Способ получения аденовирусных векторов

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ Луитдженс Альфред (NL), Льюис Джон Альфред (US) Медведев В.Н. (RU) Изобретение относится к способам крупномасштабного производства рекомбинантного аденовируса 35 с использованием перфузионных систем и инфекции при очень высоких величинах плотности клеток. Изобретение относится к области клеточных культур и получения аденовирусов. Конкретнее, оно относится к усовершенствованным способам культивирования клеток млекопитающих, инфицированию указанных клеток аденовирусом и получению из них аденовирусных частиц. Предпосылки изобретения Последние достижения в области ДНК-вакцинирования с использованием рекомбинантных вирусных векторов создали необходимость в крупномасштабном получении материала клинического качества. Требуется, чтобы способы могли обеспечивать слаборазвитые и самые отсталые страны третьего мира достаточными количествами вакцин на основе рекомбинантных аденовирусов для борьбы, например, с проблемой туберкулеза и малярии в мире. Оценка поколения новорожденных показывает, что, как ожидается, в 2010-2015 гг. в слаборазвитых и самых отсталых странах третьего мира будет более чем 150000000 рождений. На основании этого поколения новорожденных проектируемая ежегодная потребность в вакцине может достичь приблизительно 1,51019 вирусных частиц(http://esa.un.org/unpp/index.asppanel=2). Было описано несколько способов получения аденовирусов. В этих способах используются прикрепленные к субстрату клеточные культуры во вращающихся флаконах, клеточных фабриках (Nunclon, отNunc или CellStack, от Corning) или клеточных кубиках (Corning). Способы производства на прикрепленных к субстрату клеточных культурах не могут удовлетворить всемирную потребность в аденовирусных вакцинах. Поэтому клетки, используемые в способе на прикрепленных к субстрату клеточных культурах,адаптированы для суспензионных культур (например, линий клеток НЕК 293 и PER.C6). При использовании суспензионных культур можно увеличить производительность способов до крупномасштабных биореакторов. Суспензионные клеточные культуры для продукции аденовирусов обычно достигаются в масштабе от 3 до 20 л, и сообщалось об успешном наращивании масштаба до 100 л (Kamen et al., 2004), и 250 л (Xie et al., 2003). Сообщалось об экспериментах, в которых предвидится наращивание масштаба производства до 10000 л (Xie et al., 2003). Однако основным недостатком наращивания масштаба производства до 10000 л являются высокие капитальные вложения (САРЕХ), которые требуются для конструирования и построения биореакторной установки емкостью 10000 л. Кроме того, проект САРЕХ построения установки емкостью 10000 л в условиях BSL 2 (биологической безопасности 2 уровня) должен быть реализован до того, как станет известно, что продукт будет успешным (IV фаза и выше). По сообщениям общие затраты на инвестиции в установку биореактора 10000 л от 225000000 до 320000000 евро (Estape et al., 2006). Поэтому было бы желательно получение в более низком масштабе, например, в биореакторах 1000 л или меньше. При использовании существующих в настоящее время способов для достижения цели получения 1,51019 VP/год, необходимо получать более чем 150 партий в масштабе 1000 л. Поэтому существует потребность в усовершенствовании устройств для продукции аденовирусов, в увеличении выхода аденовирусных частиц для удовлетворения всемирной потребности в аденовирусных вакцинах, предпочтительно при не препятствующих затратах. Одной из проблем, встречающихся при оптимизации продукции аденовирусов, является так называемый "эффект клеточной плотности". При работе в серийном режиме некоторые ссылки свидетельствуют о существовании оптимальной плотности клеток при инфицировании для продукции аденовирусов. Оптимум находится в пределах 0,5-1106 клеток/мл (Maranga et al., 2005; Kamen et al., 2004). Для продукции аденовирусов (Ad5) в серийном барабанном биореакторе с перемешиванием было показано, что продуктивность вируса на клетку остается постоянной примерно до 0,9106 клеток/мл, но резко падает примерно при 1106 клеток/мл (Altaras et al., 2005). За пределами 2106 клеток/мл инфекционные частицы не выявлялись. Переломная точка, связанная с падением удельной производительности при плотности клеток при инфицировании, зависит от среды. Ни одна из выпускаемых в настоящее время промышленностью сред не проявила возможности поддержания высоких выходов вирусных частиц, в то же время поддерживая удельную производительность, оптимальную при величинах плотности клеток выше 1106 клеток/мл (Kamen et al., 2004). Причина этого падения пока не известна, но может быть связана с ограниченной доступностью питательных веществ для продукции вируса или может быть следствием высоких концентрации метаболитов, которые ингибируют продукцию вируса. Операции периодической подачи, подобные добавлению глюкозы, глутамина и аминокислот, обеспечивали возможность инфицирования при величинах плотности клеток до 2106 клеток/мл. Однако уровни производительности, достигаемые при высоких уровнях плотности клеток, были ниже, чем уровни производительности, получаемые инфицированием при величинах плотности клеток 1106 клеток/мл(Kamen et al., 2004). При перфузионных способах, клетки удерживаются в биореакторе полыми волокнами, спиновыми фильтрами или акустическими сепараторами, в то время как культуральная среда перфузируется через биореактор. При этих способах иногда могут достигаться величины плотности клеток 100106 клеток/мл (например, Yallop et al., 2005). Инфицированные перфузируемые клетки проявили преждевременную потерю клеток во время перфузии половолоконным устройством. Это может быть связано с их более высокой чувствительностью к сдвигу вследствие вирусной инфекции (Cortin et al., 2004). Гидродинамические напряжения, действующие в трубках, полых волокнах или перистальтическом насосе на более хрупкие, инфицированные клетки, вероятнее всего вызывали этот феномен. Поскольку инфицированные клетки более хрупкие, в частности, акустический сепаратор (Henry et al., 2004) был предложен как желательный, если перфузию предстоит поддерживать в течение всей фазы инфекции. Однако инфицирования, выполняемые в режиме перфузии, могут поддерживаться только для плотности клеток до 3106 клеток/мл при скорости перфузии 2 объема/сутки. Инфицирование при плотности клеток 6106 клеток/мл привело к пятикратному снижению удельной производительности (Henry et al., 2004). Несмотря на отмеченный другими авторами эффект плотности клеток, в одном сообщении (Yuk etal., 2004) описаны успешные перфузионные культуры человеческих опухолевых клеток в качестве основы для получения онколитических аденовирусных векторов. В указанном сообщении описан перфузионный способ с высокой плотностью клеток, в котором используется технология чередующегося тангенциального потока (ATF). При средней плотности жизнеспособных клеток при инфицировании 9106 клетокHeLaS3/мл наблюдался средний вирусный титр примерно 41011 VP/мл. Опухолевые клетки, использованные в указанном сообщении, не предпочтительны в качестве продукционных клеток, поскольку использование опухолевых клеток может представлять риски для безопасности, когда продуцируемые аденовирусные частицы предстоит вводить людям. Рекомбинантный аденовирус в указанном сообщении был основан на Ad5. Такие аденовирусы имеют ограниченные возможности для использования в качестве вакцин, поскольку большая часть населения содержит предсуществующие нейтрализующие антитела против Ad5, и поэтому рекомбинантные аденовирусы из других серотипов больше подходят для использования в качестве вакцин (см., например, WO 00/70071). В частности, рекомбинантные аденовирусы из подгруппы В, такие как Ad35, особенно предпочтительны для использования в качестве вакцин (WO 00/70071). Если и есть информация о крупномасштабном получении рекомбинантных аденовирусов из серотипов, отличных от Ad5, особенно для предпочтительного серотипа 35, то она ограниченная. Были описаны некоторые различия между Ad35 и Ad5 в отношении их очистки с использованием анионного обмена (например, см. WO 2005/080556). Несколько отличающиеся физические свойства рекомбинантных аденовирусов различных серотипов могут вызывать различия способов получения в определенных условиях. Такие потенциальные различия могут быть особенно важны при промышленном масштабе, где даже кажущиеся небольшие различия при небольшом масштабе могут иметь большие экономические последствия при масштабе, предусмотренном для продукции в количестве, удовлетворяющем годовую потребность во всемирном масштабе. Например, в настоящее время неизвестно, будет ли указанный эффект плотности клеток для Ad5 аналогичным для других серотипов. Поэтому для удовлетворения всемирной потребности в вакцинах rAd35 существует потребность в усовершенствовании систем для продукции серотипа 35 (rAd35) рекомбинантного аденовируса. Краткое описание сущности изобретения Заявители обнаружили, что выходы серотипа 35 (rAd35) рекомбинантного аденовируса дополнительно увеличивались, когда продуцирующие клетки инфицировались при величинах плотности выше 10106 жизнеспособных клеток/мл, в перфузионных культурах. Напротив, выходы рекомбинантного аденовируса серотипа 5 (rAd5) были ниже, когда продуцирующие клетки инфицировались при плотности 20106 или 30106 жизнеспособных клеток/мл, по сравнению с инфицированием при плотности 10106 жизнеспособных клеток/мл. Таким образом, в использованных условиях rAd35 размножается в продуцирующих клетках иначе, чем rAd5. Кроме того, заявители наблюдали, что еще один серотип также вел себя иначе, свидетельствуя о том, что способы для определенных серотипов аденовирусов могут требовать тонкой настройки для каждого серотипа с целью получения оптимальных результатов. Настоящее изобретение относится к оптимизированной системе для получения rAd35 с точки зрения выхода, качества полученного rAd35 и легкости манипулирования собираемого продукта для переработки на следующих стадиях процесса. Изобретение относится к способу получения рекомбинантного аденовируса серотипа 35 (rAd35),причем способ включает а) культивирование продуцирующих клеток в суспензии