Способ дифференциального анализа протеомов

010352 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности к геномике и протеомике, и обеспечивает универсальную технологию, позволяющую выявлять экспрессируемые гены, кодируемые ими транскрипты и белки, представленные в одном типе клеток организма, но отсутствующие в другом, или представленные по-разному в количественном отношении, в том числе в нормальных клетках и клетках, измененных вследствие различного рода наследственных и приобретенных патологий,включая опухолевую трансформацию, или в клетках одного типа, но при различных условиях. Созданные с помощью предлагаемой технологии диагностикумы могут быть использованы в медицине для быстрой полуколичественной оценки содержания дифференциальных белков в различных клетках, что позволит определять состояние больного, прогноз течения болезни и давать рекомендации в отношении способов лечения. Кроме того, продукты белковой и нуклеотидной природы, разработанные на ее основе, могут быть использованы в качестве терапевтических и профилактических лекарственных средств. Уровень техники Протеомика объединяет множество технологий. В целом, современное состояние протеомики характеризуется тем, что: (1) не существует единой технологии, которая удовлетворяла бы всем требованиям протеомики, (2) чем более протеомное исследование нацелено на понимание функций, тем дальше оно от совершенства и (3) до настоящего времени нет совершенной протеомной технологии [PattersonS.D., Aebersold R.H. Proteomics: the first decade and beyond. Nature Genetics. 2003, 33 Suppl.: 311-323]. Протеомный анализ начинается с анализа содержания индивидуальных белков в определенном типе клеток или тканей, их идентификации и количественной оценки. Этот анализ, пользуясь терминологией,аналогичной принятой в анализе транскриптомов, называют анализом белкового профиля (protein profileanalysis), и соответствующая область исследований определяется как экспрессионная протеомика[Takahashi N., Kaji H., et al. Proteomics: advanced technology for the analysis of cellular function. J. Nutr. 2003, 133: 2090S-2096S]. Используя экспрессионную протеомику, можно выявить характеристические особенности протеомов различного происхождения, в частности нормальных клеток и клеток, пораженных болезнью. Динамическая природа протеома сама по себе представляет большую проблему для исследований и требует использования множества стратегий, чтобы отразить разные аспекты этой динамики, в частности при переходе от нормального состояния к болезни [Hanash S. Disease proteomics. Nature. 2003, 422: 226232]. В отличие от исследований ДНК с ее технологиями, позволяющими размножать анализируемые последовательности, и с примерно одинаково представленными последовательностями различных генов при примерно 1000-кратном различии в содержании различных транскриптов, протеомике в классических вариантах приходится иметь дело с проблемами ограниченности материала, вариабельностью содержания различных белков в образцах, достигающей 106-1010, большим разнообразием посттрансляционных модификаций, которые меняются, в частности, в разных тканях или при превращении здоровой ткани в больную. Даже при использовании высокочувствительного масс-спектрометрического анализа неизбежна потеря информации о низко представленных белках. Среди последних, несомненно, содержатся важнейшие регуляторные молекулы. Например, содержание репрессоров в бактериальной клетке исчисляется единицами молекул на клетку. Ключевым моментом в большинстве подходов, используемых протеомикой, является стадия разделения белков, после которой индивидуальные компоненты смеси могут быть идентифицированы с помощью различных методов, включающих микросеквенирование, масс-спектрометрию и др. По-видимому, наиболее распространенным способом разделения белков до недавнего времени и в значительной степени сегодня является двумерный гель-электрофорез (2 Д-ГЭ) [Dove A. Proteomics: translating genomicsbeyond. Nature Genetics. 2003, 33 Suppl.: 311-323; Hanash S. Disease proteomics Nature. 2003, 422: 226-232]. В этом методе белки разделяют сначала в одном направлении по заряду и затем в другом по молекулярной массе. Белки из отдельных пятен, получаемых после разделения, могут быть далее выделены и идентифицированы масс-спектрометрически. Перед масс-спектрометрическим анализом пятна в геле расщепляют протеиназой, например трипсином. Экстрагированные пептиды анализируют с помощью,например, MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)-time-of-flight (TOF массспектрометра. Получают спектр пиков, характеризующих массы (точнее, отношение массы к заряду) пептидов. Наблюдаемый набор масс пептидов (фингерпринт масс) сопоставляют с помощью специальных компьютерных программ с базами данных белковых последовательностей [Takahashi N., Kaji H., etal. Proteomics: advanced technology for the analysis of cellular function. J. Nutr. 2003, 133: 2090S-2096S]. При сравнении двух протеомов их разделяют по отдельности в двух 2D-гелях и дифференциальные точки анализируют, как описано выше. Таким образом получают изменения, происходящие с протеомом при различных воздействиях. В частности, так можно сравнивать опухолевый и нормальный протеомы. Каждое состояние клетки может быть охарактеризовано, в принципе, своим протеомным портретом. Этот подход, в принципе, аналогичен определению профилей транскрипции генов на транскриптомном уровне, но, в силу гораздо меньшей разрешающей способности протеомных технологий, протеомный портрет гораздо менее детален.-1 010352 Общепризнано, что метод 2 Д-ГЭ далек от требований, которые определяют успешность решения задач протеомики. Помимо систематических ошибок, которые приводят к исключению из рассмотрения слишком маленьких и слишком больших или мембранных белков, метод 2 Д-ГЭ не в состоянии дать полный спектр белков в силу малой чувствительности систем детекции, частых совпадений позиций разных белков и плохой воспроизводимости [Dove A. Proteomics: translating genomics into products Nat. Biotechnol. 1999]. В последние годы этот метод был сильно усовершенствован (см. обзоры [Patterson S.D., Aebersoldproteomics Nature. 2003, 422: 226-232]) и включает, в частности, такие варианты, как: 1. использование иммобилизованного градиента рН (IPG), в котором градиент рН фиксирован в полиакриламидном геле. Это позволяет улучшить свойства системы; 2. использование дифференциального электрофореза (differential in-gel electrophoresis, DIGE), в котором два сравниваемых протеома метят различными красителями, смешивают и разделяют вместе в 2Dгеле. Эта технология гораздо более эффективна при сравнении протеомов, но страдает от тех же принципиальных недостатков, что и любая другая технология 2 Д-ГЭ - низкие чувствительность и разрешающая способность. Несмотря на прогресс в автоматизации операций с 2 Д-ГЭ, технологии, основанные на разделении в геле, недостаточны по скорости и эффективности идентификации белков с точки зрения темпов, требуемых от современной геномно-протеомной технологии. Поэтому появились многочисленные варианты жидкостной хроматографии, которые в сочетании с масс-спектрометрией значительно повысили эффективность и чувствительность анализа [Takahashi N., Kaji H., et al. Proteomics: advanced technology for thefirst decade and beyond. Nature Genetics. 2003, 33 Suppl.: 311-323] и обеспечили гораздо более высокий уровень автоматизации анализа белков. В настоящее время существует целый ряд вариантов схем протеомного анализа, которые базируются на жидкостно-хроматографических разделениях белков или пептидов. Несмотря на все эти достижения, важнейшей проблемой протеомики в ее классическом варианте,будь это 2 Д-ГЭ или жидкостная хроматография, остается колоссальный разброс в представленности индивидуальных белков и широкий диапазон свойств белков, включая массу, изоэлектрические точки, степень гидрофобности и посттрансляционные модификации. Это делает практически невозможным проведение анализа полного протеома в одном эксперименте. Поэтому для улучшения результатов предпринимают операции по уменьшению сложности протеома, например, выбирая определенную группу белков или клеточных органелл [Hanash S. Disease proteomics Nature. 2003, 422: 226-232]. Конечно, это значительно усложняет анализы полных протеомов. Онкологические заболевания занимают особое место среди заболеваний, для которых во всем мире существует острая потребность в разработке новых подходов к диагностике (в частности, ранней диагностике), профилактике, лечению и предупреждению рецидивов. Немелкоклеточный рак легких (Non-SmallCell Lung Cancer, NSCLC), основными формами которого являются аденокарцинома и плоскоклеточный рак легких (ПРЛ), занимает первое место в мире по числу летальных исходов среди онкологических заболеваний [Parkin D.M., Pisani P., et al. Global cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 1999, 49: 33-64]. По оценкам [Diamandidis D., et al. Non-Small-Cell Lung Cancer http://www.cancenetwork.com/textbook/morev12.htm], в США смертность от рака легких в год составляет 150000 человек, и новых диагнозов рака легких ставится около 170000 в год, из них на плоскоклеточный рак легких приходится 80%. Рак пищевода занимает седьмое место по смертности среди разных видов злокачественных опухолей [Enzinger P.C., Mayer R.J., et al. Esophageal cancer. N. Engl. J. Med. 2003, 349: 2241-2252]. За последнее время при исследовании плоскоклеточного рака легкого был проведен ряд работ, в которых авторы использовали современные высокопроизводительные технологии анализа изменений, происходящих в раковых клетках по сравнению с нормальной тканью. Рак пищевода существенно менее изучен. Было проведено несколько протеомных исследований плоскоклеточного рака легких [Li С., Chen Z.,et al. Comparative proteomics analysis of human lung squamous carcinoma. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, 309: 253-60; Wu X., Xiao Z., et al. Differential analysis of two-dimension gel electrophoresis profilesfrom the normal-metaplasia-dysplasia-carcinoma tissue of human bronchial epithelium. Pathol. Int. 2004, 54: 765-73; Seike M., Kondo T., et al. Proteomic signature of human cancer cells. Proteomics. 2004, 4: 2776-88]. Благодаря этим исследованиям удалось детектировать несколько сотен предположительно дифференциальных белков и с помощью масс-спектрометрии идентифицировать некоторые из них, относящиеся к онкогенам или участвующие в процессах регуляции клеточного цикла, дифференцировки и сигнальной трансдукции. Однако в этих работах не проводилось подтверждение дифференциальной природы обнаруженных белков на многих опухолевых образцах. Большинство широкомасштабных работ по поиску генов, дифференциально экспрессирующихся при раке легкого, проводилось на уровне транскриптомов. Были использованы такие методы, как SAGEepithelial tissue. Int. J. Oncol. 2005, 26: 247-58]. Учитывая недостатки, присущие ДНК-микрочипам, делались попытки сочетания технологий вычитания ДНК и ДНК-микрочипов [Amatschek S. et al. Tissue-wideexpression profiling using cDNA subtraction and microarrays to identify tumor-specific genes. Cancer Res. 2004, 64: 844-56]. Общий вывод из этих работ заключается в том, что существует большое количество генов, дифференциально транскрибирующихся в нормальных и опухолевых тканях плоскоклеточных раков легкого. В частности, отмечалось увеличение транскрипции таких генов, как циклин B1, TGF-beta 3, B-Myb, Erg2,VCAM-1 и CD44, и уменьшение транскрипции таких генов, как MIG-6, Esp 15 и CAK. Все дифференциально экспрессирующиеся гены, идентифицированные в работах по анализу транскриптомов раковых клеток, могут рассматриваться только как потенциальные гены, принимающие участие в образовании и развитии опухолей. Большинство исследований заканчивается анализом обнаруженных различий в экспрессии генов на уровне транскриптома, поэтому остается неизвестным, насколько разница в уровне транскрипции гена соответствует разнице в представленности соответствующего ему белка в нормальных и раковых клетках. Только в работе Sugita M. с соавторами [Sugita M., Geraciet M., et al. Combined use ofRes. 2002, 62: 3971-9] была предпринята попытка такого рода анализа. Методом ДНК-микрочипов ими были идентифицированы несколько дифференциально транскрибирующихся генов, относящихся к группе генов CTAG (cancer/testis antigen). С помощью антител к белкам, кодируемым этими генами, был проведен анализ уровня экспрессии белков в различных образцах тканей рака легкого, который показал, что некоторые из них могут быть использованы как специфические маркеры для ранней диагностики NSCLC. В целом, в последние годы достигнут значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов и классификации NSCLC, который ведет к улучшению результатов клинической практики. Особенно важные результаты получены при использовании современных технологий (SAGE, ДНК-микрочипы),позволяющих проводить одновременный анализ экспрессии множества генов [Petty R., Nicolson M., et al.Clin. Cancer Res. 2004, 10: 3237-48]. В случае рака пищевода за последнее время также был проведен целый ряд работ, в которых авторы использовали современные высокопроизводительные технологии анализа изменений транскриптомов и протеомов раковых клеток по сравнению с нормальными клетками. Так в одной из последних работ[Dahlberg P., Ferrin L., et al. Gene expression profiles in esophageal adenocarcinoma. Ann. Thorac. Surg. 2004,77: 1008-15] авторы проводили сравнение клеток аденокарциномы пищевода, плоскоклеточного рака пищевода, метаплазии Барретта (предраковое заболевание пищевода) и нормальной ткани пищевода. В этом исследовании анализ транскриптомов, выполненный с помощью микрочипов Affymetrix U95, позволил идентифицировать более 300 генов, экспрессия которых была изменена в раковых клетках аденокарциномы. Существенно увеличенная экспрессия гена протоонкогена ERBB2 (по-видимому, вследствие амплификации хромосомного локуса) была обнаружена в клетках аденокарциномы по сравнению с клетками нормального эпителия пищевода и эпителием метаплазии Барретта. В другой более ранней работеprofiles of Barrett's esophagus and esophageal cancer. Cancer Res. 2002, 62: 3493-7] также с использованием микрочипов было обнаружено изменение активности более чем 160 генов в раковых клетках пищевода по сравнению с клетками метаплазии Барретта. Также можно отметить работу Hu Y. и др. [Hu Y., Lam K.,et al. Profiling of differentially expressed cancer-related genes in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)ESCC. Clinical Cancer Res. 2001, 7: 3519-25], посвященную анализу экспрессии генов в двух клеточных линиях рака пищевода по сравнению с клетками нормального эпителия. В этой работе были найдены интересные маркеры плоскоклеточного рака пищевода, в частности увеличенная экспрессия МЕТ онкогена. Кроме этих работ, посвященных анализу раковых транскриптомов, необходимо выделить протеомное исследование G. Zhou и др. [Zhou G., Li H., et al. 2D differential in-gel electrophoresis for the identification ofesophageal scans cell cancer-specific protein markers. Mol. Cell Proteomics. 2002, 1: 117-24], в котором авторам с помощью сравнительного варианта 2-D электрофореза (DIGE system) удалось детектировать около 150 белковых маркеров плоскоклеточной трансформации клеток эпителия пищевода и с помощью масс-3 010352 спектрометрии идентифицировать некоторые из них. В этой работе авторы обнаружили повышенную экспрессию генов tumor rejection antigen gp96, Annexin I и альфа-тубулина. Однако упомянутые работы не носили систематического характера и были связаны, в основном, с анализом ограниченного количества белковых пятен. Раскрытие изобретения Цели изобретения Целью данного изобретения является создание универсальной технологии, позволяющей выявлять экспрессируемые гены, кодируемые ими транскрипты и белки, представленные в одном типе клеток, но отсутствующие в другом, или представленные по-разному в количественном отношении, в том числе в нормальных клетках и клетках, измененных вследствие различного рода наследственных и приобретенных патологий, включая опухолевую трансформацию, а также в клетках одного типа, но при различных условиях. Выявление различий без сравнения картин разделения продуктов и получение этих различий в виде клонированных генов является важнейшим преимуществом предлагаемой технологии. Предлагаемая технология является полногеномной и на стадии выявления различий не зависит от предварительной доступности информации о структуре генома или транскриптома. Технология согласно изобретению объединяет преимущества технологий полногеномного сравнения РНК, например вычитающей гибридизации и SAGE, для получения дифференциальных транскриптов с возможностями бесклеточного синтеза белка, генной инженерии и химического синтеза белков и пептидов для получения антител, в частности моноклональных антител, аптамеров или иных агентов, специфически взаимодействующих с данными белками или с фрагментами белков и позволяющих детектировать присутствие этих белков в различных тканях. Наиболее предпочтительным является использование для полногеномного сравнения РНК вычитающей гибридизации - метода, не требующего предварительного знания последовательностей генов. Полученные антитела, аптамеры и другие агенты, специфически взаимодействующие с дифференциально экспрессируемыми белками или фрагментами таких белков, могут быть использованы для получения лекарственных средств для лечения или профилактики заболеваний млекопитающих, и в особености человека, а также для создания диагностических систем. Технология позволяет осуществлять параллельный анализ содержания множества белков во множестве тканей. В результате такого объединения информация о дифференциальных транскриптах, способы получения которой хорошо разработаны, трансформируется в информацию о дифференциальных белках, таким образом превращаясь в технологию дифференциальной протеомики, позволяя достигать целей протеомного анализа существенно более экономичными способами. Таким образом, одним из аспектов настоящего изобретения является способ дифференциального анализа протеомов в различных типах клеток организма или в одном типе клеток при различных условиях. Способ согласно изобретению предусматривает: а) получение набора дифференциальных транскриптов, представленность которых в одном типе клеток отличается от представленности в другом типе клеток или представленность которых в клетках одного типа при различных условиях отличается; б) определение последовательности дифференциальных транскриптов; в) синтез дифференциальных белков, соответствующих дифференциальным транскриптам, или их фрагментов; г) получение агентов, взаимодействующих с указанными дифференциальными белками или их фрагментами с высокой аффинностью и специфичностью; д) определение и сравнение белковых профилей для различных типов клеток или одного типа клеток при различных условиях с использованием указанных агентов. В одном из воплощений способа настоящего изобретения в случае известности последовательности генома организма способ дополнительно включает определение полной последовательности дифференциально экспрессирующихся генов и их аналогов, соответствующих полученным дифференциальным транскриптам, путем сопоставления последовательности к ДНК/фрагмента кДНК с известной последовательностью генома организма с использованием методов биоинформатики. В одном из воплощений способа настоящего изобретения клетки являются клетками организма млекопитающего. В предпочтительном воплощении таким организмом является человек. В одном из воплощений способ согласно изобретению дополнительно предусматривает оценку диагностической и терапевтической перспективности дифференциальных белков. В одном из особо предпочтительных воплощений способ предусматривает получение набора дифференциальных транскриптов с использованием методов вычитающей гибридизации. Еще в одном предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения получение набора дифференциальных транскриптов осуществляют с использованием ДНК-микрочипа. В одном из воплощений способа синтез дифференциальных белков или их фрагментов осуществляют методами генетической инженерии. Еще в одном воплощении синтез дифференциальных белков или их фрагментов осуществляют химическими методами.