Способ получения вакцинного адъюванта

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИННОГО АДЪЮВАНТА Усовершенствованный способ получения эмульсии типа "масло в воде" включает циркуляцию компонентов эмульсии между первым контейнером и вторым контейнером через гомогенизатор и/или через микрофлюидизирующее устройство. Преимущественно первый контейнер полностью освобождается от всех компонентов эмульсии перед их возвращением. Заявка на данное изобретение заявляет приоритет предварительной патентной заявки США 61/283518, поданной 3 декабря 2009 г., полное содержание которой включено здесь путем ссылки для всех целей. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области получения адъювантов на основе эмульсий типа "масло в воде" для вакцин путем микрофлюидизации. Уровень техники Вакцинный адъювант, известный как "MF59" [1-3], представляет собой субмикронную эмульсию типа "масло в воде" сквалена, полисорбата 80 (также известного как Твин 80) и триолеата сорбита (также известного как Спан 85). Он также может включать цитрат-ионы, например, 10 мМ натрий-цитратный буфер. Состав эмульсии по объему может включать около 5% сквалена, около 0,5% Твина 80 и около 0,5% Спана 85. Адъювант и его получение более подробно описаны в главе 10 ссылки 4, главе 12 ссылки 5 и главе 19 ссылки 6. Как описано в ссылке [7], MF59 получают в промышленном масштабе диспергированием Спана 85 в скваленовой фазе и Твина 80 в водной фазе, с последующим высокоскоростным смешением с образованием грубой эмульсии. Затем эту грубую эмульсию многократно пропускают через микрофлюидизатор для получения эмульсии, имеющей масляные капельки однородного размера. Как описано в ссылке [6],затем микрофлюидизированную эмульсию профильтровывают через мембрану с величиной пор 0,22 мкм, чтобы удалить любые крупные масляные капельки, и средний размер капелек полученной эмульсии остается неизменным в течение по меньшей мере 3 лет при температуре 4C. Содержание сквалена в конечной эмульсии может быть измерено, как описано в ссылке [8]. Эмульсии типа "масло в воде" содержат капельки масла. Более крупные масляные капельки, содержащиеся в этих эмульсиях, могут действовать как центры зародышеобразования для агрегирования, ведущего к деградации эмульсии во время хранения. Цель изобретения состоит в представлении дополнительных и улучшенных способов получения микрофлюидизированных эмульсий типа "масло в воде" (таких как MF59), в частности способов, которые пригодны для применения в промышленном масштабе и которые обеспечивают улучшенное гомогенизирование и микрофлюидизацию для создания эмульсий с меньшим количеством крупных частиц. Сущность изобретения Изобретение представляет способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающей сквален,причем способ включает стадию, в которой (i) формируют первую эмульсию, имеющую первый средний размер масляных капелек, с использованием гомогенизатора, в котором первая эмульсия образуется при многократной циркуляции компонентов первой эмульсии через гомогенизатор. Изобретение также представляет способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающей сквален, причем способ включает стадию, в которой (b) проводят микрофлюидизацию первой эмульсии,имеющей первый средний размер масляных капелек, с образованием второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который является меньшим, чем первый средний размер масляных капелек, причем вторую эмульсию формируют циркуляцией компонентов второй эмульсии с переносом компонентов второй эмульсии из первого эмульсионного контейнера через первое микрофлюидизирующее устройство во второй эмульсионный контейнер и затем через второе микрофлюидизирующее устройство, причем первое и второе микрофлюидизирующие устройства являются одинаковыми. Необязательно, способ согласно настоящему изобретению включает более раннюю стадию (а) формирования первой эмульсии, имеющей первый средний размер масляных капелек. Необязательно, способ согласно настоящему изобретению включает стадию (с) фильтрации второй эмульсии. Как более подробно описано ниже, первая эмульсия может иметь средний размер масляных капелек 5000 нм или менее, например средний размер между 300 и 800 нм. Число масляных капелек в первой эмульсии с размером 1,2 мкм может составлять 51011/мл или менее, как описано ниже. Масляные капельки с размером 1,2 мкм являются неблагоприятными, поскольку они могут обусловливать нестабильность эмульсии вследствие агломерации и слияния капелек [14]. После формирования первая эмульсия может быть затем подвергнута обработке, по меньшей мере,в однопроходной микрофлюидизации для образования второй эмульсии, имеющей уменьшенный средний размер масляных капелек. Как описано ниже, средний размер масляных капелек второй эмульсии составляет 500 нм или менее. Число масляных капелек во второй эмульсии, имеющих размер 1,2 мкм,может составлять 51010/мл или менее, как описано ниже. Для достижения этих характеристик может быть необходимым многократное пропускание компонентов эмульсии через микрофлюидизирующее устройство, например 2, 3, 4, 5, 6, 7 раз. Затем вторая эмульсия может быть профильтрована, например, через гидрофильную мембрану из простого полиэфирсульфона для получения эмульсии типа "масло в воде", которая может быть пригодна для применения в качестве вакцинного адъюванта. Средний размер масляных капелек эмульсии типа 135-175 нм, между 145-165 нм или около 155 нм. Число масляных капелек во второй эмульсии, имеющих размер 1,2 мкм, присутствующих в полученной после фильтрации эмульсии типа "масло в воде", может составлять 5108/мл или менее, например, 5107/мл или менее, 5106/мл или менее, 2106/мл или менее,или 5105/мл или менее. Конечная эмульсия типа "масло в воде", образованная после фильтрации, может иметь по меньшей мере в 102 раз меньше масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, по сравнению с первой эмульсией,и в идеальном случае по меньшей мере в 103 раз меньше (например, в 104 раз меньше). В некоторых вариантах исполнения перед стадией (iii) применяют более чем один цикл стадий (i) и(ii). Подобным образом, могут быть использованы многократные повторения отдельных стадий (i) и (ii). В общем, способ исполняют при температуре между 20-60C и в идеальном случае при 405C. Хотя компоненты первой и второй эмульсий могут быть относительно стабильными даже при более высоких температурах, все же может происходить термическое разложение некоторых компонентов, поэтому предпочтительны более низкие температуры. Компоненты эмульсии Средний размер масляных капелек (т.е. среднечисленный диаметр масляных капелек эмульсии) может быть измерен с использованием метода динамического рассеяния света, как описано в ссылке[13]. Одним примером прибора для измерения динамического рассеяния света является анализатор размера частиц в субмикронном диапазоне Nicomp 380 (от фирмы Particle Sizing System). Число частиц, имеющих размер 1,2 мкм, может быть измерено с использованием счетчика частиц,такого как прибор Accusizer 770 (от фирмы Particle Sizing System). Способы согласно изобретению используются для получения эмульсий типа "масло в воде". Эти эмульсии включают три основных ингредиента: масло; водный компонент и поверхностно-активное вещество. Поскольку эмульсии предназначены для фармацевтического применения, то масло обычно будет биоразложимым (метаболизируемым) и биосовместимым. Масло может включать сквален, масло акульей печени, который представляет собой разветвленный ненасыщенный терпеноид (С 30 Н 50; [(CH3)2C[=CHCH2CH2C(CH3)]2=CHCH2-]2; 2,6,10,15,19,23-гексаметил 2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен; CAS RN 7683-64-9). Сквален в особенности предпочтителен для применения в настоящем изобретении. Масло согласно настоящему изобретению может включать смесь (или комбинацию) масел, например, включающую сквален и по меньшей мере одно дополнительное масло. Предпочтительнее, нежели (или в дополнение к этому) применение сквалена, эмульсия может включать масло(а), включающее(ие) масла, например, из животного (такого как рыба) или растительного источника. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна. Наиболее общедоступными примерами ореховых масел являются арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло. Может быть использовано, например, масло жожоба, получаемое из бобов жожоба. Масла из семян включают сафлоровое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло и т.п. В зерновой группе наиболее легкодоступным является кукурузное масло, но может быть также применено масло других хлебных злаков, таких как пшеница, овес, рожь, рис, полевичка абиссинская, тритикале и т.п. Сложные эфиры алифатических кислот, содержащих 6-10 атомов углерода, с глицерином и 1,2-пропандиолом, если не присутствуют естественным образом в маслах из семян, могут быть получены гидролизом, выделением и этерификацией надлежащих материалов, исходя из ореховых масел и масел из семян. Жиры и масла из молока млекопитающих являются метаболизируемыми и поэтому могут быть использованы. Процедуры выделения, очистки, омыления и других методов, необходимых для получения чистых масел из животных источников, хорошо известны в технологии. Многие рыбы содержат метаболизируемые масла, которые могут быть без труда извлечены. Например, рыбий жир, масла акульей печени и китовый жир, такой как спермацет, представляют собой примеры некоторых из рыбьих масел, которые могут быть здесь применены. Ряд масел с разветвленными цепями синтезируются биохимическим путем из 5-углеродных изопреновых фрагментов и в общем называются терпеноидами. Также может быть использован сквалан, насыщенный аналог сквалена. Рыбные масла, включающие сквален и сквалан, являются легкодоступными из коммерческих источников или могут быть получены известными в технологии способами. Другие применимые масла представляют собой токоферолы, в частности, в комбинации со скваленом. Там, где масляная фаза эмульсии включает токоферол, может быть применен любой из -, -, -, -,- или -токоферолов, но предпочтительными являются -токоферолы. Могут быть использованы оба изDтокоферола и DLтокоферола. Предпочтительным -токоферолом является DLтокоферол. Токоферол может принимать несколько форм, например, различных солей и/или изомеров. Соли включают органические соли, такие как сукцинат, ацетат, никотинат и т.д. Если должна быть использована соль этого токоферола, то предпочтительной солью является сукцинат. Может быть применена комбинация масел, включающая сквален и токоферол (например, DLтокоферол). Водный компонент может представлять собой простую воду (например, w.f.i. ("вода для инъекций" или может включать дополнительные компоненты, например растворенные вещества. Например,он может включать соли с образованием буфера, например такие соли, как цитраты или фосфаты, такие как натриевые соли. Типичные буферы включают фосфатный буфер; трис-буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер или цитратный буфер. Обычно буферы будут включены в диапазоне концентраций 5-20 мМ. Поверхностно-активное вещество предпочтительно является биоразложимым (метаболизируемым) и биосовместимым. Поверхностно-активные вещества могут быть классифицированы по их "HLB"-значению (гидрофильно-липофильному балансу), где HLB в диапазоне 1-10 в основном означает, что поверхностноактивное вещество является более растворимым в масле, нежели в воде, и при HLB в диапазоне 10-20 имеет место более высокая растворимость в воде, чем в масле. Эмульсии предпочтительно включают по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, которое имеет значение HLB по меньшей мере 10,например по меньшей мере 15 или предпочтительно по меньшей мере 16. Изобретение может быть использовано с поверхностно-активными веществами, включающими, но не ограничивающимися таковыми, поверхностно-активные вещества на основе сложных эфиров полиоксиэтилена и сорбита (обычно обозначаемыми как Твины), в частности полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (ЕО), пропиленоксида (РО) и/или бутиленоксида (ВО), продаваемые под торговым наименованием DOWFAX, такие как линейные ЕО/РО-блок-сополимеры; октоксинолы, которые могут варьировать по числу повторяющихся этоксильных (окси-1,2-этандиильных) групп, причем особенный интерес представляет октоксинол-9 (Тритон Х-100, или t-октилфеноксиполиэтоксиэтанол); (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); полиоксиэтиленовые