в перфузионной системе; b) инфицирование указанных клеток с помощью rAd35 при плотности примерно от 10106 жизнеспособных клеток/мл до 16106 жизнеспособных клеток/мл; с) дальнейшее культивирование инфицированных клеток перфузионной системой для размножения указанного rAd35; и d) сбора указанного rAd35. В определенных вариантах осуществления указанные клетки на стадии b) инфицируются rAd35 при плотности примерно от 10106 до 14106 жизнеспособных клеток/мл. В определенных предпочтительных вариантах осуществления указанная перфузионная система на стадии с) представляет собой перфузионную систему с чередующимся тангенциальным потоком (ATF). В других предпочтительных вариантах осуществления указанная перфузионная система на стадии а) представляет собой перфузионную систему с чередующимся тангенциальным потоком (ATF). В предпочтительном варианте осуществления указанная перфузионная система на обеих стадиях а) и с) представляет собой перфузионную систему с чередующимся тангенциальным потоком (ATF). В определенных вариантах осуществления способ по изобретению, кроме того, включает е) очисткуrAd35. В еще одних вариантах осуществления способ, кроме того, включает f) получение фармацевтической композиции, содержащей очищенный rAd35. В определенных вариантах осуществления указанный рекомбинантный аденовирус лишен, по меньшей мере, части области Е 1 и содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту. В предпочтительных вариантах осуществления отношение физической частицы к инфекционной частице (VP/IU) полученного rAd35 составляет менее чем 30:1, предпочтительно, менее чем 20:1. Аспектом изобретения является также способ получения по меньшей мере 11012 вирусных частицrAd35 (VP) /мл, причем способ включает а) культивирование продуцирующих клеток в суспензии перфузионной системой; b) инфицирование указанных клеток с помощью rAd35 при плотности примерно от 10106 жизнеспособных клеток/мл до 16106 жизнеспособных клеток/мл; с) дальнейшее культивирование инфицированных клеток перфузионной системой для размножения указанных rAd35, посредством чего концентрация вирусных частиц rAd35 достигает по меньшей мере 11012 VP/мл; и d) сбор указанных rAd35. Изобретение также относится к биореактору с рабочим объемом от 2 л до 1000 л, содержащему культуральную среду, продуцирующие клетки и по меньшей мере 11012 вирусных частиц rAd35(VP)/мл. В определенных вариантах осуществления биореактор имеет рабочий объем от 50 л до 500 л. В предпочтительных вариантах осуществления биореактор соединен с перфузионной системой ATF. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - инфицирование rAd5 при высокой плотности клеток в шейкерах; фиг. 2 - инфицирование rAd35.TB-S при высокой плотности клеток в шейкерах и двухлитровом биореакторе; фиг. 3 - инфицирование rAd35.eGFP при высокой плотности клеток в шейкерах. Подробное описание изобретения В настоящем изобретении описан новый способ получения больших количеств рекомбинантного аденовируса 35. Оптимизированный способ основан на способности инфицировать культуры при высокой плотности клеток с сохранением высокой продуктивности вируса на клетку. При этом предоставлен способ получения собранного раствора вируса с высокой концентрацией вируса в одном биореакторе. Обычные выходы современных способов для rAd35 составляют примерно 2-31011 VP/мл. Действительно, считается, что очень большие количества частиц rAd35 могут быть получены с использованием способов по настоящему изобретению, например, количества по меньшей мере примерно 51011 VP/мл, предпочтительно по меньшей мере 6, 7, 8 или 91011 VP/мл. Предпочтительно получают по меньшей мере 11012 VP/млrAd35, предпочтительнее по меньшей мере 1,51012 VP/мл, еще предпочтительнее по меньшей мере 21012 VP/мл, например, примерно от 11012 до 51012 VP/мл. Обычно способ обеспечивает выход не более чем примерно 11013 VP/мл rAd35. Выходы, которые могут быть получены способами в соответствии с настоящим изобретением, вероятно, достаточны для получения желательного количества вакцин на основе определенного rAd35 для удовлетворения всемирной потребности, без необходимости использования биореакторных установок с рабочими объемами больше чем 1000 л. Изобретение относится к способу получения рекомбинантного аденовируса серотипа 35 (rAd35),причем способ включает а) культивирование продуцирующих клеток в суспензии перфузионной системой; b) инфицирование указанных клеток с помощью rAd35 при плотности клеток по меньшей мере 10106 жизнеспособных клеток/мл; с) дальнейшее культивирование инфицированных клеток перфузионной системой для размножения указанных rAd35; и d) сбор указанных rAd35. В определенных вариантах осуществления указанные клетки на стадии b) инфицируются rAd35 при плотности примерно от 10106 до 50106 жизнеспособных клеток/мл. В еще одних вариантах осуществления указанные клетки на стадии b) инфицируются rAd35 при плотности примерно от 10106 до 20106 жизнеспособных клеток/мл. В еще одних предпочтительных вариантах осуществления указанные клетки на стадии b) инфицируются rAd35 при плотности примерно от 10106 до 16106 жизнеспособных клеток/мл, например, примерно 10, 11, 12, 13, 14 или 15106 жизнеспособных клеток/мл. В других вариантах осуществления указанные клетки на стадии b) инфицируются rAd35 при плотности примерно от 20106 до 50106 жизнеспособных клеток/мл. Продуцирующие клетки и рекомбинантный аденовирус Продуцирующие клетки (иногда также именуемые в данной области "упаковочными клетками" или"комплементирующими клетками" или "клетками-хозяевами") в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой любые продуцирующие клетки, в которых может размножаться желательный аденовирус. Например, размножение рекомбинантных вирусных векторов осуществляется в продуцирующих клетках, которые восполняют дефициты аденовируса. Такие продуцирующие клетки предпочтительно имеют в их геноме, по меньшей мере, аденовирусную последовательность Е 1, и, посредством этого, способны дополнять рекомбинантные аденовирусы делецией в области Е 1. Кроме того, аденовирус может иметь делецию в области Е 3, которая несущественна для генома Ad, и, следовательно, такая делеция не должна добавляться. Может использоваться любая дополняющая Е 1 продуцирующая клетка, такая как клетки сетчатки человека, иммортализованные Е 1, например, клетки 911 или PER.C6 (см. патент США 5994128), аминоциты с трансформированной Е 1 (см. патент ЕР 1230354), клетки А 549 с трансформированной Е 1 (см., например, WO 98/39411, патент США 5891690), GH329:HeLa (Gao et al., 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293, и тому подобные. В определенных вариантах осуществления продуцирующие клетки представляют собой, например, клетки НЕК 2 93 или клетки PER.C6 или клетки 911,или клетки IT293SF и тому подобные. Предпочтительно, клетки PER.C6 (ЕСАСС депозит 96022940; см. патент США 5994128) или клетки, происходящие от них, используются в качестве продуцирующих клеток. В настоящем изобретении показано, что серотип 35 (rAd35) рекомбинатного аденовируса имеет неизвестные до настоящего времени преимущественные свойства, по сравнению с rAd5, в способах, в которых применяется инфицирование при высокой плотности клеток. В настоящее время заявителям также известно, что еще один серотип также ведет себя иным образом при одинаковых способах, свидетельствуя о том, что для различных серотипов могут быть установлены оптимальные условия для крупномасштабного получения рекомбинантного аденовируса. Следовательно, в определенных предпочтительных вариантах осуществления аденовирус по изобретению представляет собой rAd35. Предпочтительно аденовирусный вектор дефицитен по меньшей мере по одной существенной генной функции области Е 1, например области E1a и/или области E1b, аденовирусного генома, которая требуется для вирусной репликации. В определенных вариантах осуществления вектор дефицитен по меньшей мере по одной существенной генной функции области Е 1 и по меньшей мере части несущественной области Е 3. Аденовирусный вектор может быть "множественно дефицитным", означая, что аденовирусный вектор дефицитен по одной или более существенных генных функций в каждой из двух или более областей аденовирусного генома. Например, указанные выше аденовирусные векторы с дефицитом Е 1 или дефицитом Е 1 и Е 3 могут, кроме того, иметь дефицит по меньшей мере одного существенного гена области Е 4 и/или по меньшей мере одного существенного гена области Е 2 (например, области Е 2 А и/или области Е 2 В). Аденовирусные векторы с делецией всей области Е 4 могут вызывать более низкие иммунные ответы хозяина. Примеры подходящих аденовирусных векторов включают аденовирусные векторы,которые лишены (а) всей или части области Е 1 или всей или части области Е 2, (b) всей или части области Е 1, всей или части области Е 2, и всей или части области Е 3, (с) всей или части области Е 1, всей или части области Е 2, всей или части области Е 3, и всей или части области Е 4, (d) по меньшей мере части области E1a, по меньшей мере части области E1b, по меньшей мере части области Е 2 а, и по меньшей мере части области Е 3, (е) по меньшей мере части области Е 1, по меньшей мере части области Е 3, и по меньшей мере части области Е 4, и (f) всех существенных аденовирусных генных продуктов (например,аденовирусных ампликонов, содержащих ITR (инвертированные концевые повторы) и только упаковочные сигналы). Как известно специалисту в данной области, в случае делеций существенных областей из аденовирусного генома, функции, кодируемые этими областями, должны быть обеспечены транскомплементацией, предпочтительно, продуцирующей клеткой, т.е. когда части или все области E1, E2 и/или Е 4 делетируются из аденовируса, они должны присутствовать в продуцирующей клетке, например,интегрированы в геном, или в форме так называемого хелперного аденовируса или хелперных плазмид. Аденовирусный вектор, дефицитный по репликации, может быть генерирован использованием любого вида, штамма, подтипа или смеси видов, штаммов или подтипов аденовируса или химерного аденовируса в качестве источника ДНК вектора (см., например, WO 96/26281, WO 00/03029), который может обеспечить аденовирусный вектор способностью инфицировать определенные желательные типы клеток. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения rAd35 используется в качестве аденовируса. В еще одних вариантах осуществления аденовирус по изобретению лишен по меньшей мере части области Е 1, например последовательностей, кодирующих Е 1 А и/или Е 1 В, и, кроме того, содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту. Подходящая гетерологичная нуклеиновая кислота хорошо известна специалисту в данной области и, например, может включать открытые рамки считывания трансгена, например, открытые рамки считывания, кодирующие полипептиды, против которых желателен иммунный ответ. Когда вектор rAd используется для целей вакцинации, трансгены, подходящие для генерирования иммунного ответа против малярии (см., например, WO 2004/055187), HIV, туберкулеза (см., например,WO 2006/053871), определенных вирусов и т.д., все, хорошо известны специалисту в данной области. Действительно, природа гетерологичной нуклеиновой кислоты не имеет решающего значения для настоящего изобретения, и она может представлять собой любую гетерологичную нуклеиновую кислоту и,следовательно, требует дальнейшей разработки в настоящем изобретении. Специалисту в данной области понятны возможности размножения аденовирусных векторов различных серотипов на определенных клетках-хозяевах с использованием способов, таких как, например,раскрытые в патенте США 6492169 или в документе WO 03/104467, и приведенных в них ссылок. Например, для размножения El-дефицитных rAd35 специфические продуцирующие клетки, которые экс-4 019928 прессируют Е 1 В-55 К Ad35, могут быть сконструированы, например, на основании существующих продуцирующих клеток, которые экспрессируют Е 1 А и Е 1 В Ad5, такие как клетки PER.C6 или НЕК 293 (см.,например, патент США 6492169), как известно специалисту в данной области. Альтернативно и предпочтительно существующие (Ad5-) комплементирующие клеточные линии, такие как, например, PER.C6 или НЕК 293, могут быть использованы без модификации клеток для размножения E1-дефицитныхrAd35, включением кодирующей E4-orf6 последовательности Ad5 в вектор rAd35, как обстоятельно описано, например, в WO 03/104467, полностью включенном в настоящее описание путем ссылки. Таким образом, размножение аденовирусных векторов любого серотипа может осуществляться на продуцирующих клетках с использованием средств и способов, хорошо известных специалисту в данной области. Аденовирусные векторы, способы их конструирования и способы их размножения хорошо известны в данной области и описаны, например, в патентах США 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106,5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 и 6113913 и, соответственно, в главах 67 и 68 публикацийThomas Shenk, Adenoviridae and their Replication, M.S. Horwitz, Adenoviruses, в 3-м издании монографии Virology под редакцией В. N. Fields et al., Raven Press, Ltd., New York (1996), и в других ссылках,указанных в настоящем описании. Конструкция аденовирусных векторов хорошо понятна в данной области и включает использование стандартных молекулярно-биологических методик, таких как методики, описанные, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992), и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), и в других ссылках, указанных в настоящем описании. Продуцирующие клетки в соответствии с изобретением культивируются для увеличения числа клеток и/или вирусных титров. Культивирование клетки проводится для обеспечения ее возможности метаболизировать, и/или расти, и/или делиться, и/или продуцировать представляющий интерес вирус в соответствии с изобретением. Это может быть осуществлено способами, которые хорошо известны специалистам в данной области, включая, без ограничения, обеспечение клетки питательными веществами, например, в соответствующих культуральных средах. Могут использоваться различные культуральные среды, и выбор оптимальной культуральной среды для используемых клеток и обстоятельств представляет собой часть повседневных задач специалиста в данной области. Таким образом, подходящие культуральные среды для цели настоящего изобретения хорошо известны специалисту в данной области и могут быть в целом получены из выпускаемых промышленностью источников в больших количествах или изготовлены на заказ в соответствии со стандартными протоколами. Культивирование может проводиться, например, в чашках, вращающихся флаконах или в биореакторах, используя системы серийной,порционной и непрерывной подачи и тому подобных. Для достижения крупномасштабной (непрерывной) продукции вируса посредством клеточной культуры, в данной области предпочтительно иметь клетки, способные расти в суспензии, и предпочтительно иметь клетки, способные к культивированию в отсутствие сыворотки животного или человеческого происхождения или компоненты сыворотки животного или человеческого происхождения. Подходящие условия для культивирования клеток известныanimal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9). Система клеточной культуры и перфузионная система Биореакторы широко использовались для крупномасштабного производства биологических продуктов из суспензионно-зависимых культур клеток животных. В соответствии с изобретением биореакторы, используемые для размножения аденовирусов, могут, например, представлять собой вращающиеся барабаны, одноразовые биореакторы, аэролифтные реакторы и тому подобные. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения биореактор представляет собой вращающийся барабан. В соответствии с определенными вариантами осуществления изобретения биореактор имеет рабочий объем примерно от 2 до 2000 л, причем в данном случае "отдо" включает указанные верхнюю и нижнюю предельные величины, причем 2 л представляет самый маленький рабочий объем, а 2000 л представляет самый большой рабочий объем. Подразумевается, что биореакторы, имеющие рабочий объем любой отдельной величины между этими величинами, включены в изобретение. Термин "примерно" для числовых величин, используемых в настоящем описании, означает величину 10%. В определенных предпочтительных вариантах осуществления рабочий объем составляет от 10 до 1000 л, предпочтительно от 20 до 800 л, например от 30 до 600 л, например от 50 до 500 л, например примерно 250 или примерно 500 л. Преимущество использования биореакторов с рабочим объемом в соответствии с изобретением состоит в том, что избегается использование биореакторов с очень большим объемом, т.е. биореакторов с рабочим объемом, гораздо большим, чем 2000 л, предпочтительно 1000 л, и, таким образом, не требуются огромные капитальные вложения и затраты времени на построение такого очень крупного биореактора. Кроме того, продукт, т.е. rAd, гораздо более концентрированный при использовании способов по настоящему изобретению, что экономит время и затраты при сборе и/или, кроме того,обработке rAd ниже по потоку от биореактора. Рабочий объем представляет собой эффективный объем культуры в биореакторе. Вращающиеся барабаны в целом имеют отношение высоты к диаметру от 1:1 до 3:1. Культура обычно смешивается одной или более мешалками на основании имеющих лопатки дисков или типа гребного винта. Были описаны перемешивающие устройства, вызывающие меньшие силы сдвига, чем лопатки. Перемешивание может осуществляться прямым приводом или непрямым приводом магнитно связанными устройствами. Непрямые приводы снижают риск микробного заражения через уплотнители на шкивах мешалки. Оборудование и регуляторы указанных биореакторов включают (без ограничения): регуляторы перемешивания, температуры, растворенного кислорода, рН и датчики биомассы. Перемешивание, рН, температура, концентрация растворенного кислорода среды клеточной культуры в принципе не имеют решающего значения и зависят от выбранного типа клеток. Предпочтительно, перемешивание, рН, температура, концентрация растворенного кислорода выбираются так, чтобы они были оптимальны для роста клеток. Специалисту в данной области известно, как найти оптимальное перемешивание, рН, температуру, концентрацию растворенного кислорода для культивирования. Обычно оптимальное перемешивание составляет от 50 до 300 об./мин, например 100-250 об./мин, оптимальный рН составляет от 6,7 до 7,7, оптимальная температура от 30 до 39 С, например 34, 35, 36, 37 или 38 С. С большинством крупномасштабных суспензионных культур работают как с периодическими процессами или процессами периодической подачи, потому что с ними проще всего управляться и наращивать объем производства. Однако непрерывные процессы, основанные на перфузионных принципах, становятся все более широко используемыми. В соответствии с настоящим изобретением продуцирующие клетки культивируются в перфузионной системе. Перфузионное культивирование клеток имеет свое обычное значение в данной области, т.е. оно означает, что во время культивирования клетки удерживаются сепараторным устройством, в котором отток жидкости, имеющей более низкую плотность клеток,чем перед сепарацией, и в котором имеется приток среды для культуры клеток. Использование перфузируемой культуры происходит в ответ на вызов роста клеток при более высоких уровнях плотности (например, 10-50106 жизнеспособных клеток/мл). Для увеличения уровней плотности выше 2-4106 жизнеспособных клеток/мл среда постоянно или периодически замещается подаваемой свежей средой для того, чтобы восполнить недостаточность питательных веществ и удалить токсичные продукты. Перфузия также обеспечивает возможность гораздо лучшего регулирования культуральной среды (рН, dO2, уровни питательных веществ и т.