-4 010352 В следующем воплощении синтез дифференциальных белков или их фрагментов осуществляют методами бесклеточного синтеза белка. В одном из воплощений способа клетки одного из типов являются нормальными, а клетки другого типа являются измененными вследствие наследственных или приобретенных патологий, включая опухолевую трансформацию. В предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения клетки, измененные вследствие опухолевой трансформации, являются клетками плоскоклеточного рака легких или клетками рака пищевода человека. В одном из воплощений способа дифференциального анализа протеомов указанные агенты представляют собой поли- или моноклональные антитела, или ДНК- или РНК-аптамеры. В предпочтительном воплощении способа для определения белкового профиля агенты настоящего изобретения используют в виде микрочипа, представляющего собой подложку с иммобилизованными на ней указанными агентами. В своем следующем аспекте настоящее изобретение относится к ДНК-микрочипу для анализа дифференциальных транскриптов, представляющему собой подложку с иммобилизованными на ней изолированными олигонуклеотидами, последовательности которых соответствуют или комплементарны специфичным фрагментам последовательностей дифференциальных транскриптов, полученных на стадии а) способа дифференциального анализа протеомов настоящего изобретения. В одном из воплощений ДНК-микрочип предназначен для характеристики и классификации опухолей на уровне транскрипции. Еще в одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает изолированный белок, дифференциально представленный в различных типах клеток или в одном типе клеток при различных условиях, полученный путем осуществления стадий а), б) и в) способа дифференциального анализа протеомов настоящего изобретения, или его фрагмент. В еще одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает агент, способный специфически взаимодействовать с белком, дифференциально представленным в различных типах клеток или в одном типе клеток при различных условиях, или его фрагментом, полученный путем осуществления стадий а)г) способа дифференциального анализа протеомов согласно настоящему изобретению. В одном из воплощений агент настоящего изобретения представляет собой поли- или моноклональное антитело, или ДНК- или РНК-аптамер. В одном из воплощений агент настоящего изобретения используется в качестве терапевтического/профилактического лекарственного средства. Еще в одном из воплощений агент настоящего изобретения используется в качестве диагностического средства. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к микрочипу для дифференциального анализа протеомов в различных типах клеток или в одном типе клеток при различных условиях, который представляет собой подложку с иммобилизованными на ней агентами согласно настоящему изобретению. Еще в одном из аспектов настоящее изобретение относится к набору для диагностики заболевания,прогноза его лечения и выработки терапевтических рекомендаций, содержащему по меньшей мере один агент, предусмотренный настоящим изобретением, и/или по меньшей мере один изолированный олигонуклеотид, специфически гибридизующийся с дифференциальным транскриптом, где последовательность олигонуклеотида соответствует или комплементарна специфичному фрагменту последовательности дифференциального транскрипта, определенной на стадии б) способа дифференциального анализа протеомов согласно настоящему изобретению. Преимущества, обеспечиваемые данным изобретением Способ анализа данного изобретения позволяет параллельно выявлять и анализировать множество белков, в том числе регуляторных, экспрессия которых меняется в разных условиях и которые, как правило, представлены в низких концентрациях и не во всех типах клеток или не при всех условиях, что делает затруднительным их выявление и анализ методами стандартной протеомики. Способ дифференциальной протеомики является полнопротеомным. В применении к патологическим процессам такой способ позволяет выявлять белки, вовлеченные в механизмы возникновения патологий, что способствует разработке рациональных систем диагностики и терапии заболеваний, зависящих от наследственных или приобретенных генетических изменений. Способ дифференциальной протеомики может применяться для протеомного анализа различных видов животных, преимущественно млекопитающих, включая человека. Поскольку возможность реализации способа настоящего изобретения не зависит от доступности геномных последовательностей, способ может применяться для протеомного анализа видов животных, последовательности геномов которых неизвестны, например для протеомной характеризации ценных видов и/или пород рыб, птиц, сельскохозяйственных животных. Способ дифференциальной протеомики в применении к видам животных, преимущественно млекопитающих, включая человека, геномные последовательности которых известны, позволяет прямо приписывать выявляемые с помощью него различия к определенным позициям генома и выявлять аналогичные-5 010352 гены, представленные в других местах генома, что имеет существенное значение для разработки диагностических и терапевтических процедур. Кроме того, наличие геномной информации позволяет на основании последовательности фрагментов ДНК, выявляемых при проведении вычитающей гибридизации,выводить последовательности полноразмерных транскриптов и кодируемых ими белков. Технология значительно превосходит существующие технологии традиционной протеомики по эксплуатационным характеристикам - простоте, доступности исходных материалов. Технология в силу использования простого оборудования и реагентов более надежна, чем технологии стандартной протеомики. По экологическим показателям технология представляет собой комплекс экологически чистых операций, не приводящих к загрязнению окружающей среды. Работа проводится с водными растворами,исключает использование ядовитых веществ. Технология намного более экономична, чем существующие технологии стандартной протеомики. Используются обычные лабораторные приборы и реактивы, которые несопоставимо более дешевы, чем хроматографическое и масс-спектрометрическое оборудование, используемое в стандартных протеомных технологиях. Технология является ресурсосберегающей и также превосходит по этим показателям энергозатратные технологии стандартной протеомики. Краткий перечень фигур Фиг. 1. Потоковая схема, демонстрирующая преобразование легко доступной геномной информации в трудно доступную прямыми протеомными методами информацию о дифференциальных белках. Фиг. 2. Гель-электрофорез РНК, выделенной из опухолевых и нормальных тканей. Дорожки: РНК образцов 4 и 6 из нормальной (N) и опухолевой (Т) тканей, М - маркер длин ДНК. Фиг. 3. Агарозный гель-электрофорез синтезированной кДНК. Дорожки: М - маркер молекулярного веса ДНК, 1 - кДНК, синтезированная обратной транскрипцией на матрице РНК, после ПЦР амплификации. Фиг. 4. Принципиальная схема, поясняющая метод вычитающей гибридизации. Состав операций, их последовательность и особенности приведены в тексте ниже. Фиг. 5. Агарозный гель-электрофорез продуктов ПЦР 1 и 2 для образцов нормальной (N) и опухолевой (Т) тканей легких, взятых у одного пациента. Дорожки: М - маркер молекулярного веса ДНК, 1 - вычтеный образец кДНК N после ПЦР 1, 2 - вычтеный образец кДНК Т после ПЦР 1, 3 - вычтеный образец кДНК N после ПЦР 2, 4 - вычтеный образец кДНК Т после ПЦР 2, 5 - контрольный образец кДНК N, 6 - контрольный образец кДНК Т. Фиг. 6. Результаты дифференциального скрининга вычтенной библиотеки. Результаты дифференциальной гибридизации одной плашки из N (тестер)-вычтенной библиотеки. Эта библиотека обогащена последовательностями генов, специфически экспрессирующимися в нормальной ткани. С плашки сделаны две реплики, одну из которых гибридизуют с радиоактивно меченной кДНК N (тестер)-вычтенной библиотеки (А), а другую - с кДНК Т (драйвер)-вычтенной библиотеки. Клоны, которые дают гибридизационный сигнал только на реплике А, являются дифференциальными. Например, клон А 1 - дифференциальный, а клон В 3 - нет. Фиг. 7. Виртуальный нозерн-блот анализ дифференциальных последовательностей, полученных изN - невычтенная кДНК тестера (N), Т - невычтенная кДНК драйвера (Т). Фиг. 8. Иммуноэлектрофоретический анализ экспрессии J-пептида в бесклеточной системе синтеза белка. Дорожки 1 и 2 - электрофорез в ПААГ реакционной смеси бесклеточной системы с экстрактом S30 Е. coli, содержащей (дорожка 1) и не содержащей (дорожка 2) вектор рЕТ 28, несущий ген J-пептида; дорожки 3 и 4 - иммуноблот с антисывороткой к J-пептиду образцов, фракционированных на дорожках 1 и 2. Фиг. 9. Иммуноэлектрофоретический анализ экспрессии J-пептида в клетках Е. coli. Дорожки: Mr - белковые маркеры фирмы Bio-Rad; 1, 2- электрофорез в ПААГ экстрактов Е. coli,трансформированной вектором рЕТ 28, несущим ген IgJ, индуцированной (дорожка 1) и неиндуцированной (дорожка 2) IPTG; 3, 4 - иммуноблот с антисывороткой к IgJ экстрактов Е. coli, фракционированных на дорожках 1 и 2. Фиг. 10. Результат титрования антисыворотки методом ELISA. Указаны серии разведений. 