Антитела к pcsk9 и их применение

Изобретение относится к антителам к пропротеинконвертазе субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9) или их антигенсвязывающим фрагментам, композициям, включающим такие антитела к PCSK9 или антигенсвязывающие фрагменты, и способам их применения для лечения гиперлипидемии или гиперхолестеринемии.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) Настоящее изобретение относится к области медицины. В частности, настоящее изобретение относится к антителам к пропротеинконвертазе субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), композициям, включающим такие PCSK9-антитела, и способам применения PCSK9-антител для лечения гиперлипидемии или гиперхолестеринемии. Пропротеинконвертаза субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9) является секретируемой сериновой протеазой, продуцируемой главным образом в печени, регулирующей концентрацию холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛПНП-Х) в плазме. Секретируемая PCSK9 связывается и интернализуется с рецептором ЛПНП (LDLR), расположенным на поверхности гепатоцитов. Благодаря LDLR плазма очищается от ЛПНП-Х за счет связывания и транспортировки частиц ЛПНП в лизосомы, где происходит их разрушение. После доставки частицы ЛПНП для разрушения LDLR восстанавливаются на поверхности гепатоцитов, где связывает и интернализует следующую молекулу ЛПНП-Х из плазмы. PCSK9 регулирует уровень ЛПНП-Х в плазме, направляя интернализованный LDLR на разрушение, а не на восстановление на поверхности клетки, за счет чего снижается клиренс ЛПНП-Х. Исследования на грызунах с дефицитом или сверхэкспрессией PCSK9 подтвердили, что PCSK9 контролирует уровни циркулирующего ЛПНП путем регуляции уровней LDLR. Данные о том, что циркулирующая PCSK9 участвует в разрушении LDLR печени, указывают, что нейтрализация PCSK9 антителами является перспективным терапевтическим подходом к снижению ЛПНП-Х. Кроме того, сообщалось, что статины, в настоящее время являющиеся стандартным средством для снижения ЛПНП-Х, фактически могут увеличивать экспрессию и уровни PCSK9 в сыворотке. Таким образом, антитело к PCSK9 также может снижать ЛПНП-Х синергично с лечением статинами. Антитела к PCSK9 и их влияние на снижение ЛПНП-Х в плазме известны в данной области техники. Например, в US 2009/0246192, US 2009/0142352, US 2010/0166768 и WO 2010/029513 описаны такие антитела к PCSK9 и их применение. Тем не менее, в настоящее время отсутствуют антитела, мишенью которых является PCSK9, одобренные для терапевтического применения. Таким образом, остается потребность в альтернативных PCSK9-антителах. В частности, остается потребность в альтернативныхPCSK9-антителах, эффективно снижающих уровень ЛПНП-Х. В частности, остается потребность в альтернативных антителах к PCSK9, эффективно снижающих уровень ЛПНП-Х и обеспечивающих пролонгированное действие (например, пролонгированную супрессию уровня ЛПНП-Х). В предпочтительном случае такие антитела также обладают хорошими физико-химическими свойствами, облегчающими разработку, производство или изготовление лекарственных препаратов. Настоящее изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающее вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), причемHCVR включает гипервариабельные участки (CDR) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, a LCVR содержит CDRLCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем аминокислотная последовательность HCDR1 представляет собойSEQ ID NO: 6, причем указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с PCSK9 человека. В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающее вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), причем аминокислотная последовательность HCVR представляет собойSEQ ID NO: 7, а аминокислотная последовательность LCVR представляет собой SEQ ID NO: 8, причем указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с PCSK9 человека. В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающее две вариабельные области тяжелой цепи (HCVR) и две вариабельные области легкой цепи (LCVR), причем аминокислотная последовательность каждой HCVR представляет собойSEQ ID NO: 7, а аминокислотная последовательность каждой LCVR представляет собой SEQ ID NO: 8. В еще одном конкретном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающее тяжелую цепь (НС) и легкую цепь (LC), причем аминокислотная последовательность НС представляет собой SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность LC представляет собой SEQ ID NO: 10. В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает антитело, включающее две тяжелые цепи (НС) и две легкие цепи (LC), причем аминокислотная последовательность каждой НС представляет собой SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность каждой LC представляет собой SEQ ID NO: 10. В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает антитело, включающее две НС и две LC, причем аминокислотная последовательность каждой НС представляет собой SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность каждой LC представляет собой SEQ ID NO: 10. Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции, включающие антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемые носители, разбавители или вспомогательные вещества. Более конкретно, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению дополнительно включает один или несколько дополнительных тера-1 024430 певтических агентов. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения гиперлипидемии или гиперхолестеринемии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению для применения в терапии. Настоящее изобретение также обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению для применения при лечении гиперлипидемии или гиперхолестеринемии. Настоящее изобретение также обеспечивает применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения гиперлипидемии или гиперхолестеринемии. Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты и векторам экспрессии,кодирующим антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает антитело, полученное способом, причем указанный способ включает (а) культивирование клетки-хозяина, включающей первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, заданную SEQ ID NO: 9, и вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую вторую полипептидную последовательность, заданнуюSEQ ID NO: 10, при условиях, в которых экспрессируется указанная полипептидная последовательность,и (b) выделение из указанной клетки-хозяина антитела, включающего тяжелую цепь и легкую цепь, причем полипептидная последовательность указанной тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9, а полипептидная последовательность указанной легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10. Конкретнее, антитело, получаемое указанным способом, включает две тяжелые цепи и две легкие цепи, причем полипептидная последовательность каждой тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9, а полипептидная последовательность каждой легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10. Полноразмерное антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, включающую две тяжелые (Н) и две легкие (L) цепи, связанные друг с другом дисульфидными связями. N-концевая часть каждой цепи включает вариабельную область размером около 100-110 аминокислот, ответственных, в первую очередь, за распознавание антигена гипервариабельными участками (CDR), содержащихся в них. Сконцевая часть каждой цепи ограничивает константную область, главным образом ответственную за эффекторную функцию. Легкие цепи подразделяются на каппа- или лямбда-, каждая из которых характеризуется определенной константной областью, как известно в данной области техники. Тяжелые цепи подразделяются на гамма-, мю-, альфа-, дельта- или эпсилон- и определяют изотип антитела - IgG, IgM, IgA,IgD или IgE соответственно. Антитела IgG, кроме того, делятся на подклассы, например IgGl, IgG2, IgG3,IgG4. Каждый тип тяжелой цепи также характеризуется определенной константной областью с последовательностью, общеизвестной специалистам. "Антигенсвязывающий фрагмент" в настоящем документе относится кFv-фрагментам, связывающимся с PCSK9 человека. Термин "связываться (или "связывается") с PCSK9 человека" в настоящем документе относится к взаимодействию с эпитопом на PCSK9 человека, представленным аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14. Термин "эпитоп" в настоящем документе относится к отдельному трехмерному сайту на поверхности антигена, распознаваемому антителами или антигенсвязывающими фрагментами согласно изобретению.CDR перемежаются участками, которые являются более консервативными и называются каркасными участками ("FR"). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR) и вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Три CDR легкой цепи обозначаются как "LCDR1,LCDR2 и LCDR3", а три CDR тяжелой цепи обозначаются как "HCDR1, HCDR2 и HCDR3". CDR содержат большую часть остатков, участвующих в специфическом взаимодействии с антигеном. Нумерацию и определение положения аминокислотных остатков в CDR в пределах областей LCVR и HCVR антител или антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению можно выполнить в соответствии с общеизвестным правилом нумерации Kabat (LCDR 1-3, HCDR2-3) или в соответствии с Kabat иChothia (HCDR1). Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны специалистам в данной области техники, соответствующую информацию можно найти, например, в Harlowand Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York, chapters 5-8 and 15. Например, можно иммунизировать мышей PCSK9 человека или ее фрагментами, а затем выделить, очистить и определить аминокислотные последовательности полученных антител с использованием обычных способов, хорошо известных в данной области техники. Антигенсвязывающие фрагменты также можно получить с помощью обычных способов. Антитело или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению сконструированы таким образом,что содержат одну или несколько каркасных областей человека, окружающих участки CDR, полученные из антитела