Способ получения бакуловируса

012067 Область техники Настоящее изобретение относится к получению бакуловирусов и, в частности, к способу получения промышленных количеств бакуловирусов. Уровень техники Бакуловирусы используют в различных целях, включая продуцирование рекомбинантных белков и применение в качестве биопестицидов. Трудность промышленного применения бакуловирусов заключается в том, что невозможно производить большие количества инфекционного бакуловируса. Для рентабельного промышленного производства бакуловирусов требуется получение по меньшей мере 10000 л культуры с выходом вируса более 150 ОВ (телец включений) на клетку (Greenfield, P.F.,Reid, S., Weiss, S.Scholz, В. (1999. Baculoviruses as biological control agents: research, production andcommercial issues. В The 5th Asia- Pacific Biochemical Engineering Conference Proceedings. Phuket, Thailand). В стандартном промышленном способе получения бакуловируса в больших масштабах требуется до 5 пассажей бакуловируса в клеточной культуре с целью получения достаточного количества вируса для замороженного исходного (рабочего) материала бакуловируса. Ещ 6 пассажей требуются для увеличения масштаба производства до 10000 л с целью достичь рентабельного производства (Rhodes, О.J.(1996). Economics of baculovirus-insect cell production systems. Cytotechnology 20, 291-297). В соответствии с таким обычным промышленным способом требуется 11 пассажей для получения конечного вирусного продукта в масштабе 10000, если предположить, что вирус устойчив в процессе серийного пассирования и по-прежнему образует более 150 ОВ на клетку. Однако бакуловирусы неустойчивы в процессе серийного пассирования в клеточной культуре, так как, по-видимому, они самопроизвольно мутируют с образованием FP (многогранников с малым числом граней) мутантов или DIP (дефектных интерферирующих частиц) мутантов. FP мутанты быстро накапливаются в клеточных культурах вследствие самопроизвольных мутаций в гене 25K FP вирусного генома. Что касается HaSNPV, FP мутация происходит так быстро, что к пассажу 6 вся вирусная популяция состоит из FP мутантов. Выход составляет менее 10 ОВ на клетку, и полученные ОВ не являются биологически активными (Lua, L.H.L. Pedrini, M., Reid, S., Robertson, A.Tribe, О.Е. (2002). Phenotypic andGeneral Virology 83, 947-957). Аналогичным образом DIP могут также быстро накапливаться при серийном пассировании бакуловирусов при использовании MOI (множественности заражения) в клеточной культуре. DIP при инфицировании AcMNPV обнаруживают уже при 4 пассировании, когда используютMOI 10 бое на клетку. DIP являются результатом больших делеций в вирусном геноме. DIP для репликации требуют 'хелперного вируса' (вируса дикого типа) (Pijilman, G.P. van den Born, E., Martens. D.E.Vlak, J.M. (2001). Бакуловирусы Autographa californica с большими геномными делециями быстро образуются в инфицированных клетках насекомых (Virology 283, 132-138). Наличие этих мутаций вызывает трудности при переходе от вирусного инокулята к получению в промышленных масштабах.FP мутация в процессе пассирования HaSNPV представляет большую опасность для повышения производительности процесса, нежели появление DIP. FP мутации происходят намного быстрее и раньше, чем DIP, вне зависимости от MOI. В клеточной культуре, по-видимому, отсутствует какое-либо селекционное давление на инфекционные ОВ. Клетки, инфицированные FP мутантом, дают больше бакуловируса. чем клетки, инфицированные МР (многогранники с большим числом граней), тем самым делая FP мутанты более предпочтительными. В личинках в отличие от клеточной культуры инфекционные ОВ имеют селективное преимущество в виде бакуловируса, переносимого в другие личинки (Potter, K.N., Jaques, R.P.Faulkner, P.