Новые производные стафилокиназы

1 Изобретение относится к новым производным стафилокиназы со сниженной иммуногенностью, их производству и использованиню при лечении тромбоза артерий и для изготовления фармацевтической композиции для лечения тромбоза артерий. Более конкретно, оно относится к использованию сконструированных производных стафилокиназы для изготовления фармацевтической композиции для лечения инфаркта миокарда. Тромбозные осложнения сердечнососудистых заболеваний являются основной причиной смерти и нетрудоспособности, и следовательно, тромболиз (т.е. растворение с помощью лекарственных средств сгустка крови) мог бы благоприятно влиять на исход таких угрожающих жизни заболеваний, как инфаркт миокарда, тромбоз сосудов мозга и венозная тромбоэмболия. Тромболитические средства являются активаторами плазминогена, которые превращают плазминоген, неактивный профермент фибринолитической системы крови, в протеолитический фермент плазмин. Плазмин растворяет фибрин сгустка крови, но может также разрушать нормальные компоненты гемостатической системы и вызывать так называемое "литическое состояние". Физиологический фибринолиз, однако, является фибриноориентированным в результате конкретных молекулярных взаимодействий между тканевым активатором плазминогена, фибрином, плазмином (плазминогеном) и 2-антиплазмином (1,2). В настоящее время шесть тромболитических препаратов или утверждены для клинического применения, или находятся на клинических испытаниях при лечении пациентов с острым инфарктом миокарда. Эти препараты включают стрептокиназу, урокиназу, рекомбинантный активатор тканевого плазминогена(рт-АП) или его производные, анизоилированный плазминогено-стрептокиназный активаторный комплекс (АПСАК), рекомбинантный одноцепочечный урокиназный активатор плазминогена (роцу-АП, рекомбинантная проурокиназа) и рекомбинантная стафилокиназа (Sak)(2,3). После лечения стрептокиназой, рт-АП или АПСАК у пациентов с острым инфарктом миокарда наблюдалось снижение размера области инфаркта, сохранение функции желудочков и снижение смертности (2). Одним из тромболитических средств, используемых в настоящее время для терапии,является стрептокиназа, белок с Мr 45000, секретируемый -гемолитическими стрептококками. Ее введение, однако, связано с интенсивным разрушением системного фибриногена, и ее эффективность в отношении коронарного тромболиза у больных при остром инфаркте миокарда ограничена при достижении примерно 50 процентной реканализации коронарных артерий в течение 90 мин (2). Кроме того, введение 2 стрептокиназы вызывает аллергические реакции у примерно 5 процентов лечившихся пациентов и соответственно вызывает образование специфических антител, что исключает ее повторное применение в течение месяцев или лет (4). Стафилокиназа - белок, продуцируемый некоторыми штаммами Staphylococcus aureus,который обладает профибринолитическими свойствами, что было показано более 4 десятков лет назад (5-7), также, по-видимому, представляет сильное тромболитическое средство у больных с острым инфарктом миокарда (8). Ген стафилокиназы был клонирован из бактериофагов sakC (9) и sak42D (10), a также из геномной ДНК (sakSTAR) лизогенного штамма Staphylococcus aureus (11). Он был экспрессирован под контролем промотора PR и его собственных трансляционных сигналов в Escherichia coli, а также под контролем его естественного промотора и трансляционных сигналов в Bacillus subtilis или Escherichia coli, что приводило к накоплению продукта гена в периплазматическом пространстве или в культуральной среде, соответственно (10-13). Стафилокиназный ген кодирует белок из 163 аминокислот с аминокислотой 28, соответствующей NН 2-концевому остатку зрелой стафилокиназы полной длины (10, 14, 15). Белковая последовательность варианта дикого типа SakSTAR (15) представлена на фиг.1. В кодирующих участках генов sakC, sak42D и sakSTAR было обнаружено различие лишь четырех нуклеотидов, один из которых создавал молчащую мутацию (10, 14, 15). Было выделено и очищено несколько молекулярных разновидностей стафилокиназы с немного различными Мr (16500-18000 по электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия - ДСН-ЭПАГ) и изоэлектрическими точками (11-13). Были получены производные зрелой стафилокиназы с более низкими Мr с отсутствием 6 (Sak-6) или 10 (Sak-10)NН 2-концевых аминокислот. При взаимодействии с плазмином (плазминогеном) в буферной среде зрелая стафилокиназа (с NН 2-концом SerSer-Ser) быстро и количественно превращается вSak- 10 (NH2-конец Lys-Gly-Asp-). Зрелая стафилокиназа и Sak-10, как было показано, обладают одинаковой фибринолитической активностью (11,12). Аминокислота в положении 26, повидимому, имеет решающее значение для активации плазминогена стафилокиназой. Действительно, замена единственного остатка Met в положении 26 или Arg или Val приводит к потере функциональной активности, тогда как заменаLeu или Cys имеет слабое влияние на активность или совсем не влияет на нее. Так как ни одна из замен единственной аминокислоты не вызывает значительных изменений структуры мутантных белков в растворе, механизм этого 3 дифференцирующего поведения остается неизвестным. В среде плазмы стафилокиназа способна растворять фибриновые сгустки без разрушения связанного фибриногена (17-19). Эта фибриноспецифичность стафилокиназы является результатом сниженного подавления 2 антиплазмином плазмин-стафилокиназного комплекса, связанного с фибрином, рециркуляции стафилокиназы от плазминстафилокиназного комплекса после подавления 2-антиплазмином и предотвращения превращения циркулирующей плазминогенстафилокиназы в плазмин-стафилокиназу 2 антиплазмином (20-22). На нескольких экспериментальных моделях животных стафилокиназа, по-видимому, проявляет одинаковую активность со стрептокиназой в отношении растворения сгустков цельной крови или плазмы, но значительно более активна в отношении растворения богатых тромбоцитами или сжатых тромбов(23, 24). Обнадеживающие результаты, полученные со стафилокиназой на моделях тромбоза на животных сформировали основу для ее оценки в масштабе предварительного испытания у больных с острым инфарктом миокарда (3, 25). У 4 из 5 больных с острым инфарктом миокарда 10 мг рекомбинантной стафилокиназы (SakSTAR),введенные внутривенно в течение 30 мин, как было обнаружено, вызывают ангиографически подтвержденную реканализацию коронарных артерий в течение 40 мин. На уровни фибриногена плазмы и 2-антиплазмина воздействия не оказывалось (остаточные уровни через 40 мин равнялись 90-95% от исходного), и аллергические реакции не наблюдались (3). Во второй группе из 5 больных с острой окклюзией (закупоркой) коронарных артерий внутривенное введение 10 мг стафилокиназы (SakSTAR) в течение 30 мин приводило к реканализации у всех больных в течение 20 мин без деградации связанного фибриногена (25). Контрольная ангиография через 24 ч показала, что реканализация оставалась. Иммуногенность стафилокиназы (SakSTAR) в сравнении со стрептокиназой изучали на собаках (23) и бабуинах (24). В целом эти данные, полученные на экспериментальных животных, свидетельствуют о более низкой иммуногенности стафилокиназы по сравнению со стрептокиназой. Однако, у первых 5 пациентов с острым инфарктом миокарда, получивших внутривенное вливание 10 мг стафилокиназы в течение 30 мин, титры нейтрализующих антител к стафилокиназе (SakSTAR) были низкими на исходный момент и до 6 дней после вливания,но высокие титры (титры нейтрализующих стафилокиназу антител, равные 12-42 мкг/мл плазмы) постоянно обнаруживались в плазме через 14-35 дней (3). Эти наблюдения были полно 000121 4 стью подтверждены во втором предварительном испытании у 5 пациентов (25). Так, что касается иммуногенности, первоначальные наблюдения на людях не были такими обнадеживающими,как данные, полученные на экспериментальных животных. Таким образом, подобно стрептокиназе, применение стафилокиназы должно быть ограничено единственным введением. Однако,отсутствие перекрестной реактивности индуцированных антител к стафилокиназе и стрептокиназе (26, 27) приводит к мысли, что введение обоих веществ не будет взаимоисключаемым. Иммуногенность, присущая стрептокиназе и стафилокиназе явно препятствует их неограниченному использованию. Не только больные с предшествующими высокими титрами антител будут невосприимчивы к тромболитическому действию этих веществ, но могут появляться побочные аллергические эффекты и в редких случаях угрожающая жизни анафилаксия (28). Поскольку как стрептокиназа, так и стафилокиназа являются гетерологичными белками, не очевидно, что их иммуногенность могла бы быть снижена инженерией белков. Действительно, не сообщалось об успешных попытках создания активных фрагментов с низким молекулярным весом из стрептокиназы. У стафилокиназы делеция NH2-концевых 17 аминокислот или СООН-концевых 2 аминокислот инактивирует молекулу, которая, кроме того, очень чувствительна к инактивации с помощью сайт-специфичного мутагенеза (25, 29). Тем не менее, мы неожиданно обнаружили, что вариант стафилокиназы дикого типа(SakSTAR) (8, 15) содержит три неперекрывающихся иммунодоминантных эпитопа, по крайней мере, два из которых могут быть элиминированы с помощью специфичного сайтнаправленного мутагенеза без инактивации молекулы. Эти сконструированные варианты стафилокиназы являются менее реактивными с антителами, выявляемыми у больных, лечившихся стафилокиназой дикого типа, и значительно менее иммуногенны, чем стафилокиназа дикого типа, что показано на моделях на кроликах и бабуинах и у больных с закупоркой периферических артерий. Данное изобретение, таким образом, относится к производным стафилокиназы, проявляющим сниженную иммуногенность по сравнению со стафилокиназой дикого типа. Эти производные имеют