in vitro в присутствии соответствующих модификаторов биологического ответа и/или иммуномодуляторов и/или адъювантов, таких как, без ограничения, пептид, цитокины и антигенпрезентирующие клетки. Гомологи. Белки (включая белковые антигены), такие как Gag, nef и/или RT, которые используются в изобретении (которые кодируются NOI), могут иметь гомологию и/или идентичность последовательностей с встречающимися в природе формами. Сходным образом кодирующие последовательности NOI, способные экспрессировать такие белки, обычно будут иметь гомологию и/или идентичность последовательностей с встречающимися в природе последовательностями. Способы определения идентичности последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот также известны в данной области. Обычно такие способы включают в себя определение нуклеотидной последовательности мРНК для гена и/или опреде- 17012066 ление кодируемой ею аминокислотой последовательности и сравнение указанной последовательности со второй нуклеотидной или аминокислотной последовательностью. В общем идентичность относится к точному соответствию нуклеотида с нуклеотидом или аминокислоты с аминокислотой двух полинуклеотидов или полипептидных последовательностей, соответственно. Две или более последовательности (полинуклеотидные или аминокислотные) можно сравнить посредством определения их идентичности в процентах. Идентичность в процентах двух последовательностей, либо нуклеиновых кислот, либо аминокислотных последовательностей означает число точных совпадений между двумя выровненными последовательностями, деленное на длину более коротких последовательностей и умноженное на 100. Приближенное выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот обеспечивается алгоритмом локальной гомологии Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2: 482-489 (1981). Указанный алгоритм может быть применен к аминокислотным последовательностям благодаря использованию матрицы для подсчета, разработанной Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoffed., 5 suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C, USA и нормализованной Gribskov, Nucl. Acids Res. 14 (6): 6745-6763 (1986). Иллюстративное выполнение данного алгоритма для определения идентичности последовательности представлено Genetics Computer Group(Madison, W.I.) в заявке на применение BestFit. Параметры по умолчанию для данного способа описаны в руководстве к пакету программ для анализа последовательностей Wisconsin, версия 8 (1995) (доступному из Genetics Computer Group, Madison, WI). Предпочтительным способом установления идентичности (в процентах) в контексте настоящего изобретения является использование пакета программMPSRCH, защищенного авторским правом University of Edinburgh, разработанного John F. Collins иShane S. Sturrok и распространяемого IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). На основе данного набора пакетов программ может быть применен алгоритм Smith-Waterman, в котором используются параметры по умолчанию для таблицы подсчета (например, штраф за внесение пробела 12, штраф за продолжение пробела единица и пробел - 6). На основании полученных данных значение совпадение отражает идентичность последовательностей. Другие подходящие программы для расчета идентичности или сходства в процентах между последовательностями широко известны в данной области, например, другой программой выравнивания является BLAST, используемая с параметрами по умолчанию. Например, BLASTN и BLASTP могут быть применены с использованием параметров по умолчанию: генетический код = стандартный; фильтр = отсутствует; нить = обе; предел отсечения = 60; ожидание = 10; матрица = BLOSUM62; описания = 50 последовательностей; сортировка = HIGH SCOPE; база данных = не избыточная, трансляции кодирующих последовательностей GenBank + EMBL + DDBJ+ PDB + GenBank CDS translatons + Swiss protein + Spupdate +PIR. Подробности указанных программ можно найти в Интернете по адресу: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST. Альтернативно гомологию можно определить посредством гибридизации полинуклеотидов в условиях, при которых образуются стабильные дуплексы между гомологичными областями с последующим расщеплением нуклеазой(ами), специфичной для однонитевых участков, и определением размера расщепленных фрагментов. Две последовательности ДНК или две полипептидных последовательности являются в значительной степени гомологичными друг другу, если последовательности обладают по меньшей мере примерно 80-85%, предпочтительно по меньшей мере примерно 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 95-98% идентичностью последовательностей на протяжении определенной длины молекул, которую определяют, используя описанные выше способы. В используемом в данном описании смысле термин в значительной степени гомологичные или гомологичные также относится к последовательностям, проявляющим полную идентичность с конкретной последовательностью ДНК или полипептида. Последовательности ДНК, которые являются в значительной степени гомологичными или гомологичными, могут быть идентифицированы в эксперименте по Саузерн-гибридизации, например, в жестких условиях, которые определяют для данной конкретной системы. Например, жесткие условия гибридизации могут заключаться в 50% формамиде, 5 растворе Денхардта, 5 SSC, 0,1% SDS и 100 пг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, и условия для промывки могут заключать 2 SSC, 0,1% SDS при 37 С, затем 1 SSC, 0,1% SDS при 68 С. Определение подходящих условий гибридизации может осуществить специалист в данной области. Способы анализа. Эффективность способа согласно изобретению можно тестировать, используя следующие стадии:(i) введение NOI, как указано в данном описании, субъекту-хозяину, такому как человек или экспериментальное животное, такое как мышь, крыса, кролик, морская свинка, коза, макака-резус или шимпанзе;(ii) затем сбор клеток из крови, селезенки или другой лимфоидной ткани от субъекта-хозяина и(iii) тестирование в отношении наличия активированных T-клеток, таких как T-клетки, которые примированы на то, чтобы убивать или лизировать клетки, продуцирующие компонент инфекционного агента.- 18012066 После осуществления введения NOI извлекают T-клетки из лимфоидной ткани субъекта-хозяина. Предпочтительной лимфоидной тканью будет ткань лимфатических узлов и наиболее предпочтительно ткань из дренирующих лимфатических узлов, проксимальных по отношению к месту введения NOI. В используемом в данном описании смысле подразумевается, что слова проксимальный узел относятся к узлу или узлам, которые расположены проксимально по отношению к месту введения NOI. Такие узлы физически расположены вблизи места введения NOI или в области, дренирующей место введения, и также включают дренирующие узлы, которые физически расположены на большем расстоянии от места введения. Конечная стадия способа, анализа заключается в определении того, были ли активированыT-клетки. Обычно уровень активации T-клеток можно измерить с помощью анализов, которые включают, но не ограничены указанным, анализы высвобождения радиоактивного хрома, или другие радиоизотопные анализы, или анализы отдельных клеток. Кроме того, можно использовать анализы отдельныхT-клеток с применением прижизненных красителей и/или сортировщиков клеток. Предпочтительный способ измерения активации T-клеток заключается в осуществлении контакта эффективного для киллинга количества T-клеток с совпадающими по MHC клетками-мишенями, которые имеют выбранный для исследования EOI на своих клеточных поверхностях; поддерживании контакта в течение