Доставка физиологических агентов in situ при помощи гелей, включающих анионные полисахариды

010351 Ссылка на родственные заявки Настоящая заявка является частично продолженной заявкой и притязает на приоритет заявки на патент США 10/652622, поданной 29 августа 2003 г., которая полностью включена в данное описание изобретения в качестве ссылки. Уровень техники В научной литературе описаны разные системы доставки лекарственных средств на полимерной основе, предназначенные для пролонгированного или регулируемого высвобождения лекарственного средства (см. публикацию Langer, Nature, 392 (supplement), 5-10, 1998 и относящиеся к ней ссылки). Многие из указанных систем обычно преследуют одну или несколько нижеследующих целей, а именно пролонгирование высвобождения лекарственного средства, улучшение биологической доступности лекарственного средства и/или создание неинъецируемых систем доставки лекарственных средств, так как их достижение облегчает соблюдение больным режима и схемы лечения и создает более комфортные условия лечения. Синтетические или природные полимеры обеспечивают доставку разных агентов при помощи разных механизмов в зависимости от свойств полимеров. Системы на полимерной основе имеют разную форму и могут представлять собой, например, жидкость, суспензию, эмульсию, порошок, состоящий из микрочастиц/или микросфер, пленку или таблетку. Указанные композиции вводят разными способами, включающими инъекции, местное применение или введение в слизистую оболочку глаза, влагалища, ануса, желудка или кишечника, полости рта и носа или легких. Системы на полимерной основе используют для доставки разных физиологически активных агентов, включающих лечебные и профилактические средства, в том числе низкомолекулярные или белковые средства, нуклеиновые кислоты, полисахариды, жирные кислоты и сложные эфиры, клетки и их фрагменты, вирусы и вакцины, предназначенные для профилактики инфекционных заболеваний. Во многих известных системах доставки лекарственных средств на полимерной основе лекарственные средства и/или другие фармакологически активные вещества до введения субъекту инкапсулируют в полимеры или гели, которые могут абсорбировать воду, но по существу не растворяются в воде. Гели являются твердыми или деформируемыми желеподобными полутвердыми веществами, включающими пористую трехмерную сетку полимерных молекул, содержащих в порах полимерной сетки обратимо абсорбируемую жидкость (то есть дисперсную жидкую фазу). Гели обычно содержат и/или абсорбируют большие и/или заранее определенные количества жидкости, которая часто является водой или другой водной жидкостью, включая биологическую жидкость, но тем не менее сетка гелеобразных полимерных молекул по существу не растворяется в жидкой фазе или биологической жидкости. Отдельные полимерные молекулы могут быть сшиты разными способами в зависимости от типа полимера с образованием нерастворимой сетки. Поперечные связи между полимерными молекулами возникают в результате образования ковалентных связей, координационных связей или межионного взаимодействия либо даже более слабого межмолекулярного взаимодействия, такого как образование водородной связи. В системах доставки лекарственных средств используют разные синтетические и природные полимеры, такие как крахмалы и модифицированные целлюлозы, геллан, хитозан, гиалуроновые кислоты,пектины и тому подобные. Например, в патенте США 4613500 описаны разные порошкообразные фармацевтические композиции для введения в нос, содержащие разные водорастворимые и не растворимые в воде полимеры, в том числе пектины, но в указанном патенте не были рассмотрены низшие метоксипектины, способные образовывать поперечно сшитые кальциевые гели, или способы их применения. В патентах США 5707 644 и 5804212 недавно было описано применение целого ряда полимеров, в том числе пектинов, для создания биоадгезивных микросфер диаметром менее 10 мкм для введения фармацевтических средств, пептидов и антигенных вакцин в слизистую оболочку носа, при этом было предложено получать указанные композиции из полимерных материалов, способных образовывать гель in situ,но в указанных патентах не было рассмотрено применение низших метоксипектинов для гелеобразования in situ. Гелеобразование "in situ" было описано в некоторых ранее известных системах доставки фармацевтических средств и включает образование геля в месте применения после введения композиции или препарата в слизистую оболочку, ткань, рану, брюшную полость и т.д. субъекта. Гелеобразующие композиции "in situ" превращаются в биоадгезивный гель только после контактирования с тканями или жидкостями организма. Полимерные молекулы гелеобразующей композиции in situ обычно вообще не являются поперечно сшитыми или являются недостаточно поперечно сшитыми до введения в место биологического применения, то есть находятся в форме не растворимого в воде геля, но сразу же после введения в место биологического применения происходит сшивание полимера с образованием поперечно сшитой сетки полимерного геля, которая содержит воду и/или биологические жидкости в пористой структуре сетки. Образовавшийся гель in situ по существу и/или совершенно не растворяется в воде или биологических жидкостях по крайней мере в нормальных физиологических условиях. Абсорбция воды и/или жидкостей организма обычно происходит одновременно с процессом гелеобразования in situ, но именно образование нерастворимой полимерной сетки в месте применения, а не простое поглощение воды или физиологических жидкостей, является главным фактором, определяющим гелеобразование in situ. В научной литературе ранее были описаны полимеры, способные образовывать гель in situ, такиеPEO-PLLA и PEG-PLGA-PEG (Jeong et al., Nature 388, 860-862, 1997; Jeong et al., J. Controlled Release 63,155-163, 2000), целлюлоза-ацетофталатный латекс (Gurny et al., J. Controlled Release 353-361, 1985), Gelrite (Rozier et al., Int. J. Pharm. 57, 163-168, 1989), Carbopol и Matrigel. Образование геля индуцируется изменением температуры (Poloxamer, Pluronics, диблоксополимер PEO-PLLA, триблоксополимер PEGPLGA-PEG и Matrigel), изменением рН (целлюлоза-ацетофталатный латекс и Carbopol) или взаимодействием с одно- или двухвалентными катионами (Gelrite и/или альгинаты). Однако большинство указанных веществ требуют высокой концентрации полимера для образования геля in situ (20%) (Poloxamer, диблоксополимер PEO-PLLA, триблоксополимер PEG-PLGA-PEG, целлюлоза-ацетофталатный латекс). Недостатком полимеров, образующих гель под действием тепла (Poloxamer, Pluronics, диблоксополимерPEO-PLLA, триблоксополимер PEG-PLGA-PEG и Matrigel), является также гелеобразование до введения субъекту вследствие изменения температуры во время упаковки или хранения. К сожалению, некоторые из указанных полимеров не являются биологически разрушаемыми, в частности Poloxamer, или требуют изменения температуры до введения субъекту (диблоксополимер PEO-PLLA) или во время формирования (Pluronics и Gelrite). Установлено, что глазной гелеобразующий препарат in situ для доставки лекарственного средства, состоящий из смеси полимеров Carbopol и Pluronic, является более эффективным по сравнению с препаратами, содержащими только один из указанных полимеров. Однако Pluronic используется в количестве 14% (Lin and Sung, Journal of Controlled Release 69, 379-388, 2000). Поэтому такие полимеры не пригодны для медицинских применений, связанных с лечением людей и животных. Кроме того, многие из указанных полимеров образуют только гидрогель, который является вязким, но все же текучим раствором (например, Poloxamer и Pluronics). Композиции для гелеобразования in situ описаны в патенте США 5958443, в котором рассмотрены жидкие композиции, содержащие лекарственное средство, пленкообразующий полимер и гелеобразующий ионный полисахарид. Указанные композиции включают два отдельно вводимых компонента,причем первый компонент является раствором "инородных" сшивающих двухвалентных или многовалентных катионов, который вводят в предполагаемое место биологического применения. В виде отдельной стадии (которая может иметь место до, после или одновременно с введением раствора первого компонента) в предполагаемое место применения отдельно вводят раствор второго жидкого компонента,содержащий лекарственное средство, пленкообразующий полимер и ионный полисахарид (такой как альгинат), в результате чего в месте биологического применения происходит химическая реакция сшивания между ионным полисахаридом и двухвалентными или многовалентными катионами с образованием поперечно сшитого, нерастворимого и биоадгезивного геля in situ. B патенте 5958443 пектины описаны в качестве одного из многих пленкообразующих полимеров, а не гелеобразующего ионного полисахарида. Пектины являются биологически разрушаемыми гетерополисахаридами, выделяемыми из стенок растительных клеток, которые содержат боковые группы карбоновой кислоты в остатках галактуроновой кислоты полимера. Все исследованные овощи и фрукты содержат пектины. Пектины из сахарной свеклы,подсолнечника, картофеля и грейпфрутов являются лишь несколькими хорошо известными примерами. Фактически во всех природных пектинах более 50% групп карбоновой кислоты присутствуют в форме сложных метиловых эфиров, причем такие пектины именуются "высшими метоксипектинами (HM)". Пектины, в которых менее 50% групп карбоновой кислоты являются метилэтерифицированными (то есть низшие метоксипектины (LM, не встречаются в природе, и их обычно получают синтетическими методами из природных HM пектинов. В данной области известно, что LM пектины способны образовывать гели в результате координационного связывания/сшивания двухвалентными или многовалентными ионами металлов, такими как ионы кальция. Химия и биология пектинов всесторонне описаны в научной литературе (Pilnik and Voragen, Advances in plant biochemistry and biotechnology 1, 219-270, 1992; Voragenand Voragen, In Progress in Biotechnology 14. Pectins and pectinases, J. Visser and A.G.J. Voragen (eds.). pp. 3-20. Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam, 1996). В патенте США 6432440 недавно было описано применение LM пектинов в жидких фармацевтических препаратах, превращающихся в гель при контактировании со слизистой оболочкой. В патенте США 6342251 описано применение целого ряда полимеров, в том числе пектинов, в жидких и твердых препаратах для введения в нос лекарственных средств, пригодных для лечения эректильной дисфункции. Патенты США 6432440, 6342251, 5707644 и 5304212 полностью включены в данное описание изобретения в качестве ссылки, где описаны гелеобразующие in situ фармацевтические композиции, пектины, используемые для получения таких композиций, и введение указанных композиций животным и человеку.Anderson et al. (Vaccine, 19, 840-843, 2001) описали порошкообразную вакцину против чумы рогатого скота, предназначенную для введения в нос животным, которую получают, смешивая лиофилизированный антиген с 4 мм найлоновыми гранулами и порошкообразным тальком (карбонат кальция). Маа etal. (публикация патента США 2002/0120228) описали гелеобразующие порошкообразные вакцинные композиции, содержащие соль алюминия с абсорбированным антигеном, сахарид, аминокислоту и кол-2 010351 лоидное вещество, которые могут необязательно включать полисахарид и предназначены для чрескожного введения субъектам. Порошки, состоящие из мелких частиц размером менее 5 мкм, также используют для доставки лекарственного средства глубоко в легкие. Грубые частицы лактозы служат в качестве массового носителя,физически смешиваемого с частицами лекарственных средств в микронном диапазоне для доставки лекарственных средств в легкие (Malcomson and Embleton, Pharmaceutical Science and Technology Today,Vol. 1 (9), 394-398). LiCalsi et al. (Vaccine, Vol. 19, 2629-2636, 2001) получили лиофилизированную порошкообразную живую вакцину против кори, предназначенную для введения в легкие. В приведенной выше публикации лекарственное средство или антиген физически смешивают или диспергируют на поверхности несущих частиц, а не диспергируют в лактозной матрице.Illum et al. недавно рассмотрели состояние дел в области лекарственных средств и вакцин для введения в нос в двух статьях, а именно в статье "Nasal Vaccines", опубликованной в журнале AdvancedStrategies", опубликованной на сайте www.drugdiscoverytoday.com, in Vol. 7, No 23, December 2002. B обеих статьях описано применение полимерных и/или биоадгезивных материалов с высокой вязкостью для получения порошков, предназначенных для введения вакцин и/или лекарственных средств в нос, но ни в одной из вышеуказанных статей не указано, что порошкообразные вакцинные композиции для введения в нос должны содержать хорошо растворимые в воде наполнители и/или разбавители в количествах от средних до высоких. Все вышеуказанные патенты и статьи полностью включены в данное описание изобретения в качестве ссылки, где описаны способы получения композиций для введения в нос порошкообразных лекарственных средств и способы введения указанных композиций животным и человеку. Биотехнология и ассоциированные методы доставки лекарственных средств и родственных биофармацевтических агентов были предметом всестороннего исследования на протяжении последних лет,но прогресс в области доставки указанных средств, особенно биофармацевтических средств, является весьма ограниченным. Биофармацевтические средства, такие как пептиды, белки, нуклеиновые кислоты,вакцины, антигены и клетки, созданные методами биоинженерии, микроорганизмы и вирусы, являются неустойчивыми как в процессе хранения, так и после введения. Инъецирование таких средств в ткани животного или человека иногда является успешным, но часто оказывается экономически и эстетически нежелательным, особенно при необходимости частого введения. Многие биофармацевтические агенты, в частности агенты с более высокой молекулярной массой и более полярные агенты, такие как белки, нуклеиновые кислоты, антигены и т.д., в прошлом характеризовались плохой абсорбцией при пероральном введении или введении в слизистую оболочку. Введение в слизистую оболочку носа может быть особенно сложным из-за быстрого обмена и выведения жидкостей из слизистой оболочки носа, которые, как считается, удаляются из носовой полости с периодом полувыведения порядка 15 мин. После успешного введения животному многие биофармацевтические агенты быстро разрушаются, не достигнув требуемого эффекта, и поэтому нуждаются в защите от разрушения и/или увеличении времени высвобождения. Из вышеизложенного следует, что в области введения биофармацевтических агентов существует давно известная, но до сих пор не решенная проблема доставки лекарственных средств. Таким образом, существует насущная потребность в более простых, усовершенствованных и/или более эффективных гелеобразующих in situ композициях для доставки лекарственных средств и/или биофармацевтических агентов. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к доставке физиологически активных агентов в ткани или жидкости организма животных, включая человека. Данное изобретение относится к способам получения и введения фармацевтических композиций, содержащих полисахариды, в том числе пектины, которые образуют гель "in situ", включающий физиологически активные агенты, при контактировании с тканями или жидкостями организма. Композиции по данному изобретению можно вводить в ткани и жидкости организма животного в виде жидкостей, твердых веществ или порошков, состоящих из микросфер или микрочастиц в выбранных диапазонах размеров. Композиции по данному изобретению могут быть предназначены для повышения устойчивости и/или увеличения срока хранения чувствительных биофармацевтических агентов, включая пептиды, белки, антигены, вакцины, нуклеиновые кислоты, вирусы, цельные клетки или их фрагменты. Указанные композиции можно вводить путем инъекции в ткани, органы или полости организма, обеспечивающей контактирование с жидкостями организма, такими как кровь или сыворотка, и образование геля, либо такие композиции можно вводить в разные слизистые оболочки организма, включая слизистые оболочки полости рта/пищеварительного тракта, носа и легких. Образовавшиеся гели in situ могут замедлять и/или модулировать высвобождение лекарственного средства или улучшать биологическую доступность физиологически активных агентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие способы введения позволяют существенно повысить эффективность введение биомолекул, таких как вакцины, антигены, пептиды и/или белки, при помощи гелей in situ, образующихся в полости носа.