д.). Перфузия свежей среды через культуру может быть достигнута удерживанием клеток разнообразными сепарационными устройствами (например, мелкосетчатым спиновым фильтром, полыми волокнами или плоскопластинчатыми мембранными фильтрами, осаждающими пробирками). В предпочтительных вариантах осуществления процесса настоящего изобретения сепарационное устройство представляет собой фильтровой модуль, содержащий полые волокна. Под термином "полое волокно" подразумевается трубчатая мембрана. Внутренний диаметр трубки составляет предпочтительно от 0,3 до 6,0 мм, предпочтительно от 0,5 до 3,0 мм, наиболее предпочтительно от 0,5 до 2,0 мм. В определенных вариантах осуществления размер отверстий сита (размер пор) в мембране выбирается так, чтобы размер пор в сите был близок к диаметру клеток, обеспечивая высокую задержку клеток, в то время как клеточные осколки могут проходить через фильтр. В других вариантах осуществления размер отверстий сита значительно меньше, чем диаметр клеток. Предпочтительно, размер отверстий сита составляет от 0,1 до 30 мкм, например, от 0,1 до 3 мкм, например, примерно 0,2 мкм. Фильтровые модули, содержащие полые волокна, выпускаются промышленностью, например, GeneralElectric (ранее Amersham). Во время способа по настоящему изобретению в вытекающей культуральной среде не наблюдались значительные количества аденовирусных частиц, несмотря на то, что вирусные частицы меньше, чем размер отверстий применявшегося сита. Перфузия используется для поддержания желательных уровней определенных метаболитов и для удаления и, вследствие этого, снижения содержания примесей в культуральной среде. Скорости перфузии можно измерить различными способами, такими как измерение с точки зрения замещаемых объемов за единицу времени или с точки зрения уровней определенных метаболитов, уровень которых должен поддерживаться, в течение периодов перфузии. Обычно перфузия не проводится в течение всех периодов культивирования и в целом проводится только время от времени во время культивирования по желанию. Например, перфузия обычно не начинается до тех пор, пока не начнется истощение запасов и не потребуется восполнение содержания определенных компонентов среды, таких как глюкоза. В данной области известны несколько перфузионных систем. И они в принципе подходят для способов по настоящему изобретению. Под термином "перфузионная система" подразумевается комбинация биореактора, соединенного с сепарационным устройством. Сепарационное устройство может быть или включено в биореактор (например, мелкосетчатый спиновый фильтр) или оставаться снаружи от биореактора (например, полые волокна). В обоих случаях, как объясняется выше, сепарационное устройство предотвращает вымывание клеточной массы из реактора и обеспечивает возможность обновления среды. Заявители выполнили поисковые эксперименты с несколькими перфузионными системами, из которых перфузионная система с перемежающимся тангенциальным потоком (ATF) дала наилучшие результаты. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления изобретения биореакторы работают(соединены) с перфузионной системой ATF (например, системой ATF System, Refine Technology, Co.,East Hanover, NJ). Система состоит из диафрагмального насоса, установленного в один конец кожуха с полыми волокнами. Другой конец кожуха прикреплен к соединительному устройству, которое, в свою очередь, соединено с биореактором через доступный канал. Диафрагмальный насос и система управления служат для генерирования перемежающегося тангенциального потока через полые волокна. Это означает, что имеется один поток в том же направлении (т.е. тангенциальном к) поверхностям мембран полых волокон, причем указанный поток движется назад и вперед, и что имеется другой поток в направлении, по существу перпендикулярном указанной поверхности фильтра. Тангенциальный поток может быть достигнут в соответствии со способами, известными специалисту в данной области, и, как описано,например, в патенте США 6544424. Работа перфузионной системы ATF была описана (Furey, 2002). Системы ATF обеспечивают возможность культивирования клеток в течение более длительного периода времени и достижения высоких уровней плотности клеток без наличия блокированного фильтра. Действительно, крайне высокие уровни плотности клеток, превышающие 100106 жизнеспособных клеток/мл, могут быть получены при использовании перфузионной системы ATF, например, клеток PER.C6 (см., например, Yallop et al.). Однако в более ранних сообщениях клетки PER.С 6 в перфузионных системах использовались совершенно с другой целью, а не инфицировались аденовирусом. Дополнительное преимущество системы ATF состоит в том, что система генерирует низкое напряжение сдвига. Энергия подается на поверхность жидкости, генерируя ламинарный поток с низким сдвигом. Это может, в частности, обеспечить преимущество для настоящего изобретения, где клетки инфицированы аденовирусом. Во время процессов перфузии системой ATF после инфицирования не была обнаружена потеря клеточной плотности и не наблюдалась преждевременная потеря клеток, но, скорее,наблюдался равномерный рост клеток. Поскольку клетки остаются интактными, создаются оптимальные условия для размножения вируса. Поэтому перфузия системой ATF имеет преимущество во время фазы перед культивированием(стадии а в соответствии с настоящим изобретением), поскольку она обеспечивает возможность получения очень высоких уровней плотности клеток, и клетки находятся в хорошем состоянии для последующего инфицирования аденовирусом, вероятно, способствуя получению высоких выходов. Для достижения указанных высоких уровней плотности клеток культуральная среда в определенных вариантах осуществления, по меньшей мере, частично перфузируется в течение части времени во время роста продуцирующих клеток (стадия а). В определенных вариантах осуществления перфузия начинается, как только достигается плотность клеток примерно от 2106 жизнеспособных клеток/мл до 8106 жизнеспособных клеток/мл. Кроме того, перфузия системой ATF имеет преимущество после стадии инфицирования (стадии с в соответствии с настоящим изобретением), поскольку она обеспечивает возможность получения очень высоких выходов аденовируса из инфицированных клеток. Поэтому в предпочтительных вариантах осуществления, и в стадии перед культивированием, и стадии после инфицирования способов по изобретению используется перфузионная система ATF. Объем культуральной среды, используемой во времяATF, может варьироваться в соответствии с потребностями клеток, что может легко установить и регулировать специалист в данной области, и обычно он варьируется от 0,5 до 5 объемов сосуда/день (об./д),например, от 1 до 3 об./д, например, примерно 2 об./д. В определенных предпочтительных вариантах осуществления частота обновления составляет примерно от 1 до 2 об./д, поскольку заявители показали в настоящем изобретении, что это дает очень хорошие результаты с точки зрения выходов и качества полученного rAd35, одновременно при таком же потреблении среды и поэтому еще целесообразны затраты,связанные с этим. Наконец, перфузионная система ATF представляет собой систему, обеспечивающую возможность наращивания производительности. Поскольку воздушный поток используется для продвижения культуры через половолоконную мембрану, могут генерироваться очень быстрые, обеспечивающие низкий сдвиг скорости тангенциального потока, обеспечивающие возможность использования данной технологии от RD (исследования и разработки) до производственного масштаба до 1000 л (Furey, 2002). Возможно, дальнейшие разработки обеспечат возможность еще большего наращивания масштаба производства перфузионной системы ATF. По данным Yuk et al., rAd5 получают с использованием линии опухолевых клеток, и при этом полный процесс выполняется в одном биореакторе, что займет примерно 8-10 дней в производственном биореакторе. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения используются 2 различных биореактора, один для прекультивирования (стадия а; биореактор для прекультивирования) и один для инфицирования (стадия b) и культивирования клеток после инфицирования (стадия с; производственный биореактор). Преимущество использования двух отдельных биореакторов для этих стадий состоит в том, что в производственном реакторе требуется лишь только примерно 1,5-5, обычно примерно 2-3 дня культивирования, и поэтому в течение года может быть выполнено гораздо большее количество производственных циклов. Добавление большого количества свежей культуральной среды во время инфицирования имеет дополнительное преимущество для уменьшения объема культуральной среды,требуемого во время перфузии в производственном биореакторе. В альтернативных варианта осуществ-7 019928 ления также возможно выполнение всех стадий а-с по изобретению в одном биореакторе. Инфицирование В способах по изобретению продуцирующие клетки инфицируются рекомбинантным аденовирусом. Обычно вирус подвергается воздействию соответствующих продуцирующих клеток в оптимальных условиях, позволяющих захватить вирус. Оптимальные условия зависят от типа клеток и от типа выбранного аденовируса. Специалисту в данной области известно, как найти оптимальные условия, т.е. в отношении перемешивания, рН, температуры, растворенного кислорода (dO2 или DO), множественности инфекции (MOI). Обычно оптимальное перемешивание производится со скоростью примерно от 50 до 300 об./мин, обычно примерно от 100 до 200, например, примерно 150 об./мин, типичный уровень DO составляет 20-60%, например, 40%, оптимальный рН составляет от 6,7 до 7,7, оптимальная температура составляет от 30 до 39 С, например, 34-37 С, и оптимальную MOI от 5 до 1000, например примерно 50300. Обычно аденовирус спонтанно инфицирует продуцирующие клетки и обеспечение контакта продуцирующих клеток с частицами rAd достаточно для инфицирования клеток. В целом, аденовирусный посевной материал добавляется к культуре для инициации инфекции, и в последующем аденовирус размножается в продуцирующих клетках. Все это является обычной процедурой для специалиста в данной области. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения перфузия прекращается перед инфицированием и возобновляется примерно через 1-20 ч, например 3-15 ч, например через 5 ч после инфицирования. Эта задержка должна обеспечить возможность вхождения вирусных частиц в клетки и предотвращения вымывания вирусных частиц из системы. Скорости перфузии после инфицирования определяются с точки зрения уровня глюкозы, который поддерживается посредством перфузии. Например, в настоящем изобретении концентрация глюкозы в среде обычно поддерживается на уровне примерно от 2 до 20 ммоль/л, обычно примерно от 5 до 10 ммоль/л. Преимущественно можно инфицировать биореактор rAd35 при высокой плотности клеток, т.