по существу аминокислотную последовательность стафилокиназы дикого типа или ее модифицированные версии, но, по крайней мере, один иммунодоминантный эпитоп элиминирован без нарушения биологической активности производных. В одном осуществлении этого изобретения производные имеют по существу аминокислотную последовательность, которая изображена на фиг.1, на которой одна или более аминокислот в одном или более подчеркнутых кластеров имеют замену другой 5 аминокислотой, таким образом, изменяя соответствующий(е) эпитоп(ы). Предпочтительно,аминокислоты заменяются аланином. С помощью изменения эпитопа(ов) реактивность производных с панелью моноклональных антител к одному или более из трех эпитопных кластеров 1, II и III снижена. Это показывает, что с помощью замены аминокислот дикого типа аланином антигенность стафилокиназы снижается. Это изобретение, в частности, относится к производному стафилокиназы М 8, имеющему аминокислотную последовательность, которая представлена на фиг.1, в которой аминокислотыLys в положении 74, Glu в положении 75 и Arg в положении 77 в подчеркнутом кластере 8 были заменены аланином, изменяя таким образом соответствующий эпитоп, производному стафилокиназы М 3, имеющему аминокислотную последовательность, которая изображена на фиг.1,в которой аминокислоты Lys в положении 35 иGlu в положении 38 в подчеркнутом кластере 3 были заменены аланином, изменяя таким образом соответствующий эпитоп, производному стафилокиназы М 9, имеющему аминокислотную последовательность, которая представлена на фиг.1, в которой аминокислоты Glu в положении 80 и Asp в положении 82 в подчеркнутом кластере 9 были заменены аланином, изменяя таким образом соответствующий эпитоп, производному стафилокиназы М 3, 8, имеющему аминокислотную последовательность,которая представлена на фиг.1, в которой аминокислотыLys в положении 35, Glu в положении 38, Lys в положении 74, Glu в положении 75 и Arg в положении 77 в подчеркнутых кластерах 3 и 8 были заменены аланином, изменяя таким образом соответствующие эпитопы, и к производному стафилокиназы М 8, 9, имеющему аминокислотную последовательность, которая изображена на фиг.1, в которой аминокислоты Lys в положении 74, Glu в положении 75 и А в положении 77,Glu в положении 80 и А в положении 82 в подчеркнутых кластерах 8 и 9 были заменены аланином, изменяя таким образом соответствующие эпитопы. Таким образом М 3,8 и М 8,9 являются двойными мутантами, имеющими два разрушенных эпитопа. Это изобретение демонстрирует, что сконструированные варианты стафилокиназы со сниженной иммуногенностью могут быть практичными, альтернативными стрептокиназе или стафилокиназе дикого типа тромболитическими препаратами. Это изобретение также относится к способу продукции производных этого изобретения путем получения фрагмента ДНК, содержащего,по крайней мере, часть кодирующей последовательности стафилокиназы, которая обеспечивает ее биологическую активность; осуществления invitro сайт-направленного мутагенеза в фрагменте ДНК для замены одного или более кодонов для аминокислот дикого типа кодоном для дру 000121 6 гой аминокислоты; клонирования фрагмента мутантной ДНК в подходящий вектор; трансформации или трансфекции подходящей клетки-хозяина этим вектором; и культивирования клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии фрагмента ДНК. Предпочтительно,фрагмент ДНК является фрагментом EcoriHindIII из 453 п.о. из плазмиды pMEX602SAK,сайт-направленный мутагенез выполняется с помощью системы олигонуклеотиднаправленного мутагенеза с использованием плазмиды рМа/с и дефицитного по репарации штамма E.Cоli WK6Muts, и фрагмент мутантной ДНК клонируется в E.Coli, штамм WK6. Это изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим, по крайней мере, одно из производных стафилокиназы по этому изобретению вместе с подходящим носителем для лечения артериального тромбоза. Фармацевтические композиции, содержащие менее иммуногенные варианты стафилокиназы в качестве активного ингредиента,для лечения тромбоза артерий у людей или в ветеринарной практике могут иметь форму порошков или растворов и могут применяться для внутривенного или внутриартериального введения. Такие композиции могут быть изготовлены путем объединения (например, смешивания,растворения и т.д.) активного вещества с фармацевтически приемлемыми наполнителями нейтрального характера (такими как водные или неводные растворители, стабилизаторы, эмульгаторы, детергенты и добавки), и кроме того,если необходимо, красителями. Концентрация активного ингредиента в терапевтической композиции может широко меняться в интервале от 0,1 до 100%, в зависимости от характера заболевания и способа введения. К тому же доза активного ингредиента, которую нужно применить, может изменяться в пределах от 0,05 до 1,0 мг на кг веса тела. Кроме того, это изобретение относится к способу применения производных стафилокиназы для лечения тромбоза артерий, в частности инфаркта миокарда, и использования производных стафилокиназы для изготовления фармацевтической композиции для лечения тромбоза артерий, в частности инфаркта миокарда. Выше и далее термины "производные","мутанты" и "варианты" используются, заменяя друг друга. Данное изобретение будет показано более детально в последующих примерах, которые,однако не предназначены для ограничения объема изобретения. Для опытного специалиста будут очевидны несколько вариантов и усовершенствований на основе данного изобретения. Таким образом, случайный мутагенез, начиная с комбинационного мутанта 3,8 и с комбинационного мутанта 8,9 должен дать альтернативные мутанты со сниженной иммуногенностью и,возможно, повышенной функциональной актив 7 ностью, тогда как альтернативный мутагенез в эпитоп-нейтрализующих кластерах будет давать другие варианты со сниженной иммуногенностью. Пример 1. Картирование эпитопа стафилокиназы дикого типа. Эпитопную специфичность панели из 17 мышиных моноклональных антител, индуцированных стафилокиназой дикого типа (вариантSakSTAR), определяли путем анализа биоспецифического взаимодействия в реальное время(Pharmacia, Biosensor АВ, Uppsala, Sweden). Моноклональные антитела к SakSTAR продуцировались с помощью метода Galfre и Milstein (30). Мышей BALB/c иммунизировали путем подкожной инъекции 10 мкг SakSTAR в полном адъюванте Фрейнда, за которой через две недели следовало внутрибрюшинное введение 10 мкг SakSTAR в полном адъюванте Фрейнда. После промежутка, равного, по крайней мере, 6 неделям, мыши получали внутрибрюшинно повторную инъекцию 10 мкг SakSTAR в физиологическом растворе на 4 день и за два дня до слияния клеток. Клетки селезенки выделяли и производили слияние с клетками миеломыFazekas de St. Groth and Scheidegger (31). После селекции в гипоксантин-аминоптеринтимидиновой среде супернатанты отбирали по продукции специфических антител с помощью односайтового неконкурентного микро-ELISA с использованием микротитровальных плат, покрытых стафилокиназой. Связанные иммуноглобулины определяли с помощью кроличьего противомышиного IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (32). Положительные клоны использовали для продукции асцитной жидкости у примированных пристаном мышейBALB/c (33). Фракцию IgG моноклональных антител очищали от асцитной жидкости с помощью аффинной хроматографии на протеин Асефарозе (34). Эта техника анализа биоспецифического взаимодействия, основанная на поверхностном плазмоновом резонансе (ППР) дает возможность прямого измерения взаимодействия в реальный срок без использования меток (35). Стафилокиназа была иммобилизирована на поверхности сенсорного чипа - Sensor Chip СМ 5 с использованием набора для связывания аминовAmine Couplinq kit (Pharmacia Biosensor AB),как рекомендовано производителем. Эта процедура связывает первичные аминогруппы в лиганд к карбоксиметилированной декстрановой поверхности сенсорного чипа (36). Иммобилизацию выполняли из растворов белка с концентрацией 10 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия с рН 5,0 при потоке со скоростью 5 мкл/мин в течение 6 мин. Это приводит к ковалентному связыванию 1000-1500 РЕ (резонансных единиц) ста 000121 8 филокиназных частей (соответствующих примерно 0,07 пмоль/мм 2 (37). Второй взаимодействующий компонент (анализируемое вещество т.е. моноклональные антитела) вводили в раствор над сенсором. Концентрация свободного анализируемого вещества поддерживалась постоянной по непрерывному потоку раствора при 20 С по поверхности сенсора. Вводили, по крайней мере, четыре концентрации каждого анализируемого вещества (в интервале 0-400 нм или 0-50 мкМ) в 10 мМ HEPES, 3,4 мМ ЭДТК,0,15 М NaCl и 0,005% сурфактанте Р 20, рН 7,2 при скорости потока, равной 5 мкл/мин в фазе связывания. Затем образец заменяли буфером также при скорости потока, равной 5 мкл/мин в течение от 6 до 30 мин. После каждого цикла поверхность сенсорного чипа регенерировали с помощью введения 5 мкл 15 мМ НСl. Константы скорости связывания (kacc) и диссоциации(kдисс) выводили из сенсограмм, как подробно описано в другом месте (38). Константы равновесного связывания (Кс), рассчитанные как отношение kасс и kдисс, для связывания стафилокиназы дикого типа на панели из 17 изучаемых моноклональных антител изменялись в интервале между 0,6 и 25 х 109 М-1 (среднее значение 1010 М-1) (табл.1). В табл.1 колонка, обозначенная "ID" вмещает различные стафилокиназные производные. Обозначения "17G11", "26 А 2" и т.