периода времени, достаточного для того, чтобы T-клетки лизировали клетки-мишени; и определении степени опосредованного T-клетками лизиса клеток-мишеней. Однако можно использовать любой способ, позволяющий определять специфичный T-клеточный ответ, включая, без ограничения, анализы высвобождения хрома, анализы отдельных клеток или даже определение межклеточных конъюгатов. В одном варианте изобретение относится к анализу в отношении тестирования эффективности способа, вызывающего T-клеточный ответ, при этом способом, вызывающим T-клеточный ответ, является такой же способ, как любой из способов, приведенных в данном описании. Таким образом, способ может включать в себя:(i) первую иммунизацию, которая состоит по меньшей мере из двух введений субъекту с интервалом от 1 до 14 дней, при этом каждое введение представляет собой введение представляющей интерес нуклеотидной последовательности (NOI), кодирующей T-клеточный эпитоп, и необязательно(ii) вторую иммунизацию, которая включает в себя по меньшей мере одно введение субъекту(a) NOI, кодирующей T-клеточный эпитоп, или (b) белка, содержащего T-клеточный эпитоп,при этом период между первым введением при первой иммунизации и первым введением при второй иммунизации составляет от 21 до 365 дней,при этом анализ включает в себя осуществление способа на субъекте-млекопитающем и затем определение у субъекта уровня активированных T-клеток или T-клеток памяти, специфичных по отношению к эпитопу. Предполагается, что более высокий уровень T-клеточного ответа достигается, если все введения(i) при первой иммунизации осуществляются до того, как уровень активированных T-клеток, которые образуются при начальном введении(ях), возвратится к исходному уровню, и (b) при второй иммунизация осуществляются после возвращения T-клеток к исходному уровню. Поэтому описанный выше анализ можно использовать для определения того, имеет ли данный способ, вызывающий T-клеточный ответ, первую и вторую иммунизации, которые осуществляются в соответствующий в отношении уровней активированных T-клеток период времени. В одном варианте анализ заключается в определении того,(i) укладываются ли все введения при первой иммунизации в период времени между первым введением первой иммунизации и снижением уровня активированных T-клеток до исходного уровня и/или (ii) происходит ли первое введение при второй иммунизации после снижения уровня активированных T-клеток до исходного уровня. Другие аспекты. В следующем аспекте предлагается способ, избирательно вызывающий усиленный гуморальный ответ без необходимости вызывать связанной усиление CMI-ответа, при этом способ заключается во введении NOI, кодирующей один или несколько EOI TA, по меньшей мере 3 раза субъекту-хозяину, при этом интервал времени между каждыми введениями NOI составляет примерно 48 ч и при этом способ является эффективным в обеспечении усиленного гуморального иммунного ответа против каждого экспрессируемого EOI у хозяина-млекопитающего. В другом аспекте предлагается способ, вызывающий усиленный гуморальный ответ, при этом способ заключается во введении NOI, кодирующей один или несколько EOI TA, по меньшей мере 3 раза субъекту-хозяину, при этом интервал времени между каждыми введениями NOI составляет примерно 28 дней и при этом способ является эффективным в обеспечении усиленного CMI-ответа, который помогает усиливать гуморальный иммунный ответ против каждого экспрессируемого EOI у хозяинамлекопитающего.- 19012066 Композиции. Настоящее изобретение относится к композициям, которые применимы для профилактики и/или лечения опосредованных T-клетками иммунных расстройств. В одном варианте композиция представляет собой фармацевтическую композицию. В другом предпочтительном варианте композиция представляет собой иммунотерапевтическую композицию. В еще более предпочтительном варианте композиция является композицией вакцины. Композиция может содержать терапевтически или профилактически эффективное количество NOI, кодирующей EOI TA согласно изобретению, которые описаны выше. Композиция также может содержать носитель, такой как фармацевтически или иммунологически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители или иммунологически приемлемые носители отчасти определяют по конкретной вводимой композиции, а также по конкретному способу, используемому для введения композиции. Соответственно, существует широкое множество подходящих составов фармацевтических композиций вакцин или иммунотерапевтических композиций согласно настоящему изобретению. Препараты.NOI или белок могут быть приготовлены в виде фармацевтической композиции, или иммунотерапевтической композиции, или композиции вакцины. Такие препараты содержат NOI или белок, объединенный с фармацевтически приемлемым носителем, таким как стерильная воды или стерильный изотонический физиологический раствор. Такие препараты могут быть приготовлены, упакованы или представлены на продажу в форме, подходящей для болюсного или для непрерывного введения. Инъекционные препараты могут быть приготовлены, упакованы или представлены на продажу в дозированной лекарственной форме, такой как ампулы или емкости с множеством доз, содержащие консервант. Препараты включают, но не ограничены указанным, суспензии, растворы, эмульсии в масляном или водном наполнителях, пасты и имплантируемые препараты длительного высвобождения или биоразрушаемые препараты. Такие препараты дополнительно могут содержать один или несколько дополнительных ингредиентов, включая без ограничения суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие агенты. В одном варианте препарата для парентерального введения активный ингредиент находится в сухой форме(например, в виде порошка или гранул) для перерастворения в подходящем наполнителе (например, в стерильной алирогенной воде) перед парентеральным введением: перерастворенной композиции. Фармацевтические композиции могут быть приготовлены, упакованы или представлены на продажу в форме стерильной инъекционной водной или масляной суспензии или раствора. Указанная суспензия или раствор могут быть приготовлены, как известно в данной области, и могут содержать, кроме активного ингредиента, дополнительные ингредиенты, такие как диспергирующие агенты, увлажнители или суспендирующие агенты, приведенные в данном описании. Такие стерильные инъекционные препараты могут быть приготовлены с использованием нетоксичного парентерально приемлемого разбавителя или растворителя, такого, например, как вода или 1,3-бутандиол. Другие приемлемые разбавители и растворители включают, но не ограничены указанным, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия и нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды. Другие парентерально вводимые препараты, которые применимы, включают препараты, которые содержат активный ингредиент в микрокристаллической форме, в липосомном препарате или в виде компонента систем на основе биоразрушаемых полимеров. Композиции для длительного высвобождения или имплантации могут содержать фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы, такие как эмульсия, ионообменная смола, плохо растворимый полимер или плохо растворимая соль. Также в изобретение включен набор для усиления CMI-ответа на EOI антигена-мишени. Такой набор содержит NOI, кодирующую EOI TA, и/или белок, содержащий эпитоп. Набор также может содержать адъювант, предпочтительно генетический адъювант вводят совместно или в виде части NOI или белка, и инструкции по введению NOI или белка. Другие предпочтительные компоненты набора включают аппликатор для введения NOI или белка. В используемом в данном описании смысле термин аппликатор относится к любому устройству, включая, без ограничения, шприц для подкожных инъекций,генную пушку, устройство для ускорения частиц, распылитель, капельницу, бронхоскоп, суппозиторий,пропитанный или имеющий покрытие, вагинально вводимый материал, такой как тампон, препарат для спринцевания, раствор для вагинального спринцевания, препарат для удерживающей клизмы, суппозиторий или раствор для ректального спринцевания или спринцевания ободочной кишки, для примененияNOI либо системно, либо мукозально, либо трансдермально субъекту-хозяину. Примеры Далее изобретение будет описано только в виде примера, в котором даются ссылки на следующие фигуры. Приведенные примеры представлены только для иллюстрации настоящего изобретения и для того, чтобы помочь специалисту в данной области в осуществлении и применении изобретения. Примеры никоим образом не предназначены ограничивать объем изобретения. Предприняты попытки обеспечить точность в отношении используемых числовых значений (например, количества, температуры и т.