Частицы, покрытые нуклеиновой кислотой
Формула / Реферат
1. Частицы для доставки нуклеиновых кислот пациенту, представляющие собой частицы-носители из инертного металла, содержащие на своей поверхности нуклеиновую кислоту, гомополимер аргинина формулы (Arg)x, где x - целое число от 2 до 10, или его физиологически приемлемую соль и агент, хелатирующий ионы металла.
2. Частицы по п.1, где материал частиц-носителей выбран из золота, вольфрама, платины и иридия.
3. Частицы по п.2, где частицы-носители представляют собой частицы золота, имеющие диаметр приблизительно от 1 до 3 мкм.
4. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где нуклеиновая кислота на поверхности указанных частиц кодирует антиген.
5. Частицы по п.4, где антиген выбран из вирусных антигенов, бактериальных антигенов и грибковых антигенов.
6. Частицы по п.5, где антигеном является антиген вируса папилломы человека.
7. Частицы по п.5, где антигеном является антиген ВИЧ.
8. Частицы по п.5, где антигеном является антиген HSV2 или HSV1.
9. Частицы по п.5, где антигеном является антиген вируса гриппа типа А, В или С.
10. Частицы по п.5, где антигеном является антиген вируса гепатита В.
11. Частицы по любому из пп.1-3, где нуклеиновая кислота на поверхности указанных частиц кодирует терапевтический полипептид.
12. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
13. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где гомополимер аргинина представляет собой (Arg)4 или (Arg)6.
14. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где агент, хелатирующий ион металла, выбран из этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), инозитгексафосфата, триполифосфата, полифосфорной кислоты, сукцината натрия, сукцината калия, сукцината лития, малата натрия, малата калия, малата лития, десфераля и этилендиаминди(о-гидроксифенилуксусной) кислоты (EDDHA).
15. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где один или более дисахаридных и/или трисахаридных сахаров присутствуют на поверхности частиц-носителей.
16. Частицы по п.15, где один или более сахаров выбраны из трегалозы, сахарозы, лактозы и раффинозы.
17. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где одна или более солей, выбранных из ацетата калия, хлорида кальция, хлорида лития, ацетата натрия, нитрата магния, цитрата натрия, фосфата натрия и хлорида магния, присутствуют на поверхности частиц-носителей.
18. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где на поверхности частиц-носителей присутствует антиоксидант.
19. Частицы по п.18, где антиоксидант выбран из этанола, витамина А, витамина С и витамина Е.
20. Частицы по п.1, которые получены путем осаждения ДНК на золотых частицах-носителях в присутствии ЭДТА и сахарозы.
21. Кассета для безыгольного шприца, содержащая частицы по любому из предшествующих пунктов.
22. Безыгольный шприц, наполненный частицами по любому из пп.1-20.
23. Способ получения частиц, пригодных для доставки из устройства для опосредованной частицами доставки, включающий в себя стадии:
(i) осаждения нуклеиновой кислоты на частицах-носителях из инертного металла в присутствии гомополимера аргинина формулы (Arg)x, где x - целое число от 2 до 10, или его физиологически приемлемой соли и агента, хелатирующего ионы металла; и
(ii) сбора полученных частиц.
24. Способ по п.23, где гомополимер аргинина добавляют на стадии (i) к смеси, содержащей частицы-носители и нуклеиновую кислоту.
25. Способ по п.23 или 24, где частицы-носители выбраны из частиц золота, вольфрама, платины и иридия.
26. Способ по п.25, где частицы-носители представляют собой частицы золота, имеющие диаметр приблизительно от 1 до 3 мкм.
27. Способ получения частиц по любому из пп.23-26, где нуклеиновая кислота на поверхности указанных частиц кодирует антиген.
28. Способ по п.27, где антиген выбран из вирусных антигенов, бактериальных антигенов и грибковых антигенов.
29. Способ по п.28, где антигеном является антиген вируса папилломы человека.
30. Способ по п.28, где антигеном является антиген ВИЧ.
31. Способ по п.28, где антигеном является антиген HSV2 или HSV1.
32. Способ по п.28, где антигеном является антиген вируса гриппа типа А, В или С.
33. Способ по п.28, где антигеном является антиген вирус гепатита В.
34. Способ по любому из пп.23-26, где нуклеиновая кислота кодирует терапевтический полипептид.
35. Способ по любому из пп.23-34, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
36. Способ по любому из пп.23-35, где гомополимер аргинина представляет собой (Arg)4 или (Arg)6.
37. Способ по любому из пп.23-36, где агент, хелатирующий ионы металла, выбран из этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), инозитгексафосфата, триполифосфата, полифосфорной кислоты, сукцината натрия, сукцината калия, сукцината лития, малата натрия, малата калия, малата лития, десфераля и этилендиаминди(о-гидроксифенилуксусной) кислоты (EDDHA).
38. Способ по любому из пп.23-37, где стадию (i) дополнительно проводят в присутствии одного или более дисахаридных и/или трисахаридных сахаров.
39. Способ по п.38, где один или более сахаров выбраны из трегалозы, сахарозы, лактозы и раффинозы.
40. Способ по любому из пп.23-39, где стадию (i) дополнительно проводят в присутствии одной или более солей, выбранных из ацетата калия, хлорида кальция, хлорида лития, ацетата натрия, нитрата магния, цитрата натрия, фосфата натрия и хлорида магния.
41. Способ по любому из пп.23-40, где частицы, полученные на стадии (i), контактируют с антиоксидантом.
42. Способ по п.41, где антиоксидант выбран из группы, состоящей из этанола, витамина А, витамина С и витамина Е.
43. Способ по п.23, включающий в себя стадии:
(i) осаждения ДНК на инертных частицах из золота в присутствии полиаргинина, ЭДТА и сахарозы и
(ii) сбора полученных частиц.
44. Способ иммунизации нуклеиновой кислотой, включающий в себя:
(а) обеспечение частицами, пригодными для доставки из устройства для опосредованной частицами доставки, причем частицы содержат частицы-носители из инертного металла, содержащие на своей поверхности нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген, гомополимер аргинина формулы (Arg)x, где x - целое число от 2 до 10, или его физиологически приемлемую соль и агент, хелатирующий ионы металла; и
(b) введение эффективного количества частиц субъекту.
45. Способ по п.44, где антиген выбран из вирусных антигенов, бактериальных антигенов и грибковых антигенов.
46. Способ по п.45, где антигеном является антиген вируса папилломы человека.
47. Способ по п.45, где антигеном является антиген ВИЧ.
48. Способ по п.45, где антигеном является антиген HSV2 или HSV1.
49. Способ по п.45, где антигеном является антиген вируса гриппа типа А, В или С.
50. Способ по п.45, где антигеном является антиген вируса гепатита В.
51. Способ генной терапии, включающий в себя:
(a) обеспечение частицами, пригодными для доставки из устройства для опосредованной частицами доставки, которое содержит частицы-носители из инертного металла, содержащие на своей поверхности нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтический полипептид, гомополимер аргинина формулы (Arg)x, где x - целое число от 2 до 10, или его физиологически приемлемую соль и агент, хелатирующий ионы металла; и
(b) введение эффективного количества частиц субъекту.
52. Способ по любому из пп.44-51, где частицы-носители выбраны из частиц золота, вольфрама, платины и иридия.
53. Способ по п.52, где частицы-носители представляют собой частицы золота, имеющие диаметр приблизительно от 1 до 3 мкм.
54. Способ по любому из пп.44-53, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
55. Способ по любому из пп.44-54, где гомополимер аргинина представляет сосющ (Arg)4 или (Arg)6.
56. Способ по любому из пп.44-55, где агент, хелатирующий ионы металла, выбран из этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), инозитгексафосфата, триполифосфата, полифосфорной кислоты, сукцината натрия, сукцината калия, сукцината лития, малата натрия, малата калия, малата лития, десфераля и этилендиаминди(о-гидроксифенилуксусной) кислоты (EDDHA).
57. Способ по любому из пп.44-56, где один или более дисахаридных и/или трисахаридных сахаров присутствует на поверхности частиц-носителей.
58. Способ по п.57, где один или более сахаров выбраны из трегалозы, сахарозы, лактозы и раффинозы.
59. Способ по любому из пп.44-58, где одна или более солей, выбранных из ацетата калия, хлорида кальция, хлорида лития, ацетата натрия, нитрата магния, цитрата натрия, фосфата натрия и хлорида магния, присутствует на поверхности частиц-носителей.
60. Способ по любому из пп.44-59, где антиоксидант присутствует на поверхности частиц-носителей.
61. Способ по п.60, где антиоксидант выбран из этанола, витамина А, витамина С и витамина Е.
62. Способ по пп.44-51, где частицы-носители получены путем осаждения ДНК на золотых частицах-носителях в присутствии ЭДТА и сахарозы.
Текст
010881 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к частицам, покрытым нуклеиновой кислотой, которые подходят для опосредуемой частицами доставки нуклеиновых кислот безыгольным устройством. В частности, изобретение относится к применению частиц для доставки in vivo и ex vivo молекул нуклеиновых кислот к ткани млекопитающего. Уровень техники Генная терапия и иммунизация нуклеиновыми кислотами являются многообещающими подходами к лечению и профилактике как приобретенных, так и наследуемых болезней. Данные способы предлагаются для переноса желаемой нуклеиновой кислоты субъекту с последующей экспрессией in vivo. Перенос может быть осуществлен с помощью трансфекции клеток или тканей субъекта ех vivo и повторного введения трансформированного материала хозяину. Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть введена in vivo непосредственно реципиенту. Однако способ доставки in vivo должен позволять нуклеиновой кислоте входить в клетки реципиента так, чтобы нуклеиновая кислота могла экспрессироваться. В данном контексте разработан ряд способов доставки генов. Среди них чрескожная доставка нуклеиновых кислот имеет много преимуществ по сравнению с пероральным или парентеральным способом доставки. В частности, чрескожная доставка обеспечивает безопасную, удобную и неинвазивную альтернативу традиционным системам введения, позволяющую легко избежать главных проблем, связанных с пероральной доставкой (например, различающихся скоростей поглощения, разрушения и метаболизма в желудке, эффекта первичного прохождения через печень, раздражения желудочно-кишечного тракта и/или горького или неприятного вкуса лекарства) или парентеральной доставкой (например, боли от иглы, риска внесения инфекции индивидам, подвергающимся лечению, риска контаминации или инфицирования работников здравоохранения при случайных уколах иглой и удалении использованных игл). Однако чрескожная доставка нуклеиновых кислот также имеет ряд присущих ей проблем. Пассивная доставка через интактную кожу влечет за собой транспорт молекул через ряд структурно различных тканей. Они могут включать в себя ороговевшие слои (главный барьер), живой эпидермис, папиллярную дерму или стенки капилляров, чтобы достигнуть поступления в кровоток или лимфу. Чрескожные системы доставки должны быть, следовательно, способны преодолевать различные виды устойчивости, присущие каждому типу ткани. Следовательно, разработано большое количество альтернатив пассивной трансдермальной доставке. Данные альтернативы связаны с применением агентов, увеличивающих проницаемость кожи, или усилителей проницаемости для увеличения прохождения через кожу, а также нехимическими способами, такими как применение ионофореза, электропорации или ультразвука. Однако данные альтернативные способы часто вызывают увеличение своих собственных побочных эффектов, таких как раздражение или повышение чувствительности кожи. Недавно были разработаны способы доставки с помощью частиц, подходящих для чрескожной доставки нуклеиновых кислот. Частицы, несущие интересующую нуклеиновую кислоту, ускоряются до высокой скорости и выстреливаются в ткань-мишень с помощью устройства для ускорения. In vivo частицами можно выстреливать непосредственно в клетки-реципиенты, минуя необходимость захвата клетками проходящей нуклеиновой кислоты. В данной области техники известны различные устройства для ускорения частиц, подходящие для доставки, опосредуемой частицами. В существующих устройствах применяется взрывная, электрическая или газообразная подача для проталкивания покрытых частиц-носителей к клеткам-мишеням. Устройство Biolistic, например, доставляет покрытые ДНК микроскопические золотые шарики непосредственно в клетки эпидермиса (Yang et al. (1990) PNAS USA 87: 9568-9572). Частицы могут также доставляться с применением устройства в виде безыгольного шприца, как описано в патенте США 5630796, принадлежащем Bellhouse et al. (thePowderJect needleless syringe device). Устройства для доставки, опосредуемой частицами, предназначены для того, чтобы обеспечить безопасную и легкую доставку нуклеиновых кислот. Однако необходимо создание физических характеристик частиц, соответствующих требованиям безыгольного введения, при котором частицы обычно выстреливаются при очень высокой скорости. Частицы должны иметь такую структурную