нечеловеческого происхождения. Последовательности каркасной области антител эмбрионального типа человека можно получить в ImMunoGeneTics (IMGT) через их веб-сайт http://imgt.cines.fr,или из The Immunoglobulin Facts Book Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Конкретные каркасные области легкой цепи эмбрионального типа для использования в составе антитела или антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению включают A3 иO2. Конкретные каркасные области тяжелой цепи эмбрионального типа для использования в составе антитела или антигенсвязывающих фрагментов согласно настоящему изобретению включают VH3-21 иVH3-23. Сконструированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению можно получить и очистить в соответствии с известными способами. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую цепь (например, аминокислотную последовательность, заданнуюSEQ ID NO: 10), можно клонировать и сконструировать в экспрессирующем векторе GS (глутаминсинтетазы). Сконструированный иммуноглобулин-вектор экспрессии затем можно стабильно трансфицировать в клетки СНО. Специалисту в данной области техники известно, что экспрессия антител у млекопитающего приведет к гликозилированию, обычно по высококонсервативным сайтам N-гликозилирования в Fc-области. Стабильные клоны можно проверить на экспрессию антитела, специфически связывающегося с PCSK9 человека. Положительные клоны можно размножить в бессывороточной культуральной среде для продуцирования антител в биореакторах. Среду, в которую секретируются антитела, можно очистить обычными способами. Например, среду можно нанести на колонку с белком А- илиG-сефарозой FF, уравновешенную совместимым буфером, например фосфатно-солевым буфером. Колонку промывают для удаления неспецифически связавшихся компонентов. Связанное антитело элюируют, например, градиентом рН и детектируют фракции антитела, например, методом электрофореза в ДСН-ПААГ, а затем объединяют их. Антитело можно концентрировать и/или подвергнуть стерильной фильтрации с помощью распространенных методик. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалить с использованием обычных методик, включая эксклюзионную, гидрофобную, ионообменную хроматографию или хроматографию на гидроксиапатите. Продукт можно немедленно заморозить,например, при -70 С или лиофилизировать. Антитела согласно настоящему изобретению являются моноклональными антителами. В настоящем документе термин "моноклональное антитело" или "мАт" относится к антителу, происходящему от единственной копии или клона, включая, например, клон эукариотической, прокариотической клетки или фага, а не к способу, которым оно получено. Моноклональные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты можно получить, например, с использованием гибридомных технологий, рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий, например CDR-трансплантации, или их комбинации, или иных технологий, известных в данной области техники. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или нуклеиновая кислота, кодирующая их, представлены в изолированной форме. В настоящем описании термин "изолированный" (выделенный) относится к белку, пептиду или нуклеиновой кислоте,не содержащим или по существу не содержащим других макромолекулярных соединений, встречающихся в клеточном окружении. В настоящем описании термин "по существу не содержащий" означает, что белок, пептид или нуклеиновая кислота, представляющие интерес, состоят из представленных высокомолекулярных соединений более чем на 80% (в молярном соотношении), предпочтительно более чем на 90% и более предпочтительно более чем на 95%. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению можно применять при лечении пациентов. Термин "лечение" (или "лечить") относится к замедлению, прерыванию,купированию, облегчению, остановке, снижению или обращению развития или тяжести существующего симптома, расстройства, состояния или заболевания. В настоящем описании "пациент" относится к человеку или млекопитающему, не являющемуся человеком, однако предпочтительно относится к человеку. В настоящем описании термин "эффективное количество" относится к количеству или дозе антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, которое при однократном или многократном введении пациенту обеспечивает желательное воздействие на пациента, подвергаемого лечению. Эффективное количество может легко определить лечащий диагност, как специалист в данной области техники с учетом ряда факторов, например вида млекопитающего; его размера, возраста и общего состояния здоровья; конкретного заболевания; степени или тяжести заболевания; реакции отдельного пациента; конкретного вводимого антитела; режима введения; характеристик биодоступности вводимого препарата; выбранной схемы приема и применения сопутствующих препаратов. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению или включающие их фармацевтические композиции можно вводить парентеральным путем (например, подкожно,внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно или трансдермально). Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно получить способами, широко известными в данной области техники (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro et al.,Mack Publishing Co.); указанные композиции включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, и один или более фармацевтически приемлемых носителей,разбавителей или вспомогательных веществ. Например, можно получить состав антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению с такими агентами, как цитрат на-3 024430 трия, лимонная кислота, полисорбат 80 и сахароза, а затем лиофилизировать полученную композицию и хранить ее при 2-8 С. Затем лиофилизированная композиция может быть восстановлена в стерильной воде для инъекций перед введением. Следующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение; в то же время понятно, что примеры приведены в качестве иллюстрации, а не ограниченияи что специалист в данной области техники может внести в них различные изменения. Пример 1. Сконструированное PCSK9-антитело. Мышь иммунизировали пептидом, включающим укороченный по С-концу фрагмент PCSK9 человека (SEQ ID NO: 17); IgG-антитела, связывающие PCSK9, выделяли и клонировали с помощью стандартных способов. CDR выделенных Fab мыши рандомизировали путем мутагенеза и проводили скрининг сродства полученных антител к PCSK9 человека. Мутации, усиливающие сродство, объединяли и оптимизированные CDR встраивали в каркасные области VH3-21 и A3 тяжелых и легких цепей человека соответственно. Для дальнейшей оптимизации биофизических свойств гуманизированного антитела вводили направленные замены ароматических и гидрофобных аминокислот в последовательности CDR. Кроме того, выполняли скрининг дополнительных мутаций, усиливающих сродство, в рандомизированных библиотеках CDR. Благоприятные мутации CDR объединяли случайным образом и экспрессировали, а затем выполняли скрининг сродства полученных антител к PCSK9 человека. Получили полноразмерное гуманизированное и оптимизированное PCSK9-антитело, содержащее следующие аминокислотные последовательности. Соответствующие последовательности кДНК, кодирующие аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 соответственно представляют собой: Пример 2. Экспрессия сконструированного PCSK9-антитела. Сконструированное антитело к PCSK9 согласно примеру 1 можно экспрессировать в стабильно трансфицированных клетках линии СНО. Глутаминсинтетазный (GS) вектор экспрессии, содержащий кДНК SEQ ID NO: 11 (кодирующую аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9) и SEQ ID NO: 12 (кодирующую аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10), использовали для трансфекции линии клеток китайского хомячка CHOK1SV (Lonza Biologies PLC, Slough,Великобритания) путем электропорации. Указанный вектор экспрессии кодировал ранний SV (вирус обезьян 40 Е) промотор и ген GS. Экспрессия GS обеспечивала биохимический синтез глутамина, аминокислоты, необходимой клеткам CHOK1SV. После трансфекции клетки подвергали массовому отбору с использованием 50 мкМ L-метионинсульфоксимина (MSX). Для увеличения жесткости отбора использовали ингибирование GS с помощью MSX. Клетки с кДНК вектора экспрессии, встроенной в транскрипционно активные области генома клетки-хозяина, можно отобрать путем сравнения с клеткамиCHOK1SV дикого типа, экспрессирующими эндогенный уровень GS. Жидкую культуру подвергали клонированию одиночных клеток с использованием технологии флуоресцентной сортировки клеток (FACS); клонированные линии клеток размножали и подвергали скринингу экспрессии сконструированного антитела к PCSK9 в соответствии с примером 1.PCSK9-связывающий эпитоп IgG мыши (из которого было получено сконструированное антитело кPCSK9 из примера 1) определяли путем экстракции эпитопа и масс-спектрометрии с водороднодейтериевым обменом и сужали до области в пределах линейной аминокислотной последовательности 160-181 каталитического домена PCSK9 человека (нумерация аминокислот основана на полноразмерной последовательности PCSK9 человека, включая сигнальный пептид размером 28 аминокислот). Взаимодействие сконструированного антитела в соответствии с примером 1 с указанным эпитопом каталитического домена PCSK9 человека подтверждали оценкой его связывания с синтетическими пептидами, соответствующими остаткам 160-181 (табл. 1). Сконструированное антитело в соответствии с примером 1 связывало пептид 160-181 с более высоким сродством, чем интактную PCSK9 человека, причем различие было обусловлено повышенной скоростью ассоциации (kon). Скорость диссоциации (koff) менее чем в 2 раза превышала аналогичный параметр интактной PCSK9, что указывало на близкую силу взаимодействия (после связывания). Кроме того, данные показывают, что почти все детерминанты связывания содержатся в указанной линейной области PCSK9. Связывание сконструированного антитела в соответствии с примером 1 с пептидом 166-181 было значительно слабее, чем с пептидом 160-181, что демонстрировало роль аминокислоты (или нескольких аминокислот) в области 160-165. Связывание сконструированного антитела в соответствии с примером 1 с пептидом 