д.), но, конечно, необходимо учитывать некоторую ошибку эксперимента и отклонение.- 20012066 Краткое описание фигур На фиг. 1 представлены ответы (T-клеток CD8+) после 1, 2 или 4 введений NOI мышам в течение 1 недели на 7 день (D 7), 0 день и 7 день (D 0, 7) или в 0, 2, 4, и 7 дни (D 0, 2, 4, 7) соответственно. Осуществляли 1 или 2 впрыскивания на одно введение NOI и в одной группе совместно с NOI вводили адъювант LT: на фиг. 1A показан CD8+ T-клеточный ответ после введения плазмиды с одним геном ICP27; на фиг. 1B показан CD8+ T-клеточный ответ после введения мультигенной плазмиды pJV7630. На фиг. 2 показана защита мышей от инфекционного контрольного заражения с использованием кластерного введения NOI. На фиг. 3 А показаны оптимальные интервалы времени между кластерными введениями плазмиды с одним геном ICP27. На фиг. 3 В показаны клеточные ответы, полученные после кластерного введения NOI плазмиды с одним геном HbsAg. На фиг. 3 С показан титр антител, полученных после кластерного введения NOI плазмиды с одним геном HbsAg. На фиг. 4 А показаны измерения ELISPOT через 1 неделю после кластерных введений NOI мультигенной плазмиды (PJV7630) с интервалами 0, 1, 2, 4 и 6 дней между введениями. На фиг. 4 В показаны измерения ELISPOT через 3 недели после кластерных введений NOI мультигенной плазмиды (PJV7630) с интервалами 0, 1, 2, 4 и 6 дней между введениями. Фиг. 5 А является схематичной диаграммой, показывающей, что каждое введение слагается из 1-4 введений XRI и периода покоя между каждыми введениями. На фиг. 5 В показан CMI-ответ в виде высвобождения IFN-, полученный в результате комбинирования генетического адъюванта LT и схемы кластерного введения NOI. На фиг. 5 С показан гуморальный ответ, полученный в результате комбинирования генетического адъюванта LT и схемы кластерного введения NOI. На фиг. 6 А показаны данные ELISPOT IFN-, полученные на домашних свиньях после первой кластерной иммунизации. На фиг. 6 В показана средняя площадь эритемы, имеющейся в месте введения антигена у свиней(4 животных), иммунизированных pPJV7630. На фиг. 7 показан ответ в виде антител против гемагглютинина (HA) у домашних свиней. На фиг. 8 показана плазмида pPJV1671, которая представляет собой вакцинный вектор на основе ДНК человека, кодирующей антиген НА гриппа A/Panama/2007/99 (H3N2). На фиг. 9 показано сравнение природной последовательности HA H3 Panama с НА Н 3 Panama, кодируемой pPJV1671, и консенсусной последовательностью. На фиг. 10 показана карта плазмиды pPJV2012. На фиг. 11 показана карта плазмиды pPJV7563. На фиг. 12 представлена нуклеотидная последовательность плазмиды pPJV7563. На фиг. 13 представлена блок-схема конструирования PJV7563. На фиг. 14(i)-(viii) представлены карты характерных признаков ключевых плазмид при конструировании pPJV7563. На фиг. 15 представлена блок-схема происхождения плазмид WRG7074 и WRG7128. На фиг. 16(i)-(v) представлены дополнительные карты характерных признаков ключевых плазмид. Фиг. 17-22 относятся к конструкциям, которые экспрессируют антигены ВИЧ, и к последовательностям, которые кодируют антигены ВИЧ. Фиг. 23-28 относятся к иммунизации антигенами Е 6 и Е 7 HPV. Фиг. 29-38 показывают результаты дополнительных экспериментов, в которых исследовали ответ,полученный с применением способа согласно изобретению. Общие способы Если не оговорено особо, используемые в настоящем изобретении методики рекомбинантной ДНК представляют собой стандартные способы, хорошо известные специалистам в данной области. Такие способы описаны и объясняются в литературе в таких источниках, как J. Perbal, A Practical Guide toApproach, Vol. 1-4, IRL Press (1995 and 1996); and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, GreenePub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все имеющие до настоящего времени обновленные версии), которые включены в данное описание в виде ссылки. Способ согласно настоящему изобретению заключается в прямом внедрении in vivo NOI, кодирующей по меньшей мере один или несколько EOI TA, в ткани субъекта для экспрессии EOI клетками ткани субъекта.- 21012066 Конструкции NOI согласно настоящему изобретению могут быть получены обычными способами,известными специалисту в данной области. Способы конструирования плазмидных ДНК или рекомбинантных векторов описаны в общедоступной литературе, например Burger et al., J. Gen. Virol., 72: 359367 (1991), и хорошо известны в данной области. См. также Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; and Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, GreenWiley, New York. В качестве примера NOI, которые кодируют один или несколько EOI TA или последовательности, в достаточной степени гомологичные известным EOI TA, чтобы индуцировать CMI-ответы, могут быть получены хорошо известными способами, описанными в данной области для выделения NOI из многочисленных источников, которыми являются микроорганизмы. Альтернативно, NOI, кодирующие EOITA, могут быть синтезированы в синтезаторе нуклеиновых кислот. Таким образом, изобретение относится к синтезируемым формам NOI, кодирующим EOI TA. Другие рекомбинантные бактериальные плазмиды или вирусные векторы, которые содержат такие изолированные NOI и которые предпочтительно способны направлять экспрессию EOI TA, кодируемого NOI в клетке-хозяине; и клетки, содержащие такие векторы, либо эукариотические, либо прокариотические клетки, предпочтительно эукариотические клетки, также получают известными способами. Чтобы обеспечить экспрессию EOI TA посредством NOI в форме плазмиды или вирусного вектора, NOI оперативно связывают с промоторной/регуляторной областью, способной управлять высокими уровнями экспрессии антигена в клетках-хозяевах. Множество таких промоторных/регуляторных последовательностей доступно в данной области, включая без ограничения, например, последовательность немедленного раннего промотора/энхансера цитомегаловируса,ранний промотор SV40, промотор вируса саркомы Рауса и другие промоторные/энхансерные последовательности млекопитающих. В используемом в данном описании смысле термин промоторная/регуляторная последовательность относится к последовательности ДНК, которая требуется для экспрессии NOI, оперативно связанной с промоторной/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях промоторная/регуляторная последовательность может функционировать тканеспецифичным образом, так как промоторная/регуляторная последовательность способна управлять экспрессией только в клетке конкретного типа ткани. Если не оговорено особо, выбор любого