-3 010351 В некоторых вариантах осуществления изобретения одновременное введение твердых гелеобразующих агентов и/или композиций, содержащих двухвалентные или многовалентные катионы, позволяет улучшить образование гелей и обеспечивает регулируемое высвобождение лекарственного средства. Отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения можно проиллюстрировать нижеследующими вариантами осуществления настоящего изобретения. Одним объектом настоящего изобретения является твердая фармацевтическая композиция для введения физиологически активного агента животному, которая включает:a) один или несколько физиологически активных агентов в количестве, достаточном для индукции физиологической реакции у животного;b) один или несколько полисахаридов, содержащих субзвенья с анионными карбоксилатными или сульфатными группами; иc) одну или несколько твердых композиций, индуцирующих образование полисахаридного геля, которые содержат одну или несколько фармацевтически приемлемых солей двухвалентного или многовалентного катиона металла; причем указанная фармацевтическая композиция находится в твердой форме и образует гель при контактировании с тканью или жидкостью организма животного. Другим объектом настоящего изобретения является твердая фармацевтическая композиция для введения физиологически активного агента животному, которая включает:a) один или несколько физиологически активных агентов иb) одно или несколько пектиновых веществ; причем указанная фармацевтическая композиция является твердым веществом, способным образовывать гель при контактировании с тканью или жидкостью организма животного. Родственным объектом настоящего изобретения является композиция для пролонгированного высвобождения физиологически активного агента в организме животного, которая находится в сухой форме и включает:a) один или несколько физиологически активных агентов в количестве, вызывающем физиологическую реакцию в организме животного;b) пектиновое вещество со степенью метилирования менее 30% и средней молекулярной массой более 1105 Да в количестве, достаточном для образования геля при контактировании вышеуказанной композиции с тканью или жидкостью организма животного. Настоящее изобретение относится также к способам получения композиций по данному изобретению. Одним таким объектом настоящего изобретения является способ получения сухой композиции для пролонгированного высвобождения физиологически активного агента в организме животного, который включает растворение смеси пектинового вещества и физиологически активного агента в носителе с образованием раствора или дисперсии, в которой количество пектинового вещества является достаточным для образования геля in situ в организме животного; и удаление летучих компонентов из носителя с получением сухой композиции. Настоящее изобретение относится также к способам введения твердых или жидких фармацевтических композиций, образующих гель при контактировании с тканями или жидкостями организма животного. Одним объектом настоящего изобретения является способ введения в ткань или жидкость организма животного в любом порядке или комбинации нижеследующих компонентов:a) одного или нескольких физиологически активных агентов в количестве, достаточном для индукции физиологической реакции у животного;b) одного или нескольких полисахаридов, содержащих субзвенья с анионными карбоксилатными или сульфатными группами; и с) одной или нескольких твердых гель-индуцирующих композиций, содержащих одну или несколько фармацевтически приемлемых солей двухвалентного или многовалентного катиона металла; с образованием геля при контактировании с тканями или жидкостями организма животного. В вышеописанном варианте осуществления изобретения компоненты a, b и с можно вводить в любом порядке, компоненты а и b могут находиться в форме твердого вещества или жидкого раствора, и любую комбинацию или субкомбинацию компонентов a, b и с можно вводить одновременно или в виде смесей. Настоящее изобретение относится также к жидким композициям, способным образовывать гель при контактировании с тканями или жидкостями организма животного, и к способам введения указанных композиций в ткани и жидкости организма. Одним объектом настоящего изобретения является способ введения физиологически активного агента животному, который включает:a) получение жидкого раствора или дисперсии, содержащейi) жидкий носитель,ii) пектиновое вещество со степенью метилирования менее 30% и средней молекулярной массой более 4,6105 дальтон в количестве, достаточном для превращения в гель жидкого раствора или дисперсии при введении в ткани или жидкости организма животного, иiii) один или несколько физиологически активных агентов;b) введение жидкого раствора или дисперсии в ткани или жидкости организма животного с образованием геля, содержащего физиологически активный агент, при контактировании с тканями или жидкостями организма. Другим объектом настоящего изобретения является вакцинная композиция для введения в слизистую оболочку носа животного, которая состоит из порошкообразных частиц, представляющих собой нанодисперсию:a) одного или нескольких антигенов в количестве, достаточном для индукции иммунной реакции у животного;b) одного или нескольких пектинов или его соли одновалентного катиона со степенью метилирования менее примерно 30% и средней молекулярной массой более примерно 1105 Да; причем порошкообразные частицы указанной композиции могут проходить через сито с диаметром отверстий около 250 мкм. Некоторыми другими объектами настоящего изобретения являются способы введения вакцинной композиции животным или человеку в твердой или жидкой формах, которые включают введение вакцинной композиции в слизистые оболочки животного или человека. Одним таким объектом настоящего изобретения является способ профилактической вакцинации животного, который включает:a) получение одной или нескольких порошкообразных композиций, состоящих из порошкообразных частиц, способных проходить через сито с диаметром отверстий около 250 мкм, которые включают:i) пектиновое вещество со степенью метилирования менее примерно 30% и средней молекулярной массой более 1105 Да в количестве, достаточном для образования геля при контактировании композиции со слизистыми оболочками животного; ii) один или несколько антигенов, выбираемых из группы,включающей пептид, белок, нуклеиновую кислоту, углевод, живую клетку или микроорганизм, мертвую клетку, микроорганизм или его часть, вирус или его часть, в количестве, достаточном для индукции активной иммунной реакции у животного;b) введение указанного порошка в ткани и/или жидкости носа животного с образованием геля при контактировании с тканями или жидкостями организма иc) индукцию активной иммунной реакции у животного на один или несколько антигенов. Выше были описаны некоторые из наиболее типичных отличительных признаков настоящего изобретения. Вышеописанные признаки следует рассматривать только как иллюстрацию некоторых наиболее важных признаков и применений настоящего изобретения. Более полное представление о данном изобретении можно получить, ознакомившись с приведенным ниже подробным описанием изобретения. Краткое описание фигур Для более полного понимания предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения следует обратиться к нижеследующему подробному описанию изобретения и прилагаемым фигурам, на которых соответствующие цифровые обозначения относятся к соответствующим элементам. На фиг. 1 изображена столбчатая диаграмма, показывающая взаимосвязь NaCl с гелеобразованием пектина алоэ под действием кальция. На фиг. 2 показано гелеобразование пектина алоэ in situ при разных концентрациях пектина алоэ с использованием нормальной сыворотки животного. На фиг. 3 А показано гелеобразование пектина алоэ in situ в присутствии загустителя НЕС с использованием нормальной сыворотки животного. На фиг. 3 В показано гелеобразование пектина алоэ in situ в присутствии загустителя, являющегося альгинатом натрия, с использованием нормальной сыворотки животного. На фиг. 4 показан эффект медленного высвобождения, достигаемый при помощи геля пектина алоэin situ, с использованием низкомолекулярного органического соединения (быстрый зеленый). На фиг. 5 изображена столбчатая диаграмма, показывающая взаимосвязь между обработкой bFGF и числом клеток на определенном участке. На фиг. 6 показана скорость высвобождения быстрого зеленого из жидких или сухих препаратов. На фиг. 6 а показаны результаты, полученные для LM пектина, и на фиг. 6b показаны результаты, полученные для низкомолекулярного пектина алоэ. Диаметр диффузионного пятна вокруг препарата, помещенного в нормальную телячью сыворотку, измеряли в течение определенного периода времени в соответствии с описанием, приведенным в примере 17. На фиг. 7 показано регулируемое высвобождение белка из порошкообразных препаратов, содержащих высокомолекулярный пектин алоэ, которые были суспендированы в имитированных выделениях из носа, в соответствии с описанием, приведенным в примере 20. На фиг. 8 показана специфическая реакция сывороточного IgG против антигена DT-CRM после введения крысам в нос порошкообразного вакцинного препарата в соответствии с описанием, приведенным в примере 22. На фиг. 9 показано улучшенное гелеобразование пектиновых препаратов in situ при контактировании с нормальной телячьей сывороткой, достигаемое при добавлении инородного кальция, в соответст-5 010351 вии с описанием, приведенным в примере 24. На фиг. 10 изображены последовательные поперечные срезы полости носа мыши через 4 ч после введения в нос раствора высокомолекулярного пектина алоэ (0,5%, мас./об.), показывающие образование геля на слизистой оболочке носа, в соответствии с описанием, приведенным в примере 26. На фиг. 11 показаны иммунологические реакции сывороточного IgG и легочного IgA мышей на введение в нос жидких вакцинных композиций, содержащих пектин алоэ и белковый антиген (DT-CRM)(а и b) или антиген инактивированного расщепленного субвириона гриппа (A/New Caledonia/20/99,H1N1) (с и d), в соответствии с описанием, приведенным в примере 29. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение может быть легко понято при ознакомлении с нижеследующим подробным описанием разных вариантов осуществления изобретения, с примерами, включенными в данное описание изобретения, и фигурами, а также с их предшествующим и последующим описанием. Прежде чем приступить к описанию соединений, композиций и/или способов по настоящему изобретению, следует отметить, что данное изобретение не ограничивается конкретными исходными материалами, фармацевтическими агентами или конкретными методами синтеза, которые, несомненно, могут меняться, за исключением особо оговоренных случаев. Кроме того, должно быть понятно, что терминология, используемая в данном описании изобретения, служит только для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не ограничена указанными рамками. Определения терминов В данном описании изобретения и приведенной формуле изобретения использованы термины,имеющие нижеследующие значения. Термин "необязательный" или "необязательно" означает, что описываемое далее событие или явление может произойти или может не произойти, и описание изобретения включает случаи, когда указанное событие или явление происходит, и случаи, когда оно не происходит. Например, фраза "необязательный наполнитель" означает, что данный наполнитель может входить или не входить в состав композиции. Необходимо отметить, что используемые в описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают также формы множественного числа за исключением случаев, явствующих из контекста. Так, например, термин "ароматическое соединение" включает также смеси ароматических соединений. Диапазоны часто указаны от "примерно" одного конкретного значения до "примерно" другого конкретного значения. При указании такого диапазона другой вариант осуществления изобретения включает диапазон от одного конкретного значения до другого конкретного значения. Аналогичным образом, когда значения выражены в виде приблизительных величин, использование предшествующего определения"примерно" позволяет понять, что конкретное значение относится к другому варианту осуществления изобретения. Далее будет понятно, что конечные значения каждого диапазона имеют важное значение как относительно другого конечного значения, так и независимо от другого конечного значения. Термин "фармацевтически приемлемый" означает вещество, которое не является нежелательным в биологическом или другом отношении, то есть данное вещество можно вводить субъекту вместе с соответствующим активным соединением без возникновения клинически неприемлемых биологических эффектов или вредного взаимодействия с любыми другими компонентами фармацевтической композиции,в состав которой оно входит. Термин "эффективное количество" соединения в используемом здесь значении означает количество соединения, достаточное для требуемого регулирования желаемой функции, такой как экспрессия гена,антиген-индуцированная иммунная реакция, функция белка или заболевание. Как будет указано ниже,точное необходимое количество является различным для разных субъектов в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести заболевания, подлежащего лечению, конкретного используемого агента, способа введения и подобных факторов. Таким образом, нельзя указать точное "эффективное количество". Однако соответствующее эффективное количество может быть определено любым специалистом в данной области в результате простого экспериментирования. Термин "гель" в используемом здесь значении означает эластичное твердое или деформируемое полутвердое вещество, включающее пористую трехмерную сетку органических полимерных молекул и содержащее внутри указанной сетки обратимо абсорбируемую жидкость. В контексте настоящего изобретения обратимо абсорбируемая жидкость обычно является жидкой водой, хотя в ней могут также присутствовать другие жидкие вещества. В контексте настоящего изобретения сетка полимерных молекул обычно состоит из полисахаридов, содержащих повторяющиеся звенья с карбоксилатными или сульфатными группами, в том числе из пектинов. Во многих вариантах осуществления настоящего изобретения по крайней мере некоторые карбоксилатные или сульфатные группы смежных полисахаридных цепей образуют координационные связи с двухвалентными или многовалентными катионами, такими как кальций или алюминий, создавая поперечно сшитую катионами трехмерную сетку полисахаридных молекул,которая по существу не растворяется в чистой воде. Наличие и идентичность таких поперечно сшитых катионом и не растворимых в воде гелей обычно можно экспериментально подтвердить, поместив обра-6 010351 зец геля в чистую, нейтральную воду на несколько часов, таким образом можно установить, что указанные образцы сохраняют полутвердую форму и по существу не растворяются в воде, но добавление агентов, образующих хелат с катионами металлов, таких как натриевые соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), вызывает быстрое растворение геля вследствие удаления двухвалентных или многовалентных ионов металлов. Термин "гелеобразование" в используемом здесь значении означает образование геля, которое предполагает создание поперечно сшитой полимерной сетки и абсорбцию жидкости и/или других веществ поперечно сшитой полимерной сеткой с образованием твердого или полутвердого вещества, которое по существу не растворяется в жидкости. Гели образуются in situ из приемлемых полимеровпредшественников и жидкостей, которые обычно включают воду, с последующим сшиванием при контактировании с тканью или жидкостью организма или имитированной тканью или жидкостью организма,в результате чего образуется твердое или полутвердое вещество, содержащее поперечно сшитую полимерную сетку и воду, выделенную из ткани или жидкости организма. Термин "полимер" означает макромолекулу, образующуюся в результате ковалентного связывания более 10 двухвалентных или многовалентных субзвеньев, которые обычно именуют мономерами. Полимеры по настоящему изобретению включают как природные полимеры, такие как белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и тому подобные, которые могут содержать относительно большое число мономеров разных типов, так и искусственные полимеры, такие как полиакрилаты, которые часто содержат только один или небольшое число разных мономеров. Термин "гель-индуцирующий агент" означает агент, способный вызывать образование геля из полимера или полимерного раствора. Гель-индуцирующие агенты часто индуцируют образование геля,вызывая сшивание полимерных цепей, и в контексте настоящего изобретения включают соли двухвалентных и многовалентных катионов, которые могут сшивать карбоксилатные или сульфатные замещающие группы в одинаковых или разных полисахаридных молекулах. Термин "ионный полимер" означает синтетический или природный полимер, содержащий мономеры с функциональными группами, которые ионизированы или могут быть легко ионизированы, такими как группы карбоновой кислоты или соответствующие карбоксилатные группы, группы органической сульфокислоты и соответствующие анионные группы органического сульфоната. Термин "ионотропный гель" означает гель, полученный в результате сшивания полимера ионом. Термин "сухой фармацевтический препарат" означает препарат с содержанием влаги менее 20%,который имеет форму порошка, подушечки, пленки, тампона, таблетки или капсулы. Термин "порошок" означает твердое сухое вещество, которое состоит, главным образом, из мелких твердых частиц или сфер. Самый большой размер основной массы частиц или сфер порошка составляет менее одного миллиметра. В соответствии с вышеуказанным определением "сухой" означает, что на поверхности частиц или сфер порошка присутствует очень мало, если вообще присутствует, свободнотекучей жидкости или избыточной влаги (включая воду), которая может значительно ухудшать физические свойства свободного течения порошка. Порошки по настоящему изобретению могут содержать абсорбированную воду в своих частицах или полимерной сетке, но не имеют значительного количества текучей жидкой воды на своей поверхности. Термин "микросфера" означает мелкую твердую частицу сферической формы с выпуклой поверхностью, не имеющей углов, причем указанная частица имеет эффективный диаметр от около 0,1 до около 250 микрон (мкм). Микросферы в используемом здесь значении включают микрокапсулы. "Микрочастица" в отличие от микросферы имеет гладкую, угловую, ромбоидальную поверхность или поверхность неправильной формы. Микрочастицы имеют наибольший линейный размер от около 0,1 до около 250 мкм. Термин "физиологически активный агент" означает агент, соединение или композицию, которые могут индуцировать физиологическую реакцию в организме животного. Физиологически активные агенты включают питательные вещества, низкомолекулярные лекарственные средства и терапевтические агенты, высокомолекулярные лекарственные средства и терапевтические агенты, фармакологически активное вещество, диагностический агент, терапевтический агент, нуклеиновую кислоту, пептид, полимер, низкомолекулярный белок, высокомолекулярный белок и живую клетку. Фармакологически активное вещество означает вещество, вызывающее иммунную реакцию, такое как вакцина, содержащая один или несколько антигенов. Примеры терапевтических агентов включают антибактериальные вещества,антимикробные средства, противопаразитарные средства, антибиотики, антигистаминные средства, противоотечные средства, антиметаболиты, антиглаукомные средства, противораковые средства, антивирусные средства, противогрибковые средства, противовоспалительные средства, антидиабетические средства, анестезирующие средства, антидепрессанты, аналгетики, антикоагулянты, глазные средства,ангиогенные факторы, иммунодепрессанты и противоаллергические средства."Вакцина" содержит один или несколько антигенов, обычно в форме белка, пептида, углевода, липида или нуклеиновой кислоты, цельной или неполной живой или мертвой клетки или микроорганизма,цельного или неполного вируса и т.д., которые способны индуцировать иммунную реакцию у подвергаемого лечению млекопитающего, в результате которой часто образуются антитела (гуморальный им-7 010351 мунный ответ) и/или возникают клеточные (T-клеточные) иммунные реакции, избирательно направленные против антигена, микроорганизма или ткани, из которых была получена вакцина, для лечения или профилактики заболеваний, вызываемых микроорганизмами или вирусами, и/или рака. Термин "пектиновое вещество" в значении, используемом в данном изобретении, означает любое вещество, содержащее в основном одно или несколько полисахаридных веществ, выделенных из природного пектина. Пектиновые вещества включают низшие и высшие метоксипектины, деэтерифицированный пектин, кальциевый гель пектина, натриевый гель пектина алоэ, пектиновую кислоту, пектат,пектининовую кислоту, пектинат, протопектин и вещества с высоким содержанием пектина, такие как внутренний гель клетчатки алоэ вера, используемые отдельно, вместе или в любой комбинации. Как было указано выше, пектин является групповым названием производных комплексных коллоидных углеводов, которые находятся в растениях или могут быть получены из растений и содержат большое количество мономерных звеньев ангидрогалатуроновой кислоты. Термин "деэтерифицированный" пектин означает пектин, из которого было искусственно удалено несколько групп сложного метилового эфира."