д. относятся к моноклональным антителам, связывающимся с указанными эпитопными кластерами 1, II и III. В колонке "вариант" показаны мутантные аминокислоты и их положение в однобуквенном коде для аминокислот. Эпитопный кластер 1 распознается антителами 17 П 11, 26 А 2, 30 А 2,2 В 12 и 3G10, тогда как эпитопный кластер П распознается антителами 29 С 1, 18F12, 14 Н 5,28 Н 4, 20D6, 32 В 2 и 7F10 и эпитопный кластер Ш - антителами 7 Н 11, 25 Е 1, 40 С 8, 24 С 4 и 1 А 10. Моноклональные антитела, направленные против отдельных эпитопов, будут связываться независимо одно от другого, тогда как моноклональные антитела, направленные против близкородственных эпитопов, будут взаимодействовать каждый с местом связывания другого. Поэтому эпитопная специфичность панели моноклональных антител наиболее легко определяется путем определения способности пары моноклональных антител одновременно связываться с антигеном. Анализ биоспецифического взаимодействия в реальное время (АБВ=ВIА) может использоваться для измерения конкурентного связывания пар моноклональных антител со стафилокиназой, связанной с поверхностью сенсорного чипа. Анализ проводили, как описано в Application Note 101 (Pharmacia Biosensor AB). Испытания парного связывания разделили 17 моноклональных антител на 3 группы, представляющие 3 неперекрывающиеся эпитопа на антигене, как показано на фиг.2. Не 9 зависимость этих эпитопов была подтверждена прямой демонстрацией дополнительного связывания моноклональных антител 26 А 2, 28 Н 4 и 24 С 4. Антитела объединяли по их эпитопной специфичности, что показано в табл.1. Пример 2. Конструирование и эпитопное картирование вариантов стафилокиназы "заряженный-кластер-для-аланина" (charged-clusterto-alanine"). При тщательном изучении "заряженныйкластер-для-аланина" намечали кластеры гидрофильных заряженных аминокислот. Стафилокиназа (SakSTAR) содержит 45 заряженных аминокислот (2 His, 14 Glu, 8 Asp, 1 Arg и Lys). Эти заряженные остатки подвергали мутагенезу на А 1 а в кластерах из двух или трех аминокислот, что суммировано на фиг.1. Всего был создан 21 мутант, в которых подчеркнутые заряженные аминокислоты были заменены аланином. Аминокислоты, которые должны быть заменены аланином, показаны с помощью небольшой вертикальной линии в кластере. Мутанты получали путем сайтнаправленного мутагенеза и экспрессировали вE.coli, что детально показано ниже. Ферменты рестрикции были закуплены у PharmaciaUppsala, Sweden or Boehrinqer Mannheim (Mannheim, Germany). ДНК-лигаза T4, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli и щелочная фосфатаза были получены от Boehringer Mannheim. Система олигонуклеотид-направленного мутагенеза и плазмиды рМА/с были любезно предоставлены Corvas (Ghent, Belgium) (39). Вектор экспрессии pMEX602SakB был любезно предоставлен Институтом молекулярной биотехнологии, Йена, Германия (25). Хелперный фаг М 123 К 07 был закуплен у Promega (Лейден, Нидерланды). Бульонная ростовая среда Луриа была закуплена у Life Technologies (Merelbeke,Belgium). Плазминоген выделяли и очищали из человеческой плазмы, как описано ранее (40). Ферментативные реакции выполняли, используя условия, предлагаемые поставщиками. Плазмидную ДНК выделяли, используя методику очистки QIAGEN (предоставленную Westburg, Leusden, Нидерланды). ТрансформациюE.coli выполняли с применением кальцийфосфатной методики. Секвенирование ДНК выполняли, используя метод реакции терминации дидезокси-цепи и автоматического лазерного флюоресцентного A.L.F.TM (Pharmacia). Сайтнаправленный мутагенез для мутантов D5, К 6(М 20) до К 86, Е 88, (М 10) производился с использованием рМа/с, с применением дефицитного по репарации штамма E.coli WK6Muts. Размножение плазмид рМа/с или производных,получение однонитевой ДНК и экспрессию производили в E.coli WK6 (39). Мутанты D93,К 94 (M11) по К 134, К 135, К 136 (М 19) были сконструированы в Институте молекулярной биотехнологии, Йена, Германия, как описано ранее (16). Хромогенный субстрат (S2403) L 000121 10 пироглютамил-L-фенилаланин-L-лизин-п-нитроаналин гидрохлорид был закуплен у Chromogenix. Фибриноген, меченный 125I, был закуплен в Amersham. Фрагмент EcoRI-HindIII из 453 пар оснований, содержащий всю кодирующую область дляpMEX602SakB (устойчивость к ампициллину) и клонировали в сайты EcoRI-HindIII плазмиды рМс 5-8 (устойчивость к хлорамфениколу), получая pMc-STAR. Для сайт-направленного мутагенеза in vitro однонитевую ДНК этой конструкции получали путем трансформации конструкции pMc-STAR в E.coli и введения в ночную культуру хелперного фага М 13 КO7. Через четыре часа после инъекции клетки отделяли от среды с помощью преципитации ПЭГ и экстракцией фенолом-хлороформом. Затем однонитевую pMc-STAR гибридизовали с однонитевой рМа (EcoRI-HindIII) векторной ДНК и соответствующим синтетическим олигонуклеотидом из 28-44 оснований с молчащей мутацией, создающей или делетирующей рестрикционный сайт. Реакции удлинения проводили с фрагментом Кленова ДНК-полимеразы, как описано. После трансформации E.coli WK6Muts и селекции на ампициллиновую рецистентность колонии подращивали на нитроцеллюлозных мембранах, денатурировали in situ и ДНК гибридизовали в течение ночи при комнатной температуре с использованием соответствующих радиоактивно меченных олигонуклеотидов (1,5 х 108 имп/мин (32 Р)-АТФ, использованной для мечения полинуклеотидкиназой Т 4 20-30 нг олигонуклеотида). Фильтры промывали при 42 С,используя растворы, содержащие 0,1% ДСН и 2xSSC, 1xSSC, 0,2xSSC, 0,1xSSC. Плазмидную ДНК экстрагировали из 10 мл бактериальных культур, полученных из каждого положительного клона и анализировали путем расщепления ферментом рестрикции. Желательные мутации подтверждали путем секвенирования полной кодирующей последовательности с использованием A.L.F.TM. Мутированный фрагмент HindIII-EcoRI затем лигировали обратно в вектор экспрессии(39). Мутантные белки продуцировались внутриклеточно и в растворимой форме в клеткахE.coli WK6, трансформированных этим вектором. Мутанты выделяли и очищали из разрушенных ультразвуком бактериальных экстрактов с использованием катионообменной и с гиброфобным взаимодействием хроматографии(25). Мутанты SakSTAR были получены с выходом в интервале от 10 до 80 мг/л, представляющим выделение от 15 до 88% исходного материала. Очищенный материал был чистым,что показано с помощью электрофореза на нередуцированных 10-15% градиентных гелях (не 11 показано). Анализ NН 2-концевых аминокислот подтверждал последовательность Ser-Ser-SerPhe-Asp зрелой стафилокиназы. Более подробные биохимические характеристики этих стафилокиназных мутантов сообщались ранее (41). Концентрации белка определяли по Bradford (42). Фибринолитическую активность растворов SakSTAR определяли с помощью исследования с хромогенным субстратом, проводимым в микротитровальных платах с использованием смеси из 80 мкл раствора SakSTAR и 100 мкл раствора Glu-плазминогена (концевая концентрация 0,5 мМ). После инкубации в течение 30 мин при 37 С генерированный плазмиз определяли количественно путем добавления 30 мкл S2403 (конечная концентрация 1 мкМ) и измерения поглощения при 405 нм. Активность выражали в условных единицах (УЕ) путем сравнения с местным стандартом (сер. STAN5),который устанавливал активность, равную 100000 УЕ на мг белка, что определялось по составу аминокислот (11). ДСН-ЭПАГ выполняли с помощью Phast SystemTM (Pharmacia,Uppsala, Sweden), используя 10-15% градиентные гели и окрашивание бриллиантовым синимCoomassie. Восстановление образцов производили путем нагревания при 100 С в течение 3 мин в присутствии 1% ДСН и 1% дитиоэритритола. Конструирование, продукцию и очистку мутантов М 3,8 и М 8,9 проводили, как описано детально ниже. Олигонуклеотиды, использованные для конструирования,5'ATAGCAATGCATTTCCTGCACTATCAAC-3'(М 8) и 5'TTTGCGCTTGGCGCCAATGCAACTACTCTAAACTCTTTATAT-3' (М 9) были синтезированы на заказ в Pharmacia Biotech. При конструировании мутанта М 3,8 использовали однонитевые pMc-STAR и фрагментEcoRI-HindIII рМа 5-8 для получения содержащей пробелы дуплексной молекулы ДНК, которую гибридизовали с синтетическим олигонуклеотидом М 3 из 28 оснований (содержащим сайт рестрикции NsiI). Реакции удлинения проводили с помощью фрагмента Кленова ДНКполимеразы и лигазы, как описано. После переноса E.coli WK6MutS и селекции на среде с ампициллином 81 колонию подращивали на нитроцеллюлозных мембранах, денатурировали insitu, и ДНК гибридизовали в течение ночи при комнатной температуре с использованием радиоактивно-меченного олигонуклеотида М 3(1,5 х 108 имп/мин (32 Р)-АТФ на мечение полинуклеотидкиназой Т 4 20-30 нг олигонуклеотида). Фильтры промывали при 42 С, используя растворы, содержащие 0,1% ДСН и 2xSSC, 1 хSSC, 0,2xSSC, 0,lxSSC. ДНК из 1 отобранного клона из 16 положительных получали из 150 мл бактериальных культур и анализировали с помощью расщепления рестрикционными фер 000121 12 ментами NsiI и Pvul. Мутацию М 3 (pMa-STAR3) подтверждали путем секвенирования полной кодирующей области с использованиемA.L.F.TM. Однонитевую ДНК получали путем трансформации pMa-STAR3 в E.coli, как описано выше. Однонитевую pMa-STAR3 гибридизовали с pMc (EcoRI-HindIII) и с синтетическим олигонуклеотидом М 8 из 40 оснований, который содержит сайт рестрикции NdeI, как описано выше. После трансформации E.coli WKMutS и селекции на среде с хлорамфениколом подращивали 100 колоний на нитроцеллюлозных мембранах и гибридизовали с меченным олигонуклеотидом М 8 .Подращивали положительные клоны (2 из 7) и анализировали с помощью расщепления рестрикционным ферментом (NsiIHindIII и NdeI), что давало один положительный клон. Двойной мутант М 3,8 затем лигировали обратно в вектор экспрессии pMEX602SakB. Из 12 минипрепаратов ДНК 6 имели правильную рестрикционную карту. Один из этих клонов(pMEXSakSTAR.M38) секвенировали и использовали для получения мутанта М 3,8 под контролем индуцируемого ИПТГ tac промотора и двух последовательностей Шайна-Дальгарно (ShineDalgarno), расположенными одна за другой. 