Антитела против cd3 и способы их применения

010350 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение, в общем, относится к полностью человеческим антителам против CD3, а также к способам их применения. Предществующиий уровень техники Иммунная система организма служит в качестве защиты против различных состояний, включая, например, травму, инфекцию и неоплазию, и опосредована двумя отдельными, но взаимосвязанными системами, клеточной и гуморальной иммунной системами. В общем, гуморальная система опосредована растворимыми продуктами, называемыми антителами или иммуноглобулинами, которые способны соединяться с продуктами, распознаваемыми системой как чужеродные для организма, и нейтрализовать их. В отличие от этого, клеточная иммунная система вовлекает мобилизацию особых клеток, называемых Т-клетками, которые выполняют различные терапевтические роли. Иммунная система людей и животных включает в себя два основных класса лимфоцитов: клетки тимусного происхождения (Т-клетки) и клетки костно-мозгового происхождения (В-клетки). Зрелые Тклетки выходят из тимуса и циркулируют в тканях, лимфатической системе и кровяном русле. Т-клетки проявляют иммунологическую специфичность и непосредственно вовлечены в клеточноопосредованные иммунные реакции (такие как отторжение транплантата). Т-клетки действуют против различных чужеродных структур (антигенов) или в ответ на их появление. Во многих случаях данные чужеродные антигены экспрессируются на клетках хозяина в результате инфекции. Однако чужеродные антигены также могут происходить от самого хозяина, измененного неоплазией или инфекцией. Хотя Тклетки сами не секретируют антитела, они обычно требуются для секреции антител вторым классом лимфоцитов, В-клетками. Имеются различные субпопуляции Т-клеток, которые, в общем, определяются антигенными детерминантами, находящимися на их клеточных поверхностях, а также функциональной активностью и распознаванием чужеродного антигена. Некоторые субпопуляции Т-клеток, такие как CD8+ клетки, являются киллерными/супрессорными клетками, которые играют регуляторную функцию в иммунной системе,тогда как другие, такие как CD4+ клетки, служат для стимуляции воспалительных и гуморальных реакций. Переход в митоз человеческих периферических Т-лимфоцитов может стимулироваться различными агентами, включая чужеродные антитела, моноклональные антитела и лектины, такие как фитогемагглютинин и конканавалин А. Хотя активация преимущественно происходит за счет связывания митогенов в специфических участках на клеточных мембранах, природа данных рецепторов и механизм их активации не вполне выяснены. Индукция пролиферации является только одним признаком активации Т-клеток. Другие признаки активации, определенной как изменения фонового или покоящегося состояния клетки,включают в себя повышение продукции цитокинов и активности цитотоксических клеток. Активация Т-клеток является комплексным феноменом, который зависит от участия различных молекул клеточной поверхности, экспрессированных на отвечающей популяции Т-клеток. Например, антигенспецифичный Т-клеточный рецептор (TcR) состоит из связанного дисульфидными связями гетеродимера, содержащего две клонально распределенных интегральных мембранных цепи гликопротеинов,альфа и бета ( и ), или гамма и дельта ( и 5), нековалентно ассоциированных с комплексом инвариантных белков с низкой молекулярной массой, обычно обозначаемых как CD3 (ранее обозначаемых как Т 3). Альфа- и бета-цепи TcR определяют специфичность антигена. Структуры CD3 представляют добавочные молекулы, являющиеся элементами трансдукции сигналов активации, инициированных после связывания TcR альфа-бета (TcR ) со своим лигандом. Имеются обе константных области гликопротеиновых цепей TcR, и вариабельные области (полиморфизмы). Полиморфные вариабельные областиTcR определяют субпопуляции Т-клеток с различной специфичностью. В отличие от антител, которые распознают целые или более малые фрагменты антигена, комплекс TcR взаимодействует только с малым пептидом антигена, который должен презентироваться в контексте молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС). Молекулы МНС представляют другой, высокополиморфный набор молекул, случайно распределенных по виду. Так, активация часто требует тройного взаимодействия TcR и чужеродного пептидного антигена, связанного с основными белками МНС. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к полностью человеческим моноклональным антителам, направленным против CD3. Примеры моноклональных антител включают в себя описанные здесь 28F11, 27 Н 5,23F10 и 15 С 3. Альтернативно, моноклональное антитело представляет собой антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и 28F11, 27 Н 5, 23F10 или 15 С 3. Данные антитела, соответственно, обозначаются здесь как антитела huCD3. Антитело huCD3 имеет одну или несколько следующих характеристик: антитело связывается с CD3-положительными (CD3+) клетками, но не с CD3-отрицательными(CD3-) клетками; антитело huCD3 индуцирует антигенную модуляцию с вовлечением изменения (например, снижения) уровня экспрессии на клеточной поверхности или активность CD3 или Т-клеточного рецептора (TcR); антитело huCD3 ингибирует связывание мышиного моноклонального антитела ОКТ 3-1 010350 против человеческого белка с Т-лимфоцитами; или антитело huCD3 связывает эпитоп CD3, который полностью или частично включает в себя аминокислотную последовательность EMGGITQTPYKVSISGT(SEQ ID NO:21). Антитела huCD3 по изобретению конкурируют с мышиным антителом против CD3 ОКТ 3 за связывание с CD3, и воздействие антитела huCD3 удаляет или маскирует CD3 и/или TcR без воздействия на экспрессию на клеточной поверхности CD2, CD4 или СВ 8. Маскировка CD3 и/или TcR приводит к потере или снижению активации Т-клеток, что требуется при аутоиммунных заболеваниях,где происходит бесконтрольная активация Т-клеток. Отрицательная регуляция CD3 приводит к пролонгированному эффекту сниженной активации Т-клеток, например, на период, по меньшей мере, нескольких месяцев, по сравнению с преходящей супрессией, наблюдаемой с использованием традиционного иммуносупрессорного агента, например циклоспорина. Антигенное модулирование относится к перераспределению и элиминации комплекса CD3-Тклеточный рецептор на поверхности клетки, например лимфоцита. Снижение уровня экспрессии на клеточной поверхности или активности TcR на клетки означает, что количество или функция TcR снижены. Модулирование уровня экспрессии на клеточной поверхности или активности CD3 означает, что количество CD3 на клеточной поверхности или функция CD3 изменена, например снижена. Количество CD3 или TcR, экспрессированного на плазматической мембране клетки, снижается, например, интернализацией CD3 или TcR после контакта клетки с антителом huCD3. Альтернативно, после контакта клетки с антителом huCD3 CD3 или TcR маскируются. Ингибирование связывания мышиного моноклонального антитела ОКТ 3 против человеческого белка с Т-лимфоцитом определяется снижением способности мышиного антитела ОКТ 3 образовывать комплекс с CD3 на клеточной поверхности Т-лимфоцита. Антитело huCD3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 6, 10 или 22, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 8, 16-20 или 25-26. Предпочтительно, три CDR тяжелой цепи включают в себя аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90, 92, 95, 97 98,99% или более идентичности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей изAIWYNGRKQDYADSVKG (SEQ ID NO:44), и три CDR легкой цепи включают в себя аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90, 92, 95, 97, 98, 99% или более идентичности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательностиNO: 46) и QQFNSYPIT (SEQ ID NO: 47). Антитело связывает CD3. Антитело huCD3 по изобретению характеризуется по меньшей мере двумя или более (т.е. двумя или более, тремя или более, четырьмя или более, пятью или более, шестью или более, семью или более,восемью или более, девятью или более, десятью или более, одиннадцатью или более) из следующих характеристик: антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), кодируемую генной последовательностью человеческой зародышевой линии DP50 VH или последовательностью нуклеиновой кислоты, гомологичной генной последовательности человеческой зародышевой линии DP50 VH; антитело содержит вариабельную область легкой цепи (VL), кодируемую генной последовательностью человеческой зародышевой линии L6 VL или последовательностью нуклеиновой кислоты, гомологичной генной последовательности человеческой зародышевой линии L6 VL; антитело содержит VL, кодируемую генной последовательностью человеческой зародышевой линии L4/18a VL или последовательностью нуклеиновой кислоты, гомологичной генной последовательности человеческой зародышевой линии L4/18a VL; антитело включает в себя область CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность YGMH (SEQID NO: 58); антитело включает в себя область CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность DSVKG (SEQ ID NO: 59); область CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательностьIWYX1GX2X3X4X5YX6DSVKG (SEQ ID NO: 60); область CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность XAXBGYXCXDFDXE (SEQ ID NO: 61); область CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность GTGYNWFDP (SEQ ID NO: 62) или аминокислотную последовательностьQMGYWHFDL (SEQ ID NO: 63); антитело включает в себя аминокислотную последовательность VTVSS(SEQ ID NO: 64) в положении, которое является С-концевым по отношению к CDR3-области, где положение, которое является С-концевым по отношению к CDR3-области, входит в вариабельную область; антитело включает в себя аминокислотную последовательность GTLVTVSS (SEQ ID NO: 65) в положении, которое является С-концевым по отношению к CDR3-области, где положение, которое является Сконцевым по отношению к CDR3-области, входит в вариабельную область; антитело включает в себя аминокислотную последовательность WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66) в положении, которое является С-концевым по отношению к CDR3-области, где положение, которое является С-концевым по отношению к CDR3-области, входит в вариабельную область; антитело связывается с эпитопом, который час-2 010350 тично или полностью включает в себя аминокислотную последовательность EMGGITQTPYKVSISGT(SEQ ID NO: 67); и антитело включает в себя мутацию в тяжелой цепи в аминокислотном остатке в положении 234, 235, 265 или 297 или в их сочетаниях, и где высвобождение цитокинов из Т-клетки в присутствии указанного антитела снижено по сравнению с высвобождением цитокинов из Т-клетки в присутствии антитела, которое не включает в себя мутацию в тяжелой цепи в положении 234, 235, 265 или 297, или в их комбинации. Нумерация описанных здесь остатков тяжелой цепи соответствует индексуEU (см. Kabat et al., "Proteins of Immunological Interest", US Dept. of HealthHuman Services (1983, как показано, например, в патентах США 5624821 и 5648260, содержание которых полностью включено сюда в качестве ссылки. В некоторых аспектах антитело huCD3 содержит мутацию аминокислот. Мутация находится в константной области. Мутация приводит к образованию антитела, которое имеет измененную эффекторную функцию. Эффекторная функция антитела изменена путем изменения, т.е. повышения или снижения сродства антитела в отношении эффекторной молекулы, такой как Fc-рецептор или компонента комплемента. За счет изменения эффекторной функции антитела возможно контролировать различные аспекты иммунного ответа, например усиление или подавление различных реакций иммунной системы. Например, мутация приводит к получению антитела, которое способно снижать высвобождение цитокина из Тклетки. Например, мутация происходит в тяжелой цепи в аминокислотном остатке 234, 235, 265 или 297 или в их комбинации. Предпочтительно, мутация приводит к появлению остатка аланина в положении 234, 235, 265 или 297, или остатка глутаминовой кислоты в положении 235, или их комбинации. Термин цитокин относится ко всем человеческим цитокинам, известным в данной области, которые связывают внеклеточные рецепторы, экспрессированные на клеточной поверхности, и за счет этого модулируют функцию клетки, включая в качестве неограничивающих примеров IL-2, IFN-гамма, TNF-, IL-4, IL-5,IL-6, IL-9, IL-10 и IL-13. Высвобождение цитокинов может приводить к токсичному состоянию, известному как синдром высвобождения цитокинов (CRS), обычному клиническому осложнению, которое происходит, например,при использовании антитела против Т-клеток, такого как ATG (антитимоцитарный глобулин) и ОКТ 3(мышиное антитело против человеческого CD3). Данный синдром характеризуется интенсивным высвобождением цитокинов, таких как TNF, IFN-гамма и IL-2 в циркуляторное русло. CRS происходит в результате одновременного связывания антител с CD3 (посредством вариабельной области антитела) и сFc-рецепторами и/или рецепторами комплемента (через константную область антитела) на других клетках, с активацией за счет этого Т-клеток с высвобождением цитокинов, которые продуцируют системный воспалительный ответ, характеризующийся гипотензией, повышенной температурой и ознобом. Симптомы CRS включают в себя лихорадку, озноб, тошноту, рвоту, гипотензию и одышку. Таким образом,антитело huCD3 по изобретению содержит одну или несколько мутаций, которые предотвращают опосредованное константной областью тяжелой цепи высвобождение одного или нескольких цитокинов invivo. Полностью человеческие антитела против CD3 по изобретению включают в себя, например, мутацию L234 L235 А 234 Е 235 в Fc-области, так что высвобождение цитокинов после воздействия антителаhuCD3 значительно снижено или отменено (см., например, фиг. 11 А, 11 В). Как описано ниже в примере 4, мутация L234 L235 А 234 Е 235 в Fc-области антител huCD3 по изобретению снижает или отменяет высвобождение цитокинов там, где антитела huCD3 воздействуют на лейкоциты человека, в то время как мутации, описанные ниже, поддерживают значительную способность к высвобождению цитокинов. Например, значительное снижение в высвобождении цитокинов определяется сравнением высвобождения цитокинов после воздействия антитела huCD3, имеющего мутацию L234 L235 А 234 Е 235 в Fc-области, до уровня высвобождения цитокинов после воздействия другого антитела против CD3, имеющего одну или несколько описанных здесь мутаций. Другие мутации в Fc-области включают в себя, например,L234L235A234A235, L235E235, N297A297 и D265A265. Альтернативно, антитело huCD3 кодируется нуклеиновой кислотой, которая включает в себя одну или несколько мутаций, которые замещают остаток нуклеиновой кислоты остатком нуклеиновой кислоты зародышевой линии. Под остатком нуклеиновой кислоты зародышевой линии подразумевается остаток нуклеиновой кислоты, который имеется в природе в гене зародышевой линии, кодирующем константную или вариабельную области. Ген зародышевой линии представляет собой ДНК, находящуюся в зародышевой клетке (т.е. клетке, которой суждено стать яйцеклеткой или сперматозоидом). Мутация зародышевой линии относится к наследуемому изменению конкретной ДНК, которое происходит в зародышевой клетке или в зиготе на стадии единичной клетки, и затем переносится на потомство, например мутация вводится в каждую клетку организма. Мутация зародышевой линии является противоположностью соматической мутации, которая приобретается единичной клеткой организма. В некоторых случаях нуклеотиды в последовательности ДНК зародышевой линии, кодирующей вариабельную область, мутированы (т.е. имеют соматическую мутацию) и замещены другим нуклеотидом. Таким образом, антитела по изобретению включают одну или несколько мутаций, которые замещают нуклеиновую кислоту остатком нуклеиновой кислоты зародышевой линии. Гены антитела зародышевой линии вклю-3 010350 чают, например, DP50 (инвентарный номер: IMGT/EMBL/GenBank/DDBJ:L06618) , L6 (инвентарный номер: IMGT/EMBL/GenBank/DDBJ:X01668) и L4/18a (инвентарный номер: EMBL/GenBank/DDBJ:Z00006). Тяжелая цепь антитела huCD3 происходит из гена V (вариабельной цепи) зародышевой линии, такого как, например, ген зародышевой линии DP50. Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности для гена зародышевой линии DP50 включают, например, последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности, показанные ниже: Антитела huCD3 по изобретению включают в себя область вариабельной тяжелой цепи (VH), кодируемую генной последовательностью VH человеческой зародышевой линии DP50. Последовательность гена VH зародышевой линии DP50 показана, например, в SEQ ID NO: 48 на фиг. 5. Антитела huCD3 по изобретению включают в себя область VH, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% гомологична в отношении последовательности гена VH зародышевой линии DP50. Предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 90,95, 96, 97% гомологична в отношении последовательности гена VH зародышевой линии DP50 и более предпочтительно по меньшей мере 98, 99% гомологична в отношении последовательности гена зародышевой линии VH DP50. VH-область антитела huCD3 имеет по меньшей мере 80% гомологии в отношении аминокислотной последовательности VH-области, кодируемой последовательностью гена VH зародышевой линии DP50. Предпочтительно, аминокислотная последовательность VH-области антитела huCD3 имеет по меньшей мере 90, 95, 96, 97% гомологии в отношении аминокислотной последовательности VHобласти, кодируемой последовательностью гена VH зародышевой линии DP50 и более предпочтительно по меньшей мере 98, 99% гомологии в отношении последовательности, кодируемой последовательностью гена VH зародышевой линии DP50. Антитела huCD3 по изобретению также включают в себя вариабельную область легкой цепи (VL),кодируемую последовательностью гена VL человеческой зародышевой линии L6 или L4/18a. Последовательность гена VL человеческой зародышевой линии L6 показана, например, в SEQ ID NO: 74 на фиг. 6, и последовательность гена VL человеческой зародышевой линии L4/18a показана, например, в SEQ ID NO: 53 на фиг. 7. Альтернативно, антитела huCD3 включают в себя VL-область, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% гомологична в отношении последовательности гена VL человеческой зародышевой линии L6 или L4/18a. Предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты имеет по меньшей мере 90, 95, 96, 97% гомологии в отношении последовательности гена VL зародышевой линии L6 или L4/13a и более предпочтительно по меньшей мере 98, 99% гомологии в отношении последовательности гена VL зародышевой линии L6 или L4/18a. VL-область антитела huCD3 имеет по меньшей мере 80% гомологии в отношении аминокислотной последовательностиVL-области, кодируемой последовательности гена VL зародышевой линии L6 или L4/18a. Предпочтительно, аминокислотная последовательность VL-области антитела huCD3 имеет по меньшей мере 90%,95%, 96%, 97% гомологии в отношении аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью гена VL зародышевой линии L6 или L4/18a и более предпочтительно по меньшей мере 98,99% гомологии в отношении последовательности, кодируемой последовательностью гена VL зародышевой линии L6 или L4/18a. Антитела huCD3 по изобретению имеют, например, частично консервативные аминокислотные последовательности, которые происходят из зародышевой линии DP50. Например, область CDR1 антителCDR2 антител huCD3 включает в себя, например, по меньшей мере, непрерывную аминокислотную последовательность DSVKG (SEQ ID NO: 59). Например, область CDR2 включает в себя непрерывную аминокислотную последовательность IWYX1GX2X3X4X5YX6DSVKG (SEQ ID NO: 60), в которой X1, Х 2,Х 3, Х 4, Х 5 и Х 6 представляют собой любую аминокислоту. Например, X1, X2, Х 3 и Х 4 представляют собой гидрофильные аминокислоты. В некоторых антителах huCD3 по изобретению X1 представляет собой аспарагин или аспарагиновую кислоту, Х 2 представляет собой аргинин или серии, Х 3 представляет собой лизин или аспарагин, Х 4 представляет собой лизин или глутамин, X5 представляет собой аспарагиновую кислоту, аспарагин или тирозин и/или Х 6 представляет собой валин или аланин. Например, областьVIWYDGSKKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 71) и VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 72). Область CDR3 антител huCD3 содержит, например, по меньшей мере одну непрерывную аминокислотную последовательность XAXBGYXCXDFDXE (SEQ ID NO:61), в которой XA, XB, XC, XD и XE представляют собой любую аминокислоту. В некоторых антителах huCD3 по изобретению XA и XB представляют собой нейтральные аминокислоты, XD представляет собой ароматическую аминокислоту и/или XE представляет собой гидрофильную аминокислоту. Например, XA представляет собой глицин или глутамин, XB представляет собой треонин или метионин, XC представляет собой аспарагин или триптофан, XD представляет собой триптофан или гистидин и/или XE представляет собой пролин или лейцин. Например, область CDR3 включает в себя непрерывную аминокислотную последовательность GTGYNWFDP(SEQ ID NO: 62) или непрерывную аминокислотную последовательность QMGYWHFDL (SEQ ID NO: 63). Антитела huCD3 включают в себя каркасную область 2 (FRW2), которая содержит аминокислотную последовательность WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 73). Антитела huCD3 по изобретению включают в себя каркасную область 3 (FRW3), которая содержит аминокислотную последовательностьRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 74). Некоторые антитела huCD3 включают в себя непрерывную аминокислотную последовательностьVTVSS (SEQ ID NO: 64) в положении, которое находится с С-конца относительно CDR3-области. Например, антитело содержит непрерывную аминокислотную последовательность GTLVTVSS (SEQ IDNO: 65) в положении, которое находится с С-конца относительно CDR3-области. Другие антитела huCD3 включают в себя непрерывную аминокислотную последовательность WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66),в положении, которое находится с С-конца относительно CDR3-области. Остаток аргинина в SEQ ID NO: 66 показан, например, в последовательностях VH антитела huCD3 28F11 (SEQ ID NO: 2) и антителаhuCD3 23F10 (SEQ ID NO: 6). В другом аспекте антитело относится к способам лечения, профилактики или ослабления симптома,связанного с иммунитетом нарушения путем введения субъекту антитела huCD3. Субъекту необязательно далее вводят второе средство, неограничивающими примерами которого являются противовоспалительные соединения и иммунодепрессанты. Например, субъектам с диабетом I типа или с латентным аутоиммунным диабетом взрослых (LADA) также вводят второе средство, например GLP-1 или соединение покоящихся бета-клеток (т.е. соединение, которое снижает или иначе ингибирует высвобождение инсулина, например соединение, открывающее калиевые каналы). Подходящие соединения включают в качестве неограничивающих примеров метотрексат, циклоспорин А (включая, например, микроэмульсию циклоспорина), такролимус, кортикостероиды, статины,интерферон-бета, ремикад (инфликсимаб), энбрел (этанерцепт) и гумиру (адалимумаб). Данный субъект страдает или предрасположен к развитию связанного с иммунитетом нарушения,такого как, например, аутоиммунного заболевания или воспалительного нарушения. В другом аспекте изобретение относится к способам введения антитела huCD3 по изобретению субъекту перед, во время и/или после трансплантации органа или ткани. Например, антитело huCD3 по изобретению применяют для лечения или профилактики отторжения после трансплантации органа или ткани. Краткое описание чертежей Фиг. 1 является серией представлений нуклеотидной последовательности и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой цепи и вариабельных областей тяжелой цепи антителаhuCD3 28F11. На фиг. 1 А показана нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а фиг. 1 В представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 1 А, где CDR выделены прямоугольниками. На фиг. 1 С показана нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а фиг. 1D представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 1 С, где CDR выделены прямоугольниками. Фиг. 2 является серией представлений нуклеотидной последовательности и аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой и тяжелой цепи антитела huCD3 23F10, причем фиг. 2 А представляет нуклестидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи,фиг. 2 В представляет аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 2 А, фиг. 2 С представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи, и фиг. 2D представляет аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 2 С. Фиг. 3 является серией представлений нуклеотидной последовательности и аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой и тяжелой цепи антитела huCD3 27H5. Фиг. 3 А представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи; фиг. 3 В представляет аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 3 А; фиг. 3 С представляет пять нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельную область легкой цепи для клона 27 Н 5; фиг. 3D представляет пять аминокислотных последовательностей, кодируемых нуклеотидными последовательностями, показанными на фиг. 3 С; и фиг. 3 Е представляет собой-5 010350 выравнивание пяти легких цепей из клона 27 Н 5, где звездочкав последнем ряду (отмеченная KEY) представляет консервативную аминокислоту в данном столбце; двоеточие (:) в строке KEY представляет консервативную мутацию; и точка (.) в строке KEY представляет полуконсервативную мутацию. Фиг. 4 является серией представлений нуклеотидной последовательности и аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой и тяжелой цепи антитела huCD3 15C3, причем фиг. 4 А представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи,фиг. 4 В представляет аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 4 А, фиг. 4 С представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи для клона 15 С 3, и фиг. 4D представляет аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 4 С. Фиг. 5 представляет собой выравнивание, отображающее вариабельные области тяжелой цепи антител huCD3 15C3, 27 Н 5 и 28F11, а также последовательность зародышевой линии DP-50, соединительную последовательность человеческой тяжелой цепи 5-02 и соединительную последовательность человеческой тяжелой цепи 2. Для каждой последовательности показаны области CDR. Фиг. 6 представляет собой выравнивание, отображающее вариабельные области VKIII 15C3 (вариабельная легкая цепь 1, т.е. VL1) и антитела huCD3 28F11, а также последовательность зародышевой линии L6, человеческую соединительную последовательность каппа 4 и человеческую соединительную последовательность каппа 1. Для каждой последовательности обозначены области CDR. Фиг. 7 представляет собой выравнивание, отображающее вариабельные области VKI 15C3 (вариабельная легкая цепь 1, т.е. VL2) и VL2 антитела huCD3 27H5, а также последовательность зародышевой линии L4/18a, человеческую соединительную последовательность каппа 4 и человеческую соединительную последовательность каппа 5. Для каждой последовательности обозначены области CDR. Фиг. 8 представляет собой выравнивание, отображающее вариабельные области VKII антителаhuCD3 VL1 27 Н 5 и DPK22, а также человеческую соединительную последовательность каппа 5. Для каждой последовательности обозначены области CDR. Фиг. 9 А представляет собой график, на котором показано связывание молекул CD3 на поверхности клеток Jurkat с использованием различных антител против CD3, включая антитела huCD3 28F11,27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 и 15C3VL2 по изобретению. Фиг. 9 В представляет собой график, на котором показана способность различных антител против CD3, включая антитела huCD3 28F11, 27H5VL1,27H5VL2, 15C3VL1 и 15C3VL2 по изобретению, ингибировать связывание мышиного антитела противCD3 ОКТ 3 с CD3-положительными клетками. Фиг. 9 С представляет собой график, на котором показано антигенное модулирование CD3 и TCR с поверхности человеческих Т-клеток периферической крови различными антителами против CD3, включая антитела huCD3 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 и 15C3VL2 по изобретению. Фиг. 9D представляет собой график, на котором показан эффект различных антител против CD3, включая антитела huCD3 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 и 15C3VL2 по изобретению на пролиферацию Т-клеток. Фиг. 10 представляет собой иллюстрацию, на которой показан профиль связывания полностью человеческого моноклонального антитела 28F11 с пептидным чипом, происходящим из аминокислотной последовательности CD3-эпсилон. Фиг. 11 представляет собой серию графиков, на которых показан уровень высвобождения цитокинов после воздействия антитела huCD3 дикого типа 28F11 (28F11WT), мутантного антитела huCD3 28F11, имеющего мутацию L234 L235A234 A235 (28F11AA), и мутантное антитело huCD3 28F11, имеющее мутацию L234 L235A234 E235 (28F11AE) . На фиг. 11 А показан уровень высвобождения TNF-альфа после воздействия данных антител, а фиг. 11 В обозначает уровень высвобождения интерферона-гамма. Подробное описание Настоящее изобретение относится к полностью человеческим моноклональным антителам, специфичным в отношении эпсилон-цепи CD3 (CD3). Антитела соответственно обозначаются здесь как антитела huCD3.CD3 представляет собой комплекс по меньшей мере из пяти мембраносвязанных полипептидов в зрелых Т-лимфоцитах, которые нековалентно ассоциированы друг с другом и с Т-клеточным рецептором. Комплекс CD3 включает в себя цепи гамма, дельта, эпсилон, зета и эта (также обозначенные как субъединицы). Не относящиеся к человеку моноклональные антитела были разработаны против некоторых из данных цепей, например мышиные антитела ОКТ 3, SP34, UCHT1 или 64.1. (см., например, June,et al., J. Immunol. 136: 3945-3952 (1986); Yang, et al., J. Immunol. 137: 1097-1100 (1986); и Hayward, et al.,Immunol. 64:87-92 (1988. Антитела huCD3 по изобретению продуцировали путем иммунизации трансгенных мышей двух линий, мышей HuMab и мышей KM (Medarex, Princeton, Нью-Джерси). Антитела huCD3 по изобретению имеют одну или несколько следующих характеристик: антитело связывается с CD3-положительными (CD3+) клетками, но не с CD3-отрицательными (CD3-) клетками; антитело huCD3 индуцирует антигенную модуляцию с вовлечением изменений уровня экспрессии на клеточной поверхности CD3 или Т-клеточного рецептора (TcR) или антитело huCD3 ингибирует связы-6 010350 вание мышиного моноклонального антитела ОКТ 3 против человеческого белка с Т-лимфоцитами. Антитела huCD3 по изобретению конкурируют с мышиным антителом против CD3 ОКТЗ за связывание сCD3, и воздействие на антитело huCD3 удаляет или маскирует CD3 и/или TcR без воздействия на экспрессию на клеточной поверхности CD2, CD4 или CD8. Маскировка CD3 и/или TcR приводит к потере или снижению активации Т-клеток. Антитела huCD3 по изобретению связываются с CD3, который полностью или частично включает в себя аминокислотные остатки от положения 27 до положения 43 процессированной эпсилонсубъединицы человеческого CD3 (т.е. без лидерной последовательности). Аминокислотная последовательность эпсилон-субъединицы человеческого CD3 показана, например, в инвентарных номерах GenBank NP000724; ААА 52295; Р 07766; А 32069; САА 27516; и ААН 49847. Например, антитело huCD3 связывается с эпитопом CD3, которое полностью или частично включает в себя аминокислотную последовательность EMGGITQTPYKVSISGT (SEQ ID NO: 67). Типовое моноклональное антитело huCD3, которое связывается с данным эпитопом, представляет собой описанное здесь антитело 28F11. Антитело 28F11 включает в себя вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO:2), кодируемую последовательностью нуклеотидной кислоты, показанной ниже в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи(SEQ ID NO: 4), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 3(фиг. 1 А-1D). Аминокислоты, составляющие определяющие комплементарность области (CDR), установленныеChothia et al. 1989, Е. A. Kabat et al., 1991, выделены ниже прямоугольниками (см. также фиг. 1 В и ID и фиг. 5 и 6). (См. Chothia, С, et al., Nature 342: 877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Sequences of Protein of immunological interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government PrintingOffice (1991. CDR тяжелой цепи антитела 28F11 имеют следующие последовательности: GYGMH (SEQID NO: 27), VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 28) и QMGYWHFDL (SEQ ID NO: 29). CDR легкой цепи антитела 28F11 имеют следующие последовательности: RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 30) Антитело 23F10 включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO:6), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной ниже в SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 8), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ IDNO: 7. Аминокислоты, составляющие определяющие комплементарность области (CDR), установленныеChothia et al. 1989, Е. A. Kabat et al., 1991, выделены ниже прямоугольниками (см. также фиг. 2 В, 2D).CDR тяжелой цепи антитела 23F10 имеют следующие последовательности: GYGMH (SEQ ID NO: 27),VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 28) и QMGYWHFDL (SEQ ID NO: 29). CDR легкой цепи антитела 23F10 имеют следующие последовательности: RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 30), DASNRAT (SEQ Антитело 27 Н 5 включает в себя вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO:10), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной ниже в SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей, показанных ниже в SEQ ID NO: 1620, и кодируемых последовательностями нуклеиновой кислоты, показанными в SEQ ID NO: 11-15. Как описано здесь в примере 2, гибридома одного клона, выделенная из трансгенных мышей HuMAb, может продуцировать много легких цепей из единичной тяжелой цепи. Каждая продуцируемая комбинация тяжелых или легких цепей тестируется на оптимальное функционирование, как описано в примере 2. Аминокислоты, составляющие определяющие комплементарность области (CDR), установленныеChothia et al. 1989, Е. A. Kabat et al., 1991, выделены ниже прямоугольниками (см. также фиг. 3 В, 3D, 5 и 7-8). CDR тяжелой цепи антитела 27 Н 5 имеют следующие последовательности: SYGMH (SEQ ID NO: 33), IIWYDGSKKNYADSVKG (SEQ ID NO: 34) и GTGYNWFDP (SEQ ID NO: 35). CDR легкой цепи антитела 27 Н 5 имеют следующие последовательности: RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 36); GASSRAT Антитело 15 С 3 включает в себя вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 22), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной ниже в SEQ ID NO: 21, и вариабельную область-9 010350 легкой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей, показанных ниже в SEQ ID NO: 25-26 и кодируемых последовательностями нуклеиновой кислоты, показанными в SEQ ID NO: 23-24. Как описано здесь в примере 2, гибридома одного клона, выделенная из трансгенных мышей HuMAb, может продуцировать много легких цепей из единичной тяжелой цепи. Каждая продуцируемая комбинация тяжелых или легких цепей тестируется на оптимальное функционирование, как описано в примере 2. Аминокислоты, составляющие определяющие комплементарность области (CDR), установленныеChothia et al. 1989, Е. A. Kabat et al., 1991, выделены ниже прямоугольниками (см. также фиг. 4 В, 4D и 57). CDR тяжелой цепи антитела 15 С 3 имеют следующие последовательности: SYGMH (SEQ ID NO: 33),AIWYNGRKQDYADSVKG (SEQ ID NO: 44) и GTGYNWFDP (SEQ ID NO: 35). CDR тяжелой цепи антитела 15C3 имеют следующие последовательности: RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 30); DASNRAT (SEQ ID Антитела huCD3 по изобретению также включают в себя антитела, которые включают вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90, 92, 95, 97, 98,99% или более идентична в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 6, 10 или 22,и/или вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 90,92, 95, 97 98, 99% или более идентична в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4,8, 16-20 или 25-26. Альтернативно, моноклональное антитело представляет собой антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и 28F11, 27 Н 5, 23F10 или 15C3. Кроме определенных иначе случаев, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют значения, которые обычно подразумеваются обычными специалистами в данной области. Далее, кроме случаев, когда контекст требует иного, термины в единственном числе включают в себя множественное число, и термины во множественном числе включают в себя единственное число. В общем, описанные здесь номенклатуры и способы, используемые в связи с клеточной и тканевой культурой, молекулярной биологией и химией белков и олиго- или полинуклеотидов и гибридизации, соответствуют хорошо известным и обычно используемым в данной области. Стандартные способы используют для рекомбинантной ДНК, синтеза олигонуклеотидов и культуры ткани и трансформации (т.