Пектиновая кислота" является групповым названием пектиновых веществ, состоящих, главным образом, из коллоидных полигалактуроновых кислот и по существу не имеющих групп сложного метилового эфира. Полностью деэтерифицированный пектин представляет собой пектиновую кислоту или полигалактуроновую кислоту. "Пектаты" являются нормальными или кислыми солями пектиновых кислот. "Пектининовые кислоты" являются коллоидными полигалактуроновыми кислотами, содержащими незначительное количество групп сложного метилового эфира. "Пектинаты" являются нормальными или кислыми солями пектининовых кислот. "Протопектин" означает не растворимый в воде исходный пектин, который присутствует в растениях и в результате ограниченного гидролиза образует пектины, пектининовые кислоты и другие. Не растворимый в воде пектин может быть связан с целлюлозой, присутствующей в растении, такой как внутренний гель клетчатки коры алоэ вера. Остаток химического продукта в значении, используемом в описании изобретения и формуле изобретения, означает фрагмент или часть структуры, получаемой в качестве конечного химического продукта при выполнении определенной схемы реакций или при последующем образовании химического продукта, независимо от того, действительно ли данный фрагмент или часть структуры получены из конкретного химического продукта. Так, остаток Gal А в пектине означает одно или несколько мономерных повторяющихся звеньев галактуроной кислоты независимо от наличия или использования самой галактуроновой кислоты для получения пектина. В приведенном ниже описании изобретения часто указываются единицы "% (мас./об.)". Выражение"% (мас./об.)" означает число граммов вещества в 100 мл жидкого раствора. В разбавленных водных растворах плотность жидкости равна примерно 1 г на 1 мл, так что значение "% (маc./об.)" должно быть примерно равно числу граммов твердого вещества в 100 г жидкости. В указанных единицах "%CMC, карбоксиметилцеллюлоза; Да, дальтон; DM, степень метилирования; Gal А, галактуроновая кислота; НЕС, гидроксиэтилцеллюлоза; HM, высшая метоксильная группа; HPMC, гидроксипропилметилцеллюлоза; кДа, килодальтон; LM, низшая метоксильная группа; PBS, забуференный фосфатом физиологический раствор; PEG-PLGA-PEG, сополимер полиэтиленгликоля, сополимера молочной и гликолевой кислоты и полиэтиленгликоля; PEO-PLLA, сополимер полиэтиленоксида и поли-L-лактида; PEOPPO-PEO, сополимер полиэтиленоксида, полипропиленоксида и полиэтиленоксида. Фармацевтические композиции для гелеобразования in situ Фармацевтические композиции по настоящему изобретению являются гелеобразующими "in situ" композициями в твердой или жидкой форме, содержащими один или несколько анионных полисахаридов и один или несколько физиологически активных агентов, которые отличаются тем, что после введения в ткани, жидкости организма или слизистые оболочки животного анионные полисахариды в указанных композициях обычно образуют гель in situ в результате создания пористой трехмерной полимерной сетки. До введения в ткани, жидкости организма или слизистые оболочки животных фармацевтические композиции по настоящему изобретению и большая часть или все их компоненты обычно растворяются в чистой воде, но после введения в ткани или жидкости организма происходит сшивание карброксилатных или сульфатных групп анионных полисахаридов в результате координационного связывания с "инородным" двухвалентным кальцием, абсорбированным из биологических жидкостей, с образованием биоадгезивного геля, который не растворяется в воде или жидкостях организма в физиологических условиях. Композиции по настоящему изобретению отличаются от ранее известных композиций, которые являются заранее поперечно сшитыми полимерными композициями, не подвергающимися сшиванию в месте применения. В соответствии с определением геля по настоящему изобретению жидкость, находящаяся в порах полимерной сетки, часто включает воду, физиологический раствор или биологические жидкости, выделенные из организма подвергаемого лечению животного или субъекта, которые содержат воду, при этом-8 010351 лекарственные средства или фармакологически активные вещества обычно также заключены в поры поперечно сшитой полимерной сетки. В контексте настоящего изобретения гелевые сетки часто образуются координационным/ионным связыванием анионных карбоксилатных или сульфатных групп в смежных полисахаридных молекулах и путем сшивания двухвалентными или многовалентными катионами, образующими координационные связи с карбоксилатными или сульфатными группами. Твердые композиции Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к твердой фармацевтической композиции для доставки физиологически активного агента в организм животного, которая включает:a) один или несколько физиологически активных агентов в количестве, достаточном для индукции физиологической реакции у животного;b) один или несколько полисахаридов, содержащих субзвенья с анионными карбоксилатными или сульфатными группами; иc) одну или несколько твердых композиций, индуцирующих образование полисахаридного геля, которые включают одну или несколько фармацевтически приемлемых солей двухвалентного или многовалентного катиона металла; причем указанная фармацевтическая композиция находится в твердой форме и образует гель при контактировании с тканью или жидкостью организма животного. Другой вариант осуществления изобретения, родственный вышеописанному варианту, относится к композиции для введения физиологически активного агента животному, которая включает:a) один или несколько физиологически активных агентов в количестве, достаточном для индукции физиологической реакции у животного; иb) одно или несколько пектиновых веществ со степенью метилирования менее примерно 30% и средней молекулярной массой более примерно 1105 Да; причем указанная композиция является твердым веществом, способным образовывать гель при контактировании с тканью или жидкостью организма животного. Описанные выше твердые фармацевтические композиции имеют любую твердую форму, включая подушечку, таблетку, капсулу или порошок. Во многих вариантах осуществления изобретения твердую фармацевтическую композицию получают в форме порошка. Другой родственный вариант осуществления изобретения относится к вакцинной композиции для введения в нос животному, которая состоит из порошкообразных частиц, представляющих собой нанодисперсиюa) одного или нескольких антигенов в количестве, достаточном для индукции иммунной реакции у животного; иb) одного или нескольких пектинов или его соли одновалентного катиона со степенью метилирования менее примерно 30% и средней молекулярной массой более примерно 1105 Да; причем указанные порошкообразные частицы могут проходить через сито с диаметром отверстий около 250 мкм. Порошки могут представлять собой множество микрочастиц и/или микросфер в соответствии с приведенными определениями. Порошки с требуемым размером частиц могут быть получены на практике любыми способами, хорошо известными в данной области, которые включают эмульгирование, инкапсулирование, распылительную сушку, дробление или размалывание твердых веществ и т.д. На конечной стадии многих процессов твердые вещества-предшественники или порошки пропускают через один или несколько наборов сит. Такие сита имеют отверстия требуемых размеров, например, 250, 200, 150,100, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 11, 10, 9, 5, 1 и 0,1 мкм, благодаря чему получают частицы разных размеров для порошков, микрочастиц и/или микросфер. Частицы требуемых размеров могут включать частицы в диапазоне размеров, указанных в приведенной ниже таблице 1. В одном варианте осуществления изобретения через отверстия сит могут проходить порошки, микрочастицы или микросферы размером около 250 мкм или меньше. Полученный порошок затем может быть необязательно пропущен через сито с меньшим размером отверстий для удаления самых мелких частиц, в результате чего получают твердую композицию с частицами размером, например, от около 11 мкм до около 250 мкм. Кроме того, хороший эффект достигается при введении других ограничений при распределении частиц по размерам. В некоторых вариантах осуществления изобретения определенный процент частиц твердой композиции должен находиться в установленном диапазоне размеров. Например, может быть желательно, чтобы примерно 80%, примерно 85%, примерно 90% или примерно 95% частиц находились в установленном диапазоне размеров. В качестве примера можно привести некоторые варианты осуществления изобретения, в которых твердые композиции включают микросферы, при этом менее 90% микросфер имеют диаметр от 0,1 до 10 мкм. В некоторых вариантах осуществления изобретения физиологически активные агенты осаждают на поверхности частиц, включающих ионный полисахарид и/или другие твердые ингредиенты, либо порошок, содержащий физиологически активный агент, смешивают с порошком, содержащим ионные полисахариды. Однако во многих предпочтительных вариантах осуществления изобретения физиологически активные агенты диспергируют в твердой матрице, включающей смесь анионных полисахаридов, загус-9 010351 тителей, наполнителей и т.д. Смесь разных компонентов предпочтительно диспергируют в твердой матрице в виде смеси отдельных молекул и/или ионов на молекулярном уровне, хотя в такой смеси могут присутствовать более крупные агрегаты подобных молекул (в частности, неорганические соли). Такую полуоднородную смесь твердой матрицы можно именовать "нанодисперсией" ингредиентов твердой смеси. Еще более предпочтительную смесь получают в результате по существу однородного диспергирования ингредиентов твердой смеси и образующих их молекул на молекулярном уровне с образованием"твердого раствора" компонентов твердой смеси. Такие "нанодисперсии" и "твердые растворы" обеспечивают более высокую стабилизацию чувствительных биологически активных агентов и позволяют улучшить диспергирование, скорости высвобождения лекарственного средства и/или биологическую доступность физиологически активных агентов. Таблица 1. Выбранные диапазоны содержания компонентов гелеобразующих композиций по настоящему изобретению Несмотря на попарное указание диапазонов в приведенной выше таблице, предполагается, что любые конечные значения, указанные для определенной категории компонентов в таблице, могут быть объединены с любыми другими соответствующими конечными значениями, указанными для данной категории компонентов, с образованием нового диапазона для данной категории компонентов. Один или несколько полисахаридов, используемых в настоящем изобретении, могут быть нейтральными или анионными, так как они содержат моносахаридные субзвенья с анионными карбоксилатными или сульфатными группами. Следует отметить, что анионные карбоксилатные группы могут находиться в форме соли карбоновой кислоты, присоединенной к мономерным субзвеньям, или в форме исходной карбоновой кислоты, которая легко ионизируется или уже ионизирована при физиологическом значении рН. Аналогичным образом анионные сульфатные группы моносахаридных субзвеньев включают как соль моносахарида, содержащего группу сульфоновой кислоты, так и мономерное субзвено,содержащее кислую форму сульфата. Разные полисахариды включают анионные карбоксилатные или сульфатные группы, в том числе карбоксилированные крахмалы, пектиновые вещества, альгинат, каррегинан или геллан. Во многих вариантах осуществления изобретения твердые фармацевтические композиции содержат- 10010351 один или несколько пектинов в виде кислоты или соли карбоновой кислоты. Во многих предпочтительных вариантах осуществления изобретения анионные полисахариды и/или пектины присутствуют в виде соли одновалентного катиона, причем такие катионы включают катионы лития, натрия, калия и/или аммония (NH4+), которые хорошо растворяются в воде при физиологическом значении рН. Пектины имеют полимерный остов полисахарида с -(14 )-связанной полигалактуроновой кислотой (Gal А), разделенный остатками рамнозы. Остатки Gal А имеют замещающие группы карбоновой кислоты, присоединенные к сахаридному кольцу, которые могут быть в форме карбоновой кислоты, ее соли или сложного эфира. Содержание Gal А в большинстве пектинов равно примерно 70-75% и содержание рамнозы обычно составляет менее 2%. Остатки рамнозы связаны в -(12)-положении с остатками Gal А в остове и образуют Т-образный изгиб в главной цепи, сообщающий большую гибкость полисахаридных цепям. Боковые цепи нейтрального сахара присоединены к остаткам рамнозы в остове в положении 0-3 или 0-4, при этом остатки рамнозы сгруппированы в остове. Указанные области, содержащие остатки рамнозы, с боковыми цепями, именуются "волосяной областью" пектина, в то время как большие участки повторяющихся остатков Gal А с неразветвленной цепью именуются "гладкой областью" пектина. Гидроксильные заместители и/или замещающие группы карбоновой кислоты в сахаридных кольцах также часто связаны с компонентами, которые не являются сахаром, такими как метильные и ацетильные группы. Количество вставок рамнозы и других модификаций в цепи и ее мономерах изменяется в зависимости от растительного источника пектина. Карбоксильные группы остатков Gal А подвергаются метилированию с образованием сложных метиловых эфиров карбоновой кислоты. Степень метилирования или образования сложного метилового эфира ("DM") в пектине определяется в виде процентного значения карбоксильных групп (остатки Gal А) , этерифицированных метанолом. С учетом значения DM пектины делятся на два класса: низший метоксипектин ("LM") с DM 50% и высший метоксипектин ("HM") с DM 50%. Большинство природных пектинов и большинство коммерчески доступных пектинов, обычно получаемых из цитрусовых и яблок, являются HM пектинами.LM пектины обычно получают из HM пектинов при помощи искусственных химических или биохимических процессов деэтерификации. Коммерчески доступные LM пектины обычно имеют значениеDM, равное 20-50%. Полностью деэтерифицированный пектин именуется "пектиновой кислотой" или"полигалактуроновой кислотой". Пектиновая кислота в форме кислоты является нерастворимой, но растворяется в форме соли. Обычной солью пектиновой кислоты является натриевая или калиевая соль. Пектины обычно являются наиболее устойчивыми при кислотных значениях рН, равных примерно 3-4. При значении рН ниже 3 обычно происходит удаление метоксильных и ацетильных групп, а также боковых цепей нейтрального сахара. Известно, что в нейтральных и щелочных условиях группы сложного метилового эфира остатков Gal А омыляются с образованием карбоновой кислоты или карбоксилата, а полигалактуроновый остов разрывается в результате расщепления гликозидных связей в -положении у невосстанавливающихся концов метилированных остатков Gal А, в результате чего молекулярная массаLM пектинов обычно оказывается значительно меньше молекулярной массы исходного HM пектина. Образовавшиеся пектиновые кислоты и LM пектины становятся относительно более устойчивыми к потере молекулярной массы в нейтральных и щелочных условиях из-за наличия ограниченного числа групп сложного метилового эфира или полного их отсутствия, благодаря чему замедляется расщепление полимерных цепей в -положении. Как HM, так и LM пектины образуют гели. Однако указанные гели образуются при помощи совершенно разных механизмов (Voragen et al. In Food polysaccharides and their applications, pp. 287-339. MarcelDekker, Inc. New York, 1995). HM пектин образует гель в присутствии высоких концентраций определенных сорастворенных веществ (например, сахарозы) при низком значении pH. HM пектины обычно не взаимодействуют с кальцием или другими многовалентными ионами и поэтому не образуют кальциевый гель подобно LM пектинам (см. ниже). Однако определенным HM пектинам можно сообщить способность взаимодействовать с кальцием при помощи поблочной деэтерификации с сохранением значенияDM 50%. См. Christensen et al., патент США 6083540. Известно, что LM пектины, содержащие большое число неэтерифицированных групп карбоновой кислоты и/или карбоксилатных групп, образуют гели в присутствии катионов кальция в достаточных концентрациях. Считается, что ионы кальция образуют координационные связи с анионными карбоксилатными группами полимерных субзвеньев Gal А, поэтому такие группы именуются "кальцийреактивными". Предполагается, что сетка кальциевого геля LM пектина образуется в результате возникновения соединительных зон в виде "яичной коробки", в которых Са вызывает координационное связывание и сшивание дополнительных карбоксилатных групп вдоль двух дополнительных участков полимерных цепей полигалактуроновой кислоты. На образование кальциевого геля LM пектина влияют несколько факторов, включающих значение DM, ионную силу, значение рН и молекулярную массу пектина (Garnier et al., Carbohydrate Research, 240, 219-232, 1993; 256, 71-81, 1994). Коммерчески доступные в настоящее время LM пектины обычно имеют молекулярную массу, равную 7-14104 Да, и содержаниеNew York, 1995). Типичные пектины содержат рамнозу в количестве 2%. Пектины, обычно используемые в пищевой промышленности, классифицируются Управлением по контролю за продуктами и лекарствами как "GRAS" (безвредные). В течение длительного времени их также использовали в качестве коллоидных агентов и средств против диареи. В последнее время пектины стали использовать в медицинских устройствах и системах доставки лекарственных средств (Thakur etal., Critical Reviews in Food ScienceNutrition 37, 47-73, 1997). В области доставки лекарственных средств пектин нашел применение во многих экспериментальных препаратах для пероральной доставки лекарственных средств в ободочную кишку, так как пектин легко разрушается бактериями, присутствующими в данной области кишечника. Пектин используют, как есть, без гелеобразования, или предварительно получают кальциевый гель пектина для инкапсулирования лекарственного средства перед введением. Ashford et al, J. Controlled Release 26, 213-220, 1993; 30, 225-232, 1994; Munjeri et al., J. ControlledRelease 46, 273-278, 1997; Wakerly et al, J. PharmacyPharmacology 49, 622-625, 1997; International Journal of Pharmaceutics 153, 219-224, 1997; Miyazaki et al, International Journal of Pharmaceutics 204, 127-132,2000. В некоторых вариантах осуществления изобретения пектины имеют степень метилирования (DM),равную или менее примерно 70, 50, 30, 25, 20, 19, 18, 15, 14, 12, 10, 9 или 5%. Более низкие степени метилирования обычно, но не всегда, улучшают свойства гелеобразования, хотя в определении свойств гелеобразования пектинов участвуют многие другие факторы. Молекулярная масса пектинового вещества или пектина имеет важное значение для гелеобразования, причем более высокие молекулярные массы соответствуют лучшим свойствам гелеобразования. Значение молекулярной массы для гелеобразования пектинов описано в патенте США 5929051, который полностью включен в данное описание изобретения в качестве ссылки, где описаны характеристики пектинов и пектинов алоэ. Во многих вариантах осуществления изобретения пектиновые вещества или пектины имеют среднюю молекулярную массу более примерно 4,6105 Да или примерно 5,0105 Да. Альтернативно, пектиновые вещества или пектины могут иметь среднюю молекулярную массу, равную или меньше примерно 2105, 3105, 4105, 6105, 7105, 8105 или 9105 Да. В некоторых вариантах осуществления изобретения пектиновые вещества или пектины имеют молекулярную массу более 1106 Да и степень метилирования менее 10%. Из некоторых предпочтительных пектинов по настоящему изобретению, таких как пектины алоэ компании DelSite Biotechnologies, Inc. и/или их водорастворимые соли одновалентного катиона, плотный эластичный гель может быть получен при использовании 0,5% (мас./об.) LM пектина и 30-60 мг/г Ca2+. Твердые композиции по настоящему изобретению могут содержать небольшое количество воды, в частности композиции, включающие пектины, в которых сохраняется остаточная вода, абсорбированная пектинами. Поэтому твердые композиции по настоящему изобретению могут содержать примерно 20 мас.