163-174 было значительно сильнее, чем с пептидом 166-181, что также указывало на вклад остатков 163-165. Таблица 1 Кинетика связывания и сродство антитела в соответствии с примером 1 к пептидам, соответствующим последовательностям каталитического домена PCSK9 человека Использовали зрелую форму hPCSK9, не содержащую сигнальный пептид размером 28 аминокислот и содержащую С-концевой His-маркер. Номера аминокислот присваивали в соответствии с полной PCSK9 человека, включающей сигнальный пептид размером 28 аминокислот. Пример 4. Кинетика связывания и сродство. Анализ методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР), широко известный в данной области техники, использовали для оценки кинетики связывания и сродства тестируемого антитела к PCSK9 кPCSK9 человека, яванского макака, мыши, крысы и кролика. При использовании буфера с физиологическими параметрами (ионной силой и рН) и температурой (37 С) сконструированное антитело в соответствии с примером 1 связывалось с PCSK9 человека со средней константой ассоциации (kon) 1,2105 M-1 с-1 и средней константой диссоциации (koff) 1,210-3 с-1. Средняя KD связывания PCSK9 человека со сконструированным антителом в соответствии с примером 1 составила приблизительно 11 нМ. Сконструированное антитело в соответствии с примером 1 связывалось с PCSK9 яванского макака со средней скоростью ассоциации (kon) 1,1105 M-1 с-1 и средней скоростью диссоциации (koff) 2,510-3 с-1,что обеспечивало KD связывания с PCSK9 яванского макака приблизительно 25 нМ. В табл. 2 показана сводная информация по дополнительным результатам, полученным для сконструированного антитела кPCSK9 в соответствии с примером 1 с использованием PCSK9 мыши, крысы и кролика. Приведенные данные показывают, что сконструированное антитело к PCSK9 в соответствии с примером 1 связывалось с PCSK9 как человека, так и яванского макака с наномолярным сродством при физиологических рН,ионной силе и температуре."NB" Связывание не обнаружено. Анализ выполняли при 37 С. Анализ выполняли при 25 С.PCSK9 регулирует уровень ЛПНП-Х в плазме, снижая содержание LDLR в печени, что приводит к снижению поглощения ЛПНП гепатоцитами. Каталитический домен PCSK9 является областью, связывающейся с LDLR. Таким образом, ожидается, что антитела, распознающие каталитический доменPCSK9, ингибируют связывание PCSK9 с LDLR. Для определения влияния тестируемого антитела к PCSK9 на связывание PCSK9 с рецептором ЛПНП использовали формат AlphaLISA. Рекомбинантную полноразмерную PCSK9, используемую в анализе, экспрессировали как белок с С-концевым HIS-маркером в стабильной линии клеток 293 эмбриональной почки человека (HEK) (Qian et al., J. Lipid Res. 48: 1488-1498, 2007). Рекомбинантный внеклеточный домен рецептора ЛПНП экспрессировали как белок с С-концевым FLAG-маркером во транзиентно трансфицированных клетках HEK 293 Е (Qian et al., J. Lipid Res. 48: 1488-1498, 2007). мАт мыши кPCSK9, связывавшееся с С-концевым доменом PCSK9 человека, экспрессировали в клетках HEK 293 и очищали на аффинной колонке с белком G, а затем на Superdex 200. Моноклональное антителоANTI-FLAG BioM2 (Sigma) является очищенным моноклональным IgG1-антителом мыши, ковалентно связанным с биотином гидразидной связью. ANTI-FLAG BioM2 распознает последовательность FLAG наN-конце, Met-N-конце или С-конце гибридных FLAG-белков. ANTI-FLAG BioM2 можно обнаружить с помощью конъюгатов авидина или стрептавидина. Моноклональное антитело ANTI-FLAG BioM2 поставлялось в растворе 50% глицерина, 10 мМ фосфата натрия, рН 7,25, 150 мМ NaCl, содержащем 0,02% азид натрия, и хранилось при температуре -20 С. Эксперименты AlphaLISA проводили в 384-луночных белых планшетах ProxiPlate (Perkin Elmer) с использованием 25 мМ HEPES; рН 7,5, 100 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl2, 0,5% ТХ-100, 0,1% казеина, 1 мг/мл декстрана-500 и 0,05% Proclin-300 в качестве буфера. В анализе использовали донорные гранулы со стрептавидином AlphaLISA Streptavidin Donor Beads (Perkin Elmer) и мАт мыши против PCSK9,конъюгированное с акцепторными гранулами AlphaLISA Acceptor beads. Когда гранулы располагались в непосредственной близости друг от друга за счет взаимодействия партнеров по связыванию - PCSK9 иLDLR, происходил перенос синглетного кислорода с донорной гранулы на акцепторную гранулу. При возбуждении лазером при 680 нм синглетный кислород возбуждает акцепторную гранулу, что приводит к световому излучению. Акцепторные гранулы связывали с мАт мыши к PCSK9 за счет восстановительного аминирования, используя NaBH3CN (Sigma), и хранили при 4 С. Акцепторные гранулы, конъюгированные с мАт против PCSK9 (22 мкг/мл) предварительно нагружали 2,22 нМ PCSK9 в течение 1 ч. Донорные гранулы (44 мкг/мл) предварительно нагружали 5,55 нМ ANTI-FLAG BioM2 и 2,22 нМ LDLR,содержащего FLAG-маркер, в течение 1 ч. После предварительной нагрузки в ProxiPlate, содержавший 9 мкл каждой смеси гранул (конечная концентрация PCSK9 и LDLR = 1 нМ), добавляли 2 мкл тестируемого антитела к PCSK9 или контрольного IgG с помощью полностью автоматизированного Multimek (Beckman) и оставляли