алифатические простые эфиры, производные лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как поверхностно-активные вещества Brij), такие как монолауриловый простой эфир триэтиленгликоля (Brij 30); полиоксиэтилен-9-лауриловый простой эфир; и сложные эфиры сорбита (общеизвестные как СПАНы), такие как триолеат сорбита (Спан 85) и монолаурат сорбита. Предпочтительными поверхностно-активными веществами для включения в эмульсию являются полисорбат 80 (Твин 80; полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат), Спан 85 (триолеат сорбита), лецитин и Тритон Х-100. В эмульсию могут быть включены смеси поверхностно-активных веществ, например смеси Твин 80/Спан 85, или смеси Твин 80/Тритон Х-100. Также пригодна комбинация сложного полиоксиэтиленового эфира сорбита, такого как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат (Твин 80), и октоксинола, такого какt-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Тритон Х-100). Еще одна подходящая комбинация включает лаурет-9 плюс сложный полиоксиэтиленовый эфир сорбита и/или октоксинол. Применимые смеси могут включать поверхностно-активное вещество со значением HLB в диапазоне 10-20 (например, Твин 80,с HLB 15,0), и поверхностно-активное вещество со значением HLB в диапазоне 1-10 (например, Спан 85,с HLB 1,8). Формирование первой эмульсии. Перед стадией микрофлюидизации компоненты эмульсии могут быть смешаны с образованием первой эмульсии. Масляные капельки в первой эмульсии могут иметь средний размер 5000 нм или менее, например 4000 нм или менее, 3000 нм или менее, 2000 нм или менее, 1200 нм или менее, 1000 нм или менее, например средний размер между 800 и 1200 нм или между 300 и 800 нм. В первой эмульсии число масляных капелек с размером 1,2 мкм может составлять 51011/мл или менее, например 51010/мл или менее или 5109/мл или менее. Затем первая эмульсия может быть подвергнута микрофлюидизации с образованием второй эмульсии, имеющей меньший средний размер масляных капелек, чем в первой эмульсии, и/или меньшее число масляных капелек с размером 1,2 мкм. Средний размер масляных капелек первой эмульсии может быть достигнут перемешиванием компонентов первой эмульсии в гомогенизаторе. Например, как показано на фиг. 1, они могут быть объединены в смесительном резервуаре (12), и затем объединенные компоненты могут быть введены (13) в механический гомогенизатор, такой как ротор-статорный гомогенизатор (1). Гомогенизаторы могут работать в вертикальном и/или горизонтальном режиме. Для удобства наладки при промышленном применении предпочтительны поточные гомогенизаторы. Компоненты поступают в ротор-статорный гомогенизатор и наталкиваются на быстро вращающийся ротор, содержащий пазы или прорези. Компоненты отбрасываются центробежными силами наружу наподобие действия центробежного насоса и проходят через пазы/прорези. В некоторых вариантах исполнения гомогенизатор включает многочисленные комбинации роторов и статоров, например, в концентрической компоновке колец с сопряженными зубчатыми гребенками, как показано кодовыми номерами (3) и (4); (5) и (6) и (7) и (8) на фиг. 1 и 2. Роторы в применяемых крупномасштабных гомогенизаторах могут иметь кольца с сопряженными зубчатыми гребенками на краю горизонтально ориентирован-3 024770 ной многолопастной крыльчатки (например, под кодовым номером (9) на фиг. 1), выставленные с жестким допуском сопряжения с зубьями статической гильзы. Первая эмульсия образуется в результате сочетания турбулентности, кавитации и механической сдвиговой нагрузки, возникающих внутри зазора между ротором и статором. Компоненты преимущественно вводятся по направлению, параллельному оси ротора. Важным параметром производительности ротор-статорных гомогенизаторов является окружная скорость ротора (периферическая скорость). Этот параметр представляет собой функцию как скорости вращения, так и диаметра ротора. Применимая окружная скорость составляет по меньшей мере 10 м/с и в идеальном случае быстрее, например 20 м/с, 30 м/с, 40 м/с и т.д. Окружная скорость в 40 м/с может быть без труда достигнута при скорости вращения 10000 об/мин в малом гомогенизаторе или при более низких скоростях вращения (например, 2000 об/мин) в более крупном гомогенизаторе. Пригодные гомогенизаторы с высокой сдвиговой нагрузкой имеются в продаже на рынке. Для производства в промышленном масштабе гомогенизатор в идеальном случае должен иметь величину расхода потока по меньшей мере 300 л/ч, например 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000,2000, 5000 или даже 10000 л/ч. Пригодные высокопроизводительные гомогенизаторы имеются в продаже на рынке. Предпочтительный гомогенизатор обеспечивает скорость сдвига между 3105 и 1106 с-1, например между 3105 и 7105 с-1, между 4105 и 6105 с-1, например около 5105 с-1. Хотя ротор-статорные гомогенизаторы выделяют относительно малое количество теплоты во время работы, гомогенизатор может быть подвергнут охлаждению в ходе применения. В идеальном случае температуру первой эмульсии во время гомогенизирования поддерживают ниже 60C, например ниже 45C. В некоторых вариантах исполнения компоненты первой эмульсии могут быть гомогенизированы многократно (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или более раз). Во избежание необходимости в длинной серии контейнеров и гомогенизаторов, компоненты эмульсии вместо этого могут циркулировать (например, как показано кодовым номером (11) на фиг. 1). В частности, первая эмульсия может быть сформирована многократной циркуляцией компонентов первой эмульсии через гомогенизатор (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100 и т.д. раз). Однако слишком много циклов могут быть нежелательными, так как это может создавать повторное слияние, как описано в ссылке [14]. Таким образом, размер масляных капелек можно отслеживать, если используют циркуляцию через гомогенизатор,для проверки того, что достигнут желательный размер капелек и/или что повторное слияние не происходит. Циркуляция через гомогенизатор является преимущественной, поскольку она может сокращать средний размер масляных капелек в первой эмульсии. Циркуляция также является предпочтительной,поскольку она может уменьшать число масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, в первой эмульсии. Это сокращения среднего размера масляных капелек и числа капелек с величиной 1,2 мкм в первой эмульсии может обеспечивать преимущества для процесса(ов) ниже по потоку. В частности, циркуляция компонентов первой эмульсии через гомогенизатор может вести к улучшению процесса микрофлюидизации, что затем может иметь результатом сниженное число масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, во второй эмульсии, т.е. после микрофлюидизации. Этот улучшение параметров второй эмульсии может обеспечивать повышенную производительность фильтрации. Повышенная производительность фильтрации может вести к меньшим потерям содержания во время фильтрации, например, потерям сквалена, Твина 80 и Спана 85, когда эмульсия типа "масло в воде" представляет собой MF59. Два конкретных типа циркуляции обозначены здесь как "тип I" и "тип II". Циркуляция типа I иллюстрирована на фиг. 5, тогда как циркуляция типа II иллюстрирована на фиг. 6. Циркуляция компонентов первой эмульсии может включать циркуляцию типа I с переносом компонентов первой эмульсии между первым контейнером для предварительного смешения и гомогенизатором. Первый контейнер для предварительного смешения может иметь емкость от 50 до 500 л, например от 100 до 400 л, от 100 до 300 л, от 200 до 300 л, 250 л или 280 л. Первый контейнер для предварительного смешения может быть изготовлен из нержавеющей стали. Циркуляция типа I может продолжаться в течение времени от 10 до 60 мин, например от 10 до 40 мин или 20 мин. Циркуляция компонентов первой эмульсии может включать циркуляцию типа II с переносом компонентов первой эмульсии из первого контейнера для предварительного смешения, через первый гомогенизатор во второй контейнер для предварительного смешения (необязательно имеющий такие же характеристики, как первый контейнер для предварительного смешения) и затем через второй гомогенизатор. Второй гомогенизатор обычно будет таким же, как первый гомогенизатор, но в некоторых компоновках первый и второй гомогенизаторы различаются. После прохождения компонентов первой эмульсии через второй гомогенизатор компоненты первой эмульсии могут быть переведены обратно в первый контейнер для предварительного смешения, например, если процесс циркуляции типа II должен быть повторен. Таким образом, компоненты эмульсии могут перемещаться по пути в форме восьмерки между первым и вторым контейнерами для предварительного смешения через единый гомогенизатор (см. фиг. 6). Циркуляция типа II может быть проведена один раз или многократно, например 2, 3, 4, 5 и т.д. раз. Циркуляция типа II является предпочтительной сравнительно с циркуляцией типа I, поскольку она может способствовать обеспечению того, что все компоненты первой эмульсии проходят через гомогенизатор. Опорожнение первого контейнера для предварительного смешения означает, что все содержимое эмульсии прошло через гомогенизатор во второй контейнер для предварительного смешения. Подобным образом, содержимое второго контейнера для предварительного смешения может быть опустошено, опять же гарантируя, что оно целиком прошло через гомогенизатор. Таким образом, компоновка типа II может преимущественно обеспечивать то, что все компоненты эмульсии подвергнуты гомогенизированию по меньшей мере дважды, что может сократить как средний размер масляных капелек, так и число масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, в первой эмульсии. Идеальная циркуляция типа II тем самым включает опорожнение первого контейнера для предварительного смешения и прохождение по существу всего его содержимого через гомогенизатор во второй контейнер для предварительного смешения, с последующим опорожнением второго контейнера для предварительного смешения и повторного прохождения по существу всего его содержимого через гомогенизатор обратно в первый (пустой) контейнер для предварительного смешения. Таким образом, все частицы проходят через гомогенизатор по меньшей мере дважды, что является труднодостижимым при циркуляции типа I. В некоторых вариантах исполнения используют комбинацию циркуляций типа I и типа II, и эта комбинация может создать первую эмульсию с хорошими характеристиками. В частности, эта комбинация может значительно уменьшить число масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, в первой эмульсии. Эта комбинация может включать любой порядок циркуляций типа I и II, например, после типа I следует тип II, после типа II следует тип I, после типа I следует тип II, с последующим типом I опять, и т.д. В одном варианте исполнения комбинация включает 20 мин циркуляции типа I с последующей одиночной циркуляцией типа II, т.е. перенос циркулирующих компонентов первой эмульсии из первого контейнера для предварительного смешения через первый гомогенизатор во второй контейнер для предварительного смешения, и затем однократно через второй гомогенизатор. В первом и втором контейнерах для предварительного смешения может поддерживаться атмосфера инертного газа, например, азота, например, под давлением до 0,5 бар (0,05 МПа). Это может предохранить компоненты эмульсии от окисления, что является особенно преимущественным, если один из компонентов эмульсии представляет собой сквален. Этим можно обеспечить повышение стабильности эмульсии. Как было упомянуто выше, первоначальная загрузка для гомогенизатора может представлять собой негомогенизированную смесь компонентов первой эмульсии. Эта смесь может быть приготовлена смешением индивидуальных компонентов первой эмульсии отдельно, но в некоторых вариантах исполнения многочисленные компоненты могут быть объединены перед этим смешением. Например, если эмульсия включает поверхностно-активное вещество со значением HLB ниже 10, то это поверхностно-активное вещество может быть объединено с маслом до смешения. Подобным образом, если эмульсия включает поверхностно-активное вещество с величиной HLB выше 10, то это поверхностно-активное вещество может быть объединено с водным компонентом до смешения. Буферные соли могут быть объединены с водным компонентом перед смешением, или могут быть добавлены отдельно. Способы согласно изобретению могут быть применены в крупном масштабе. Так, способ может включать получение первой эмульсии, объем которой превышает 1 л, например составляет 5, 10, 20,50, 100, 250 л и т.