% воды либо около 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 3, 2, 1 или меньше. При любом вышеуказанном процентном содержании воды частицы могут быть определены как "сухие" с учетом того, что на поверхности частиц отсутствует избыток свободнотекучей жидкости или влаги, способный вызвать значительное слипание, которое может препятствовать свободному течению твердого вещества в форме порошка. В некоторых вариантах осуществления изобретения желательно более низкое процентное содержание воды для улучшения устойчивости физиологически активных агентов во время хранения или для улучшения физических характеристик твердого вещества. Активные агенты Композиции по настоящему изобретению (жидкие или твердые) могут содержать один или несколько физиологически активных агентов в соответствии с определением данного термина, приведенным в описании изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения физиологически активные агенты могут включать терапевтический агент, диагностический агент, углевод, липид, пептид,нуклеиновую кислоту, живую клетку, цельную или неполную мертвую клетку, цельный или неполный микроорганизм, цельный или неполный вирус, вакцину, антиген и белок. Композиции по настоящему изобретению могут содержать такие терапевтические агенты, как низкомолекулярные лекарственные средства. Во многих вариантах осуществления изобретения композиции по настоящему изобретению могут содержать целый ряд более крупных биологических агентов, включающих молекулы, клетки, вирусы, антигены и т.д. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения физиологически активные агенты являются антигенами, предназначенными для получения вакцин, которые включают пептиды,белки, живые клетки, цельные или неполные мертвые клетки, цельные или неполные вирусы, инактивированные микробы или вирусы, живые ослабленные микробы или вирусы, фаги, субъединичные вакцинные белки, субъединичные вакцинные пептиды, субъединичные вакцинные углеводы, репликоны, вирусные векторы, плазмиды и другие иммуноактивные генетические и рекомбинантные материалы или их смеси. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько антигенов независимо выбирают из антигенов, используемых для профилактики гриппа, дифтерии, столбняка и коклюша,ТОРС (SARS), СПИДа, холеры, шигеллеза, менингита, бляшек, гепатита, лихорадки денге, желтой лихо- 12010351 радки, энцефалита, малярии, герпеса, кори, брюшного тифа, туберкулеза, эпидемического сыпного тифа,отита, сибирской язвы или их смесей. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько антигенов являются антигенами вируса гриппа или их смесями, включающими, например, один или несколько инактивированных или ослабленных вирусов гриппа (цельный вирион) или их субъединицы (расщепленный вирион, субвирион), в частности один или несколько гликопротеинов вирусной оболочки, таких как гемагглютинин(НА) или нейраминидаза (NA), или внутренний белок вируса, такой как нуклеокапсидный белок, или их смеси. В настоящее время для получения вакцин против гриппа наиболее широко используют расщепленные субвирионы или субъединичные антигены. Вирусы гриппа, типичные для двух или трех вирусных штаммов, циркулирующих среди исследуемого населения в предыдущем году, выращивают в эмбрионах куриных яиц и собирают из аллантоидных жидкостей или выращивают в линиях определенных животных клеток, таких как клетки MDCK (почки собаки Madin-Darby), инактивированных химическими агентами, такими как формальдегид, и очищают с получением очищенных цельных вирусов. Цельные инактивированные или ослабленные вирусы могут быть использованы для получения вакцины из цельного вириона, либо очищенные вирусы могут быть разрушены химическими веществами для разделения их на отдельные компоненты, такие как мембранные белки НА и NA, и их разные известные подтипы,после чего белковые антигены могут быть подвергнуты дальнейшей очистке. Антигены из одного или нескольких штаммов затем объединяют с получением конечной вакцины. Дозу вакцины против гриппа для многих субвирионных вакцин против гриппа часто определяют с учетом содержания НА. Один или несколько антигенов вируса гриппа предпочтительно включают в состав композиций и/или вводят субъектам в количестве, достаточном для индукции у млекопитающих или человека титра торможения гемагглютинации (HAI) 40. Порошкообразная вакцинная композиция против гриппа для введения в нос может содержать примерно 5-50 микрограммов НА, выделенного из трех циркулирующих вирусных штаммов, в одной дозе порошка для введения унифицированной дозы. Антигены, используемые для приготовления вакцины, и другие фармакологически активные агенты на основе белков и других биологических материалов часто входят в состав композиций по настоящему изобретению или применяются для введения способами по настоящему изобретению в значительно более низких концентрациях по сравнению с другими искусственными лекарственными средствами или терапевтическими агентами, например на уровне микрограммов. Количество антигена, используемого для приготовления вакцины, которое необходимо для индукции у животного иммунитета на приемлемом в медицинском отношении уровне, конечно, является разным в зависимости от вида и массы тела животного, характеристик иммунной системы млекопитающего и/или субъекта определенного типа. Тем не менее в качестве примера можно отметить, что один или несколько антигенов могут присутствовать в композициях в количестве от около 0,001 до около 10 мас.% композиции, от около 0,01 до около 1 мас.% или от около 0,05 до около 0,5 мас.%. Биологические агенты, используемые в настоящем изобретении, являются гораздо менее устойчивыми, чем другие материалы, как при хранении, так и во время применения. Композиции по настоящему изобретению способствуют повышению устойчивости и хранения таких биологических агентов. В частности, при смешивании с соответствующим гелеобразующим полисахаридом, в частности с пектинами, и сушке с образованием твердого вещества полярная природа полисахарида и других носителей и/или наполнителей в твердых композициях и низкое содержание воды в твердой композиции могут значительно продлить срок хранения биологической молекулы, которая в противном случае могла бы быть неустойчивой в водном растворе, находящемся при комнатной температуре или даже в условиях хранения при низких температурах. Кроме того, находясь в геле in situ после введения в ткани или жидкости организма, высокомолекулярные биологические агенты стабилизируются полисахаридной матрицей и высвобождаются из геля гораздо медленнее, чем соединения с меньшей молекулярной массой, в результате чего достигается высокая степень биологической доступности, но при требуемой медленной скорости высвобождения. Такие характеристики композиций по настоящему изобретению могут иметь особенно важное значение при введении вакцин и ассоциированных антигенов. Другим объектом настоящего изобретения является способ доставки физиологически активного агента в организм животного, который включает введение в ткань или жидкость организма животного в любом порядке или комбинации нижеследующих компонентов:a) одного или нескольких физиологически активных агентов в количестве, достаточном для индукции физиологической реакции у животного;b) одного или нескольких полисахаридов, содержащих субзвенья с анионными карбоксилатными или сульфатными группами; иc) одной или нескольких твердых гель-индуцирующих композиций, содержащих одну или несколько фармацевтически приемлемых солей двухвалентного или многовалентного катиона металла; с образованием геля при контактировании с тканью или жидкостями организма животного. В данном варианте и других вариантах осуществления изобретения твердые гель-индуцирующие композиции, включающие одну или несколько фармацевтически приемлемых солей двухвалентного или многовалентного катиона металла, могут находиться в виде химически отличной твердой фазы, необяза- 13010351 тельно в присутствии или в смеси с физиологически активными агентами и/или другими твердыми наполнителями. Такие твердые гель-индуцирующие композиции предназначены для создания "экзогенного" вспомогательного твердого источника гель-индуцирующих двухвалентных или многовалентных катионов, дополняющего аналогичные источники, существующие in situ в тканях или жидкостях организма в месте применения, который вызывает образование, увеличивает скорость и/или эффективность образования геля. Двухвалентный или многовалентный катион обычно находится в твердой гель-индуцирующей композиции в форме фармацевтически приемлемой соли двухвалентного или многовалентного катиона, которая при контактировании с жидкостями организма создает вспомогательный источник двухвалентных или многовалентных катионов, необходимых для гелеобразования анионных полимеров в результате быстрого и эффективного сшивания анионных групп смежных полисахаридных цепей с целью улучшения качества требуемого геля или уменьшения концентрации анионного полисахарида, необходимой для образования геля. Фармацевтически приемлемые соли кальция и алюминия являются предпочтительными солями для использования в составе твердой гель-индуцирующей композиции. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтически приемлемая соль двухвалентного или многовалентного катиона легко растворяется в воде, физиологическом растворе или жидкостях организма, таких как сыворотка или выделения из слизистой оболочки. При контактировании с жидкостями организма растворимая фармацевтически приемлемая соль двухвалентных или многовалентных катионов быстро растворяется и высвобождает катионы в водную среду, которые быстро диффундируют в растворе с анионными полисахаридами, такими как пектины, и образуют координационные связи с анионными группами, сшивая анионные полисахариды. Примеры таких быстро растворимых солей двухвалентных или многовалентных катионов включают галогениды кальция, в частности хлорид кальция. В других вариантах осуществления изобретения фармацевтически приемлемая соль двухвалентного или многовалентного катиона плохо растворяется в водной среде биологических жидкостей или "практически не растворяется" в жидкостях организма в соответствии с терминологией, приведенной в публикации Merck Index. Такие плохо растворимые фармацевтически приемлемые соли двухвалентного или многовалентного катиона предпочтительно не растворяются в воде при комнатной температуре и физиологическом значении рН с образованием раствора, содержащего более 510-3 моль на 1 л соли или предпочтительно не более 110-5 моль на 1 л плохо растворимой соли. Примеры плохо растворимых фармацевтически приемлемых солей двухвалентного или многовалентного катиона включают фосфат кальция и гидроксид алюминия. В композициях по настоящему изобретению, которые включают такие плохо растворимые фармацевтически приемлемые соли двухвалентных или многовалентных катионов, анионные полисахариды диффундируют на поверхности твердых частиц плохо растворимой соли и взаимодействуют с двухвалентными или многовалентными катионами на поверхности частицы, в результате чего гель образуется на поверхности частиц твердой гель-индуцирующей композиции. Таким образом, введение твердой гельиндуцирующей композиции вызывает образование на поверхности тканей или слизистой оболочки гелеобразных агрегатов анионных полисахаридов, содержащих физиологически активный агент, в которых диспергированы многочисленные частицы твердой гель-индуцирующей композиции. Такие гелеобразные агрегаты обеспечивают лучшую биоадгезию по сравнению с композициями, не содержащими твердых гель-индуцирующих композиций, и являются более устойчивыми к растворению геля из-за наличия превышающих нормальные концентраций двухвалентных или многовалентных катионов, благодаря чему происходит медленная и лучшая доставка физиологически активных агентов, чем при инкапсулировании указанных агентов внутри геля. В описанных выше способах компоненты a, b и с можно вводить в любом порядке, комбинации или физической форме, если компонент с вводят в виде твердого вещества и гель образуется при контактировании с тканями или жидкостями организма. В некоторых вариантах осуществления указанного способа компоненты а, b и с вводят в виде порошкообразной композиции, в котором указанные компоненты могут находиться в виде физической смеси одной или нескольких твердых фаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения твердый компонент с присутствует в виде отдельной твердой фазы, включающей порошкообразные частицы, в то время как в других вариантах осуществления изобретения твердый компонент с может также находиться в смеси с физиологически активным агентом на молекулярном уровне. В некоторых вариантах осуществления изобретения компоненты а и b вводят в виде отдельных или смешанных порошков, в то время как компонент с находится в другой и химически отличной твердой фазе. Например, компоненты а и b можно вводить в виде физической смеси одного или нескольких порошков, содержащих компонент а, и одного или нескольких порошков, содержащих компонент b, которые могут быть введены отдельно от компонента с или вместе с компонентом с. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения компоненты а и b вводят в виде твердой композиции, которую получают, растворяя один или несколько физиологически активных- 14010351 агентов и один или несколько полисахаридов в жидком носителе, после чего значительную часть жидкого носителя удаляют с образованием твердой смешанной композиции, в которой активный агент и полисахарид смешаны на молекулярном уровне. Компонент с можно вводить до, одновременно или после введения твердой смешанной композиции, которую часто вводят в форме порошка. Как было описано выше, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям и способам введения вакцин и/или антигенов животным и/или человеку. Поэтому некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу введения вакцины в слизистую оболочку носа животного, который включает:a) введение одного или нескольких порошков, состоящих из микросфер или микрочастиц, которые отдельно или вместе включаютi) один или несколько полисахаридов, содержащих субзвенья с анионными карбоксилатными или сульфатными группами, в количестве, достаточном для образования геля при контактировании композиции со слизистой оболочкой животного;ii) один или несколько антигенов, выбираемых из группы, включающей пептид, белок, нуклеиновую кислоту, живую клетку, мертвую клетку или ее часть, или вирус, в количестве, достаточном для индукции активной иммунной реакции у животного;b) введение порошка в ткани и/или жидкости носа животного с образованием геля при контактировании с тканями или жидкостями организма; иc) индукцию активной иммунной реакции на один или несколько антигенов у животного. Жидкие композиции В некоторых других вариантах осуществления изобретения компоненты а и b вводят в виде раствора в жидком носителе, в то время как компонент с вводят в виде отдельного твердого вещества. Другой вариант осуществления изобретения относится к способу пролонгированного высвобождения физиологически активного агента в организм животного, который включает а) получение жидкого раствора или дисперсии, содержащей i) жидкий носитель; ii) пектиновое вещество со степенью метилирования менее 30% и средней молекулярной массой более 4,6105 Да в количестве, достаточном для образования геля из жидкого раствора или дисперсии при введении в ткани или жидкости организма животного; иiii) один или несколько физиологически активных агентов;b) введение жидкого раствора или дисперсии в ткани или жидкости организма животного с образованием геля, содержащего физиологически активный агент, при контактировании с тканями. В некоторых вариантах осуществления вышеописанных способов введения жидких композиций пектиновое вещество может быть пектином алоэ, полезные характеристики которого были описаны выше. В родственных вариантах осуществления вышеописанных способов введения жидких композиций физиологически активный агент является биологическим агентом, таким как пептид, белок, антиген, вакцина, живая клетка, цельная или неполная мертвая клетка, цельный или неполный вирус. В родственных вариантах осуществления изобретения ткань или жидкость организма может быть слизистой оболочкой,в том числе слизистой оболочкой носа. В вышеописанных способах введения жидких композиций указанные композиции могут быть модифицированы определенными агентами с целью улучшения их характеристик хранения. Как будет далее описано в примере 25 и в настоящем описании изобретения, к жидкой композиции могут быть добавлены соли одновалентных катионов, такие как хлорид натрия и/или хлорид аммония, или буферы, такие как фосфатные буферы, для сообщения раствору физиологического значения рН и ионной силы. Кроме того, такие растворы приобретают некоторые улучшенные свойства, если сначала их выдерживают в условиях хранения и затем вводят физиологически активные агенты. При добавлении NaCl и NH4Cl в соответствующих концентрациях к жидким растворам, содержащим пектины и активные агенты, указанные растворы могут обратимо образовывать гель вследствие охлаждения во время хранения (при температуре около 4 С). Образовавшийся гель может стабилизировать и защищать чувствительные биологические активные агенты от осаждения и/или разложения. Когда указанную композицию возвращают после хранения для введения животному или человеку, гель растворяется, превращаясь в прозрачный раствор без осадка, пригодный для инъецирования в слизистые оболочки и подобные ткани. Кроме того, к жидким растворам могут быть добавлены небольшие количества солей двухвалентных катионов без образования геля, как это описано в примере 24, причем преимуществом такого добавления является усиление гелеобразования in situ при введении модифицированного раствора в ткань или жидкость организма. Жидкие растворы могут дополнительно включать другие загустители и/или наполнители, рассмотренные в настоящем описании изобретения. Введение вакцин в нос представляет особый интерес благодаря многим преимуществам такого введения. Введение в нос обычно позволяет избежать дискомфорта и затрат, связанных с инъекциями, а также разрушительного воздействия кислот и ферментов пищеварительного тракта на чувствительные антигены. Кроме того, известно, что в организме отдельно существуют системная и слизистая иммунные системы, и что слизистая иммунная система имеет очень важное значение для защиты от негативного- 15010351 воздействия многих инфекционных болезней. Во многих случаях введение антигенов в нос может стимулировать иммунные реакции как в системной, так и в слизистой иммунных системах. Тем не менее,введение вакцин в нос