целостность,чтобы они могли пережить действие, например, струи газа шприца или баллистическое столкновение с кожей или слизистой оболочкой. Важно также, чтобы частицы имели плотность, которая позволяет частицам достичь достаточной кинетической энергии для проникновения в ткань. Для доставки нуклеиновых кислот, однако, частицы должны быть более мелкими, чем размер клетки, так, чтобы они могли пройти клеточные мембраны, не разрушая клеток. Нуклеиновые кислоты сами подвергаются деградации при хранении. Следовательно, при ассоциации с частицей необходимо поддерживать нуклеиновую кислоту в стабильном состоянии. Однако ассоциация нуклеиновой кислоты с частицей должна также позволять нуклеиновой кислоте эффективно экспрессироваться после доставки к клетке-мишени. Когда нуклеиновая кислота кодирует антиген, способ ассоциации частицы должен также позволять антигену проявлять иммуногенность в организме субъекта. В соответствии с одним из способов частицы, подходящие для опосредуемой частицами доставки,-1 010881 могут быть образованы путем нанесения молекул нуклеиновой кислоты на частицы инертного металланосителя. Частицы-носители выбирают из материалов, имеющих подходящую плотность и размер, таких как вольфрам или золото. Известен ряд способов покрытия или осаждения ДНК или РНК на золотые или вольфрамовые частицы. В данных способах обычно смешивают предопределенное количество золота или вольфрама с ДНК плазмиды, CaCl2 и спермидином. Полученный раствор непрерывно встряхивают при перемешивании в течение процедуры покрытия с тем, чтобы обеспечить гомогенность реакционной смеси. После осаждения нуклеиновой кислоты покрытые частицы могут быть перенесены на подходящие мембраны, и им дают высохнуть перед применением, они могут быть нанесены на поверхности модуля образца или кассеты или введены в кассету для доставки при применении, в частности, в приборах для опосредуемой частицами доставки. Сущность изобретения Разработан новый состав для оптимизации как стабильности нуклеиновой кислоты, присоединенной к частицам-носителям, что тем самым повышает срок хранения частиц, так и количества нуклеиновой кислоты, доставляемой в интактном виде к клеткам-мишеням, а также экспрессии и физиологической активности нуклеиновой кислоты после доставки к клеткам-мишеням. Конкретно, было обнаружено, что нуклеиновые кислоты могут стабильно присоединяться к инертным металлическим частицамносителям в присутствии агента, конденсирующего нуклеиновую кислоту, и агента, хелатирующего ион металла. Таким образом, нуклеиновая кислота может быть осаждена на частицы-носители при нейтральном,но не щелочном pH, что способствует сохранению целостности нуклеиновой кислоты. Более того, частицы затем могут быть промыты в водных или спиртовых растворах без потери нуклеиновой кислоты, что тем самым облегчает включение агентов, повышающих стабильность. Конденсация нуклеиновой кислоты совместно с химическим действием хелатирующего агента защищает нуклеиновую кислоту как от физического повреждения, так и химического разрушения, например окисления свободными радикалами или гидролиза эндонуклеазами. Частицы согласно изобретению могут быть доставлены к клеткам с помощью эффективной опосредуемой частицами доставки. Несмотря на стабильность ассоциации нуклеиновой кислоты с частицей, было показано, что имеется эффективная экспрессия нуклеиновой кислоты в клетках-мишенях. Более того, был продемонстрирован иммунный потенциал нуклеиновых кислот, кодирующих антигены. Соответственно, в настоящем изобретении предлагаются частицы, пригодные для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки, причем частицы получают путем осаждения нуклеиновой кислоты на инертные металлические частицы-носители в присутствии агента, вызывающего конденсацию нуклеиновой кислоты, и агента, хелатирующего ион металла. Состав частиц может быть дополнительно улучшен с помощью одного или более сахаров и/или солей при получении частиц и/или путем обработки частиц антиоксидантом, таким как этанол или витамин А, С или Е. В изобретении также предлагаются способ получения частиц, пригодных для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки, включающий в себя стадии:(i) осаждения нуклеиновой кислоты на частицах-носителях из инертного металла в присутствии агента, вызывающего конденсацию нуклеиновой кислоты, и агента, хелатирующего ион металла; и(ii) сбора полученных частиц; способ иммунизации нуклеиновой кислотой, включающий в себя:(a) получение частиц, пригодных для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки, причем частицы получают путем осаждения нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, на частицах-носителях из инертного металла в присутствии агента, вызывающего конденсацию нуклеиновой кислоты, и агента, хелатирующего ион металла; и(b) введение эффективного количества частиц субъекту; способ генной терапии, включающий в себя:(a) получение частиц, пригодных для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки, причем частицы получают путем осаждения нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтический полипептид, на частицах-носителях из инертного металла в присутствии агента, вызывающего конденсацию нуклеиновой кислоты, и агента, хелатирующего ион металла; и(b) введение эффективного количества частиц субъекту; частицы, пригодные для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки, которые включают в себя частицы-носители из инертного металла, имеющие на своей поверхности нуклеиновую кислоту, агент, хелатирующий ион металла, и одно или более из следующего:(i) агента, вызывающего конденсацию нуклеиновой кислоты;(ii) одного или более дисахаридных и/или трисахаридных сахаров; и(iii) одной или более солей. В изобретении также предлагается емкость для единицы лекарственной формы для устройства для опосредуемой частицами доставки, причем емкость содержит частицы согласно изобретению, а также-2 010881 устройство для опосредуемой частицами доставки, наполненное частицами согласно изобретению. Данные и другие объекты, аспекты, осуществления и преимущества настоящего изобретения должны быть вполне понятны специалистам в данной области в свете представленного здесь раскрытия. Подробное описание предпочтительных осуществлений Перед подробным описанием настоящего изобретения следует пояснить, что настоящее изобретение не ограничено конкретно проиллюстрированными молекулами или параметрами способа, поскольку таковые, конечно, могут варьироваться. Следует также понимать, что применяемая здесь терминология предназначена лишь для целей описания конкретных осуществлений изобретения и не предназначена для его ограничения. Кроме того, при практическом осуществлении настоящего изобретения должны применяться, если это не указано иначе, традиционные способы вирусологии, микробиологии, молекулярной биологии, технологии рекомбинантной ДНК и иммунологии, каждый из которых доступен специалисту в данной области. Данные способы полностью раскрыты в литературе. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach,vol.III (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); и Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. III (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.). Все цитированные здесь выше или ниже публикации, патенты и патентные заявки включены в качестве ссылки во всей своей полноте. Необходимо отметить, что применяемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа подразумевают также и множественное число, если особо не указано иначе. Если не указано иначе, все применяемые здесь технические и научные термины имеют то же значение, что и общепринятое понимание специалистами в областях техники, к которым изобретение имеет отношение. Хотя при осуществлении настоящего изобретения можно использовать целый ряд способов и веществ, сходных или эквивалентных тем, которые здесь описаны, в данном описании приведены предпочтительные вещества и способы. А. Определения. При описании настоящего изобретения будут применяться следующие термины, которые следует определять, как указано ниже. Термины "молекула нуклеиновой кислоты" и "полинуклеотид" применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидов, либо рибонуклеотидов или их аналогов. Полинуклеотиды могут обладать любой трехмерной структурой и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают в себя ген, фрагмент гена, экзоны, интроны, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомную РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенную ДНК любой последовательности, выделенную РНК любой последовательности, зонды нуклеиновой кислоты и праймеры. Полинуклеотид обычно состоит из конкретной последовательности из четырех оснований нуклеотидов: аденина (А); цитозина (С); гуанина (G) и тимина (Т) (урацила (U) вместо тимина (Т), когда полинуклеотидом является РНК). Таким образом, термин последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой алфавитное представление полинуклеотидной молекулы. Данное алфавитное представление может быть внесено в базы данных компьютера, имеющего центральный блок процессора, и использовано для целей биоинформатики, таких как функциональная геномика и поиск гомологии. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая "кодирует" выбранный антиген, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) или транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vivo при размещении ее под контролем подходящих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5'(амино) конце и стоп-кодоном трансляции на 3' (карбоксильном) конце. Для целей изобретения такие последовательности нуклеиновых кислот могут включать в себя, не ограничиваясь этим, кДНК от вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, геномные последовательности от вирусной или прокариотической ДНК или РНК и даже синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции может быть расположена на 3'-конце кодирующей последовательности."Вектор" способен переносить последовательности нуклеиновой кислоты к клеткам-мишеням (например, вирусные векторы, невирусные векторы, частицы-носители и липосомы). Обычно "векторный конструкт", "экспрессирующий вектор" и "вектор переноса гена" означают любой конструкт нуклеиновой кислоты, способный направлять экспрессию интересующего гена и который может переносить генные последовательности к клеткам-мишеням. Таким образом, этот термин охватывает клонирующие и экспрессирующие носители. "Плазмида" представляет собой вектор в виде внехромосомного генетического элемента."Промотор" представляет собой нуклеотидную последовательность, которая инициирует и регулирует транскрипцию полинуклеотида. Промоторы могут включать в себя индуцируемые промоторы (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, оперативно связанной с промотором, индуцируется аналитом, кофактором, регуляторным белком и т.д.), репрессируемые промоторы (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, оперативно связанной с промотором, подавляется аналитом, кофак-3 010881 тором, регуляторным белком и т.д.) и конститутивные промоторы. Подразумевается, что термин "промотор" или "контрольный элемент" охватывает полноразмерные промоторные области и функциональные(например, контролирующие транскрипцию или трансляцию) сегменты данных областей."Оперативно связанные" относится к организации элементов, в которой описанные таким образом компоненты расположены так, чтобы выполнять свою обычную функцию. Таким образом, данный промотор, оперативно связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, способен влиять на экспрессию данной последовательности, когда присутствуют подходящие ферменты. Промотору необязательно прилегать к последовательности до тех пор, пока он функционирует как управляющий ее экспрессией. Таким образом, например, внедренные не транслируемые, но транскрибируемые последовательности могут присутствовать между последовательностью промотора и последовательностью нуклеиновой кислоты, и последовательность промотора все еще может рассматриваться как "оперативно связанная" с кодирующей последовательностью."Рекомбинантная" применяется здесь для описания молекулы нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), геномной, кДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, которая в силу своего происхождения или манипуляций не связана со всем или частью полинуклеотида, с которым она связана в природе, и/или присоединена к полинуклеотиду, отличному от того, к которому она присоединена в природе. Две последовательности нуклеиновой кислоты, которые содержатся в пределах одной молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, являются "гетерологичными" по отношению друг к другу,когда они обычно не связаны друг с другом в природе."Полипептид" применяется в своем самом широком смысле для обозначения соединения из двух или более аминокислотных субъединиц, аминокислотных аналогов или других пептидомиметиков. Субъединицы могут быть связаны пептидными связями или другими связями, например простыми эфирными, сложно-эфирными и т.д. Применяемый здесь термин "аминокислота" относится и к природным,и/или неприродным или синтетическим аминокислотам, включая глицин, и как к D-, так и к Lоптическим изомерам, и к аналогам аминокислот и пептидомиметикам. Пептид из трех или более аминокислот обычно называют олигопептидом, если пептидная цепь является короткой. Если пептидная цепь является длинной, пептид обычно называют полипептидом или белком."