е. электропорации, липофекции). Ферментативные реакции и способы очистки проводят по спецификациям производителя или как это обычно выполняется в данной области и описано здесь. Сле- 10010350 дующие способы и процедуры, в общем, проводят обычными способами, хорошо известными в данной области и описанными в различных общих и более специфичных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в данной спецификации. См., например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989. Описанные здесь номенклатуры, лабораторные процедуры и способы, используемые в связи с аналитической химией, химией органического синтеза, и медицинской и фармацевтической химией, соответствуют хорошо известным и обычно используемым в данной области. Для химического синтеза, химического анализа, получения и доставки фармацевтических препаратов и лечения пациентов используют стандартные способы. Используемые в соответствии с настоящим описанием следующие термины, кроме указанных иначе случаев, следует понимать как имеющие следующее значение. Используемый здесь термин антитело относится к иммуноглобулиновым молекулам и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулина (Ig), т.е. молекул, которые содержат антигенсвязывающий участок, специфично связывающий антиген (иммунно взаимодействующий с ним). Такие антитела включают в себя в качестве неограничивающих примеров поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные, Fab, Fab' и F(ab')2 и экспрессионную библиотеку Fab. Под специфичным связыванием и иммунным взаимодействием подразумевается, что антитело взаимодействует с одной или несколькими антигенными детерминантами требуемого антигена и не взаимодействует (т.е. не связывается) с другими полипептидами или связывается с ними с намного меньшим сродством (Kd10-6) с другими полипептидами. Основная структурная единица антитела, как известно, включает в себя тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну легкую (примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (примерно 50-70 кДа). N-концевая часть каждой цепи включает в себя вариабельную область примерно из 100-110 или более аминокислот, непосредственно ответственных за распознавание антитела. С-концевая часть каждой цепи определяет константную область, в первую очередь, ответственную за эффекторную функцию. Человеческие легкие цепи классифицируются как легкие цепи каппа и лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgA и IgE соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельные и константные области соединены J-областью размером примерно 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также включает в себя D-область длиной примерно 10 или более аминокислот. В общем, см. Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ea., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989. Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь образуют связывающий участок антитела. Используемый здесь термин моноклональное антитело (MAb) или композиция моноклонального антитела относится к популяции молекул антитела, которые содержат молекулы только одного вида антитела, состоящие из уникального продукта гена легкой цепи и уникального продукта гена тяжелой цепи. В частности, определяющие комплементарность области (CDR) моноклонального антитела идентичны в отношении всех молекул популяции. MAb содержат антигенсвязывающий участок, способный к иммунному взаимодействию с конкретным эпитопом антигена, характеризующийся уникальным сродством связывания с ним. В общем, молекулы антитела, полученные от людей, относятся к любому из классов IgG, IgM, IgA,IgE и IgD, которые отличаются один от другого природой тяжелой цепи, присутствующей в молекуле. Конкретные классы имеют также подклассы, такие как IgG1, IgG2 и другие. Более того, у людей легкая цепь может представлять собой каппа-цепь или лямбда-цепь . Термин антигенсвязывающий участок или связывающая часть относится к части иммуноглобулиновой молекулы, которая участвует в связывании антигена. Антигенсвязывающий участок образован аминокислотными остатками N-концевых вариабельных (V) областей тяжелых (Н) и легких(L) цепей. Три высокодивергентных участка в V-областях тяжелой и легкой цепей, обозначенные как гипервариабельные области, расположены между более консервативными фланкирующими участками, известными как каркасные области или FR. Таким образом, термин FR относится к аминокислотным последовательностям, которые находятся в природе между гипервариабельными областями в иммуноглобулинах и прилегают к ним. В молекуле антитела три гипервариабельных области легкой цепи и три гипервариабельных области тяжелой цепи расположены друг относительно друга в трехмерном пространстве с образованием антигенсвязывающей поверхности. Антигенсвязывающая поверхность комплементарна трехмерной поверхности связывающего антигена, и три гипервариабельных области каждой из тяжелых и легких цепей обозначены как определяющие комплементарность области илиCDR. Нумерация аминокислот каждого домена проводится в соответствии с определениями Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991,или ChothiaLesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342: 878-883 (1989). Используемый здесь термин эпитоп включает в себя любую белковую детерминанту, способную специфично связываться с иммуноглобулином, scFv или Т-клеточным рецептором. Термин эпитоп включает в себя любую белковую детерминанту, способную к специфичному связыванию с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных группировок молекул, таких как аминокислотные или сахарные боковые цепи, и обычно имеют спе- 11010350 цифичные трехмерные структурные характеристики, а также специфичные характеристики заряда. Говорят, что антитело специфично связывается с антигеном, когда константа диссоциации составляет 1 мкМ; предпочтительно 100 нМ и наиболее предпочтительно 10 нМ. Используемые здесь термины иммунологическое связывание и свойства иммунологического связывания относятся к нековалентным взаимодействиям того типа, который происходит между иммуноглобулиновой молекулой и антигеном, в отношении которого иммуноглобулин является специфичным. Сила или сродство взаимодействий иммунологического связывания может выражаться в виде константы диссоциации (Kd) взаимодействия, причем более низкая Kd означает более сильное сродство. Свойства иммунологического связывания выбранных полипептидов подвергают количественному анализу с использованием способов, хорошо известных в данной области. Один из таких способов включает в себя измерение скорости образования и диссоциации комплекса антигенсвязывающего участка/антигена, где указанные скорости зависят от концентраций партнеров в комплексе, сродства взаимодействия, геометрических параметров, которые в равной степени влияют на скорость в обоих направлениях. Таким образом, константа скорости прямой реакции (Kon) и константа скорости обратной реакции (Koff) могут определяться расчетом концентраций и истинных скоростей ассоциации и диссоциации(см. Nature 361:186-87 (1993. Отношение Koff/Kon обеспечивает отмену всех параметров, не связанных со сродством, и равно константе диссоциации Kd. (В общем, см. Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59: 439-473). Говорят, что антитело по настоящему изобретению специфично связывается с эпитопомCD3, когда равновесная константа связывания (Kd) составляет 1 мкМ, предпочтительно 100 нМ, более предпочтительно 10 нМ и наиболее предпочтительно от 100 пМ примерно до 1 пМ, что измеряется такими анализами, как анализы связывания радиоактивного лиганда, известные специалистам в данной области. Специалистам в данной области понятно, что возможно определить без излишнего экспериментирования, имеет ли человеческое моноклональное антитело ту же специфичность, что и человеческое моноклональное антитело по изобретению (например, моноклональное антитело 28F11, 27 Н 5, 23F10 или 15 С 3) путем установления того, препятствует ли первое связыванию второго с антигенным полипептидом CD3. Если тестируемое человеческое моноклональное антитело конкурирует с человеческим моноклональным антителом по изобретению, что показано снижением связывания человеческого моноклонального антитела по изобретению, то два моноклональных антитела связываются с одним и тем же или близкородственным эпитопом. Другой путь определения того, имеет ли человеческое моноклональное антитело специфичность человеческого моноклонального антитела по изобретению, состоит в предварительной инкубации человеческого моноклонального антитела по изобретению с антигенным полипептидом CD3, с которым оно обычно взаимодействует, и последующем добавлении тестируемого человеческого моноклонального антитела для определения того, ингибируется ли способность тестируемого человеческого антитела связывать антигенный полипептид CD3. Если тестируемое человеческое моноклональное антитело ингибируется, то, по всей вероятности, оно имеет ту же, или функционально эквивалентную, эпитопную специфичность, что и моноклональное антитело по изобретению. Различные процедуры, известные в данной области, используются для продукции моноклональных антител, направленных против белка, такого как белок CD3, или против его производных, фрагментов,аналогов, гомологов или ортологов (см., например, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and LaneD, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, что включено сюда в качестве ссылки). Полностью человеческие антитела представляют собой молекулы антитела, в которых вся последовательность легкой цепи или тяжелой цепи, включая CDR, происходит из человеческих генов. Такие антитела называются здесь человеческие антитела или полностью человеческие антитела. Человеческие моноклональные антитела получают, например, с использованием процедур, описанных здесь в примере 1. Человеческие моноклональные антитела также получают с использованием способа триомы; способа человеческой В-клеточной гибридомы (см. Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72) и способаEBV-гибридомы для продукции человеческих моноклональных антител (см. Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Человеческие моноклональные антитела могут использоваться и могут продуцироваться с использованием человеческих гибридом (см. Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) или путем трансформации человеческих В-клеток вирусом Эпштейн-Барр in vitro (см. Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIESAND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Антитела очищают хорошо известными способами, такими как хроматография с использованием белка А или белка G, которые предоставляют в основном фракцию IgG иммунной сыворотки. Впоследствии или специфичный антиген, который относится к искомому иммуноглобулину, или, альтернативно,его эпитоп, может иммобилизоваться на колонке для очистки иммуноспецифичного антитела путем иммуноаффинной хроматографии. Очистка иммуноглобулинов обсуждается, например, D. Wilkinson (TheScientist, опубликовано The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28). Когда требуется модифицировать антитело по изобретению в плане эффекторной функции, усиливается, например, эффективность антитела в лечении связанных с антителом заболеваний. Например, вFc-область вводят остаток(ки) цистеина, обеспечивая таким образом образование дисульфидной связи в данной области. Гомодимерное антитело, полученное таким образом, может характеризоваться улучшенной способностью к интернализации и/или повышенной опосредованной комплементом гибелью клеток и антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) (см. Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) и Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992. Альтернативно, может конструироваться антитело, которое имеет двойные Fc-области и за счет этого могут характеризоваться усиленным лизисом комплемента и способностями ADCC (см. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230(1989. Изобретение также относится к Fv, Fab, Fab' и F(ab')2 фрагментам huCD3, к одноцепочечным антителам huCD3, биспецифическим антителам huCD3 и антителам-гетероконъюгатам huCD3. Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые имеют специфичность связывания по меньшей мере для двух различных антигенов. В настоящем случае необходимо, чтобы одна из связывающих специфичностей соответствовала CD3. Вторая связывающая мишень представляет собой другой антиген, и преимуществом является белок клеточной поверхности, или рецептор, или субъединица рецептора. Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционно, рекомбинантная продукция биспецифических антител основана на совместной экспрессии двух пар иммуноглобулиновой тяжелой цепи/легкой цепи, где тяжелые цепи имеют различную специфичность (Milstein andCuello, Nature, 305:537-539 (1983. По причине случайного ассортимента иммуноглобулиновых легких и тяжелых цепей, данные гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь десяти различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифичную структуру. Очистка правильной молекулы обычно выполняется путем стадий аффинной хроматографии. Сходные процедуры описаны в WO 93/08829, опубликованной 13 мая 1993 г., и в Traunecker et al., EMBO J. , 10: 3655-3659(1991). Вариабельные домены антитела с требуемой специфичностью связывания (участки комбинации антитело-антиген) могут подлежать слиянию с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Слияние предпочтительно происходит с константными доменами тяжелой цепи иммуноглобулина,включающего в себя по меньшей мере часть шарнира, области СН 2 и СН 3. Предпочтительно иметь первую константную область (СН 1) тяжелой цепи, содержащую участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующий по меньшей мере в одном из продуктов слияния. ДНК, кодирующие продукты слияния иммуноглобулиновой тяжелой цепи и, если требуется, иммуноглобулиновой легкой цепи,встраивают в отдельные экспрессирующие векторы и совместно трансфицируют в подходящий организм хозяина. Для дальнейших подробностей по получению биспецифических антител см., например, Sureshet al. , Methods in Enzymology, 121:210 (1986). Согласно другому подходу, описанному в WO 96/27011, поверхность взаимодействия между парой молекул антител может конструироваться с целью максимизации процента гетеродимеров, которые получают из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная поверхность взаимодействия включает в себя по меньшей мере часть области СН 3 константного домена антитела. В данном способе одна или несколько малых аминокислотных боковых цепей поверхности взаимодействия первой молекулы антител замещают более объемными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). Компенсаторные полости идентичного или сходного размера, что и крупная(ые) боковая(ые) цепь(и), формируют на поверхности второго антитела замещением крупных аминокислотных боковых цепей на менее объемные (например, аланин или треонин). Это обеспечивает механизм повышения выхода гетеродимера над другими ненужными конечными продуктами, такими как гомодимеры. Биспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab')2 антител). Способы получения биспецифических антител из фрагментов антител описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть получены с использованием химического связывания. Brennan et al., Science 22 9: 81 (1985) описывают процедуру, в которой интактные антитела расщепляют протеолитически с образованием F(ab')2-фрагментов. Данные фрагменты восстанавливают в присутствии образующего комплекс с дитиолом агента арсенита натрия для стабилизации соседних дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных мостиков. Полученные Fab' фрагменты затем преобразуют в производные динитробензоата (TNB). Одно из производных Fab'-TNB затем преобразуют обратно в Fab'-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB с образованием биспецифического антитела. Продуцированные биспецифические антитела могут использоваться в качестве средств для селективной иммобилизации ферментов. Кроме того, Fab'-фрагменты могут быть непосредственно получены из Е. coli и химически связаны с образованием биспецифических антител. Shalaby et al. J. Exp. Med. 175: 217-22 5 (1992) описывают продукцию молекулы полностью гуманизированного биспецифического антитела F(ab')2. Каждый Fab'фрагмент отдельно секретировался из Е. coli и подвергался направленному химическому связыванию invitro с образованием биспецифического антитела. Биспецифическое антитело, образованное таким образом, было способно связываться с клетками, гиперэкспрессировавшими рецептор ErbB2 и с нормальны- 13010350 ми человеческими Т-клетками, а также опосредовать лизисную активность человеческих цитотоксических лимфоцитов против опухолевых клеток-мишеней молочной железы. Также описаны различные способы получения и выделения биспецифических фрагментов антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела могут продуцироваться с использованием лейциновых застежек. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5):1547-1553(1992). Пептиды лейциновой застежки из белков Fos и Jun связывали с Fab'-частями двух различных антител путем слияния генов. Гомодимеры антитела восстанавливали в области шарнира с образованием мономеров и затем обратно окисляли с образованием гетеродимеров антител. Данный способ также может использоваться для продукции гомодимеров антитела. Технология диатела, описанная Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), предоставляет альтернативный механизм получения фрагментов биспецифических антител. Данные фрагменты включают в себя тяжелый домен вариабельной цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) линкером, слишком коротким для обеспечения образования пары двух доменов одной цепи. В соответствии с этим, VH- и VL-домены одного фрагмента принуждают к образованию пары с комплементарными VL- и VH-доменами другого фрагмента, с образованием таким образом двух антигенсвязывающих участков. Другой стратегией получения биспецифических фрагментов антител, о которой имеется сообщение, является применение одноцепочечных димеров Fv (sFv) (см. Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994. Рассматриваются антитела с более чем двумя валентностями. Например, могут быть получены триспецифические антитела (Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991. Типовые биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами, по меньшей мере один из которых происходит из белкового антигена по изобретению. Альтернативно, направленное против антигена плечо иммуноглобулиновой молекулы может комбинироваться с плечом, которое связывает триггерную молекулу на лейкоците, такую как молекула Т-клеточного рецептора (например, CD2, CD3, CD28 или В 7), или Fc-рецепторы для IgG (FcR), например FcRI (CD64), FcRH (CD32) и FcRIII (CD16), так что механизмы клеточной защиты фокусируются на клетке, экспрессирующей конкретный антиген. Биспецифические антитела также могут использоваться для направления цитотоксических агентов на клетки, которые экспрессируют конкретный антиген. Данные антитела имеют антигенсвязывающее плечо и плечо, которое связывает цитотоксический агент или хелатор радионуклида, например EOTUBE, DPTA, DOTA или ТЕТА. Другое интересующее биспецифическое антитело связывает описанный здесь белковый антиген и далее связывает тканевой фактор (TF). Антитела-гетероконъюгаты также относятся к объему настоящего изобретения. Антителагетероконъюгаты составлены из двух ковалентно объединенных антител. Такие антитела, например,предложены для направления клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США 4676980) и для лечения инфекции ВИЧ (WO 91/00360; WO 92/200373; ЕР 03089). Предусмотрено, что антитела могут быть получены in vitro с использованием известных в синтетической химии белка способов, включая те, которые включают в себя перекрестно связанные агенты. Например, иммунотоксины могут конструироваться с использованием реакции обмена дисульфидных мостиков или с образованием тиоэфирной связи. Примеры подходящих для этой цели реагентов включают в себя иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат и те, что описаны, например, в патенте США 4676980. Изобретение также относится к иммуноконъюгатам, включающим в себя антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом, таким как токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибного, растительного, или животного происхождения, или его фрагментов), или радиоактивный изотоп (т.е. радиоактивный конъюгат). Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут использоваться, включают в себя цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагмент дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модекцина, альфасарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII, и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Для продукции радиоконъюгированных антител доступны различные радионуклиды. Примеры включают в себя 212Bi, 131I, 131In, 90Y и 86Re. Конъюгаты антитела и цитотоксического агента получают с использованием различных бифункциональных агентов для связывания белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтиол)пропионат(SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCL), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидо-соединения (такие как бис-(п-азидобензил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис-(п-диазонийбензил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6 диизоцианат) и бис-соединения активного фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например,рициновый иммунотоксин может быть получен, как описано Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (MXDTPA) представляет собой типовой хелатирующий агент для конъюгации радионуклида с антителом (см.- 14010350 Специалистам в данной области понятно, что очень разнообразные возможные радикалы могут присоединяться к полученным в результате антителам или к другим молекулам по изобретению (см.,например, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E.Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989), полное содержание которого включено сюда в качестве ссылки). Связывание осуществляется любой химической реакцией, которая будет связывать две молекулы,при том, что антитело и другой радикал сохраняют соответствующую им активность. Данное связывание может включать в себя многие химические механизмы, например ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркаляцию, координатное связывание и образование комплекса. Предпочтительное связывание, однако, является ковалентным. Ковалентное связывание достигается путем прямой конденсации существующих боковых групп или путем внедрения извне молекул-мостиков. Многие бивалентные или поливалентные связывающие агенты могут использоваться в связывании белковых молекул, таких как антитела по настоящему изобретению, с другими молекулами. Например, репрезентативные связывающие агенты могут включать в себя органические соединения, такие как тиоэфиры, карбодиимиды,сукцинимидные сложные эфиры, диизоцианаты, глутаровый альдегид, диазобензол и гексаметилендиамины. Данный список не предназначен для полного перечисления различных классов связывающих агентов, известных в данной области, но, тем не менее, типичен для более обычных связывающих агентов(см. Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62: 185216 (1982); и Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987. Предпочтительные линкеры описаны в литературеMBS (M-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир), см. также патент США 5030719, в котором описано применение галогенированного производного ацетилгидразида, связанного с антителом путем олигопептидного линкера). В частности, предпочтительные линкеры включают в себя: (i) EDC (1 этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид; (ii) SMPT (4-сукцинимидилокарбонилальфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуол (Pierce Chem. Co., кат.21558G); (iii) SPDP (сукцинимидил 6[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексанат (Pierce Chem. Co., кат. 21651G); (iv) сульфо-LC-SPDPEDC. Описанные выше линкеры содержат компоненты, которые имеют различные признаки, что ведет к образованию конъюгатов с отличающимися физико-химическими свойствами. Например, сульфо-NHSэфиры алкилкарбоксилатов более стабильны, чем сульфо-NHS-эфиры ароматических карбоксилатов.NHS-эфиры, содержащие линкеры, менее растворимы, чем сульфо-NHS-эфиры. Далее, линкер SMPT содержит стерически блокированную дисульфидную связь и может образовывать конъюгаты с повышенной стабильностью. Дисульфидные связи в общем менее стабильны, чем другие связи, поскольку дисульфидная связь расщепляется in vitro, что приводит к меньшей доступности конъюгата. СульфоNHS, в частности, может усиливать стабильность карбодиимидных связей. Карбодиимидные связи (такие как EDC) при использовании с сульфо-NHS образуют сложные эфиры, которые более устойчивы к гидролизу, чем сама по себе карбодиимидная связь. Используемый здесь термин выделенный полинуклеотид означает полинуклеотид геномного происхождения, происхождения из кДНК, или синтетического происхождения, или какую-либо их комбинацию, причем благодаря своему происхождению выделенный полинуклеотид (1) не ассоциирован со всем полинуклеотидом, с которым выделенный полинуклеотид находится в природе, или его частью, (2) функционально связан с полинуклеотидом, который не связан с ним в природе, или (3) не встречается в природе как часть более длинной последовательности. Указанный здесь термин выделенный белок означает белок, происходящий из кДНК, рекомбинантной РНК, или белок синтетического происхождения, или некоторую их комбинацию, причем благодаря своему происхождению или источнику получения выделенный белок (1) не ассоциирован с белками, с которыми он находится в природе, (2) лишен других белков из того же источника, например лишен морских белков, (3) экспрессирован клеткой из другого вида или (4) не встречается в природе. Термин полипептид используется здесь в качестве общего термина для обозначения нативного белка, фрагментов или аналогов полипептидной последовательности. Следовательно, нативные белковые фрагменты и аналоги представляют собой виды полипептидного рода. Предпочтительные полипептиды по изобретению включают в себя человеческие иммуноглобулиновые молекулы тяжелой цепи, представленные на фиг. 1 В, 2 В, 3 В и 4 В, и иммуноглобулиновые молекулы легкой цепи, представленные на фиг. 1D, 2D, 3D и 4D, а также молекулы антитела, образованные комбинацией, включающей в себя иммуноглобулиновые молекулы тяжелой цепи с иммуноглобулиновыми молекулами легкой цепи, такие как иммуноглобулиновые молекулы легкой цепи каппа, и наоборот, а также их фрагменты и аналоги. Используемый здесь термин встречающийся в природе, применяемый к объекту, относится к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может выделяться из источника в природе и которая не была умышленно модифицированной человеком в лаборатории или- 15010350 иначе, является встречающейся в природе. Используемый здесь термин функционально связанный относится к тому, что положения компонентов, описанных таким образом, находятся в отношениях, позволяющих им функционировать в предназначенной им манере. Контрольная последовательность, функционально связанная с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с последовательностями контроля. Используемый здесь термин последовательность контроля относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Природа таких последовательностей контроля отличается в зависимости от организма хозяина в прокариотах, причем такие последовательности контроля в общем включают в себя промотор, участок связывания рибосомы, и последовательность терминации транскрипции у эукариот, в общем, такие последовательности контроля включают в себя промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин последовательность контроля, как подразумевается, включает в себя как минимум все компоненты, присутствие которых существенно для экспрессии и процессинга, и также может включать в себя дополнительные компоненты, присутствие которых предпочтительно, например лидерные последовательности и последовательности партнера слияния. Указанный здесь термин полинуклеотид означает полимерный ряд нуклеотидов по меньшей мере из 10 оснований в длину, рибонуклеотидов, или дезоксирибонуклеотидов, или модифицированной формы каждого типа нуклеотидов. Термин включает в себя одно- или двухцепочечные формы ДНК. Указанный здесь термин олигонуклеотид включает в себя встречающиеся в природе и модифицированные нуклеотиды, связанные друг с другом встречающимися в природе и не встречающимися в природе олигонуклеотидными связями. Олигонуклеотиды представляют собой подмножество полинуклеотидов, в общем включающее в себя в длину 200 оснований или менее. Предпочтительно, олигонуклеотиды составляют от 10 до 60 оснований в длину и наиболее предпочтительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или от 20 до 40 оснований в длину. Олигонуклеотиды обычно являются одноцепочечными, например для зондов, хотя олигонуклеотиды могут быть и двухцепочечными, например для применения в конструкции генного мутанта. Олигонуклеотиды по изобретению представляют собой смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды. Указанный здесь термин встречающиеся в природе нуклеотиды включает в себя дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Указанный здесь термин модифицированные нуклеотиды включает в себя нуклеотиды с модифицированными или замещенными сахарными группами и тому подобным. Указанный здесь термин олигонуклеотидные связи включает в себя олигонуклеотидные связи, такие как фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, фосфороселеноатные, фосфородиселеноатные, фосфороанилотиоатные, фосфороаниладатные, фосфороимидатные, и подобные им (см., например, LaPlanche et al. Nucl.U. S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990. Олигонуклеотид, если требуется, может включать в себя метку для детекции. Указанный здесь термин селективно гибридизоваться означает детектируемо и специфично связываться. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты по изобретению селективно гибридизуются с цепями нуклеиновой кислоты в условиях гибридизации и отмывки, которые минимизируют ощутимые количества детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. Условия высокой жесткости могут использоваться для достижения селективных условий гибридизации, как это известно в данной области и обсуждается здесь. В общем, гомология последовательности нуклеиновой кислоты между полинуклеотидами, олигонуклеотидами и фрагментами по изобретению и интересующей последовательностью нуклеиновой кислоты, составляет по меньшей мере 80% и более, обычно с предпочтительно возрастающими значениями гомологии, равными по меньшей мере 85, 90, 95, 99 и 100%. Две аминокислотные последовательности гомологичны, если имеется частичная или полная идентичность между их последовательностями. Например, 85% гомология означает, что 85% аминокислот идентичны при выравнивании последовательностей на предмет максимального совпадения. Для максимального совпадения последовательностей допускаются пропуски (в одной из двух совпадающих последовательностей) предпочтительно длиной 5 или менее остатков, более предпочтительно 2 или менее остатков. Альтернативно и предпочтительно, две белковые последовательности (или происходящие от них полипептидные последовательности длиной по меньшей мере 30 аминокислот в длину) гомологичны, в применении здесь этого термина, если они имеют коэффициент выравнивания более 5 (в единицах стандартного отклонения), полученный с использованием программы ALIGN с матрицей данных по мутациям и штрафом за пропуск 6 или более (см. Dayhoff, M. О., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972 and Supplement 2 to this volume, pp. 110). Две последовательности или их части более предпочтительно гомологичны, если их аминокислоты идентичны на 50% или более, при оптимальном выравнивании с использованием программы ALIGN. Используемый здесь термин соответствует означает, что полинуклеотидная последовательность- 16010350 гомологична (т.е. идентична, а не строго эволюционно связана) всей последовательности полинуклеотида сравнения или ее части, или что полипептидная последовательность идентична полипептидной последовательности сравнения. В противоположность этому используемый здесь термин комплементарен означает, что комплементарная последовательность гомологична всей последовательности полинуклеотида сравнения или ее части. Для иллюстрации нуклеотидная последовательность ТАТАС соответствует последовательности сравнения ТАТАС и комплементарна последовательности сравненияGTATA. Следующие термины используются для описания отношений последовательностей между двумя или более полинуклеотидными или аминокислотными последовательностями: последовательность сравнения, окно сравнения, идентичность последовательности, процент идентичности последовательности и существенная идентичность. Последовательность сравнения представляет собой определенную последовательность, используемую в качестве основы для сравнения последовательности,причем последовательность сравнения может быть подмножеством более длинной последовательности,например сегментом полноразмерной кДНК или генной последовательности, приведенной в списке последовательностей, или может представлять собой полную последовательность кДНК или генную последовательность. В общем, последовательность сравнения составляет по меньшей мере 18 нуклеотидов или 6 аминокислот в длину, часто по меньшей мере 24 нуклеотида или 8 аминокислот в длину и часто по меньшей мере 48 нуклеотидов или 16 аминокислот в длину. Поскольку две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности могут каждая (1) включать в себя последовательность (т.