может быть затруднено, так как хорошо известно, что слизистая оболочка носа быстро обновляется и удаляет чужеродные агенты в течение очень коротких периодов времени. Поэтому многие предшествующие попытки введения вакцин в нос не достигали поставленной цели вследствие быстрого удаления компонентов вакцины из слизистой оболочки носа из-за недостаточного времени контактирования, необходимого для эффективной индукции требуемой иммунной реакции у животного,особенно при использовании высокомолекулярных и высокополярных антигенов, таких как белки. Настоящее изобретение относится к композициям и способам введения указанных композиций, которые позволяют преодолеть проблемы, возникавшие ранее в данной области, благодаря созданию композиций, образующих гели in situ, содержащие антигены, которые сцепляются со слизистой оболочкой носа и увеличивают время пребывания антигенных компонентов вакцины в носу. См. пример 26 и фиг. 10. Как показано в примере 22 и на фиг. 8, достигаемым результатом является улучшенная и более сильная индукция активной иммунной реакции у животного. Во многих вариантах осуществления изобретения после введения вакцины и/или антигенов в слизистую оболочку носа животного иммунная реакция животного может увеличиться более чем примерно на 10% при измерении уровней IgA в промывных водах легкого животного по сравнению с уровнямиIgA, полученными в контрольном эксперименте по введению контрольной композиции, не содержащей полисахарид. Иммунная реакция животного предпочтительно увеличивается более чем примерно на 25,50, 75, 100, 150 или 200% при измерении уровней IgA в промывных водах легкого животного по сравнению с уровнями IgA, полученными в контрольном эксперименте по введению контрольной композиции,не содержащей полисахарид. Следует отметить, что одним уникальным преимуществом порошкообразного препарата, содержащего гелеобразующие ионные полимеры, является способность указанного порошкообразного препарата смешиваться с сухим гель-индуцирующим агентом и гарантированно образовывать гель после введения. Таким образом, к порошкообразному препарату можно добавлять гель-индуцирующий агент, полученный в виде сухого порошка. Поскольку индуцирующий агент находится в сухом состоянии, не происходит образования геля до введения или гидратации. После введения гель-индуцирующий агент растворяется и облегчает гелеобразование порошкообразных частиц препарата в результате взаимодействия с гелеобразующим ионным полимером. Для таких полимеров, как пектины, альгинаты и полифосфазен, в качестве гель-индуцирующего агента можно использовать двухвалентные (2+), трехвалентные (3+) и другие многовалентные ионы металлов. Примеры указанных ионов включают кальций, цинк, магний, железо и алюминий. Указанные агенты могут быть получены в виде порошка без примесей или в присутствии наполнителя. Плотность и размер порошкообразных частиц индуцирующего агента можно отрегулировать с возможностью однородного смешивания с порошкообразным активным агентом. Наполнители и адъюванты Дополнительно могут быть использованы другие группы фармацевтически приемлемых наполнителей, включающих связующие вещества, наполнители, лубриканты, флаворанты и вещества, маскирующие вкус. Связующие вещества используют для получения свободнотекущих порошков; наполнители используют для увеличения массы порошка; смазывающие вещества используют для увеличения текучести порошка; вещества, маскирующие вкус, используют для ослабления неприятного вкуса лекарственного средства. Одним предпочтительным классом фармацевтически приемлемых наполнителей являются фармацевтически приемлемые моно- или дисахариды или их смеси, а также их алкилированные, гидроксиалкилированные или ацилированные производные. Такие моно- или дисахариды обычно являются нетоксичными и/или классифицируются как "безопасные", легко растворяются в воде или биологических жидкостях и являются дешевыми. Примеры таких фармацевтически приемлемых моно- или дисахаридов включают рибозу, арабинозу, ксилозу, фруктозу, глюкозу, рамнозу, глюкозамин, галактозамин, глюконовую кислоту, глюкуроновую кислоту, галактозу, маннозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, ксилит, маннит и трегалозу. Предпочтительная подгруппа фармацевтически приемлемых моно- или дисахаридов включает фруктозу, глюкозу, галактозу, маннозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, маннит и трегалозу. Предпочтительным наполнителем является лактоза, особенно в форме моногидрата. Фармацевтически приемлемые моно- или дисахариды могут присутствовать в любой концентрации,но в некоторых вариантах осуществления изобретения они присутствуют в относительно высоких концентрациях, то есть от около 10,0 до около 99,9 мас.% композиций, предпочтительно от около 30 до около 99,5 мас.%, от около 50 до около 99,5 мас.% или от около 80 до около 99,5 мас.%. Когда моно- или дисахариды присутствуют в твердых композициях в относительно высоких концентрациях, полученные порошкообразные частицы могут частично растворяться или распадаться при контактировании с выделениями слизистой оболочки до гелеобразования композиции. Моно- и дисахариды быстро растворяются или абсорбируются, оставляя концентрированный, вязкий и биоадгезивный гелевый остаток активных агентов и/или пектинов или других анионных полисахаридов, хорошо диспергированный и сцепленный с- 16010351 биологической поверхностью, такой как слизистая оболочка. Вышеописанные применения моно- или дисахаридов в качестве наполнителей в композициях по настоящему изобретению могут быть особенно полезными при получении порошкообразных препаратов,состоящих из микрочастиц/микросфер и предназначенных для введения в нос антигенов, используемых для приготовления вакцины, и других биологических активных агентов, вводимых в низких концентрациях. Присутствие моно- или дисахаридов в качестве наполнителей, разбавителей и/или увеличивающих объем агентов позволяет получить частицы относительно большого размера в диапазоне 10-250 мкм, в котором, как известно, происходит осаждение большинства частиц на слизистой оболочке носа при введении композиции путем инсуффляции и подобными методами, причем в течение короткого периода времени моно- или дисахариды растворяются и/или абсорбируются, оставляя концентрированный, вязкий и биоадгезивный гелевый остаток in situ, содержащий физиологически активный агент, хорошо диспергированный и/или сцепленный со слизистой оболочкой носа. Фармацевтически приемлемые моно- или дисахариды являются особенно предпочтительными наполнителями в твердых препаратах, в которых они могут образовывать хорошо растворимые в воде растворители и/или стабилизаторы для фармакологически активных агентов, особенно для биофармацевтических агентов, таких как пептиды, белки, антигены и т.д., которые обычно являются неустойчивыми и вводятся в низких концентрациях. Композиции по настоящему изобретению могут также содержать один или несколько дополнительных фармацевтически приемлемых адъювантов, промоторов абсорбции или их смесей. Адъюванты являются добавками, которые вводят в композицию для улучшения эффективности или активности главного фармакологически активного агента. Что касается вакцинных композиций, то адъюванты улучшают иммунную реакцию, возникающую у субъекта на антигены, используемые для приготовления вакцины. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцинные композиции по настоящему изобретению содержат один или несколько адъювантов, выбираемых из группы, включающей липополисахарид, термолабильный энтеротоксин E.coli (LT), холерный энтеротоксин (CT), монофосфориллипид A (MPL), сапонин, цистозинфосфат-гуанозин (CpG), цитокины или их производные, соли алюминия, фосфат кальция, карбонат кальция или их смеси. При введении фармакологически активных агентов в слизистые оболочки и особенно в слизистую оболочку носа использование одного или нескольких промоторов абсорбции может усиливать абсорбцию активных агентов слизистой оболочкой, клеточными мембранами или межклеточными сочленениями. Приемлемые промоторы абсорбции, используемые в композициях по настоящему изобретению для введения в слизистую оболочку, могут включать поверхностно-активные вещества, миколитические агенты, ингибиторы ферментов, разрушающих белок или нуклеиновую кислоту, хелатирующие агенты(такие как EGTA, EDTA), ацилглицерины, жирные кислоты и соли, тилоксапол, салицилаты, соли желчной кислоты, их аналоги, гибриды или смеси. Пектин алоэ Пектины алоэ, выделяемые из растения Aloe vera, были недавно описаны в патенте США 5929051, который полностью включен в данное описание изобретения в качестве ссылки. Пектины алоэ являются природными LM пектинами, образующими гель под воздействием кальция. Кроме того, пектины алоэ могут обладать несколькими уникальными химическими свойствами, относящимися, в частности, к гелеобразованию, которые включают высокую молекулярную массу (1106 Да) , высокое содержанием Gal А (75, 80, 85 и во многих случаях 90%) и низким значением DM (10%). Значение DM менее 10% делает пектин алоэ почти пектиновой кислотой, но со значительно более высокой молекулярной массой, чем у других коммерчески доступных пектинов и пектиновых кислот с низким значениемDM, как это показано в примере 27, табл. 8. Пектины алоэ имеют также значительно более высокое процентное содержание карбоксилатных групп в полимере по сравнению с другими пектинами благодаря высокому содержанию Gal А. Кроме того, пектины алоэ обычно характеризуются высокой степенью разветвления полисахаридной цепи и необычно гибким полимерным остовом благодаря высокому содержанию рамнозы, которое может быть 3% или более 4% по сравнению примерно с 2% в других пектинах. Пектин с таким низким значением DM, высокой молекулярной массой и высоким содержанием Gal А и рамнозы не был описан до патента США 5929051. Пектин алоэ, который недавно стал коммерчески доступен в чистом виде, пригодном для фармацевтических применений, представляет собой не совсем белый порошок, полностью растворимый в воде в виде готового коммерческого продукта, в то время как ранее коммерчески доступные и/или экспериментальные LM пектины являются желтыми или желтоватокоричневыми порошками, содержащими значительное количество нерастворимых веществ и, таким образом, нежелательными для фармацевтических применений. Листья алоэ вера состоят из двух частей: наружной зеленой кожицы и прозрачного внутреннего геля, который именуется также мякотью. Пектин алоэ экстрагируют из внутреннего геля или клетчатки наружной кожицы. Установлено, что использование хелатирующего агента при небольшом щелочном значении рН является наиболее эффективным методом экстракции. Пектин алоэ обладает уникальными свойствами по сравнению с ранее описанными пектинами. Указанный пектин характеризуется высоким содержанием рамнозы 4% в очищенном пектиновом препарате, которое по крайней мере в 2 раза выше- 17010351 обнаруженного в других пектинах, таких как цитрусовые, яблоки, сахарная свекла и подсолнечник. Рамноза является основным сахаром в остове пектина, содержание которого влияет на гибкость молекулы. Кроме того, пектин алоэ содержит редкий сахар, 3-ОМе-рамнозу, который не обнаружен в других пектинах. Пектин алоэ является природным LM пектином, имеющим значение DM 30%, которое может достигать 10%. Содержание Gal А в пектине алоэ составляет 70% и может достигать 90%. Пектин алоэ может образовывать гель в присутствии кальция. Одновалентный катион, такой как натрий, калий и литий, ускоряет образование геля. Пектин алоэ можно отличить от других пектинов по одному или нескольким нижеследующим признакам: 1. Высокая молекулярная масса (1106 Да) и высокая характеристическая вязкость (550 мл/г); 2. Высокое содержание рамнозы (4%); 3. Высокое содержание галактуроновой кислоты (90%); 4. Содержание 3-ОМе-рамнозы; 5. Природный LM пектин со значением DM 10%; 6. Способность образовывать гель в присутствии кальция; 7. Способность образовывать гель в присутствии одновалентного катиона при низкой температуре(4C). Авторы настоящего изобретения установили, что при инъецировании или местном нанесении на поверхность раны нежелатинированный жидкий пектин может образовывать гель in situ в месте введения. Гель in situ является плотным и нетекучим подобно кальциевому гелю, образуемому in vitro, который отличается от гидрогеля, представляющего собой вязкий, но все же текучий раствор. Было обнаружено, что гелеобразование пектина алоэ in situ является особенно эффективным, так как для образования плотного твердого геля in situ необходима низкая концентрация пектина алоэ, равная 2,5 мг/мл или 0,25% (мac./об.), которая может быть еще ниже при добавлении загустителя. Кроме того, способность гелеобразования в присутствии одновалентного катиона может быть успешно использована для получения композиций, содержащих чувствительные биологические молекулы и хлорид натрия и/или аммония при физиологическом значении рН и ионной силе, которые образуют обратимый гель при охлаждении, что позволяет получить гель, способный стабилизировать чувствительные биологические агенты. Полученные таким образом гели вновь растворяются при комнатной температуре с образованием прозрачной жидкой фармацевтической композиции без осадка, как это описано в примере 25. Восстановленный раствор можно вводить в ткани или жидкости организма разными способами с образованием геля in situ. Могут быть получены изотонические или изоосмотические гелевые композиции, в которых показатель рН может быть отрегулирован в соответствии с рН жидкостей организма млекопитающего, таких как слезная жидкость. Показатель рН и осмотическое давление таких жидкостей организма равны, соответственно, 7,4 и 29 мОсм/кг. Фармакологически активное лекарственное средство желательно вводить в область тела млекопитающего, требующую фармакологического лечения, при таком значении рН и осмотическом давлении, которые, например, соответствуют показателям жидкостей организма. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению необязательно могут быть получены в стерильных условиях. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно предположить, что гелеобразование пектина in situ опосредовано главным образом ионами кальция в жидкостях организма. Концентрация кальция в крови равна 8,5-10,3 мэкв./дл. Гелеобразование пектинов под воздействием кальция усиливается в присутствии NaCl, который также является обычным компонентом жидкостей организма. СодержаниеNaCl в крови равно 134 мэкв./л. Гель образуется in situ также в присутствии разных агентов, включающих низкомолекулярные органические соединения, белки, нуклеиновую кислоту, живые клетки и другие полимеры, при подкожном введении, что свидетельствует о способности пектина доставлять целый ряд агентов в инкапсулированной или захваченной форме. Гель образуется in situ также при введении в композицию плохо растворимого соединения, такого как сильваден. Будучи доставленным к месту действия гель пектина in situ замедляет высвобождение активного агента. Данное явление было продемонстрировано в условиях in vitro и in vivo с использованием имитирующего низкомолекулярного органического соединения (быстрый зеленый). Кроме того, при доставке к месту действия основного фактора роста фибробластов (bFGF) вместе с гелем пектина in situ наблюдается значительное увеличение пролиферации клеток вокруг геля. Пектин алоэ является более эффективным, чем производимые в настоящее время коммерчески доступные пектины, включающие LM пектины, полигалактуроновую кислоту и амидированные LM пектины, используемые для гелеобразования in situ. Хороший гель был получен in situ только при использовании коммерчески доступной полигалактуроновой кислоты или LM пектина в концентрации, которая в 10 раз превышала концентрацию пектина алоэ. Коммерчески доступные в настоящее время LM пектины и полигалактуроновые кислоты характеризуются более низким содержанием Gal А (75%), гораздо меньшей молекулярной массой (7-14104 Да) и значением DM, равным 15-50%. Существуют другие полиме- 18010351 ры, способные образовывать кальциевый гель. Одним примером такого полимера является альгинат. Однако ранее не предполагалось, что альгинат может образовывать качественный гель in situ в испытанных концентрациях. Альгинат является полисахаридным блоксополимером, содержащим гулуроновую кислоту (G) и мануроновую кислоту (M) (Мое et al., In Food polysaccharides and their applications, pp. 287339. Marcel Dekker, Inc. New York, 1995). Два вышеуказанных остатка присутствуют в альгинатах в видеG-блока, М-блока или чередующегося MG-блока. Только G-блок имеет отношение к гелеобразованию под действием кальция. Общее содержание G изменяется в широких пределах в зависимости от источников получения, причем наибольшее содержание G равно 70%. Кроме того, гелеобразование альгината под действием кальция подавляется в присутствии NaCl, находящегося в физиологических жидкостях. Установлено, что несколько других полимеров способны образовывать гель in situ. Однако большинство таких полимеров необходимо использовать в высокой концентрации для образования геля insitu (20%) (Poloxamer, диблоксополимер PEO-PLLA, триблоксополимер PEG-PLGA-PEG, целлюлозаацетофталатный латекс). Некоторые из указанных полимеров не подвержены биологическому разрушению, в частности Poloxamer, или требуют изменения температуры до введения (диблоксополимер PEOPLLA) или во время образования (Pluronics и Gelrite). Недостатком термогелеобразующих полимеров(Poloxamer, диблоксополимер PEO-PLLA, триблоксополимер PEG-PLGA-PEG и Matrigel) является также гелеобразование до введения вследствие изменения окружающей температуры во время упаковки или хранения. Кроме того, многие из указанных полимеров образуют только гидрогель, вязкий, но все же текучий раствор (например, Poloxamer и Pluronics). Кроме того, некоторые полимерные составы требуют двух разных полимеров или введения второго компонента для индукции гелеобразования. Пектин, в частности пектин алоэ, является более перспективным по сравнению с указанными полимерами или композициями в том отношении, что концентрация полимера, необходимая для гелеобразования in situ, является очень низкой (0,25%, мас./об.) и может быть еще ниже при добавлении загустителя. Указанный препарат не требует изменения температуры или значения рН либо применения второго компонента для индукции гелеобразования in situ. Получаемый гель является прозрачным, при этом отсутствует значительное помутнение геля при превышении определенных концентраций, как это имеет место в случае триблоксополимера PEG-PLGA-PEG и Pluronics. Благодаря достижениям биотехнологии получают все больше и больше терапевтических средств на белковой основе. Белкам свойственна неустойчивость. Получение препаратов и их доставка имеют важное значение для выполнения требуемых функций in vivo (Langer, Nature, 392, 5-10, 1998; Putney andBurke, Nature Biotechnology, 16, 153-157, 1998). Гель пектина in situ особенно пригоден для доставки белка благодаря мягким условиям гелеобразования. Многие белковые агенты предназначены также для местного применения с пролонгированным действием, например факторы роста для заживления ран и ангиогенные