Антиген" относится к любому агенту, обычно макромолекуле, который может вызывать иммунный ответ у индивида. Термин может быть применен для обозначения индивидуальной макромолекулы или гомогенной или гетерогенной популяции антигенных макромолекул. Применяемый здесь "антиген" обычно используют для обозначения белковой молекулы или ее части, которая содержит один или более эпитопов. Для целей настоящего изобретения антигены могут быть получены или могут происходить из любого подходящего источника. Более того, для целей настоящего изобретения "антиген" включает в себя белок, имеющий модификации по отношению к природной последовательности, такие как делеции,добавки и замены (обычно консервативные по природе), до тех пор, пока белок сохраняет значительную иммуногенность. Данные модификации могут быть преднамеренными, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза, или могут быть случайными, такими как при мутациях хозяев, которые продуцируют антигены."Иммунный ответ" против интересующего антигена представляет собой развитие у индивида гуморального и/или клеточного иммунного ответа на антиген. Для целей настоящего изобретения "гуморальный иммунный ответ" относится к иммунному ответу, опосредуемому молекулами антител, в то время как "клеточный иммунный ответ" представляет собой ответ, опосредуемый Т-лимфоцитами и/или другими белыми клетками крови. Термин "иммунизация нуклеиновой кислотой" используется здесь для обозначения введения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более выбранных антигенов, в клетку-хозяина для экспрессии in vivo антигена или антигенов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть введена непосредственно субъекту-реципиенту с помощью чрескожной доставки частиц. Альтернативно, молекула может быть введена ex vivo в клетки, которые были отобраны у субъекта. В данном последнем случае клетки, содержащие интересующую молекулу нуклеиновой кислоты, повторно вводят субъекту так, чтобы можно было вызвать иммунный ответ против антигена, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые при такой иммунизации, обычно обозначаются здесь как "вакцинирующие нуклеиновые кислоты". Термин "чрескожная" доставка подразумевает внутрикожное (например, в дерму или эпидермис),трансдермальное (например, "подкожное") и трансмукозное введение, т.е. доставку путем поступления агента в кожу или через кожу или слизистые оболочки. См., например, Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled DrugDelivery of Drugs, vols. 1-3, Kydonieus и Berner (eds.,), CRC Press, (1987). Таким образом, термин охватывает доставку из безыгольного шприца, как описано в патенте США 5630796, а также опосредуемую частицами доставку, как описано в патенте США 5865796. Под безыгольным шприцем подразумевается инструмент, который доставляет композицию частиц чрескожно без помощи общепринятой иглы для прокалывания кожи. Безыгольные шприцы для при-4 010881 менения в настоящем изобретении обсуждаются на протяжении данного документа. Термины индивид и субъект применяются здесь взаимозаменяемо для обозначения любого члена подтипа хордовых, включая - без ограничения - человека и других приматов, включая нечеловекообразных обезьян, таких как шимпанзе и другие виды обезьян и мартышек; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашних животных, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая домашних, диких птиц и пернатую дичь, таких как цыплята, индейки и другие представители отряда куриных, утки, гуси и пр. Термины не относятся к конкретному возрасту. Таким образом,для охвата предназначены как взрослые, так и новорожденные индивиды. Описанные здесь способы предназначены для применения у любого из указанных выше видов позвоночных, так как иммунная система всех этих позвоночных функционирует сходным образом. В. Общие способы. Изобретение касается опосредуемой частицами доставки нуклеиновых кислот. В частности, в изобретении предлагаются частицы, которые подходят для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки и которые получают с помощью способа, который включает в себя или который в некоторых осуществлениях, по существу, состоит из осаждения нуклеиновой кислоты на инертные металлические частицы-носители в присутствии агента, конденсирующего нуклеиновую кислоту, и агента, хелатирующего ион металла. Частицы-носители выбирают из металлов, которые имеют подходящую плотность и подходящий размер частиц для внутриклеточной доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки. Предпочтительно, чтобы плотность частиц-носителей составляла приблизительно от 15 до 25 г/мл, например от приблизительно 15 до 23 г/мл или приблизительно от 16 до 20 г/мл. Частицы-носители могут иметь диаметр приблизительно от 0,5 до 10 мкм, например приблизительно от 1 до 5 мкм. Особенно предпочтительно, чтобы частицы-носители имели диаметр приблизительно от 0,5 до 3 мкм, например приблизительно от 1 до 3 мкм или от 0,5 до 2 мкм. Металлические частицы-носители являются инертными в том смысле, что они не взаимодействуютex vivo с клетками или организмом субъекта, в которые частицы предполагается вводить. Обычно применяются золотые, вольфрамовые, платиновые или иридиевые частицы-носители. Предпочтительны золотые или вольфрамовые частицы. Золотые частицы могут представлять собой частицы из коллоидного золота. Золотые частицы обеспечивают однородность по размеру (доступны от Alpha Chemicals с размером частиц приблизительно от 1 до 3 мкм или доступны от Degussa, South Plainfield, NJ с диапазоном размеров частиц, включая 0,95 мкм) и пониженную токсичность. Микрокристаллическое золото (например, золотой порошок А 1570, доступен от Engelhard Corp., East Newark, NJ) дает разное распределение частиц по размеру, обычно в диапазоне приблизительно от 0,1 до 5 мкм. Однако неровная площадь поверхности микрокристаллического золота обеспечивает высокоэффективное покрытие нуклеиновыми кислотами. Вольфрамовые частицы легко доступны при средних размерах приблизительно от 0,5 до 2 мкм в диаметре. Обычно молекула нуклеиновой кислоты включает в себя терапевтически важную нуклеотидную последовательность для доставки субъекту. Предпочтительно, чтобы настоящие частицы подходили для применения для иммунизации нуклеиновыми кислотами или генной терапии. Нуклеиновая кислота может, таким образом, включать в себя последовательность, способную обеспечить иммуногенность, например, иммуногенную последовательность, которая вызывает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ при доставке субъекту. Альтернативно, нуклеиновая кислота может включать в себя один или более генов, кодирующих терапевтический полипептид, например, белок, который является дефектным или пропущенным в геноме клетки-мишени, или неприродный белок, обладающий желаемым биологическим или терапевтическим эффектом (например, противовирусной активностью). Нуклеиновая кислота может включать в себя последовательность, которая кодирует антисмысловую молекулу или молекулу, имеющую функцию рибозима. Для лечения генетических нарушений субъекту могут быть введены функциональные гены, соответствующие генам, известным как недостающие при конкретном нарушении. Предпочтительно нуклеиновой кислотой является ДНК. Подходящие нуклеиновые кислоты для доставки включают те, которые применяют для лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных, хронических и инфекционных болезней, включая такие нарушения как СПИД, рак, неврологические заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, гиперхолестеринемия, различные заболевания крови, включая различные анемии, талассемию и гемофилию; генетические дефекты, такие как кистозный фиброз, болезнь Гоше, дефицит аденозиндезаминазы (ADA),эмфизему и т.д. Ряд антисмысловых олигонуклеотидов (например, короткие олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям, находящимся рядом с сайтом инициации трансляции (кодон AUG) мРНК), которые пригодны для антисмысловой терапии рака и вирусных заболеваний, описан в данной области техники. См., например, Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 4313; Uhlmann et al. (1990)Acad. Sci. USA 85: 7079; и Heikkila et al. (1987) Nature 328:445. Описан также ряд рибозимов, подходящих для применения здесь. См., например, Chec et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17479, и патент США-5 0108815225347, принадлежащий Goldberg et al. Например, в способах лечения солидных опухолей гены, кодирующие токсичные пептиды (т.е. химиотерапевтические агенты, такие как рицин, дифтерийный токсин и фактор яда кобры), генысупрессоры опухолей, такие как р 53, гены, кодирующие последовательности мРНК, которые являются антисмысловыми по отношению к трансформирующим онкогенам, антинеопластические пептиды, такие как фактор некроза опухолей (TNF) и другие цитокины, или трансдоминантные негативные мутанты трансформирующих онкогенов, могут быть доставлены для экспрессии на самой опухоли или вблизи нее. Сходным образом могут быть также введены нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, известные как проявляющие противовирусную и/или антибактериальную активность, или стимулирующие иммунную систему хозяина. Нуклеиновая кислота может кодировать один из различных цитокинов (или его функциональные фрагменты), таких как интерлейкины, интерфероны и колоннестимулирующие факторы. Нуклеиновая кислота может кодировать антиген для лечения или профилактики ряда состояний,включая в себя, не ограничиваясь этим, рак, аллергии, токсичность и инфицирование патогеном, таким как, но не ограничиваясь этим, грибы, вирусы, включая вирусы папилломы человека (HPV), ВИЧ,HSV2/HSV1, вирус гриппа (типа А, В и С) , полиовирус, вирус RSV, риновирусы, ротавирусы, вирус гепатита А, группу вирусов Norwalk, энтеровирусы, астровирусы, вирус кори, вирус парагриппа, вирус паротита, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, аденовирусы, вирус краснухи,вирус Т-клеточной лимфомы типа I человека (HTLV-I), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита Сb), Toxoplasma gondic, Complybacteriosis, Moraxella catarrhalis, Donovanosis и Actinomycosis; грибковые патогены, включая Candidiasis и Aspergillosis; паразитарные патогены, включая Taenia, Flukes, Roundworms, Amebiasis, Giardiasis, Cryptosporidium, Schitosoma, Pneumocystis carinii, Trichomoniasis и Trichinosis. Нуклеиновая кислота может также быть использована для обеспечения подходящего иммунного ответа против многочисленных ветеринарных заболеваний, таких как заболевания лап и рта, коронавирусные заболевания, Pasteurella multocida, Helicobacter, Strongylus vulgaris, Actinobacillus pleuropneumonia,вирус диареи коров (BVDV), Klebsiella pneumoniae, E. Coli, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis иBordetella brochiseptica. Таким образом, в одном из аспектов частицы согласно изобретению могут найти применение в качестве вакцины. Изобретение также находит применение в антисмысловой терапии, например, для доставки олигонуклеотидов, способных гибридизоваться со специфическими комплементарными последовательностями, ингибируя тем самым транскрипцию и/или трансляцию данных последовательностей. Таким образом, мишенью могут служить ДНК или РНК, кодирующие белки, необходимые для прогрессии конкретного заболевания, что тем самым нарушает патологический процесс. Антисмысловая терапия и многочисленные олигонуклеотиды, которые способны связываться специфически и предсказуемо с определенными последовательностями нуклеиновых кислот-мишеней, с тем, чтобы ингибировать или модулировать экспрессию генов, вызывающих заболевание, известны и легко доступны для специалиста в данной области техники. Uhlmann et al., (1990) Chem Rev. 90: 543, Neckers et al., (1992) Int. Rev. Oncogenesis 3,175; Simons et al., (1992) Nature 359, 67; Bayever et al. (1992) Antisense Res. Dev. 2: 109; Whitesell et al.Rev. Biochem. 