1 - антисыворотка с антигеном J, 2 -контрольная антисыворотка с антигеном J, 3 - антисыворотка с контрольным антигеном, 4 - контрольная антисыворотка с контрольным антигеном. Фиг. 11. Вестерн-блот антисыворотки Феофания с антигеном J. Дорожки: М - белковые маркеры фирмы Bio-Rad, 1 - лизат, из которого выделяли антиген, 2 - очищенный препарат антигена, 3 - контрольный антиген (другой белок, очищенный металлоаффинной хроматографией). Дорожки 4-6 - те же антигены, что и в случае дорожек 1-3, но с другой антисывороткой. Разведение антисыворотки 1:2000. Фиг. 12. Иммуноэлектрофоретический анализ экспрессии J-пептида в нормальных и опухолевых-6 010352 тканях человека. Электрофорез в ПААГ и иммуноблот с антисывороткой к J-пептиду образцов белковых экстрактов,полученных из нормальных и опухолевых тканей. Mr - белковые маркеры фирмы Bio-Rad; J - очищенный препарат J-пептида, N и Т - нормальная и опухолевая ткани, соответственно, взятые у одного пациента. Осуществление изобретения Настоящее изобретение, в целом, обеспечивает универсальную технологию для сравнительного анализа нормальных и патологических тканей, а также одних и тех же тканей при различных условиях,направленную на получение диагностических, профилактических и терапевтических препаратов, в частности против раковых заболеваний. Общая научная идеология, составляющая основу универсальной технологии данного изобретения,иллюстрируется потоковой схемой фиг. 1, которая показывает, что преобразование легко доступной геномной информации в трудно доступную прямыми протеомными методами информацию о дифференциальных белках значительно облегчает и удешевляет идентификацию последних и использование этой информации для диагностических и, в перспективе, терапевтических подходов. Возможности настоящего изобретения в применении к дифференциальному анализу экспрессии белков в различных типах клеток животных, в частности человека, значительно расширяются благодаря успешному завершению проекта по секвенированию полного генома человека и наличию доступных баз данных по последовательностям транскриптов и белков человека (последняя сводка баз данных [GalperinM. The molecular biology Database collection: 2005 update. Nucl. Acids Res. 2005; 33: D5-24]), а также благодаря наличию информации о последовательностях полных геномов различных организмов (ibid). Информация, которая получается в результате осуществления данного способа, может быть трансформирована в биоинформационную динамическую базу данных по дифференциальной экспрессии генов в нормальных и пораженных болезнью тканях, например опухолевых тканях. Далее изобретение будет подробно описано со ссылкой на его наиболее предпочтительные воплощения. Хотя описаны предпочтительные воплощения, однако, должно быть ясно, что изобретение ими не ограничивается. Напротив, предполагается, что изобретение охватывает альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в него с учетом сущности и рамок данного изобретения,которые определяются формулой изобретения. Для получения дифференциальной протеомной информации могут использоваться клетки одного типа одного и того же организма на разных стадиях развития или же в процессе естественного старения организма. В частности, фундаментальная информация о механизмах эмбриогенеза и органогенеза может быть получена при дифференциальном анализе протеомов различных типов стволовых клеток (эмбриональных, тотипотентных, плюрипотентных, региональных, клеток-предшественников и т.д.). Особый интерес представляет сравнение протеомов клеток одной и той же ткани в норме и патологии, например при злокачественном перерождении. Также весьма интересным представляется сравнение нормальных клеток и клеток, пораженных бактериальным или вирусным патогеном. В этом случае дифференциальный протеомный анализ позволяет выявить те белки, которые патоген рекрутирует в целях своего развития и размножения, и белки, которые клетка использует в качестве средства борьбы против инфекционного агента. Способ дифференциального анализа протеомов предполагает осуществление доступа к мРНК, содержащейся в клетках, подлежащих анализу. В зависимости от типа клеток и их принадлежности к тому или иному организму существует обширный арсенал методов, хорошо известный специалистам в данной области. Например, для разрушения клеток млекопитающих и выделения РНК может быть использован метод [Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 1987, 162: 156-159]. Для получения библиотек транскриптов (в виде кДНК), представленных в одном типе клеток (например, в нормальных клетках), но отсутствующих в другом типе клеток (например, в клетках опухоли),или в клетках одного типа, но при различных условиях, или представленных в них по-разному в количественном отношении, могут быть использованы различные методы полногеномного сравнения транскриптомов, например SAGE или вычитающая гибридизация. Предпочтительным является использование метода вычитающей гибридизации, не требующего предварительного знания последовательности генов. В настоящее время наиболее широко используемой в мире является модификация метода вычитающей гибридизации, известная под названием супрессионной вычитающей гибридизации (suppression subtractiveD., Desai S., et al. Suppression subtractive hybridization. Methods Mol. Biol. 2004; 258: 107-34]. Вычитающая гибридизация позволяет выявлять различия между двумя сравниваемыми полными транскриптомами независимо от информации о первичной структуре геномов. Важно отметить, что, во-первых, SSH использует в качестве исходного материала очень небольшие количества клеток (до нескольких тысяч) или тканей и, во-вторых, получаемые в итоге дифференциальные продукты содержат готовые универсальные адаптеры, благодаря которым эти продукты можно легко амплифицировать, клонировать или транскрибировать, превращая в РНК.-7 010352 Подход на основе супрессионной вычитающей гибридизации является истинно полногеномным(точнее, полнотранскриптомным). Таким образом, вычитающая гибридизация не закрывает перед исследователем перспективы открытия новых неизвестных генов и их транскриптов. Важнейшим практическим преимуществом метода SSH является то, что дифференциально экспрессирующиеся последовательности выявляются не в виде небольшого числа сигналов на фоне десятков тысяч недифференциально экспрессирующихся последовательностей, а выделяются в процессе вычитания в виде физического материала (дифференциальных клонов) (фиг. 6), который можно непосредственно использовать в дальнейших операциях. Это происходит за счет автоматического отбрасывания недифференциальных последовательностей (см. фиг. 4). В результате экспериментатору приходится оперировать не с тысячами и не десятками тысяч клонов, только незначительная часть которых дифференциальна, а с сотнями заведомо дифференциальных клонов. Технология вычитающей гибридизации не требует дорогого оборудования и может рутинно использоваться в любой лаборатории, специализирующейся в области молекулярной биологии. Имеются коммерчески доступные наборы для вычитающей гибридизации в модификации SSH (фирма Клонтек,США). Для получения библиотек транскриптов (в виде кДНК), представленных в одном типе клеток (например, в нормальных клетках), но отсутствующих в другом типе клеток (например, в клетках опухоли),или в клетках одного типа, но при различных условиях, или представленных в них по-разному в количественном отношении, также могут использоваться другие известные в данной области подходы, например подход, известный как серийный анализ экпрессии генов SAGE [Velculescu, V.Е., Zhang, L., Vogelstein,В., and Kinzler, K.W., 1995. Serial analysis of gene expression. Science 270 (5235), 484-7], или подходы на основе ДНК-микрочипов [Lockhart D., Winzeler E. Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature. 2000, 405: 827-836; Alon U., Barkai N., Notterman D., et al. Broad patterns of gene expression revealed byidentified by gene expression profiling. Nature. 2000, 403: 503-511]. Специалисту в данной области известны различные способы определения нуклеотидной последовательности, такие как, например, секвенирование дидезокси-методом Сэнгера [Sanger F., Nicklen S., CoulsonA. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977, 74: 5463-67]. Существует большое количество различных модификаций данных методов, и наборы и оборудование для проведения секвенирования в автоматическом режиме широко доступны из коммерческих источников [Chanof DNA sequencing techniques. Q. Rev. Biophys. 