факторы для лечения ангиогенеза. Указанные цели могут быть также достигнуты при помощи геля пектина in situ. При введении bFGF с помощью геля пектина алоэ in situ наблюдается значительно более зысокая пролиферация клеток вокруг геля. С учетом массы конечной композиции или препарата содержание физиологически активного агента может изменяться от около 0,01% до более 90%. Количество используемого физиологически активного агента зависит от типа, формы и природы физиологически активного агента. Диапазон содержания пектинового вещества может изменяться от около 0,01% до около 40% из расчета общей массы композиции, предпочтительно от около 0,1% до около 20% и более предпочтительно от около 0,25% до около 2%. Количество используемого пектинового вещества зависит от типа, формы и природы физиологически активного агента. Необязательно можно использовать носитель или наполнитель. Носитель, используемый в данном изобретении, включает любой фармацевтически приемлемый носитель, такой как вода, физиологический раствор, забуференный водный раствор, эмульсия, в частности эмульсия масла в воде, адъювант, смачивающее вещество, таблетка и капсула. С учетом массы конечной композиции или препарата количество носителя может изменяться от около 0% до около 90%. Количество присутствующего носителя зависит от физиологически активного агента и способа введения указанного препарата или композиции. Типичные буферы включают карбонат, хлорид, сульфат, фосфат, бикарбонат, цитрат, борат, ацетат и сукцинат щелочных и щелочноземельных металлов и/или хлорид аммония. Типичные консерванты включают бисульфит натрия, тиосульфат натрия, аскорбат, хлорид бензалкония, хлорбутанол, тимеросал, фенилртутьборат, парабен, бензиловый спирт и фенилэтанол. Таким образом, один вариант осуществления настоящего изобретения относится к композиции для пролонгированной доставки физиологически активного соединения, которая содержит пектин и физиологически активное соединение с фармацевтически приемлемым загустителем или без него. Указанная композиция предпочтительно превращается из жидкости в гель при введении данной композиции в организм животного, обеспечивая пролонгированное или регулируемое высвобождение физиологически активного соединения. В препарат может быть добавлен биологически разрушаемый загуститель, такой как поливинилпирролидон ("PVP"), карбоксиметилцеллюлоза ("CMC"), гидроксиэтилцеллюлоза ("HPMC"), альгинат- 19010351 натрия, коллаген, желатин и гиалуроновая кислота. Добавление такого загустителя не влияет на эффективность гелеобразования, как будет описано ниже, но при этом усиливает плотность гелевой матрицы и образование геля in situ при более низких концентрациях пектина. Кроме того, могут быть также использованы полимеры, изменяющие значение рН, ионную силу и температуру, если их действие является синергичным с гелеобразованием пектина. Смесь разных пектинов можно использовать с загустителем или без него. Другие загустители включают Carbopol, Gelrite, хитозан и ксилоглюкан. С учетом массы конечной композиции или препарата количество загустителя может изменяться от около 0% до около 90%. Количество используемого биологически разрушаемого загустителя зависит от физиологически активного агента и способа применения данной композиции или препарата. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к композиции, содержащей пектин с фармацевтически приемлемым загустителем или без него и предназначенной для использования в качестве медицинского устройства. Пектиновое вещество предпочтительно взаимодействует с кальцием в соответствии с механизмом,при котором карбоксилатные замещающие группы мономерных субзвеньев галактуроновой кислоты пектина взаимодействуют с ионами кальция с образованием координационных связей, в результате чего образуются поперечно сшитые кальциевые гели. Образование таких кальций-реактивных гелей можно определить разными спектроскопическими и/или мокрыми химическими методами, которые включают взаимодействие поперечно сшитых гелей с хелататирующими агентами кальция, такими как этилендиаминтетрауксусная кислота и ее соли ("EDTA"), которые могут быть использованы для удаления из геля кальция координационных связей, что вызывает растворение геля. Более предпочтительно пектиновое вещество является LM пектином или полигалактуроновой кислотой. Еще предпочтительнее пектиновое вещество является пектином алоэ. Композиции для гелеобразования пектина in situ, содержащие терапевтические или диагностические агенты, можно вводить или доставлять в организм животного разными способами. Например, такую композицию можно вводить местно в глаза, слизистые оболочки или раны. Указанную композицию можно также вводить парентерально, например при помощи подкожной, внутримышечной или внутрибрюшинной инъекции. Данную композицию можно также инъецировать в орган, суставную капсулу или опухоль. Пектин может быть экстрагирован из многих разных растительных источников. Помимо цитрусовых и яблок, пектин, например, может быть получен из картофеля, грейпфрутов, сахарной свеклы и подсолнечника. Пектин может быть модифицирован. Например, в результате обработки аммиаком получают амидированный пектин. Пектин, подобный пектину алоэ, несомненно, может присутствовать в других видах растений, либо пектин из других растительных источников может быть подвергнут переработке и/или модификации с целью усиления способности гелеобразования in situ на основании принципов, изложенных в данном описании изобретения. Несмотря на то что предпочтительным для настоящего изобретения является LM пектин со значением DM50%, благодаря его взаимодействию с кальцием, известно, что определенные HM пектины также чувствительны к воздействию кальция и способны образовывать кальциевый гель, поэтому они могут быть использованы для гелеобразования in situ (Tibbits et al.,Carbohydrate research, 310, 101-107, 1998). Кроме того, можно также использовать поблочно деэтерифицированный HM пектин, все еще имеющий значение DM 50%, но ставший чувствительным к воздействию кальция в результате поблочной деэтерификации. См. Christensen et al., патент США 6083540. Таким образом, специалистам в данной области должно быть понятно, что вышеописанные конкретные варианты осуществления изобретения можно использовать в качестве основы для модификации или создания других структур для достижений целей, преследуемых настоящим изобретением. Специалистам в данном области должно быть также понятно, что такие эквивалентные структуры не выходят за пределы объема и духа настоящего изобретения, описанного в прилагаемой формуле изобретения и/или примерах. Пример 1. Гелеобразование пектинов алоэ in situ. Экстракция пектина алоэ. Пектин алоэ экстрагировали из клетчатки, полученной из мякоти или кожицы листьев Aloe vera. B научной литературе описаны общие методы экстракции пектинов. См. публикации Voragen et al., In Foodpolysaccharides and their applications, pp. 287-339. Marcel Dekker, Inc. New York, 1995, а также патент США 5929051, которые полностью включены в данное описание изобретения в качестве ссылки. Пектин алоэ экстрагировали при помощи хелатирующего агента, такого как EDTA, или в других условиях,включающих использование горячей воды, горячей разбавленной кислоты (HCl, рН 1,5-3) и холодного разбавленного основания (NaOH и Na2CO3, рН 10). После первоначальной экстракции оставшиеся волокна удаляли путем фильтрации через фильтр грубой и тонкой очистки. Пектин осаждали этанолом. Осадок пектина промывали раствором этанола и сушили. Пектины алоэ, полученные вышеуказанным методом из клетчатки мякоти или кожицы, характеризовались молекулярной массой (1105 Да), низким значением DM (50%) и высоким содержанием Gal- 20010351 А (80%). Молекулярная масса предпочтительно была равна 1106 Да, значение DM было равно 10% и содержание Gal А составляло 90%. Молекулярную массу пектинов определяли при помощи вытеснительной хроматографии на основе ВЭЖХ с использованием пуллулана в качестве эталона. DM определяли методом избирательного восстановления (Maness et al., Analytical Biochemistry 185, 346-352, 1990) и методом на основе ВЭЖХ (Voragen et al., Food Hydrocolloids, 1, 65-70, 1986). Содержание Gal А определяли методом с использованием м-гидроксидифенила (Blumenkrantz, N.and Asboe-Hansen, G. Analytical Biochemistry, 54, 484-489, 1973). Все три публикации включены в данное описание изобретения в качестве ссылки. Гелеобразование растворов пектина алоэ in situ, вводимых путем инъекции in vivo. Пектин алоэ сначала растворяли в стерильной деионизированной воде и затем смешивали с равным объемом 2-кратного физиологического раствора (0,3M NaCl). Пектин алоэ плохо растворялся в солевом растворе. Тем не менее, пектин, растворенный в воде, можно было смешать с солевым раствором до достижения физиологической ионной силы. Раствор пектина, полученный в физиологическом растворе подобным образом, оставался прозрачным. Растворы пектина были свободнотекучими при комнатной температуре и имели значение рН 5,0-6,0 в зависимости от концентраций полимеров. Температуру или показатель рН не регулировали, за исключением особо оговоренных случаев. Полученный препарат инъецировали подкожно в нижнюю часть брюшной полости мышам Swiss Webster (0,05 или 0,1 мл в одно место) в соответствии с методами выполнения экспериментов с использованием животных. Мышей умерщвляли в разное время после инъекции и исследовали образование геля. Набухание кожи в месте инъекции не исчезало с течением времени, в отличие от контрольной инъекции физиологического раствора. При хирургическом надрезе кожи над местом инъекции был виден кусочек геля в виде шарика или овала. Гель был светлым, прозрачным и плотным. Гель можно было легко отделить от окружающих тканей. Гель вырезали хирургическим путем вместе с кожей, фиксировали в формалине, изготавливали срезы, окрашивали НЕ и исследовали под микроскопом. Слегка окрашенный гель был хорошо виден в окружении дермальных тканей. Аналогичное гелеобразование in situ наблюдалось также у крыс. Набухание в месте инъекции не было таким же заметным у крыс, как у мышей,из-за более толстой кожи и волосяного покрова. Однако после хирургического надреза кожи в месте инъекции был виден такой же гель in situ. Крысам можно было подкожно инъецировать один мл раствора пектина алоэ в нижнюю часть брюшной полости и соответственно получить гораздо большие кусочки геля. Образование геля зависит от концентрации пектина. При концентрации 0,25% (мас./об.) образовывался твердый плотный гель. Гель не образовывался при 0,1% (мас./об.). При концентрациях от 0,1% до 0,25% образовывался мягкий гель. Гель образовывался in situ также при доведении значения рН раствора пектина алоэ до 7,2 в результате добавления разбавленного гидроксида натрия. Способность гелеобразования in situ зависит от молекулярной массы пектина алоэ. При использовании пектина алоэ с гораздо меньшей молекулярной массой (3104 Да) , но с таким же значением DM и содержанием Gal А гелеобразование отсутствовало in situ при испытании 0,5% (мас./об.) препарата. Гель in situ образовывался также после внутрибрюшинной и внутримышеной инъекции, хотя при этом гель не был таким же однородным по форме, как после подкожной инъекции. Пример 2. Гелеобразование in situ после местного введения на поверхность раны. Препарат пектина алоэ (0,5%, мас./об.) в физиологическом растворе вводили непосредственно в свежие раны, полученные в результате иссечения кожи на всю толщу, у мышей или крыс. В качестве контрольных образцов использовали 0,5% (мас./об.) препарат CMC в физиологическом растворе и коммерчески доступные повязки на рану с гидрогелем. Раны были нанесены при помощи дерматома в соответствии с методами выполнения экспериментов с использованием животных. Через 4 ч крыс умерщвляли и раны удаляли хирургическим путем. Раны фиксировали в формалине, изготавливали срезы и окрашивали НЕ. На поверхности ран, обработанных препаратом пектина алоэ, был отчетливо виден слой геля, который отсутствовал на ранах с CMC или коммерчески доступными повязками на рану с гидрогелем. Пример 3. Гелеобразование пектина in situ, опосредуемое ионами кальция в жидкостях организма при изменении методом анализа фронтальной миграции геля. Жидкости организма, такие как кровь, слезная жидкость, легочная жидкость и выделения из носа,содержат ионы кальция (например, 8,5-10,3 мэкв./дл в крови). Так как пектин алое образует кальциевый гель, роль кальция в гелеобразовании пектина алоэ in situ исследовали при помощи анализа гелеобразования in vitro с использованием животной сыворотки, стимулирующей образование геля in situ. Вышеуказанный анализ in vitro известен как анализ фронтальной миграции геля. Животную сыворотку помещали в нижнюю часть стеклянной пробирки и поверх сыворотки вводили раствор пектина алоэ (раствор пектина можно также поместить в нижнюю часть пробирки в зависимости от плотности испытуемого раствора относительно раствора пектина). Использовали нормальную телячью сыворотку, соответст- 21010351 вующую культуре ткани. Два мл сыворотки помещали в нижнюю часть стеклянной пробирки (0,811 см) и сверху вводили 1 мл раствора пектина (0,5-0,75%, мас./об.). Образование геля начиналось непосредственно у линии контакта (поверхность раздела между растворами), после чего гелевая фаза или фронт геля постепенно перемещался вверх в раствор пектина. Гель, образовавшийся в верхней пектиновой фазе, можно отличить от раствора пектина по большей мутности при исследовании в источнике света. Кроме того, в случае образования геля при наклоне пробирки поверхность раздела не перемещается. Толщину геля, образовавшегося на поверхности раздела, можно измерить в зависимости от времени (такие измерения далее определяются как "длина геля"). Однако, если жидкость организма, такая как сыворотка, была сначала диализована против физиологического раствора или EDTA (хелатор для двухвалентных катионов) , для удаления из раствора свободного кальция или к сыворотке была добавлена EGTA (специфический хелатор для кальция) до конечной концентрации, равной 10 мМ, образование геля не наблюдалось. Полученные данные свидетельствуют о том, что ионы кальция, присутствующие в жидкостях организма, участвуют в гелеобразованиb пектинаin situ. Гелеобразование пектина происходило также при выполнении подобных экспериментов in vivo с использованием гепаринизированной цельной крови мыши или выделенной из нее плазмы. Пример 4. Гелеобразование пектина in situ с использованием других жидкостей организма. Помимо сыворотки или крови существует много других жидкостей организма, содержащих кальций, таких как слезная жидкость, легочная жидкость и выделения из носа. Для определения возможности гелеобразования пектина в экспериментах in vitro с использованием других жидкостей тела выполняли анализ фронтальной миграции геля, описанный в примере 3, с использованием пектина алоэ (0,25% в физиологическом растворе). Образование геля происходило при использовании натуральной перитонеальной жидкости. В данном эксперименте в качестве перитонеальной жидкости использовали асцитическую жидкость мышей, в которую инъецировали гибридому для продуцирования моноклональных антител. Образование геля происходило также при использовании нижеследующих имитированных жидкостей организма: 1. Слезная жидкость (0,68 г NaCl, 0,22 г NaHCO3, 0,008 г CaCl2.2H2O и 0,14 г KCl на 100 мл (см. публикацию Stjernschantz and Asitin, in Edman, P.(ed.), "Biopharmaceutics of Ocular Drug Delivery", CRC(см. публикацию Fisher and Briant, Radiation Protection Dosimetry, 53, 263-267, 1994); и 3. Выделения из носа (0,867 г NaCl, 0,44 г Na2HPO4, 0,108 г NaH2PO4, 0,058 г CaCl2.2H2O, 0,31 г KCl,0,636 г альбумина на 100 мл (см. публикацию Lorin et al., Journal of Laboratory Clinical Medicine, 2, 275267, 1994). Пример 5. Усиление гелеобразования пектина под действием кальция в присутствии NaCl. Такие жидкости организма, как кровь и слезная жидкость, также содержат ионы натрия (135-146 мэкв./л в крови). Установлено, что NaCl усиливает гелеобразование LM пектинов под действием кальция. Фармакологические препараты для местного или парентерального применения обычно получают в забуференном или незабуференном физиологическом растворе (0,15 М NaCl) или изотоническом растворе. Для определения возможности усиления растворами NaCl гелеобразования пектина алоэ выполняли анализ фронтальной миграции геля. Растворы пектина алоэ (0,5% мас./об.), полученные в 0,15 М раствореNaCl (2 мл), помещали в нижнюю часть пробирки и 100 мМ (0,05 мл) менее плотного раствора CaCl2 вводили поверх раствора пектина. Образовавшийся гель с течением времени перемещался вниз в раствор пектина. Миграцию фронта геля вниз в раствор пектина измеряли через определенные периоды времени после добавления CaCl2. Полученные результаты показали, что фронт геля мигрировал быстрее в присутствии NaCl, то есть гелеобразование пектина алоэ под действием кальция усиливалось в присутствииNaCl (см. фиг. 1). Влияние NaCl зависело также от концентрации кальция; скорость миграции геля была выше в 0,15 М растворе NaCl, чем в 0,05 М растворе NaCl. Указанные наблюдения совместимы с ранее полученными результатами при использовании другихLM пектинов (Garnier et al., Carbohydrate Research 240, 219-232, 1993; 256, 71-81, 1994). На фиг. 1 изображена столбчатая диаграмма, показывающая взаимосвязь NaCl с гелеобразованием пектина алоэ под действием кальция. Пример 6. Более быстрое гелеобразование пектина in situ при низких концентрациях пектина. Выполняли вышеописанный анализ фронтальной миграции геля. Пектин алоэ, находящийся в разных концентрациях в физиологическом растворе (1 мл), помещали на нормальную телячью сыворотку (2 мл). Указанную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 18 ч и затем измеряли длину образовавшегося геля (то есть толщину геля). Первоначальное гелеобразование на поверхности раздела происходило сразу же независимо от концентрации пектина. Однако скорость увеличения длины геля с- 22010351 течением времени отличалась при разных концентрациях пектина. Было установлено, что при более низкой концентрации пектина происходило более быстрое гелеобразование; длина геля, образовавшегося при концентрации 0,05% (мас./об.), была почти в 5 раз больше, чем при концентрации 0,5% (мас./об.)