д. После ее формирования первая эмульсии может быть подвергнута микрофлюидизации или может храниться в ожидании микрофлюидизации. В некоторых вариантах исполнения, в частности, таких, где используются многочисленные циклы стадий (i) и (ii), материал, поступающий в гомогенизатор, будет материалом, выходящим из микрофлюидизатора, так что первую эмульсию подвергают микрофлюидизации и затем опять направляют на гомогенизирование. Микрофлюидизация. После формирования первой эмульсии ее подвергают микрофлюидизации, чтобы сократить средний размер ее масляных капелек и/или уменьшить число масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм. Устройства для микрофлюидизации сокращают средний размер масляных капелек путем проталкивания потоков поступающих компонентов через геометрически фиксированные каналы при высоком давлении и с высокой скоростью. Давление на входе в камеру взаимодействия (также называемое "первым давлением") может быть по существу постоянным (т.е. 15%; например 10, 5, 2%) на протяжении по меньшей мере 85% времени, в течение которого компоненты подаются в микрофлюидизатор, например по меньшей мере 87%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 99 или 100% времени, в течение которого эмульсия подводится в микрофлюидизатор. В одном варианте исполнения первое давление составляет 1300 бар 15% (18 kpsi15%) (130 МПа 15%), т.е. между 1100 и 1500 бар (между 15 и 21 kpsi) (110-150 МПа), на протяжении 85% времени, в течение которого эмульсия подается в микрофлюидизатор. Два подходящих профиля давления показаны на фиг. 3. На фиг. 3 А давление является по существу постоянным в течение по меньшей мере 85% времени, тогда как на фиг. 3 В давление непрерывно остается по существу постоянным. Устройство для микрофлюидизации обычно включает по меньшей мере один напорный насос для повышения давления (предпочтительно два насоса, которые могут быть синхронизированы) и камеру взаимодействия. Напорный насос, который в идеальном случае имеет электрогидравлический привод,создает высокое давление (т.е. первое давление) для принудительного продвижения эмульсии в камеру взаимодействия и через нее. Синхронизированное действие напорных насосов может быть использовано для создания по существу постоянного давления обсуждаемой выше эмульсии, что означает, что все капельки в эмульсии подвергаются воздействию по существу на одном уровне сдвиговых нагрузок во время микрофлюидизации. Одно преимущество применения по существу постоянного давления состоит в том, что оно может сокращать усталостные разрушения микрофлюидизирующего устройства, что может обеспечивать более длительный срок службы устройства. Дополнительное преимущество применения по существу постоянного давления заключается в том, что могут быть улучшены параметры второй эмульсии. В частности,может быть сокращено число присутствующих во второй эмульсии масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм. Кроме того, может быть уменьшен средний размер масляных капелек второй эмульсии, когда используют по существу постоянное давление. Сокращение среднего размера масляных капелек и числа масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, во второй эмульсии может обеспечивать повышенную производительность фильтрации. Повышенная производительность фильтрации может вести к меньшим потерям содержания во время фильтрации, например потерям сквалена, Твина 80 и Спана 85, когда эмульсия представляет собой MF59. Камера взаимодействия может содержать многочисленные, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.,каналы с фиксированной геометрией, в которые проходит эмульсия. Эмульсия поступает в камеру взаимодействия через впускной трубопровод, который может иметь диаметр между 200 до 250 мкм. Эмульсия разделяется на потоки, когда она поступает в камеру взаимодействия, и, под высоким давлением,разгоняется до высокой скорости. Когда она проходит через каналы, силы, создаваемые высоким давлением, могут действовать так, чтобы сокращать размер масляных капелек эмульсии и уменьшать число масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм. Эти силы могут включать: сдвиговые нагрузки, обусловленные деформацией потока эмульсии, которая возникает при контакте со стенками канала; ударные нагрузки, обусловленные столкновениями, который возникают, когда высокоскоростные потоки эмульсии сталкиваются друг с другом; и кавитационные силы, обусловленные формированием и схлопыванием полостей внутри потока. Камера взаимодействия обычно не включает движущихся частей. Она может включать каналы с керамическими (например, из оксида алюминия) или алмазными (например, из поликристаллического алмаза) поверхностями. Другие поверхности могут быть сформированы нержавеющей сталью. Фиксированная геометрия многочисленных каналов в камере взаимодействия может представлять собой геометрию "Y"-типа или геометрию "Z"-типа. В камере взаимодействия Y-типа единый входной поток эмульсии разделяется на первый и второй потоки эмульсии, которые затем сливаются в единый выходной поток эмульсии. Перед слиянием каждый из первого и второго потоков эмульсии может быть независимо разделен на первое и второе множество (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) подпотоков. Когда потоки эмульсии сливаются, первый и второй потоки эмульсии (или их подпотоки) в идеальном случае протекают по существу в противоположных направлениях (например, первый и второй потоки эмульсии или их подпотоки протекают по существу в одной плоскости (20), и направление течения первого потока эмульсии на 18020 отличается от направления течения второго потока эмульсии). Силы, создаваемые, когда потоки эмульсии сливаются, могут действовать для сокращения размера масляных капелек эмульсии и уменьшения числа масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм. В камере взаимодействия с Z-геометрией поток эмульсии проходит вокруг многочисленных (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) по существу прямоугольных углов (т.е. 9020). Фиг. 4 иллюстрирует камеру взаимодействия с геометрией Z-типа и два прямоугольных угла по направлению течения. Во время его прохождения мимо углов входной поток эмульсии может быть разделен на многочисленные(например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) подпотоки и затем сливается в единый выходной поток эмульсии(например, как показано на фиг. 4, с четырьмя подпотоками (32. Разделение и затем слияние (31) могут происходить в любой точке между входным и выходным каналами. Силы, создаваемые, когда эмульсия контактирует со стенками каналов, когда она проходит мимо углов, могут действовать для сокращения размера масляных капелек эмульсии и уменьшения числа масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм. Примером камеры взаимодействия Z-типа является камера взаимодействия E230Z от фирмы Microfluidics. В одном варианте исполнения поток эмульсии проходит вокруг двух по существу прямоугольных углов. В момент, когда входной поток эмульсии проходит вокруг первого по существу прямоугольного угла, он разделяется на пять подпотоков. В момент, когда подпотоки проходят вокруг второго по существу прямоугольного угла, они сливаются в единый выходной поток эмульсии. В прототипе было обычным применение камер взаимодействия Y-типа для эмульсий "масло в воде", подобных эмульсиям согласно настоящему изобретению. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что для эмульсий "масло в воде" предпочтительным является применение камеры взаимодействия с геометрией Z-типа, поскольку это может вести к более значительному уменьшению числа масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, присутствующих во второй эмульсии, по сравнению с камерой взаимодействия с геометрией Y-типа. Уменьшение числа масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, во второй эмульсии может обеспечивать повышенную производительность фильтрации. Повышенная производительность фильтрации может вести к меньшим потерям содержания во время фильтрации, например, потерям сквалена, Твина 80 и Спана 85, когда эмульсия представляет собой MF59. Предпочтительное микрофлюидизирующее устройство действует при давлении между 170 и 2750 бар (приблизительно от 2500 до 40000 psi) (17-275 МПа), например при давлении около 345 бар(34,5 МПа), около 690 бар (69 МПа), около 1380 бар (138 МПа), около 2070 бар (207 МПа) и т.д. Предпочтительное микрофлюидизирующее устройство работает при величине расхода потока до 20 л/мин, например до 14, до 7, до 3,5 л/мин и т.д. Предпочтительное микрофлюидизирующее устройство имеет камеру взаимодействия, которая обеспечивает скорость сдвига свыше 1106 с-1, например 2,5106,5106, 107 с-1 и т.д. Микрофлюидизирующее устройство может включать многочисленные камеры взаимодействия, которые используются параллельно, например 2, 3, 4, 5 или более, но более целесообразно она включает одну камеру взаимодействия. Микрофлюидизирующее устройство может включать вспомогательный обрабатывающий модуль(АРМ), включающий по меньшей мере один канал. АРМ содействует сокращению среднего размера масляных капелек в эмульсии, проходящей через микрофлюидизирующее устройство, хотя в основном сокращение происходит в камере взаимодействия. Как было упомянуто выше, компоненты эмульсии вводятся в камеру взаимодействия с помощью напорного(ых) насоса(ов) при первом давлении. Компоненты эмульсии в основном выходят из АРМ при втором давлении, которое является более низким, чем первое давление (например, при атмосферном давлении). В общем, между 80 и 95% падения давления между первым и вторым давлениями происходят вдоль камеры взаимодействия (например, от P1 до Р 2 на фиг. 4) и от 5 до 20% падения давления между первым и вторым давлениями происходят в пределах вспомогательного обрабатывающего модуля, например, камера взаимодействия может обусловливать приблизительно 90% падения давления, тогда как на АРМ могут приходиться приблизительно 10% падения давления. Если давление, падающее вдоль камеры взаимодействия, и давление, падающее в пределах вспомогательного обрабатывающего модуля, не относить на счет всей разности давлений между первым и вторым давлением, то это может быть обусловлено конечным падением давления в пределах соединительных каналов между камерой взаимодействия и вспомогательным обрабатывающим модулем. Обычно АРМ не содержит движущихся деталей. Он может включать каналы с керамическими (например, из оксида алюминия) или алмазными (например, из поликристаллического алмаза) поверхностями. Другие поверхности могут быть сформированы нержавеющей сталью. АРМ в основном размещен ниже по потоку относительно камеры взаимодействия, и также может быть позиционирован сразу после камеры взаимодействия. В прототипе модули АРМ в основном размещены ниже по потоку относительно камер взаимодействия, включающих каналы Y-типа, для подавления кавитации и тем самым повышения скорости течения в камере Y-типа на величину до 30%. Кроме того, в прототипе модули АРМ в основном размещены выше по потоку относительно камер взаимодействия,включающих каналы Z-типа, для уменьшения размера крупных агломератов. В последнем случае АРМ только снижает скорость течения в камерах Z-типа на величину до 3%. Однако было найдено, что в настоящем изобретении является предпочтительным позиционирование АРМ ниже по потоку относительно камеры взаимодействия, включающей многочисленные каналы Z-типа, поскольку это может вести к более значительному сокращению среднего размера масляных капелек и большему уменьшению числа масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, присутствующих во второй эмульсии. Как обсуждалось выше, уменьшение числа масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, во второй эмульсии может обеспечивать повышенную производительность фильтрации. Повышенная производительность фильтрации может вести к меньшим потерям содержания во время фильтрации, например, потерям сквалена, Твина 80 и Спана 85, когда эмульсия типа "масло в воде" представляет собой MF59. Дополнительное преимущество этого позиционирования камеры взаимодействия Z-типа и АРМ ниже по потоку состоит в том,что это может вести к более медленному снижению давления после камеры взаимодействия. Более медленное