связываться в течение ночи при комнатной температуре. Сигнал AlphaLISA (событий в секунду) измеряли с помощью Envision Turbo (Perkin Elmer). Все эксперименты с анализом AlphaLISA проводили в условияхPCSK9 человека с LDLR в анализе AlphaLISA возрастало в зависимости от концентрации PCSK9. Добавление сконструированного антитела к PCSK9 в соответствии с примером 1 (тестируемого PCSK9 антитела) вызывало зависимое от концентрации полное ингибирование связывания PCSK9 с LDLR при средней IC50 приблизительно 90 пМ. Контрольный IgG4 не оказывал влияния в ходе анализа. Результаты указанного анализа продемонстрировали, что сконструированное антитело к PCSK9 в соответствии с примером 1 ингибировало связывание PCSK9 с LDLR. Пример 6. Ингибирование функции PCSK9 в клетках HepG2. Для определения влияния тестируемого антитела к PCSK9 на плотность LDLR на гепатоцитах клетки HepG2 человека культивировали в колбах Т 75 с поли-D-лизиновым покрытием. Через 24 ч клетки высевали в количестве 5000 клеток/лунку в 100 мкл среды DMEM/F-12 (3:1), содержавшей 5% (об./об.) сыворотки человека, истощенной по липопротеинам (LPDS; Intracel) в 96-луночные черные планшеты с поли-D-лизиновым покрытием (Becton-Dickinson). После инкубирования в течение ночи в среде, содержащей LPDS, клетки инкубировали с 69 нМ (5 мкг/мл) рекомбинантной PCSK9 человека с С-концевымHIS-маркером и тестируемым PCSK9-антителом или контрольным IgG4-антителом в концентрациях от 2,6 до 1333 нМ в течение 2 ч. Все этапы инкубирования выполняли при 37 С. Мониторинг уровня LDLR осуществляли с использованием LDLR-антитела (Progen), флуоресцентно меченого Zenon Alexa Fluor 488 и при помощи набора для мечения IgG2b мыши Mouse IgG2b Labeling Kit (Invitrogen). Клетки инкубировали с детекторным антителом в течение 90 мин при комнатной температуре, а затем фиксировали в течение 10 мин с использованием фиксатора, не содержащего формалина (Prefer; ANATECH, Ltd), с последующей пермеабилизацией в 0,01% тритоне Х-100. Клетки окрашивали 10 мкг/мл пропидий-йодида(Invitrogen) для определения общего количества клеток. Количественную оценку сигнала LDLR осуществляли с помощью лазерного сканирующего флуоресцентного микропланшетного цитометра с детектором флуоресценции Acumen Explorer (TTP LabTech). При осуществлении процедур, по существу, как описано выше, PCSK9 человека вызывала снижение LDLR на клетках HepG2 в зависимости от концентрации, причем ЕС 50 составляла 18 нМ. Сконструированное антитело к PCSK9 в соответствии с примером 1 (тестируемое PCSK9-антитело) ингибировалоPCSK9-индуцированную супрессию LDLR на клетках HepG2, причем IC50 составляла 104 нМ. Контрольный IgG4 человека был относительно неактивен при концентрациях до 1333 нМ. Указанные данные продемонстрировали, что сконструированное антитело к PCSK9 в соответствии с примером 1 ингибировалоPCSK9-опосредованное разрушение LDLR. Пример 7. Ингибирование PCSK9-индуцированного снижения поглощения ЛПНП. Для определения влияния тестируемого антитела к PCSK9 на поглощение ЛПНП клетки HepG2 высевали в количестве 5000 клеток/лунку в 100 мкл среды DMEM/F-12 (3:1) с 5% LPDS человека в 96-луночные черные планшеты с поли-D-лизиновым покрытием и инкубировали при 37 С в атмосфере 5% СО 2 в течение 18 ч. PCSK9 человека (69 нМ) добавляли к клеткам с тестируемым PCSK9-антителом или контрольным IgG4 человека или без них в концентрациях от 2,6 до 1333 нМ и предварительно инкубировали с клетками в течение 2 ч при 37 С. После добавления 100 нг/лунку флуоресцентно меченого ЛПНП (BODIPY-LDL, Invitrogen) клетки инкубировали в течение 4 ч при 37 С. Клетки фиксировали в фиксаторе, не содержащем формалина (Prefer; ANATECH, Ltd.) в течение 20 мин при комнатной температуре. После двукратной промывки клеток ФБР клетки пермеабилизовали буфером ФБР, содержащем 0,01% тритон Х-100, в течение 15 мин при комнатной температуре и окрашивали 10 мкг/мл пропидиййодида для определения общего количества клеток. Поглощение ЛПНП определяли с использованием лазерного сканирующего флуоресцентного микропланшетного цитометра Acumen Explorer и выражали в процентах флуоресцентных клеток по отношению к общему количеству клеток. Ответ тестируемого антитела к PCSK9 или контрольного IgG выражали в виде процентного ингибирования PCSK9, т.е. процента восстановления максимального поглощения ЛПНП в отсутствие PCSK9 по сравнению с исходным поглощением ЛПНП-X в присутствии только PCSK9. Кроме того, рассчитывали соответствующие значения IC50 для ингибирования PCSK9-индуцированного снижения поглощения ЛПНП. При осуществлении процедур, по существу, как описано выше, PCSK9 человека вызывала снижение поглощения ЛПНП клетками HepG2 в зависимости от концентрации, причем ЕС 50 составляла 32 нМ. Сконструированное антитело к PCSK9 в соответствии с примером 1 (тестируемое PCSK9-антитело) обращало PCSK9-индуцированное ингибирование, что приводило к усилению поглощения ЛПНП, в то время как контрольный IgG не вызывал обращения ингибирования. Конкретно, сконструированное антитело к PCSK9 в соответствии с примером 1 продемонстрировало среднее