е. часть полной полинуклеотидной или аминокислотной последовательности), которая сходна между двумя молекулами, и (2) могут далее включать в себя последовательность, которая различается между двумя полинуклеотидными или аминокислотными последовательностями, сравнения последовательностей между двумя(или более) молекулами обычно проводят путем сравнения последовательностей двух молекул в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательности. Используемый здесь термин окно сравнения относится к концептуальному сегменту по меньшей мере 18 следующих друг за другом положений нуклеотидов или 6 аминокислот, в которых полинуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность может сравниваться с последовательностью сравнения по меньшей мере из 18 следующих друг за другом нуклеотидов или 6 аминокислотных последовательностей, и где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может включать в себя дополнения, делеции, замены и тому подобное (т.е. пропуски) в количестве 20% или менее по сравнению с последовательностью сравнения (которая не содержит дополнения или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения может проводиться по алгоритму локальной гомологии Smithand Waterman Adv. Appl: Math. 2: 482 (1981), по алгоритму гомологичного выравнивания Needleman andWunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), по способу поиска сходства Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 85: 2444 (1988), с использованием компьютеризованных реализаций данных алгоритмов (GAP,BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном обеспечении Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Висконсин), Geneworks или MacVector или путем инспекции и выбирают лучшее выравнивание (т.е. в результате которого получают самый высокий процент гомологии в окне сравнения), сгенерированное различными способами. Термин идентичность последовательности означает, что две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности идентичны (т.е. на основе отношения нуклеотида к нуклеотиду или остатка к остатку) в пределах окна сравнения. Термин процент идентичности последовательности рассчитывается путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в пределах окна сравнения, с определением числа положений, в которых в обеих последовательностях случается идентичное основание нуклеиновой кислоты (т.е. А, Т, С, G, U или I) или остаток для получения числа совпадающих положений, причем это число делят на общее число положений в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножают результат на 100 с получением процента идентичности последовательности. Используемый здесь термин существенная идентичность означает характеристику полинуклеотидной или аминокислотной последовательности, где полинуклеотид или аминокислота содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 85-процентную идентичность последовательности, предпочтительно идентичность последовательности по меньшей мере от 90 до 95%, более обычно, идентичность последовательности по меньшей мере 99%, по сравнению с последовательностью сравнения в окне сравнения, равном по меньшей мере 18 нуклеотидным (6 аминокислотным) положениям, часто в окне,равном по меньшей мере 24-48 нуклеотидным (8-16 аминокислотным) положениям, где процент идентичности последовательности рассчитывается путем сравнения последовательности сравнения с последовательностью, которая может включать в себя делеции или добавления, составляющие всего 20% или менее от последовательности сравнения в окне сравнения. Последовательность сравнения может представлять собой подмножество более длинной последовательности. Используемые здесь двадцать обычных аминокислот и их аббревиатуры соответствуют общепринятому применению. См. Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer- 17010350 аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как ,-двухзамещенные аминокислоты, Nалкиламинокислоты, молочная кислота и другие необычные аминокислоты также могут быть подходящими компонентами для полипептидов по настоящему изобретению. Примеры необычных аминокислот включают в себя: 4-гидроксипролин, -карбоксиглутамат, -N,N,N-триметиллизин, -N-ацетиллизин, Офосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, -N-метиларгинин и другие сходные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В используемой здесь записи полипептида левостороннее направление представляет собой N-концевое направление и правостороннее направление представляет собой С-концевое направление в соответствии со стандартным применением и правилом. Сходным образом, кроме указанных иначе случаев, левосторонний конец одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей представляет собой 5'-конец, левостороннее направление двухцепочечных нуклеотидных последовательностей обозначается как 5'-направление. Добавочные последовательности, лежащие в 5' и 3'-направлении от образующихся РНК-транскриптов, обозначаются как области последовательностей направления транскрипции на цепи ДНК, имеющей ту же последовательность,что и РНК, и те из них, которые лежат в 5'-направлении от 5'-конца транскрипта РНК, обозначаются как вышележащие последовательности, при этом области последовательности на цепи ДНК, имеющие ту же последовательность, что РНК, и находящиеся в 3'-направлении от 3'-конца РНК-транскрипта, обозначаются как нижележащие последовательности. По отношению к полипептидам термин существенная идентичность означает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании, например, посредством программ GAP или BESTFIT с использованием значений веса пропуска по умолчанию характеризуются по меньшей мере 80%ной идентичностью по последовательности, предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью по последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичностью по последовательности и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ной идентичностью по последовательности. Предпочтительно, положения остатков, которые не идентичны, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Консервативные аминокислотные замены относятся к взаимозаменяемости остатков, имеющих сходные боковые цепи. Например, группа аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, включает в себя глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, имеющих алифатические гидроксильные боковые цепи, включает в себя серин и треонин; группа аминокислот, имеющих амидосодержащие боковые цепи, включает в себя аспарагин и глутамин; группа аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, включает в себя фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот,имеющих основные боковые цепи, включает в себя лизин, аргинин и гистидин и группа аминокислот,имеющих серосодержащие боковые цепи, включает в себя цистеин и метионин. Предпочтительные группы консервативных замен аминокислот включают в себя: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланинтирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутаминовую кислоту-аспарагиновую кислоту и аспарагинглутамин. Как обсуждается здесь, минорные вариации в аминокислотных последовательностях антител или иммуноглобулиновых молекул, как предусматривается, относятся к настоящему изобретению, с обеспечением того, что вариации аминокислотной последовательности сохраняют по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80, 90, 95% и наиболее предпочтительно 99%. В частности, предусматриваются консервативные аминокислотные замены. Консервативные замены соответствуют тем,которые имеют место в семействе аминокислот, которые относятся к их боковым цепям. Генетически кодируемые аминокислоты, в общем, подразделяются на семейства: (1) кислые аминокислоты включают в себя аспартат и глутамат; (2) основные аминокислоты включают в себя лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные аминокислоты включают в себя аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин,метионин, триптофан и (4) незаряженные полярные аминокислоты включают в себя глицин, аспарагин,глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Гидрофильные аминокислоты включают в себя аргинин,аспарагин, аспартат, глутамин, глутамат, гистидин, лизин, серин и треонин. Гидрофильные аминокислоты включают в себя аланин, цистеин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, триптофан,тирозин и валин. Другие семейства аминокислот включают в себя (i) серин и треонин, которые представляют собой семейство алифатических гидроксисодержащих аминокислот; (ii) аспарагин и глутамин, которые представляют собой амидосодержащее семейство; (iii) аланин, валин, лейцин и изолейцин, которые представляют собой алифатическое семейство; и (iv) фенилаланин, триптофан и тирозин, которые представляют собой ароматическое семейство. Например, следует ожидать, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или сходная замена аминокислоты структурно родственной аминокислотой не будет иметь большого влияния на связывание или свойства полученной в результате молекулы, особенно если замена не вовлекает аминокислоту в каркасном участке. Там, где изменение аминокислоты,приводящее к образованию функционального пептида, может легко определяться путем анализа специ- 18010350 фичной активности полипептидного производного. Здесь подробно описаны анализы. Фрагменты или аналоги антител или иммуноглобулиновых молекул могут быть легко получены специалистами в данной области. Предпочтительные N- или С-концы фрагментов или аналогов происходят вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут идентифицироваться сравнением данных нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности с доступными общественности или коммерческими базами данных последовательностей. Предпочтительно, используются компьютеризованные способы сравнения для идентификации мотивов последовательности или предсказанных доменов конформации белка, которые имеют место в других белках с известной структурой и/или функцией. Известны способы идентификации белковых последовательностей, которые сворачиваются в известные трехмерные структуры. Bowie et al. Science 253: 164 (1991). Таким образом, следующие примеры демонстрируют, что специалист в данной области может выявить мотивы последовательности и структурные конформации, которые могут использоваться для определения структурных и функциональных доменов по изобретению. Предпочтительные аминокислотные замены представляют собой те, которые: (1) снижают чувствительность к протеолизу, (2) снижают чувствительность к окислению, (3) изменяют сродство связывания образования белковых комплексов, (4) изменяют сродство связывания и (5) создают или модифицируют физикохимические или функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут включать в себя различные мутеины с последовательностью, отличной от встречающейся в природе пептидной последовательности. Например, единичные или множественные аминокислотные замены (предпочтительно консервативные аминокислотные замены) могут быть сделаны во встречающейся в природе последовательности (предпочтительно в части полипептида вне домена(ов) межмолекулярных контактов). Консервативная аминокислотная замена существенно не меняет структурных характеристик родительской последовательности (например, заменившая аминокислота не ведет к нарушению спирали, которая имеется в родительской последовательности, или не нарушает другие типы вторичной структуры, которой характеризуется родительская последовательность). Примеры известных в данной области полипептидных вторичных и третичных структур описаны в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.,W. H. Freeman and Company, New York (1984; Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze,eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991; и Thornton et al. Nature 354:105(1991). Используемый здесь термин полипептидный фрагмент относится к полипептиду, который имеетN-концевую и/или С-концевую делецию, но где оставшаяся аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям встречающейся в природе последовательности, предсказанной,например, из полноразмерной последовательности кДНК. Фрагменты обычно составляют в длину по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 14 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, обычно по меньшей мере 50 аминокислот и даже более предпочтительно по меньшей мере 70 аминокислот. Используемый здесь термин аналог относится к полипептидам, которые составлены из сегмента длиной по меньшей мере 25 аминокислот, по существу, идентичного в отношении части предсказанной аминокислотной последовательности и имеющего по меньшей мере одно из следующих свойств: (1) специфичное связывание с CD3 в подходящих условиях связывания, (2) способность блокировать соответствующее связывание с CD3 или (3) способность ингибировать рост CD3-экспрессирующих клеток invitro или in vivo. Обычно полипептидные аналоги содержат консервативные аминокислотные замены(или добавления или делеции) по отношению к встречающейся в природе последовательности. Аналоги обычно составляют в длину по меньшей мере 20 аминокислот, предпочтительно 50 аминокислот или более, и могут часто по длине соответствовать полноразмерному встречающемуся в природе полипептиду. Аналоги пептидов обычно используются в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарственных средств со свойствами, аналогичными таковым исходного пептида. Данные типы непептидного соединения называются пептидные миметики или пептидомиметики. Fauchere, J. Adv.Drug Res. 15: 29 (1986), Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); и Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Такие соединения часто разрабатывают с помощью компьютеризованного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, которые структурно сходны с используемыми в терапии пептидами, могут применяться для продукции эквивалетного терапевтического или профилактического эффекта. В общем, пептидомиметики структурно сходны с теоретическим полипептидом (т.е. полипептидом, который имеет биохимические свойства или фармакологическую активность), таким как человеческое антитело, но имеют одну или несколько пептидных связей, необязательно замещенных связью, выбранной из группы, состоящей из-CH2NH-, -CH2S-, -СН 2-СН 2-, -СН=СН-(цис или транс), -COCH2-, СН(ОН)СН 2- и -CH2SO-, способами, хорошо известными в данной области. Системная замена одной или нескольких аминокислот консенсусной последовательностью D-аминокислотой того же типа (например, D-лизином вместо L-лизина) может использоваться для получения более стабильных пептидов. Кроме того, фиксированные пептиды, содержащие консенсусную последовательность или, по существу, идентичную консенсусу вариацию последовательности, могут генерироваться способами, известными в данной области (Rizo and Gierasch Ann. Rev.Biochem. 61: 387 (1992; например добавлением внутреннего цистеинового остатка, способного образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые циклизуют пептид.- 19010350 Термин агент используется здесь для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, полученного из биологических материалов. Используемые здесь термины метка или меченный относится к введению детектируемого маркера, например, путем введения радиоактивной аминокислоты или присоединения к полипептиду биотиновых групп, которые могут быть выявлены меченным авидином (например, стрептавидином, содержащим флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которая может выявляться оптическими или калориметрическими методами). В некоторых ситуациях метка или маркер также могут быть терапевтическими. Различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов известны в данной области и могут использоваться. Неограничивающие примеры меток для полипептидов включают в себя следующее: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3 Н, 14 С, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, лантаниды фосфора), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, (-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные, биотиновые группы, предварительно выявленные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательность пары лейциновых застежек, участки связывания вторичных антител,связывающие металл домены, эпитопные метки). В некоторых вариантах осуществления метки присоединяются к спейсерным плечам различной длины для снижения потенциального стерического препятствия. Используемый здесь термин фармацевтическое средство или лекарственное средство относится к химическому соединению или композиции, способной к индукции требуемого терапевтического эффекта, при надлежащем введении пациенту. Другие химические термины используются здесь по общепринятому применению в данной области,например, как в The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco(1985. Термин антинеопластическое средство используется здесь для обозначения функционального свойства ингибирования или прогрессии неоплазии у человека, в частности злокачественного (ракового) очага, такого как карцинома, саркома, лимфома или лейкоз. Ингибирование метастазирования часто представляет собой свойство антинеопластического средства. Используемый здесь термин по существу, чистый означает, что указанный вид молекулы является преобладающим присутствующим видом (т.