(1978). Modification of Trichoplusia ni nuclear polyhedrosis virus passaged in vivo. Intervirology 9, 76-85). Серийным пассированием можно получать большие количества бакуловируса, но вирус не является инфекционным. Получение больших количеств вируса с использованием личинок-гусениц не имеет практического значения, так как требуется большое количество личинок и из-за трудностей последующей крупномасштабной очистки, необходимой для выделения вируса. Способы выделения "вкраплнного" вируса из телец включений после каждого пассажа в процессе получения больших объмов продукции также сложны технически и непрактичны. Было бы нужно выделять тельца включений из клеток и концентрировать после каждого пассажа, при этом сохраняя стерильность в ходе всего процесса. В настоящее время не существует никаких рентабельных (экономичных) способов получения больших промышленных количеств инфекционного бакуловируса. Сущность изобретения Целью настоящего изобретения является создание альтернативного способа получения больших количеств бакуловируса. Замысел и практическое осуществление настоящего изобретения вызваны потребностью получать промышленные количества ОВ инфекционного бакуловируса. Настоящее изобретение было задумано при определении преимущества получения телец включений с использованием инфекционного бакуловируса в личинках-гусеницах и большого числа вирусных частиц с использованием серийных пассажей в клеточной культуре. Затем создан двухстадийный способ, а именно, первоначально получают инфекционный вирус в личинках-гусеницах, а затем полученный инфекционный вирус используют в качестве-1 012067 инокулята для ограниченного количества серийных пассажей в клеточной культуре, таким образом, чтобы получать большие количества инфекционного бакуловируса. В одном аспекте настоящее изобретение содержит способ получения больших количеств бакуловируса, включающий введение в личинки-гусеницы бакуловирусного инокулята; инкубацию инокулированных личинок-гусениц; сбор телец включений бакуловируса из инфицированных личинок-гусениц; извлечение (экстракцию) полученного при "вкраплении" вируса из телец включений; введение в культуры клеток хозяина-насекомого инокулята вируса, полученного при "вкраплении"; инкубацию вирусной/клеточной культуры и сбор бакуловируса из инкубированной вирусной/клеточной культуры. Инкубацию вирусной/клеточной культуры предпочтительно проводить в течение периода времени,который делает возможным четыре или пять пассажей (пассирований) бакуловируса. Бакуловирус используется в данном описании как общий термин, охватывающий различные виды бакуловирусов, включая Helicoverpa armigera SNVP, Helicoverpa zea SNPV, Spodoptera frugiperda MNPV,Anticarsia gemmatalis MNPV, Autographa californica MNPV, Anagrapha falcifera MNPV, Lymantria disparMNPV, Bombyx mori MNPV, Spodoptera exigua MNPV, Trichoplusia ni MNPV, Orgyia pseudotsugata MNPV и Buzura suppressaria SNPV. Предпочтительным бакуловирусом является изолят Helicoverpa armigera. Предпочтительным изолятом Helicoverpa armigera является штамм Н 25 ЕА 1. Первоначальный бакуловирусный инокулят можно получать из любого подходящего источника,включая тельца включений из культуры личинок или клеточной культуры. Чтобы получить подходящее количество исходного материала телец включений, можно провести более одной стадии получения бакуловируса с помощью личинок. В одной предпочтительной форме бакуловирус можно получать с помощью личинок на начальной стадии для того, чтобы создать основной материал телец включений. В предпочтительной форме исходный материал телец включений содержит примерно 21012 телец включений, тогда как основной (эталонный) материал содержит 109 телец включений. Как основной (эталонный) материал, так и рабочий материал могут храниться при 4 С или в замороженном состоянии. Предпочтительно вирус, полученный при "вкраплении" (ODV), инокулируют в клеточную культуру с относительно высоким значением MOI. В предпочтительном варианте изобретения инокулят вируса,полученного при "вкраплении" ("вируса вкраплений), получают уже из 2,51010 телец-включений и вводят в биореактор мкостью 10 л, содержащий 5105 клеток на мл. Объм культуры постепенно увеличивается с 10 л (Р 1) до 100 л (Р 2), затем до 1000 л (Р 3) и, наконец, до 10000 л (Р 4). 