снижение давления может обусловливать повышение стабильности продукта ввиду меньшего количества газа, захваченного эмульсией. АРМ содержит по меньшей мере один канал с фиксированной геометрией, в который проходит эмульсия. АРМ может содержать многочисленные, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д., каналы с фик-7 024770 сированной геометрией, в которые проходит эмульсия. Канал или каналы в АРМ могут быть линейными или нелинейными. Подходящие нелинейные каналы имеют геометрию "Z"-типа или геометрию "Y"типа, которые являются такими же, как каналы, описанные выше для камеры взаимодействия. В одном варианте исполнения канал, или каналы, в АРМ имеют геометрию Z-типа. Многочисленные каналыZ-типа разделяют эмульсию на потоки, когда она поступает в АРМ. В отличие от рекомендаций изготовителя, применение АРМ, включающего многочисленные каналы с фиксированной геометрией, является предпочтительным по сравнению с единичным каналом с фиксированной геометрией в АРМ, поскольку это может вести к более значительному уменьшению числа масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, присутствующих во второй эмульсии. Как обсуждалось выше, уменьшение числа масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, во второй эмульсии может обеспечивать повышенную производительность фильтрации. Повышенная производительность фильтрации может вести к меньшим потерям содержания во время фильтрации, например, потерям сквалена, Твина 80 и Спана 85, когда эмульсия типа "масло в воде" представляет собой MF59. Микрофлюидизирующее устройство выделяет теплоту во время работы, которая может повышать температуру эмульсии на 15-20C относительно первой эмульсии. Поэтому является предпочтительным охлаждение эмульсии, подвергаемой микрофлюидизации, настолько быстро, насколько возможно. Температуру второй эмульсии можно поддерживать ниже 60C, например ниже 45C. Таким образом, выходной поток из камеры взаимодействия и/или выходной поток из АРМ могут быть поданы в охлаждающее устройство, такое как теплообменник или охлаждаемый змеевик. Расстояние между выходным каналом и охлаждающим устройством следует поддерживать настолько коротким, насколько возможно,чтобы сократить общее время уменьшением задержек с охлаждением. В одном варианте исполнения расстояние между выходным каналом микрофлюидизатора и охлаждающим устройством составляет между 20-30 см. Охлаждающее устройство является в основном полезным, когда эмульсию подвергают обработке в многочисленных стадиях микрофлюидизации, для предотвращения перегревания эмульсии. Результатом микрофлюидизации является эмульсия типа "масло в воде", вторая эмульсия, в которой средний размер масляных капелек составляет 500 нм или менее. Этот средний размер является в основном предпочтительным, так как он облегчает фильтрационную стерилизацию эмульсии. В особенности применимыми являются эмульсии, в которых по меньшей мере 80% числа масляных капелек имеют средний размер 500 нм или менее, например 400 нм или менее, 300 нм или менее, 200 нм или менее или 165 нм или менее. Кроме того, число масляных капелек во второй эмульсии, имеющих размер 1,2 мкм,составляет 51010/мл или менее, например 5109/мл или менее, 5108/мл или менее или 2108/мл или менее. Исходным входным материалом для микрофлюидизации может быть первая эмульсия. Однако в некоторых вариантах исполнения микрофлюидизированную эмульсию опять подвергают микрофлюидизации так, что происходят многочисленные циклы микрофлюидизации. В частности, вторая эмульсия может быть сформирована многократной циркуляцией компонентов второй эмульсии через микрофлюидизирующее устройство, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д. раз. Вторая эмульсия может быть сформирована циркуляцией компонентов второй эмульсии через микрофлюидизирующее устройство от 4 до 7 раз. Циркуляция компонентов второй эмульсии может включать циркуляцию типа I с переносом компонентов второй эмульсии между первым эмульсионным контейнером (необязательно имеющим такие же характеристики, как первый контейнер для предварительного смешения) и микрофлюидизирующим устройством. Циркуляция компонентов второй эмульсии может включать циркуляцию типа II с переносом компонентов второй эмульсии из первого эмульсионного контейнера через первое микрофлюидизирующее устройство во второй эмульсионный контейнер (необязательно имеющий такие же характеристики, как первый контейнер для предварительного смешения) и затем через второе микрофлюидизирующее устройство. Второе микрофлюидизирующее устройство может быть таким же, как первое микрофлюидизирующее устройство. В альтернативном варианте, второе микрофлюидизирующее устройство может отличаться от первого микрофлюидизирующего устройства. Первый эмульсионный контейнер может быть таким же, как первый контейнер для предварительного смешения. В альтернативном варианте, первый эмульсионный контейнер может быть таким же, как второй контейнер для предварительного смешения. Второй эмульсионный контейнер может быть таким же, как первый контейнер для предварительного смешения. В альтернативном варианте, второй эмульсионный контейнер может быть таким же, как второй контейнер для предварительного смешения. Первый эмульсионный контейнер может быть таким же, как первый контейнер для предварительного смешения, и второй эмульсионный контейнер может быть таким же, как второй контейнер для предварительного смешения. В альтернативном варианте, первый эмульсионный контейнер может быть таким же, как второй контейнер для предварительного смешения, и второй эмульсионный контейнер может быть таким же, как первый контейнер для предварительного смешения. В качестве альтернативы, первый и второй эмульсионные контейнеры могут отличаться от первого и второго контейнеров для предварительного смешения. После прохождения компонентов второй эмульсии через второе микрофлюидизирующее устройство компоненты второй эмульсии могут быть переведены обратно в первый эмульсионный контейнер,например, если должен быть повторен процесс циркуляции типа II. Циркуляция типа II может быть проведена за один раз или многократно, например, 2, 3, 4, 5 и т.д. раз. Циркуляция типа II является предпочтительной, так как она обеспечивает то, что все компоненты второй эмульсии прошли через микрофлюидизирующее устройство по меньшей мере 2 раза, что сокращает средний размер масляных капелек и число масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, во второй эмульсии. Во время микрофлюидизации может быть использована комбинация циркуляции типа I и циркуляции типа II. Эта комбинация может включать любой порядок циркуляций типа I и II, например, после типа I следует тип II, после типа II следует тип I, после типа I следует тип II, с последующим типом I опять и т.д. В первом и втором эмульсионных контейнерах может поддерживаться атмосфера инертного газа,например, азота под давлением до 0,5 бар (0,05 МПа). Это может предотвращать окисление компонентов эмульсии, что является особенно преимущественным, если один из компонентов эмульсии представляет собой сквален. Это ведет к повышению стабильности эмульсии. Способы согласно изобретению могут быть применены в крупном масштабе. Так, способ может включать микрофлюидизацию объема, превышающего 1 л, например 5, 10, 20, 50, 100, 250 л и т.д. Фильтрация. После микрофлюидизации вторую эмульсию профильтровывают. Эта фильтрация удаляет любые крупные масляные капельки, которые выдержали процедуры гомогенизирования и микрофлюидизации. Хотя будучи незначительными в отношении количества, эти масляные капельки могут быть крупными в отношении объема, и они могут действовать как центры зародышеобразования для агрегирования, приводя к деградации эмульсии во время хранения. Более того, эта стадия фильтрации может обеспечивать фильтрационную стерилизацию. Конкретная фильтрационная мембрана, пригодная для стерилизации фильтрованием, зависит от характеристик текучей среды второй эмульсии и требуемой степени фильтрации. Характеристики фильтра могут влиять на его пригодность для фильтрации микрофлюидизированной эмульсии. Например, могут быть важными размер его пор и характеристики поверхности, в особенности при фильтрации эмульсии на основе сквалена. Размер пор мембраны, используемой в изобретении, должен обеспечивать возможность прохождения желательных капелек, в то же время задерживая нежелательные капельки. Например, она должна задерживать капельки, которые имеют размер 1 мкм, в то же время позволяя проходить капелькам величиной 200 нм. Фильтр с размером пор 0,2 или 0,22 мкм является идеальным, и также может достигать стерилизации фильтрованием. Эмульсия может быть предварительно профильтрована, например, через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Предварительная фильтрация и фильтрация могут быть проведены в одну стадию с использованием известных двухслойных фильтров, которые включают первый мембранный слой с более крупными порами и второй мембранный слой с более мелкими порами. Двухслойные фильтры в особенности пригодны согласно изобретению. Первый слой в идеальном случае имеет поры с размером 0,3 мкм, такие как между 0,3-2 мкм, или между 0,3-1 мкм, или между 0,4-0,8 мкм, или между 0,5-0,7 мкм. Предпочтителен размер пор в первом слое 0,75 мкм. Таким образом, первый слой может иметь поры с размером,например, 0,6 или 0,45 мкм. Второй слой в идеальном случае имеет поры с размером, который составляет менее 75% (и в идеальном случае менее половины) размера пор первого слоя, таким как между 25-70% или между 25-49% размера пор первого слоя, например, между 30-45%, таким как 1/3 или 4/9 от размера пор первого слоя. Таким образом, второй слой может иметь поры размером 0,3 мкм, таким как между 0,15-0,28 мкм или между 0,18-0,24 мкм, например, размер пор второго слоя 0,2 или 0,22 мкм. В одном примере первый мембранный слой с более крупными порами представляет собой фильтр с размером пор 0,45 мкм, тогда как второй мембранный слой с более мелкими порами образует фильтр с размером пор 0,22 мкм. Фильтрационная мембрана и/или мембрана для предварительной фильтрации могут быть асимметричными. Асимметричная мембрана представляет собой мембрану, в которой размер пор варьирует от одной стороны мембраны к другой, например, в которой размер пор является большим на стороне входа,чем на стороне выхода. Одна сторона асимметричной мембраны может быть названа "крупнопористой поверхностью", тогда как другая сторона асимметричной мембраны может быть названа "тонкопористой поверхностью". В двухслойном фильтре один или (в идеальном случае) оба слоя могут быть асимметричными. Фильтрационная мембрана может быть пористой или однородной. Однородная мембрана обычно представляет собой плотную пленку, варьирующую от 10 до 200 мкм. Пористая мембрана имеет пористую структуру. В одном варианте исполнения фильтрационная мембрана является пористой. В двухслойном фильтре оба слоя могут быть пористыми, оба слоя могут быть однородными, или могут быть один пористый слой и один однородный слой. Предпочтительный двухслойный фильтр представляет собой фильтр, в котором оба слоя являются пористыми. В одном варианте исполнения вторую эмульсию предварительно профильтровывают через асимметричную гидрофильную пористую мембрану, и затем профильтровывают через еще одну асимметричную гидрофильную пористую мембрану, имеющую меньшие поры, чем в мембране для предварительной фильтрации. Для этого может быть использован двухслойный фильтр. Фильтрационная(ые) мембрана(ы) может(ут) быть подвергнута(ы) обработке в автоклаве перед применением для обеспечения ее(их) стерильности. Фильтрационные мембраны обычно изготовлены из полимерных материалов-носителей, таких как(поливинилиденфторид), найлоны (полиамиды), РР (полипропилен), целлюлозы (в том числе сложные эфиры целлюлозы), PEEK (простой полиэфирэфиркетон), нитроцеллюлоза и т.д. Они имеют различные характеристики, причем некоторые носители по своей природе являются гидрофобными (например,PTFE), а другие являются изначально гидрофильными (например, ацетаты целлюлозы). Однако эти изначально присущие характеристики могут быть модифицированы обработкой поверхности мембраны. Например, известно получение гидрофилизированных или гидрофобизованных мембран обработкой их другими материалами (такими как другие полимеры, графит, силикон и т.