максимальное процентное ингибирование PCSK9 на 84% при среднем значении IC50 194 нМ. Указанные данные продемонстрировали,что сконструированное антитело к PCSK9 в соответствии с примером 1 ингибировало PCSK9 индуцированное снижение поглощения ЛПНП. Пример 8. Эффективность in vivo. Для определения фармакокинетических (ФК) и фармакодинамических (ФД) эффектов тестируемого антитела к PCSK9 in vivo тестируемое антитело можно ввести здоровым яванским макакам и затем определить различные ФК- и ФД-параметры. Например, тестируемое антитело к PCSK9 можно внутривенно или подкожно ввести здоровым, не подвергавшимся ранее воздействию PCSK9 яванским макакам и затем измерить концентрацию тестируемого антитела в сыворотке с использованием сэндвичтвердофазного ИФА с IgG человека. Концентрации в сыворотке, полученные в различные моменты времени после введения антитела, можно использовать для определения различных ФК-параметров тестируемого антитела, включая T1/2, Cmax, ППК и клиренс в плазме (CL). Аналогично, тестируемое антитело к PCSK9 можно внутривенно или подкожно ввести здоровым наивным яванским макакам и затем измерить концентрацию ЛПНП-Х в сыворотке с использованием автоматического анализатора (Direct LDL-CPlus, 2nd Gen., Roche Diagnostics). Осуществляя процедуры, по существу, как описано выше, оценивали фармакокинетику сконструированного антитела к PCSK9 в соответствии с примером 1 у здоровых яванских макаков после однократного внутривенного введения в дозе 1, 5 или 15 мг/кг и после однократного подкожного введения в дозе 5 мг/кг. Фармакокинетические параметры, определенные в ходе указанных исследований, представлены ниже в табл. 3. Таблица 3 Фармакокинетические параметры сконструированного антитела к PCSK9 в соответствии с примером 1 у яванских макаков ЛПНП в сыворотке измеряли после введения сконструированного антитела к PCSK9 в соответствии с примером 1 в двух независимых исследованиях. В обоих исследованиях свидетельства супрессии ЛПНП-Х были заметны в течение 24 ч после введения сконструированного антитела к PCSK9 в соответствии с примером 1. После внутривенного (в/в) введения антитела в соответствии с примером 1 в дозе 5 мг/кг наблюдали максимальное среднее снижение ЛПНП-Х на 60% (исследование 1) и на 25% (исследование 2). При в/в введении 5 мг/кг средняя супрессия ЛПНП-Х поддерживалась в течение приблизительно 8 недель (исследование 1) и 2 недель (исследование 2). В исследовании 2 отмечено умеренное влияние дозы (1-15 мг/кг) на величину супрессии ЛПНП-Х (25-35%). Влияние дозы на продолжительность супрессии ЛПНП-Х было более очевидным. При подкожном введении (5 мг/кг) сконструированное антитело к PCSK9 в соответствии с примером 1 эффективно обеспечивало супрессию уровня ЛПНП-Х,причем величина супрессии была аналогична таковой после внутривенного введения. Влияние сконструированного антитела к PCSK9 в соответствии с примером 1 на холестерин липопротеинов высокой плотности в любой дозе отсутствовало. Пример 9. Физико-химические свойства сконструированного PCSK9-антитела. Кроме того, обнаружено, что сконструированное антитело к PCSK9 в соответствии с примером 1 обладало хорошей растворимостью, химической стабильностью и физической стабильностью. А. Растворимость. Для удобства приема желательна достаточно высокая растворимость. Например, доза 1 мг/кг при введении посредством 1,0-мл инъекции пациенту весом 100 кг требует растворимости, равной 100 мг/мл. Кроме того, желательно сохранение антитела в мономерном состоянии без образования высокомолекулярных (ВМС) агрегатов при высокой концентрации. Для определения растворимости тестируемого антитела указанное антитело можно диализовать в (1) 10 мМ цитрат, рН 6; (2) 10 мМ цитрат, рН 6, 150 мМNaCl и (3) фосфатно-солевой буфер (ФБР) рН 7,4. Затем восстановленный диализат можно анализировать путем аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) с целью измерения процентного содер-8 024430 жания ВМС. Затем тестируемое антитело можно концентрировать в 4-мл центрифужном концентраторе при 25 С до предела растворимости или свободного объема концентратора. При достижении свободного объема, концентрацию регистрировали как . Затем концентрированное антитело можно анализировать методом эксклюзионной хроматографии для измерения процентного содержания ВМС. Для определения обратимости увеличения % ВМС при концентрировании концентрированный образец можно разбавить до 1 мг/мл и исследовать методом эксклюзионной хроматографии. При осуществлении процедур, по существу, как описано выше, сконструированное антитело кPCSK9 в соответствии с примером 1 проявляло растворимость более 128 мг/мл при всех протестированных условиях. Кроме того, при высоких концентрациях имел место лишь низкий уровень ВМС. Таблица 4 Процент ВМ-соединений в образцах для исследования растворимости,определенный методом эксклюзионной хроматографии В. Химическая стабильность. Химическая стабильность облегчает разработку составов препарата с достаточным сроком хранения. Для оценки химической стабильности тестируемого антитела можно изготовить составы указанного антитела