60: 631. Соответственно, антисмысловые олигонуклеотиды, способные селективно связываться с последовательностями-мишенями в клетках-хозяевах, предлагаются здесь для применения в антисмысловой терапии. Обычно нуклеиновая кислота предлагается в виде экспрессирующего вектора. Такие экспрессирующие векторы могут быть сконструированы обычным способом, известным в молекулярной биологии,и могут, например, включать в себя плазмидную ДНК и подходящие инициаторы, промоторы, энхансеры и другие элементы, такие, например, как сигналы полиаденилирования, которые могут быть необходимы и которые располагаются в правильной ориентации, для того, чтобы разрешить экспрессию включенной последовательности. Подходящие векторы должны быть очевидны специалистам в данной области. В качестве дополнительного примера в этом отношении можно сослаться на публикацию Sambrook et al.,1989. Подходящий экспрессирующий вектор включает в себя полинуклеотид для применения в настоящем изобретении, оперативно связанный с контролирующей последовательностью, обычно промотором,который способен обеспечить экспрессию полинуклеотида клеткой-хозяином. Предпочтительно, чтобы вектор подходил для применения в способе генной терапии или иммунизации нуклеиновой кислотой. Вектор может быть использован ex vivo, например, для трансформации клетки-хозяина, которую затем повторно вводят субъекту. Альтернативно, вектор может быть использован in vivo для непосредственной доставки субъекту. Вектор обычно представляет собой плазмиду, обеспеченную ориджином репликации, промотором-6 010881 для экспрессии полинуклеотида и необязательно регулятором промотора. Векторы могут содержать один или более генов-маркеров, например ген устойчивости к ампициллину. Промоторы и другие регулирующие экспрессию сигналы выбирают так, чтобы они были совместимы с клеткой-хозяином, в которой организуется экспрессия. Могут быть использованы индуцируемые,репрессируемые или контролируемые другим образом промоторы. Для экспрессии в хозяевахмлекопитающих или клетках-хозяевах млекопитающих могут быть использованы контролирующие элементы как эукариот, так и фагов. Подходящие промоторы млекопитающих включают в себя металлотионеиновый промотор, который может быть индуцирован в ответ на тяжелые металлы, такие как кадмий, и -актиновые промоторы. Особенно предпочтительны тканеспецифические промоторы. Подходящие вирусные промоторы включают в себя, например, длинный концевой повтор вируса лейкоза Молони мыши (MMLV LTR), LTRпромотор вируса саркомы Рауса (RSV), SV40-промотор, непосредственный ранний (IE) промотор цитомегаловируса человека (hCMV), аденовирус, HSV-промоторы (такие как IE-промоторы HSV) или промоторы HPV, особенно вышележащая регуляторная область HPV (URR). Все эти промоторы легко доступны в данной области. Обычно также должны присутствовать последовательности терминации транскрипции и полиаденилирования, расположенные на 3'-конце по отношению к каждому стоп-кодону трансляции. Предпочтительно, чтобы присутствовала также последовательность для оптимизации инициации трансляции,расположенная на 5'-конце каждой кодирующей последовательности. Примеры сигналов терминации транскрипции/полиаденилирования включают в себя такие, которые происходят из SV40, как описано уSambrook et al., а также последовательность терминации транскрипции гормона роста быка. Кроме того,могут быть включены энхансерные элементы для увеличения уровня экспрессии. Примеры подходящих энхансеров включают в себя ранний энхансер гена SV40 (Dijkema et al. (1985) EMBOJ. 4:761), энхансер/промотор, происходящий от длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса (LTR) (Gorman et al.(Boshart et al. (1985) Cell 41:521), например элементы, включенные в интрон последовательности A CMV. Агент, конденсирующий нуклеиновую кислоту, для применения в изобретении взаимодействует с нуклеиновой кислотой таким образом, чтобы конденсировать нуклеиновую кислоту до более компактной структуры. Конденсированная нуклеиновая кислота обычно более стабильна, чем неконденсированная форма, и обычно имеет более упорядоченную структуру, например, торообразную или стержнеобразную форму. Конденсирующие агенты обычно представляют собой основные молекулы, которые взаимодействуют электростатически с нуклеиновой кислотой, нейтрализуя ее отрицательный заряд. Сообщалось,например, что требуется нейтрализация 88-90% заряда, чтобы произошла эффективная конденсация(Deng H. and V.A. Bloomfield (1999) Biophys J 77:1556-61). Обычно конденсирующий агент связывается с молекулой нуклеиновой кислоты с относительно высоким сродством. Может быть применен любой подходящий конденсирующий нуклеиновую кислоту агент, включая катионные полимеры и мультивалентные катионы. В одном из осуществлений конденсирующий агент представляет собой катионный полимер или его физиологически приемлемую соль. Такие фармацевтически приемлемые соли включают в себя, например, соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и пр., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и пр. Обычно соль представляет собой гидрохлорид или сульфат. Предпочтительно катионный полимер представляет собой полиамин. Полиамины, которые могут быть использованы, включают в себя протамины, путресцин, спермидин, спермин, гексадиметринбромидные полиаргинины (Polybrene) и полилизины или физиологически приемлемые соли указанных выше полиаминов. Катионный полимер может представлять собой пептид, содержащий полиамин. Предпочтительно, полиамин представляет собой катионный полимер основных аминокислот. Обычно основные аминокислоты выбирают из лизина, аргинина и гистидина. Такие полиаминокислоты легко доступны от Sigma-Aldrich. Полиаминокислота может быть гомополимером основной аминокислоты. Например, полиаргинин,полилизин или полигистидин. Альтернативно, полиаминокислота может быть полимером одной или более основных аминокислот, необязательно также включая одну или более неосновных аминокислот. Таким образом, полиаминокислота может включать в себя одну или более основных аминокислот, необязательно одну или более других аминокислот. Такой сополимер обычно включает в себя большую часть основных аминокислот. Например, от 50 до 100% аминокислот в сополимере могут быть основными. Предпочтительно основными являются от 60 до 90% или от 70 до 80%. В одном осуществлении по меньшей мере 75%, например, по меньшей мере 85, 95, 98 или 99% аминокислот в сополимере являются основными. В целом, основные аминокислоты включают в себя одну или более аминокислот, выбранных из лизина, гистидина и аргинина. Когда сополимер включает одну или более неосновных аминокислот,они предпочтительно не являются кислыми аминокислотами, такими как аспартат или глутамат. Одна или более неосновных аминокислот могут включать в себя аминокислоты с алифатическими или ароматическими боковыми цепями, например треонин, пролин, триптофан, серин или фенилаланин.-7 010881 Аминокислоты в любой из указанных выше полиаминокислот могут представлять собой L- или Dаминокислоты. Предпочтительно применяют L-аминокислоты. В предпочтительном осуществлении полиамин представляет собой гомополимер аргинина (Arg)x или лизина (Lys)x. Предпочтительны поли-L-аргинин или поли-L-лизин, в особенности поли-L-аргинин. Обычно гомополимер имеет молекулярную массу приблизительно от 500 до 15000, например от 500 до 10000, от 500 до 5000 или от 500 до 1000. В одном осуществлении x в указанной выше формуле может колебаться от 2 до 100, например от 2 до 50, от 2 до 30 или от 2 до 20. Особенно предпочтительны малые пептидные гомополимеры, например, те, которые имеют молекулярную массу в диапазоне от 500 до 1500, такую как от 500 до 1250 или от 700 до 1000. Обычно в малом пептиде х составляет величину от 2 до 10, например от 4 до 8. Гомополимеры, в которых x=4 или 6,например (Arg)4 или (Arg)6, особенно пригодны в настоящем изобретении. Конденсирующий агент может быть членом протаминового семейства белков, например протаминсульфатом. Протамины представляют собой основные белки, которые находятся в связи с ДНК спермы в области гистонов. Ядра спермы, следовательно, обеспечивают прекрасным источником протаминов, например, сальмином из спермы лосося, клупеином из спермы сельди, иридином из спермы форели, стурином из спермы осетра и скомбрином из спермы макрели. Протамин, протаминсульфат, протаминфосфат и ядра спермы легко доступны от Sigma-Aldrich. Другие подходящие полиамины, такие как путресцин, спермидин и спермин, вместе с их физиологически приемлемыми солями также легко доступны, например, от Sigma-Aldrich. Конденсирующий агент может также включать в себя мультивалентные катионы или их физиологически приемлемые соли. Такие мультивалентные катионы включают в себя, например, хлорид гексамино-кобальта (III) (Cohex), хлорид трис-(этилендиамин)кобальта (III) (Coen) и хлорид сепульхратокобальта (III) (Cosep). Подходящие физиологические соли включают перечисленные выше в отношении катионных полимеров. В данной области техники известен ряд тестов, которые могут быть применимы для идентификации агентов, конденсирующих нуклеиновую кислоту. В них обычно исследуются изменения свойств тестируемой молекулы нуклеиновой кислоты, когда изменения связаны с процессом конденсации, например,сжатие нуклеиновой кислоты до твердого состояния, нейтрализация заряда молекулы нуклеиновой кислоты или скрытие или блокирование ранее доступных сайтов узнавания агентов, таких как эндонуклеазы и транскрипционные факторы. Тесты, применимые для оценки конденсации жидких составов нуклеиновой кислоты, включают в себя, не ограничиваясь этим, микроскопию с электронным и атомным разрешением, определение размера частиц, зета-потенциала, спектрофлуорометрический тест, тест по исключению бромида этидия, сдвиг в геле, круговой дихроизм и ядерный магнитный резонанс. Примерами используемых литературных ссылок являются J. Mol Biol (1978) 121, 311-326; Biophysical Journal (1996), 70, 2847-2856, Nucleic AcidsRes (1999) 27(8), 1943-1949; J. Amer. Chem. Soc, (1998) 120 (35), 8903-8909; J. Pharm Sci (1998) 87(6), 678683 и Int. J. Pharm (2000) 210 (1-2), 97-107. Хелатирующий агент для применения в настоящем изобретении хелатирует ионы металлов из раствора. Обычно встречающиеся ионы металлов для хелатирования включают ионы Fe2+, Fe3+, Cr3+, Ca2+ иNa+. Предпочтительно агент хелатирует ионы Ca2+ и Na+. Альтернативно, предпочтительно, чтобы агент хелатировал ионы Fe2+ и Fe3+. Агент может быть моно- или мультидентатным. Например, подходящие агенты включают в себя, не ограничиваясь этим, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), нитрилотриуксусную кислоту (NTA), инозитгексафосфат,триполифосфат, полифосфорную кислоту, сукцинат натрия, сукцинат калия, сукцинат лития, малат натрия, малат калия, малат лития, десфераль и этилендиаминди(о-гидроксифенилуксусную) кислоту (EDDHA). Обычно применяют ЭДТА, DTPA или десфераль, в особенности ЭДТА или его соль, например динатриевую соль ЭДТА. Предпочтительно также, чтобы нуклеиновая кислота наносилась на инертные металлические частицы-носители в присутствии одного или более дисахаридных и/или трисахаридных сахаров. Один или более сахаров помогает увеличить стабильность нуклеиновой кислоты/металлической частицы. Подходящие сахара включают в себя, не ограничиваясь этим, сахарозу, монолаурат сахарозы, трегалозу, лактозу, раффинозу и маннит. Предпочтительно, чтобы сахар выбирали из трегалозы, сахарозы,лактозы и раффинозы. В одном осуществлении применяют смесь одного или более дисахаридных или трисахаридных сахаров. Например, может быть использована смесь из одного или более сахаров, перечисленных выше. Особенно предпочтительна смесь сахароза/раффиноза. Обычно смесь сахароза/раффиноза перемешивают в отношении 3:1 мас.:мас. Нуклеиновая кислота может быть нанесена на инертные металлические частицы-носители также в присутствии одной или более солей. Одна или более солей обеспечивают еще дополнительную стабильность. Соль является дополнением к любой соли, которая может быть применена согласно изобретению в качестве хелатирующего агента. Следовательно, соль, на которую ссылаются, в целом представляет собой нехелатирующую соль. Например, соль обычно не является малатом или сукцинатом. Соль явля-8 010881 ется также дополнением к физиологически приемлемой соли, которая может быть использована согласно изобретению в качестве агента, конденсирующего нуклеиновую кислоту. В предпочтительном осуществлении одна или более солей выбраны из хлоридов, ацетатов, цитратов, нитратов, фосфатов и сульфатов. Подходящие соли включают в себя, не ограничиваясь этим, ацетат калия, хлорид кальция, хлорид лития, ацетат натрия, нитрат магния, цитрат натрия, фосфат натрия, хлорид натрия, сульфат натрия и сульфат калия. Предпочтительно солью является ацетат калия. В предпочтительном осуществлении частицы, несущие нуклеиновую кислоту, контактируют с антиоксидантом, таким как этанол или витамин А, витамин С или витамин Е. Обычно обработка частиц антиоксидантом увеличивает стабильность. Обычная обработка может включать в себя промывку частиц антиоксидантом. В одном осуществлении один или более компонентов, применяемых при получении частиц, становятся включенными или связанными с полученной частицей. Соответственно, предлагаются частицы,пригодные для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки, включающие или иногда состоящие, по существу, из частиц-носителей из инертного металла, имеющих на своей поверхности нуклеиновую кислоту, агент, хелатирующий ион металла, и один или более из следующих компонентов:(ii) одного или более дисахаридных и/или трисахаридных сахаров; и(iii) одной или более солей. Каждый из компонентов частицы представляет собой описанное выше. Предпочтительно частицы включают в себя, по меньшей мере, (i) и/или (ii). В изобретении также предлагается способ получения частиц согласно изобретению. Способ включает в себя или в некоторых осуществлениях состоит, по существу, из:(i) осаждения нуклеиновой кислоты на частицах-носителях из инертного металла в присутствии агента, конденсирующего нуклеиновую кислоту, и агента, хелатирующего ион металла; и(ii) сбора полученных частиц. Обычно стадия (i) включает в себя контактирование нуклеиновой кислоты с частицами-носителями из инертного металла в присутствии агента, конденсирующего нуклеиновую кислоту, и агента, хелатирующего ион металла, путем смешивания. Предпочтительно непрерывно встряхивать смесь