д.) для нанесения покрытия на поверхность мембраны, например, смотри раздел 2.1 в ссылке [15]. В двухслойном фильтре две мембраны могут быть сделаны из различных материалов или (в идеальном случае) из одного и того же материала. Идеальный фильтр для применения в изобретении имеет гидрофильную поверхность, в отличие от указаний в ссылках 9-12, что следует использовать гидрофобные (полисульфоновые) фильтры. Фильтры с гидрофильными поверхностями могут быть сформированы из гидрофильных материалов, или гидрофилизацией гидрофобных материалов, и предпочтительный фильтр для применения в изобретении представляет собой гидрофильную мембрану из простого полиэфирсульфона. Для преобразования гидрофобных PES-мембран в гидрофильные PES-мембраны известно несколько различных способов. Часто этого достигают нанесением на мембрану покрытия из гидрофильного полимера. Для обеспечения постоянного сцепления гидрофильного полимера с PES слой гидрофильного покрытия обычно подвергают обработке в реакции либо сшивания, либо прививки. Ссылка 15 представляет способ модифицирования поверхностных свойств гидрофобного полимера, имеющего пригодные к функционализации концы цепей,включающий стадии, в которых проводят контактирование полимера с раствором линкерного реагента с образованием ковалентной связки, и затем контактирование прореагировавшего гидрофобного полимера с раствором модифицирующего реагента. В ссылке 16 представлен способ гидрофилизацииPES-мембраны непосредственным нанесением на мембрану покрытия, включающий стадии, в которых проводят предварительное смачивание спиртом, и затем пропитывание в водном растворе, содержащем гидрофильный мономер, полифункциональный мономер (сшивающий реагент) и инициатор полимеризации. Мономер и сшивающий реагент затем полимеризуют с использованием термически или УФ-инициируемой полимеризации с образованием покрытия из сшитого гидрофильного полимера на поверхности мембраны. Подобным образом, ссылки [17 и 18] описывают нанесение покрытия на PESмембрану вымачиванием ее в водном растворе гидрофильного полимера (полиалкиленоксида) и по меньшей мере одного полифункционального мономера (сшивающего реагента), и затем полимеризацией мономера с образованием неэкстрагируемого гидрофильного покрытия. Ссылка [19] описывает гидрофилизацию PES-мембраны путем реакции прививки, в которой PES-мембрану подвергают обработке низкотемпературной гелиевой плазмой с последующей прививкой гидрофильного мономерногоN-винил-2-пирролидона (NVP) на поверхность мембраны. Кроме того, такие способы раскрыты в ссылках [20-26]. В способах, которые не основываются на нанесении покрытия, PES может быть растворен в растворителе, смешан с растворимой гидрофильной добавкой, и затем смешанный раствор использован для литья гидрофильной мембраны, например, осаждением или инициированием сополимеризации. Такие способы раскрыты в ссылках [27-33]. Например, в ссылке [33] представлен способ получения гидрофильной, модифицированной зарядами мембраны, которая имеет малое количество экстрагируемых компонентов мембраны и позволяет быстрое восстановление удельного сопротивления ультрачистой воды, имеющей сшитую взаимопроникающую полимерную сетчатую структуру, сформированную приготовлением полимерного раствора смеси PES, PVP, полиэтиленимина и алифатического диглицидилового простого эфира, формированием тонкой пленки раствора и осаждением пленки в качестве мембраны. Подобный способ описан в ссылке [34]. Могут быть применены гибридные подходы, в которых гидрофильные добавки присутствуют во время формирования мембраны, и также добавляются позднее как покрытие, например, см. ссылку [35]. Гидрофилизация PES-мембраны также может быть достигнута обработкой низкотемпературной плазмой. Ссылка [36] описывает гидрофильное модифицирование PES-мембраны обработкой низкотемпературной СО 2-плазмой. Гидрофилизация PES-мембраны также может быть выполнена окислением, как описано в ссылке[37]. Этот способ включает предварительное смачивание PES-мембраны жидкостью, имеющей низкое поверхностное натяжение, воздействие на мокрую PES-мембрану водного раствора окислителя и затем нагревание. Может быть также использована инверсия фаз, как описано в ссылке [38]. Идеальная гидрофильная PES-мембрана может быть получена обработкой PES (гидрофобного) поливинилпирролидоном (PVP) (гидрофильным). Было показано, что обработка полиэтиленгликолем(PEG) (гидрофильным) вместо PVP дает гидрофилизированную PES-мембрану, которая легко загрязняется (в особенности, когда используют содержащую сквален эмульсию), а также неблагоприятно выделяет формальдегид во время обработки в автоклаве. Предпочтительный двухслойный фильтр имеет первую гидрофильную PES-мембрану и вторую гидрофильную PES-мембрану. Известные гидрофильные мембраны включают Bioassure (от фирмы Cuno); простой полиэфирсульфон EverLUX; простой полиэфирсульфон STyLUX (оба от фирмы Meissner); мембраны Millex GV,Millex HP, Millipak 60, Millipak 200 и Durapore CVGL01TP3 (от фирмы Millipore); мембрану FluorodyneEX EDF, Supor EAV; Supor EBV, Supor EKV (все от фирмы Pall); Sartopore (от фирмы Sartorius); гидрофильную PES-мембрану от фирмы Sterlitech; и PES-мембрану WFPES от фирмы Wolftechnik. Во время фильтрации эмульсию можно поддерживать при температуре 40C или менее, например 30C или менее, для облегчения успешной стерильной фильтрации. Некоторые эмульсии могут не проходить через стерильный фильтр, когда они имеют температуру выше 40C. Является предпочтительным проводить стадию фильтрации в пределах 24 ч, например, в течение 18 ч, в течение 12 ч, в течение 6 ч, в течение 2 ч, в течение 30 мин получения второй эмульсии, поскольку после этого времени может оказаться невозможным прохождение второй эмульсии через стерильный фильтр без забивания фильтра, как обсуждается в ссылке [39]. Способы согласно изобретению могут быть применены в крупном масштабе. Так, способ может включать фильтрацию объема, превышающего 1 л, например, 5, 10, 20, 50, 100, 250 л и т.д. Конечная эмульсия. Результатом микрофлюидизации и фильтрации является эмульсия типа "масло в воде", в которой средний размер масляных капелек может быть меньше 220 нм, например 15520 нм, 15510 нм или 1555 нм, и в которой число масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, может составлять 5108/мл или менее, например 5107/мл или менее, 5106/мл или менее, 2106/мл или менее или 5105/мл или менее. Средний размер масляных капелек описываемых здесь эмульсий (включая первую и вторую эмульсии) в основном составляет не менее 50 нм. Способы согласно изобретению могут быть применены в крупном масштабе. Так, способ может включать получение конечной эмульсии с объемом, превышающим 1 л, например 5, 10, 20, 50,100, 250 л и т.д. Как только эмульсия типа "масло в воде" была сформирована, она может быть перенесена в стерильные стеклянные бутылки. Стеклянные бутылки могут иметь объем 5, 8 или 10 л. В альтернативном варианте, эмульсия типа "масло в воде" может быть перенесена в стерильные гибкие мешки (flex bag). Гибкий мешок может иметь объем 50, 100 или 250 л. В дополнение, гибкий мешок может быть оснащен одним или более стерильными соединительными трубками для соединения гибкого мешка с системой. Применение гибкого мешка со стерильными соединительными трубками является предпочтительным по сравнению со стеклянными бутылками, поскольку гибкий мешок является более крупным, чем стеклянные бутылки, что значит, что может не быть необходимости в замене гибкого мешка для хранения всей эмульсии, полученной в одиночной партии. Этим может быть создана стерильная замкнутая система для получения эмульсии, которая может снижать вероятность занесения загрязняющих примесей в конечную эмульсию. Это может быть особенно важным, если конечную эмульсию используют для фармацевтических целей, например, если конечная эмульсия представляет собой адъювант MF59. Предпочтительные количества масла (в об.%) в конечной эмульсии составляют между 2-20%, например около 10%. В особенности применимо содержание сквалена около 5 или около 10%. Содержание сквалена (вес./об.) применимо на уровне между 30-50 мг/мл, например между 35-45 мг/мл,36-42 мг/мл, 38-40 мг/мл и т.д. Предпочтительные количества поверхностно-активных веществ (вес.%) в конечной эмульсии составляют: сложные полиоксиэтиленовые эфиры сорбита (такие как Твин 80) от 0,02 до 2%, в частности около 0,5 или около 1%; сложные эфиры сорбита (такие как Спан 85) от 0,02 до 2%, в частности около 0,5 или около 1%; октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (такие как Тритон Х-100) от 0,001 до 0,1%,в частности от 0,005 до 0,02%; простые полиоксиэтиленовые эфиры (такие как лаурет-9) от 0,1 до 20%,- 11024770 предпочтительно от 0,1 до 10% и в особенности от 0,1 до 1% или около 0,5%. Применимо содержание полисорбата 80 (вес./об.) между 4-6 мг/мл, например между 4,1-5,3 мг/мл. Применимо содержание триолеата сорбита (вес/объем) между 4-6 мг/мл, например между 4,1-5,3 мг/мл. Способ в основном полезен для получения любой из следующих эмульсий типа "масло в воде": эмульсии, включающей сквален, полисорбат 80 (Твин 80) и триолеат сорбита (Спан 85). Состав эмульсии по объему может включать около 5% сквалена, около 0,5% полисорбата 80 и около 0,5% триолеата сорбита. В весовых единицах эти количества выражаются как 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и около 0,48% триолеата сорбита. Этот адъювант известен как "MF59". Эмульсия MF59 преимущественно включает цитрат-ионы, например 10 мМ натрий-цитратный буфер; эмульсии, включающей сквален, -токоферол (в идеальном случае DLтокоферол) и полисорбат 80. Эти эмульсии могут иметь (по весу) от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% -токоферола и от 0,3 до 3% полисорбата 80, например 4,3% сквалена, 4,7% -токоферола, 1,9% полисорбата 80. Весовое соотношение "сквален:токоферол" предпочтительно составляет 1 (например, 0,90), так как это дает более стабильную эмульсию. Сквален и полисорбат 80 могут присутствовать в объемном соотношении около 5:2,или в весовом отношении около 11:5. Одна такая эмульсия может быть получена в стадиях, в которых растворяют полисорбат 80 в натрий-фосфатном буфере (PBS) с образованием 2%-ного раствора, затем 90 мл этого раствора смешивают со смесью (5 г DLтокоферола и 5 мл сквалена), затем микрофлюидизируют смесь. Полученная эмульсия может иметь субмикронные масляные капельки, например, размером между 100 и 250 нм, предпочтительно около 180 нм; эмульсии из сквалена, токоферола и Тритона как моющего средства (например, Тритона Х-100). Эмульсия также может включать 3-O-дезацилированный монофосфориллипид A ("3d-MPL"). Эмульсия может содержать фосфатный буфер; эмульсии, включающей сквален, полисорбат (например, полисорбат 80), детергент Тритон (например, Тритон Х-100) и токоферол (например, сукцинат -токоферола). Эмульсия может включать эти три компонента в массовом соотношении около 75:11:10 (например, 750 мкг/мл полисорбата 80, 110 мкг/мл Тритона Х-100 и 100 мкг/мл сукцината -токоферола), и эти концентрации должны включать любой вклад этих компонентов от антигенов. Эмульсия также может включать 3d-MPL. Эмульсия также может включать сапонин, такой как QS21. Водная фаза может содержать фосфатный буфер; эмульсии, включающей сквален, водный растворитель, гидрофильное неионное поверхностноактивное вещество на основе простого полиоксиэтиленалкилового эфира (например, простой полиоксиэтилен-(12)-цетостеариловый эфир), и гидрофобное неионное поверхностно-активное вещество (например, сложный эфир сорбита или сложный эфир маннида, такой как моноолеат сорбита или "Спан 80"). Эмульсия предпочтительно является термореверсивной и/или имеет по меньшей мере 90% масляных капелек (по объему) с размером менее 200 нм [40]. Эмульсия также может включать одно или более из: альдитола; криопротектора (например, сахара, такого как додецилмальтозид и/или сахароза); и/или алкилполигликозида. Она также может включать такой агонист TLR4, химическая структура которого не включает углеводный цикл [41]. Такая эмульсия может быть лиофилизирована. Составы этих эмульсий, выраженные выше в процентных единицах, могут быть модифицированы разбавлением или концентрированием (например, в целое число раз, такое как 2 или 3, или дробное число раз, такое как 2/3 или 3/4), причем их соотношения остаются прежними. Например, вдвое концентрированный MF59 имел бы около 10% сквалена, около 1% полисорбата 80 и около 1% триолеата сорбита. Концентрированные формы могут быть разбавлены (например, раствором антигена) до достижения желательной конечной концентрации эмульсии. Эмульсии согласно изобретению идеально сохраняются при температуре между 2 и 8C. Их не следует замораживать. В идеальном случае их следует содержать вне прямого освещения. В частности, содержащие сквален эмульсии и вакцины согласно изобретению следует защищать во избежание фотохимического разложения сквалена. Если эмульсии согласно изобретению оставляют на хранение, то это предпочтительно делать в инертной атмосфере, например N2 или аргона. Вакцины. Хотя адъюванты на основе эмульсии типа "масло в воде" могут быть введены пациентам в своем собственном состоянии (например, для создания адъювантного эффекта для антигена, который был отдельно введен пациенту), более обычным является смешение адъюванта с антигеном до введения с образованием иммуногенной композиции, например вакцины. Смешение эмульсии и антигена может быть проведено непосредственно перед немедленным приемом, во время применения, или может иметь место во время приготовления вакцины, перед заполнением. Способы согласно изобретению могут быть применены в обеих ситуациях. Так, способ согласно изобретению может включать дополнительную технологическую стадию, в которой смешивают эмульсию с антигенным компонентом. В качестве альтернативы он может включать дополнительную стадию, в которой упаковывают адъювант в набор как компонент набора вместе с антигенным компонентом. Поэтому в целом изобретение может быть применено при приготовлении смешанных вакцин или при приготовлении наборов, включающих готовые к смешению антиген и адъювант. Там, где смешение проводят во время приготовления, объемы массивов антигена и эмульсии, которые смешиваются, обычно будут больше чем 1 л, например 5, 10, 20, 50, 100, 250 л и т.