10 мкл суспензии клеток E.coli WK6,трансформированные с помощью рекомбинантной плазмиды pMEXSakSTAR.M38, инкубировали в 100 мл среды LB (Gibco/BRL), содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Смесь инкубировали в течение ночи при 37 С с перемешиванием при 200 об/мин, что давало в результате плотность клеток, равную примерно 5 единицам поглощения при 600 нм. Аликвоты в 20 мл переносили в 2 л объемы (в 5 л колбах) среды LB,содержащей 100 мкл/мл ампициллина. Смеси инкубировали в течение 3 ч при 37 С при перемешивании перед добавлением 200 мкМ ИПТГ для индукции экспрессии М 3,8, которой давали развиваться в течение 4 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин, ресуспендировали в 1/10 объема 0,01 М фосфатного буфера, рН 6,5, и разрушали ультразвуком при 0 С. Остатки клеток удаляли центрифугированием в течение 30 мин при 20000 об/мин, и супернатант хранили при 20 С до использования. У объединенных просветленных клеточных лизатов (2-х литровые объемы) из 20-30 литровых бактериальных культур рН доводили до 5,9, их стерилизовали фильтрованием через 0,22 мкм фильтр Сарториуса и наносили на 5 х 25 см колонку сефарозы, предварительно обработанную 0,5 М NaOH и стерильным 0,01 М фосфатным буфером, при скорости потока, равной 12 мл/мин и при 4 С в ламинарном потоке. Колонку промывали 2-3 л буфера и элюировали с помощью градиента соли от 0 до 1 М свыше 500 мл и от 1 М до 2 М свыше 250 мл при скорости потока, равной 10 мл/мин и при 4 С. Содержа 13 щие М 3.8 фракции, локализованные с помощью электрофореза в геле с ДСН, объединяли (примерно 200 мл) и диализировали против 15 л стерильного 0,01 М фосфатного буфера, рН 8,0 при 4 С. Прошедший диализ материал центрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 мин, снова стерилизовали фильтрацией и наносили на колонку 2,5 х 12 см Q-сефарозы с быстрым током,предварительно обработанную 0,5 М NaOH и стерильным 0,01 М фосфатным буфером, рН 8,0, при скорости потока, равной 3 мл/мин при 4 С. Колонку промывали примерно 600 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 8,0, при скорости потока, равной 8 мл/мин, и элюировали раствором соли с градиентом концентрации от 0 до 0,17 М свыше 30 мл, от 0,17 до 0,2 М свыше 100 мл и от 0,2 М до 1,5 М свыше 200 мл, при скорости потока, равной 4 мл/мин. Фракции, содержащие М 3.8, локализованные с помощью электрофореза в геле с ДСН, объединяли, концентрацию белка доводили до 1 мг/мл и материал стерилизовали путем фильтрации через 0,22 мкм-фильтр Миллипор. Три препарата М 3.8 давали 8025 мг чистого белка (среднее СО) со специфической активностью,равной 450005200 УЕ/мг. При конструировании мутанта М 8.9 для получения содержащей пробелы дуплексной молекулы ДНК использовали однонитевую рМс-STAR и фрагмент EcoRI-HindIII рМа 5-8,которые гибридизовали с синтетическим олигонуклеотидом М 9 из 42 оснований, содержащим сайт рестрикции NarI. Реакции удлинения проводили с помощью фрагмента Кленова ДНКполимеразы и лигазы, как описано. После трансформации E.coli WK6MutS и селекции на среде с ампициллином колонии подращивали на нитроцеллюлозных мембранах, денатурировалиin situ и ДНК гибридизовали в течение ночи при комнатной температуре с использованием радиоактивно меченного олигонуклеотида (1,5 х 108 имп/мин (32 Р)-АТФ на мечение полинуклеотидкиназой Т 4 20-30 нг олигонуклеотида). Фильтры промывали при 42 С, используя растворы, содержащие 0,1% ДСН и 2 х SSC, 1 хSSC, 0,2 х SSC, 0,1 х SSC, Получали ДНК из 2 отобранных клонов из 4 положительных и 1 из них охарактеризовывали с помощью анализа нуклеотидной последовательности с использованием A.L.F.TM. Вставку EcoRI-HindIII из pMaSTAR9 затем лигировали обратно в вектор экспрессии pMEX602SakB. Клоны (58) сортировали путем гибридизации in situ с радиоактивно меченным олигонуклеотидом М 9 в качестве пробы. Один клон pMEXSakSTAR.M9 охарактеризовывали с помощью анализа нуклеотидной последовательности и затем использовали для конструирования мутанта М 8.9. Чтобы сконструировать М 8.9 в М 9 вводили мутацию 8 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводили в общем объе 000121 14 ме, равном 100 мкл с использованием 5 ед. фермента и 1 мкг каждого из следующих праймеров: олигонуклеотидаII=5'-CAGGAAACAGAATTCAGGAG , олигонуклеотида III=5'TATATAATATTCGACATAGTATTCAАТТТТТ 3',олигонуклеотида,IV=5'-TATCCCGGGCATTAGATGCGAGATGCGACAGCATATGCAGCGTTTGCAGTA-3', и олигонуклеотида y=5'CAAAACAGCCAA-GCTTCATTCATTCAGC-3'. Концентрации dATP, dCTP, dGTP и dTTP составляли 200 мкМ. Денатурацию проводили в течение 1 мин при 94 С, с ренатурацией в течение 2 мин при 55 С и удлинением в течение 1,5 мин при 72 С. После 30 циклов образцы инкубировали в течение 10 мин при 72 С и охлаждали до 4 С. В первой реакции ПЦР 2 нг pMEXSakSTAR. М 9 амплифицировали с использованием олигонуклеотидов IV и V в качестве праймеров. Ампликон ПЦР расщепляли с помощьюSmaI и HindIII и очищали после электрофореза в 1,5% агарозном геле при использовании набораPrep-A-qene: (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA,USA) .Полученный в результате фрагмент клонировали в сайты SmaI-HindIII pUC18 (Pharmacia BioTech, Uppsala, Sweden) с использованием набора для быстрого лигирования ДНК (Boerinqer Mannheim). После трансформации в клеткиE.coli WK6, получали ДНК из 12 колоний, и все 12 генерировали фрагмент из примерно 230 пар оснований при расщеплении EcoRI и HindIII. Одну из этих ДНК (pUC18-M89) использовали для клонирования второго продукта ПЦР (смотри ниже). Вторую реакцию ПЦР выполняли на 2 нг pMEXSakSTAR.M9 с использованием олигонуклеотидов II и III в качестве праймеров. Продукт реакции ПЦР расщепляли с помощью SspI и EcoRI и дополнительно очищали, как описано выше. Полученный в результате фрагмент лигировали в сайты SmaI-EcoRI pUC18-M89. После трансформации в клетки E.coli WK6 отбирали 6 клонов для получения ДНК. Пять из 6 генерировали фрагмент из примерно 453 пар оснований после расщепления с помощью EcoRI и HindIII. Этот фрагмент, кодирующий весь мутант М 8,9,клонировали в сайты EcoRI-HindIII вектора экспрессии рМЕХ 602-SakB. После трансформации клеток E.coli WK6 ДНК из 6 колоний анализировали с помощью расщепления EcoRI и HindIII, дающего фрагмент из примерно 453 пар оснований во всех случаях. Одну из этих ДНК,кроме того, охарактеризовывали путем анализа нуклеотидной последовательности. В 100 мл среды LB (GIBCO/BRL), содержащей 100 мкг/мл ампициллина засевали 100 мкл суспензии клеток E.coli WK6, трансформированных рекомбинантной плазмидой pMEXSakSTAR.M89. Культуру инкубировали в течение ночи при 37 С с перемешиванием при 140 об/мин до плотности клеток, равной примерно 5 единицам поглощения при 600 нм. Аликвоты по 4 мл использовали для инокуляции 2-литровых"Terrific Broth", содержащей 150 мкл/мл ампициллина. Культуры инкубировали в течение примерно 20 ч при 30 С и при 140 об/мин, получая в результате конечную плотность клеток,равную примерно 4109 клеток/мл. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин, ресуспендировали в 1/5 объема 0,01 М фосфатного буфера, рН 6,5 и разрушали ультразвуком при 0 С. Затем рН доводили до 5,8 и остатки клеток удаляли 30-минутным центрифугированием при 20000 об/мин. Супернатант хранили при -20 С до дальнейшей обработки. В объединенном просветленном лизате клеток (1800 мл) рН доводили до 5,8 и наносили его на колонку 2,5 х 20 см из SP-сефарозы, предварительно обработанной 0,5 М NaOH и свежим буфером из 0,01 М фосфата, 2,5 М NaCl, рН 7,5 при скорости потока, равной 2 мл/мин при 4 С. Колонку промывали 500 мкл буфера и элюировали градиентом соли от 0 до 1 М свыше 200 мл при скорости потока, равной 6 мл/мин. Объединенные фракции М 8,9, идентифицированные с помощью электрофореза с ДСН, доводили до 2,5 М твердым NaCl и подвергали хроматографии гидрофобного взаимодействия на колонке 2,5 х 20 см фенил-сефароза, предварительно обработанной 0,5 М NaOH и свежим буфером из 0,01 М фосфата, 2,5 М NaCl с рН 7,5 при скорости потока, равной 2 мл/мин и 4 С. Колонку промывали примерно 500 мл буфера и элюировали 0,01 М фосфатным буфером, рН 6,5. Фракции, содержащие М 8.9, локализованные с помощью электрофореза в геле с ДСН, объединяли и подвергали диализу в 2 л 0,01 М фосфатного буфера, рН 9,0. Диализированный материал центрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 мин и наносили на 1,6 х 5 см колонку Qсефарозы с быстрым потоком, предварительно обработанную 0,5 М NaOH и свежим 0,01 М фосфатным буфером, рН 9,0, при скорости потока, равной 2 мл/мин и 4 С. Колонку промывали примерно 150 мл 0,01 М фосфатного буфера,рН 9,0, и элюировали градиентным раствором соли от 0 до 1 М NaCl свыше 100 мл при скорости потока, равной 4 мл/мин. Колонку промывали примерно 150 мл 0,01 М фосфатного буфера,рН 9,0, и элюировали градиентом соли от 0 до 1 М NaCl свыше 100 мл при скорости потока,равной 4 мл/мин. Содержащие М 8.9 фракции,локализованные с помощью электрофореза на геле с ДСН, объединяли и концентрацию белка доводили до 1 мг/мл, и материал стерилизовали фильтрованием через 0,22 мкМ фильтр Миллипор. Эти препараты М 8.9 давали 7317 мг чистого белка со специфической активностью, равной 510003500 УЕ/мг. Результаты по фибринолитической активности различных мутантов SakSTAR, опреде 000121 16 ленной с помощью исследования с хромогенным субстратом, обобщены в табл. 1. Из 21 мутанта, сконструированного как показано на фиг.1, E99, Е 100 (M13) и E99, Е 100,E102 (M14) можно было получить в очищенной форме, тогда как K11, D13, D14 (М 1), Е 46, Л 50(М 4) и Е 65, D69 (М 7) были неактивными. Шестнадцать мутантов, сведенных в табл.1, были изучены детально вместе с SakSTAR дикого типа. Из этих мутантов D5, К 6 (М 20), К 8, К 10(М 21), D33, К 35 (М 2), К 57, Е 58, К 59 (М 5), Е 61,Е 65 (М 6), К 86, Е 88 (M10), D93, К 94 (M11), К 96,К 97, К 98 (М 12), Е 108, К 109 (М 15), D115, Е 118,Н 119 (М 16), Н 