конкретного плазмидного вектора или другого ДНК-вектора или вирусного вектора не является ограничивающим фактором в данном изобретении, и векторы, указанные в данном описании, могут быть заменены другими ДНК или вирусными векторами после прочтения данного описания. Специалисты в данной области могут выбрать конкретные промоторные/регуляторные последовательности и оперативно связать указанные промоторные/регуляторные последовательности с последовательностью ДНК, кодирующей требуемый антиген. Такая методика хорошо известна в данной области и описана, например, в Sambrook (там же) и Ausubel(там же). Использовали следующие общие способы, чтобы провести исследования, описанные в примерах 1-5 ниже. В каждом исследовании NOI, содержащие EOI, наносили в виде покрытия на частицы золота,чтобы получить примеры композиций согласно настоящему изобретению. Покрытые частицы вводили животным и оценивали способность композиций вызывать антигенспецифичные T-клеточные и/или гуморальный ответы. Покрывание коровых частиц носителя. Делали соответствующие навески частиц золота непосредственно в пробирках Эппендорф объемом 1,5 мл. Затем добавляли примерно 300 мкл 0,05 M раствора спермидина, чтобы суспендировать золото,используя ультразвуковое устройство для диспергирования золота. Затем к раствору золота/спермидина добавляли раствор (примерно 50 мкл), содержащий соответствующую плазмидную ДНК, в концентрации 2 мкг ДНК/мг золота. Раствор ДНК может содержать один тип плазмиды или в случае некоторых экспериментов две или более плазмиды (например, генетический адъювант) можно смешать вместе перед смешиванием с раствором золота. Смесь ДНК/золото встряхивали при небольшой скорости и во время встряхивания по каплям добавляли 300 мкл 10% раствора CaCl2. Частицам ДНК/золото давали возможность осесть при комнатной температуре и затем недолго центрифугировали (10-15 с), чтобы осадить золото. Осадок 3 раза промывали примерно 800 мкл EtOH. Затем частицы ДНК/золото суспендировали в растворе 0,03 мг/мл PVP (поливинилпирролидона), приготовленного в EtOH, примерно в концентрации 1 мг ДНК/золота в 3 мл раствора PVP. Затем полученный раствор наносили в виде покрытия на трубку из тефзела, как описано ранее. См., например, заявку на выдачу патента PCT/US95/00780 и патенты США 5733600, 5780100, 5865796 и 5584807, описания которых включены в данное описание в виде ссылки. Поверхностный антиген гепатита B (HBSAG). Конструирование плазмиды (конструкция PWRG7128). Векторную плазмиду для поверхностного антигена гепатита В (HBsAg) конструировали следующим образом. Чтобы создать кодирующую область HBsAg, конструкцию pAM6 (полученную из Американской коллекции типовых культур АТСС) разрезали NcoI и обрабатывали нуклеазой золотистой фасоли, чтобы удалить стартовый кодон Х-антигена. Затем полученную в результате ДНК разрезали BamHI и обрабатывали ДНК-полимеразой Т 4, чтобы затупить концы ДНК и создать кассету экспрессии HBsAg. Кассета экспрессии HbsAg присутствует во фрагменте длиной 1,2 т.п.н. Конструкцию плазмидыpPJV7077 (Schmaljohn et al. (1997), J. Virol. 71: 9563-9569), которая содержит полноразмерный немедленный ранний промотор CMV человека (штамм Towne) (с энхансером), разрезали HindIII и BglII и затем обрабатывали ДНК-полимеразой Т 4 и щелочной фосфатазой теленка, чтобы создать ДНК с тупыми концами, и кассету экспрессии HbsAg лигировали в плазмиду, получая конструкцию pWRG7128. Иммуноанализы in vitro. Образцы сыворотки от отдельных мышей тестировали в отношении антител, специфичных кHBsAg, используя анализ ELISA. Для ELISA планшеты для микротитрования Falcon Pro Bind покрывали в течение ночи при 4C очищенным HBsAg (BioDesign) по 0,1 мкг на лунку в PBS (фосфатно-солевой буфер, BioWhittaker). Планшеты блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ) смесью 5% сухое молоко/PBS, затем 3 раза промывали буфером для промывки (забуференный 10 мМ трисом физиологический раствор, 0,1% Brij-35) и в планшет добавляли образцы сыворотки, разбавленные в буфере для разведения (2% сухое молоко/PBS/0,05% Твин 20) и инкубировали в течение 2 ч при КТ. Планшеты 3 раза промывали и в планшет добавляли биотинилированное противомышиное антитело козы (SouthernBiotechnology), разбавленное 1:8000 в буфере для разведения, и инкубировали в течение 1 ч при КТ. После инкубации планшеты 3 раза промывали, после этого добавляли конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена (Southern Biotechnology) в разведении 1:8000 в PBS и планшет инкубировали еще в течение 1 ч при КТ. После трех дополнительных промывок планшеты промывали 3 раза, затем добавляли раствор субстрата TMB (BioRad) и реакцию останавливали 1 н. H2SO4 через 30 мин. Регистрировали оптическую плотность при 450 нм. Конечные титры рассчитывали путем сравнения образцов со стандартом с известным титром. Для клеточного иммунного анализа суспензии отдельных клеток спленоцитов из селезенки иммунизированных животных культивировали in vitro в присутствии пептида, соответствующего известномуCD8-эпитопу у мышей Balb/c. Пептид растворяли в ДМСО (10 мг/мл) и разбавляли до 10 мкг/мл в культуре. Последовательность пептида представляла собой IPQSLDSWWTSL (SEQ ID NO: 20). Для анализа ELISPOT IFN- планшеты с фильтрующими мембранами покрывали 50 мкл 15 мкг/мл антисыворотки против IFN- (Pharmingen) в стерильном 0,1 M карбонатном буфере (рН 9,6) в течение ночи при 4C. Планшеты 6 раз промывали стерильным PBS и затем блокировали средой для культуры ткани, содержащей 10% фетальную сыворотку теленка (FBS), в течение 1-2 ч при КТ. Среду удаляли и клетки селезенки распределяли в лунки, всего по 1106 клеток на лунку. В случае лунок, в которые добавляли меньше 1106 клеток от иммунизированных животных, использовали клетки от нативных животных, чтобы довести общее количество до 1106. Клетки инкубировали в течение ночи в инкубаторе для культуры ткани в присутствии пептида, который описан выше. Затем планшеты 2 раза промывалиPBS и 1 раз дистиллированной водой. После этого следовали 3 промывки PBS. В планшет добавляли биотинилированное моноклональное антитело против IFN- (Pharmingen) (50 мкл раствора 1 мкг/мл вPBS) и инкубировали в течение 2 ч при КТ. Планшеты промывали 6 раз PBS, после этого добавляли 50 мкл конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза (1:1000 в PBS, Pharmingen) и инкубировали в течение 2 ч при КТ. Планшеты промывали 6 раз PBS, добавляли дающий окраску субстрат щелочной фосфатазы (BioRad) и реакции давали возможность продолжаться вплоть до появления темных пятен. Реакцию останавливали 3-кратной промывкой водой. Планшеты сушили на воздухе и подсчитывали пятна под микроскопом. Антиген GP120 ВИЧ-1. Конструирование плазмиды, кодирующей антиген GP120 ВИЧ-1. Плазмидный вектор, кодирующий gp120 ВИЧ-1, конструировали следующим образом. Вектор конструировали, начиная с остова плазмиды Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA), немедленного раннего промотора цитомегаловируса человека (hCMV) (Fuller et al. (1994) Aids Res. Hum Retroviruces 10:1433) и позднего сайта полиаденилирования вируса SV40. Промотор hCMV находится в AccII-фрагменте длиной 619 пар оснований (п.н.), простирающемся на 522 п.н. выше и 96 п.н. ниже от сайта инициации немедленной ранней транскрипции. Последовательность позднего полиаденилирования вируса SV40 находится в BamHI-BglII-фрагменте длиной примерно 800 п.н., получаемом из pSV2dhfr (ранее доступном изgp160 ВИЧ-1, названную pC-Env. Указанная плазмида содержит KpnI-XhoI-фрагмент длиной 2565 п.