д. Когда же смешение происходит в момент применения, то объемы, которые смешиваются, обычно будут меньшими чем 1 мл, например 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 мл и т.д. В обоих случаях обычной практикой является смешение по существу равных объемов эмульсии и раствора антигена, т.е. по существу 1:1 (например, между 1,1:1 и 1:1,1, предпочтительно между 1,05:1 и 1:1,05, и более предпочтительно между 1,025:1 и 1:1,025). Однако в некоторых вариантах исполнения может быть использован избыток эмульсии или избыток антигена [42]. Там,где применяют избыточный объем одного компонента, избыток в основном будет составлять по меньшей мере 1,5:1, например 2:1, 2,5:1, 3:1, 4:1, 5:1 и т.д. Там, где антиген и адъювант присутствуют как отдельные компоненты внутри набора, они физически отделены друг от друга внутри набора, и это разделение может быть достигнуто разнообразными путями. Например, компоненты могут быть в отдельных контейнерах, таких как флаконы. Содержимое двух флаконов затем может быть смешано при необходимости, например, извлечением содержимого одного флакона и добавлением его в другой флакон, или удалением содержимого обоих флаконов по отдельности и смешением их в третьем контейнере. В еще одной компоновке один из компонентов набора представляет собой шприц, и другой находится в контейнере, таком как флакон. Шприц может быть использован (например, с иглой) для введения его содержимого во флакон для смешения, и смесь затем может быть вытянута в шприц. Смешанное содержимое шприца затем может быть введено пациенту, обычно через новую стерильную иглу. Упаковка одного компонента в шприц устраняет необходимость в применении отдельного шприца для введения пациенту. В еще одной предпочтительной компоновке два компонента набора содержатся вместе, но разделенными в одном и том же шприце, например, в двухкамерном шприце, таком как шприц, представленный в ссылках 43-50 и т.д. Когда шприц приводят в действие (например, во время введения пациенту), то содержимое двух камер смешивается. Эта компоновка избегает необходимости в отдельной стадии смешения во время применения. Содержимое разнообразных компонентов набора в основном будет во всех случаях в жидкой форме. В некоторых компоновках компонент (обычно скорее антигенный компонент, нежели эмульсионный компонент) находится в сухой форме (например, в лиофилизированной форме), причем другой компонент находится в жидкой форме. Два компонента могут быть смешаны, чтобы реактивировать сухой компонент и образовать жидкую композицию для введения пациенту. Лиофилизированный компонент обычно будет размещен скорее внутри флакона, нежели в шприце. Высушенные компоненты могут включать стабилизаторы, такие как лактоза, сахароза или маннит, а также их смеси, например смеси лактозы с сахарозой, смеси сахарозы с маннитом и т.д. В одной возможной компоновке применяют жидкий эмульсионный компонент в предварительно заполненном шприце и лиофилизированный антигенный компонент во флаконе. Если вакцины содержат компоненты в дополнение к эмульсии и антигену, то эти дополнительные компоненты могут быть включены в один из этих двух компонентов набора или могут быть частью третьего компонента набора. Пригодные контейнеры для смешанных вакцин согласно изобретению или для индивидуальных компонентов набора включают флаконы и одноразовые шприцы. Эти контейнеры должны быть стерильными. Там, где композиция/компонент размещены во флаконе, флакон предпочтительно изготавливают из стекла или пластического материала. Флакон предпочтительно стерилизуют перед добавлением в него композиции. Во избежание проблем с чувствительными к латексу пациентами, флаконы предпочтительно закупоривают не содержащей латекса пробкой, и предпочтительным является отсутствие латекса во всех упаковочных материалах. В одном варианте исполнения флакон имеет пробку из бутилкаучука. Флакон может включать однократную дозу вакцины/компонента, или он может включать более чем одну дозу (флакон "для многократного приема"), например 10 доз. В одном варианте исполнения флакон включает 100,25 мл доз эмульсии. Предпочтительные флаконы сделаны из бесцветного стекла. Флакон может иметь колпачок (например, разъем типа Луер), приспособленный так, что предварительно заполненный шприц может быть введен в колпачок, содержимое шприца может быть выдавлено во флакон (например, для восстановления лиофилизированного материала в нем), и содержимое флакона может быть извлечено обратно в шприц. После удаления шприца из флакона затем может быть присоединена игла, и композиция может быть введена пациенту. Колпачок предпочтительно размещают внутри пробки или крышки так, что пробка или крышка должны быть удалены, чтобы открыть доступ к колпачку. Там, где композиция/компонент упакованы в шприц, шприц обычно не будет иметь присоединенной к нему иглы, хотя со шприцем может поставляться отдельная игла для сборки и применения. Пред- 13024770 почтительны безопасные картриджи с иглой. Типичными являются иглы 23-го размера длиной 1 дюйм(25,4 мм), 25-го размера длиной 1 дюйм (25,4 мм) и 23-го размера длиной 5/8 дюйма (15,9 мм). Шприцы могут быть снабжены отслаиваемыми этикетками, на которых могут быть напечатаны номер партии,сезон гриппа и дата истечения срока годности содержимого, чтобы облегчить ведение учета. Поршень в шприце предпочтительно имеет фиксатор для предотвращения случайного извлечения поршня во время засасывания. Шприцы могут иметь латексный каучуковый колпачок и/или поршень. Одноразовые шприцы содержат однократную дозу вакцины. Шприц в основном будет иметь верхний колпачок для закупоривания верхушки до присоединения иглы, и верхний колпачок предпочтительно изготовлен из бутилкаучука. Если шприц и игла упакованы по отдельности, то игла предпочтительно оснащается защитной оболочкой из бутилкаучука. Эмульсия перед упаковкой во флакон или шприц может быть разбавлена буферным раствором. Типичные буферные растворы включают: фосфатный буфер; трис-буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер; или цитратный буфер. Разбавление может снижать концентрацию компонентов адъюванта, в то же время сохраняя их относительные пропорции, например, с созданием адъюванта "половинной силы". Контейнеры могут быть промаркированы, чтобы показывать объем половинной дозы, например,для облегчения введения детям. Например, шприц, содержащий дозу в 0,5 мл, может иметь отметку, показывающую объем 0,25 мл. Там, где используют стеклянный контейнер (например, шприц или флакон), предпочтительно применение контейнера, сделанного скорее из боросиликатного стекла, нежели из натриево-кальциевосиликатного стекла. С эмульсиями типа "масло в воде" могут быть применены разнообразные антигены, включающие,но не ограничивающиеся таковыми, вирусные антигены, такие как вирусные поверхностные белки; бактериальные антигены, такие как белковые и/или углеводные антигены; грибковые антигены; паразитарные антигены; и опухолевые антигены. Изобретение в основном применимо для вакцин против вируса гриппа, ВИЧ, анкилостом, вируса гепатита В, вируса простого герпеса, бешенства, респираторносинцитиального вируса, цитомегаловируса, Staphylococcus aureus, хламидии, вируса тяжелого острого респираторного синдрома, вируса ветряной оспы, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis,Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, вируса Эпштейна-Барр, вируса человеческой папилломы и т.д. Антигены вируса гриппа. Они могут принимать форму живого вируса или инактивированного вируса. Там, где используют инактивированный вирус, вакцина может включать целый вирион, расщепленный вирион или очищенные поверхностные антигены (включающие гемагглютинин и, обычно, также включающие нейраминидазу). Антигены вируса гриппа также могут присутствовать в форме виросом. Антигены могут иметь любой субтип гемагглютинина, выбранный из H1, Н 2, Н 3, Н 4, Н 5, Н 6, Н 7, Н 8, Н 9, H10, Н 11, Н 12, Н 13,Н 14, Н 15 и/или Н 16. Вакцина может включать антиген(ы) из одного или более (например, 1, 2, 3, 4 или более) штаммов вируса гриппа, в том числе вируса гриппа А и/или вируса гриппа В, например моновалентная вакцина A/H5N1 или A/H1N1 или тривалентная вакцина A/H1N1 + A/H3N2 + В. Вирус гриппа может представлять собой реассортантный штамм, и может быть получен методами обратной генетики(например, [51-55]). Так, вирус может включать один или более сегментов РНК из вируса A/PR/8/34 (типично 6 сегментов из A/PR/8/34, с сегментами НА и N из вакцинного штамма, т.е. реассортантного с формулой генома 6:2). Вирусы, используемые в качестве источника антигенов, могут быть выращены либо на яйцах (например, эмбриональных куриных яйцах), либо на клеточной культуре. Там, где применяют клеточную культуру, клеточный субстрат типично будет представлять собой клеточную линию млекопитающих, такую как MDCK; СНО; 293 Т; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38 и т.д. Предпочтительные клеточные линии млекопитающих для выращивания вирусов гриппа включают: клетки MDCK[56-59], производные от Madin Darby canine kidney (клетки почки собаки); клетки Vero [60-62], производные от African green monkey kidney (почки африканской зеленой мартышки); или клетки PER.C6 [63],производные от ретинобластов человеческих эмбрионов. Там, где вирус был выращен на клеточной линии млекопитающих, состав преимущественно не будет содержать яичных белков (например, овальбумина и овомукоида) и ДНК цыпленка, тем самым снижая аллергенность. Единичные дозы вакцины обычно стандартизированы по отношению к уровням содержания гемагглютинина (НА), типично измеряемым с использованием метода одиночной радиальной иммунодиффузии (SRID). Существующие вакцины обычно содержат около 15 мкг HA на штамм, хотя могут быть применены меньшие дозы, в частности, когда используют адъювант. Были использованы дробные дозы, такие как 1/2 (т.е. 7,5 мкг НА на штамм), 1/4 и 1/8 [64, 65], так и более высокие дозы (например, 3 х- или 9 х-дозы [66, 67]). Таким образом,вакцины могут включать между 0,1 и 150 мкг НА на штамм гриппа, предпочтительно между 0,1 и 50 мкг,например 0,1-20 мкг, 0,1-15 мкг, 0,1-10 мкг, 0,1-7,5 мкг, 0,5-5 мкг и т.д. Конкретные дозы включают, например, около 15, около 10, около 7,5, около 3,8, около 3,75, около 1,9, около 1,5 и т.