10 л культуры продуцирует около 107 бое (бакуловирусов) на мл. Плотность клеток культуры объмом 10000 л предпочтительно составляет 1,5-2,0109 клеток на литр и 2,51011 ОВ на литр (что составляет примерно 150 ОВ на клетку). Значение LC50 ОВ против гусениц совки (heliothis) составляет 0,2-1,0 ОВ на мм 2. Экстракцию "вкрапленного" вируса из рабочего материала можно осуществлять любым подходящим способом. "Вкраплнный" вирус предпочтительно экстрагируют щлочью для лизирования телец включений и полученные вирусные частицы стабилизируют в подходящих буферизующих средах. Предпочтительный способ экстракции включает смешение щелочного раствора с суспензией ОВ и инкубацию смеси в течение такого периода времени и при такой температуре, которые обеспечивают отделение вирусных частиц. Затем ODV предпочтительно суспендируют в стабилизирующих средах, предпочтительно VPM3 (описанной на фиг. 2). Предпочтительно не включается никаких стадий нейтрализации. Предпочтительным способом экстракции ODV является приведнный ниже способ экстракции VPM3. Способ экстракции VPM3 имеет преимущества, так как в нм не используется обработка трипсином и средыVPM3 не содержат сыворотки, что делает способ более рентабельным (экономичным), чем обычные методы, и, следовательно, более пригодным для промышленного крупномасштабного производства. В другом аспекте изобретение включает бакуловирусный продукт, полученный вышеуказанным способом. Бакуловирусный продукт характеризуется тем, что является определнным количеством инфекционного бакуловируса около 2,51015 ОВ с LC50 против гусениц Helicoverpa spp 0,2-1,0 ОВ на мм 2. Такое количество инфекционкого бакуловируса ранее нельзя было получать ни одним in vitro способом получения. Другим преимуществом является то, что это количество инфекционного бакуловируса является с экономической точки зрения технологичным. Полученный бакуловирус можно использовать для различных целей, включая и применение в качестве биопестицида. В качестве примера Helicoverpa armigera OB можно применять партиями от 51011 до 51012 ОВ на га для того, чтобы обеспечить контроль за сельскохозяйственным вредителем гусеницей Н.armigera. Краткое описание чертежей Для того чтобы было проще понять настоящее изобретение и вникнуть в практический эффект, даются ссылки на прилагающиеся чертежи, где на фиг. 1 в виде диаграммы представлен способ получения больших количеств бакуловируса;-2 012067 на фиг. 2 показан состав стабилизирующих сред для экстракции VPM3 по предпочтительному варианту изобретения; на фиг. 3 датся сравнение числа ОВ, используемых для экстракции, и полученных ОВ на клетку после пассажа 4; на фиг. 4 на двух образцах (колбы А и В) показан выход ОВ после 4 пассажей. Подробное описание предпочтительного варианта изобретения Предпочтительный вариант способа получения больших количеств бакуловируса включает двухстадийный способ первоначального получения вируса в личинках-гусеницах и последующее применение полученного в помощью личинок "вкраплнного" вируса для введения инокулята в клеточную культуру и проведение ограниченного числа пассажей в клеточной культуре (см. фиг. 1). Способ включает сначала приготовление основного и рабочего материала телец включений в культуре личинок-гусениц. Основной и рабочий материалы ОВ личинок готовят, давая в виде подкормки каждой большой личинке Helicoverpa armigera примерно по 1000 ОВ. Когда они погибают (через 6-10 дней после инфицирования), их собирают и хранят при 4 С. Примерно 1,5-2 личинки требуется для 10 л (пассаж 1) инокулята, так как на цикл требуется 2,51010 ОВ, а личинка продуцирует около 1,71010 ОВ. Когда соберут достаточное число погибших гусениц, их экстрагируют с помощью SDS (30 мин, конечная концентрация 0,5%), гомогенизируют (в блендере), фильтруют (через марлю), центрифугируют и суспендируют в воде (1010 ОВ/мл). Для удаления избытка дебриса несколько раз отмывают водой. Суспензию ОВ можно хранить в охлажднном или замороженном виде. ОВ экстрагируют методом экстракцииVPM3, который включает стадии прибавления 40 мкл щелочного раствора (0,5M Na2CO3, 1M NaCl) на каждые 0,7 мл суспензии ОВ (1010 ОВ/мл), смесь тщательно перемешивают и инкубируют при 28 С в течение 30 мин. После инкубации ОВ смесь разводят, добавляя 10 мл среды VPM3 на каждые 0,74 мл экстрагированных ОВ (см. на фиг. 2 состав VPM3). Затем разведнную суспензию ODV фильтруют через стерилизующий фильтр 0,22 мкм. Далее полученную суспензию ODV используют в качестве инокулята. На фиг. 3 даны примеры выходов ОВ на клетку, используемых для экстракции, и результирующий выход ОВ на клетку после пассажа 4. Требуется около 2,51010 ОВ, чтобы получить достаточное количество ODV с целью применения в качестве инокулята для заражения 10 л культуры (5105 клеток/мл). 