в процессе контактирования для обеспечения однородности реакционной смеси. Предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота и агент, конденсирующий нуклеиновую кислоту, были отделены друг от друга (например,были в отдельных растворах) до того времени, пока не должна осуществиться конденсация, например, до того как будут присутствовать частицы-носители и также хелатирующий агент. Особенно предпочтительно добавлять конденсирующий агент к смеси, уже содержащей частицы-носители и нуклеиновую кислоту, во избежание преждевременного осаждения нуклеиновой кислоты. Агент, хелатирующий ион металла, может затем находиться в препарате конденсирующего агента и/или смеси частиц-носителей и нуклеиновой кислоты. Конденсирующий агент может быть добавлен постепенно, например по каплям. Альтернативно, смесь конденсирующего агента и частиц-носителей может быть смешана с препаратом нуклеиновой кислоты. Частицы металла, нуклеиновая кислота, агент, конденсирующий нуклеиновую кислоту, и хелатирующий агент описаны выше. Смесь на стадии осаждения может дополнительно включать в себя один или более дисахаридных и/или трисахаридных сахаров, например сахарозу, монолаурат сахарозы, трегалозу, лактозу, раффинозу или маннит или их сочетание. Предпочтительно сахар выбирают из трегалозы, сахарозы, лактозы и раффинозы или их сочетания. Может быть применена смесь из одного или более дисахаридных и/или трисахаридных сахаров. Например, может быть использована смесь из одного или более из указанных выше сахаров. Особенно пригодна смесь сахароза:раффиноза в отношении 3:1 мас.:мас. Осаждаемая смесь может также включать в себя одну или более солей. Соль является дополнением к любой соли, которая может быть применена согласно изобретению в качестве хелатирующего агента. Следовательно, соль, на которую ссылаются, в целом представляет собой нехелатирующую соль. Например, соль обычно не является малатом или сукцинатом. Соль является также дополнением к любой физиологически приемлемой соли, которая может быть использована согласно изобретению в качестве агента, конденсирующего нуклеиновую кислоту. В предпочтительном осуществлении одна или более солей выбраны из хлоридов, ацетатов, цитратов, нитратов, фосфатов и сульфатов. Подходящие соли включают в себя, не ограничиваясь этим, ацетат калия, хлорид кальция, хлорид лития, ацетат натрия, нитрат магния, цитрат натрия, фосфат натрия, хлорид натрия, сульфат натрия и сульфат калия. Обычно соль не является фосфатом алюминия. Предпочтительно солью является ацетат калия. Сахар и/или соль могут присутствовать в одном или обоих исходных препаратах для смешивания,например, в препарате конденсирующего агента или в препарате частиц-носителей/нуклеиновой кислоты. В одном осуществлении раствор, содержащий предопределенные количества агента, конденсирующего нуклеиновую кислоту, сахар и агент, хелатирующий ион металла, добавляют по каплям к рас-9 010881 твору, содержащему предопределенные количества металлических частиц-носителей, нуклеиновой кислоты, сахара и агента, хелатирующего ион металла. Соль может присутствовать в одном из растворов или в обоих растворах. Концентрации компонентов на стадии (i) могут варьироваться без существенного влияния на стабильность нуклеиновой кислоты в полученных частицах. Металлические частицы-носители могут присутствовать в любом подходящем количестве, например, в суспензии от 0,1 до 100 мг/мл, такой как от 0,1 до 10 мг/мл или от 1 до 10 мг/мл. Предпочтительно, чтобы концентрация нуклеиновой кислоты была от 0,01 до 10 мг/мл, такая как от 0,1 до 1 мг/мл. Обычно конденсирующий агент находится в концентрации от 0,1 до 10 мг/мл, например от 0,1 до 1 мг/мл. Предпочтительно концентрация агента, хелатирующего ион металла, составляет от 0,1 мМ до 1 М, такая как от 1 мМ до 0,1 М, например от 10 до 50 мМ. Сахар, если он присутствует, может находиться, например, в концентрации от 0,1 мг/мл до 1 г/мл, предпочтительно от 1 мг/мл до 0,1 г/мл, например от 10 до 50 мг/мл. Соль, если она присутствует, находится обычно в концентрации от 0,1 мМ до 1 М, например от 1 мМ до 0,1 М, такой как от 10 до 50 мМ. Способ согласно изобретению может дополнительно включать контактирование частиц, покрытых нуклеиновой кислотой, с антиоксидантом. Обычно данная обработка включает промывание частиц раствором антиоксиданта. Например, может быть использован этанол. Предпочтительно этанол насыщен сахарозой. Другие подходящие антиоксиданты включают витамин А, витамин С и витамин Е. Дополнительно или альтернативно частицы, покрытые нуклеиновой кислотой, могут быть промыты один или более раз водным или спиртовым раствором, таким как вода или изопропанол. Покрытые, необязательно промытые частицы могут быть перенесены на подходящие мембраны, и им дают высохнуть перед применением, они могут быть нанесены на поверхности модуля образца или кассеты или введены в кассету для доставки при применении, в частности, в приборах для опосредуемой частицами доставки. Может быть применен любой подходящий способ высушивания. Предпочтительно,чтобы высушивание выполняли в потоке азота. Частицы согласно изобретению могут быть упакованы в виде единичных лекарственных форм или в контейнеры для множественных доз. Такие контейнеры могут включать герметически запаянный контейнер, заключающий в себе подходящее количество частиц. Частицы могут быть упакованы в виде стерильного состава, и герметически запаянный контейнер может быть, таким образом, создан для сохранения стерильности состава до его применения при доставке субъекту. Контейнеры предпочтительно адаптированы для непосредственного применения в устройстве для опосредуемой частицами доставки. Обычно такие контейнеры имеют форму капсул, мешочков из фольги, саше, кассет и тому подобное. Могут также предлагаться устройства для доставки частиц в предварительно нагруженном состоянии,содержащие подходящую дозу покрытых частиц. Предварительно нагруженное устройство может затем также быть предварительно упаковано в герметически запаянный контейнер. Контейнер, в который упакованы частицы, может быть дополнительно снабжен этикеткой для идентификации композиции и обеспечения информацией, относящейся к дозировке. Кроме того, контейнер может быть снабжен этикеткой с указаниями в форме, предписанной государственным органом, например, Администрацией по контролю за продуктами питания и лекарствами, где в указаниях представлено одобрение органами федеральной власти производства, применения или продажи содержащегося там препарата нуклеиновой кислоты для введения человеку. В данной области известны устройства для ускорения частиц, подходящие для доставки, опосредуемой частицами. В устройствах в виде струйной генной пушки применяют взрывчатый, электрический или газообразный разряд для продвижения покрытых частиц-носителей к клеткам-мишеням. Покрытые частицы-носители могут быть присоединены с возможностью высвобождения к движимому листуносителю или присоединены с возможностью удаления к поверхности, вдоль которой проходит поток газа, поднимающий частицы с поверхности и ускоряющий их движение в направлении мишени. Пример устройства с газовым разрядом описан в патенте США 5204253. Устройство взрывчатого типа описано в патенте США 4945050. Один пример прибора с электрическим разрядом, подходящего для применения здесь, описан в патенте США 5120657. Другой прибор с электрическим разрядом описан в патенте США 5149655. Раскрытие всех данных патентов включено здесь во всей их полноте в качестве ссылки. Покрытые частицы согласно изобретению могут быть также введены с применением устройства с безыгольным шприцем, таким как описано в патенте США 5630796, выданном на имя Bellhouse et al.("thePowderJect needleless syringe device"), и в международных публикациях WO 94/24263,WO 96/04947, WO 96/12513 и WO 96/20022, все из которых включены в данное описание в виде ссылки. Устройства, такие как описано в патенте США 5630796, могут быть предложены в виде аппарата в форме ручки, содержащего двигающийся в линейном порядке от верха к дну газовый цилиндр, кассету или упаковку с частицами и ультразвуковую форсунку, соединенную с глушителем. Частицы предлагаются в подходящем контейнере, например кассете, образованной двумя разрываемыми полимерными мембранами, которые припаяны при нагревании к дискообразному спейсеру с образованием самосодержащей запаянной единицы. Мембранные материалы могут быть отобраны для достижения конкретного способа открытия и разрывного давления, которое диктуют условия, при которых инициируется ультра- 10010881 звуковой поток. При работе устройство приводится в действие для высвобождения сжатого газа из цилиндра в расширенную камеру в пределах устройства. Высвобожденный газ контактирует с кассетой с частицами и,когда создается достаточное давление, внезапно разбивает мембраны кассеты, увлекая частицы в ультразвуковую форсунку для последующей доставки. Форсунка создана для достижения конкретной скорости газа и паттерна потока для доставки количества частиц к поверхности-мишени предварительно определенной области. Глушитель применяют для ослабления шума, производимого ультразвуковым потоком газа. В системе доставки, описанной в международной публикацииWO 96/20022, также применяется энергия источника сжатого газа для ускорения и доставки порошкообразных композиций. Однако она отличается от системы патента США 5630796 использованием в ней ударной взрывной волны вместо потока газа для ускорения частиц. Более конкретно, мгновенный подъем давления, обеспечивающий ударную взрывную волну, генерируемый позади гибкого колпака, ударяет в спину колпака, вызывая внезапный выворот гибкого колпака в направлении поверхности-мишени. Данный внезапный выворот катапультирует порошкообразную композицию (которая расположена на внешней стороне колпака) при достаточной скорости, таким образом, давая импульс для проникновения в ткань-мишень, например, ткань слизистой ротовой полости. Порошкообразная композиция высвобождается в момент полного выворота колпака. Колпак также служит для полного сдерживания потока газа под высоким давлением, который,следовательно, не входит в контакт с тканью. Так как газ не высвобождается в течение работы данной системы доставки, система является, по существу, бесшумной. Данный дизайн может быть использован в других закрытых или другим образом восприимчивых применениях, например, для доставки частиц к минимально инвазивным хирургическим областям. Покрытые частицы согласно изобретению могут быть доставлены in vivo непосредственно субъекту или ex vivo в клетки, отобранные у субъекта, причем трансформированные клетки затем повторно имплантируются субъекту. Для доставки in vivo обычно частицы вводят подкожно, эпидермально, интрадермально, внутрь слизистых (например, интраназально, ректально и/или вагинально), внутрибрюшинно,внутривенно, перорально или внутримышечно. Предпочтительно, чтобы доставка осуществлялась к окончательно дифференцированным клеткам; однако, частицы могут быть также доставлены к недифференцированным или частично дифференцированным клеткам, таким как стволовые клетки крови и фибробласты кожи. Наиболее предпочтительно, чтобы доставка осуществлялась к эпидермальным клеткам кожи. Покрытые частицы вводят субъекту способом, совместимым с составом лекарственной формы и в количестве, которое должно быть профилактически и/или терапевтически эффективным. Терапевтически эффективное количество композиций частиц согласно изобретению должно быть достаточным для осуществления лечения или профилактики симптомов заболевания или состояния и должно попадать в относительно широкий диапазон, который может быть определен с помощью обычных испытаний. Обычно частицы доставляются в количестве от 0,001 до 1000 мкг, более предпочтительно от 0,01 до 10,0 мкг нуклеиновой кислоты на дозу. Однако точное необходимое количество будет варьироваться в зависимости от возраста и общего состояния индивида, подвергаемого лечению, и конкретной выбранной нуклеотидной последовательности, а также от других факторов. Подходящее эффективное количество может быть легко определено при клинических испытаниях. В целях определения необходимого количества полезны Physicians Desk Reference и Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics. С. Экспериментальная часть. Ниже представлены примеры конкретных осуществлений для реализации способов согласно изобретению. Примеры предназначены лишь для целей иллюстрации и не предназначены для какого бы то ни было ограничения объема настоящего изобретения. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении применяемых чисел (например, количеств, температуры и т.