2002, 35: 169-200]. Полученные в результате секвенирования данные о нуклеотидных последовательностях затем сравниваются с последовательностями генома конкретного организма, представленными в различных базах данных, в частности в базе данных по геному человека (базы данных GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez;http://www.ebi.ac.uk/embl.html). Данная стадия полезна для идентификации генов, всех их структурных элементов, таких как инициирующие и терминирующие кодоны, 5'- и 3'-регуляторные элементы, интронэкзонная структура, сайты альтернативного сплайсинга и т.д. Это позволяет выбрать правильные последовательности для экспрессии, например, белковых доменов, определить значимость и функцию/биологическую роль белка, которую он играет в организме, если известно, что это за белок. В том случае, когда обнаруженные последовательности являются новыми, о которых ничего не известно, полученные клоны непосредственно экспрессируют. В настоящее время существует широкий спектр компьютерных программ, позволяющих проводить такие сравнения [MEGABLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST); RepeatMasker (http://ftp.genome.washington.edu/cgibin/RepeatMasker);(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/hgTracks.html)]. Для синтеза белков, последовательность которых кодируется выявленными дифференциально экспрессируемыми генами, в настоящее время существуют различные подходы. Один из подходов заключается в использовании методов генной инженерии [Hunt I. From gene to protein: a review of new and enablingtechnologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr. Purif. 2005, 40: 1-22]. Вкратце, ген, кодирующий целевой белковый продукт, встраивают в подходящий вектор. При необходимости вектор может содержать дополнительные регуляторные элементы, обеспечивающие эффективную экспрессию гена в хозяине. К таким регуляторным элементам могут относиться, в частности, промоторы транскрипции,операторы, терминаторы, энхансеры, сайты связывания рибосомы и т.д. [Colosimo A., Goncz K., Holmes A.,et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. Biotechniques. 2000, 29: 314-324; LopezFerber M., Sisk W., Possee R. Baculovirus transfer vectors. Methods Mol. Biol. 1995, 39: 25-63; Yarranton G.Inducible vectors for expression in mammalian cells. Curr. Opin. Biotechnol. 1992, 3: 506-511]. Затем полученный вектор трансформируют в подходящего хозяина и выращивают клетки-хозяева в условиях, обеспечивающих эффективную экспрессию гена. В данной области известно множество векторов, которые могут быть использованы для экспрессии чужеродных генов. К ним относятся, в частности, векторы для экспрессии в клетках E. coli серии рЕТ-8 010352 фирмы Novagen (США) и pQE фирмы Qiagen (США). Для экспрессии в клетках млекопитающих, чаще всего, в качестве регуляторных элементов применяют комбинации вирусных промоторов и энхансеров,например векторы, выпускаемые фирмой Promega (США), pCI (содержит промотор-энхансер ранних генов цитомегаловируса) и pSI (содержит промотор-энхансер вируса SV40). Для экспрессии в эукариотических системах наиболее подходящими являются векторы на основе вируса полиэдроза (клетки насекомых)vector for gene therapy: an emerging strategy. Mol. Ther. 2002, 6: 5-11], на основе аденовирусов [Kovesdi I.,Brough D., et al. Adenoviral vectors for gene transfer. Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8: 583-9], вируса осповакцины (клетки млекопитающих) [Hruby D., Thomas G. Use of vaccinia virus to express biopharmaceuticalTher. 2003, 10: 1135-41]. При необходимости к гену, кодирующему целевой белковый продукт, в соответствующей рамке считывания может быть присоединена лидерная последовательность, обеспечивающая синтез белка в виде пробелка и его последующую секрецию в культуральную среду. Также при необходимости целевой белок может синтезироваться в виде слитого белка, в котором в качестве партнера по слиянию используется фрагмент, обеспечивающий, например, последующую эффективную очистку или укладку белка в биологически активную нативную конформацию. Такие партнеры по слиянию и векторы, обеспечивающие клонирование целевых генов в Е. coli, хорошо известны в данной области техники. Например, последовательность из 6 или более остатков His позволяет осуществлять очистку белков наNi-содержащей смоле, а использование в качестве лидерного фрагмента гена белка тиоредоксина повышает, ко всему прочему, растворимость рекомбинантного слитого продукта в клетках Е. coli (плазмиды компаний Novagen, Qiagen). В качестве клеток-хозяев могут быть использованы как прокариотические (например, но не ограничиваясь только ими, E. coli, В. subtilis) [Sorensen H., Mortensen K. Advanced genetic strategies for recombinantDevelopments in the use of Bacillus species for industrial production. Can. J. Microbiol. 2004, 50: 1-17], так и эукариотические клетки (например, но не ограничиваясь только ими, клетки нитчатых грибов (A. niger),дрожжей (P. pastoris, S. cerevisiae [Gerngross Т. Advances in the production of human therapeutic proteins inproduction of recombinant proteins. Nat. Biotechnol. 22 (11), 1415-22]. Эукариотические клетки особенно благоприятны для синтеза олигомерных, сложномодифицированных и секретируемых белков, т.к. они обеспечивают правильную укладку полипептидной цепи, сборку олигомерных белков в одной клетке, секрецию белков в культуральную среду и посттрансляционную модификацию белков, включая гликозилирование, фосфорилирование, ацилирование остатками жирных кислот и т.д. В целом, достигается структура рекомбинантного белка, максимально приближенная к природной [Macauley-Patrick S., Fazenda M., McNeil В. and Harvey L.M. Heterologous protein production usingproteins for human use: implications of choice of expression system. Mol. Biotechnol. 2004, 28: 241-255; Gomord V.,Faye L. Posttranslational modification of therapeutic proteins in plants. Curr. Opin. Plant. Biol. 2004, 7: 171-181]. Способы введения векторов в клетки-хозяева включают (но не ограничиваются только ими) трансформацию [Hanahan D., Jessee J., Bloom F. Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria.Methods Enzymol. 1991, 204: 63-113], инфекцию, осаждение ДНК кальций-фосфатом, электропорацию, липофекцию, бомбардировку микрочастицами (например, при помощи системы Genegun) и т.д. [Colosimo A.,Goncz K., et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. Biotechniques. 2000, 29: 314-8,320-2, 324; Trezise A. In vivo DNA electrotransfer. DNA Cell Biol. 2002, 21: 869-77; Mahato R. Water insolublePhysical methods for gene transfer: improving the kinetics of gene delivery into cells. Adv. Drug Deliv. Rev. 2005, 57: 733-53]. Еще одним подходом к синтезу дифференциальных белков, применимым в рамках способа данного изобретения, является синтез с использованием системы бесклеточной трансляции. Данный способ хорошо известен в данной области техники [Spirin A.S. ed. Cell-Free Translation Systems. 2002, Springer Verlag,Berlin-Heidelberg-New York]. Имеются доступные коммерческие наборы (Roche, Швейцария; CellFreeScience, Япония). Одним из вариантов синтеза белка в бесклеточных системах является разработанная в Институте белка РАН технология препаративного синтеза непрерывного действия. Эта технология позволяет синтезировать белки, экспрессия генов которых в клетках затруднена (регуляторные белки, токсины, нестабильные белки) или нецелесообразна по причине трудностей очистки белков от клеточных-9 010352 компонентов. Кроме того, новый биотехнологический подход нашел другое, исследовательское применение, получившее широкое и быстро растущее развитие для целей протеомики: это быстрое получение широких наборов разных белков, не требующее длительных процедур клонирования и экспрессии генов в бактериях или культурах клеток. Препаративные системы бесклеточного синтеза белков разработаны как в бактериальном, так и в эукариотическом вариантах [Spirin A.S. ed. Cell-Free Translation Systems. 2002, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 91-107], что позволяет производить как пептиды, так и крупные белки с высоким выходом их нативной, физиологически активной формы. В качестве альтернативы синтез полипептидов может быть также осуществлен химически. В данной области техники хорошо известны различные химические способы синтеза полипептидов, например гомогенный синтез [Gravert D., Janda K. Synthesis on soluble polymers: new reactions and the construction ofearly development of solid-phase peptide synthesis. Methods Enzymol. 1997, 289: 3-13]. Предпочтительным является твердофазный синтез полипептидов с использованием Fmoc-альфа-аминокислот [Dick F. Acidcleavage/deprotection in Fmoc/tBu solid-phase peptide synthesis. Methods Mol. Biol. 1994, 35: 63-72]. Реагенты, автоматизированные системы синтеза пептидов, системы очистки получаемых продуктов доступны от широкого спектра коммерческих производителей (PerkinElmer, Advanced ChemTech, Novabiochem). Данное изобретение также обеспечивает агенты, обладающие высокой специфичностью и аффинностью в отношении выявленных (обнаруженных, полученных) дифференциальных белков и/или их фрагментов. Предпочтительными воплощениями таких агентов являются антитела и аптамеры. Антитела могут быть как моноклональными, так и поликлональными. Способы получения антител хорошо известны специалисту в данной области [Coligan J., Kruisbeek A., et al. Current protocols in immunology.WileySons, NY, v. 1, с. 2]. Кроме того, могут быть использованы полученные генно-инженерными методами варианты антител, такие как, например, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scAb [Willemsen R., Debets R., et al. Genetic engineeringof T cell specificity for immunotherapy of cancer. Hum. Immunol. 