е. на молярной основе он наиболее обилен, чем любой другой вид молекулы в композиции) и предпочтительно, по существу, очищенная фракция представляет собой композицию, в которой указанный вид молекулы составляет по меньшей мере примерно 50% (на молярной основе) от всех присутствующих видов макромолекул. В общем, по существу, чистая композиция включает в себя более чем примерно 80% всех видов макромолекул, присутствующих в композиции, более предпочтительно более чем примерно 85, 90, 95 и 99%. Наиболее предпочтительно, указанный вид очищен до существенной гомогенности (контаминантные виды не могут детектироваться в композиции общепринятыми способами детекции), при этом композиция состоит, по существу, из одного вида макромолекул. Термин пациент включает собой людей и субъектов ветеринарии. Человеческие антитела и гуманизация антител Антитело huCD3 получали, например, путем иммунизации ксеногенных мышей, способных вырабатывать полностью человеческие антитела (см. пример 1). Антитело IgG huCD3 получали, например,путем преобразования антитела IgM анти-CD3, выработанного трансгенными мышами (см. пример 2). Альтернативно, такое антитело huCD3 получали, например, с использованием способов фагового дисплея, с помощью антител, содержащих только человеческие последовательности. Такие подходы хорошо известны в науке, например описаны в WO 92/0104 7 и патенте США 6521404, которые включены здесь в виде ссылки. При таком подходе, комбинаторную библиотеку фагов, несущих случайные пары легких и тяжелых цепей, исследовали с использованием естественных или рекомбинантных источников CD3 или их фрагментов. Изобретение включает в себя способы получения антител huCD3 с помощью процесса, в котором по меньшей мере одна стадия включает в себя иммунизацию трансгенных животных белком CD3 человека. Некоторые из локусов эндогенных тяжелых и/или каппа легких цепей этих ксеногенных животных неспособны к перестройке, необходимой для образования генов, кодирующих иммуноглобулины в ответ на антиген. Кроме того, по меньшей мере один локус тяжелой цепи человека и по меньшей мере один локус легкой цепи человека были стабильно трансфицированы животным. Таким образом, в ответ на введение антигена человеческие локусы перестраивались для выработки генов, кодирующих различные человеческие области, иммуноспецифичные для антигена. После иммунизации, таким образом, ксеногенные мыши вырабатывали В-клетки, которые секретировали полностью человеческие иммуноглобулины. Различные способы получения ксеногенных животных хорошо известны в науке. Например, см. патенты США 6075181 и 6150584. Согласно одной стратегии, гены ксеногенного (человеческого) иммуноглобулина с тяжелыми и легкими цепями вводили в зародышевую линию хозяина (например, сперматозоиды или ооциты) и на отдельных стадиях соответствующие гены хозяина делали нефункционирующими путем инактивации с помощью гомологичной рекомбинации. Гены человеческого иммуноглобу- 20010350 лина с тяжелыми и легкими цепями реконструировали в соответствующих эукариотических или прокариотических микроорганизмах и полученные в результате фрагменты ДНК вводили подходящему хозяину, например в пронуклеарные или фертильные мышиные ооциты или эмбриональные стволовые клетки. Инактивации локусов эндогенного иммуноглобулина хозяина достигали путем направленного повреждения соответствующих локусов гомологичной рекомбинацией в клетках хозяина, в частности в эмбриональных стволовых клетках или в пронуклеарных или фертильных мышиных ооцитах. Направленное повреждение может включать в себя введение нарушения или делеции в локус-мишень или делецию локуса-мишени в сочетании с введением в локус, например, опознавательного маркера. В случае эмбриональных стволовых клеток образуются химерные животные, происходящие частично из модифицированных эмбриональных стволовых клеток и способные к передаче генетических модификаций в зародышевой линии. Скрещивание хозяев с введенными локусами человеческого иммуноглобулина с линиями с инактивированными эндогенными локусами позволяет получить животных, продуцирующих чисто ксеногенные, например человеческие, антитела. Согласно альтернативной стратегии по меньшей мере части локусов человеческих иммуноглобулинов с тяжелыми и легкими цепями использовали для замещения непосредственно соответствующих локусов эндогенных иммуноглобулинов путем гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках. Это приводило к одновременной инактивации и замещению эндогенного иммуноглобулина. Вследствие этого образовывались химерные животные, у которых клетки, происходящие из эмбриональных стволовых клеток, могли передаваться в зародышевых линиях. Например, клон В-клеток, экспрессирующий человеческое антитело анти-CD3, выделяли из ксеногенных животных и иммортализовывали в соответствии с различными способами, известными в науке. Эти В-клетки могут быть получены непосредственно из крови животных или из лимфоидных тканей,включающих в себя, но не ограничивающихся ими, селезенку, миндалины, лимфоузлы и костный мозг. В итоге, иммортализованные В-клетки сохраняли и культивировали in vitro для получения значительных,клинически применимых количеств антитела huCD3. Альтернативно, гены, кодирующие иммуноглобулины с одним или более различными человеческими областями, могут быть выявлены и экспрессированы в клетках разных типов, включающих в себя, но не ограничивающихся ею, систему культуры клеток млекопитающих, с целью получения непосредственно антител или их отдельных цепей, состоящих из одноцепочечных молекул Fv. Кроме того, полный набор полностью человеческих антител анти-CD3, выработанных ксеногенными животными, может быть исследован для идентификации одного такого клона с оптимальными характеристиками. Эти характеристики включают в себя, например, сродство связывания с человеческим белком CD3, стабильность взаимодействия, а также изотип полностью человеческого антитела анти-CD3. Клоны из полного набора, имеющие желаемые характеристики, использовали затем как источник нуклеотидных последовательностей, кодирующих различные желаемые участки, для дальнейших манипуляций для получения антител с этими характеристиками в альтернативных системах клеток, с использованием общепринятых рекомбинантных или трансгенных способов. Эта общая стратегия была продемонстрирована вместе с образованием первых линий XenoMouse,как опубликовано в 1994 г. См. Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994). Этот подход в дальнейшем обсуждался и использовался в заявках на выдачу патента США 07/466008, поданной 12 января 1990 года,07/610515, поданной 8 ноября 1990 года, 07/919297, поданной 24 июля 1992 года, 07/922649, поданной 30 июля 1992 года, 08/031801, поданной 15 марта 1993 года, 08/112848, поданной 27 августа 1993 года,08/234145, поданной 28 апреля 1994 года, 08/376279, поданной 20 января 1995 года, 08/430938, поданной 27 апреля 1995 года, 08/464584, поданной 5 июня 1995 года, 08/464582, поданной 5 июня 1995,08/463191, поданной 5 июня 1995 года, 08/462837, поданной 5 июня 1995 года, 08/486853, поданной 5 июня 1995 года, 08/486857, поданной 5 июня 1995 года, 08/486859, поданной 5 июня 1995 года,08/462513, поданной 5 июня 1995 года, 08/724752, поданной 2 октября 1996 года и 08/759620, поданной 3 декабря 1996 года, и в патентах США 6162963, 6150584, 6114598, 6075181 и 5939598, патентах Японии 3068180 В 2, 3068506 В 2 и 3068507 В 2. См. также Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) иGreen and Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). См. также европейский патентЕР 04 63151 В 1,решение о выдаче опубликовано 12 июня 1996, заявку на международный патентWO 94/02602, опубликованную 3 февраля 1994 года, заявку на международный патентWO 96/34096, опубликованную 31 октября 1996 года, WO 98/24893, опубликованную 11 июня 1998 года, WO 00/76310, опубликованную 21 декабря 2000 года. В альтернативном подходе некоторые применяли минилокусный способ. При минилокусном способе экзогенный локус Ig мимикрировали путем включения участков (индивидуальных генов) локусаIg. Таким образом, один или более генов VH, один или более генов DH, один или более генов JH, константную область mu и вторую константную область (предпочтительно область константы гамма) формировали в конструкцию для введения животному. Этот подход описан в патенте США 5545807, выданном Surani et al., в патентах США 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650,5814318, 5877397, 5874299 и 6255458, каждый выдан Lonberg и Kay, в патентах США 5591669 и 6023010, выданных Krimpenfort и Berns, в патентах США 5612205, 5721367 и 5789215, выданныхBerns et al., и в патенте США 5643763, выданном Choi и Dunn, и в заявках GenPharm International на патент США 07/574748, поданной 29 августа 1990 года, 07/575962, поданной 31 августа 1990 года,07/810279, поданной 17 декабря 1991 года, 07/853408, поданной 18 марта 1992 года, 07/904068, поданной 23 июня 1992 года, 07/990860, поданной 16 декабря 1992 года, 08/053131, поданной 26 апреля 1993 года,08/096762, поданной 22 июля 1993 года, 08/155301, поданной 18 ноября 1993 года, 08/161739, поданной 3 декабря 1993 года, 08/165699, поданной 10 декабря 1993 года, 08/209741, поданной 9 марта 1994 года. См. также европейский патент 0546073 В 1, заявки на международный патентWO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 и WO 98/24884 и патент США 5981175. См. далее Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994) и Tuaillon et al., (1995), Fishwildet al., (1996). Преимуществом минилокусного подхода является быстрота, с которой конструкции, включающие в себя порции локуса Ig, могут быть созданы и введены животным. Однако соразмерным и значительным недостатком минилокусного подхода является в теории недостаточное многообразие, представленное при введении малых количеств генов V, D и J. Действительно, опубликованные работы подтверждают это опасение. Развитие В-клеток и продукция антител животными, полученными с использованием минилокусного подхода, представляются недостаточными. Таким образом, исследования, сопутствующие настоящему изобретению, были в основном направлены на введение больших порций локуса Ig с целью достижения большего разнообразия и в стремлении перестроить иммунный спектр животных.Kirin также показал образование человеческих антител у мышей, которым вводили путем микроклеточного слияния большие участки хромосом или целые хромосомы. См. заявки на европейский патент 773288 и 843961. Успешное срабатывание человеческих анти-мышиных антител (НАМА) привело промышленность к производству химерных или иначе гуманизированных антител. Поскольку химерные антитела имеют человеческую константную область и вариабельную иммунную область, ожидается, что у человека будут наблюдаться определенные анти-химерные антительные ответы (НАСА), особенно при длительном применении антител или при применении больших доз антител. Следовательно, было бы желательным получение полностью человеческих антител против CD3 с целью избежать опасений и/или эффектов ответа НАМА или НАСА. Получение антител со сниженной иммуногенностью также осуществлено через гуманизацию и представляет способы с использованием соответствующих библиотек. Обнаружено, что мышиные антитела или антитела других животных могут быть гуманизированы или приматизированы с использованием способов, хорошо известных в науке. См., например, Winter and Harris Immunol Today 14:43 46 (1993) и Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). Интересующие антитела могут быть созданы способами с использованием рекомбинантной ДНК для замены CH1, CH2, СН 3, шарнирного домена и/или скелетного домена с соответствующей человеческой последовательностью (см. WO 92102190 и патенты США 5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 и 5777085). Также известно в науке использование кДНК Ig для конструирования генов химерного иммуноглобулина (Liu et al., P.N.A.S. 84:3439 (1987) и J. Immunol. 139:3521 (1987. мРНК изолировали из гибридомы или другой клетки, вырабатывающей антитела, и использовали для получения кДНК. Интересующую кДНК амплифицировали полимеразной цепной реакцией с использованием специфичных праймеров (патенты США 4683195 и 4683202). Альтернативно, создавали и изучали библиотеку для изолирования интересующей последовательности. Последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, затем подвергали слиянию с последовательностью человеческой константной области. Последовательности генов человеческих константных областей можно найти в Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunologicalInterest, N.I.H. публикация 91-3242. Человеческие гены участка С легкодоступны из известных клонов. Выбор изотипа будет определяться желаемыми эффекторными функциями, такими как фиксация комплемента или активность в клеточной цитотоксичности, зависящей от антител. Предпочтительными изотипами являются IgG1, IgG3 и IgG4. Может быть использована как каппа,так и лямбда легкая цепь константных областей. Химерное, гуманизированное антитело затем экспрессируют общепринятыми способами. Фрагменты антител, такие как Fv, F(ab')2 и Fab, могут быть получены путем расщепления интактного белка, например с помощью протеазы или химическим расщеплением. Альтернативно, может быть создан процессированный ген. Например, химерный ген, кодирующий порцию фрагмента F(ab')2, может включать в себя последовательности ДНК, кодирующие домен CH1 и шарнирную область цепи Н, с последующим трансляционным стоп-кодоном, для получения процессированной молекулы. Транскрипционные последовательности областей Н и L, J могут применяться для создания олигонуклеотидов, использующихся как направляющие для введения полезных сайтов рестрикции в область J для последующего связывания сегментов области V с сегментами области С. Содержащая область С кДНК может быть модифицирована путем направленного мутагенеза сайта для помещения сайта рестрикции в аналогичную позицию человеческой последовательности. Векторы экспрессии включают в себя плазмиды, ретровирусы, эписомы, происходящие от YAC,- 22010350EBV и тому подобное. Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально полноценную последовательность СН или CL человеческого иммуноглобулина с соответствующими сайтами рестрикции, сконструированными таким образом, что любая последовательность VH или VL-31 может быть легко введена и экспрессирована. В таких векторах сплайсинг обычно происходит между сайтомдонором сплайсирования в введенной области J и сайтом-акцептором сплайсирования, предшествующим человеческой области С, а также в областях сплайсирования, находящихся в пределах человеческих СН экзонов. Полиаденилирование и окончание транскрипции происходит в естественных хромосомных сайтах ниже кодирующих областей. Полученное в результате химерное антитело может быть присоединено к любому сильному промотору, включающему в себя ретровирусные LTR, например ранний промоторSV-40 (Okayama et al., Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983, LTR вирус саркомы Роуза (Gorman et al. , P.N.A.S. 79:6777 (1982 и LTR вирус лейкемии мышей Молони (Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985. Также, что будет особенно ценно, могут использоваться естественные Ig-промоторы и им подобные. Далее, человеческие антитела или антитела других животных могут быть получены с использованием способов дисплейного типа, включающих в себя, без ограничения, фаговый дисплей, ретровирусный дисплей, рибосомальный дисплей и другие способы, хорошо известные в науке, и полученные молекулы могут быть подвергнуты дополнительному созреванию, такому как созревание сродства, как это хорошо известно в науке. Wright and Harris, выше, Hanes and Plucthau PEAS USA 94:4937-4942 (1997)(рибосомальный дисплей), Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988) (фаговый дисплей), Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:10811085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992) и патент США 5733743. Если дисплейные способы используются для получения антител, не являющихся человеческими, то такие антитела могут быть гуманизированы, как описано выше. Используя эти способы, могут быть созданы антитела к клеткам, экспрессирующим CD3, самомуCD3, формам CD3, их эпитопам или пептидам и, кроме того, к библиотекам экспрессии (см., например,патент США 5703057), которые затем могут быть исследованы, как описано выше, на активность, как описано выше. Разработка и создание других лекарств В соответствии с настоящим изобретением и на основе активности антител, полученных и охарактеризованных здесь в отношении CD3, разработка других способов лечебного воздействия, помимо молекул антител, упрощается. Такие способы воздействия включают в себя, без ограничения, усовершенствованные антительные лекарства, такие как биспецифические антитела, иммунотоксины и радиоактивно меченые лекарства, создание пептидных лекарств, генную терапию, особенно интратела, антисмысловые лекарства и малые молекулы. Например, в связи с биспецифическими антителами, биспецифические антитела могут быть созданы таким образом, что будут содержать: (i) два конъюгированных антитела: одно со специфичностью кCD3, а другое ко второй молекуле, (ii) одно антитело, имеющее одну цепь, специфичную к CD3, и вторую цепь, специфичную ко второй молекуле, или (iii) одноцепочечное антитело, имеющее специфичность к CD3 и другой молекуле. Такие биспецифические антитела могут быть созданы с использованием хорошо известных способов, например в связи с (i) и (ii), см., Fanger et al., Immunol Methods 4:72-81(1994) и Wright and Harris, выше, а в связи с (iii) см., например, Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992). В каждом случае вторая специфичность может быть создана к рецепторам активации,относящимся к тяжелым цепям, включающим в себя, без ограничения, CD16 или CD64 (см., например,Deo et al., 18:127 (1997, или CD89 (см., например, Valerius et al., Blood 90:4485-4492 (1997. Биспецифические антитела, полученные в соответствии с вышеизложенным, будут, вероятно, способны убивать клетки, экспрессирующие CD3, и особенно те клетки, в отношении которых эффективны антитела к CD3 по изобретению. В связи с иммунотоксинами антитела могут быть модифицированы и применены в способах, использующих иммунотоксины, хорошо известных в науке. См., например, Vitetta Immunol Today 14:252(1993). См. также патент США 5194594. В связи с получением радиомеченых антител такие модифицированные антитела также легко могут применяться в используемых способах, хорошо известных в науке. См., например, Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafnerand Longo, eds., Lippincott Raven (1996. См. также патенты США 4681581, 4735210, 5101827, 5102990(RE 35500), 5648471 и 5697902. Каждый из иммунотоксинов