е. выше, чем 10106 жизнеспособных клеток/мл, с сохранением высокой продуктивности вируса на клетку. В определенных вариантах осуществления удельная продуктивность остается на уровне примерно от 0,5105 до 1,5105 VP/клетка. Кроме того, в настоящем изобретении жизнеспособность клеточной культуры перед инфицированием остается выше, чем 75%. Это означает, что, по меньшей мере, 75% общего количества клеток в культуре жизнеспособны в момент инфицирования. В определенных вариантах осуществления жизнеспособность клеточной культуры при инфицировании составляет по меньшей мере 80%, в еще одних вариантах осуществления по меньшей мере 85%. Жизнеспособность можно измерить с использованием обычных способов, имеющихся в распоряжении специалиста в данной области, например, исключения триптофана синего, определения количества клеток по Casy и тому подобных. В определенном варианте осуществления плотность клеток при инфицировании составляет примерно от 10106 до 50106 жизнеспособных клеток/мл, например, примерно от 10106 до 20106 жизнеспособных клеток/мл, например, примерно от 10106 до 15106 жизнеспособных клеток/мл, например,примерно от 10106 до 14106 жизнеспособных клеток/мл, например, примерно 12-13106 жизнеспособных клеток/мл. Эти величины плотности клеток обеспечивают возможность высокой продуктивности вируса с ограниченным накоплением клеточных осколков и ДНК клеток-хозяев, что обеспечивает преимущество данных вариантов осуществления при обработке собранных аденовирусов ниже по ходу процесса. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает оптимизированный способ получения rAd35,дающий большие количества частиц rAd35 хорошего качества, в то же время обеспечивая собираемый материал, который еще может подвергаться манипулированию в целях переработки ниже по ходу процесса. В других вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, плотность клеток при инфицировании составляет примерно от 15106 до 50106 жизнеспособных клеток/мл, например, примерно от 17106 до 45106 жизнеспособных клеток/мл, например примерно от 20106 до 40106, например примерно от 25106 до 35106 жизнеспособных клеток/мл, например, примерно от 30106 жизнеспособных клеток/мл. Инфицирования при указанных величинах плотности клеток могут вызвать даже более высокие концентрации рекомбинантного аденовируса, в частности, rAd35, и превосходят выходы rAd35, описанные до настоящего времени. Как впервые показано в настоящем описании, в отличие от инфицирования rAd5 при высокой плотности клеток (выше 10106 жизнеспособных клеток/мл) инфицированиеrAd35 при величинах плотности выше 10106 жизнеспособных клеток/мл еще увеличивало волюметрическую продуктивность rAd35 при увеличивающейся плотности клеток по меньшей мере до 30106 жизнеспособных клеток/мл при инфицировании с использованием продуцирующих клеток в суспензии перфузионной системой. Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу получения по меньшей мере 11012 частиц вируса rAd35 (VP)/мл. Способы по настоящему изобретению обеспечивают возможность извлечения rAd35 при отношении физических частиц к инфекционным частицам менее чем 30:1, которое представляет собой важный параметр для аденовируса, который предстоит ввести людям. Он может быть измерен в виде отношения вирусных частиц (VP)/инфекционных единиц (IU), например, с использованием анализа QPA (Wang etal., 2005). Более низкое отношение имеет преимущество, поскольку необходимо ввести меньше вирусных частиц для инфицирования такого же числа клеток в каждом случае. Действующие инструкции FDA требуют, чтобы отношение VP/IU составляло менее чем 30:1, и, следовательно, способы по изобретению,описанные в настоящей заявке, подходят для получения больших количеств rAd35, что выполняет данное конкретное требование. Авторы, Yuk et al. (2004), сообщили о более низких абсолютных числах вирусных частиц, чем числа, описанные в настоящей заявке, и, кроме того, отношение VP/IU образцов,описанных Yuk et al. (2004), составляет примерно 100 (фиг. 2 А/2 В, Yuk et al., 2004). Напротив, заявители сообщают о более высоких абсолютных выходах и, кроме того, значительно лучших отношениях VP/IU ниже 20:1. Поэтому в определенных вариантах осуществления способы по изобретению обеспечивают получение партий rAd35, которые имеют отношение VP/IU менее чем 20:1, например, примерно от 20:1 и до примерно 5:1. Способы сбора и лизиса клеток После инфицирования аденовирусом вирус реплицируется внутри клетки и, посредством этого, амплифицируется. Аденовирусная инфекция, в конечном счете, приводит к лизису инфицированных клеток. Поэтому литические характеристики аденовируса обеспечивают возможность двух различных режимов получения вируса. Первый режим представляет собой сбор вируса перед лизисом клеток с использованием внешних факторов для лизиса клеток. Второй режим представляет собой сбор вирусного супернатанта после (почти) полного лизиса клеток полученным вирусом (см., например, патент США 6485958, описывающий сбор аденовируса без лизиса клеток-хозяев внешним фактором). Для последнего режима требуются более длительные периоды инкубации для достижения полного лизиса клеток и, следовательно, для более высоких выходов вируса. Кроме того, постепенное смывание содержимого клетокхозяев в среду может оказывать повреждающее действие на целостность и выход полученных вирусов. Следовательно, предпочтительно использование внешних факторов для активного лизиса клеток для сбора аденовируса в соответствии с изобретением. Способы, которые могут использоваться для активного лизиса клеток, известны специалисту в данной области и были, например, обсуждены в WO 98/22588, pp. 28-35. Полезными способами в этом отношении являются, например, сублимация, сдвиг в твердом состоянии, гипертонический и/или гипотонический лизис, сдвиг в жидком состоянии, обработка ультразвуком, экструзия под высоким давлением,лизис детергентом, комбинации указанных выше способов и тому подобные. В одном варианте осуществления изобретения клетки лизируются с использованием по меньшей мере одного детергента. Использование детергента для лизиса имеет преимущество в том, что он является легким способом и что его масштаб легко наращивается. Детергенты, которые могут использоваться, и метод, которым они используются, в целом известны специалисту в данной области. Несколько примеров, например, обсуждаются в WO 98/22588, pp. 29-33. Детергенты, используемые в настоящем изобретении, могут включать анионные, катионные, цвиттерионные и неионные детергенты. Специалисту в данной области ясно, что концентрация детергента может варьироваться, например, в пределах диапазона примерно 0,1-5% (мас./мас.). В одном варианте осуществления используемый детергент представляет собой Triton X-100. Нуклеаза может использоваться для удаления загрязняющих, т.е. в основном продуцирующих клетки, нуклеиновых кислот. Иллюстративные нуклеазы, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают Benzonase, Pulmozyme или любую другую ДНазу и/или РНазу, обычно используемую в данной области. В предпочтительных вариантах осуществления нуклеаза представляет собойBenzonase, которая быстро гидролизует нуклеиновые кислоты гидролизом внутренних фосфодиэфирных связей между определенными нуклеотидами, посредством этого снижая вязкость клеточного лизата.Benzonase выпускается компанией Merck KGaA (код W214950). Концентрация, в которой используется нуклеаза, находится предпочтительно в пределах диапазона 1-100 единиц/мл. Способы сбора аденовируса из культур продуцирующих клеток детально описан в WO 2005/080556. В соответствии с настоящим изобретением время сбора составляет примерно от 24 до 120 ч после инфицирования, например примерно от 48 до 96 ч после инфицирования, например, через 72 ч после инфицирования. Способы очистки В определенных вариантах осуществления собранный аденовирус подвергается дальнейшей очистке. Очистка аденовируса может выполняться в несколько стадий, включающих осветление, ультрафильтрацию, диафильтрацию или сепарацию хроматографией, как описано, например, в WO 05/080556, включенном в настоящее описание путем ссылки. Осветление может осуществляться стадией фильтрации,удаляющей клеточный дебрис и другие примеси из клеточного лизата. Ультрафильтрация используется для концентрации раствора вируса. Диафильтрация или буферный обмен с использованием ультрафильтров представляет собой метод удаления и обмена солей, сахаров и тому подобных веществ. Спе-9 019928 циалисту в данной области известно, как найти оптимальные условия для каждой стадии очистки. Также в WO 98/22588, полностью включенном в настоящее описание путем ссылки, описаны способы получения и очистки аденовирусных векторов. Способы включают выращивание клеток-хозяев, инфицирование клеток-хозяев аденовирусом, сбор и лизис клеток-хозяев, концентрацию неочищенного лизата, обмена буфера неочищенного лизата, обработку лизата нуклеазой и, кроме того, очистку вируса с использованием хроматографии. Очистка может, например, достигаться центрифугированием в градиенте плотности, как, например,описано в WO 98/22588, pp. 59-61. Однако предпочтительно, при очистке используется по меньшей мере одна стадия хроматографии,как, например, обсуждается в WO 98/22588, pp. 61-70. Было описано множество способов для дальнейшей очистки аденовирусов, где стадии хроматографии включены в способ. Специалисту в данной области известны эти способы, и он может варьировать точный метод использования хроматографических стадий для оптимизации процесса. Например, можно очищать аденовирусы стадиями анионообменной хроматографии, см., например,WO 05/080556. Для очистки аденовируса предпочтительно использование по меньшей мере одной стадии анионообменной хроматографии. После стадии анионообменной хроматографии вирус может быть достаточно чистым. Однако в определенных вариантах осуществления, кроме того, выполняется стадия хроматографии с исключением по размеру для увеличения эффективности способа. Эта стадия может проводиться перед или после стадии анионообменной хроматографии. Очевидно, что другие стадии очистки могут также подходящим образом комбинироваться со стадией анионообменной