(см. фиг. 2). Гель, образовавшийся при низких концентрациях (0,2%, мас./об.), был гораздо мягче и мог быть разрушен при сильном перемешивании. Такие же результаты были получены, когда вместо сыворотки использовали раствор хлорида кальция. Полученные данные показывают, что скорость гелеобразования пектина под действием кальция выше при более низких концентрациях пектина. Пример 7. Усиление гелеобразования пектина in situ при добавлении других полимеров или загустителей. Выполняли вышеописанный анализ фронтальной миграции геля. С пектином алоэ (0,05%, мас./об.) смешивали такие полимеры, как гидроксиэтилцеллюлоза (НЕС, 0,45%, мас./об.), карбоксиметилцеллюлоза (CMC, 0,45%, мас./об.) или альгинат натрия (0,45%, мас./об.). Альгинат натрия, который был способен образовывать кальциевый гель с использованием растворов CaCl2 в условиях in vitro, не образовывал гель in situ с использованием сыворотки. При выполнении анализа фронтальной миграции геля один мл полимерных растворов помещали на 2 мл нормальной телячьей сыворотки. Длину образовавшихся гелей измеряли через 18 ч. Полученные результаты показали, что добавление других полимеров не влияло на скорость гелеобразования пектина in situ (см. фиг. 3 А и 3B). Аналогичный результат был также получен при смешивании полимера с пектином алоэ в другом соотношении (0,4% по сравнению с 0,1%). При выполнении эксперимента in vivo с использованием мышей аналогично примеру 1 смесь пектина алоэ (0,375%, мас./об.) и CMC (0,37 5%, мас./об.) в физиологическом растворе образовывала гель insitu после подкожной инъекции мыши. Кроме того, добавление загустителя (альгинат натрия или НЕС в количестве 0,4% или 0,3%, мас./об.) вызывало образование геля in situ лучшего качества при более низких концентрациях пектина алоэ (0,1% или 0,2%, мас./об.), в то время как при использовании только пектина алоэ гели были мягкими или вообще не образовывались in situ (пример 1). Пример 8. Сравнение с другими пектинами и альгинатами. В экспериментах по гелеобразованию in vivo использовали несколько полисахаридов, отличных от пектина алоэ, которые были способны образовывать гель под действием кальция. Другие полисахариды включали LM пектин из цитрусовых со степенью метилирования (DM) 28% и полигалактуроновую кислоту, полученную из яблочного пектина (DM=0), которые были предоставлены компанией SigmaChemical Co., и амидированный пектин с DM 28-34% и DA (степень амидирования) 16-22%. Перед использованием указанные пектины растворяли в деионизированной воде, фильтровали, осаждали этанолом и сушили. Эксперименты по гелеобразованию in situ в результате подкожного инъецирования мышам растворов других пектинов выполняли аналогично примеру 1. Каждый образец инъецировали двум мышам в четыре места. Полученные результаты показали, что после подкожной инъекции всех альтернативных полисахаридов, используемых в концентрации 1,0 или 1,65% (мас./об.), не происходило четко выраженного образования геля in situ, так как были обнаружены только размазанные гелеобразные вещества. Однако при испытании в более высокой концентрации (3,0 или 3,3%, мас./об.) хорошо сформировавшиеся гели были получены при использовании как полигалактуроновой кислоты, так и амидированного LM пектина. Аналогичным образом, низкомолекулярный пектин алоэ, описанный в примере 1, также образовывал гель in situ при использовании в высокой концентрации (2,5%, мас./об.). Кроме того, испытывали цитрусовый HM пектин с DM 64%. Указанный пектин был получен аналогично LM пектинам. Не наблюдалось образования геля при использовании HM пектина в концентрации 3% (мас./об.). Место инъекции было мокрым и водянистым, при этом отсутствовали кусочки твердого геля. Были испытаны также альгинаты, включающие Keltone HVCR и альгинат с высоким содержанием гулуроновой кислоты (G) Manugel DMB (содержание G 60-70%) в концентрации 0,5%. При исследовании через 4 часа после подкожной инъекции было получено размазанное гелеобразное вещество, из чего следует, что большая часть веществ диффундировала без образования геля. Альгинаты также не образовывали гель при использовании нормальной животной сыворотки при выполнении вышеописанного анализа гелеобразования in situ в условиях in vitro (пример 7). Обобщенные результаты позволили установить,что LM пектин, полигалактуроновая кислота, амидированный LM пектин и альгинат являются гораздо менее эффективными, чем пектин алоэ для гелеобразования in situ в аналогичных концентрациях. Пример 9. Доставка физиологически активных агентов при помощи геля пектина in situ. Для доставки лекарственного средства при помощи гелеобразования in situ указанное явление должно произойти в присутствии лекарственного средства или диагностических агентов. Поэтому разные соединения или агенты смешивали с пектином алоэ в физиологическом растворе с конечной концентрацией пектина 0,5% (мас./об.). Экспериментальные агенты включали низкомолекулярное органическое соединение (быстрый зеленый, внутренняя соль гидроксида N-этил-N-(4-[(4-этил[(3-сульфофенил)метил]аминофенил)-(4-гидрокси-2-сульфофенил)метилен]-2,5-циклогексадиен-1-илиден)-3-сульфобензол- 23010351 метанаммония, динатриевая соль, 808 Да, 10 мг/мл), низкомолекулярный белок (bFGF, 17 кДа, 10 мкг/мл), среднемолекулярный белок (бычий сывороточный альбумин, 66 кДа, 10 мг/мл), высокомолекулярный белок (бычий коллаген типа I, 2 мг/мл), нуклеиновую кислоту (лямбда-фрагменты Hind III ДНК,200 мкг/мл), углеводный полимер (CMC, 0,5%, мас./об.) и клетки Raw 264.7 (линия макрофагов мыши,1108/мл). Указанные смеси вводили мышам в виде подкожной инъекции. Образование геля исследовали через 4 ч после инъекции. Полученные результаты показали, что образование геля in situ происходило в присутствии всех агентов аналогично гелям, образовавшимся при использовании только пектина алоэ в качестве контрольных образцов. Кроме того, при помощи анализа фронтальной миграции геля было установлено, что гелеобразование 0,5% (мас./об.) раствора пектина алоэ in situ происходило также в присутствии 1) 0,1% (мас./об.) сильвадена (сульфадиазин серебра), плохо растворимого антибактериального средства, обычно используемого для лечения ран, 2) 0,5% (мас./об.) гидроксиэтилцеллюлозы (НЕС) и 3) 0,5% (маc./об.) альгината натрия (Keltone HVCR, Kelco). Присутствие 0,5% (мас./об.) НЕС или альгината натрия не влияло на эффективность гелеобразования in situ, описанного в примере 6. Таким образом, тот факт, что гелеобразование in situ происходит с использованием многих разных агентов, ясно показывает, что гель пектина in situ можно использовать для доставки целого спектра лекарственных средств. Пример 10. Медленное высвобождение низкомолекулярного органического соединения из гелей пектина in situ в условиях in vitro. Терапевтические и диагностические агенты имеют молекулярную массу, изменяющуюся в широких пределах, от 100 Да до более 10000 Да. Как правило, чем ниже молекулярная масса соединения, тем труднее добиться медленного высвобождения лекарственного средства. В данном примере в качестве испытуемого соединения было выбрано низкомолекулярное органическое соединение "быстрый зеленый", которое является красителем, широко используемым в пищевой и фармацевтической промышленности. Указанный краситель смешивали с пектином алоэ (0,5%, мас./об.) в физиологическом растворе при концентрации быстрого зеленого, равной 1 мг/мл. В качестве контрольного образца использовали раствор 1 мг/мл красителя в физиологическом растворе без пектина. Один мл препарата красителя/пектина или контрольного образца вводили в трубку для диализа (диаметром 1 см) , обеспечивающую отделение веществ с отсечкой 12 кДа. Затем трубки для диализа с образцами помещали в 25 мл нормальной телячьей сыворотки в 30-мл стеклянных пробирках. В одну пробирку с сывороткой, в которую вводили раствор красителя/пектина алоэ, также добавляли EDTA до конечной концентрации 10 мМ для предотвращения гелеобразования под действием кальция. Пробирки с сывороткой, содержащие образцы,затем непрерывно встряхивали со скоростью 100 оборотов/мин в ротационном шейкере. В разные периоды времени отбирали небольшие количества сыворотки (100 мкл). Количество красителя, выделившегося в сыворотку, определяли путем измерения оптической плотности (OD) при 620 нм. Образцы сыворотки с известными количествами быстрого зеленого, использовали для построения стандартной кривой. Полученные результаты показали, что из контрольного образца и препарата красителя/пектина алоэ сEDTA высвобождались одинаковые количества быстрого зеленого (без образования геля), при этом количество красителя, выделившегося из препарата красителя/пектина алоэ без EDTA (с образованием геля) было значительно меньше (р 0,05; t-критерий Стьюдента) в периоды времени выполнения измерения (см. фиг. 4). Полученные данные показывают, что присутствие пектина алоэ и его гелеобразование значительно замедляют высвобождение вещества, имитирующего низкомолекулярный фармацевтический агент. Пример 11. Медленное высвобождение низкомолекулярного органического соединения из гелей пектина in situ после подкожной инъекции. Для определения возможности вышеуказанного медленного высвобождения в условиях in vivo мышам подкожно инъецировали быстрый зеленый (1 мг/мл)/пектин алоэ (0,5%, мас./об.) в физиологическом растворе или только быстрый зеленый в физиологическом растворе. Места инъекций (по два на каждый образец) исследовали через 4 ч. Было установлено, что в присутствии пектина происходило образование гелей in situ, которые частично удерживали краситель, хотя цвет не был таким же интенсивным,как у первоначального препарата до инъекции. В отличие от этого в местах инъекций контрольного образца не был обнаружен гель и изменение окраски и, следовательно, отсутствовал краситель. Таким образом, гель пектина in situ удерживал краситель и действительно замедлял высвобождение в условиях invivo. Пример 12. Локальная доставка bFGF при помощи геля пектина алоэ in situ. Факторы роста, оказывающие локальное воздействие на ткани вокруг места введения, должны быть доставлены в матрице для обеспечения медленного или пролонгированного высвобождения лекарственного средства. Доставка только в физиологическом растворе или буфере является неэффективной. В данном примере был использован фактор роста (bFGF). bFGF (основной фактор роста фибробластов илиFGF-2) является фактором роста, который, как известно, стимулирует пролиферацию фибробластов и ангиогенез или образование кровеносных сосудов. Указанный фактор роста смешивали с пектином алоэ(0,5%, мас./об.) в физиологическом растворе при концентрации 1-10 мкг/мл и затем подкожно инъециро- 24010351 вали в нижнюю левую или правую сторону брюшной полости мышей. В одну сторону вводили контрольный образец (только пектин) и в другую сторону вводили bFGF-содержащий препарат. Гели, полученные у двух мышей in situ, удаляли вместе с кожей на 5-10 день, фиксировали в формалине, изготавливали срезы и окрашивали НЕ. Отбирали два идентичных участка у каждого конца геля, расположенные вертикально между поверхностью геля и мышечным слоем кожи и горизонтально на 510 мкм внутрь от бокового края геля, и клетки в указанных двух отобранных участках из каждого геля нумеровали при помощи программного обеспечения NIH. Полученные результаты показали, что число клеток в bFGFобработанном образце было более чем в 2 раза больше по сравнению с контрольным образцом (фиг. 5). Повышенное образование кровеносных сосудов вокруг геля также наблюдалось при высокой концентрации bFGF (10 мкг/мл). Полученные данные показывают, что bFGF высвобождался из геля in situ и оказывал требуемое действие в окружающих тканях. Пример 13. Гелеобразование сухой композиции пектина in situ. Смесь пектина алоэ и CMC (0,75 мас.% каждого вещества) и 1,5% CMC, полученные в воде, лиофилизировали отдельно на взвешивающих тарелках. Из сухих материалов вырезали круглые подушечки(диметром около 1 см и толщиной около 3 мм) и погружали в 10 мл нормальной телячьей сыворотки в чашке Петри. Подушечка из пектина алоэ/CMC образовывала прозрачный гель, который оставался неповрежденным в течение четырех дней до окончания экспериментов, в то же время подушечки, содержащие только CMC, растворялись или исчезали через несколько часов нахождения в аналогичных условиях. Таким образом, полученные результаты показывают, что пектин в сухой форме также может образовывать гель после погружения в жидкость организма. Пример 14. Применение геля пектина in situ для доставки лекарственного средства: способ получения препарата. Гель пектина in situ можно использовать для получения физиологически приемлемой композиции,содержащей терапевтический или диагностический агент и гелеобразующий полимер (пектин) в низкой концентрации, которая характеризуется значением рН и осмотическим давлением жидкостей организма и способна превращаться из жидкости в гель после введения. Способ получения жидкого препарата включает нижеследующие стадии. 1. Пектин растворяют в стерильной воде. 2. Получают забуференный или незабуференный физиологический раствор. 3. Оба раствора смешивают. 4. Физиологически активное соединение добавляют в препарат, полученный на стадии 3. Физиологически активный агент может быть альтернативно добавлен к любому раствору до смешивания. Помимо воды и забуференного или незабуференного физиологического раствора или водного раствора могут быть также использованы другие фармацевтически приемлемые носители, включая эмульсии, такие как эмульсия масла в воде, адъюванты, разные типы смачивающих веществ, таблетки и капсулы. Показатель рН препарата регулируют при помощи приемлемых буферов, таких как смесь борной кислоты - бората натрия, смесь фосфата натрия (одноосновного) - фосфата натрия (двухосновного) и трис-буфер с HCl. Осмотическое давление препарата доводят до значения, характерного для жидкостей организма, при помощи солей, таких как NaCl, KCl и MgCl2, и других агентов, регулирующих осмотическое давление, таких как сорбит, сахароза, глицерин и маннит. Может быть добавлен фармацевтически приемлемый загуститель. Загустителем может быть поливинилпирролидон ("PVP"), модифицированные целлюлозные полимеры, такие как карбоксиметилцеллюлоза ("CMC"), гидроксиметилцеллюлоза ("HPMC"), гидроксиэтилцеллюлоза ("НЕС"), альгинат, желатин,декстран, циклодекстрин или гиалуроновая кислота. Указанный препарат можно хранить при комнатной температуре или в охлажденном виде (4 С). Если препарат содержит 0,15 М NaCl, (натриевый) гель образуется при хранении при 4 С. До введения нуждающемуся субъекту гель выдерживают при комнатной температуре для превращения в раствор. Для лекарственных средств или терапевтических агентов, находящихся в форме частиц, которые могут образовывать агрегаты или характеризуются плохой растворимостью в воде, таких как сильваден (сульфадиазин серебра), может быть полезным хранение в гелевой матрице, так как гель может предотвращать агрегацию или образование осадка. Альтернативно данный препарат может быть получен в сухой форме. Смесь пектина и физиологически активного агента в воде или забуференном или незабуференном физиологическом растворе подвергают лиофилизации. Альтернативно порошок пектина и сухой физиологически активный агент смешивают и прессуют с приданием требуемой формы. Сухую форму можно использовать в виде подушечки, таблетки, капсулы или порошка. Относительные количества физиологически активного агента и пектинового вещества в препарате или композиции могут изменяться в широких пределах в зависимости от конкретного доставляемого агента. В жидком препарате содержание агента может изменяться от около 0,01% до около 50%(мас./об.), при этом содержание пектинового вещества может изменяться от около 0,01% до около 40%(мас./об.). В сухом или суспендированном препарате активный агент или пектиновое вещество может- 25010351 составлять более 90% (мас./мас.). Пример 15. Получение фармацевтических порошкообразных препаратов, содержащих сортированные анионные полисахариды, и их гелеобразующие свойства. Были получены порошкообразные препараты, содержащие имитированные активные агенты, разные анионные полисахариды, загустители и необязательные наполнители, указанные в нижеследующей табл. 2. Ниже перечислены ионные полимеры, использованные для получения препарата. Высокомолекулярный пектин алоэ (HMW AP), DM10%, Мм 1,0106 Да. Низкомолекулярный пектин алоэ LMW AP), DM10%, Мм=1,3105 Да. Полигалактуроновая кислота (поли-Gal А) компании Sigma, DM3%, MM=1, 7105 Да. Низкомолекулярный пектин (LM пектин), DM=26%, Sigma, Мм=2,0105 Да. Альгинат, средняя вязкость, Sigma Chemical Co. Молекулярную массу определяли при помощи вытеснительной хроматографии, используя пуллулан в качестве эталона, в соответствии со способом, описанным в примере 10 патента США 5929051. Вытеснительную хроматографию (SEC) выполняли в колонке TSK-Gel G5000 PWX (Toso Haas). Образцы получали в концентрации 0,3 мг/мл в воде с использованием 0,05% (мас./об.) азида натрия. В колонку инъецировали 50 мкл образца и элюировали при помощи 0,05% азида натрия со скоростью 1 мл/мин. Затем измеряли показатель преломления. В качестве эталонов использовали пуллуланы (4,04105,7,88105 и 1,66106 Да). Молекулярную массу высчитывали на основании прямой линейной регрессии эталонов. Коммерчески доступные в настоящее время пектины алоэ очищали, подвергали микрофильтрации и получали в соответствии со стандартами cGMP (современная практика качественного производства). Другие полисахариды, представленные в таблице, содержали значительное количество нерастворимых веществ и образовывали мутные растворы при растворении в воде. Все указанные полисахариды подвергали микрофильтрации для удаления нерастворимых веществ, осаждали спиртом и сушили перед применением. Бычий сывороточный альбумин (BSA) и лизоцим использовали в качестве фармацевтически активных агентов. BSA широко используют при исследовании разных фармацевтических препаратов в качестве агента, имитирующего, в частности, средства для доставки белка. Известно, что лизоцим является антибактериальным средством. Повидон (поливинилпирролидон, К 2 9-32) использовали в качестве загустителя и лактозу использовали в качестве наполнителя, причем оба вещества были предоставлены компанией Sigma Chemical Co. Для приготовления порошкообразных препаратов получали жидкую смесь всех ингредиентов, указанных в табл. 2, после чего раствор лиофилизировали с образованием лиофилизированного твердого вещества. В табл. 2 представлены составы как жидких растворов-предшественников, так и конечных порошков. Таблица 2 Величины в скобках означают процентное содержание каждого ингредиента в сухом виде в расчете на сухое вещество (мас./мас.). Лиофилизированные твердые вещества измельчали в смесителе Eberbach с микроконтейнером. Порошок просеивали через стерильное 100-мкм найлоновое мембранное сито, получая при этом порошок с размером частиц 100 мкм, и затем через стерильные найлоновые мембранные сита с разным размером пор (40, 70 и 100 мкм; клеточный фильтр, Becton Dickinson Labware), получая при этом порошки с разными размерами частиц (40, 40-70 и 70-100 мкм). Частицы размером 100 мкм еще раз просеивали через 200 мкм сито, в результате чего были получены частицы размером 100-200 мкм. Порошки просеивали в вакууме, используя стеклянный фильтродержатель, и собирали на 0,22-мкм мембране. Порошки хранили при комнатной температуре. Кроме того, были получены контрольные порошки, содержащие все компоненты, за исключением ионных полимеров. Два порошкообразных препарата, полученных с использованием высокомолекулярного пектина алоэ, указанного в табл. 2, из которых один образец содержал BSA и другой контрольный образец не- 26010351 содержал BSA, измельчали и просеивали до величины частиц 100 мкм. Содержание влаги в обоих образцах было определено равным 2-3% (мас./мас.) с помощью анализатора влаги при температуре сушки 120C. Пример 16. Гелеобразующие свойства порошкообразных препаратов. Для исследования гелеобразующих свойств порошкообразных препаратов, состав которых