н. из LAV-1BRU (ATCCдоступа 53069, GenBankдоступа K02013), который начинается с последовательности, кодирующей положение аминокислоты 4 аминоконца зрелого gp160. Фрагмент последовательности, кодирующей env, помещали сразу ниже и сливали в рамке с синтетическим фрагментом длиной 160 п.н., кодирующим сигнальный пептид гликобелка D (gD) вируса простого герпеса и девять аминокислот аминоконца зрелого gD, который описан ранее (Fuller et al. (1994), Aids Res. Hum Retroviruses 10: 1433). Затем конструировали плазмиду, кодирующую gp120 ВИЧ-1, названную в данном описанииpCIA-Env/T, следующим образом. Плазмида pCIA-Env/T кодирует укороченную форму gp160 ВИЧ-1 и является идентичной конструкции pC-Env, за исключением того, что последовательности, кодирующие- 23012066 трансляции gp160 с точкой укорочения, лежащей на 128 аминокислотных остатков ниже сайта процессинга gp120/ gp 41. Иммуноанализы in vitro. Ответы в виде наличия в сыворотке антител к антигену gp120. ВИЧ тестировали, используя анализ ELISA, на образцах, собранных через 5 и 6,5 недель (после примирования и после бустер-иммунизации соответственно). Для ELISA планшеты с высокой степенью связывания EIA покрывали 0,3 мкг/лунку рекомбинантного gp120 ВИЧ (Intracel) в 50 мкл PBS посредством инкубации в течение ночи при 4C. Планшеты 3 раза промывали и блокировали 2% БСА в PBS в течение 2 ч при комнатной температуре. К покрытым планшетам добавляли серийные разведения сыворотки и инкубировали при 37C в течение 1 ч. После промывки планшеты инкубировали с разведением 1:1500 конъюгированного с щелочной фосфатазой антитела козы против IgG мыши (H+L) (BioRad) с последующим развитием окраски при использовании паранитрофенилфосфата (PNPP) (BioRad) и регистрацией OD при 405 нм. Количество антигенспецифичного IFN-, секретируемого спленоцитами, определяли, используя цитометрический анализ с шариками; 1106 спленоцитов добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и стимулировали только в среде (негативный контроль) или в среде с 1 мкг/мл пептида gp120 ВИЧ,имеющего следующую последовательность: RIQRGPGRAFVITGK (SEQ ID NO: 21). После 48-часовой инкубации при 37 С в 5% СО 2 надосадки извлекали и измеряли уровни IFN- цитометрическим анализом с шариками (BD Biosciences). Антигены HSV-2. Конструирование плазмиды, кодирующей ICP27 HSV-2. Конструировали ДНК-вакцину, кодирующую ICP27, и затем объединяли с различными комбинациями имеющихся адъювантных плазмидных векторов, чтобы получить композиции вакцины. После иммунизации иммунизированных животных контрольно заражали вирусом HSV-2 и определяли защитный эффект различных композиций вакцин. Что касается конструирования плазмиды с ДНК антигена, то использовали стандартные способы ПЦР, чтобы сконструировать плазмиду. Стандартные условия ПЦР, которые использовали для конструирования вектора, были следующими: 1 основной буфер для ПЦР с 1,5 мМ MgCl2 (Promega Corp., Madison, WI); 0,400 мкМ каждого праймера; 200 мкМ каждого dNTP (USB Inc., Cleveland, ОН); 2,5 мкг полимеразы Taq (Promega Corp., Madison, WI); 1,0 нг ДНК-матрицы; вода до 100 мкл и верхний слой минерального масла (Aldrich Chemical Inc., Milwaukee WI). Термоциклер PTC-200 (MJ Research Inc., Waltham, MA) программировали на работу в следующем режиме: 4 мин при 95 С; 30 циклов (1 мин при 95 С/1 мин 15 с при 55 С/1 мин при 72 С); 10 мин при 72 С; хранение при 4 С. Продукты амплификации извлекали из реакционной смеси для ПЦР, используя набор для очистки продуктов ПЦР QIAquick7 (Qiagen Inc., Valencia CA) перед разрезанием ферментами рестрикции (NewEngland Biolabs, Beverly, MA). Более конкретно, плазмидный вектор ДНК-вакцины, кодирующий ранний антиген ICP27 HSV-2,конструировали следующим образом. HSV является двунитевым ДНК-вирусом, имеющим геном примерно 150-160 т.п.н. Вирусный геном упакован в икосаэдрический нуклеокапсид, который окружен мембранной оболочкой. Мембрана (или оболочка) содержит по меньшей мере 10 кодируемых вирусом гликобелков, наибольшую часть из которых составляют gB, gC, gD и gE. Вирусный геном также кодирует более 70 других белков, включая группу примерно из 5 немедленных ранних антигенов. Указанные ранние белки синтезируются на ранней стадии в цикле репликации вируса, в отличие от гликобелков оболочки, которые образуются только на поздней стадии в жизненном цикле вируса. Обзор молекулярной структуры и организации HSV см., например, Roizman and Sears (1996), "Herpes simplex viruses and theirreplication" in Fields Virology, 3rd ed., Fields et al. eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA. Антиген ICP27 HSV-2 можно легко получить из генома HSV-2, например области генома, простирающейся примерно от нуклеотида 114589 до 134980 генома HSV-2, или EcoRI-фрагмента, который простирается от нуклеотида 110931 до 139697 в геноме HSV-2. Последовательность генома HSV-2 доступна из опубликованных источников, например последовательность, депонированная в GenBank с номером доступа NC 001798. Чтобы сконструироватьICP27-вектор,используемый в настоящем исследовании,кодирующую область ICP27 подвергали ПЦР из генома HSV-2, используя следующие праймеры: 5'CGCC ACT CTC TTC CGA САСС 3' (SEQ ID NO: 25) и 5'CCAA GAA CAT CAC ACG GAA СС 3'(SEQ ID NO: 26) чтобы получить нуклеотидный фрагмент, содержащий нуклеотидные последовательности 114523-116179 (GenBank) HSV-2, которые соответствуют кодирующей области ICP27. Затем ICP27 фрагмент клонировали в области множественного клонирования вектора pTarget (Promega Corp.,Madison, WI). Конструирование плазмиды PJV7630. Источниками генов антигенов для pPJV7630 являются геномный фрагмент HSV-2 штамма MS, который был клонирован в космидном векторе, названном космидой 23. Космида 23 состояла из 3EcoRI-фрагментов из HSV-2, которые простираются от нуклеотида 110931 до 147530 на основании опубликованной последовательности (штамм HG52). Космиду 23 частично расщепляли EcoRI и повторно лигировали и отбирали конструкцию, которая имела только примерно фрагмент длиной 28000 п.н.(110931-139697). Полученная молекула названа ОР 23. На основе данной молекулы получали 6 модификаций, чтобы изменить последовательности в ОР 23. Модификации были предназначены для удаления генов, не являющихся немедленными ранними генами, из последовательностей HSV-2, а также последовательности ДНК остова. Одна конечная модификация заключалась в замене последовательностей остова подходящим геном резистентности к антибиотикам для клинического применения. Стадии описаны ниже. 1. Расщепление Bst1107I и ScaI и повторное лигирование (удаляет ген резистентности к ампициллину). Создает ОР 23-1. 2. Расщепление NsiI и повторное лигирование, чтобы удалить начало репликации SV40. Создает ОР 23-2. 3. Частичное расщепление BstXI и повторное лигирование, чтобы удалить области между ICP27 иICP0, с получением OP23-3. 4. Полное расщепление BspHI с последующим частичным расщеплением BsiWI, затем повторное лигирование, чтобы удалить последовательности после гена ICP22 и некоторые последовательности остова. Создает ОР 23-4. 5. Расщепление SrfI и повторное лигирование, чтобы создать ОР 23-5. Удаляет последовательности между ICP4 и ICP0. 6. Полное расщепление BstXI и повторное лигирование, чтобы создать ОР 23-6. Небольшой фрагмент удаляется между ICP27 и ICP0. 