д.), однако, разумеется, в их отношении допустимы определенная экспериментальная погрешность и отклонение. Пример 1. Был проведен ряд экспериментов для оценки действия различных сахаров, хелатирующих агентов и других наполнителей/добавок в трех составах частиц ДНК/золото: "DSEP" (эксперимент А), "поли Arg"(эксперимент В) и "модифицированный спермидин" (эксперимент С). Различные частицы оценивали согласно одному или более из следующих критериев:(i) выход ДНК на частицах измеряли путем элюции и спектрофотометрически при А 260 или флуориметрически;(ii) физическую стабильность ДНК на частицах оценивали путем анализа в геле или с помощью ВЭЖХ;(iii) агломерацию частиц оценивали с помощью световой микроскопии или путем включения в гель;(iv) активность ДНК на частицах оценивали путем измерения экспрессии люциферазного репортерного гена в клетках СНО после введения в клетки частиц, несущих данный ген;(v) иммунный потенциал частиц оценивали, определяя титры антител сыворотки мышей, причем- 11010881 мышей вакцинировали частицами, несущими ДНК, кодирующую антиген, с которым специфически связывается антитело. Для каждого состава частицы ранжировали в соответствии с указанными выше критериями. Эксперимент А. Состав DSEP. Частицы получали согласно следующей формуле: частица золота - ДНК - сахар - соль - прочее Тестируемые сахара выбирали из монолаурата сахарозы, трегалозы маннита, лактозы, раффинозы и монокапрата сахарозы. Тестируемые соли выбирали из ацетата калия, хлорида кальция, хлорида лития,ацетата натрия, нитрата магния, цитрата натрия, фосфата натрия, фосфата алюминия, хлорида натрия,сульфата натрия и хлорида магния. Были использованы различные сочетания сахаров и солей, как изложено ниже. Оценивали также действие промывки этанолом, насыщенным сахарозой. Результаты приведены ниже с ранжированием различных сахаров или солей по каждому критерию от наиболее эффективного или желаемого до наименее эффективного. Например, наиболее ценные сахара в отношении выхода ДНК обеспечивают относительно высокий выход ДНК; наиболее ценные сахара в отношении агломерации обеспечивают относительно низкий уровень агломерации.(i) Выход ДНК на частицах. Сахар: сахароза-сахароза. Монолаураттрегалозалактозараффинозамонокапрат сахарозы (отсутствие выхода). Соль: ацетат калияхлорид кальцияхлорид литияацетат натриянитрат магнияцитрат натрияфосфат натрияфосфат алюминия. Прочее: промывка этанолом, насыщенным сахарозой, не удаляет ДНК с порошка золота. Отсутствие любой соли значительно снижает выход.(ii) Физическая стабильность ДНК на частицах. Сахар: сахарозатрегалозаманитлактозараффинозамонолаурат сахарозымонокапрат сахарозы. Соль: ацетат калияацетат натрияцитрат натрияфосфат натрияхлорид натриясульфат натрияхлорид лития. Прочее: промывка этанолом, насыщенным сахарозой, способствует стабильности. Фосфат алюминия предотвращает преципитацию.(iv) Экспрессирующая активность ДНК на частицах. Сахароза/ацетат натрияацетат калия/раффинозасахароза/нитрат магнияацетат калия/монолаурат сахарозы.(v) Иммунный потенциал у мышей. Для формул, стареющих в реальном времени при хранении при комнатной температуре: Сахароза/ацетат натрияспермидин/CaCl2 частицы нуклеиновой кислоты через 3 месяца. Раффиноза/ацетат калиямонолаурат сахарозы/ацетат калияспермидин/CaCl2 частицы нуклеиновой кислоты через 1 месяц. Эксперимент В. Состав поли Arg. Частицы получали согласно следующей формуле: частица золота - ДНК - сахар - хелатирующий агент - полиаргининовый пептид Тестируемые сахара выбирали из трегалозы, сахарозы и раффинозы. Тестируемые хелатирующие агенты выбирали из ЭДТА, DTPA и десфераля (DFO). Тестируемые полиаргининовые пептиды выбирали из полиаргинина с мол. мас. 13000, (Arg)6 и (Arg)4. Тестировали разные сочетания сахара, хелатирующего агента и полиаргинина. Результаты показаны ниже, вновь ранжированные в порядке от наиболее желаемого компонента до наименее желаемого или эффективного.(i) Выход ДНК на частицах. Тестированные сахара: трегалоза, сахароза, раффиноза. Хелаторы: ЭДТА, DTPA, десфераль (DFO). Прочее: поли-Arg пептиды, с мол. мас. 13000, (Arg)6 либо (Arg)4. Выходы для всех сочетаний указанного выше превышали 50% от теоретического выхода.(ii) Физическая стабильность ДНК на частицах. Сахар: сахарозатрегалозараффиноза. Хелаторы: ЭДТАDTPAдесфераль (DFO). Прочее: Все поли-Arg-пептиды давали сходную стабильность.(iii) Агломерация. Для данного состава проблемы не существует.(iv) Экспрессирующая активность ДНК на частицах. Трегалоза/ЭДТА/(Arg)4 трегалоза/DTPA/(Arg)4. Частицы, полученные с применением ДНК, частиц золота и спермидина, показали сходный с данными составами уровень экспрессирующей активности.(v) Иммунный потенциал у мышей. Сахароза/ЭДТА/(Arg)4 трегалоза/ЭДТА/(Arg)4 трегалоза/DTPA/(Arg)4 сахароза/DTPA/(Arg)4. Частицы, полученные с применением ДНК, CaCl2, частиц золота и спермидина, показали иммунный потенциал, сходный с таковым частиц трегалоза/ЭДТА/(Arg)4. Эксперимент С. Модифицированный состав спермидина. Частицы получали согласно следующей формуле: частица золота - ДНК - спермидин - сахар - соль - прочее Тестируемые сахара выбирали из сахарозы, трегалозы и раффинозы. Тестируемые соли выбирали из хлорида магния, нитрата магния, хлорида кальция, сульфата натрия, сульфата калия и бромида натрия. Тестировали также влияние концентрации спермидина и обработку частиц определенными растворами вода/спирт. Результаты показаны ниже.(i) Выход ДНК на частицах. Сахара: раффинозатрегалозасахароза. Соли: MgCl2MgNO3CaCl2 сульфат натриясульфат калиябромид натрия. Прочее: На выход также влияют концентрация спермидина и % смеси спирт/вода.(ii) Физическая стабильность ДНК на частицах. Сахара: раффинозатрегалозасахароза. Соли: MgCl2MgNO3CaCl2 сульфат натриясульфат калиябромид натрия.(iii) Агломерация. Для данного состава проблемы не существует. Пример 2. Исследование стабильности различных покрытых ДНК частиц. Покрытые частицы получали с применением различных соотношений протаминсульфата, ЭДТА,воды и одного из трегалозы, сахарозы или лактозы. Частицы получали в соответствии с десятью различными соотношениями, как изложено в десяти формулах в табл. 1. Стабильность частиц, полученных в соответствии с каждым из соотношений, тестировали при 4 и 60 С при временных интервалах 0, 7 и 14 дней. Способ. Для каждого соотношения готовили пробирки А и В согласно табл. 1. Содержимое пробирок А и В встряхивали с высокой скоростью в течение 10 с или до тех пор, пока каждый раствор не был хорошо перемешан. При встряхивании пробирки А со средней скоростью добавляли по каплям содержимое пробирки В с помощью 5-мл пипетки. Пробирку А встряхивали еще в течение 15 с и содержимое отстаивали в течение 5 мин. Супернатант пробирки А удаляли и оставшийся осадок промывали однократно 1 мл 100% изопропанола. Содержимое пробирки встряхивали и осаждали. Изопропанол удаляли и осадок сушили до порошка с помощью струи азота. 3-5 мг каждого из препаратов частиц отвешивали в 1,5-мл микроцентрифужные пробирки для инкубации при 4 или 60 С. Стабильность ДНК в каждом из препаратов частиц тестировали через 0, 7 и 14 дней с помощью электрофореза в агарозном геле и ВЭЖХ. Результаты. Препараты частиц показали сходную стабильность на протяжении тестирования. Частицы, полученные согласно соотношению 4 (формула 4, табл. 1), были выбраны для последующей работы.- 13010881 Таблица 1 Экспериментальная величина DOE, использованная для оптимизации концентраций сахара и ЭДТА для получения частиц Числа наверху таблицы представляют собой конечную концентрацию сахара и ЭДТА в каждой пробирке. Числа внутри таблицы представляют собой количество мкл каждого компонента, добавленное в пробирку. Пример 3. Дополнительные исследования стабильности на основе частиц, полученных согласно соотношению 4 (формула 4). Частицы получали, как в примере 2 и в соответствии с соотношением 4 табл. 1, но в большем масштабе (350 мг частиц золота) и с одним из следующих компонентов:(d) лактозой. Частицы инкубировали при 4 и 60 С, и стабильность ДНК на частицах оценивали через 8 недель с помощью электрофореза в агарозном геле. Пример 4. Создание тетрааргининовых составов. После апробации нескольких составов для проверки того, что полиаргинины различной длины обладают способностью осаждать ДНК на микрочастицы золота, был проведен эксперимент для выяснения того, какова должна быть длина применяемого полиаргинина, посредством изучения выхода и стабильности. Также исследовали выбор сахара и хелатирующего агента, которые, как было показано ранее, повышают стабильность в предшествующих составах. Результаты показали, что полиаргинины из 4 и 6 мономеров обладают большей стабилизирующей активностью по сравнению с полимером с молекулярной массой 13000 (приблизительно 80 мономеров). Исследованные сахара и хелатирующие агенты действовали кооперативно. И трегалоза, и сахароза были эффективными сахарами. Хорошими хелатирующими агентами были и ЭДТА, и DTPA. Тетрамер аргинина был выбран вследствие его, по-видимому, более быстрой диссоциации от ДНК, а также благодаря тому, что он, вероятно, образует меньшее количество продуктов деградации по сравнению с 6-мером. Полученные составы для дальнейшего изучения были названы ТА 101.1 (ДНК, сахароза, ЭДТА), ТА 101.2(ДНК, сахароза, DTPA), TA101.3 (ДНК, трегалоза, ЭДТА), ТА 101.4 (ДНК, трегалоза, DTPA). Данные четыре состава помещали на длительное хранение и сравнивали друг с другом и с контролем спермидин/CaCl2 (в котором спермидин и хлорид кальция применяли для осаждения ДНК на микрочастицах золота) при 4, 25 и 40 С. Их стабильность показана в табл. 2. Данные составы также тестировали в отношении биологической активности в исследовании на мышах и в экспериментах по экспрессии люциферазы (люциферазы, кодируемой ДНК). Таблица 2 Скорость разложения серии 101 (полосы SC)- 14010881 Эксперименты по активности показали, что все серии 101 являются активными, экспрессирующими и приблизительно равными спермидину/CaCl2. Стабильность составов ТА 101.1 и ТА 101.3 была выше,чем ТА 101.2 и ТА 101.4. Это свидетельствует о том, что хелатирующий агент ЭДТА оказывал большее стабилизирующее действие по сравнению с DTPA, но разница между трегалозой (3 и 4) и сахарозой (1 и 2) в составе данных порошков была небольшой. Композиции состава серии 101 с составами тетрааргинина показаны в табл. 3. Таблица 3 Композиции серии 101 После этого было произведено два эксперимента, в которых применяли насыщающие уровни трегалозы и ЭДТА в качестве окружения состава. На этом фоне применяли множественные уровни этанола. В данных составах использовалась идея о том, что близкие к насыщенным растворы могли бы осаждать на золото большее количество стабилизаторов. Состав можно было бы готовить при различных содержании воды и плотности путем изменения процента этанола. Состав, полученный в данных условиях, повидимому, является более стабильным по сравнению с серией 101 состава. Затем был предпринят эксперимент, предназначенный для оптимизации уровня этанола, ЭДТА,трегалозы и тетрааргинина. Эксперимент проводили таким образом, что варьирующие компоненты (тетрааргинин, EtOH, ЭДТА, трегалоза) применялись на пяти уровнях указанных диапазонов. Применяли смесь ДНК, которая содержала 10% кодирующей люциферазу ДНК. Это позволяло исследовать и стабильность, и активность в одном эксперименте. Оптимальный состав выбирали с учетом выхода, а также путем моделирования данных в соответствии с эмпирическими квадратными уравнениями, которые предсказывают стабильность и экспрессирующую эффективность во всем диапазоне эксперимента. Полученные составы для дальнейших исследований были обозначены как ТА 201.2, ТА 201.5, ТА 201.11 и ТА 201.15. Композиции данных четырех составов показаны в табл. 4. Данные композиции представляют собой композиции составов окружения, т.е. не являются конечными порошками. В табл. 3 показано, что в данных составах применяется этанол при высоком процентном содержании в растворителе. Основная разница между 201.5 и 201.11 заключается в уровне трегалозы, но уровень тетрааргинина в 201.5 также в три раза выше. Единственным различием между 201.2 и 201.15 является наличие ЭДТА в 201.15. Состав ТА 201.5 представляет собой оптимальный состав в соответствии с программой оптимизации при одновременной оптимизации по критериям экспрессии и стабильности. ТА 201.11 представляет собой оптимальный состав при оптимизации состава только по стабильности. Другие составы представлены для сравнения. ТА 201.2 был наиболее экспрессируемым составом и был включен в дальнейшие исследования в качестве высокой планки отсчета в экспериментах по активности. ТА 201.15 служил центральной точкой отсчета в эксперименте и составлялся много раз. Таким образом, данный состав имел наиболее воспроизводимые данные по стабильности и активности и служил в качестве хорошего маяка для выявления воспроизведения тенденций как таковых при дальнейшем изучении состава. Таблица 4 Композиции серии 201 Составы ТА 201.5, ТА 201.15 и ТА 201.11 были очень стабильны. Действительно, измерение скорости разложения при 25 С не могло быть произведено после 6 месяцев хранения. Температура была близка к условиям, которые можно было бы ожидать при хранении. Стабильность ТА 201.5 исследовали при более высоких температурах. Сравнение относительной скорости разложения при более высоких температурах указывает на относительную стабильность при более низких температурах. В табл. 5 показана стабильность составов при различных температурах.- 15010881 Таблица 5 Стабильность вариантов ТА при различных температурах Оценивали физическую токсичность составов ТА 201.5 и ТА 201.11 в отношении кожи. Побочных реакций не наблюдали. Исследовали активность белков, кодируемых ДНК составов. Наблюдали экспрессию люциферазы при применении ДНК, кодирующей люциферазу. В табл. 6 показаны результаты исследований на животных, когда использовали ДНК, кодирующую коровый антиген гепатита В (Cag) и поверхностный антиген гепатита В (Sag).