и радиомеченых молекул будут, вероятно,способны убивать клетки, экспрессирующие CD3, и особенно те клетки, в отношении которых эффективны антитела к CD3 по изобретению. В связи с созданием лекарственных пептидов путем использования структурной информации, относящейся к CD3 и антителам к ним, такими как антитела по изобретению, или исследования пептидных библиотек могут быть созданы лекарственные пептиды, направленные против CD3. Разработка и исследование пептидных лекарств обсуждались также в Houghten et al., Biotechniques 13:412-421 (1992),Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al., Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake and LitziDavis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992). Иммунотоксины и радиомеченые молекулы также могут быть получены и способом, сходным с пептидными молекулами, как обсуждалось выше в связи с анти- 23010350 телами. Если предположить, что молекула CD3 (или ее форма, такая как сплайсинговый вариант, или альтернативная форма) является функционально активной в процессе заболевания, также представляется возможным разработать генные и, кроме того, антисмысловые лекарства с использованием общепринятых способов. Такие способы воздействия могут применяться для изменения функции CD3. В связи с этим, антитела по настоящему изобретению облегчают разработку и использование соответствующих функциональных анализов, помимо прочего. Разработка и стратегия для антисмысловых лекарств обсуждается в деталях в заявке на международный патентWO 94/29444. Разработка и стратегии для генной терапии хорошо известны. Однако, в частности, использование способов генной терапии, включающих в себя интратела, могут доказать свои явные преимущества. См., например, Chen et al., Human GeneTherapy 5:595-601 (1994) и Marasco, Gene Therapy 4:11-15 (1997). Общий подход к разработке и соображения, касающиеся генных лекарств, также обсуждаются в заявке на международный патентWO 97/38137. Тщательно изученные сведения по структуре молекулы CD3 и ее взаимодействию с другими молекулами в соответствии с настоящим изобретением, такими как антитела по изобретению, и другими, могут быть использованы для рациональной разработки других терапевтических воздействий. В этом отношении, рациональные способы разработки лекарств, такие как рентгеновская кристаллография, компьютерное молекулярное моделирование (САММ), способ количественного или качественного соотношения структура-активность (QSAR) и подобные способы, могут применяться для фокусирования усилий по разработке лекарств. Рациональная разработка позволяет предсказывать белковые или синтетические структуры, которые могут взаимодействовать с молекулой или ее специфическими формами, что может быть использовано для изменения активности CD3. Такие структуры могут быть синтезированы химически или экспрессированы в биологических системах. Этот подход был рассмотрен в Capsey et al.,Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988. Далее, могут быть разработаны и синтезированы комбинаторные библиотеки для использования в программах скрининга, таких как высокоэффективные программы скрининга. Лекарственные формы и введение лекарств Было бы желательно, чтобы введение лекарственных веществ в соответствии с изобретением происходило с приемлемыми носителями, наполнителями и другими агентами, которые включаются в лекарственную форму для улучшения транспортировки, доставки, переносимости и тому подобного. Множества подходящих лекарственных форм могут быть найдены в справочнике, известном всем фармакологическим химикам: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA(1975, особенно в Части 87, написанной Blaug и Seymour. Эти лекарственные формы включают в себя,например, порошки, пасты, мази, гели, воски, масла, жиры, везикулы, содержащие липиды (катионные или анионные) (такие как Lipofectin), конъюгаты ДНК, обезвоженные абсорбирующие пасты, эмульсии масло-в-воде и вода-в-масле, карбоваксовые эмульсии (полиэтиленгликоли различных молекулярных масс), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Любые из вышеуказанных смесей могут быть пригодны для лечения в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивая то, что активный ингредиент лекарственной формы не инактивируется лекарственной формой, и лекарственная форма является физиологически совместимой и переносимой с учетом пути введения. См. также Baldrick P.Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) и ссылки, приведенные здесь для дополнительной информации,относящейся к лекарственным формам, наполнителям и носителям, хорошо известным фармакологическим химикам. Терапевтические лекарственные формы по изобретению, которые включают в себя антитела huCD3 по изобретению, использовали для лечения или облегчения симптомов, связанных с иммунными нарушениями, такими, например, как аутоиммунное заболевание или воспалительное нарушение. Аутоиммунные заболевания включают в себя, например, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД (AIDS), который является вирусным заболеванием с аутоиммунным компонентом), очаговое облысение, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунную болезнь внутреннего уха (AIED), аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (ALPS), аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру (АТР), болезнь Бехчета, кардиомиопатию, глютеиновую болезнь; синдром хронической усталости (CFIDS), хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию (CIPD),рубцующий пемфигоид, болезнь холодовой агглютинации, крест-синдром, болезнь Крона, болезнь Дегоса, ювенильный дерматомиозит, дискоидную волчанку, эссенциальную смешанную криоглобулинемию,фибромиалгию-фибромиозит, болезнь Грейвса, синдром Гиллана-Барра, тиреоидит Хашимото, идиопатический легочный фиброз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), IgA-нефропатию,инсулин-зависимый сахарный диабет, ювенильный хронический артрит (болезнь Стилла), ювенильный ревматоидный артрит, болезнь Меньера, спаечную болезнь, множественный склероз, мигастению гравис,- 24010350 пернициозную анемию, узелковый полиартрит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный билиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, феномен Рейнауда, синдром Рейтера, ревматическую лихорадку, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермию (прогрессирующий системный склероз(PSS), также известный как системный склероз (SS, синдром Шегрена, синдром Моэрша-Вольтмана,системную красную волчанку, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, витилиго и гранулематоз Вегенера. Воспалительные нарушения включают в себя, например, хронические и острые воспалительные нарушения. Примеры воспалительных нарушений включают в себя болезнь Альцгеймера, астму, атопическую аллергию, аллергию, атеросклероз, бронхиальную астму, экзему, гломерулонефрит, болезнь трансплантат против хозяина, гемолитические анемии, остеоартрит, сепсис, инсульт, трансплантации тканей и органов, васкулиты, диабетическую ретинопатию и повреждения легких, вызванные вентиляцией. В одном варианте осуществления композиции антитела huCD3 по изобретению вводили в сочетании со вторым агентом, таким как, например, GLP-1 или соединениями, ингибирующими бета-клетки (то есть соединениями, которые уменьшают или иным образом ингибируют высвобождение инсулина, такими как активаторы калиевых каналов). Примеры подходящих GLP-1 соединений описаны, например, в опубликованной заявке на патент США 20040037826, а подходящие соединения, ингибирующие бетаклетки, описаны в опубликованной заявке на патент США 20030235583, каждая из которых полностью включена здесь в виде ссылки. В другом варианте осуществления композиции антитела huCD3, использовавшиеся для лечения нарушений, связанных с иммунитетом, вводили в комбинации с любым из различных известных противовоспалительных и/или иммуносупрессивных соединений. Приемлемые известные соединения включают в себя, но не ограничиваются ими, метотрексат, циклоспорин А (включающий в себя, например, микроэмульсию циклоспорина), такролимус, кортикостероиды, статины, интерферон бета, ремикад (инфликсимаб), энбрел (этанерцепт) и хумира (адалимумаб). Например, в лечении ревматоидного артрита композиции антитела huCD3 по изобретению могут вводиться совместно с кортикостероидами, метотрексатом, циклоспроином А, статинами, ремикадом(инфликсимабом), энбрелом (этанерцептом) и/или хумирой (адалимумабом). В лечении увеита композиции антитела huCD3 могут вводиться в сочетании, например, с кортикостероидами, метотрексатом, циклоспроином А, циклофосфамидом и/или статинами. Аналогично, пациенты, страдающие такими заболеваниями, как болезнь Крона или псориаз, могут получать лечение комбинацией композиции антитела huCD3 по изобретению с ремикадом (инфликсимабом) и/или хумирой(адалимумабом). Пациенты с множественным склерозом могут получать комбинацию композиции антитела huCD3 по изобретению в сочетании, например, с ацетатом глатирамера (копаксон), интерфероном бета-1a (авонекс), интерфероном бета-1a (ребиф), интерфероном бета-1b (бетасерон или бетаферон), митоксантроном(новантрон), дексаметазоном (декадрон), метилпреднизолоном (депомедрол) и/или преднизоном (дельтазон) и/или статинами. Настоящее изобретение также включает в себя способы лечения или облегчения симптомов, связанных с иммунозависимыми нарушениями, или симптомов, связанных с отторжением после трансплантации органов. Например, композиции по изобретению используют для лечения или облегчения симптомов любых аутоиммунных заболеваний и воспалительных нарушений, описанных здесь. Терапевтические композиции по изобретению также используют как иммуносупрессивные агенты при трансплантации органа или ткани. Используемый здесь термин "иммуносупрессивный агент" относится к агенту, чье действие на иммунную систему ведет к немедленному или отсроченному снижению активности по меньшей мере одного пути, вовлеченного в иммунный ответ, независимо от того, является ли этот ответ естественным или патологическим, является ли этот ответ частью врожденной иммунной системы, адаптивной иммунной системы или обеих. Эти иммуносупрессивные композиции антителаhuCD3 вводят субъекту до, в процессе и/или после трансплантации органа или ткани. Например, антитело huCD3 по изобретению используют в лечении или предотвращении отторжения после трансплантации органа или ткани. В одном варианте осуществления иммуносупрессивные композиции антитела huCD3 по изобретению вводят в сочетании со вторым агентом, таким как, например, GLP-1 или соединением, ингибирующим бета-клетки, как описано выше. В другом варианте осуществления эти иммуносупрессивные композиции антитела huCD3 вводят в сочетании с любым из различных известных противовоспалительных и/или иммуносупрессивных соединений. Приемлемые противовоспалительные и/или иммуносупрессивные соединения для использования с антителами huCD3 по изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, метотрексат, циклоспроин А (включающий в себя, например, микроэмульсию циклоспроина), такролимус, кортикостероиды и статины. В другом варианте осуществления по изобретению, антитело huCD3 вводят человеку при определе- 25010350 нии присутствия аутореактивных антител у человека. Такие аутореактивные антитела известны в науке как антитела со сродством связывания к одному или более белкам, экспрессируемым эндогенно в организме человека. В одном аспекте по изобретению человека тестируют на наличие аутореактивных антител, специфично вовлеченных в одно или более аутоиммунное заболевание, как хорошо известно в науке. В одном специальном варианте осуществления человека тестируют на наличие антител против инсулина, декарбоксилазы глутаминовой кислоты и/или белка IA-2, после чего вводят антитело huCD3 при положительном результате определения одного или более таких аутореактивных антител. В другом варианте осуществления по изобретению антитело huCD3 вводят человеку для предотвращения, уменьшения или снижения рекрутинга иммунных клеток в человеческие ткани. АнтителоhuCD3 по изобретению вводят субъекту при необходимости предотвращения и лечения состояний, связанных с ненормальным или нерегулируемым рекрутингом иммунных клеток в тканевые области, вовлеченные в заболевание человека. В другом варианте осуществления по изобретению антитело huCD3 вводят человеку для предотвращения, уменьшения или снижения экстравазации и диапедеза иммунных клеток в человеческие ткани. Таким образом, антитела huCD3 по изобретению вводят для предотвращения и/или лечения состояний, связанных ненормальной или нерегулируемой инфильтрацией иммунных клеток в тканевые области, вовлеченные в заболевание человека. В другом варианте осуществления по изобретению антитело huCD3 вводят человеку для предотвращения, уменьшения или снижения эффектов, опосредованных высвобождением цитокинов в организме человека. Термин цитокины относится ко всем человеческим цитокинам, известным в науке,которые связывают экстрацелюллярные рецепторы на поверхности клеток и, таким образом, изменяют клеточную функцию и включают в себя, не ограничиваясь ими, IL-2, IFN-g, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9,IL-10 и IL-13. Высвобождение цитокинов может вести к токсическому состоянию, известному как синдром высвобождения цитокинов (CRS), частое клиническое осложнение, которое развивается, например, при использовании анти-Т-клеточных антител, таких как ATG (анти-тимоцитарный глобулин) и ОКТЗ (мышиное антитело анти-CD3 человека). Этот синдром характеризуется избыточным высвобождением цитокинов, таких как TNF, IFN-гамма и IL-2, в циркуляцию. CRS развивается как результат одновременного связывания антител к CD3 (через различные области антитела) и рецепторов Fc и/или рецепторов комплемента (через константную область антитела) на других клетках, активируя, таким образом, Т-клетки к высвобождению цитокинов, вызывающих системный воспалительный эффект, характеризующийся гипотензией, лихорадкой и слабостью. Симптомы CRS включают в себя жар, ознобы, тошноту, рвоту, гипотензию и диспноэ. Таким образом, антитело huCD3 по изобретению содержит одну или более мутаций для предотвращения ненормального высвобождения и продукции одного или более цитокин(ов) in vivo. В другом варианте осуществления по изобретению антитело huCD3 вводят человеку для предотвращения, уменьшения или снижения эффектов, опосредованных высвобождением цитокиновых рецепторов в организме человека. Термин цитокиновые рецепторы относится ко всем человеческим цитокиновым рецепторам, известным в науке, которые связывают один или более цитокин(ов), описанных здесь, и включает в себя, не ограничиваясь ими, рецепторы вышеупомянутых цитокинов. Таким образом,антитело huCD3 по изобретению вводят для лечения и/или предотвращения состояний, опосредованных ненормальной активацией, связыванием или лигированием одного или более цитокинового рецептора(ов) в организме человека. В дальнейшем предполагается, что введение антитела huCD3 in vivo уменьшит внутриклеточную сигнализацию, опосредованную цитокиновым рецептором(ами) в организме человека. В одном аспекте осуществления по изобретению антитело huCD3 вводят человеку при снижении функции панкреатических бета-клеток. В одном варианте осуществления пациента тестируют на функцию бета-клеток, секрецию инсулина или уровень с-белка, как это известно в науке. Затем, при обнаружении существенного снижения одного из показателей пациенту вводят в соответствии с определенным режимом дозирования антитело huCD3 для предотвращения дальнейшего прогрессирования аутоиммунного нарушения функции бета-клеток. Диагностические и профилактические лекарственные формы Полностью человеческие анти-CD3 MAb по изобретению используют в диагностических и профилактических лекарственных формах. В одном варианте осуществления huCD3 MAb по изобретению вводят пациентам, у которых есть риск развития одного из вышеуказанных аутоиммунных заболеваний. Предрасположенность пациента к одному или более из вышеуказанных аутоиммунных заболеваний может быть определена с использованием генотипических, серологических или биохимических маркеров. Например, присутствие определенных подвидов HLA и серологических аутоантител (против инсулина, GAD65 и IA-2) показательны для диабета I типа. В другом варианте осуществления по изобретению антитело huCD3 вводят человеку, у которого диагностированы одно или более из вышеуказанных аутоиммунных заболеваний. После диагностики антитело huCD3 вводят для устранения или обратного развития эффектов аутоиммунитета. В одном таком примере человеку с диагностированным диабетом I типа вводили достаточную дозу антитела huCD3- 26010350 для восстановления функции поджелудочной железы и минимизации повреждения, вызванного аутоиммунной инфильтрацией поджелудочной железы. В другом варианте осуществления человеку с диагностированным ревматоидным артритом вводили антитело huCD3 для уменьшения инфильтрации иммунными клетками и разрушения суставов конечностей. Антитела по изобретению также применимы для определения CD3 в образцах пациента и соответственно применимы в диагностике. Например, антитела huCD3 по изобретению применимы в анализах invitro, например ELISA, для определения уровней CD3 в образцах пациента. В одном варианте осуществления антитело huCD3 по изобретению иммобилизируют на твердом носителе (например, луночном планшете). Иммобилизированные антитела служат как антитела-ловушки для любых CD3, которые могут присутствовать в тестируемом образце. Перед контактом иммобилизированных антител с образцом пациента твердую подложку промывали и обрабатывали блокирующим агентом, таким как белок норки или альбумин, для предотвращения неспецифической адсорбции аналита. В дальнейшем лунки обрабатывали тестируемым образцом, в котором ожидалось присутствие антигена, или раствором, содержавшем стандартное