хроматографии. Использование анионообменной хроматографии для очистки аденовируса было детально описано, и поэтому данный аспект вполне доступен для специалиста в данной области. Для очистки аденовируса использовались и подходят многие различные хроматографические матрицы, и специалист в данной области может легко найти оптимальный анионообменный материал для очистки вируса, например, под контролем следующих документов предшествующего уровня техники. В патенте США 5837520 (см. также Huyghe et al., 1995, Human Gene Therapy 6: 1403-1416) описан способ очистки аденовируса, в котором лизат клеток-хозяев обрабатывается нуклеазой с последующим анионным обменом и аффинной хроматографией с ионами металлов. В патенте США 6485958 описано использование сильной анионообменной хроматографии для очистки рекомбинантного аденовируса. Анионообменная хроматография использовалась в колонках с псевдоожиженным слоем для очистки частиц аденовируса, см. WO 00/50573. Кроме того, анионообменная хроматография в расширенном слое и определенные хроматографические смолы для анионообменной хроматографии для очистки частиц аденовируса были описаны в патенте США 6586226. В дополнение к анионообменным колонкам, подходят продукты для анионообменной мембранной хроматографии, такие как продукты, выпускаемые Pall (например, серии Mustang) и Sartorius (например, серии Sartobind). Информация об использовании этих фильтров и их преимуществах при очистке аденовирусов содержится, например, в WO 03/078592 и WO 2005/080556. В патенте США 65377 93 описана очистка аденовирусных частиц из клеток-хозяев с использованием ионообменной хроматографии, в частности, речь идет о предпочтении для этого назначения хроматографической подложки типов Q Sepharose XL. В одном варианте осуществления настоящего изобретения аденовирус дополнительно очищают с использованием колонки Q Sepharose XL. В способе очистки может также использоваться стадия хроматографии с исключением по размеру. В международной заявке WO 97/08298 описана очистка аденовирусов с использованием определенных хроматографических матриц для предотвращения повреждения вирусов, включая стадии анионного обмена и исключения по размеру. В патенте США 6261823 описан способ очистки аденовируса,где препарат аденовируса подвергается анионообменной хроматографии с последующей хроматографией с исключением по размеру. На данной стадии исключения по размеру достигается групповая сепарация вирусных частиц от примесей с низкой молекулярной массой. Возможно также использование гидроксиапатитовой среды для очистки аденовируса, см. WO 02/44348. Может также использоваться стадия адсорбции в обращенной фазе, как, например, описано в WO 03/097797, р.26. В международной заявке WO 97/08298 описана очистка аденовируса с использованием определенных хроматографических матриц для предотвращения повреждения вирусов, включающая стадии анионного обмена и исключения по размеру. Определенные способы ультрафильтрации также очень подходят для очистки аденовируса, как описано в WO 2006/108707. Такие стадии могут выполняться в дополнение к определенным стадиям хроматографической очистки или вместо них. Получение фармацевтического препарата В определенных вариантах осуществления очищенный аденовирус включается в состав фармацевтической композиции. Это может быть осуществлено в соответствии с обычными способами, хорошо известными специалисту в данной области. В целом, способ предусматривает доставку аденовирусных частиц в фармацевтически приемлемой композиции, содержащей аденовирус, и, по меньшей мере, фармацевтически приемлемый эксципиент. Такая композиция может быть получена в условиях, известных специалисту в данной области, и в определенных вариантах осуществления подходит для введения людям. Например, аденовирус может подвергаться буферному обмену во время групповой сепарации в буфер, который также используется для Аденовирусного Всемирного Стандарта и, в конечном счете, хранится в нем (Hoganson et al., Development of a stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing March 2002, pp. 43-48): 20 мМ Tris pH 8, 25 мМ NaCl, 2,5% глицерин. Очевидно, что могут использоваться многие другие буферы, и несколько примеров подходящих составов для хранения и фармацевтического введения препаратов очищенного (адено)вируса можно, например, найти в европейском патенте 0853660, и в международных патентных заявках WO 99/41416,WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763. В определенных вариантах осуществления аденовирусные векторы используются в качестве вакцин, и они обычно содержатся в фармацевтически приемлемых носителях или эксципиентах и/или разбавителях. Фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты и разбавители хорошо известны в данной области и активно используются в широком диапазоне терапевтических продуктов. Предпочтительно, используются носители, которые хорошо работают в вакцинах. Предпочтительнее, вакцины,кроме того, содержат адъювант. Адъюванты известны в данной области для дополнительного увеличения иммунного ответа на применяемый антигенный детерминант, и фармацевтические композиции, содержащие аденовирус и адъювант в виде фосфата алюминия, описаны, например, в WO 2007/110409. Для введения людям в изобретении могут использоваться фармацевтические композиции, содержащие rAd и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. В настоящем контексте термин"фармацевтически приемлемый" означает, что носитель или эксципиент в используемых дозировках и концентрациях не вызовет никаких нежелательных или вредных эффектов у индивидов, которым они вводятся. Такие фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты хорошо известны в данной области (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing CompanyPress [2000]). Очищенный rAd предпочтительно составляется и вводится в виде стерильного раствора,хотя в объем данного изобретения входит использование лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают стерилизационной фильтрацией или обоими способами, известными в данной области. Затем растворы лиофилизируются или заполняются в фармацевтические дозировочные контейнеры. рН раствора в целом находится в диапазоне рН 3,0-9,5, например рН 5,0-7,5. rAd обычно находится в растворе, имеющем подходящий фармацевтически приемлемый буфер, и раствор rAd может также содержать соль. Необязательно присутствие стабилизирующего агента, такого как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляется детергент. В определенных вариантах осуществления rAd может включаться в состав препарата для инъекций. Эти препаративные формы содержат эффективные количества rAd, представляют собой или стерильные жидкие растворы, жидкие суспензии или лиофилизированные варианты и, возможно, содержат стабилизаторы или эксципиенты. В настоящем изобретении раскрываются способы получения аденовирусных векторов, в частностиrAd35, с очень высокими выходами, и, насколько известно заявителям, ранее не сообщалось о выходах,полученных и описанных в настоящем изобретении. В способах по изобретению используются биореакторы, и биореактор с очень большим числом частиц аденовируса на объем представляет собой непосредственный (промежуточный) продукт по изобретению. Поэтому изобретение также относится к биореактору с рабочим объемом от 2 до 2000 л, предпочтительно от 10 до 1000 л, содержащему культуральную среду, продуцирующие клетки и по меньшей мере 11012 частиц вируса rAd35 (VP)/мл. Культуральная среда может представлять собой любую культуральную среду, подходящую для размножения клеток и инфицирования аденовирусом, как описано выше. Аспекты объема биореактора, продуцирующих клеток и числа частиц rAd35 и отношения VP/IU описаны выше для способов по изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления биореактор соединен с перфузионной системой ATF. В еще одном аспекте изобретение относится к способу получения по меньшей мере 11012 вирусных частиц rAd35 (VP)/мл, причем способ включает: а) культивирование продуцирующих клеток в суспензии перфузионной системой; b) инфицирование rAd35 указанных клеток при плотности от 10106 жизнеспособных клеток/мл до 16106 жизнеспособных клеток/мл; с) дальнейшее культивирование инфицированных клеток перфузионной системой для размножения указанных rAd35, посредством чего концентрация вирусных частиц rAd35 достигает по меньшей мере 11012 VP/мл; и d) сбор указанныхrAd35. До настоящего описания было неизвестно, возможны ли вообще были такие высокие выходыrAd35, не говоря уже о том, как достичь таких высоких выходов. В настоящем изобретении показано, что в соответствии с описанными в данной заявке способами возможны указанные выходы. Предпочтительно, отношение физических частиц к инфекционным частицам собранных rAd35 составляет менее чем 30:1. Другие предпочтительные варианты осуществления представляют собой описанные выше для способов в соответствии с изобретением. Изобретение далее объясняется в следующих примерах. Примеры ни в коей мере не ограничивают изобретение. Они просто служат целям разъяснения изобретения. Примеры Пример 1. Инфицирование вектором Ad5 при высоких величинах плотности клеток Клетки, полученные из рабочего банка клеток PER.C6, оттаивали и размножали в бессывороточной культуральной среде в увлажненном инкубаторе при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование выполняли через каждые 3-4 дня до достижения достаточной плотности клеток для инокуляции двухлитрового биореактора в объеме 1,5 л и плотности клеток от 0,2 до 0,5106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножались в биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Процесс перфузии ATF начинали при плотности клеток 4,7106 общего количества клеток/мл. ATF получали от Refine Technology, Co., East Hanover, NJ. Через 89 ч плотность клеток достигала 12,4106 общего количества клеток/мл. В этот момент часть клеток собирали и клетки центрифугировали в течение 5 мин при 300g. Клеточный осадок после центрифугирования ресуспендировали до следующих концентраций в свежей бессывороточной среде: 1,3106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл 10106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл 20106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл 30106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл Шейкеры инфицировали Ad5.CS (вектор rAd5; Shott et al., 2008) при MOI 90 VP/клетка и инкубировали при 36 С, 10% СО 2 и 100 об./мин. В 1-й и 2-й день после инфицирования выполняли обновление среды для шейкеров, инфицированных в дозе 10, 20 и 30106 жизнеспособных клеток/мл. Это обновление среды выполняли стадией центрифугирования в течение 5 мин при 300g и ресуспендировали клеточный осадок после центрифугирования в 30 мл свежей среды на шейкер. В 3-й день после инфицирования клетки из шейкеров собирали и брали пробы для анализа AEX-HPLC (анионообменной ВЭЖХ). Лизис собранных клеток выполняли смешиванием образца объемом 1 мл из каждого шейкера со 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубацией при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 мкл бензоназы/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцу добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до выполнения анализа анионообменной ВЭЖХ для определения числа продуцированных вирусных частиц (VP/мл). Результаты представлены на фиг. 1. Волюметрический выход инфекции при плотности клеток 10106 жизнеспособных клеток/мл был в 10 раз выше, чем при 1106 жизнеспособных клеток/мл. Это было несколько неожиданно с учетом эффекта плотности клеток, о котором сообщалось в более ранних сообщениях при гораздо более низких величинах плотности (т.