7. Замена последовательностей остова, кодирующих ген резистентности к антибиотику, фрагментом, содержащим ген резистентности к канамицину, чтобы создать pPJV7630. Конструкция pPJV7630 является крупной (19517 оснований) и содержит гены, кодирующие немедленные ранние антигены ICP0, ICP4, ICP22 и ICP27. Иммуноанализы in vitro. Мыши. Суспензии отдельных клеток получали из селезенок мышей. Селезенки продавливали через сетку,чтобы получить суспензию отдельных клеток, и затем клетки осаждали и обрабатывали буфером ACK(Bio Whittaker, Walkersville MD), чтобы лизировать эритроциты. Затем клетки дважды промывали в средеRPMI 1640 с добавлением HEPES, 1% глутамина (Bio Whittaker) и 5% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка (FCS, Harlan, Indianapolis IN). Клетки подсчитывали и ресуспендировали до соответствующей концентрации в полной среде, состоящей из RPMI 1640 с HEPES и 1% глутамином с добавлением 5% инактивированной нагреванием FCS, 50 мкМ меркаптоэтанола (Gibco-BRL, LongIsland NY), гентамицина (Gibco-BRL), 1 мМ пирувата натрия MEM (Gibco-BRL) и заменимых аминокислот MEM (Sigma, St. Louis MO). Для CD8-специфичных анализов клетки культивировали in vitro в присутствии пептида, соответствующего известному эпитопу CD8. Для ICP27 у мышей BALB/C последовательность пептида представляла собой HGPSLYRTF (QCB Inc). Пептиды готовили в ДМСО (10 мг/мл) и разбавляли до 10 мкг/мл в культуральной среде. Для анализа ELISPOT IFN- планшеты с фильтрующими мембранами Millipore Multiscreen покрывали 50 мкл 15 мкг/мл антисыворотки против IFN- (Pharmingen) в стерильном 0,1 M карбонатном буфере (рН 9,6) в течение ночи при 4 С. Планшеты 6 раз промывали стерильным PBS и затем блокировали средой для культуры ткани, содержащей 10% фетальную сыворотку теленка (FBS), в течение 1-2 ч при КТ. Среду удаляли и клетки селезенки распределяли в лунки, всего по 1106 клеток на лунку. В случае лунок, в которые добавляли меньше 1106 клеток от иммунизированных животных, использовали клетки от нативных животных, чтобы довести общее количество до 1106. Клетки инкубировали в течение ночи в инкубаторе для культуры ткани в присутствии пептида, который описан выше. Затем планшеты 2 раза промывали PBS и 1 раз дистиллированной водой. После этого следовали 3 промывки PBS. В планшет добавляли биотинилированное моноклональное антитело претив IFN- (Pharmingen) (50 мкл раствора 1 мкг/мл в PBS) и инкубировали в течение 2 ч при КТ. Планшеты промывали 6 раз PBS, после этого добавляли 50 мкл конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза (1:1000 в PBS, Pharmingen) и инкубировали в течение 2 ч при КТ. Планшеты промывали 6 раз PBS и добавляли дающий окраску субстрат (BioRad) и реакции давали возможность продолжаться вплоть до появления темных пятен. Реакцию останав- 25012066 ливали 3-кратной промывкой водой. Планшеты сушили на воздухе и подсчитывали пятна под микроскопом. Анализ in vivo. Мыши. Использовали модель инфекционного контрольного заражения, чтобы тестировать способность разных схем иммунизации защищать от летального заражения HSV-2. Мышей иммунизировали перед заражением и для инфицирования анестезировали и вводили летальную дозу HSV-2 интраназально в 30 мкл PBS. За мышами следили в течение 20 дней после инфекции и подсчитывали заболеваемость и смертность. Иммуноанализы in vitro. Домашние свиньи. Чтобы выделить мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), цельную кровь центрифугировали через подушку Histopaque-1077 (3000 об/мин в течение 30 мин) при комнатной температуре иPBMC извлекали из градиента в виде полосы. PBMC промывали 3 раза в полной среде и ресуспендировали в 25 мл полной среды для подсчета и ресуспендировали до 1107 клеток/мл в полной среде. АнализELISPOT осуществляли, как описано для мышей, за исключением того, что антигены представляли собой пулы пептидов, полученных из библиотек перекрывающихся пептидов антигенов HSV-2, и для регистрации использовали пару антител против IFN, специфичных для IFN- домашних свиней (RDsystems). Анализ in vivo. Домашние свиньи. Другой анализ, используемый для исследования иммунных ответов у домашних свиней, представлял собой анализ гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). В указанном анализе использовали как плазмидные ДНК, так и белковые экстракты в качестве источников антигенов, которые доставляли в кожу свиней, используя устройство XR1 и инъекции иглой соответственно. Область покраснения (эритемы), окружающую место доставки антигенов, измеряли через 48 ч после введения в качестве показателя реакции ГЗТ. Доставку антигенов в кожу осуществляли через 7 дней после завершения иммунизации. Пример 1. Две разные плазмиды, содержащие NOI, использовали для иммунизации мышей. Плазмиды представляли собой мультигенную плазмиду для клинической HSV-2-вакцины (PJV7630) и плазмиду с одним геном, содержащую NOI ICP27, оперативно связанную с промотором HCMV. NOI ICP27 кодирует доминантный эпитоп, обнаруженный в PJV7630, и на графиках представлены CD8-ответы, специфичные для данного белка. Схема введения NOI.NOI вводили 1, 2 или 4 раза в течение 1 недели либо на 7 день (D 7), 0 и 7 день (D 0, 7) или 0, 2, 4 и 7 день (D 0, 2, 4, 7) соответственно. Осуществляли 1 или 2 впрыскивания на одно введение NOI и в одной группе адъювант LT вводили совместно с NOI. Результаты. Ген ICP27 является доминантным антигеном, обнаруженным в PJV7630, и на фиг. 1A и 1B представлены CD8-ответы, специфичные для данного антигена-мишени. Обычно обе плазмиды PJV7630 (фиг. 1B) и ICP27 (фиг. 1A) давали 500 пятен в ELISPOT/миллион клеток после только одного введения NOI и 1500 пятен в ELISPOT/миллион клеток после двух введенийNOI. Когда после двух введений NOI следовал генетический адъювант LT, обнаружили примерно 3500 пятен в ELISPOT. Указанное значение 3500 пятен в ELISPOT/миллион клеток получали после четырех введений NOI даже в отсутствие адъюванта LT, но генетический адъювант LT также будет усиливать ответы. На фиг. 1A ответ в результате совместного введения LT с NOI не измеряли, так как результаты были за пределами шкалы. Выводы. Обнаружено, что кластерные введения NOI вызывают усиленные клеточные иммунные ответы на основании анализа ELISPOT CD8-клеток, продуцирующих IFN-, специфичных по отношению к ICP27,измеряемых у мышей, иммунизированных PJV7630. Пример 2. Целью следующих трех экспериментов являлась оценка того, коррелирует ли усиленный CMIответ, возникающий в результате кластерных введений NOI плазмиды с одним геном, с усиленной защитой от летального заражения. Методика. Плазмиду PJV7630 вводили мышам в течение периода времени, составляющего 1 неделю. На протяжении периода, составляющего 1 неделю, осуществляли либо одно (7 день), два (0 и 7 дни), либо 4 (0,2, 4 и 7 дни) введения NOI. Одна группа получала 2 дозы при каждой иммунизации, но большинство мышей получали одну дозу PJV7630 при каждой иммунизации.- 26012066 Результаты. Пометка на графиках означает количество введенийколичество доз на введение, так что 41 означает, что животные получали 4 введения NOI по одной дозе на каждое введение. После 1 недели введения NOI животных оставляли в покое либо на 1 неделю, либо на 2 недели перед инфицированием вирусом. Доза вируса составляла примерно 5-кратную дозу от LD50. На фиг. 2 А показаны результаты, полученные на мышах С 57 Вl/6 после 2-недельного покоя. Результаты ясно показывают, что схема 41 (т.е. 4 введения 1 дозу на введение) оказывала большую защиту. Полученный результат, по-видимому, не является следствием повышенной дозы, так как 22 (т.е. 2 введения NOI2 дозы) также в сумме давал 4 дозы. На фиг. 2 В показаны результаты, полученные на мышах С 57 Вl/6 после 1-недельного покоя. На основании фиг. 2 В очевидно, что фактически получили такие же результаты, как в случае 2-недельного покоя, показанного на фиг. 2 А. Однако на фиг. 2 В имеется дополнительная группа только с одним введением NOI. На фиг. 2 С показаны результаты, полученные на мышах Balb/c после 1-недельного покоя. Из результатов ясно, что доза заражения была недостаточно высокой, чтобы получить четкое отличие в смертности, но имели место различия в заболеваемости. Числа в скобках означают оценки заболеваемости, при этом чем выше число, тем больше заболеваемости животных. Результаты соответствуют результатам на фиг. 2 А и 2 В, которые показывают, что 41 (т.