в концентрации 1 мг/мл в 10 мМ цитратном буфере при рН 4, 5, 6 или 7. Затем составленные образцы инкубировали в течение 4 недель при 4, 25 и 40 С в рамках исследования ускоренного разложения. Изменения зарядового профиля антитела, отражающие химические изменения, можно оценить с помощью капиллярного изоэлектрического фокусирования (кИЭФ) в соответствии со стандартными процедурами. При осуществлении процедур практически в соответствии с вышеприведенным описанием анализ химической стабильности сконструированного антитела к PCSK9 в соответствии с примером 1 позволили получить следующие результаты. Таблица 5 Химическая стабильность, определенная с помощью кИЭФ Результаты показывают, что через 4 недели хранения при 25 С % основного пика снижался лишь на 4,1 процентных пункта в составе с рН 6 (рН, часто используемом при изготовлении составов антител),что указывает на достаточную химическую стабильность сконструированного антитела к PCSK9 в соответствии с примером 1 для облегчения разработки растворов с адекватным сроком хранения. Кроме того,указанное антитело также проявляло хорошую химическую стабильность при рН 5 и, в меньшей степени,при рН 7, что указывает на характеристики стабильности антитела, потенциально обеспечивающие изготовление составов в диапазоне рН. С. Физическая стабильность. Для оценки физической стабильности тестируемого антитела можно изготовить составы указанного антитела с концентрацией белка 1 мг/мл в 10 мМ цитратном буфере при рН 4, 5, 6 или 7 (или 10 мМ трис,рН 8). Затем образцы инкубировали в течение 4 недель при 4, 25 и 40 С в рамках исследования ускоренного разложения. После инкубирования оценивали физическую стабильность методом эксклюзионной хроматографии (SEC), отделявшей желательное мономерное антитело от агрегированного высокомолекулярного (ВМС) антитела. В табл. 6 приведена сводная информация по результатам анализа физической стабильности сконструированного антитела к PCSK9 в соответствии с примером 1 после выполнения процедур, по существу,-9 024430 как описано выше. Данные показывают, что при рН 5, 6 и 7 изменения содержания ВМС на протяжении 4 недель при 25 или 40 С составляли менее 1%, что указывает на хорошую физическую стабильность и устойчивость к самоассоциации и агрегации. Таблица 6 Процент ВМС в образцах при оценке физической стабильности ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающее вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), причем HCVR включает гипервариабельные участки (CDR) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, a LCVR включает CDR LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем аминокислотная последовательность HCDR1 представляет собой SEQ ID NO: 1, аминокислотная последовательность HCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 2, аминокислотная последовательность HCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 3, аминокислотная последовательность LCDR1 представляет собой SEQID NO: 4, аминокислотная последовательность LCDR2 представляет собой SEQ ID NO: 5, а аминокислотная последовательность LCDR3 представляет собой SEQ ID NO: 6, причем указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с PCSK9 человека. 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, включающее вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), отличающийся тем, что аминокислотная последовательность HCVR представляет собой SEQ ID NO: 7, а аминокислотная последовательностьLCVR представляет собой SEQ ID NO: 8. 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, включающее две HCVR и две LCVR,отличающийся тем, что аминокислотная последовательность каждой HCVR представляет собойSEQ ID NO: 7, а аминокислотная последовательность каждой LCVR представляет собой SEQ ID NO: 8. 4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, включающее тяжелую цепь (НС) и легкую цепь (LC), отличающийся тем, что аминокислотная последовательность НС представляет собойSEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность LC представляет собой SEQ ID NO: 10. 5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, включающее две тяжелые цепи (НС) и две легкие цепи (LC), отличающийся тем, что аминокислотная последовательность каждой НС представляет собой SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность каждой LC представляет собойSEQ ID NO: 10. 6. Антитело для лечения гиперлипидемии или гиперхолестеринемии, состоящее из двух тяжелых цепей и двух легких цепей, причем аминокислотная последовательность каждой тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность каждой легкой цепи представляет собойSEQ ID NO: 10. 7. Фармацевтическая композиция для лечения гиперлипидемии или гиперхолестеринемии, включающая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ. 8. Способ лечения гиперлипидемии или гиперхолестеринемии, включающий введение пациенту,нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента по п.1. 9. Способ лечения гиперлипидемии или гиперхолестеринемии, включающий введение пациенту,нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела по п.6.