е. при плотности примерно 0,5-3106 клеток/мл, например Maranga et al., 2005;Kamen et al., 2004; Altaras et al., 2005). Однако после 10106 клеток/мл наблюдавшийся эффект плотности клеток и волюметрические выходы уменьшались. Пример 2. Инфицирование rAd35 при низких величинах плотности клеток (1-1,6106 жизнеспособных клеток/мл) В примере 1 использовали rAd5. Однако известны различные серотипы аденовирусов, и они были описаны для различных целей. Эти серотипы могут иметь различные свойства и, следовательно, способы, используемые для одного серотипа, не всегда обязательно подходят для другого серотипа. Это может быть особенно уместно в способах промышленного масштаба, где кажущиеся небольшими различия могут иметь большое экономическое значение. Один особенно предпочтительный серотип для использования в настоящих вакцинах является Ad35, и в следующих примерах заявители тестировали возможность увеличения выходов rAd35 для получения больших его количеств. Данный пример показывает инфицирование вектором rAd35 при низких уровнях плотности, по сравнению со следующими примерами, где клетки инфицируются при более высоких уровнях плотности клеток. Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки оттаивали и размножали в бессывороточной культуральной среде в увлажненном инкубаторе при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование выполняли через каждые 3-4 дня до достижения достаточной плотности клеток для инокуляции 10-литровых биореакторов в объеме 5 л и плотности клеток от 0,2 до 0,35106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножались в биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Через 4 дня после заражения (когда плотность клеток достигала от 2 до 3,5106 жизнеспособных клеток/мл) клеточную суспензию разбавляли 5 л свежей среды и в последующем инфицировали rAd35.TB-S (вектором rAd35; Radosevic et al., 2007) при MOI 70 VP/клетка. Размножение вируса выполняли при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. Через 3 дня после инфицирования из биоре- 12019928 акторов брали пробы для подсчета клеток и определения продукции вируса. Для высвобождения вируса 1 мл образца из каждого биореактора смешивали со 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 мкл бензоназы/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцу добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до анализа с помощью анионообменной ВЭЖХ. Всего выполняли 10 циклов биореакторов и анализировали в соответствии с описанным выше способом, и эти циклы дали согласованные результаты (не показаны). Средняя продукция вирусных частиц составляла 2,31011 VP/мл. Для годовой потребности примерно 1,51019 VP при таком выходе должно было бы перерабатываться примерно 65000 л. Это потребовало бы больших установок и, поэтому, больших начальных капиталовложений во время разработки вакцины. Пример 3. Исследование осуществимости способа инфицирования rAd35 при высоких уровнях плотности клеток (10106 жизнеспособных клеток/мл) Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки оттаивали и размножали в бессывороточной культуральной среде в увлажненном инкубаторе при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование выполняли через каждые 3-4 дня до достижения достаточной плотности клеток для инокуляции 2-литрового биореактора в объеме 1,5 л и плотности клеток от 0,2 до 0,5106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножались в биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Перфузию средой начинали при плотности клеток 6,8106 общего количества клеток/мл с использованием системы ATF. Через 70 ч плотность клеток достигала 36,8106 общего количества клеток/мл. В этот момент выполняли следующие инфицирования: Инфицирование в шейкерах при величинах плотности клеток 1,3106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл 10106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл 20106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл 30106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл Инфицирование в масштабе 2-литрового биореактора при 8,7106 общего количества клеток/мл(жизнеспособность 84%) Через один час после инфицирования биореактора образец брали из биореактора и переносили в два шейкера по 250 мл, 30 мл/шейкер. Для процесса инфицирования в шейкерах по 250 мл часть клеточной суспензии из 2-литрового биореактора собирали. И эту суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 300g. Клеточный осадок после центрифугирования ресуспендировали до указанных выше концентраций в свежей бессывороточной среде. Шейкеры инфицировали Ad35.TB-S при MOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, 10% СО 2 и при 100 об./мин. В 1-й и 2-й день после инфицирования в шейкерах выполняли освежение среды при плотности 10, 20 и 30106 жизнеспособных клеток/мл. Это освежение среды выполняли стадией центрифугирования в течение 5 мин при 300g и ресуспендированием клеточного осадка после центрифугирования в 30 мл свежей среды на шейкер. В 3-й день после инфицирования содержимое шейкеров собирали и брали образцы для анализа анионообменной ВЭЖХ. Лизис сбора клеток, выращенных в культуре,выполняли смешиванием 1 мл объема образца из каждого шейкера со 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубацией при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 мкл бензоназы/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до выполнения анализа анионообменной ВЭЖХ. Оставшиеся клетки в 2-литровом биореакторе разбавляли свежей бессывороточной средой до клеточной концентрации 8,7106 общего количества клеток/мл (жизнеспособность 84%). Биореактор инфицировали Ad35.TB-S при MOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. Систему ATF запускали через 15 ч после инфицирования при скорости обновления среды 1 объем биореактора в сутки. В 1-й, 2-й, 3-й и 4-й день после инфицирования брали образцы содержимого биореактора для подсчета количества клеток (счетчик клеток CASY) и определения продукции вируса анионообменной ВЭЖХ. Получение образца выполняли, как описано выше. Образцы хранили при температуре ниже -65 С до выполнения анализа анионообменной ВЭЖХ. Приблизительно через один час после инфицирования биореактора из 2-литрового биореактора брали образец по меньшей мере 60 мл и два инфицирования (в шейкерах по 250 мл) начинали в объеме 30 мл на шейкер. В 1-й и 2-й день после инфицирования обновление среды выполняли для имитации перфузионной системы. Это обновление среды выполняли стадией центрифугированием в течение 5 мин при 300g и ресуспендированием клеточного осадка после центрифугирования в 30 мл свежей среды на шейкер. В 3-й день после инфицирования содержимое шейкеров собирали и брали образцы для анализа анионообменной ВЭЖХ. Образцы готовили, как описано выше. Образцы хранили при температуре ниже -65 С до выполнения анализа анионообменной ВЭЖХ. Результаты представлены на фиг. 2. Результаты показывают, что инфекция от 1,3106 жизнеспособных клеток/мл до 30106 жизнеспособных клеток/мл возможна. В отличие от результатов с rAd5, общие выходы rAd35 увеличивались с увеличением плотности клеток при инфицировании образцов с плотностью даже выше 10106 жизнеспособных клеток/мл. При плотности 30106 жизнеспособных клеток/мл был достигнут волюметрический выход 1,41012 VP/мл. Эти результаты ясно указывают на то, что возможны инфекции Ad35.TB-S при высоких уровнях плотности клеток, т.