2003, 64: 56-68]. Для терапевтических и профилактических целей предпочтительным является использование гуманизированных антител [Clark М. Antibody humanization: a case of the 'Emperor's new clothes' Immunol. Today. 2000, 21: 397-402]. Под аптамерами понимают олигонуклеотиды, отобранные в результате проведения отбора методомSELEX [Sun S. Technology evaluation: SELEX, Gilead Sciences Inc. Curr. Opin. Mol. Ther. 2000, 2: 100-5],которые обладают выраженной трехмерной структурой, обеспечивающей их высокую специфичность и аффинность связывания в отношении мишени (в данном случае дифференциального белка или его фрагмента). Аптамеры могут быть как на основе ДНК, так и на основе РНК, а также содержать различные модифицированные основания, такие как (без ограничения) инозин, 8-деазагуанин [Tombelli S., Minunni М., Mascini M. Analytical applications of aptamers. Biosens. Bioelectron. 2005, 20: 2424-34]. Полученные агенты (антитела и аптамеры) могут быть использованы для диагностических, профилактических и терапевтических целей [Marrs J. The use of monoclonal antibodies in oncology. Clin. J. Oncol.Nurs. 2004, 8: 311-3, 315; Review; Brody E., Gold L. Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J. Biotechnol. 2000, 74: 5-13]. В частности, полученные агенты могут быть использованы для определения содержания дифференциальных белковых продуктов в различных тканях больных и здоровых индивидуумов для оценки диагностической и терапевтической перспективности дифференциальных белков. Кроме того, полученные агенты могут быть использованы для проведения систематического серологического анализа дифференциально экспрессирующихся белков в крови индивидов, в частности больных различными видами рака, в первую очередь рака пищевода и легких. На основании такого анализа могут быть созданы диагностикумы, которые позволяют диагностировать болезнь, прогнозировать ее лечение и вырабатывать терапевтические рекомендации на основании наличия (отсутствия) дифференциального белка у пациента. Предпочтительно, полученные агенты (антитела и аптамеры) являются частью микрочипа для дифференциального анализа протеомов. Такие микрочипы представляют собой подложку, на которой каждый из нанесенных на нее агентов иммобилизован ковалентно или нековалентно в отдельном положении. В качестве подложки могут быть использованы твердые подложки с нанесенными на поверхность субстратами/пленками различной природы для повышения связывания белков [Zhu H., Snyder M. Proteinarrays and microarrays. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5: 40-45]. В качестве таких пленок используют, например, агарозу [Afariassiev V., Hanemann V., Wolf S. Preparation of DNA and protein microarrays on glassslides coated with an agarose film. Nucleic Acids Res. 2002, 28:e66], гидрогели на основе декстрана [Lofasdetection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2001, 2: 0004.1-0004.13]. Способы иммобилизации белков (антител) и олигонуклеотидов (аптамеров) хорошо известны специалистам и включают, в частности, ковалентную пришивку, абсорбцию через неспецифическое взаимодействие [MacBeath G. and Schreiber S. Printing proteins as microarrays for high-throughput functionNat. Biotechnol. 2000, 18: 989-994]. Ковалентное связывание через молекулы золота, покрывающие стеклаand Mrksich M. Peptide chips for the quantitative evaluation of protein kinase activity. Nat. Biotechnol. 2002,20: 270-274], имеет то преимущество, что позволяет использовать методы поверхностного плазмонного резонанса (SPR, Surface Plasmon Resonance) и масс-спектроскопии для детекции, мониторинга динамики реакции и идентификации связавшихся молекул. На основании полученных агентов могут быть созданы диагностические наборы (диагностикумы). Такие наборы будут содержать антитела или аптамеры к клинически значимым белкам. В состав таких диагностикумов будет входить контрольный биологический образец, а также набор очищенных антигенных препаратов, позволяющих проводить количественное определение содержания соответствующих антигенов в биологических/клинических образцах. В том случае, когда полученный агент представляет собой антитело, анализ может проводиться в любом из форматов, применяемых при стандартном иммуноанализе (например, прямой иммуноанализ,сэндвич-анализ, конкурентный иммуноанализ) [The Immunoassay Handbook, Ed: D. Wild, Elsevier Science,3 edition, 2005]. Наиболее предпочтительным является твердофазный иммуноферментный анализ типаELISA, для которого разработано множество модификаций и коммерчески доступных реактивов, материалов и оборудования [The ELISA Guidebook (Methods in Molecular Biology) Ed: J.R. Crowther. HumanaImmunoassay Handbook, Ed: D. Wild, Elsevier Science; 3 edition, 2005]. В том случае, когда полученный агент представляет собой аптамер, можно использовать те же форматы, что и для анализов с использованием антител. Диагностикумы, содержащие антитела к клинически важным белкам, могут быть использованы для определения количеств этих белков у пациентов. В свою очередь, эти данные позволят выявить значимые белки для терапевтического воздействия и создать терапевтические препараты, основанные на ингибировании избыточно синтезируемых белков или, наоборот, на доставке низко представленных белков в пораженные болезнью органы, в частности средствами генной терапии. Выявленные дифференциально экспрессирующиеся гены могут быть использованы для создания различных диагностикумов в формате ДНК-микрочипов, основанных на анализе содержания РНК этих генов в опухолевых образцах (прежде всего, биопсийных). ДНК-микрочип представляет собой подложку с иммобилизованными на ней изолированными олигонуклеотидами, последовательности которых соответствуют или комплементарны специфичным фрагментам последовательностей дифференциальных транскриптов. Технология создания ДНК-микрочипов хорошо разработана [DNA Microarrays Part A: Arraynetworks: Analysis of gene expression profiles. Methods Mol. Biol. 2006, 316: 35-48]. Существуют доступные программы для подбора последовательностей олигонуклеотидов для микрочипов: напримерhttp://oligodb.charite.de; http://earray.chem.agilent.com/earray; http://www.cbs.dtu.dk/services/OligoWi. Примеры Следующие далее примеры раскрывают наиболее предпочтительные воплощения данного изобретения и приведены исключительно с целью лучшего пояснения его сущности. Специалисту в данной области будет понятно, что можно осуществить множество модификаций как в отношении используемых материалов, так и в отношении используемых способов без отступления за рамки изобретения. Пример 1. Выделение и очистка РНК из тканей легких человека. Для выделения РНК использовали следующий метод. Растертый и хранящийся в жидком азоте порошок тканей смешивают с 8-10 объемами лизирующего буфера (4 М гуанидин изотиоцианат, 0,5% саркозилат натрия, 25 мМ ацетат натрия, рН 7,0, 100 мМ бета-меркаптоэтанол), пропускают 5-10 раз через шприц до исчезновения вязкости раствора. Добавляют 1/10 объема 2 М ацетата натрия, рН 5,0. К смеси добавляют равный объем фенола (водонасыщенный фенол должен иметь рН около 5,0), интенсивно перемешивают, добавляют 1/5 объема хлороформа и инкубируют 10-15 мин на льду. Разделяют водную и органические фазы центрифугированием. Отбирают водную фазу и повторяют экстракцию фенолом/хлороформом несколько раз до исчезновения интерфазы. Последний раз экстракцию проводят равными объемами фенола и хлороформа. РНК из водной фазы осаждают равным объемом изопропанола. Осадок РНК промывают дважды 70% этанолом, высушивают, растворяют в воде и хранят при -70 С. Для удаления геномной ДНК образцы РНК инкубируют с ДНКазой I (2 ед. акт. фермента на 2 мкг- 11010352 РНК) в течение 10 мин при 37 С. Затем смесь прогревают, дважды экстрагируют смесью фенол/хлороформ для полного удаления ДНКазы I, осаждают этанолом, промывают 70% этанолом, высушивают. Все работы с РНК проводят на холоду. Количество и качество РНК определяют спектрометрически по соотношению поглощения при 260/280 нм и электрофорезом в агарозном геле, оценивая соотношение полос рибосомальных РНК(28S/18S рРНК). Для визуализации РНК в гель добавляют бромистый этидий в конечной концентрации 0,5 мг/мл и результаты электрофореза анализируют по флуоресценции красителя при облучении УФ-светом (фиг. 2). Пример 2. Обратная транскрипция. Двуцепочечную кДНК синтезируют из образцов РНК с помощью SMART метода [Zhu Y.,Machleder E., et al. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA libraryconstruction. Biotechniques. 2001, 30: 892-897]. Для синтеза первой цепи кДНК используют SMART Oligo II олигонуклеотид (5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGrGrG-3') и CDS праймер (5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAd(T)30-3'). Для синтеза первой цепи кДНК берут 0,3 мкг РНК в общем объеме реакционной смеси 10 мкл. 0,2 мкл первой цепи кДНК берут для ПЦР амплификации с использованием SMART ПЦР праймера (5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3') и проводят 18 циклов ПЦР (каждый цикл включает: 95 С - 7 с; 65 С - 20 с; 72 С - 3 мин). Результаты обратной транскрипции и ПЦР-амплификации проверяют путем электрофореза в агарозном геле. Для визуализации двухцепочечной кДНК в гель добавляют бромистый этидий в конечной концентрации 0,5 мг/мл и результаты электрофореза анализируют по флуоресценции красителя при облучении УФ-светом (фиг. 3). Пример 3. Супрессионная вычитающая гибридизация. Принципиальная схема проведения супрессионной вычитающей гибридизации приведена на фиг. 4. Способ включает следующие стадии. 