количество антигена. Таким образцом может быть,например, образец сыворотки субъекта, у которого ожидается присутствие уровней циркулирующего антигена, признанных диагностическими для патологии. После удаления тестируемого образца или стандарта твердую подложку обрабатывали вторым антителом, меченным для детекции. Меченное второе антитело служит как детектируемое антитело. Измеряют уровень детектируемой метки и определяют в тестируемом образце концентрацию антигена CD3 путем сравнения со стандартной кривой, полученной для стандартного образца. Ожидается, что на основе результатов, полученных с использованием антител huCD3 по изобретению в диагностических анализах in vitro, будет возможно определять стадию заболевания (например,аутоиммунного или воспалительного нарушения) у субъекта, основываясь на уровнях экспрессии антигена CD3. Для конкретного заболевания образцы крови берут у субъектов, у которых диагностированы разные стадии прогрессирования заболевания и/или на разных стадиях лечения заболевания. Используя группу образцов, позволяющую получить статистически значимые результаты для каждой стадии прогрессирования или лечения, определяют концентрационные уровни антигена, которые могут быть признаны характерными для каждой стадии заболевания. Все публикации и патентная документация, цитируемые здесь, включены в виде ссылки, если каждая такая публикация или документация были специфичными и показательными для включения здесь в виде ссылки. Цитирование публикаций и патентной документации не предполагает допущения, что они относятся к предшествующему уровню техники, и также не допускает указания на контекст или датировку данных источников. Что касается изобретения, описанного здесь в письменной форме, то специалисту в данной области ясно, что оно может воплощаться различными вариантами осуществления, и описанные ниже примеры служат только для иллюстративных целей и не ограничивают следующую формулу изобретения. ПРИМЕРЫ Следующие примеры, включающие в себя проведенные эксперименты и полученные результаты,приведены только для иллюстративных целей и не являются лимитирующими по настоящему изобретению. Пример 1. Получение антител huCD3. Иммунизационные стратегии: для получения полностью человеческих антител huCD3 использовали две линии трансгенных мышей, мыши HuMab и мыши KM (Medarex, Princeton NJ). Первоначальные иммунизационные стратегии следовали хорошо документированным протоколам, из литературы, для получения мышиных антител (см., например, Kung P, et al., Science; 206(4416):347-9 (1979); Kung PC, etal., Transplant Proc. (3 Suppl 1):141-6 (1980); Kung PC, et al., Int J Immunopharmacol.3 (3):175-81). Стандартные протоколы, известные в науке, оказались непригодными для получения полностью человеческих антител анти-huCD в мышах HuMAb или KM. Например, следующие иммунизационные стратегии были безуспешны и не позволили получить функционирующие антитела как в мышах HuMAb, так и в KM: иммунизация только тимоцитами или только Т-клетками; иммунизация только рекомбинантным человеческим CD3 материалом; иммунизация рекомбинантным CD3 материалом в наполнителе Freund; иммунизация клетками в наполнителе Freund; иммунизация тимоцитами или Т-клетками, вводимыми в сочетании с растворенным CD3; иммунизация тимоцитами или Т-клетками, вводимыми в сочетании с рекомбинантными CD3 экспрессирующими клетками. При использовании первоначальных иммунизационных стратегий на мышах BALB/c, а не вHuMAb или KM, эти стратегии позволяли получить мышиные антитела анти-CD3, а не человеческие антитела анти-CD3. Одновременно разрабатывали новые иммунизационные стратегии, варьируя следующие параметры:- 27010350 типы используемых антигенов; частота инъекций; типы используемых наполнителей; типы используемых способов совместного стимулирования; используемые пути иммунизации; типы вторичной лимфоидной ткани, используемой для слияния. Разрабатывали серии новых иммунизационных стратегий, включающих в себя, например: (i) иммунизацию вирусными частицами, экспрессирующими только CD3, и (ii) иммунизацию костимуляторными сигналами (например, CD40, CD27 или их комбинациями), вводившимися совместно с Т-клетками, тимоцитами или с клетками, которые были трансфицированы для экспрессии рекомбинантного CD3. В первой новой иммунизационной стратегии, обозначенной здесь как протокол гиперстимуляции, мышей HuMAb (Medarex, Inc., Princeton, NJ) или KM (Medarex, Inc., Kirin) иммунизировали первой инъекцией человеческих клеток, например тимоцитов или Т-клеток. В промежутках времени от 1 до 8 недель после инъекции тимоцитов и/или Т-клеток мыши получали одну или более последующих гиперстимулирующих инъекций. Гиперстимулирующая инъекция включает в себя, например, растворимый белок CD3 (например,рекомбинантный растворимый белок CD3), дополнительные инъекции тимоцитов или Т-клеток, клетки,трансфицированные CD3, вирусные частицы, экспрессирующие высокие уровни CD3 и их комбинации. Например, гиперстимулирующая инъекция содержит комбинацию растворимого белка CD3 и клетки,трансфицированные CD3. Преимущественно, в протоколах стимулирующей гипериммунизации, иммунизированные мыши получали две финальные гиперстимулирующие инъекции на 6 и 3 сутки перед слиянием лимфатических узлов и/или селезенки. Например, у мышей KM ткань слияния происходит из селезенки, у мышей HuMAb ткань слияния происходит из лимфатических узлов и/или ткани селезенки. В одном примере протокола стимулирующей гипериммунизации одну мышь HuMAb иммунизировали трижды человеческими тимоцитами (106 клеток) в 0, 7 и 28 сутки. Китайскую линию клеток яичника (СНО), трансфицированных кДНК, кодирующей человеческие цепи CD3 и(CHO/CD3, 106 клеток), затем вводили на 47 и 65 сутки. Другую стимуляцию вирусными частицами, экспрессирующими высокие уровни CD3 на своей поверхности, проводили на 79 сутки. В итоге, мышам вводили растворимый рекомбинантный человеческий CD3 на 121 и 124 сутки перед слиянием лимфатических узлов на 127 сутки. Все иммунизации проводили подкожно с Ribi (Corixa Corp., Seattle WA) в качестве наполнителя. Всего в слиянии было задействовано 8,5106 клеток. Только семь из 470 исследованных гибридом вырабатывали полностью человеческие антитела анти-CD3, и все полностью человеческие антитела анти-CD3 были молекулами IgM. Два из этих антител анти-CD3 были отобраны как кандидаты для клинического терапевтического применения (фиг. 1-3). Во втором примере протокола стимулирующей гипериммунизации одну мышь KM дважды иммунизировали растворимым рекомбинантным человеческим CD3 на 0 и 25 сутки. Человеческие тимоциты (106 клеток) использовали затем для стимуляции на 40, 49 и 56 сутки. Растворимый рекомбинантный CD3 инъецировали дважды на 70, 77, 84 и 91 сутки. Линию мышиных Т-клеток, трансфицированных кДНК, кодирующейицепи человеческого CD3 (EL4/CD3, 106 клеток), инъецировали на 98 сутки. В конце мышам вводили растворимый рекомбинантный человеческий CD3 на 101 сутки, перед слиянием селезенки на 104 сутки. Иммунизацию проводили интраперитонеально с Alum в качестве наполнителя, кроме 70 дня, когда в качестве наполнителя применяли Ribi. CpG использовали как костимуляторный агент на 0, 25, 84 и 91 сутки. В целом слиянию подвергали 1,27108 клеток. Только пять из 743 исследованных гибридом продуцировали полностью человеческие антитела анти-CD3, и все полученные антитела были молекулами IgG. Одно из этих антител анти-CD3 было отобрано как кандидат для клинического терапевтического применения (фиг. 4). Критерии отбора: кандидатов на клиническое терапевтическое применение отбирали с использованием следующих критериев. Во-первых, анализировали связывание антител с CD3-позитивными клетками по сравнению с CD3-негативными клетками. Для этого Jurkat CD3-позитивные клетки (J+) и Jurkatнегативные клетки (J-) инкубировали с различными антителами и анализировали связывание путем проточной цитометрии (фиг. 9 А). Во-вторых, конкурентный анализ, в котором способность антителакандидата ингибировать связывание мышиных анти-человеческих моноклональных антител ОКТ 3 сCD3-позитивными клетками, применяли с использованием клеток J+ и конкуренцию определяли путем проточной цитометрии (фиг. 9 В). Затем, антигенную модуляцию CD3 и TCR на поверхности Т-клеток периферической крови человека изучали путем проточной цитометрии (фиг. 9 С). В конце, предпринимали анализ пролиферации Т-cell с использованием Т-клеток периферической крови человека, окрашенныхCFSE, и деление клеток определяли путем проточной цитометрии (фиг. 9D). Пример 2. Изменение изотипа антител анти-CD3 человека. Некоторые антитела huCD3, полученные с использованием новых протоколов, описанных в приме- 28010350 ре 1, были антителами IgM. Эти антитела IgM преобразовывали в антитела IgG, преимущественно в антитела IgG1. Например, антитела IgM преобразовывали путем способа клонирования, в котором область VDJ гена, кодирующего антитело IgM, клонировали в ген тяжелой цепи IgG1, полученный из вектора, содержащего ген, кодирующий аллотип F гамма 1. Для преобразования легкой цепи последовательность IgM клонировали в вектор, содержащий область каппа. В мышах Medarex, например HuMAb,получали множественные легкие цепи, благодаря дефициту аллельных исключений. Каждую комбинацию тяжелых и легких цепей трансфицировали в клетки с использованиемFuGENE 6 (Roche Diagnostics) трансфицирующего агента в соответствии с инструкцией производителя. Секретированные моноклональные антитела тестировали для оптимизации функционирования, например связывания с антигеном-мишенью, с использованием критериев отбора, описанных в примере 1. Пример 3. Антигенная модуляция с использованием антител huCD3. Антитела huCD3 по изобретению способны к антигенной модуляции, которую определяют как перераспределение и элиминацию комплекса, индуцированного связыванием антитела. Экспрессия других молекул на клеточной поверхности Т-клеток, включающая в себя, например, CD4, не меняется при экспозиции с антителами анти-СВ 3 по изобретению (фиг. 9 С). Пример 4. Уменьшение синдрома высвобождения токсичных цитокинов с помощью антителhuCD3. Преимущественно, антитела huCD3 по изобретению включают в себя мутацию области Fc, такую как мутацию, изменяющую течение синдрома высвобождения цитокинов. Как описано выше, синдром высвобождения цитокинов (CRS) является частым осложнением, развивающимся при использовании анти-Т-клеточных антител, таких как ATG (антитимоцитарный глобулин) и ОКТ 3 (мышиные антитела анти-CD3). Этот синдром характеризуется избыточным высвобождением цитокинов, таких как TNF,IFN-гамма и IL-2, в циркуляцию. Цитокины, выделяемые активированными Т-клетками, вызывают разновидность системного воспалительного ответа, сходного с наблюдаемым при тяжелых инфекциях и характеризующегося гипотензией, лихорадкой и слабостью. Симптомы CRS включают в себя, например,жар, ознобы, тошноту, рвоту, гипотензию и диспноэ. Антитела huCD3 по изобретению содержат одну или более мутаций, которые предотвращают высвобождение одного или более цитокин(ов), опосредованное константной областью, содержащей тяжелые цепи, in vivo. В одном варианте осуществления антитела huCD3 по изобретению являются молекулами IgG, имеющими одну или более из следующих мутаций в модифицированном скелете IgG 1: "1N2 97A", в котором остаток аспарагина в положении 297 замещен остатком аланина; "1 L234/A,L235/A", в котором остатки лейцина в положениях 234 и 235 замещены остатками аланина; "1 L234/A;L235/E", в котором остаток лейцина в положении 234 замещен остатком аланина, тогда как остаток лейцина в положении 235 замещен остатком глутаминовой кислоты; "1 L235/E", в котором остаток лейцина в положении 235 замещен остатком глутаминовой кислоты; и "1 D2 65/A", в котором остаток аспартата в положении 265 замещен остатком аланина. Описанные здесь остатки, содержащие тяжелые цепи, взяты из индекса EU (смотри Kabat et al., "Proteins of Immunological Interest", US Dept. of HealthHuman Services (1983, как показано, например, в патентах США 5624821 и 5648260, содержание которых полностью включено здесь в виде ссылки. Другие модификации скелета IgG 1, которые могут быть использованы в антителах huCD3 по изобретению, включают в себя, например, "A330/S", в котором остаток аланина в положении 330 замещен остатком серина, и/или "P331/S", в котором остаток пролина в положении 331 замещен остатком серина. Полностью человеческие антитела CD3 по изобретению, имеющие мутацию L234L235A234E235 в области Fc, имеют уникальную функцию - элиминацию высвобождения цитокинов в присутствии антителhuCD3. Предшествующие исследования исключали из использования LE мутации (см., например, Xuet al., Cellular Immunology, 200, pp. 16-26 (2000), на стр. 23). Однако именно эти две мутации в положениях 234 и 235 (т.е., L234L235A234E235) элиминируют синдром высвобождения цитокинов, как показано наin vitro аналитической системе мононуклеарных клеток периферической крови человека (фиг. 11 А, 11 В). В этом анализе мононуклеарные клетки периферической крови человека изолировали с использованием градиента фиколла, меченного CFSE, и клетки, меченные CFSE, высаживали затем на 96-луночные плашки. Различные моноклональные антитела добавляли в разных разведениях и инкубировали в течение 72 ч при 37 С. Через 6 ч 50 мкл супернатанта отбирали для изучения выделения TNF с помощьюELISA. Через 48 ч 50 мкл супернатанта отбирали для изучения выделения IFN- с помощью ELISA. Через 72 ч клетки собирали и анализировали пролиферацию с помощью FACS с использованием интенсивности CFSE-мечения. Таким образом, в противоположность дикому типу тяжелых цепей и в противоположность сериям других мутаций, описанным другими исследователями (например, TolerX (мутации агликозилирования),Bluestone (мутации L234L235A234A235) (см., например, патент США 5885573, которые все показывали значительный уровень эффекта, связанного с выделением цитокинов, мутации L234L235A234E235 антител huCD3 по изобретению не проявляли феномен высвобождения цитокинов. Уровень проявления эффекта высвобождения цитокинов был 100% для дикого типа Fc, около 50-60% для мутаций Bluestone(L234L235A234A235) и неопределимым для мутаций Ala/Glu Fc, описанных здесь (фиг. 11 А, 11 В). Пример 5. Пептидный анализ идентификации эпитопа связывания антител huCD3. Синтез и исследование способом ELISA большого количества пептидов использовали для определения аминокислотных остатков, входящих в эпитоп, для различных моноклональных антител (см., например, Geysen et al., J Immunol Methods, vol. 102(2):259-74 (1987. В экспериментах, описанных здесь,анализы перекрывающихся пептидов, происходящих из аминокислотной последовательности эпсилонцепи CD3, были получены от Jerini (Berlin, Germany) и затем тестированы на места связывания полностью человеческими анти-CD3 мAb по изобретению. Пептиды в анализах получали с использованием способа "SPOT синтеза" для прямого химического синтеза на мембранной основе (см. Frank and Overwin, Meth Mol Biol, vol. 66:149-169 (1996); Kramer andSchneider-Mergener, Meth Mol Biol, vol. 87:25-39 (1998. Линейные 14-мерные пептиды ковалентно связывали с целлюлозной основой Whatman 50 С-концами, оставляя N-концы свободными (т.е. несвязанными). При использовании стандартных способов вестерн-блоттинга с данными пептидами, связанными с твердой фазой, показано, что моноклональное антитело 28F11 распознавало перекрывающийся набор аминокислот поблизости от N-конца (фиг. 10). Другие варианты осуществдения Поскольку изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, приведенное выше описание предназначено для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем следующей формулы изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело против CD3 или его фрагмент,где указанное антитело имеет следующие характеристики:b) модулирует уровень экспрессии CD3 на клеточной поверхности или его активность иc) снижает уровень экспрессии Т-клеточного рецептора на клеточной поверхности или его активность. 2. Антитело по п.1, где указанное антитело ингибирует связывание мышиного моноклонального антитела ОКТ 3 против человеческого белка с Т-лимфоцитом. 3. Антитело по п.1, где указанное антитело связывается с эпитопом, который полностью или частично включает в себя аминокислотную последовательность EMGGITQTPYKVSISGT (SEQ ID NO: 67). 4. Антитело по п.1, где указанное антитело включает в себя мутацию в тяжелой цепи в аминокислотном остатке в положении 234, 235, 265 или 297 или сочетания таких мутаций и снижает высвобождение цитокинов из Т-клетки. 5. Антитело по п.4, где указанная мутация приводит к появлению в указанном положении аланина или глутаминовой кислоты. 6. Антитело по п.1, где указанное антитело имеет изотип IgG1 и содержит по меньшей мере первую мутацию в положении 234 и вторую мутацию в положении 235, где указанная первая мутация приводит к появлению остатка аланина в положении 234, а указанная вторая мутация приводит к появлению остатка глутаминовой кислоты в положении 235. 7. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело, где указанное антитело имеет тяжелую цепь с тремя CDR, содержащими аминокислотную последовательность, выбранную из группы,состоящей из аминокислотных последовательностей GYGMH (SEQ ID NO: 27); VIWYDGSKKYADSVKG (SEQ ID NO: 44), и легкую цепь с тремя CDR, которые включают в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей RASQSQQFNSYPIT (SEQ ID NO: 47), где указанное антитело связывается с CD3. 8. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело, где указанное антитело имеет тяжелую цепь с тремя CDR, содержащими аминокислотную последовательность, выбранную из группы,состоящей из аминокислотных последовательностей GYGMH (SEQ ID NO: 27); VIWYDGSKKYADSVKG (SEQ ID NO: 44), где указанное антитело связывается с CD3. 9. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело, где указанное антитело включа- 30