е. 4 введения 1 дозу) дают наилучшую защиту. Выводы. Группирование 41 дозы на введение в течение 1 недели быстро вызывает сильный защитныйCMI-ответ, который оказывается сильнее, чем однократные введения или использование более высоких доз при введении. Пример 3. Целью данного эксперимента было варьирование временного интервала между введениями ДНК плазмиды с одним геном. Методика. Все мыши получали суммарно 4 введения в разные даты получения каждых введений и с разным временным интервалом между введениями. Мыши имели интервалы в 6, 4, 2, 1 или 0 дней между введениями (т.е. в случае 0 делали 4 впрыскивания в один день). Последнее введение в каждой схеме осуществляли в один и тот же календарный день и затем всех животных забивали через 7 дней после последнего введения. Результаты. На фиг. 3 А представлены результаты ELISPOT CD8 для временных интервалов, составляющих 0, 1,2, 4 и 6 дней, между кластерными введениями плазмиды с одним геном ICP27. Результаты показывают,что увеличение временного интервала между введениями усиливает результаты ELISPOT CD8, при этом максимальные результаты получали в случае 4-дневного интервала (т.е. 96 ч) между введениями NOI. На фиг. 3 В представлены результаты ELISPOT CD8 для временных интервалов, составляющих 0, 1,2, 4 и 6 дней, между кластерными введениями плазмиды с одним геном HbsAg. Результаты показывают,что увеличение временного интервала между введениями усиливает результаты ELISPOT CD8, при этом максимальные результаты получали в случае 4-6-дневного интервала между введениями NOI. Выводы. Исследование временных интервалов между кластерными введениями NOI у мышей показало, что если дают 4 введения NOI, то оптимальные ответы в виде ответа T-клеток CD8+ получают в том случае,если введения NOI разделены интервалом в 4 или 6 дней. На фиг. 3 С представлены результаты измерения антител в результате кластерного введения плазмиды с одним геном HbsAg. Титры антител получали довольно слабыми. Указанные результаты свидетельствуют, что кластерные введения NOI с интервалами в 0, 1, 2, 4, или 6 дней между введениями, повидимому, существенно не увеличивают титр антител, даже при том, что ответ T-клеток CD8+ усилен. Пример 4. Целью данного эксперимента являлась оценка CMI-ответа в виде ответа T-клеток CD8+ в случае кластерного введения NOI мультигенной плазмиды (PJV7630). Методика. Животные получали всего по 4 введения NOI, но временной интервал между введениями NOI варьировал. Последнее введение для каждой группы осуществляли в один и тот же день (начало введенийNOI варьировало) и измеряли ответы через 1 неделю и 3 недели после завершения введений. Отбор проб через 3 недели добавляли для того, чтобы минимизировать влияние, которое разные схемы оказывали на время введений. Например, животные, получавшие 4 введения NOI с 6-дневным интервалом между введениями, имели 18-дневный интервал между первым и четвертым введением, тогда как животные с 0 временным интервалом между введениями должны были получать все впрыскивания на 18 день.ELISPOT CD8, продуцирующих IFN-, специфичных для ICP27. На графике указан период между введениями NOI. Все животные получали всего по 4 впрыскивания. Очевидно, что результаты при использовании мультигенной плазмиды (PJY7630) были параллельны результатам начальных экспериментов с использованием плазмиды с одним геном (ICP27). В этом отношении 4- и 6-дневные интервалы между введениями давали оптимальный ответ, судя по измерениям ELISPOT (см. фиг. 3C) и ответ сохранялся на 3 неделе, но к этому времени ответы снижались примерно в 3 раза (см. фиг. 3D). Пример 5. Целью данного эксперимента являлось определение того, существует ли какая-либо синергия между применением генетических адъювантов и схемой кластерного введения NOI в усилении гуморальных и опосредованных клетками иммунных (CMI) ответов на относительно слабый антиген, такой как gp120 ВИЧ-1. Способ. Данный эксперимент заключается во введении по меньшей мере двух введений антигена gp120 мышам, при этом каждое введение состоит из группы от 1 до 4 введений XR1. См. схематичную диаграмму на фиг. 5 А. Кроме того, период покоя между введениями составляет 1 неделю. Использовали генетический адъювант LT А+В (pPJV2012). Карта плазмиды pPJV2012 представлена на фиг. 10. Плазмиду pPJV2012 получали клонированием генов LT, кодирующих белки субъединиц LTA и LTB в плазмидах pPJV-2004 и pPJV-2005 соответственно, как описано в WO 03/004055. Затем гены, кодирующие белки субъединиц LTA и LTB, вырезали из исходных плазмид и встраивали в одну плазмиду, получая плазмиду pPJV2012. Результаты. На фиг. 5 В показаны данные, полученные для группы животных с 7-дневным временным интервалом между введениями NOI. Количество введений XR1 в каждой группе варьировало, также как присутствие или отсутствие генетического адъюванта LT А+В (pPJV2012). Полученные результаты показывают, что присутствие или отсутствие генетического адъюванта оказывало наиболее сильное влияние на клеточные ответы (продуцирование IFN-). Фиг. 5 В ясно показывает, что LT-усиленные ответы были наиболее сильными в том случае, когда схема введения NOI заключалась в группировке двух введений. Полученные результаты показывают, что схема кластерного введения вносит существенный вклад в полный клеточный ответ, полученный с генетически адъювантом LT. Фиг. 5 С демонстрирует, что, в отличие от CMI-ответа, показано, что кластерные введения оказывают наибольшее влияние на силу общих гуморальных ответов. Как показано на фиг. 5 С, очень высокиеgp120-специфичные титры (в 5-10 раз выше, чем встречались ранее) были вызваны с использованием 4 введений в кластере в присутствии и в отсутствие вектора генетического адъюванта. Важно, что присутствие генетического адъюванта влияло на баланс подклассов IgG1-IgG2a, но не требовалось для того,чтобы вызвать высокие титры антител (не показано). Выводы. Результаты показывают, что, когда NOI, кодирующую слабый антиген, вводят совместно с NOI, кодирующей адъювант, максимальный CMI-ответ в виде высвобождения интерферона гамма получают после двух введений NOI. Напротив, сильный гуморальный иммунный ответ получают либо в присутствии, либо в отсутствие адъюванта при использовании кластера из четырех введений NOI с временным интервалом, составляющим примерно 48 ч между введениями. Пример 6. Целью данного эксперимента было определение того, может ли иммунизация домашних свиней с использованием pPJV7630 вызывать клеточные иммунные ответы, судя по ELISPOT IFN- и ГЗТ-ответам. Способ. В случае данного эксперимента домашним свиньям вводили либо pPJV7630, либо плацебо (отдельно золото) с помощью устройства XR1. Свиньям вводили две дозы при каждой иммунизации и использовали кластерную схему из 4 иммунизаций в течение периода, составляющего 1 неделю. Таким образом,каждая свинья получала всего 8 доз вакцины в кластере. Вторую кластерную иммунизацию начинали через 28 дней после окончания первого кластера. Результаты. На фиг. 6 А показаны данные ELISPOT IFN-, полученные на животных после первой кластерной иммунизации. Значения представляют собой средние для 8 иммунизированных животных и 8 контрольных животных. Данные показывают, что схема кластерной иммунизации способна вызывать клеточные иммунные ответы у домашних свиней, которые считаются трудной моделью для измерения иммуногенности. У всех контрольных свиней наблюдали фоновые уровни в ELISPOT. На фиг. 6 В показана средняя площадь эритемы, имеющейся в месте введения антигена у свиней (4 животных), иммунизированных pPJV7630 (данные для контрольных животных не включены в график).