1. Выделение РНК из нормальных и опухолевых тканей, синтез двуцепочечной кДНК. 2. Гидролиз кДНК эндонуклеазой рестрикции RsaI. 3. Разделение кДНК тестера на две порции (А и В), лигирование адаптеров А и В к соответствующей порции тестера. Адаптеры А и В имеют одинаковые по нуклеотидной последовательности внешние части и различающиеся внутренние. Такая структура адаптеров позволит в дальнейшем использовать эффект ПЦР супрессии. Порции тестера А и В смешивают (по отдельности) с избытком кДНК драйвера,не имеющей адаптера, денатурируют, ренатурируют в течении 8 ч. 4. На втором этапе гибридизации объединяют порции тестера А и В, добавляют новую порцию драйвера и продолжают ренатурацию еще 12 ч. На этом этапе происходят нормализация и обогащение дифференциальными последовательностями фракций тестеров А и В. 5. Создание матрицы для ПЦР амплификации дифференциально транскрибирующихся последовательностей (достройка однонитевых адаптеров полимеразой). 6. Селективная амплификация дифференциальных последовательностей с праймером, имеющим нуклеотидную последовательность, идентичную внешней части адаптеров А и В (идет амплификация только тех молекул, которые имеют на концах разные адаптеры). Амплификация молекул, имеющих на концах только А или только В адаптеры, не идет (за счет эффекта ПЦР супрессии). 7. Для увеличения специфичности и амплификации нужного продукта проводят дополнительный ПЦР с праймерами, последовательность которых идентична внутренним частям адаптеров А и В.SMART-амплифицированные образцы двуцепочечной кДНК, полученные, как описано в примере 2,обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Rsa I. Вычитание образцов кДНК проводят методом вычитающей гибридизации по описанной методикеdifferentially expressed genes. Method Enzym. 1999, 303: 349-380]. В вычитании используют два образца кДНК: тестер (берут в недостатке) и драйвер (берут в избытке по отношению к тестеру). В результате вычитания получают набор фрагментов кДНК,присутствующий в кДНК тестера, но отсутствующий в кДНК драйвера. Для каждого вычитания получают две популяции тестера. Для этого к тестеру лигируют различные супрессионные адаптеры А и В (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' и 5'CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'). Эти популяции смешивают с 30 кратным избытком драйвера (кДНК драйвера не содержит адаптеров) в двух отдельных пробирках, денатурируют путем нагревания при температуре 98 С в течение 1,5 мин и инкубируют при 68 С в течение 8 ч. После первой гибридизации популяции тестера объединяют, добавляют свежий денатурированный драйвер и инкубируют при 68 С в течение ночи. После окончания гибридизации в реакционную смесь добавляют 200 мкл буфера для разведения (20 мМ HEPES-HCl, рН 8,3, 50 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭДТА, рН 8,0) и- 12010352 прогревают при 75 С в течение 7 мин. Затем проводят 26 циклов амплификации вычтенной кДНК с праймером 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (фиг. 5). Затем проводят 12 циклов второй амплификации с праймерами 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' и 5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'(фиг. 5). Для получения библиотеки, обогащенной специфичными для нормальной ткани транскриптами (Nспецифическая библиотека), при вычитании в качестве тестера используют кДНК из нормальной ткани, а драйвера - кДНК из опухолевой ткани; для получения библиотеки, обогащенной транскриптами, специфичными для опухолевой ткани (Т-специфическая библиотека), в качестве тестера используют кДНК из опухолевой ткани, а драйвером служит кДНК нормальной ткали. Два вычтенных образца кДНК, обогащенных дифференциально экспрессирующимися последовательностями (специфическими для нормальной ткани и специфическими для опухолевой ткани, соответственно), используют для приготовления кДНК библиотек. 40 нг кДНК лигируют в вектор pGemT Easy (Promega) и используют для трансформации в Е. coli. Пример 4. Дифференциальный скрининг. Для дифференциального скрининга берут 480 (пять 96-луночных плашек) выбранных случайным образом белых колоний из N-специфической библиотеки и 480 (пять 96-луночных плашек) выбранных случайным образом белых колоний из Т-специфической библиотеки. Клоны подращивают в плашках в 100 мкл среды LB, содержащей ампициллин (75 мкг/мл), 6 ч при 37 С. По 1 мкл бактериальной суспензии из каждой лунки берут для ПЦР амплификации. После добавления в бактериальную суспензию глицерина до 20% плашки помещают на -70 С. По 2,0 мкл каждой амплифицированной вставки (около 100 нг ДНК) наносят в 96-луночном формате на нейлоновые мембраны и гибридизуют с 32 Р-мечеными вычтенными N- и Т- кДНК пробами. Результаты дифференциального скрининга представлены на фиг. 6. Клоны из библиотеки, которые гибридизуются со своим зондом, но не гибридизуются с другим, отбирают как дифференциальные. Для подтверждения дифференциальной природы отобранных клонов проводят виртуальный нозерн-блот анализ. SMART-амплифицированную не вычтенную кДНК (N) и (Т) подвергают электрофорезу в агарозном геле и переносят на мембраны Hybond-N. Мембраны гибридизуют с 32 Р-мечеными пробами, приготовленными из амплифицированных вставок индивидуальных дифференциальных клонов, выявленных при дифференциальном скрининге. Результаты виртуального нозернблот анализа приведены на фиг. 7. Клоны, которые по результатам виртуального нозерн-блот-анализа являются дифференциальными,далее используют для выделения плазмидной ДНК стандартным методом, например щелочным методомAcids Res. 1979, 7: 1513] или с использованием коммерчески доступных наборов для выделения плазмидной ДНК (например, Wizard Plus SV Minipreps (Promega, CIIIA); QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen, США). Полученную плазмидную ДНК затем используют для определения нуклеотидной последовательности вставки. Для секвенирования используют коммерчески доступные наборы (например, набор реактивов для секвенирования ДНК по методу Сэнгера Kit Sequenase Version 2.0 (USB, США); набор реактивов для секвенирования ПЦР фрагментов "fmol DNA Cycle Sequencing System"(Promega, США и автоматический секвенатор (например, Applied Biosystems 373 automatic DNA sequencer). Последовательность гена сравнивают с базами данных (например, Non-redundant and HTGS (containsincomplete sequences of the human genome) Databases of GenBank+EMBL+DDBJ (EST Division, используя один из доступных алгоритмов (например, BLAST [http://ncbi.nhn.nih.gov/blast], Human Genome BLAST[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/HsBlast.html] и Human Genome Browser Draft [http://genome.ucsc.edu/] для идентификации гена. Пример 5. Экспрессия в гетерологических системах гена, дифференциально транскрибирующегося в нормальных и опухолевых тканях. При анализе дифференциально транскрибирующихся генов, выявленных вычитающей гибридизацией, показано 20-кратное превышение содержания РНК J-пептида полимерных иммуноглобулинов (IgJ) в нормальной ткани по сравнению с опухолевой. Для дальнейших исследований по экспрессии белка этого гена в нормальных и опухолевых тканях и иммуногистохимических анализов экспрессировали кДНК гена J-пептида в гетерологических системах (система бесклеточного синтеза белка и экспрессия в клетках Е. coli). Полноразмерную кДНК J-пептида получают ПЦР амплификацией кДНК, синтезированной на РНК из нормальной ткани легких человека, с праймерами, содержащими сайты узнавания рестриктаз BamHI и HindIII, ATG, инициирующий или комплементарный терминирующему АТТ кодоны и последовательности, соответствующие 5'- и 3'-концевым нуклеотидам кДНК J-пептида (IGJ-For 5'GAGAGGATCCATGAAGAACCATTTGCTTTTCTG и IGJ-Rev 5'-GCGCTAAAGCTTATTAGTCAGGATAGCAGGCATCT). Полноразмерную кДНК J-пептида обрабатывают соответствующими рестриктазами и клонируют в гидролизованный рестриктазами BamHI и HindIII вектор рЕТ-28 а(+) под контроль гибридного T7/lac промотора (Novagen, США). Вектор рЕТ-28 а(+) используют для получения белков в клетках Е. coli и в бесклеточной системе синтеза белка с экстрактом S30 E. coli.- 13010352 Экспрессия гена в бесклеточной системе Для получения J-пептида в бесклеточной системе используют сопряженные системы транскрипциитрансляции на основе клеточных экстрактов Е. coli [Spirin A.S. ed. Cell-Free Translation Systems. 