119, К 121 (М 17), К 130 (М 18) и Е 134, К 135, К 136 (М 19) реагировали с панелью моноклональных антител также, как и SakSTAR. Однако К 35, Е 38 (М 3) и Е 80, D82 (М 9) слабо реагировали с антительными кластерами 7 Н 11,25 Е 1, 40 С 8, тогда как К 74, Е 75, R77 (М 8) слабо реагировали кластером 26 А 2, 3 ОА 2, 2 В 12 и 3G10. Аддитивность элиминации эпитопа была установлена с мутантами К 35, Е 38/К 74, Е 75,R77 (М 3,8) и К 74, Е 75, R77/E80, D82 (М 8,9),которые сочетали сниженную реактивность с моноклональными антителами обеих родительских молекул. Пример 3. Адсорбция с вариантами антител к стафилокиназе дикого типа и "заряженный-кластер-на-аланин", выявленных у больных при лечении SakSTAR. Чтобы получить информацию по эпитопной специфичности индуцированных антител,выявленных у больных с острым инфарктом миокарда после лечения SafcSTAR, образцы плазмы от 16 больных абсорбировали с помощью молярного избытка (над нейтрализующей активностью стафилокиназы) одного или сочетанных мутантов "заряженный-кластер-дляаланина" в течение 10 мин перед определением остаточного связывания с SakSTAR с помощью анализа биоспецифического взаимодействия. Нейтрализующая активность стафилокиназы у этих образцов определяли следующим образом. Повышенные концентрации варианта дикого типа или SakSTAR (объемы 50 мкл, содержащие 0,2-1000 мкг/мл) добавляли к смеси 300 мкл цитратной человеческой плазмы и 50 мкл буфера или испытуемой плазмы, сразу после этого добавляли 100 мкл смеси, содержащей тромбин(50 NIH ед/мл) и СаС 12 (25 мМ). Время лизиса сгустков плазмы измеряли и наносили на график зависимости от концентрации SakSTAR составляющей. По этой кривой определяли концентрацию активатора плазминогена, которая вызывала полный лизис сгустка через 20 мин. Титр нейтрализующей активности определяли как разницу между значениями для испытуемой плазмы и буфера и выражали в мкг на мл испытуемой плазмы. Результаты суммированы в табл.2. В то время как SakSTAR дикого типа абсорбировал более 90 процентов связывающих антител из 17 всех образцов, с мутантом К 35, Е 38 (М 3) у 4 больных, с мутантом К 74, Е 75, R77 (М 8) у 12 больных и с мутантом Е 80, D82 (М 9) у 5 больных наблюдалась неполная абсорбция. Абсорбция с сочетанными мутантами К 35, Е 38/К 74,Е 75, R77 (М 3, 8) и К 74, Е 75, R77/E80, D82(среднее значение из 68 и 65 процентов, соответственно, от 16 больных), тогда как ожидалось, смесь исходных молекул сочетанных мутантов (М 8 и М 3 или М 9) постоянно абсорбировали свыше 90 процентов антител. Пример 4. Иммуногенность вариантов стафилокиназы "заряженный-кластер-на аланин" у кроликов, иммунизированных стафилокиназой (SakSTAR) дикого типа, мутантами К 35, Е 3.8 (М 3), К 74, Е 75, R77 (М 8) и Е 80, D82(М 9) и сочетанными мутантами К 35, Е 38/К 74,Е 75, R77(M3.8) и К 74, Е 75, R77/Е 80, Д 82,(М 8.9). Сравнительную иммуногенность SakSTAR по отношению к каждому из вариантов SakSTAR, М 3, М 8, М 9, М 3.8 и М 8.9, изучали после иммунизации подкожным введением в группах из 4 или 8 кроликов, предназначенных для введения SakSTAR, и в группах из 8 кроликов,предназначенных для введения определенного варианта. Иммунизацию проводили путем внутривенного вливания 400 мкг/кг SakSTAR и 2001000 мкг/кг мутантов в неделю 0 (для определения исходной способности лизиса сгустков) с последующей подкожной инъекцией 400 мкг того же самого вещества в полном адъюванте Фрейнда на 2-й неделе и в неполном адъюванте Фрейнда на 3 и 5 неделе. Иммуногенность оценивали количественно через 6 недель путем определения активности, нейтрализующей стафилокиназу, в плазме и остаточной тромболитической способности, как описано детально ниже. Вкратце, активность по нейтрализации стафилокиназы в плазме определяли путем добавления повышенных концентраций SakSTAR дикого типа или мутанта SakSTAR (50 мкл объемы, содержащие 0,2-1000 мкг/мл) к смеси 300 мкл цитратной человеческой плазмы и 50 мкл буфера или кроличьей плазмы с немедленным последующим добавлением 100 мкл смеси, содержащей тромбин (50 NIH ед/мл) и СаС 12 (25 мМ). Определяли время лизиса сгустка плазмы и наносили его на график зависимости от концентрации SakSTAR или варианта. По этой кривой определяли концентрацию активатора плазминогена, которая давала полный лизис сгустка через 20 мин. Титр нейтрализующей активности определяли как различие между значениями для кроличьей плазмы и для буфера и выражали в мкг на мл кроличьей плазмы. Тромболитические свойства изучали, используя 0,3 мл сгустка кроличьей плазмы, обедненной тромбоцитами, меченные 125I-фибрином,помещенные в экстракорпоральные артериовенозные петли. Выделенную бедренную артерию 18 для этого катетеризовали катетером Френча 4(Portex White, Portex, Hythe, UK) и соединяли через два подкожных шприца с катетеризованной ушной веной. Поток крови через экстракорпоральную петлю поддерживали на уровне 10 млн/мин с помощью перистальтического насоса. Сгустки плазмы с меченным 125I-фибрином вводили в каждый из двух шприцов, вставленных в петлю. Сгустки плазмы получали путем смешивания 0,3 мл бедной тромбоцитами плазмы с небольшим количеством (примерно 1,5 мкКю) раствора меченного 125I-человеческого фибриногена (Amersham, Buckinghamshire, UK) и 0,5 М СаСl2 с последующей инкубацией в течение 30 мин при 37 С. За тридцать минут до начала инфузии вводили 7,5 мг/кг ридогреля (сочетанные ингибитор тромбоксансинтазы и антагонист простагландин-эндопероксидных рецепторов)(43) в виде быстрой внутривенной инъекции для предупреждения осаждения тромбоцитов в экстракорпоральной петле. Животным для антикоагуляции вводили гепарин (300 ед/кг с последующим непрерывным вливанием 200 ед/кг/ч во время эксперимента) и распределяли по случайной выборке на вливание 400 мкг/кг SakSTAR(4-8 кроликов) или на вливание 200-1000 мкг/кг варианта SakSTAR(8 кроликов). Через 6 недель половине кроликов, предназначенных для варианта SakSTAR, снова вводили тот же самый вариант SakSTAR, а другой половине вводилиSakSTAR дикого типа, кроме того, кроликам,иммунизированным SakSTAR, вводили или вариант SakSTAR (если эта контрольная группа состояла из 4 кроликов) или по случайной выборке - SakSTAR дикого типа или вариант SakSTAR (если эта контрольная группа состояла из 8 кроликов). Тромболитические средства вводили внутривенно в виде ударного 10 или 90%ного вливания в течение 1 ч. Ход со временем лизиса сгустка контролировали непрерывно путем внешней оценки гамма-излучения с использованием двух 3 х 0,5 дюймовых кристаллов иодида натрия/таллия (Bicron, Newbury, ОН), помещенных над экстракорпоральными петлями. Сцинтилляционные кристаллы соединяли с приспособленной системой Canberra-S100 (Canberra-Packard, Meriden, СТ) и данные были проанализированы, как описано ранее (44). В конце эксперимента остаточные сгустки также удалялись из шприцов для определения содержания в них радиоизотопа. Эксперименты на животных проводили в согласии с руководящими принципами Американского физиологического общества и Международного комитета по тромбозу и гемостазу (45). Иммуногенность SakSTAR и соответствующих одиночных мутантов (М 3, М 8 и М 9) сравнивается в табл.3 А. Результаты выражены как среднее значение СКО. У 8 кроликов случай выбранных для мутанта М 3 исходная нейтрализующая активность составляла 0,00,0 мкг/мл как в отношении Sak 19STAR, так и М 3. Внутривенное вливание 200 мкг/кг М 3 вызывало 7623-процентный лизис сгустка. Эти 8 кроликов затем иммунизировали М 3, суспендированным в 500 мкл полного адъюванта Фрейнда через 2 недели и в 500 мкл неполного адъюванта Фрейнда через 3 и 5 недель. Через 6 недель нейтрализующая активность плазмы увеличивалась до 116,7 мкг/мл в отношении SakSTAR и до 117,2 мкг/мл в отношении М 3. Через 6 недель вливание 400 мкг SakSTAR у 4 из этих кроликов, выбранных случайным образом, вызывало 1827-процентный лизис сгустков, тогда как вливание 200 мкг/кг М 3 у 4 других кроликов вызывало 1617 процентный лизис. У 4 кроликов, предназначенных для введения SakSTAR, исходная нейтрализующая активность составила 0,20,2 мкг/мл в отношении SakSTAR и 0,00,0 мкг/мл в отношении М 3. Внутривенное вливание 400 мкг/кг SakSTAR продуцировало 898,6 процентный исходный лизис. Этих четырех кроликов затем иммунизировали 400 мкг SakSTAR, суспендированными в или 500 мкг полного (на второй неделе) или неполного (на 3 и 5 неделе) адъюванта Фрейнда. На 6 неделе нейтрализующая активность плазмы увеличивалась до 3523 мкг/мл в отношении SakSTAR и до 1913 мкг/мл в отношении М 3. Внутривенное вливание 200 мкг/кг SakSTAR. М 3 у этих кроликов на 6 неделе индуцировало 9,38,2 процентный лизис. У 8 кроликов, предназначенных для мутанта М 8, исходная нейтрализующая активность в плазме составляла 1,40,2 мкг/мл в отношенииSakSTAR и 0,60,5 мкг/мл в отношении М 8. Внутривенное вливание 1000 мкг/мл М 8 продуцировало 4113-процентный лизис. Этих кроликов иммунизировали 400 мкг М 8, суспендированного в полном адъюванте Фрейнда на 2 неделе и тем же самым количеством в неполном адъюванте Фрейнда на 3 и 5 неделе. На 6 неделе нейтрализующая активность плазмы повышалась до 3,81,8 мкг/мл в отношении SakSTAR и до 5,92,7 мкг/мл в отношении М 8. Вливание 400 мкг/кг SakSTAR у 4 из этих кроликов давало 4928-процентный лизис, тогда как вливание 1000 мкг/кг М 8 у 4 других кроликов продуцировало 2411-процентный лизис. У 8 кроликов,предназначенных для группы SakSTAR, исходная нейтрализующая активность в плазме составляла 0,90,6 мкг/мл в отношении SakSTAR и 0,60,3 мкг/мл в отношении М 8. Внутривенное вливание 400 мкг/кг SakSTAR продуцировало 6818-процентный лизис. Этих кроликов затем иммунизировали подкожно 400 мкг SakSTAR, суспендированного в полном адъюванте Фрейнда на 2 неделе и тем же самым количеством в неполном адъюванте Фрейнда на 3 и 5 неделе. На 6 