10 л культуры с введнным инокулятом инкубируют в аэробных условиях в биореакторе при 28 С примерно 3 дня. Инкубация представляет собой пассаж (пассирование) 1. Ферментация постепенно увеличивается так, что пассажи 2, 3 и 4 составляют 100, 1000 и 10000 л соответственно. Все операции инкубации проводят в условиях аэрации при 28 С около 2 дней, за исключением последней инкубации, которая длится 10-15 дней. Примерная плотность клеток в 10000 л культуры составляет между 1,5-2,0109 клеток на литр и 2,51011 ОВ на литр (то есть около 150 ОВ на клетку). Величина LC50 против гусениц Helicoverpa spp для этих ОВ составляет 0,2-1,0 ОВ на мм 2. В другом примере, показанном на фиг. 4, 1011 ОВ последовательно экстрагируют и фильтруют. Отбирают образцы фильтрованного стерилизованного экстракта для заражения 100 мл культуры в двойном повторе (колбы А и В). Выходы ОВ после пассажа 4 (10000 л культуры) относительно высоки, составляют 263 и 239 ОВ на клетку для колб А и В соответственно. Хотя вышеописанное представлено в виде иллюстрирующего примера данного изобретения, предполагается, что все подобные и другие модификации и вариации, которые очевидны для специалистов в данной области техники, входят в объм и в границы настоящего изобретения, как если бы они были представлены в данном описании. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения промышленных количеств бакуловируса, включающий введение в личинки-гусеницы бакуловирусного инокулята; инкубацию инокулированных личинок-гусениц; сбор телец включений бакуловируса из инфицированных личинок-гусениц после их гибели; экстракцию вкрапленного вируса из телец включения; введение в культуру клеток хозяина-насекомого инокулята экстрагированного вируса; инкубацию клеточной культуры в течение такого периода времени, который позволяет осуществить четыре или пять пассажей бакуловируса; и сбор бакуловируса из инкубированной клеточной культуры. 2. Способ по п.1, при котором бакуловирус выбирают из нижеприведнной группы, включающейSNPV. 3. Способ по п.2, при котором бакуловирус представляет собой Helicoverpa armigera.-3 012067 4. Способ по п.1, при котором проводят более одной стадии получения бакуловируса из личинок с целью получить подходящее количество рабочего материала в виде телец включения. 5. Способ по п.1, при котором бакуловирусный инокулят, вводимый в личинки гусениц, получают из личинок. 6. Способ по пп.4-5, при котором рабочий материал в виде телец включения содержит около 21012 телец включений, а бакуловирусный инокулят, вводимый в личинки гусеницы, содержит около 109 телец включения. 7. Способ по п.1, при котором экстрагированный вирус инокулируют в клеточную культуру с относительно высокой множественностью заражения. 8. Способ по п.1, при котором инокулят экстрагированного вируса, полученного как минимум из 2,51010 телец включения, вводят в биореактор на 10 л, содержащий 5105 клеток хозяина в мл, затем культуру постепенно увеличивают в объме от 10 л (Р 1) до 100 л (Р 2), затем до 1000 л (Р 3) и, наконец, до 10000 л (Р 4); при этом 10 л культуры продуцирует около 107 бакуловирусов на мл, 10000 л культуры продуцирует выход конечного бакуловируса, при этом примерная плотность клеток культуры объмом 10000 л предпочтительно составляет 1,5-2,0109 клеток на литр и указанная структура содержит 2,51011 телец включения на литр (т.е. примерно 150 телец включений на клетку), а величина LC50 телец включения против гусениц совки составляет 0,2-1,0 телец включения на мм 2. 9. Способ по п.1, при котором вкраплнный вирус экстрагируют из телец включения щлочью с целью лизировать тельца включения и полученные в результате вирусные частицы стабилизируют в подходящих буферизующих средах. 10. Способ по п.1, при котором экстракция включает смешивание раствора щелочи с суспензией телец включения и инкубирование смеси в течение такого периода времени и при такой температуре, которые обеспечивают отделение вирусных частиц и затем суспендирование частиц в среде VPM3.