- 16010881 Таблица 6 Краткое изложение исследований на животных Свежие, содержащие спермидин/CaCl2. Применяли также хранившиеся со спермидином/CaCl2 в М 110 и М.114. Данные результаты ясно показывают, что состав ТА 201.5 может конкурировать со спермидином/CaCl2 в плане тестов антител при ИФА и ELISPOT в ответ на ND5.5 трансфекцию у животных при дозе ДНК 2 мкг при введении 1 мг частиц-носителей. Состав проявлял постоянно большую или равную по сравнению со спермидином/CaCl2 эффективность в плане данных ELISPOT (по критерию МаннУитни). Измеряли конечную композицию состава ТА 201.5. В табл. 7 показаны общие диапазоны композиции, которые были измерены с применением порошков ТА 201.5. Таблица 7 Конечные общие композиции и диапазоны ТА 201.5 ЭДТА измеряли в ее 4(-) состоянии, выражали в виде массы данной формы (без натрия, воды или водорода, как наблюдается в F.W. во флаконе). В табл. 8 указаны вещества, которые применяли для получения тетрааргининовых составов. Для составления ТА 201.5 в масштабе 35 мг порошка золота применяли следующую процедуру. Оборудование. Весы; смеситель; аппарат для обработки ультразвуком; центрифуга; 2-мл эппендорфовские пробирки; дозатор на 1 мл, 200 мкл; струя воздуха. Получение реагентов. 11,3 мг/мл тетрааргинина (партия 523352): отвесить от 0,8 до 1,0 мг тетрааргинина. Добавить 88,5 мкл H2O на мг навески. Данный состав должен быть изменен для партий с другим составом. Раствор трегалозы: отвесить по меньшей мере 30 мг трегалозы (поставщик указан в перечне веществ). Добавить 120 мкл H2O на 30 мг навески или четырехкратное количество воды по отношению к трегалозе (по массе или в мкл, поскольку 1 мг/мкл). 500 мМ Na2 ЭДТА: данный состав может быть заказан в Sigma в виде раствора (см. перечень веществ для выяснения каталожного номера). Процедура. Пробирка В: подготовить пробирку В перед добавлением этанола и ДНК в пробирку А. Добавить раствор хелатирующего агента, раствор сахара, EtOH и раствор тетрааргинина. Перемешать с высокой скоростью в течение 10 c. Пробирка А: отвесить золото в пробирку. Добавить раствор хелатирующего агента и раствор сахара. Обработать ультразвуком в течение 30 c, перемешивать в течение 1 мин при высокой скорости. Добавить EtOH по каплям при перемешивании. Добавить раствор ДНК. После добавления ДНК добавить содержимое пробирки В в пробирку А, как описано ниже. Стадии составления: при перемешивании пробирки А со средней скоростью (при обеспечении смешивания золота с раствором) добавить по каплям содержимое пробирки В. После добавления всего содержимого пробирки В в пробирку А перемешивать пробирку А, содержащую конечный состав тетрааргинина, при высокой скорости в течение 1 мин. Дать составу осесть в течение 5 мин. Перемешать, затем центрифугировать в течение 10 c. Отсосать супернатант и оставить его для анализа. Промыть осадок 250 мкл этилового спирта. Перемешивать в течение 30 c, обработать ультразвуком в течение 3 с. Осадить осадок центрифугированием в течение 10 c и удалить этиловый спирт. Вновь промыть осадок 250 мкл этилового спирта. Перемешивать в течение 30 с, обработать ультразвуком в течение 3 c. Осадить осадок путем центрифугирования в течение 10 с и удалить этиловый спирт. Высушить осадок под струей воздуха при скорости 0,5 л/мин в течение 2 ч. Пробирка А и пробирка В: добавить по каплям содержимое пробирки В в пробирку А при перемешивании;- 18010881 перемешивать в течение 1 мин; дать осесть в течение 5 мин; центрифугировать 10 с и удалить супернатант; промыть этиловым спиртом, 250 мкл, перемешать 30 с, обработать ультразвуком 3 с, центрифугировать 10 с, удалить; промыть этиловым спиртом, 250 мкл, перемешать 30 с, обработать ультразвуком 3 с, центрифугировать 10 с, удалить; сушить под воздухом или азотом в течение 2 ч. При разработке формулы ТА 201.5 процедура составления была исходно создана для индивидуальных исходных растворов каждого из компонентов с последующим их добавлением в пробирку с составом в определенном порядке. Однако получение формулы в чистой комнате потребовало бы стадии стерильной фильтрации. Для выяснения необходимости в этом был осуществлен эксперимент со смешиванием главных составов (NB2334-80). При данной стратегии применяют смеси главных составов всех водных компонентов в пробирке А (главный состав А) и в пробирке В (главный состав В). Смеси затем фильтровали с помощью шприца для стерилизации, и отфильтрованное вещество поступало в пробирки для состава. В эксперименте со смешиванием главных составов производили сопоставление друг с другом порошков, полученных с помощью процедуры смешивания главных составов и стандартной процедуры, в плане стабильности и общей композиции. Таблица 9 Конечные композиции эксперимента со смешиванием главных составов Таблица 10 Стабильность главных составов по сравнению с нормальными Время полужизни в табл. 10 рассчитывали, усредняя два рассчитанных времени полужизни. Одно из них было получено на основании скорости распада нг SC (60 по сравнению с 4), а второе было получено на основании скорости распада % SC (60 по сравнению с 4). Поскольку две процедуры давали один и тот же конечный продукт, можно было бы рассматривать стратегию смешивания главных составов как непроблемную, и ее можно было бы использовать для составления порошка последующих порошков ТА 201.5. Для выяснения того, какие стадии процесса являются решающими, был проведен дополнительный эксперимент, касающийся процесса. Эксперимент. Составы 1-9 получали в масштабе 70 мг из одних и тех же исходных растворов. Смесь главного состава для пробирки А получали путем смешивания растворов ЭДТА, трегалозы и ДНК в соотношениях формулы и затем фильтровали с помощью шприца. Смесь главного состава для пробирки В получали путем смешивания растворов ЭДТА, трегалозы и тетрааргинина в соотношениях формулы и затем фильтровали с помощью шприца. Затем получали формулу 1 с помощью следующего процесса: Получение реагентов (для 10, 70 мг преп.). ДНК: исходные растворы плазмидной и кодирующей люциферазу ДНК получали при 1 мг/мл. Смешать два раствора ДНК при объемном отношении 9SC18:1 люцифераза. 1500 мкл SC18 + 166,7 мкл люциферазной ДНК. 11,3 мг/мл тетрааргинин: отвесить 20 мг тетрааргинина. Добавить 88,5 мкл H2O на мг навески. Раствор трегалозы: отвесить по меньшей мере 700 мг трегалозы. Добавить 140 мкл H2O на 35 мг навески или четырехкратное количество воды по отношению к трегалозе (по массе или в мкл, поскольку 1 мг/мкл).- 19010881 500 мМ ЭДТА: данный реагент может быть заказан на фирме Sigma в виде раствора (Кат. Е-7889). Объемные отношения главного состава А: 1500 мкл трегалозы, 562,5 мкл ЭДТА, 1500 мкл ДНК(1 мг/мл) Фильтровать через шприц главный состав А Объемные отношения главного состава В: 1500 мкл трегалозы, 562,5 мкл ЭДТА, 1500 мкл тетрааргинина Фильтровать через шприц главный состав В Пробирка А и пробирка В: добавить содержимое пробирки В в пробирку А по каплям при перемешивании; после добавления всего содержимого В перемешивать в течение 1 мин при высокой скорости; дать осесть в течение 5 мин; перемешать в течение 5 с, затем центрифугировать в течение 10 с, удалить супернатант; промыть EtOH, 500 мкл, перемешать 30 с, обработать ульразвуком 3 с, центрифугировать 10 с, удалить; повторить последнюю стадию 1 раз; сушить осадок под воздухом в течение 1 ч при 0,5 л/мин. Данный процесс представляет собой контрольное составление. В следующей таблице показаны вариации процесса для порошков 2-9. Остальной состав представлял собой формулу, в которой порядок добавления был изменен для оценки возможности смеси главного состава 1 для данного состава. Процесс был сходен с контрольным. Объемное отношение смеси главного состава: 400 мкл трегалозы, 150 мкл ЭДТА и 200 мкл тетрааргинина Фильтровать с помощью шприца смеси главного состава Формула 10 70 мг золота 525 мкл смеси главного состава 735 мкл EtOH по каплям при перемешивании обработать ультразвуком 30 с, перемешивать 10 с 140 мкл ДНК по каплям/медленно (с интервалом 5 с между каплями) при перемешивании После добавления всего содержимого В перемешивать в течение 1 мин при высокой скорости- 20010881 Отстаивать в течение 5 мин Перемешать в течение 5 с, затем центрифугировать в течение 10 с, удалить супернатант Промыть EtOH, 500 мкл, перемешать 30 с, обработать ультразвуком 3 с, центрифугировать 10 с,удалить Повторить последнюю стадию 1 раз Сушить осадок под воздухом в течение 1 ч при 0,5 л/мин Удаление жидкости с осадка после центрифугирования следует производить 1000-мкл пипеткой для удаления основной части жидкости, затем 200-мкл пипеткой для удаления оставшейся жидкости. Следует оставлять как можно меньше на порошке. Все порошки анализировали в отношении общего состава, стабильности, экспрессии люциферазы в клетках СНО и быстрого разделения в геле. Таблица 11 Композиции эксперимента по устойчивости процесса Таблица 12 Стабильность при 60 С эксперимента по устойчивости процесса Указанные выше числа рассчитывали по изменениям в нанограммах суперспирализованной ДНК из данных для состава на 13 и 20 дни. Времена полужизни были очень близки между собой. Это указывает на то, что процесс составления в плане стабильности является правильным. Формулы 5 и 7 обладали несколько лучшей стабильностью по сравнению с другими, но формулы 9 и 10 обладали явно выраженным преимуществом в стабильности(3X). Формулу 9 не промывали (и не подготавливали к процессу), а формула 10 была получена в результате изменения в порядке введения добавок. Данные по экспрессии показали, что формулы были очень сходны (300-400 кимп/с). Формулы со свежим спермидином/CaCl2 были более эффективны в экспрессии (или содержали большее количество экспрессированного вещества в момент анализа клеток), но проявляли также большее высвобождение массы. Формулы 10 и 7 имели некоторое преимущество в экспрессии люциферазы (450-600 кимп/с) по сравнению с другими формулами с тетрааргинином. В целом, эксперимент показал, что процесс является очень эффективным. Другим аспектом эффективности является изменение порядка введения добавок и процессов, применяемых для создания формулы. В одном таком осуществлении (NB2251-124) исследовали различные пути создания формулы с теми же самыми веществами (количество и концентрации). В данном эксперименте лишь проверялась стабильность формул, созданных для осаждения компонентов в различном порядке. Это могло бы предположительно оказать существенное влияние, поскольку ДНК могла бы осаждаться непосредственно на золото до, одновременно или после стабилизаторов.- 21010881 Процессы составления. 1. Подход с пробирками А и В. Пробирки А и В имеют одинаковый состав, за исключением того,что А содержит ДНК, а В содержит тетрааргинин. Обе хорошо перемешивают, и В добавляют к А по каплям. 2. Другой подход с пробирками А и В. На этот раз в пробирку А (с золотом) этанол добавляли до р-ра ДНК для предварительного покрытия золота избытком сахара перед добавлением ДНК. После этого в пробирку А добавляли ДНК, и затем немедленно в пробирку А добавляли содержимое пробирки В. 3. Данный подход был разработан для одновременного осаждения ДНК и стабилизаторов. Все компоненты, за исключением ДНК и этанола, добавляли в одну пробирку. Затем ДНК и этанол смешивали друг с другом и добавляли. 4. В данном процессе ДНК осаждали до добавления этанола. Все компоненты, за исключением ДНК, тетрааргинина и этанола, добавляли в одну пробирку. Данные последние компоненты добавляли в порядке ДНК, тетрааргинин и этанол, соответственно. 5. Процесс был таким же, что и 4, за исключением того, что тетрааргинин добавляли перед ДНК. Этанол оставался последним. Данные составы помещали в инкубаторы на 4 и 60 С и анализировали через 2 недели после составления. Не было больших различий между данными порошками по данным электрофореза в агарозном геле, хотя порошки 4 и 5 (последний этанол, комплексирование ДНК:ARG4 до этанола) были слегка более стабильны. Соответственно, были описаны новые, покрытые нуклеиновой кислотой частицы, пригодные для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки, процесс получения частиц и способы генной терапии и иммунизации нуклеиновой кислотой с применением частиц. Хотя предпочтительные осуществления рассматриваемого изобретения были весьма подробно описаны, следует понимать, что могут быть осуществлены очевидные вариации без выхода за пределы концепции и объема изобретения,определяемых прилагаемой формулой изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Частицы для доставки нуклеиновых кислот пациенту, представляющие собой частицы-носители из инертного металла, содержащие на своей поверхности нуклеиновую кислоту, гомополимер аргинина формулы (Arg)x, где x - целое число от 2 до 10, или его физиологически приемлемую соль и агент, хелатирующий ионы металла. 2. Частицы по п.1, где материал частиц-носителей выбран из золота, вольфрама, платины и иридия. 3. Частицы по п.2, где частицы-носители представляют собой частицы золота, имеющие диаметр приблизительно от 1 до 3 мкм. 4. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где нуклеиновая кислота на поверхности указанных частиц кодирует антиген. 