неделе нейтрализующая активность плазмы увеличивалась до 5947 мкг/мл в отношении SakSTAR и до 2216 мкг/мл в отношении М 8, тогда как остаточная тромболитиче 000121 20 ская способность 400 мкг/кг SakSTAR снижалась до 7,52,4 процентов и 1000 мкг/кг М 8 - до 4,14,8 процентов. У 8 кроликов, предназначенных для мутанта М 9, исходная нейтрализующая активность в плазме составляла 0,20,05 мкг/мл по отношению к SakSTAR и 0,030,05 мкг/мл в отношении М 9. Внутривенное вливание 400 мкг/кг М 9 продуцировало 7211 процентный лизис сгустка. Этих кроликов затем иммунизировали 400 мкг М 9, суспендированными в полном адъюванте Фрейнда на второй неделе и тем же количеством в неполном адъюванте Фрейнда на 3 и 5 неделе. На 6 неделе нейтрализующая активность плазмы повышалась до 8,04,6 мкг/мл в отношении SakSTAR и до 3,52,6 мкг/мл в отношении М 9. На 6 неделе вливание 400 мкг/кгSakSTAR у 4 этих кроликов продуцировало 5311-процентный лизис сгустков, тогда как вливание 400 мкг/кг М 9 у 4 других кроликов давало 407,8-процентный лизис. У 4 контрольных кроликов, предназначенных для SakSTAR,исходная нейтрализующая активность плазмы составпяла 0,10,05 мкг/мл в отношении SakSTAR и 0,050,06 мкг/мл в отношении М 9. Внутривенное вливание 400 мкг/кг SakSTAR давало 7813-процентный лизис. Этих кроликов затем иммунизировали 400 мг SakSTAR, суспендированными в полном (2 неделя) и неполном (3 и 5 неделя) адъюванте Фрейнда, соответственно. На 6 неделе нейтрализующая активность в плазме повышалась до 165,0 мкг/мл в отношении SakSTAR и до 129,1 мкг/мл в отношении М 9, тогда как тромболитическая способность М 9 снижалась до 2433 процентов. Иммуногенность SakSTAR по сравнению с двойными мутантами М 3.8 и М 8.9 сравнивается в табл.3 В. У 8 кроликов, предназначенных для группы М 3.8, исходная нейтрализующая активность в плазме составляла 0,60,3 мкг/мл в отношении SakSTAR и 3,52,0 мкг/мл в отношении М 3.8. Внутривенное вливание 1000 мкг/кг М 3.8 продуцировало 5313-процентный лизис. Этих кроликов затем иммунизировали 400 мкг М 3.8, суспендированными в полном адъюванте Фрейнда, на 2 неделе и тем же самым количеством в неполном адъюванте Фрейнда на 3 и 5 неделе. На 6 неделе нейтрализующая активность плазмы повышалась только до 1,70,7 мг/мл в отношении SakSTAR и до 6,13,0 мкг/мл в отношении М 3.8. Вливание 400 мкг/кгSakSTAR у 4 из этих кроликов продуцировало 7718-процентный лизис сгустка, тогда как вливание 1000 мг/кг М 3.8 у 4 других кроликов давало 5925-процентный лизис. У 8 кроликов,предназначенных для группы SakSTAR, исходная нейтрализующая активность в плазме составляла 0,60,4 мкг/мл в отношении SakSTAR и 2,02,0 мкг/мл в отношении М 3.8. Внутривенное вливание 400 мкг/мл SakSTAR продуцировало 8010-процентный лизис. Этих кроликов затем иммунизировали подкожно 400 мкг Sak 21STAR, суспендированными в полном адъюванте Фрейнда, на 2 неделе и тем же самым количеством в неполном адъюванте Фрейнда на 3 и 5 неделе. На 6 неделе нейтрализующая активность в плазме увеличивалась до 2015 мкг/мл в отношении SakSTAR и до 2122 мкг/мл в отношении М 3.8, тогда как остаточная тромболитическая способность 400 мкг/кг SakSTAR снижалась до 8,55,7 процентов, а 1000 мкг/кг М 3.8 до 3029 процентов. У 8 кроликов, предназначенных для группы М 8.9, исходная нейтрализующая активность в плазме составляла 0,30,2 мкг/мл в отношенииSakSTAR и 1,60,5 мкг/мл в отношении М 8.9. Внутривенное вливание 800 мкг/кг М 8.9 продуцировало 3913-процентный лизис сгустка в исходный момент. Этих 8 кроликов затем иммунизировали 400 мкг М 8.9, суспендированными в полном (2 неделя) или в неполном (недели 3 и 5) адъюванте Фрейнда. Через 6 недель нейтрализующая активность плазмы увеличивалась только до 2,51,5 мкг/мл в отношении SakSTAR и до 4,91,3 мкг/мл в отношении М 8.9. На 6 неделе вливание 400 мкг/кг SakSTAR у 4 из этих кроликов продуцировало 5135-процентный лизис сгустка, в то время как вливание 800 мкг/кг М 8.9 и у других кроликов давало 3912 процентный лизис. У 4 контрольных кроликов,предназначенных для SakSTAR, нейтрализующая активность до введения препаратов была равна 0,20,1 мкг/мл в отношении SakSTAR и 0,70,3 мкг/л в отношении М 8.9.Внутривенное вливание 400 мкг/кг SakSTAR , вызывало 6719-процентный лизис сгустка. Этих 4 кроликов затем иммунизировали 400 мкг SakSTAR ,суспендированными в полном (неделя 2) или неполном (недели 3 и 5) адъюванте Фрейнда. На 6 неделе нейтрализующая активность в плазме повышалась до 2015 мкг/мл в отношении SakSTAR и до 1815 мкг/мл в отношении М 8.9,тогда как остаточное тромболитическое действие М 8.9 снижалось только до 3130 процентного лизиса. Эти результаты показывают, что в этом прямом сравнительном исследовании SakSTAR и выбранных вариантах особенно двойные мутанты (М 3.8 и М 8.9) индуцируют значительно меньшую нейтрализующую активность, связанную с антителами, и устойчивость к лизису, чемSakSTAR и М 3.8 у бабуинов. Сравнительную иммуногенность SakSTAR и М 3.8 в отношении индукции нейтрализующих антител и рефрактерности к тромболизу при повторном введении изучали на бабуинах. Эксперименты на животных выполняли в соответствии с руководящими принципами Американского физиологического общества и Международного комитета по тромбозам и гемостазу (45). У анестезированных и интубированных бабуинов создавали экстракорпора 000121 22 льный артериовенозный кровоток путем соединения через внешнюю полиэтиленовую петлю катетеризованной большеберцовой или плечевой артерии с периферической веной. Перистальтический насос направлял и поддерживал непрерывно контролируемый поток крови через экстракорпоральную петлю, в которой были вставлены два приспособленных шприца для подкожного введения, каждый из которых содержал один свежий 0,3 мл сгусток общей плазмы бабуинов с меченным 125I фибрином. Ход лизиса сгустка во время вливания SakSTAR или варианта М 3.8 непрерывно контролировали путем внешнего измерения гамма-излучения над шприцами. В качестве альтернативы подсчитывали баланс определения изотопа путем сравнения суммы подсчета радиоактивности во всей крови в конце эксперимента (умноженной на фактор 3 для коррекции на экстраваскулярное распределение) плюс радиоактивность в возвращенных тромбах, вместе с той, которая первоначально присутствовала в сгустках. Перед каждым экспериментом тромболиза бабуинам предварительно вводили внутривенно ударную дозу ридогреля 3 мг/кг для предотвращения оседания тромбоцитов в экстракорпоральной системе. В течение экспериментов тромболиза внутривенно вводили гепарин в виде ударной дозы 300 МЕ/кг с последующим вливанием 200 МЕ/кг/ч. Двенадцать взрослых самцов-бабуинов(Papio Hamadryas) по случайной выборке в начале эксперимента (неделя 0) распределяли на введение 50 мкг/кг или SakSTAR (группа 1) или варианта М 3.8 (группа 2), вливаемых внутривенно в течение одного часа путем 10% ударной дозы, и исходную тромболитическую способность оценивали путем слежения за исчезновением радиоактивности из сгустков в течение 2 ч. Затем бабуинов иммунизировали подкожным введением 500 мкг или SakSTAR (группа 1), или варианта М 3.8 (группа 2), суспендированных в полном адъюванте Фрейнда, через 2 недели и в неполном адъюванте Фрейнда через 3 и 5 недель. Через 6 недель тромболитическое действие оценивали количественно с помощью модели экстракорпорального тромболиза в течение 4 ч: по случайной выборке отбирали 3 из 6 бабуинов из группы 1, которым вводили в начале эксперимента SakSTAR, а затем их им иммунизировали, и 3 из 6 бабуинов из группы 2, которым в начале эксперимента вводили М 3.8 и которых затем им иммунизировали, и вводили им сначала 50 мкг/кг SakSTAR путем внутривенного вливания в течение одного часа одной ударной 10% инъекции, а затем через 2 ч от начала вливания SakSTAR давали M3.8 в том же режиме(группы 1 А и 2 А, соответственно). Другие 6 бабуинов получали те же препараты, но в обратном порядке: сначала M3.8, затем SakSTAR(группы 1 В и 2 В для бабуинов, предварительно иммунизированных SakSTAR и M3.8, соответ 23 ственно). Через 18 недель тромболитическую активность оценивали в третий раз путем контроля исчезновения радиоактивности из фибриновых сгустков в течение 3 ч: 3 из 6 бабуинов,иммунизированных SakSTAR, вводили 250 мкг/кг SakSTAR в виде внутривенной ударной инъекции в течение 2,5 мин (группа 1 А), в то время как 3 другие бабуина, иммунизированныеSakSTAR, получали то же самое количествоM3.8 (группа 1 В). Из 6 бабуинов, иммунизированных M3.8, 3 получали внутривенную ударную инъекцию 250 мкг/кг SakSTAR (группа 2 А) и 3 то же самое количество M3.8 (группа 2 В). Образцы крови собирали в цитратные пробирки (конечная концентрация 0,01 М) в начале исследования и через определенные промежутки времени потом для измерения активированного парциального тромбопластинового (аПТВ),определения фибриногена, 2-антиплазмина (в начале и конце каждого эксперимента) и активности по нейтрализации SakSTAR и M3.8 (перед тромболитическим вливанием). Для этого к смеси 300 мкл цитратной человеческой плазмы и 50 мкл буфера или испытуемой плазмы бабуинов добавляли повышающиеся количества или 2 антиплазмина или M3.8 (50 мкл объемы, содержащие от 0,2 до 1000 мкг/мл) непосредственно после добавления 100 мкл смеси тромбина (50NIH Ед/мл) и СаСl2 (25 мМ). Время лизиса сгустка плазмы измеряли и наносили на график зависимости от концентрации SakSTAR илиM3.8. По этой кривой определяли концентрацию активатора плазминогена, которая давала полный лизис сгустка через 20 мин. Нейтрализующую активность определяли как разницу между значениями для испытуемой плазмы и для буфера и выражали в мкг/мл плазмы. Системный фибриноген не разрушался,как и не истощался 2-антиплазмин, что отражало общую фибриноспецифичность обоих препаратов. По истечении 6 недель нейтрализующая активность в отношении SakSTAR у группы 1 была значительно выше, чем нейтрализующая активность в отношении М 3.8 в группе 2. В группе 1 нейтрализующая активность развивалась быстрее и значительно заметнее в отношении SakSTAR, чем в отношении М 3.8, тогда как активность нейтрализации М 3.8 никогда не превосходила активность нейтрализации SakSTAR в группе 2 (табл.4). По истечении 8 недель в группе 1 развивалась значительно большая нейтрализующая активность как в отношении SakSTAR, так и в отношении М 3.8, чем в группе 2(табл.4). В начале исследования 50 мкг/кг SakSTAR,вливаемые внутривенно в течение 1 ч, индуцировали 772,9%-ный лизис сгустка через 2 ч у 6 бабуинов (группа 1) и 50 мкг/кг М 3.8, индуцировали 833,6% лизис сгустка через 2 ч у 6 других бабуинов (группа 2) (среднее СКО), р=0,2. 