д. на штамм. Вирус иммунодефицита человека, включающий ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Антиген типично будет представлять собой капсульный антиген. Поверхностные антигены вируса гепатита В. Этот антиген предпочтительно получают методами рекомбинантных ДНК, например, после экспрессии в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. В отличие от нативного вирального HBsAg, рекомбинантный экспрессированный в дрожжах антиген не гликозилирован. Он может быть в форме по существу сферических частиц (со средним диаметром около 20 нм), включающих липидный матрикс, содержащий фосфолипиды. В отличие от нативных частиц HBsAg, экспрессированные в дрожжах частицы могут включать фосфатидилинозит. HBsAg может быть из любого из субтипов ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr,adw2, adw4, adrq- и adrq+. Анкилостомы, в частности, как обнаруживаемые у собачьих (Ancylostoma caninum). Этот антиген может представлять собой рекомбинантную Ас-МТР-1 (металлопротеаза астацинового типа), и/или аспарагиновую гемоглобиназу (Ас-APR-1), который может быть экспрессирован в системе "бакуловирус/клетки насекомых" как секретированный белок [68, 69]. Антигены вируса простого герпеса (HSV). Предпочтительный антиген HSV для применения согласно изобретению представляет собой мембранный гликопротеин gD. Является предпочтительным применение gD из штамма HSV-2 (антиген"gD2"). В композиции может использоваться форма gD, в которой С-концевой мембранный якорный регион был удален [70], например усеченная gD, включающая аминокислоты 1-306 природного белка с добавлением аспарагина и глутамина у карбоксильного конца. Эта форма белка включает сигнальный пептид, который отщепляют с образованием зрелого белка из 283 аминокислот. Делеция якоря позволяет приготовить белок в растворимой форме. Антигены вируса человеческой папилломы (HPV). Предпочтительные антигены HPV для применения согласно изобретению представляют собой капсидные белки L1, которые могут собираться с образованием структур, известных как вирусоподобные частицы (VLP). VLP могут быть продуцированы рекомбинантной экспрессией L1 в дрожжевых клеткахS.frugiperda, или в клетках Drosophila). Для дрожжевых клеток ген(ы) L1 могут нести плазмидные векторы; для клеток насекомых ген(ы) L1 могут нести бакуловирусные векторы. Более предпочтительно композиция включает L1 VLP из штаммов как HPV-16, так и HPV-18. Было показано, что эта бивалентная комбинация является высокоэффективной [71]. В дополнение к штаммам HPV-16 и HPV-18, также возможно включение L1 VLP из штаммов HPV-6 и HPV-11. Возможно также применение онкогенных штаммов HPV. Вакцина может включать между 20-60 мкг/мл (например, около 40 мкг/мл) на штаммHPV. Антигены сибирской язвы. Сибирская язва вызывается бактерией Bacillus anthracis. Пригодные антигены B.anthracis включают А-компоненты (летальный фактор (LF) и фактор (EF), вызывающий отек), оба из которых могут сочетаться в белковом комплексе с общим компонентом В, известным как протективный антиген (РА). Антигены необязательно могут быть детоксифицированы. Дополнительные подробности можно найти в ссылках [72-74]. Антигены стафилококка золотистого (S.aureus). Известны многочисленные антигены S.aureus. Пригодные антигены включают капсулярные сахариды (например, из штамма типа 5 и/или типа 8), и белки(например, IsdB, Hla, и т.д.). Капсулярные сахаридные антигены идеально конъюгируют с белковым носителем. Антигены пневмококка (S.pneumoniae). Известны многочисленные антигены S.pneumoniae. Пригодные антигены включают капсулярные сахариды (например, из одного или более серотипов 1, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19F и/или 23F) и белки(например, пневмолизин, детоксифицированный пневмолизин, полигистидиновый триадный белок D(PhtD) и т.д.). Капсулярные сахаридные антигены идеально конъюгируют с белковым носителем. Раковые антигены. Известны многообразные опухолеспецифические антигены. Изобретение может быть использовано с антигенами, которые вызывают иммунотерапевтический отклик против рака легких, меланомы, рака молочной железы, рака простаты и т.д. Раствор антигена обычно смешивают с эмульсией, например, в объемном отношении 1:1. Это смешение может быть выполнено или изготовителем вакцины, до заполнения, или же может быть проведено в момент применения работником здравоохранения. Фармацевтические композиции. Композиции, приготовленные способами согласно изобретению, являются фармацевтически приемлемыми. Они могут включать компоненты в дополнение к эмульсии и, необязательно, антиген. Композиция может включать консервант, такой как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Однако предпочтительно, что вакцина по существу не должна содержать (т.е. содержать менее 5 мкг/мл) ртуть содержащий материал, например, не включать тиомерсал [75, 76]. Более предпочтительны вакцины и компоненты, не содержащие ртути. Значение рН композиции в основном будет составлять между 5,0 и 8,1 и более типично между 6,0 и 8,0, например между 6,5 и 7,5. Поэтому способ согласно изобретению может включать стадию, в которой корректируют значение рН вакцины перед упаковкой. Композиция предпочтительно является стерильной. Композиция предпочтительно является непирогенной, например, содержащей 1 EU (эндотоксинная единица, стандартное измерение) на дозу и предпочтительно 0,1 EU на дозу. Композиция предпочтительно не содержит глютен. Композиция может включать материал для одиночной иммунизации, или может включать материал для множественной иммунизации (т.е. "многодозный" набор). В многодозных компоновках предпочтительно включение консерванта. Вакцины обычно вводят в объемной дозировке около 0,5 мл, хотя детям может быть введена половинная доза (т.е. около 0,25 мл). Способы лечения и введения вакцины. Изобретение представляет наборы и композиции, приготовленные с использованием способов согласно изобретению. Композиции, приготовленные соответственно способам согласно изобретению,пригодны для введения человеческим пациентам, и изобретение представляет способ повышения иммунного отклика у пациента, включающий стадию, в которой вводят такую композицию пациенту. Изобретение также представляет эти наборы и композиции для применения в качестве медикаментов. Изобретение также представляет применение (i) водного состава антигена и (ii) эмульсии типа"масло в воде", полученной согласно изобретению, при изготовлении медикамента для повышения иммунного отклика у пациента. Иммунный отклик, повышенный с помощью этих способов и вариантов применения, в основном будет включать образование антител, предпочтительно протективный гуморальный иммунный ответ. Композиции могут быть введены разнообразными путями. Наиболее предпочтительный путь иммунизации представляет собой внутримышечную инъекцию (например, в руку или ногу), но другие доступные пути включают подкожную инъекцию, введение через нос [77-79], оральное [80], внутрикожное[81, 82], чрезкожное, трансдермальное [83] введение и т.д. Вакцины, приготовленные согласно изобретению, могут быть использованы для лечения, как детей,так и взрослых. Пациент может иметь возраст менее 1 года, 1-5 лет, 5-15 лет или по меньшей мере 55 лет. Пациент может быть пожилым (например, возраста 55 лет, предпочтительно 65 лет), юным (например,с возрастом 5 лет), госпитализированными пациентами, работниками здравоохранения, военнослужащим вооруженных сил, беременной женщиной, хроническим больным, иммунодефицитными пациентами, и лицами, выезжающими за рубеж. Однако вакцины пригодны не только для этих групп и могут быть применены среди населения в более общем плане. Вакцины согласно изобретению могут быть введены пациентам по существу в то же время (например, во время той же медицинской консультации или визита к профессиональному работнику здравоохранения), как и прочие вакцины. Промежуточные процессы. Изобретение также представляет способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающий стадии микрофлюидизации первой эмульсии с образованием второй эмульсии, и затем фильтрации второй эмульсии. Первая эмульсия имеет вышеописанные характеристики. Изобретение также представляет способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающий фильтрацию второй эмульсии, т.е. микрофлюидизированной эмульсии. Микрофлюидизированная эмульсия имеет вышеописанные характеристики. Изобретение также представляет способ получения вакцины, включающий стадию, в которой объединяют эмульсию с антигеном, где эмульсия имеет вышеописанные характеристики. Конкретные варианты осуществления. Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения включают: Способ получения эмульсии типа "масло в воде", содержащей сквален, включающий стадии, в которых (i) формируют первую эмульсию, имеющую первый средний размер масляных капелек; (ii) проводят микрофлюидизацию первой эмульсии с образованием второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который является меньшим, чем первый средний размер масляных капелек; и(iii) проводят фильтрацию второй эмульсии с использованием гидрофильной мембраны. Способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающий стадии, в которых (i) формируют первую эмульсию, имеющую первый средний размер масляных капелек 5000 нм или менее; (ii) проводят микрофлюидизацию первой эмульсии с образованием второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который является меньшим, чем первый средний размер масляных капелек; и(iii) проводят фильтрацию второй эмульсии с использованием гидрофильной мембраны. Способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающий стадии, в которых (i) формируют первую эмульсию, имеющую первый средний размер масляных капелек; (ii) проводят микрофлюидиза- 16024770 цию первой эмульсии с образованием второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который является меньшим, чем первый средний размер масляных капелек; и (iii) проводят фильтрацию второй эмульсии с использованием гидрофильной мембраны из простого полиэфирсульфона. Способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающей сквален, причем способ включает стадии, в которых (i) формируют первую эмульсию, имеющую первый средний размер масляных капелек, с использованием микрофлюидизатора, причем первую эмульсию формируют многократной циркуляцией компонентов первой эмульсии через гомогенизатор. Способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающей сквален, причем способ включает стадию (b) микрофлюидизации первой эмульсии, имеющей первый средний размер масляных капелек, с образованием второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который является меньшим, чем первый средний размер масляных капелек, причем вторую эмульсию формируют циркуляцией компонентов второй эмульсии с переносом компонентов второй эмульсии из первого эмульсионного контейнера через первое микрофлюидизирующее устройство во второй эмульсионный контейнер, и затем через второе микрофлюидизирующее устройство, причем первое и второе микрофлюидизирующие устройства являются одинаковыми. Способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающий стадии, в которых: пропускают первую эмульсию, имеющую первый средний размер масляных капелек, через микрофлюидизирующее устройство с образованием второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который является меньшим, чем первый средний размер масляных капелек; причем микрофлюидизирующее устройство включает камеру взаимодействия, которая включает многочисленные каналы Z-типа, и вспомогательный обрабатывающий модуль, включающий по меньшей мере один канал; причем вспомогательный обрабатывающий модуль позиционируют ниже по потоку относительно камеры взаимодействия. Способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающий стадию, в которой пропускают первую эмульсию, имеющую первый средний размер масляных капелек, через микрофлюидизирующее устройство с образованием второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который является меньшим, чем первый средний размер масляных капелек; причем микрофлюидизирующее устройство включает камеру взаимодействия и вспомогательный обрабатывающий модуль, включающий многочисленные каналы. Способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающий стадию, в которой пропускают первую эмульсию, имеющую первый средний размер масляных капелек, через микрофлюидизирующее устройство с образованием второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который является меньшим, чем первый средний размер масляных капелек, причем микрофлюидизирующее устройство включает камеру взаимодействия, и причем давление компонентов эмульсии на входе в камеру взаимодействия является по существу постоянным на