5. Частицы по п.4, где антиген выбран из вирусных антигенов, бактериальных антигенов и грибковых антигенов. 6. Частицы по п.5, где антигеном является антиген вируса папилломы человека. 7. Частицы по п.5, где антигеном является антиген ВИЧ. 8. Частицы по п.5, где антигеном является антиген HSV2 или HSV1. 9. Частицы по п.5, где антигеном является антиген вируса гриппа типа А, В или С. 10. Частицы по п.5, где антигеном является антиген вируса гепатита В. 11. Частицы по любому из пп.1-3, где нуклеиновая кислота на поверхности указанных частиц кодирует терапевтический полипептид. 12. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. 13. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где гомополимер аргинина представляет собой (Arg)4 или (Arg)6. 14. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где агент, хелатирующий ион металла, выбран из этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA),нитрилотриуксусной кислоты (NTA), инозитгексафосфата, триполифосфата, полифосфорной кислоты,сукцината натрия, сукцината калия, сукцината лития, малата натрия, малата калия, малата лития, десфераля и этилендиаминди(о-гидроксифенилуксусной) кислоты (EDDHA). 15. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где один или более дисахаридных и/или трисахаридных сахаров присутствуют на поверхности частиц-носителей. 16. Частицы по п.15, где один или более сахаров выбраны из трегалозы, сахарозы, лактозы и раффинозы. 17. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где одна или более солей, выбранных из ацетата калия, хлорида кальция, хлорида лития, ацетата натрия, нитрата магния, цитрата натрия, фосфата натрия и хлорида магния, присутствуют на поверхности частиц-носителей.- 22010881 18. Частицы по любому из предшествующих пунктов, где на поверхности частиц-носителей присутствует антиоксидант. 19. Частицы по п.18, где антиоксидант выбран из этанола, витамина А, витамина С и витамина Е. 20. Частицы по п.1, которые получены путем осаждения ДНК на золотых частицах-носителях в присутствии ЭДТА и сахарозы. 21. Кассета для безыгольного шприца, содержащая частицы по любому из предшествующих пунктов. 22. Безыгольный шприц, наполненный частицами по любому из пп.1-20. 23. Способ получения частиц, пригодных для доставки из устройства для опосредованной частицами доставки, включающий в себя стадии:(i) осаждения нуклеиновой кислоты на частицах-носителях из инертного металла в присутствии гомополимера аргинина формулы (Arg)x, где x - целое число от 2 до 10, или его физиологически приемлемой соли и агента, хелатирующего ионы металла; и(ii) сбора полученных частиц. 24. Способ по п.23, где гомополимер аргинина добавляют на стадии (i) к смеси, содержащей частицы-носители и нуклеиновую кислоту. 25. Способ по п.23 или 24, где частицы-носители выбраны из частиц золота, вольфрама, платины и иридия. 26. Способ по п.25, где частицы-носители представляют собой частицы золота, имеющие диаметр приблизительно от 1 до 3 мкм. 27. Способ получения частиц по любому из пп.23-26, где нуклеиновая кислота на поверхности указанных частиц кодирует антиген. 28. Способ по п.27, где антиген выбран из вирусных антигенов, бактериальных антигенов и грибковых антигенов. 29. Способ по п.28, где антигеном является антиген вируса папилломы человека. 30. Способ по п.28, где антигеном является антиген ВИЧ. 31. Способ по п.28, где антигеном является антиген HSV2 или HSV1. 32. Способ по п.28, где антигеном является антиген вируса гриппа типа А, В или С. 33. Способ по п.28, где антигеном является антиген вирус гепатита В. 34. Способ по любому из пп.23-26, где нуклеиновая кислота кодирует терапевтический полипептид. 35. Способ по любому из пп.23-34, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. 36. Способ по любому из пп.23-35, где гомополимер аргинина представляет собой (Arg)4 или (Arg)6. 37. Способ по любому из пп.23-36, где агент, хелатирующий ионы металла, выбран из этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), инозитгексафосфата, триполифосфата, полифосфорной кислоты, сукцината натрия, сукцината калия, сукцината лития, малата натрия, малата калия, малата лития, десфераля и этилендиаминди(о-гидроксифенилуксусной) кислоты (EDDHA). 38. Способ по любому из пп.23-37, где стадию (i) дополнительно проводят в присутствии одного или более дисахаридных и/или трисахаридных сахаров. 39. Способ по п.38, где один или более сахаров выбраны из трегалозы, сахарозы, лактозы и раффинозы. 40. Способ по любому из пп.23-39, где стадию (i) дополнительно проводят в присутствии одной или более солей, выбранных из ацетата калия, хлорида кальция, хлорида лития, ацетата натрия, нитрата магния, цитрата натрия, фосфата натрия и хлорида магния. 41. Способ по любому из пп.23-40, где частицы, полученные на стадии (i), контактируют с антиоксидантом. 42. Способ по п.41, где антиоксидант выбран из группы, состоящей из этанола, витамина А, витамина С и витамина Е. 43. Способ по п.23, включающий в себя стадии:(i) осаждения ДНК на инертных частицах из золота в присутствии полиаргинина, ЭДТА и сахарозы и(ii) сбора полученных частиц. 44. Способ иммунизации нуклеиновой кислотой, включающий в себя:(а) обеспечение частицами, пригодными для доставки из устройства для опосредованной частицами доставки, причем частицы содержат частицы-носители из инертного металла, содержащие на своей поверхности нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген, гомополимер аргинина формулы (Arg)x, где x целое число от 2 до 10, или его физиологически приемлемую соль и агент, хелатирующий ионы металла; и(b) введение эффективного количества частиц субъекту. 45. Способ по п.44, где антиген выбран из вирусных антигенов, бактериальных антигенов и грибковых антигенов. 46. Способ по п.45, где антигеном является антиген вируса папилломы человека.- 23010881 47. Способ по п.45, где антигеном является антиген ВИЧ. 48. Способ по п.45, где антигеном является антиген HSV2 или HSV1. 49. Способ по п.45, где антигеном является антиген вируса гриппа типа А, В или С. 50. Способ по п.45, где антигеном является антиген вируса гепатита В. 51. Способ генной терапии, включающий в себя:(a) обеспечение частицами, пригодными для доставки из устройства для опосредованной частицами доставки, которое содержит частицы-носители из инертного металла, содержащие на своей поверхности нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтический полипептид, гомополимер аргинина формулы(Arg)x, где x - целое число от 2 до 10, или его физиологически приемлемую соль и агент, хелатирующий ионы металла; и(b) введение эффективного количества частиц субъекту. 52. Способ по любому из пп.44-51, где частицы-носители выбраны из частиц золота, вольфрама,платины и иридия. 53. Способ по п.52, где частицы-носители представляют собой частицы золота, имеющие диаметр приблизительно от 1 до 3 мкм. 54. Способ по любому из пп.44-53, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. 55. Способ по любому из пп.44-54, где гомополимер аргинина представляет собой (Arg)4 или (Arg)6. 56. Способ по любому из пп.44-55, где агент, хелатирующий ионы металла, выбран из этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), инозитгексафосфата, триполифосфата, полифосфорной кислоты, сукцината натрия, сукцината калия, сукцината лития, малата натрия, малата калия, малата лития, десфераля и этилендиаминди(о-гидроксифенилуксусной) кислоты (EDDHA). 57. Способ по любому из пп.44-56, где один или более дисахаридных и/или трисахаридных сахаров присутствует на поверхности частиц-носителей. 58. Способ по п.57, где один или более сахаров выбраны из трегалозы, сахарозы, лактозы и раффинозы. 59. Способ по любому из пп.44-58, где одна или более солей, выбранных из ацетата калия, хлорида кальция, хлорида лития, ацетата натрия, нитрата магния, цитрата натрия, фосфата натрия и хлорида магния, присутствует на поверхности частиц-носителей. 60. Способ по любому из пп.44-59, где антиоксидант присутствует на поверхности частицносителей. 61. Способ по п.60, где антиоксидант выбран из этанола, витамина А, витамина С и витамина Е. 62. Способ по пп.44-51, где частицы-носители получены путем осаждения ДНК на золотых частицах-носителях в присутствии ЭДТА и сахарозы.
МПК / Метки
МПК: A61K 39/00, A61K 9/00, A61K 38/02
Метки: нуклеиновой, кислотой, покрытые, частицы
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/25-10881-chasticy-pokrytye-nukleinovojj-kislotojj.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Частицы, покрытые нуклеиновой кислотой</a>
Химерный олигонуклеотидный праймер для способа амплификации нуклеиновой кислоты; продукт для амплификации нуклеиновой кислоты;зонд для способа детекции нуклеиновой кислоты-мишени; материал с иммобилизованной амплифицированной нуклеиновой кислотой и способ его получения; способ определения нуклеотидной последовательности
Номер патента: 7414
Опубликовано: 27.10.2006
Авторы: Уемори Такаси, Еноки Тацудзи, Сагава Хироаки, Асада Киезо, Кобаяси Ейдзи, Като Икуносин, Мукаи Хироюки, Ямамото Дзунко, Томоно Дзун
МПК: C12Q 1/68, C12N 15/09
Метки: амплификации, кислоты, получения, способа, продукт, иммобилизованной, способ, определения, праймер, кислотой, нуклеиновой, детекции, олигонуклеотидный, кислоты;зонд, химерный, кислоты-мишени, последовательности, материал, амплифицированной, нуклеотидной
Формула / Реферат:
1. Зонд, гибридизующийся с фрагментом, амплифицированным с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, выбранного из следующей группы: (a) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции энтерогеморрагической Escherichia coli, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 31-34, 47, 48, 51-53, 64-72, 84, 85, 113, 114, 130 и 131; (b) химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вироида, имеющий...
Покрытые оболочкой частицы гранулированного кристаллического ибупрофена
Номер патента: 2897
Опубликовано: 31.10.2002
Авторы: Шовё Шарль Андре, Демишели Жилль, Цуккарелли Жан-Марк, Жан Карина
МПК: A61K 9/50
Метки: частицы, гранулированного, кристаллического, оболочкой, ибупрофена, покрытые
Формула / Реферат:
1. Покрытые оболочкой частицы на основе гранулированных микрокристаллов ибупрофена, его изомеров и его фармацевтически приемлемых солей, отличающиеся тем, что они имеют покрытие состоящее из смеси, включающей A) от 5 до 50 мас.%, предпочтительно от 10 до 30 мас.% этилцеллюлозы относительно массы ибупрофена, Б) от 10 до 60 мас.%, предпочтительно от 15 до 50 мас.% гидроксипропилметилцеллюлозы относительно массы этилцеллюлозы, и B) от 0,1 до 40...
Модифицированный олигомер нуклеиновой кислоты, способ его получения, модифицированная проводящая поверхность, способ ее получения и способ электрохимического определения событий гибридизации олигомеров нуклеиновой кислоты
Номер патента: 3929
Опубликовано: 30.10.2003
Автор: Хартвих Герхард
МПК: C07H 21/00, C12Q 1/68
Метки: проводящая, гибридизации, модифицированная, получения, определения, поверхность, электрохимического, способ, модифицированный, олигомеров, событий, олигомер, кислоты, нуклеиновой
Формула / Реферат:
1. Олигомер нуклеиновой кислоты, модифицированный путем ковалентного присоединения группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, характеризующийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, включает, по меньшей мере, одну электронодонорную молекулу и, по меньшей мере, одну электроноакцепторную молекулу, причем электронодонорная молекула и электроноакцепторная молекула не связаны друг с...
Частицы термообработанного катализатора фишера-тропша
Номер патента: 3416
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Эспиноза Рафаэль Льюис, Шольтц Ян Хендрик, Гибсон Филип
МПК: B01J 23/745, C07C 1/04, C10G 2/00...
Метки: частицы, термообработанного, катализатора, фишера-тропша
Формула / Реферат:
1. Способ получения частиц самонанесенного осажденного катализатора на основе железа для применения в процессе Фишера-Тропша во взвешенном слое, отличающийся тем, что включает термообработку указанных частиц при температуре от 320 до 500шC и выдерживание их при температуре термообработки, по меньшей мере, 0,1 ч для придания указанным частицам устойчивости к разрушению и, таким образом, ингибирования образования мелких частиц при использовании. ...
Хранение и обнаружение нуклеиновой кислоты, нанесенной на твердый носитель
Номер патента: 10153
Опубликовано: 30.06.2008
Авторы: Де Бар Маринус Петрус, Де Роий Эстер Регина
МПК: C12Q 1/68, C12M 1/00, G01N 33/53...
Метки: носитель, кислоты, нанесенной, хранение, твердый, обнаружение, нуклеиновой
Формула / Реферат:
1. Способ обнаружения и количественного анализа представляющей интерес нуклеиновой кислоты по меньшей мере в одном образце, включающий нанесение указанного образца на твердый носитель, способный, по меньшей мере, частично абсорбировать указанный образец; сушку указанного носителя; обработку, по меньшей мере, репрезентативной части указанного носителя, содержащей по меньшей мере 100 мкл образца, раствором для выделения нуклеиновой кислоты для...
Предыдущий патент: Способ оценки характеристики области, расположенной между стенкой обсадной колонны и породой
Следующий патент: Таблетка ii прессованной жевательной резинки
Случайный патент: Способ генерирования псевдослучайной последовательности