24 Через 6 недель лизирующее действие 50 мкг/кгSakSTAR, впиваемых внутривенно в течение 1 ч, через 2 ч снижалась до 9,21,0% у 3 бабуинов, иммунизированных SakSTAR (группа 1 А) и до 8,53,2% у 3 бабуинов, иммунизированных М 3.8 (группа 2 А), в то время как эффективность лизиса 50 мкг/кг М 3.8, введенных внутривенно в течение 2 ч, снижалась до 106,9% у трех бабуинов, иммунизированных SakSTAR (группа 1 В) и до 117,4% у трех бабуинов, иммунизированных М 3.8 (группа 2 В); р 0,001 при сравнении с соответствующим исходным лизисом для всех групп; р=НС между группами). Через 2 ч после начала первого тромболитического вливания внутривенно вливали 50 мкг/кг другого вещества в течение 1 ч с получением сравнительной остаточной эффективности лизиса: 7,71,5%-ный и 115,7%-ный лизис сгустка в течение 2 ч с помощью М 3.8 в группах 1 А и 2 А,соответственно, и 132,7% и 122,1%-ый лизис сгустка через 2 ч с помощью SakSTAR в группах 1 В и 2 В, соответственно. Через 18 недель внутривенное введение ударной дозы 250 мкг/кг SakSTAR давало 395,3%-ный лизис сгустка через 3 ч у 3 бабуинов, иммунизированных SakSTAR (группа 1 А),тогда как остаточная тромболитическая способность 250 мкг/кг М 3.8 у 3 бабуинов, иммунизированных М 3.8 (группа 2 В) была значительно больше: 684,5%-ный лизис сгустка в течение 3 ч (р 0,005)."%) мкг/кг SakSTAR продуцировали 589,5%-ный лизис сгустка через 3 ч у 3 бабуинов, иммунизированных М 3.8 (группа 2 А; р=0,1 при сравнении с группой 1 А), в то время как лизис сгустка через 3 ч с помощью 250 мкг/кг М 3.8 у 3 бабуинов, иммунизированных SakSTAR (группа 1 В), составлял 393,6% (р=0,0005 при сравнении с группой 2 В). Общий анализ,независимо от вещества, вводимого через 18 недель, продемонстрировал остаточный лизис через 3 ч, равный 393,0% для группы 1, иммунизированной SakSTAR, по сравнению с 635,2% для группы 2, иммунизированной М 3.8(р 0,0005). Тромболитическая способность коррелировала обратно пропорционально с соответствующей нейтрализующей активностью в течение периода изучения (Spearman r=-0,83; р 0,0001). Таким образом, мутант М 3.8 является сравнительно активным и фибриноспецифичным, но значительно менее антигенен, чем SakSTAR дикого типа у бабуинов, о чем свидетельствует меньшая индукция нейтрализующей активности в плазме и более быстрое восстановление тромболитической способности после иммунизации. Эти результаты, полученные на аутбредных приматах, подтверждают и расширяют вышеприведенные наблюдения на кроликах. Пример 6. Сравнительная тромболитическая эффективность и иммуногенность М 3.8 иSakSTAR (n=3), М 3.8 (n=4) и М 8.9 (n=4) вводили внутриартериально у или в проксимальный конец закупоривающего тромба в виде ударной дозы в 2 мг с последующим вливанием 1 мг в час у больных с ангиографически подтвержденной артериальной окклюзией периферической артерии или обходного сосудистого шунта. Пациентов включали в исследование после получения согласия после полной информации и методика утверждалась Комитетом по исследованиям на людях университета г.Лувен. Критерии включения или исключения были по существу такими же, как и описанные ранее(46), за исключением того, что допускалось повторное введение части рекомбинантной стафилокиназы в течение 48 ч. Сочетанное антитромбозное лечение гепарином, аспирином и пероральными антикоагулянтами было таким же,как описано ранее (46). Состояние открытости окклюзированных периферических артерий или обходного сосудистого шунта периодически исследовали перед,по крайней мере, каждые 4 ч во время и в конце внутриартериального вливания SakSTAR дикого типа или модификация SakSTAR. Состояние ангиографической проходимости целевого сосуда в конце вливания составляло конец основного изучения. Введение тромболитического средства прерывалось, когда достигалось соответствующее открытие сосудов, когда осложнения требовали его прекращения, или когда две последовательные ангиограммы не демонстрировали прогресса в лизисе сгустка. Восстановление просвета определялось, как лизис сгустка,достаточный для восстановления активного прямого потока через ранее окклюзированный сегмент. Были допустимы дополнительные внутрисосудистые вмешательства, такие как подкожная чрезпросветная ангиопластика(РТА=ПТА), когда исследователи считали, что тромб был достаточно лизирован или что дополнительного лизиса тромба не ожидается. Давление крови и пульс контролировали до, во время и после вливания SakSTAR, М 3.8 и М 8.9. Образцы крови отбирали до, в конце и через 6 ч после ангиографического обследования. Исследования включали анализ крови, определение протромбинового времени (ПВ),аПТВ,определение фибриногена,2 антиплазмина, плазминогена и биохимическую оценку функции печени и функции почек. Активность по нейтрализации SakSTAR, М 3.8 и М 8.9 и анти-SakSTAR, анти-М 3.8 и анти-М 8.9IgG и IgM периодически определяли в образцах крови, взятых во время госпитализации и после выписки. Клиническое наблюдение было сосредоточено на рецидиве тромбоза и на побочном действии, таком как аллергические реакции и большое кровотечение (т.е. необходимость переливания крови или хирургического вмеша 000121SakSTAR дикого типа, развилась анафилактоидная реакция в течение 5 мин после введения ударной дозы в 2 мг. Вливание было немедленно прекращено, и давление вернулось к норме в течение 20 мин во время вливания плазмозаменителей. Этот больной не был включен в подсчет средних значений СКО в табл.57. У одного больного (LAN),получавшего М 8.9,развилась повторная окклюзия через 30 ч, что лечили 6,5 мг модифицированного варианта. У этого больного развилась нейтрализующая активность в отношении 7,8 мкг/мл М 8.9 и концентрация 270 мкг/мл специфических анти-М 8.9IgG через 2-3 недели. Значения исходных показателей отдельных больных представлены в табл.5. Большинство ОПА были на бедренноподколенном уровне. Все случаи были связаны с тромбозом in situ. В исследование были включены два случая обходного сосудистого шунта и 2 подвздошных артерии со стентом. Представлены девять больных с нетрудоспособностью, связанной с перемежающейся хромотой, и 2 с хронической ишемической остаточной болью, 4 с подострой и 1 с острой ишемией. В табл.6 обобщены индивидуальные результаты лечения и его исход. Внутриартериальное вливание в дозе 5,5-13 мг в течение 3,511 ч, вызывало полное восстановление просвета у 13 больных, частичное восстановление просвета у 1 пациента и не дало улучшения у 1 больного. Дополнительные внутрисосудистые вмешательства (в основном ПТА) выполнялись у 12 и дополнительное хирургическое вмешательство сразу же после лизиса тромбов у 1 пациента. Рецидив тромбоза после окончания ангиографической процедуры произошел у 4 больных: первый больной был успешно снова излечен после 30 ч введения 6,5 мг М 8.9, второй подвергся аортоподвздошному обходному анастомозу, у третьего больного просвет сосуда успешно восстановлен после 20 ч введения 40 мг rt-PA и у четвертого больного тромб аспирировали через просвет. Осложнения в виде кровоизлияний отсутствовали или ограничивались слабым или умеренным образованием гематом в местах пункции для ангиографии, за исключением одного больного, у которого появилась гематома в правой квадрицепсной мышце. Другие осложнения, относящиеся к внутрисосудистым вмешательствам, включали дистальную эмболизацию и рассечение артерии,которое требовало преждевременного прекращения вливания тромболитиков у одного больного. Одна неглубокая окклюзия бедренной ар 27 терии, как показано, была устойчива к действию 8,0 мг SakSTAR, вливаемой в течение 6,0 ч и с ней впоследствии успешно справились путем ПТА (табл.6). Уровни фибриногена, плазминогена и 2 антиплазмина в кровотоке оставались неизменными во время вливания заместителей SakSTAR(табл.7), что отражало абсолютную фибриноспецифичность этих веществ в использованной дозировке. Существенное расщепление фибринаin vivo, проявлялось в виде явного повышения уровней D-димеров. Внутриартериальная гепариновая терапия продолжала аПТТ (табл.7). Нейтрализующая активность в отношенииSakSTAR, М 3.8 и М 8.9, связанная с антителами и анти-SakSTAR -, анти-М 3.8- и анти-М 8.9 специфическим IgG была низкой в начале терапии и в течение первой недели после вливания(табл.8). Со второй недели уровни нейтрализующей активности повышались до средних значений, равных 2,9 и 3,3 мкг модификацийSakSTAR (р=0,03 для модификаций при сравнении с диким типом по критерию суммы ранговMann-Whitney). Уровни SakSTAR-специфического IgG, повышались до средних значений,равных 51 и 31 мкг/ мл плазмы у больных, которых лечили М 3.8 и М 8.9, соответственно, что значительно ниже, чем среднее значение, равное 240 мкг/ мл, у больных, которых лечили SakSTAR (р=0,01 для модификаций при сравнении с диким типом по критерию суммы ранговMann-Whit-nеу. Таким образом, у больных с периферической артериальной окклюзией, которые получали дозы, равные 5,5-13 мг соединения, М 3.8 и М 8.9, индуцировали значительно меньше нейтрализующих антител и специфического антистафилокиназного IgG, чем SakSTAR Эти модификации обеспечили доказательство концепции о том, что снижение гуморального ответа к рекомбинантной стафилокиназе путем конструирования белков осуществимо. На чертежах показано: на фиг.1. - белковая последовательность стафилокиназы дикого типа, SakSTAR. Нумерация начинается с NH2-концевой аминокислоты зрелой стафилокиназы полной длины. Показаны модификации "заряженный-кластер-на-аланин",которые были изучены; на фиг.2 - схематическое изображение эпитопной специфичности панели из 17 мышиных моноклональных антител, индуцированных SakSTAR. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Производные стафилокиназы, имеющие аминокислотную последовательность, пред 000121 28 ставленную на фиг.1, в которой одна или более аминокислот в одном или более подчеркнутых кластеров заменены другой аминокислотой. 2. Производные стафилокиназы по п.1,имеющие аминокислотную последовательность,представленную на фиг.1, в которой одна или более аминокислот заменены аланином со снижением таким образом реактивности этих производных с панелью моноклональных антител,состоящей, например, из антител 17G11, 26A2,30 А 2, 2 В 12 и 3G10, направленных к эпитопному кластеру 1. 3. Производные стафилокиназы по п.1,имеющие аминокислотную последовательность,представленную на фиг.1, в которой одна или более аминокислот заменены аланином со снижением таким образом реактивности этих производных с панелью моноклональных антител,состоящей, например, из антител 7 Н 11, 25 Е 1.,40C8, 24 С 4 и 1 А 10, направленных к эпитопному кластеру III. 4. Производные стафилокиназы по п.1,имеющие аминокислотную последовательность,представленную на фиг.1, в которой одна или более аминокислот заменены аланином со снижением таким образом, реактивности этого производного с панелями моноклональных антител, направленных к эпитопным кластерам I иArg в положении 77 в подчеркнутом кластере 8 заменены аланином с изменением таким образом соответствующего эпитопа. 6. Производное стафилокиназы МЗ,имеющее аминокислотную последовательность,лредставленную на фиг.1, в которой аминокислоты Lys в положении 35 и Glu в положении 38 в подчеркнутом кластере 3 заменены аланином с изменением таким образом, соответствующего эпитопа. 7. Производное стафилокиназы М 9,имеющее аминокислотную последовательность,представленную на фиг.1, в которой аминокислоты Glu в положении 80 и Asp в положении 82 в подчеркнутом кластере заменены аланином. 8. Производное стафилокиназы М 3,8,имеющее аминокислотную последовательность,которая представлена на фиг.1, в которой аминокислоты Lys в положении 35 и Glu в положении 38, Lys в положении 74, Glu в положении 75 и Arg в положении 77 в подчеркнутых кластерах 3 и 8 заменены аланином. 9. Производное стафилокиназы М 8,9. имеющее аминокислотную последовательность,которая представлена на фиг.1, в которой аминокислоты Lys в положении 74, Glu в положении 75, Arg в положении 77, Glu в положении 80 и Asp в положении 82 в подчеркнутых кластерах 8 и 9 заменены аланином. 30 выполняется с помощью системы олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием плазмиды рМА/с и дефицитного по репарации штамма E.coli WK6MutS, и осуществление экспрессии мутантного фpaгмeнта ДНК при культивировании в Е.со 1i, штамм WK6. 12. Фармацевтическая композиция, состоящая из производных стафилокиназы по любому одному из пп.1-9 и фармацевтически приемлемого наполнителя. 13. Применение фармацевтической композиции по п.2 для лечения тромбоза артерий. 14. Применение производных стафилокиназы по любому из пп.1-9 при лечении тромбоза артерий. 15. Применение производных стафилокиназы по любому из пп.1-9 для получения фармацевтической композиции для лечения тромбоза артерий. 10. Способ получения производных стафилокиназы по любому одному их пп.1-9, включающий получение фрагмента ДНК, включающего, по крайней мере, часть кодирующей последовательности стафилокиназы,которая обеспечивает ее биологическую активность,осуществление in vitro сайт-направленного мутагенеза фрагмента ДНК для замены одного или более кодонов аминокислот дикого типа кодоном другой аминокислоты, клонирование мутантного фрагмента ДНК в подходящий вектор,трансформацию или трансфекцию подходящей клетки-хозяина указанным вектором и культивирование клетки-хозяина в условиях,обеспечивающих экспрессию фрагмента ДНК. 11. Способ по п.10, в котором фрагмент ДНК представляет собой EcoRI-HindIII фрагмент из 453 пар оснований плазмиды Таблица 1: Константы равновесной ассоциации (КАх 109 м-1) для связывания мышиных моноклональных антител со стафилокиназой дикого типа и мутантами "заряженныый-кластер-на-аланин" Эпитопный кластер 1 17 Таблица 2. Абсорбция антител, вызванных лечением стафилокиназой дикого типа (SakSTAR ) у больных с острым инфарктом миокарда, со стафилокиназой дикого типа и модификациями "заряженный-кластер-на-аланин" Код 682 6720 65 Сред 3726 951 95 90 712 83128 0 72 93 1 68 нее 34 96 КО Сред нее Абсорбция 90 процентов представлена как +. Эпитопные кластеры те же, что представленные в таблице I. Таблица -3 А. Иммуногенность SakSTAR, M3, М 8 и М 9 у кроликовC.SakSTAR в сравнении с М 9 имму- Нейтрализующая активность (мкг/мл) низирую щий препара т Результаты представлены средними значениями КО от числа экспериментов, данного в скобках Статистическое значение различий определялось по т-тесту Стьюдента для парных или непарных значений или по критерию суммы рангов Манн-Уитни, в зависимости от применимости. Данные представляют средние значенияКО от числа экспериментов, данного в скобках Статистическое значение различий определялось по т-тесту Стьюдента для парных и непарных значений или по критерию суммы рангов Манн-Уитни, в зависимости от применимости. Таблица 4. Изменение со временем активности нейтрализации SakSTAR и М 3,8 (в мкг/мл) ВведениеSakSTAR Активность 0.00.0 б.73.3 4.52.4 8.83.2 196.0 227.1 9.01.2 7.30.5 6.22.2 4.80.7 2.81.7 нейтрализующая М 3,8 Р 0.3 0.1 0.06 0.6 0.3 0.003 0.2 0.008 0.6 0.05 Данные представлены средним значением 4: СКО по группе из 6 бабуинов. Для расчета значений р использовали парный т-тест Стьюдента. Смотрите таблицу 1 для более детального представления о графике иммунизации. в/в - внутривенно; п/к - подкожно. Таблица 5: Характеристики больных с окклюзией периферических артерий, лечившихся М 3,8, М 3,9 или SakSTAR. Соеди- Пол Воз- Клиническая Относящийся к делу Курение Место нение раст картина анамнез окклюКод. хромота Перемежающаяся хромота Перемежающаяся заболевание каро- тидной артерии Трансплантация почки Аорто-бибедренный + хромота Ишемическая трансплантат; боль покоя ампутация переднего отдела стопы Правая 40 средняя ПБА 25 Левая средняя ПБА Правая 7 ПБА артерии Левый под- + коленноподколенный Перемежаю- трансплантат Ин+ щаяся фаркт миокарда; стентирование хромота По- правой общей поддострая ише- вздошной артерии Гиперлипидэмия; мия гипертензия; ИБС; умеренная почечная недостаточность Подострая ишемия(стент) Трансплантат ПА Правый ОПА Правый 1 бедренноподколенный 60 трансплантат Правая средняя ПБА хромота Перемежающаяся хромота Подострая ишемия Перемежающаяся трансплантат. Аневризма правой ЛА Гиперлипидэмия хромота По- Аденокарпинома дострая ише- простаты мия Перемежаю- Гипертанзия, гищаяся перлипидэмия Правая (21) средняя ПБА Правая 3 ЛА Среднее 634 б 18 165,8 СКО 4 ПБА, поверхностная бедренная артерия; ОПА: общая подвздошная артерия; ПА: подколенная артерия; ИБС, ишемическая болезнь сердца. не включен в расчет среднегоСКО Таблица 6: Лечение и его исход у больных с окклюзией периферических артерий, лечившихся М 3,8,М 8,9 или SakSTAR. СоКод Восстановление Общая доза едине- просвета ние пациента путем лизиса тромболитического тромба препарата (мг) Общая продолжи Допол- Осложнения при нитель- ангиографии ная тельность влива- терапия Дрожь (при отсутствии лихорадки) ЧЧА Дистальная эмболизация после ЧЧА; устраненная во время продолжительного вливания SakSTAR,М 3,8; рвота ЧЧА Вскрытие артерии; проходящая легкая лихорадка Бедрен- Никаких нобольшеберцовый трансплантат ЧЧА+ст Повторная окклюентиро- зия через 8 дней,вание вылеченная с помощью аортоби-подвздошного трансплантата Никакой Никаких ЧЧА + Дистальная эмболистенти- зация после ЧЧА,рование излеченная аспирацией; по 41 вторная окклюзия через 30 часов,излеченная 6,5 мгSakSTAR.M8,9 (в течение 4,5 час) и ЧЧА Аспира- 30 мг рт-АП, вводимые в течение 20 ция бляшек часов Гематома правого ЧЧА бедра трансплантата; аспирация тромба(малоберцовая артерия) Острая ишемия геЧЧА,абдоми- теролатеральной нальная части ступни в аортальная аневризмо- результате (холестерол) эмболизации от абдоминальной аортальной аневризмы до дистальных артерий нижней части левой голени (день 4), не отвечающая на лечение 110 мг рт-АТ. ЧЧА Гематома в месте пункции вены. Анафилактический шок в течение 5 мин после ударного введения с последовавшей через 45 минут и после нормализации давления крови преходящей ишемией области левой средней церебральной артерии. Стенти- Повторная окклюрование зия стента через 6 недель ЧЧА Никаких Острая повторная окклюзия (день 1) Успешная чрезпросветная аспира 43 ция тромба Гематома в месте пункции вены Седнее 8,81,0 6,91,0 СКО ЧЧА, чрезкожная черезпросветная ангиопластика;из-за ограниченного наличия SakSTAR, М 8,9,терапию продолжали рт-АП.не включен в расчет среднегоСКО Таблица 7. Параметры коагуляции перед и после введения М 3,8, M8,9 или у больных с окклюзией периферической артерии. Плазминоген антиплаз-мин(нг/мл) едине- риноген б- (%) ного (г/л) ние До После До После Ло После До После+ Р по парному т-тесту Стьюдента Для расчета среднего значения "'" и не учитывались.не включены для расчета среднего значенияСКО повторное лечение через 30 часов;лечение прервано после ударной дозы.