- 28012066 Антигены вводили через 7 дней после завершения иммунизаций, и свиньи получили две кластерных иммунизации. Наличие эритемы через 48 ч после введения антигена свидетельствует о реакции ГЗТ. Результаты показывают, что ГЗТ-ответ является антигенспецифичным, так как нулевая плазмида (N) или плазмида с нерелевантным антигеном (sAg), поверхностным антигеном гепатита В, не индуцируют ГЗТ-реакции, тогда как плазмиды, экспрессирующие вакцинные антигены (0, 4, 22, 27), дают хорошие ГЗТ-ответы. У свиней, получавших только плацебо (данные не показаны), не обнаружено ГЗТ-реакций в случае любых антигенов, что подтверждает, что ответы, показанные на фиг. 6 В, являются результатом иммунизации pPJV7630. B местах, в которые инъецировали белковые экстракты, было несколько хороших измерений ГЗТ в случае белков ICP22 и ICP4, но ни одного в случае контрольного раствора PBS и белков ICP0 и ICP27. Поскольку для инъекции имелось только 5 мкг белкового экстракта и до 100 мкг можно было использовать, чтобы вызвать ГЗТ-ответ, то низкий ответ может быть связан с вводимой дозой. Выводы. В модели с использованием домашних свиней обнаружено, что кластерная иммунизация может индуцировать клеточные иммунные ответы против антигенов вакцины. Домашняя свинья не считается хорошей моделью для того, чтобы вызывать иммунные ответы, но кластерная иммунизация обладала способностью вызывать клеточные иммунные ответы. Пример 7. Изучение домашних свиней осуществляли для того, чтобы исследовать влияние дозирования и устройства на гуморальный ответ на белок ha, экспрессируемый с pPJV1671, как подробно описано ниже в табл. 1. (Устройство для ускорения частиц XR описано выше). Таблица 1 Животных примировали и подвергали бустер-иммунизации вакцинами на 4 неделе. Кровь брали в разных временных точках, и ниже в виде графиков изображены титры антител через 2 недели после бустер-иммунизации. Две группы получали всего по 8 доз при каждой иммунизации либо в виде кластера,либо все в одном время. Животные, иммунизированные с использованием кластерного введения, имели высокий уровень антител в сыворотке. Титры антител. Титры антител измеряли в ELISA, следуя стандартным способам с использованием 200 единиц гемагглютинации/лунку разрушенного саркозилом очищенного вируса Sw/IN, разбавленного в фосфатносолевом буфере. Непосредственно измеряли антитела свиньи, используя конъюгат козьего антитела против иммуноглобулина G свиньи с щелочной фосфатазой. Плазмида pPJV1671. Плазмида pPJV1671, которая показана на фиг. 8, является вектором ДНК-вакцины человека, кодирующим антиген гемагглютинина (НА) вируса гриппа A/Panama/2007/99 (H3N2). Последовательность,кодирующую НА, получали стандартным способом клонирования на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), используя образец вируса A/Panama/2007/99, полученный изCDC, в качестве источника РНК-матрицы. Следующие стадии использовали при разработке конечного вектора ДНК-вакцины pPJV1671 НА:- 29012066 получение в ОТ-ПЦР фрагмента днДНК на участке РНК 4 вируса A/Panama/2007/99 (H3N2); размножение клона ДНК, полученного на участке РНК 4, в стандартном основанном на pUC19 векторе в E.coli; анализ последовательности кодирующей последовательности НА Н 3 Panama в клоне участка РНК 4; вторая ПЦР-реакция для создания фрагмента ДНК, содержащего кодирующую последовательность Н 3 Panama (без ее кодона ATG) с концами, совместимыми с вектором ДНК-вакцины pPJV7563 (Nhe I иBsp 1201). Встраивание кодирующей последовательности НА Н 3 Panama в pPJV7563 дает конечный вектор ДНК-вакцины НА Н 3 Panama pPJV1671, который соответствует консенсусу Козака. Использование доставляемого вектором кодона ATG (посредством инсерции в сайт Nhe I) приводит к минорной 2-аминокислотной инсерции на аминоконце кодирующей последовательности гена НА, как изображено на фиг. 9. Выводы. Данное исследование показывает, что кластерная иммунизация в значительной степени повышает гуморальный ответ в модели с использованием домашних свиней. Плазмида pPJV7563. Конструирование pPJV7563. Карта плазмиды pPJV7563 представлена на фиг. 11. Состав оснований для плазмиды pPJV7563 представлен на фиг. 12. Компоненты и их положение в плазмиде pPJV7 563 указаны далее: 1-44 последовательности транспозона 903; 45-860 последовательность, кодирующая резистентность к канамицину, из транспозона 903; 861-396 последовательности транспозона 903; 897-902 сайт Sal1; 903-1587 промотор CMV; 1588-1718 нетранслируемая лидерная последовательность из немедленного раннего гена CMV; 1719-1724 слияние ферментов рестрикции BamH1 и BglII; 1725-1857 интрон А инсулина крысы; 1858-1863 сайт BamH1; 1864-1984 5'-нетранслируемый лидер поверхностного антигена HBV; 1985-1993 синтетический стартовый кодон/Nhe1-сайт клонирования; 1994-2011 синтетический сайты клонирования; 2012-2544 энхансер HBV; 2545-2555 последовательность первоначального вектора. Нет совпадений по сравнению с базой данных NCBI; 2556-2686 область полиаденилирования бета-глобина кролика; 2687-3759 последовательность вектора pUC19. Плазмиду pPJV7563 получали следующим образом. Описание фиг. 13, изображающей в виде блок-схемы конструирование PJV7563. Сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGHpA) в pWRG7074 заменяли сигналом полиаденилирования бета-глобина кролика (RBGpA), получая pWRG7284. Интрон A CMV удаляли изpWRG7284, заменяя все последовательности CMV полученным из pWRG7128 ПЦР-фрагментом, содержащим промотор CMV и слияние экзон 1/2. При этом получали pWRG7293. Последовательности CMV и HBV удаляли из pWRG7284 и заменяли последовательностями CMV и 5'-HBV из pWRG7293 и последовательностями 3'-HBV из pWRG7128. Ha данной стадии удаляли последовательность гена nef SIV, получая pPJV7382. pPJV7382 дополнительно конструировали добавлением интрона А инсулина крысы A (RIA), чтобы создать pPJV7389. Ген резистентности к канамицину (KanR) вpPJV7389 заменяли укороченным вариантом, чтобы удалить ненужные последовательности с обоих концов данного гена, получая pPJV7496. Сайт Nhe1 в RIA удаляли из pPJV7496, получая pPJV7530. Последовательности HBV на протяжении 5'-области 3'-UTR в pPJV7530 удаляли и заменяли 5'-UTRHBV, геном flu M2 и 5'-областью 3'-UTR из pPJV7468, получая PJV7549. В PJV определено, что использование 5'-UTR-областей HBVenh и HBV из WRG7128 в векторах, кодирующих множество антигенов,может воспроизводимо улучшать как экспрессию генов, так и иммуногенность. В настоящее время указанные области являются общими элементами в векторах ДНК-вакцин PJV. Затем ген М 2 делетировали из pPJV7549 и заменяли олигонуклеотидами, которые образовывали полилинкер. Указанная процедура давала pPJV7563, экспрессирующий вектор, который способен принимать другие кодирующие последовательности. Конструирование плазмиды pWRG7074, исходного вектора для получения PJV7563. Конструировали стандартный плазмидный остов, pWRG7074. Указанный остов использовали в качестве плазмидного предшественника, чтобы из него сконструировать pWRG7128, вектор, экспрессирующий HBsAg, используемый в нескольких клинических испытаниях. Создание данного остова описано в этом разделе и показано на фиг. 15 и 16, Схема происхождения плазмид PJV7074 и PJV7128 и Карты характерных признаков ключевых плазмид соответственно. Коротко, pWRG7074 получали по- 30