подробно указан в примере 15, порошки (10 мг, 100 мкм), состоящие из разных пектинов и альгината, суспендировали в 2 мл физиологических растворов. Физиологические растворы в одной серии образцов содержали 3 мМ хлорида кальция и в другой серии образцов не содержали хлорид кальция. В присутствии кальция порошкообразные частицы гидратировали, но оставались в форме частиц, при этом суспензия была мутной. Под микроскопом было видно, что порошкообразные частицы в растворе, содержащем кальций, превратились в частицы или кусочки светлого и прозрачного геля. В отличие от этого при отсутствии кальция частицы быстро растворялись в течение 10 мин, и суспензия превращалась в прозрачный раствор (за исключением порошка, полученного при использовании высокомолекулярного пектина алоэ, который плохо растворяется в обычном физиологическом растворе с NaCl, но при этом все равно не превращается в гель в физиологическом растворе; см. приведенное ниже описание). При добавлении хелатора кальция EDTA (10 мМ) к порошкам, суспендированным в вышеописанном солевом растворе кальция, частицы быстро растворялись в течение 10 мин. Аналогичные результаты были получены при суспендировании порошков, полученных с использованием пектинов или альгината, в нормальной телячьей сыворотке. То есть порошкообразные частицы оставались в форме твердых частиц при суспендировании в нормальной телячьей сыворотке, содержащей кальций. Но при добавлении EDTA большая часть частиц растворялась в течение 10 мин. Аналогичные результаты были также получены при использовании имитированных выделений из носа (0,867 гet al., Journal of Laboratory Clinical Medicine, 2, 275-267, 1994). Результаты выполненных экспериментов свидетельствуют о том, что порошкообразные частицы, суспендированные в растворах, содержащих свободные ионы кальция, образуют поперечно сшитый кальциевый гель, но при отсутствии кальция или в результате удаления кальция из геля при помощи хелатирующего агента гель не образуется или является нестойким, при этом частицы полисахарида растворяются. Как было указано выше, высокомолекулярный пектин алоэ растворяется в воде, но плохо или только частично растворяется в физиологическом растворе с NaCl или забуференном физиологическом растворе. Порошкообразные частицы высокомолекулярного пектина алоэ, выделенные из физиологических растворов с NaCl центрифугированием (500 г в течение 5 мин) и вторично суспендированные в воде, быстро растворялись в течение нескольких минут. Такое поведение отличается от поведения частиц, полученных из низкомолекулярных LM пектинов, полигалактуроновой кислоты, низкомолекулярного пектина алоэ или альгината, которые хорошо растворяются как в воде, так и в физиологических растворах сNaCl. Тем не менее частицы, выделенные из содержащего кальций физиологического раствора или раствора нормальной телячьей сыворотки, оставались в форме частиц при введении в воду, свидетельствуя о гелеобразовании разных порошкообразных частиц полисахарида в присутствии ионов кальция. Пример 17. Сравнение твердого и жидкого препарата в отношении образования геля и регулирование высвобождения лекарственного средства. Были получены жидкие препараты, содержащие водные растворы разных анионных полисахаридов и краситель "быстрый зеленый" (1 мг/мл). Быстрый зеленый использовали для имитации низкомолекулярного терапевтического агента. Анионные полисахаридные полимеры использовали в концентрациях,равных 0,5% для высокомолекулярного пектина алоэ, 1% для альгината и 2% для полигалактуроновой кислоты, низкомолекулярного пектина алоэ и LM пектина цитрусовых. Для получения твердых препаратов 20 микролитров водных растворов препаратов помещали на взвешивающую тарелку в виде капли,лиофилизировали и удаляли в виде сухого диска. Сухие диски препарата или 20 мкл жидких препаратов вводили в 3,5 мл нормальной телячьей сыворотки в 60-мм чашках Петри, добавляя или не добавляя 10 мМ EDTA. Диффузию красителя "быстрого зеленого", который имитировал высвобождение лекарственного средства, определяли, измеряя в течение определенного периода времени диаметр диффузионного пятна зеленого красителя вокруг первоначальных точек введения препаратов. В нормальной телячьей сыворотке без EDTA сухие диски препаратов сохраняли форму твердого диска и постепенно превращались в кусочки прозрачного и твердого геля. Через 24 ч после диффузии всего красителя гели, образовавшиеся из сухого препарата, становились светлыми и прозрачными. Гелеобразование сухого препарата было далее подтверждено путем вымачивания гелевых дисков в физиологическом растворе с 10 мМ EDTA, в котором диски быстро растворялись в течение 30 мин. В нормальной телячьей сыворотке, содержащей EDTA, сухие диски препарата также постепенно растворялись подобно любому диску или пленке. В отличие от этого, большинство жидких препаратов постепенно растворялись и/или диффундировали без образования четко выраженных кусочков геля, напоминающих исходную каплю, при этом образовался только тонкий слой кусочков геля, которые были обнаружены в результате осторожного встря- 27010351 хивания чашек Петри через 2 ч. Из вышеизложенного следует, что порошкообразные препараты образуют гель эффективнее жидкостей. Тем не менее, когда капли препаратов вводили в 50 мМ раствора CaCl2 через иглу размером 25 G, жидкие препараты не расплывались и образовывали шарики геля. Однако жидкие препараты, полученные с использованием высокомолекулярного пектина алоэ, не расплывались и образовывали маленький кусочек геля, размер которого был лишь немного больше размера исходной капли в сыворотке. Это подчеркивает высокую эффективность образования геля, характерную для высокомолекулярных пектинов алоэ. Сделанные наблюдения показывают, что эффективность гелеобразования сухого препарата in situ может быть выше, чем жидкого препарата. Диаметры диффузионного пятна быстрого зеленого вокруг препаратов, погруженных в нормальную телячью сыворотку с EDTA и без EDTA, измеряли в течение определенного периода времени при использовании сухих и жидких препаратов (см. фиг. 6). Установлено, что гелеобразование в твердых или жидких образцах без EDTA замедляет высвобождение красителя или лекарственного средства с учетом того, что гелеобразование является более эффективным в сухом препарате. Аналогичные результаты были получены для всех препаратов за исключением сухого препарата, содержащего высокомолекулярный пектин алоэ, в котором диффузия красителя была лишь немного быстрее в сыворотке с EDTA, чем в сыворотке без EDTA. Подобный результат может быть обусловлен тем, что высокомолекулярный пектин алоэ хуже растворяется или вообще не растворяется в физиологическом растворе, что является еще одним отличительным признаком высокомолекулярного пектина алоэ. Пример 18. Применение порошков, содержащих растворимые соли кальция, для индукции гелеобразования порошкообразных препаратов in situ на основе полисахарида/активного агента. Два порошкообразных препарата, содержащих белковый активный агент (BSA) и полисахарид, выбираемый из низкомолекулярного пектина алоэ или альгината (как показано в табл. 2, образцы 2 и 5),просеивали с образованием порошков с размером частиц менее 100 мкм. Порошок, содержащий кальций,был получен из жидкого препарата, включающего 2,5% (мас./об.) поливинилпирролидона, 10% (мас./об.) лактозы и 1% (мас./об.) хлорида кальция, который сушили, твердое вещество измельчали и просеивали до частиц порошка 40 мкм, в результате чего после сушки был получен гель-индуцирующий порошок с содержанием хлорида кальция 7,4%. Порошкообразные полисахариды и гель-индуцирующие порошки смешивали в массовом отношении 4:1, в результате чего конечное содержание хлорида кальция в порошкообразной смеси было равно 1,48% (мас./мас.). Порошкообразную смесь суспендировали в физиологическом растворе (5 мг в 1 мл). Все три несмешанных порошка (то есть пектин+белок, альгинат+белок и содержащий кальций гель-индуцирующий порошок) растворялись при раздельном суспендировании в физиологическом растворе с NaCl. Однако смеси содержащего кальций гель-индуцирующего порошка с порошками, включающими низкомолекулярный пектин алоэ+белок или альгинат+белок, не растворялись в физиологическом растворе с NaCl. Аналогичные результаты были получены при использовании лизоцима в качестве активного агента. Полученные результаты позволяют предположить, что порошок, содержащий кальций, индуцирует гелеобразование порошков полисахарида/белка при контактировании с физиологическим раствором, имитирующим жидкость организма. Пример 19. Применение порошков, содержащих плохо растворимые соли многовалентных катинов,для индукции гелеобразования порошкообразных препаратов in situ на основе полисахарида/активного агента. Гидроксид алюминия (Al(OH)3) плохо растворяется в воде, но утвержден в качестве фармацевтического адъюванта для использования в лекарственных средствах для человека. Суспензия гидроксида алюминия, приобретенная в компании Sigma Chemical Co., представляла собой беловатую, мутную, но однородную суспензию частиц. Раствор пектина алоэ (2 мг/мл в воде) образовывал гель при смешивании с суспензией нерастворимого гидроксила алминия, о чем свидетельствует образование видимых крупных агрегатов частиц гидроксида алюминия. Аналогичные результаты были получены при использовании других пектинов и альгината. Агрегаты были крупными и хорошо заметными при достижении требуемого соотношения полимер/гидроксид алюминия. Аналогичные результаты были также получены при использовании фосфата кальция (Sigma Chemical Co.), хотя образовавшиеся агрегаты не были такими же крупными, как при использовании гидроксида алюминия. Как гидроксид алюминия, так и фосфат кальция являются относительно нерастворимыми веществами (Merck Index, 13th ed.), но вышеуказанные плохо растворимые соли, по-видимому, ионизируются на поверхности в процессе гидратации, что делает возможным взаимодействие с пектином алоэ. Для дальнейшего исследования указанного явления порошки гидроксида алюминия и фосфата кальция суспендировали в воде или физиологическом растворе (10 мг/мл) и затем смешивали с раствором высокомолекулярного пектина алоэ в разных конечных концентрациях (2,5-0,0012 мг/мл). Происходило такое же гелеобразование, определяемое по образованию крупных агрегатов. Аналогичные результаты были получены при использовании альгината, LM пектина и полигалактуроновой кислоты, из чего следует, что можно использовать плохо растворимые соли двухвалентных или многовалентных катионов металлов в качестве гель-индуцирующего агента. В качестве примера порошкообразный препарат, полученный при использовании пектина алоэ(HMW) аналогично примеру 15, смешивали с порошкообразным гидроксидом алюминия в отношении 3:1. Смеси (10 мг) суспендировали в 2 мл физиологического раствора. Сразу же образовались крупные агрегаты. К суспензии добавляли толуидиновый синий для окрашивания частиц порошкообразного ионного полимера. Через 30 мин или больше маленькую каплю суспензии помещали на предметное стекло и исследовали под микроскопом. Агрегаты состояли из окрашенных в розовый цвет частиц порошкообразного препарата и частиц гидроксида алюминия сероватого цвета, что подтверждает образование агрегатов. В качестве второго примера порошкообразный препарат, полученный с использованием низкомолекулярного пектина алоэ, смешивали с порошкообразным гидроксидом алюминия в отношении 3:1 и порошкообразную смесь суспендировали в физиологическом растворе. Несмотря на образование агрегатов, под микроскопом было обнаружено мало окрашенных в розовый цвет частиц порошкообразного препарата, при этом агрегаты состояли в основном из частиц гидроксида алюминия. Полученные данные показывают, что частицы порошкообразного препарата растворились и нерастворимые соли не вызвали гелеобразования всех частиц препарата. Однако, когда порошкообразную смесь полисахаридного препарата/гидроксида алюминия суспендировали в физиологическом растворе, содержащем 3 мМ хлорида кальция, были обнаружены частицы полисахаридного препарата и образовавшиеся агрегаты, состоящие из частиц препарата и частиц гидроксида алюминия. Аналогичное образование агрегатов было также обнаружено при суспендировании данной смеси в нормальной телячьей сыворотке. Плохо растворимые соли ионов металлов с трудом проникают в частицы препарата, содержащего полисахарид, и поэтому не могут вызывать гелеобразования всех частиц или могут вызывать сшивание или гелеобразование полимера на поверхности частиц. Поскольку указанные частицы плохо растворяются или почти не растворяются, нерастворившиеся частицы, содержащие многовалентный катион, могут служить физическим носителем для геля или продолжительным источником сшивающих двухвалентных или многовалентных катионов. Кроме того, частицы порошкообразного препарата и плохо растворимые твердые гель-индуцирующие агенты могут вызывать образование гелеобразных агрегированных композиций. В зависимости от соотношений и относительных размеров частиц двух разных порошков в смеси размеры и другие характеристики образовавшихся агрегатов могут быть изменены и/или модулированы. При высоком или низком соотношении частицы агрегатов могут быть очень мелкими, причем частица одного типа может быть окружена частицами другого типа, при соотношении 1 частицы могут соединяться в виде сети, образуя большую сетку. Поэтому комплексы агрегатов с гелями, образовавшиеся в разных условиях, можно использовать для модулирования физических свойств, характеристик растворимости и времени высвобождения гелей, образовавшихся в месте введения in situ, таком как слизистая оболочка и/или полость носа. Пример 20. Пролонгированное высвобождение фармацевтически активного агента из порошкообразных препаратов. Влияние гелеобразующего порошкообразного препарата на высвобождение активного агента in situ оценивали, используя имитированные выделения из носа (SNF) в качестве среды высвобождения. Порошкообразные препараты были получены вышеописанным способом с использованием повидона и лактозы в разных количествах, но все препараты содержали одинаковое количество белка (BSA) (0,1% в расчете на сухую массу) (см. таблицу 3). Контрольные порошки содержали все компоненты за исключением ионного полимера (высокомолекулярный пектин алоэ). Таблица 3 На сухой основе Десять мг порошков суспендировали в 0,25 мл SNF. Через 30 мин раствор или супернатант отделяли от частиц или осадка центрифугированием, после чего белок в супернатанте и осадке анализировали при помощи гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и денситометрии. Процентное высвобождение белкового агента из каждого препарата определяли по нижеследующей формуле- [белок в супернатанте/(белок в супенатанте+белок в осадке)]100%. По результатам исследования было установлено, что произошло почти полное высвобождение белков из контрольных порошков (высвобож- 29010351 дение 90%), которые почти полностью растворились. В отличие от этого высвобождение белка из порошков, содержащих пектин алоэ, было значительно более медленным; только 55% (препарат 1) или 68%(препарат 2) активного агента было выделено из порошков, содержащих ионный полимер (фиг. 7). Аналогичные результаты были получены при использовании лизоцима в качестве активного агента. Кроме того, было установлено, что высвобождение белка происходило быстрее из препарата 2, чем из препарата 1. Препарат 2 содержал 2,5% PVP и 10% лактозы, в то время как препарат 1 содержал 15% PVP и не содержал лактозы (таблица 3). Полученные результаты показывают, что скорость высвобождения может быть далее отрегулирована с учетом количества и типа используемых наполнителей. Пример 21. Физические смеси порошков, содержащих фармакологически активные агенты, полисахариды, гель-индуцирующие композиции и другие наполнители. Порошкообразный препарат, представленный в табл. 2, получали без активного агента и просеивали до достижения частиц соответствующего размера. Порошок активного агента, полученный с фармацевтически приемлемым наполнителем или без него, затем смешивали с полимерным порошком. Композиция может также необязательно содержать одну или несколько твердых гель-индуцирующих композиций, рассмотренных в настоящем описании изобретения. Полученную смесь порошков затем вводили животному. Пример 22. Введение в нос животному порошкообразного вакцинного препарата, содержащего антиген. Порошкообразный вакцинный препарат, содержащий высокомолекулярный пектин алоэ и антиген мутанта дифтерийного токсина CRM (DT-CRM), получали путем растворения компонентов, указанных в табл. 4, в водном растворе и лиофилизации раствора с образованием порошка, измельчения и последующего просеивания порошка. Аналогичным образом были получены контрольные препараты, содержащие все ингредиенты за исключением антигена. Таблица 4 Вакцинные препараты были получены с возможностью доставки 7,75 мкг антигена на 10 мг порошкообразного препарата. Крыс массой 200-250 г анестезировали и в каждое носовое отверстие при помощи 200-мкл пипетки, присоединенной к 5-мл шприцу, вводили 10 мг порошка, пропуская 3 мл воздуха через резиновую трубку, ранее описанным способом (Ryden and Edman, Int. J. Pharm. 83 (1992), pp. 1-10;Schipper et al., Pharm. Res. 10 (1993), pp. 682-686). Через одну неделю после инокуляции у крыс брали пробы сыворотки и при помощи анализа ELISA(твердофазный иммуноферментный анализ) определяли содержание специфического сывороточного IgG(иммуноглобулин G). Конечную точку титра IgG определяли в виде обратной величины наибольшего разведения, оптическая плотность которого была на 50% выше фонового значения (оптическая плотность лунок, сенсибилизированных антигеном, без добавления сыворотки). У двух крыс, которым вводили порошок DT, образовались специфические антитела к антигену DTCRM, причем только через одну неделю средний титр IgG была равен 800. У двух контрольных крыс,которым вводили контрольный препарат без антигена DT-CRM, такие антитела не образовались (фиг. 8). Полученный результат показывает, что при введении в нос порошкообразный вакцинный препарат эффективно индуцирует специфическую иммунную реакцию у крыс. Пример 23. Парентеральная доставка порошкообразных препаратов животным. Как описано в примере 16, порошкообразные частицы сохраняют форму частиц или превращаются в частицы геля при суспендировании в содержащем кальций физиологическом растворе. Таким образом,указанные порошки могут быть инъецированы в виде суспензии частиц после суспендирования в физиологическом растворе, содержащем кальций, или в забуференном кальцием физиологическом растворе. Альтернативно порошкообразные препараты могут быть предварительно смешаны с порошкообразным кальцием в соответствии с описанием, приведенным в примере 17, при этом порошки суспендируют в физиологическом растворе или забуференном физиологическом растворе до инъецирования в ткани животного. Были использованы порошкообразные препараты, описанные в примере 16, с размером частиц 100 мкм, хотя в применениях, относящихся к инъекции суспендированных порошков, могут быть желательны частицы порошка меньшего размера. Каждый порошок (80 мг) суспендировали в 0,4 мл физиологического раствора, содержащего 3 мМ