2002,Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 91-107]. Иммуноэлектрофоретический анализ экспрессии Jпептида в бесклеточной системе синтеза белка приведен на фиг. 8. Экспрессия гена в клетках Е. coli Для экспрессии J-пептида в клетках Е. coli конструкцию трансформируют в штамм Е. coli BL21(DE3),содержащий хромосомную копию гена Т 7 РНК полимеразы под контролем промотора lacUV5, наращивают бактерии в среде LB и индуцируют промотор ИПТГ, собирают биомассу центрифугированием, разрушают клетки ультразвуком. Иммуноэлектрофоретический анализ экспрессии J-пептид в клетках Е. coli BL21(DE3) приведен на фиг. 9. Пример 6. Получение поликлональных антител. Поликлональные антитела к J-пептиду получают из сыворотки крови кролика, иммунизированного рекомбинантным антигеном (J), полученным в результате экспрессии гена J-пептида в Е. coli. Белок очищают до гомогенного, по данным электрофореза в ПААГ, состояния с помощью металлоаффинной хроматографии на Ni2+-NTA-агарозе (Qiagen, Германия) в денатурирующих условиях согласно рекомендуемому протоколу производителя. Полученный препарат J-пептида диализуют против PBS и используют для иммунизации кролика по схеме: по 100 мкг белка в 1-й, 22-й и 43-й день. Антисыворотку тестировали на 53-й день эксперимента методами ELISA и Вестерн-блоттинга (фиг. 10 и 11). Пример 7. Определение содержания белка J-пептида в нормальных и опухолевых тканях. Белки из образцов опухолевых и нормальных тканей, предварительно измельченных в жидком азоте,экстрагируют тремя объемами лизирующего буфера (1% Нонидет Р-40; 0,2 % дезоксихолат Na; 50 мМTris-HCl, рН 7,5; 0,1M NaCl; 1 мМ ЭДТА; 1 мМ ЭГТА; 10 мМ NaF; 1 мМ Na3VO4; 0,5 мМ NaPPi; 10 мкг/мл апротинин; 10 мкг/мл леупептин и 1 мМ AEBSF). Тканевые гомогенаты обрабатывают ультразвуком,после чего образцы центрифугируют (17000 об./мин, 30 мин при 4 С). Надосадочную жидкость отбирают и определяют концентрацию белка с помощью набора реактивов ВСА Protein Assay Kit (Pierce, США). Для гель-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) готовят белковые образцы с конечной концентрацией белка 1,25 мг/мл, используя стандартный буфер: 1% SDS; 50 мМ Tris-HCl, рН 6,8; 5% меркаптоэтанол и 10% глицерин. После окончания гель-электрофореза белки окрашивают в геле красителем Coomassie Brilliant Blue G250 (фирма Bio-Rad, США). Для проведения Вестерн-блот-анализа разделенные в полиакриламидном геле белки переносят на PVDF мембрану с использованием электрофоретической ячейки фирмы Novex (США). Мембрану обрабатывают первичными антителами к J-пептиду (полученными при иммунизации кролика, разведение 1:1000) или -актину (разведение 1:1000, Actin(C-2): sc-8432, Santa Cruz Biotechnology,Inc., США). Затем мембрану обрабатывают коньюгированными с пероксидазой вторичными антителами к белкам сыворотки кролика в случае J-пептида (разведение 1:10000, Goat Anti-Rabbit IgG HRP conjugate,Santa Cruz Biotechnology, Inc., США) или мыши в случае -актина (разведение 1:1000, Goat Anti-MouseIgG HRP conjugate, Santa Cruz Biotechnology, Inc., США) и выявляют J-пептид на мембране с помощью пероксидазного субстрата (ТМВ Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase, Promega, США). Содержание J-пептида на мембране для образцов нормальных тканей определяют с помощью программы Gel-ProAnalyzer 3.1, используя препарат рекомбинантного J-пептида в качестве контрольного белка с задаваемой концентрацией. Эту же аналитическую программу используют для сравнения относительных уровней J-пептида и -актина в образцах нормальных и опухолевых тканей. Было проанализировано 26 пар образцов белковых экстрактов, полученных из нормальных и опухолевых тканей пациентов с плоскоклеточным раком и аденокарциномой легких. Независимо от области локализации и стадии заболевания в низкодифференцированных формах опухоли наблюдали понижение уровня J-пептида. Исключение составила группа с центральной локализацией высокодифференцированной опухоли, в которой для половины пар образцов не наблюдали изменений в синтезе J-пептида, а оставшиеся образцы поровну распределились между вариантами регуляции. На основании этих результатов можно предположить, что низкодифференцированная форма опухоли является более регулируемой, а трансформированные клетки в этом случае легче воспринимают внешние метаболические сигналы, тогда как опухоль, содержащая высокодифференцированные клетки, находится в изолированном, более стабильном состоянии. Все патенты, публикации, научные статьи, и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем ссылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем ссылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде. Конкретные дифференциально экспрессируемые гены, применения, используемые материалы и методы, описанные здесь, относятся к предпочтительным вариантам осуществления, приведены в качестве примеров и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. При изучении этого описания другие объекты, аспекты и воплощения будут приходить в голову специалистам в данной области, и- 14010352 они охватываются рамками данного изобретения. Специалистам в данной области будет понятно, что различные замены и модификации могут быть произведены в отношении описанного здесь изобретения без отклонения от его объема и рамок, которые определяются прилагаемой формулой изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ дифференциального анализа протеомов в различных типах клеток организма или в одном типе клеток при различных условиях, включающий: а) получение набора дифференциальных транскриптов, представленность которых в одном типе клеток отличается от представленности в другом типе клеток или представленность которых в клетках одного типа при различных условиях отличается; б) определение последовательности дифференциальных транскриптов; в) синтез дифференциальных белков, соответствующих дифференциальным транскриптам, или их фрагментов; г) получение агентов, взаимодействующих с указанными дифференциальными белками или их фрагментами с высокой аффинностью и специфичностью; д) определение и сравнение белковых профилей для различных типов клеток или одного типа клеток при различных условиях с использованием указанных агентов. 2. Способ по п.1, который в случае известности последовательности генома организма дополнительно включает определение полной последовательности дифференциально экспрессирующихся генов и их аналогов, соответствующих полученным дифференциальным транскриптам, путем сопоставления последовательности кДНК/фрагмента кДНК с известной последовательностью генома организма с использованием методов биоинформатики. 3. Способ по п.1, в котором клетки являются клетками организма млекопитающего. 4. Способ по п.3, где организмом является человек. 5. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий оценку диагностической и терапевтической перспективности дифференциальных белков. 6. Способ по п.1, в котором получение набора дифференциальных транскриптов осуществляют с использованием методов вычитающей гибридизации. 7. Способ по п.1, в котором получение набора дифференциальных транскриптов осуществляют с использованием ДНК-микрочипа. 8. Способ по п.1, в котором синтез дифференциальных белков или их фрагментов осуществляют методами генетической инженерии. 9. Способ по п.1, в котором синтез дифференциальных белков или их фрагментов осуществляют химическими методами. 10. Способ по п.1, в котором синтез дифференциальных белков или их фрагментов осуществляют методами бесклеточного синтеза белка. 11. Способ по п.1, в котором клетки одного из типов являются нормальными, а клетки другого типа являются измененными вследствие наследственных или приобретенных патологий, включая опухолевую трансформацию. 12. Способ по п.11, в котором клетки, измененные вследствие опухолевой трансформации, являются клетками плоскоклеточного рака легких или клетками рака пищевода человека. 13. Способ по п.1, в котором указанные агенты представляют собой поли- или моноклональные антитела, или ДНК- или РНК-аптамеры. 14. Способ по п.1, в котором для определения белкового профиля указанные агенты используют в виде микрочипа, представляющего собой подложку с иммобилизованными на ней указанными агентами. 15. ДНК-микрочип для анализа дифференциальных транскриптов, представляющий собой подложку с иммобилизованными на ней изолированными олигонуклеотидами, последовательности которых соответствуют или комплементарны специфичным фрагментам последовательностей дифференциальных транскриптов, полученных на стадии а) способа по п.1. 16. ДНК-микрочип по п.15, предназначенный для характеристики и классификации опухолей на уровне транскрипции. 17. Изолированный белок, дифференциально представленный в различных типах клеток или в одном типе клеток при различных условиях, полученный путем осуществления стадий а)-в) способа по п.1,или его фрагмент. 18. Агент, способный специфически взаимодействовать с белком, дифференциально представленным в различных типах клеток или в одном типе клеток при различных условиях, или его фрагментом,полученный путем осуществления стадий а)-г) способа по п.1. 19. Агент по п.18, представляющий собой поли- или моноклональное антитело, или ДНК- или РНКаптамер. 20. Агент по любому из пп.18 и 19, используемый в качестве терапевтического/профилактического лекарственного средства.- 15010352 21. Агент по любому из пп.18 и 19, используемый в качестве диагностического средства. 22. Микрочип для дифференциального анализа протеомов в различных типах клеток или в одном типе клеток при различных условиях, представляющий собой подложку с иммобилизованными на ней агентами по любому из пп.18, 19 и 21. 23. Набор для диагностики заболевания, прогноза его лечения и выработки терапевтических рекомендаций, содержащий по меньшей мере один агент по любому из пп.18, 19 и 21 и/или по меньшей мере один изолированный олигонуклеотид, специфически гибридизующийся с дифференциальным транскриптом, где последовательность олигонуклеотида соответствует или комплементарна специфичному фрагменту последовательности дифференциального транскрипта, определенной на стадии б) способа по п.1.