протяжении по меньшей мере 85% времени, в течение которого эмульсию подают в микрофлюидизатор. Способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающий стадию формирования первой эмульсии, имеющей первый средний размер масляных капелек, причем формирование первой эмульсии проводят под инертным газом, например азотом, например, под давлением до 0,5 бар (0,05 МПа). Способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающий стадию, в которой пропускают первую эмульсию, имеющую первый средний размер масляных капелек, через микрофлюидизирующее устройство с образованием второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который является меньшим, чем первый средний размер масляных капелек, причем формирование первой эмульсии проводят под инертным газом, например, азотом, например, под давлением до 0,5 бар(0,05 МПа). Способ получения эмульсии типа "масло в воде", включающий стадии, в которых (i) формируют первую эмульсию, имеющую первый средний размер масляных капелек; (ii) проводят микрофлюидизацию первой эмульсии с образованием второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который является меньшим, чем первый средний размер масляных капелек; (iii) проводят фильтрацию второй эмульсии; (iv) переносят эмульсию типа "масло в воде" в стерильный гибкий мешок. Общие положения. Термин "содержащий" охватывает "включающий", а также "состоящий", например, композиция,"включающая" X, может состоять исключительно из X или может включать нечто дополнительное, например X+Y. Слово "по существу" не исключает "полностью", например, композиция, которая "по существу не содержит" Y, может быть полностью свободна от Y. Где необходимо, слово "по существу" может быть опущено из определения изобретения. Термин "около" в отношении численного значения "х" является необязательным и означает, например, х 10%. Если конкретно не оговорено иное, способ, включающий стадию, в которой смешивают два или более компонентов, не требует никакого конкретного порядка смешения. Таким образом, компоненты могут быть смешаны в любом порядке. Там, где имеются три компонента, могут быть объединены друг с другом два компонента, и затем комбинация может быть объединена с третьим компонентом и т.д. Там, где в клеточной культуре используют материалы животного происхождения (и конкретно бычьего), они должны быть получены из источников, которые не содержат трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (TSE) и, в частности, свободны от губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE). В целом же предпочтительно, чтобы в клеточных культурах полностью отсутствовали материалы животного происхождения. Краткое описание чертежей Фиг. 1 показывает конкретный пример гомогенизатора, который может быть использован для формирования первой эмульсии. Фиг. 2 показывает деталь ротора и статора, которые могут быть использованы в таком гомогенизаторе. Фиг. 3 показывает два профиля давления для синхронизированного режима работы напорных насосов для повышения давления. Фиг. 4 показывает камеру взаимодействия с каналом Z-типа. Фиг. 5 показывает циркуляцию типа I, тогда как фиг. 6 показывает циркуляцию типа II. Контейнеры обозначены как "С", тогда как гомогенизатор обозначен как "Н". Показаны направление и порядок перемещений текучей среды. На фиг. 6 гомогенизатор имеет две входных стрелки и две выходных стрелки, но на самом деле гомогенизатор имеет единичный входной канал и единичный выходной канал. Варианты осуществления изобретения Пример 1. Компоненты эмульсии, сквален, полисорбат 80, триолеат сорбита и натрий-цитратный буфер, были введены в поточный, высокоскоростной, ротор-статорный гомогенизатор (IKA Super Dispax Reactor DRS 2000/5). Были использованы исходные объемы эмульсии 280 и 250 л, и скорость гомогенизатора была установлена на 50001000 об/мин. Температуру эмульсии во время гомогенизирования поддерживали ниже 60C. Провели три испытательных цикла. В первом испытательном цикле 280 л компонентов эмульсии подвергли циркуляции типа I, между гомогенизатором и первым контейнером для предварительного смешения, в течение 20 мин, с последующими однократной циркуляцией типа II, переводом компонентов первой эмульсии из первого контейнера для предварительного смешения из нержавеющей стали через гомогенизатор во второй контейнер для предварительного смешения из нержавеющей стали, и затем обратно через гомогенизатор. Во втором испытательном цикле 280 л компонентов эмульсии подвергли циркуляции типа I между гомогенизатором и первым контейнером для предварительного смешения из нержавеющей стали в течение 5 мин, с последующими 5 циркуляциями типа II, переводом компонентов первой эмульсии из первого контейнера для предварительного смешения из нержавеющей стали через гомогенизатор во второй контейнер для предварительного смешения из нержавеющей стали, и затем обратно через гомогенизатор в первый контейнер для предварительного смешения из нержавеющей стали. В третьем испытательном цикле 250 л компонентов эмульсии подвергли циркуляции типа I между гомогенизатором и первым контейнером для предварительного смешения из нержавеющей стали в течение 20 мин, с последующими однократной циркуляцией типа II, переводом компонентов первой эмульсии из первого контейнера для предварительного смешения из нержавеющей стали через гомогенизатор во второй контейнер для предварительного смешения из нержавеющей стали и затем обратно через гомогенизатор в первый контейнер для предварительного смешения из нержавеющей стали. Первую эмульсию гомогенизировали, пока она не стала иметь средний размер масляных капелек 1200 нм или менее и число масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, 5109/мл или меньше. Затем первую эмульсию подвергли микрофлюидизации с образованием второй эмульсии. Эмульсию пропускали через микрофлюидизирующее устройство пять раз. Микрофлюидизирующее устройство работало при давлении приблизительно между 600 и 800 бар (60-80 МПа) (т.е. приблизительно между 9000 и 12000 psi), и эмульсию во время микрофлюидизации поддерживали при температуре 405C с использованием охлаждающего устройства. Затем вторую эмульсию подвергли стерильной фильтрации. Средний размер масляных капелек в профильтрованных эмульсиях в каждом испытательном цикле соответствовал техническим спецификациям адъюванта MF59. Другие параметры эмульсий во время первого, второго и третьего испытательных циклов можно найти в табл. 1. Результаты всех трех испытательных циклов являются превосходными. Однако результаты в табл. 1 показывают, что испытательный цикл 1 дает наибольшее процентное сокращение (99,5%) числа частиц с размером 1,2 мкм в эмульсии после фильтрации, по сравнению с числом, присутствующим во второй эмульсии. Поэтому наилучшая картина циркуляционного гомогенизирования представляет собой 20 мин циркуляции типа I с последующей циркуляцией типа II. Пример 2. В дополнительных экспериментах первая эмульсия была сформирована в условиях циркуляции типа I (фиг. 5) или типа II (фиг. 6). Для пяти отдельных циклов среднее число крупных частиц на 1 мл было следующим (табл. 2). Таблица 2 Таким образом, циркуляция типа II имеет результатом меньшее число крупных капелек и меньшую вариацию от партии к партии. Будет понятно, что изобретение было описано только посредством примера, могут быть сделаны и модификации, в то же время оставаясь в пределах объема и сущности изобретения. Список цитированной литературы ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения вакцинного адъюванта на основе содержащей сквален эмульсии типа "масло в воде", включающий следующие стадии:(i) объединение компонентов первой эмульсии в смесительном резервуаре;(ii) формирование первой эмульсии с первым средним размером масляных капелек, используя ротор-статорный гомогенизатор,где первую эмульсию формируют переносом ее компонентов из первого контейнера во второй контейнер через гомогенизатор, а затем возвращают их из второго контейнера в первый контейнер через тот же гомогенизатор; и(iii) микрофлюидизация первой эмульсии с образованием второй эмульсии со вторым средним размером масляных капелек, который меньше первого среднего размера масляных капелек. 2. Способ по п.1, где первая эмульсия образуется:(a) циркуляцией с переносом компонентов первой эмульсии между первым контейнером и гомогенизатором; а затем(b) циркуляцией с переносом компонентов первой эмульсии из первого контейнера во второй контейнер через гомогенизатор, а затем возвращая их из второго контейнера в первый контейнер через тот же гомогенизатор. 3. Способ по любому предшествующему пункту, в котором стадия (ii) включает два или более цикла переноса компонентов первой эмульсии из первого контейнера во второй контейнер и опять обратно. 4. Способ по любому предшествующему пункту, где в первом и втором контейнерах поддерживают атмосферу инертного газа. 5. Способ по п.1, в котором гомогенизатор является ротор-статорным гомогенизатором, а микрофлюидизацию проводят в камере взаимодействия, не имеющей движущихся частей. 6. Способ по п.5, в котором гомогенизатор обеспечивает скорость сдвига выше 1106 с-1, а микрофлюидизацию проводят в камере взаимодействия, которая обеспечивает скорость сдвига 2,5106 с-1. 7. Способ по любому предшествующему пункту, который включает (iv) фильтрацию второй эмульсии. 8. Способ по любому из пп.1-7, в котором во время стадии (iii) вторую эмульсию формируют многократной циркуляцией компонентов второй эмульсии через микрофлюидизирующее устройство. 9. Способ по п.8, в котором вторая эмульсия образуется путем циркуляции компонентов второй эмульсии через устройство для микрофлюидизации три раза. 10. Способ по п.8 или 9, в котором циркуляция компонентов второй эмульсии включает перенос компонентов второй эмульсии между первым эмульсионным контейнером и микрофлюидизирующим устройством. 11. Способ по любому из пп.8-10, в котором циркуляция компонентов второй эмульсии включает перенос компонентов второй эмульсии из первого эмульсионного контейнера через микрофлюидизирующее устройство во второй эмульсионный контейнер и затем снова через микрофлюидизирующее устройство. 12. Способ по любому из пп.1-11, где в первом и втором контейнерах поддерживают атмосферу инертного газа. 13. Способ по любому предшествующему пункту, в котором первый средний размер масляных капелек составляет 5000 нм или менее. 14. Способ по любому предшествующему пункту, в котором число масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, во второй эмульсии составляет 51011/мл или менее. 15. Способ по любому из пп.1-14, в котором второй средний размер масляных капелек составляет 500 нм или менее. 16. Способ по любому из пп.1-15, в котором число масляных капелек, имеющих размер 1,2 мкм, во второй эмульсии составляет 51010/мл или менее. 17. Способ по любому предшествующему пункту, в котором вакцинный адъювант на основе эмульсии типа "масло в воде" содержит 2-20 об.% масла. 18. Способ по любому предшествующему пункту, в котором вакцинный адъювант на основе эмульсии типа "масло в воде" содержит сквален, полисорбат 80 и триолеата сорбита. 19. Способ по п.18, в котором вакцинный адъювант на основе эмульсии типа "масло в воде" содержит 30-50 мг/мл сквалена, 4-6 мг/мл полисорбата 80 и 4-6 мг/мл триолеата сорбита. 20. Способ получения вакцинной композиции, включающий получение эмульсии по любому из пп.1-19 и объединение эмульсии с антигеном. 21. Способ получения вакцинного набора, включающий получение эмульсии по любому из пп.1-19 и процесс упаковки эмульсии в набор в качестве компонента набора вместе с антигенным компонентом. 22. Способ по п.21, в котором компоненты набора находятся в отдельных флаконах, где флаконы сделаны из боросиликатного стекла. 23. Способ по любому из пп.20-22, в котором адъювант представляет собой адъювант, имеющий объем более 1 л, и способ включает отбор единичных доз из массива адъюванта для упаковки в качестве компонентов набора. 24. Способ по любому из пп.20-23, в котором антиген представляет собой антиген вируса гриппа,где комбинация эмульсии и антигена образует вакцинную композицию, включающую около 15, около 10, около 7,5, около 5, около 3,8, около 1,9, около 1,5 мкг гемагглютинина на штамм вируса гриппа. 25. Способ по п.19, в котором вакцинный адъювант на основе эмульсии типа "масло в воде" содержит 36-42 мг/мл сквалена, 4,1-5,3 мг/мл полисорбата 80 и 4,1-5,3 мг/мл триолеата сорбита.