е. 10106 жизнеспособных клеток/мл или выше. Даже при плотности 30106 жизнеспособных клеток/мл инфекции дали высокие волюметрические выходы. Отмечается, что наблюдается уменьшение единицы производительности со 120000 VP/клетка при 1,3106 клеток до 47000 VP/клетка при 30106 жизнеспособных клеток/мл. Шейкеры, запущенные от клеточной суспензии, которая была инфицирована в биореакторе, проявляют выход сбора клеточной культуры 8,01011 VP/мл и единицу производительности 92000 VP/клетка. Результаты, полученные в 2 литровом биореакторе, несколько ниже: достигнут выход сбора клеточной культуры 51011 VP/мл, что составляет единицу производительности 57000 VP/клетка. Пример 4. Возможность осуществления инфицирования при высоких уровнях плотности клеток другим вектором rAd35 Клетки, полученные из рабочего банка клеток PER.C6, оттаивали и размножали в бессывороточной культуральной среде в увлажненном инкубаторе при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование выполняли через каждые 3-4 дня до достижения достаточной плотности клеток для инокуляции двухлитрового биореактора в объеме 1,5 л и плотности клеток от 0,2 до 0,5106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножались в биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Процесс перфузии ATF начинали при плотности клеток5,1106 общего количества клеток/мл. Через 70 ч плотность клеток достигала 25106 общего количества клеток/мл. В этот момент часть клеток собирали. Клетки центрифугировали в течение 5 мин при 300g и клеточный осадок после центрифугирования ресуспендировали до следующих концентраций в свежей бессывороточной среде: 1,3106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл 10106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл 20106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл 30106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/шейкер, два шейкера по 250 мл Шейкеры инфицировали Ad35.eGFP (rAd35, содержащий другой трансген, а именно, ген GFP) приMOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, 10% СО 2 и 100 об./мин. В 1-й и 2-й день после инфицирования выполняли обновление среды для шейкеров, инфицированных в дозе 10, 20 и 30106 жизнеспособных клеток/мл. Это обновление среды выполняли стадией центрифугирования в течение 5 мин при 300g и ресуспендировали клеточный осадок после центрифугирования в 30 мл свежей среды на шейкер. В 3-й день после инфицирования клетки из шейкеров собирали и брали пробы для анализа анионообменной ВЭЖХ. Лизис собранных клеток выполняли смешиванием образца объемом 1 мл из каждого шейкера со 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубацией при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 мкл бензоназы/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцу добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до выполнения анализа анионообменной ВЭЖХ. Результаты представлены на фиг. 3. Результаты показывают, что инфицирование при высоких уровнях плотности клеток также осуществимо другим вектором (Ad35.eGFP). Волюметрические выходы (фиг. 3) и единица производительности (данные не показаны) были в таком же диапазоне как для вектора Ad35.TB-S. Пример 5. Дальнейшие эксперименты по инфицированию при высоких уровнях плотности клеток вектором rAd35 Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки оттаивали и размножали в бессывороточной культуральной среде в увлажненном инкубаторе при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование выполняли через каждые 3-4 дня до достижения достаточной плотности клеток для инокуляции 2-литрового биореактора при плотности клеток 0,25106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножались в 2-литровом биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Когда достигалась плотность клеток приблизительно 3,7106 общего количества клеток/мл (4-й день после инокуляции), запускалась система ATF. Через 67 ч достигалась плотность клеток 40,7106 общего количества клеток/мл. В этот момент часть клеточной суспензии собирали, а оставшиеся клетки разбавляли свежей средой в 2-литровом биореакторе до плотности клеток 12,7106 общего количества клеток/мл (жизнеспособность 87%, следовательно 11106 жизнеспособных клеток/мл). В последующем 2-литровый биореактор инфицировали Ad35.TB-S при MOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. Систему ATF запускали через 15 ч после инфицирования при скорости обновления среды 5 объемов сосуда в сутки. В 1, 2, 3 и 4-й день после инфицирования, из 2 литрового биореактора брали образцы для подсчета клеток и анализа продукции вируса анионообменной ВЭЖХ. Для высвобождения вируса 1 мл образца смешивали со 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 мкл бензоназы/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при темпера- 14019928 туре ниже -65 С до анализа анионообменной ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 1. Таблица 1. Результаты примера 5 Результаты продемонстрировали, что инфицирование при величинах плотности клеток выше 10106 жизнеспособных клеток/мл осуществимо в биореакторах, соединенных с перфузионной системой,и что возможно увеличение волюметрического выхода почти в 7 раз по сравнению с серийным способом(пример 2). Не наблюдали преждевременной потери клеток инфицированной культуры, указывая на то,что процесс ATF представляет собой целесообразную систему для культивирования инфицированных клеток. Требованием FDA к партиям rAd является отношение VP/IU30. Анализ QPA (анализ активности на основе Q-PCR; Wang et al., 2005) показал, что все образцы отвечали этому требованию. Напротив, образцы, описанные Yuk et al. (2004), имели отношение VP/IU примерно 100 (фиг. 2 А/2 В в указанной публикации). Отношение физических частиц к инфекционным частицам представляет собой релевантный параметр для аденовирусов, и более низкое отношение предпочтительно для партий rAd. Партии, полученные в данном примере, согласованно имели такое низкое отношение примерно от 15:1 до 18:1. Для годовой потребности примерно 1,51019 VP и при выходе примерно 1,51012 VP/мл понадобится переработать примерно 10000 л. Эти объемы могут быть переработаны в установках емкостью 1000 л или менее и, таким образом, снизились бы прямые затраты во время разработки вакцины. Пример 6. Дальнейшие эксперименты по инфицированию при высоких уровнях плотности клеток вектором rAd35 при сниженных скоростях перфузии Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки оттаивали и размножали в бессывороточной культуральной среде в увлажненном инкубаторе при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование выполняли через каждые 3-4 дня до достижения достаточной плотности клеток для инокуляции 2-литрового биореактора при плотности клеток 0,59106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножались в 2-литровом биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Когда достигалась плотность клеток приблизительно 2,9106 общего количества клеток/мл (4-й день после инокуляции), запускалась система ATF. После 118 ч перфузии достигалась плотность клеток 29106 общего количества клеток/мл. В этот момент часть клеточной суспензии собирали, а оставшиеся клетки разбавляли свежей средой в 2-литровом биореакторе до плотности клеток 16,4106 общего количества клеток/мл (жизнеспособность 82%, следовательно, 13,4106 жизнеспособных клеток/мл). В последующем 2-литровый биореактор инфицировали Ad35.TB-S при MOI 70VP/клетка и инкубировали при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. Систему ATF запускали через 15 часов после инфицирования при скорости обновления среды 2 объемов сосуда в сутки. В 1, 2 и 3-й день после инфицирования из 2-литрового биореактора брали образцы для подсчета клеток и анализа продукции вируса анионообменной ВЭЖХ. Для высвобождения вируса 1 мл образца смешивали со 100 мкл 10% Triton X100 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 мкл бензоназы/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до анализа анионообменной ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 2. Результаты продемонстрировали, что инфицирования при величинах плотности клеток выше 10106 жизнеспособных клеток/мл осуществимы в биореакторах, соединенных с перфузионной системой, и что возможно увеличение волюметрического выхода почти в 10 раз по сравнению с серийным способом (пример 2). Не наблюдали преждевременной потери клеток инфицированной культуры, указывая на то, что процесс ATF представляет собой целесообразную систему для культивирования инфицированных клеток. Требованием FDA к партиям rAd является отношение VP/IU30. Анализ QPA (анализ активности на основе Q-PCR; Wang et al., 2005) показал, что все образцы отвечали этому требованию. Напротив, образцы, описанные Yuk et al. (2004), имели отношение VP/IU примерно 100 (фиг. 2 А/2 В в указанной публикации). Отношение физических частиц к инфекционным частицам представляет собой релевантный параметр для аденовирусов, и более низкое отношение предпочтительно для партий rAd. Партии, полученные в данном примере, согласованно имели такое низкое отношение менее чем 10:1. Для годовой потребности примерно 1,51019 VP и при выходе примерно 21012 VP/мл понадобится переработать менее чем 7500 л собранных культивированных клеток. Эти объемы могут быть переработаны в установках емкостью 1000 л или менее и, таким образом, снизились бы прямые затраты во время разработки вакцины. Пример 7. Дальнейшие эксперименты по инфицированию при высоких уровнях плотности клеток вектором rAd35 при сниженных скоростях перфузии Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки оттаивали и размножали в бессывороточной культуральной среде в увлажненном инкубаторе при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование выполняли через каждые 3-4 дня до достижения достаточной плотности клеток для инокуляции 2-литрового биореактора при плотности клеток 0,44106 общего количества клеток/мл. Клетки размножались в 2-литровом биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Систему ATF запускали через 4 дня после инокуляции при плотности клеток приблизительно 2,72106 общего количества клеток/мл. После 144 ч перфузии достигалась плотность клеток 30,5106 общего количества клеток/мл. В этот момент часть клеточной суспензии собирали,а оставшиеся клетки разбавляли свежей средой в 2-литровом биореакторе до плотности клеток 16,2106 общего количества клеток/мл (жизнеспособность 81%, следовательно, 13,1106 жизнеспособных клеток/мл). В последующем 2-литровый биореактор инфицировали Ad35.TB-S при MOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. Систему ATF запускали через 5 ч после инфицирования при скорости обновления среды 2 объема сосуда в сутки. Во 2, 3 и 4-й день после инфицирования из 2 литрового биореактора брали образцы для подсчета клеток и анализа продукции вируса анионообменной ВЭЖХ. Для высвобождения вируса 1 мл образца смешивали со 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 мкл бензоназы/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до анализа анионообменной ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3. Результаты примера 7 Результаты снова продемонстрировали, что инфицирование при величинах плотности клеток выше 10106 жизнеспособных клеток/мл осуществимо в биореакторах, соединенных с перфузионной системой, и что возможно увеличение волюметрического выхода почти в 10 раз, по сравнению с серийным способом (пример 2). Кроме того, примеры 6 и 7 продемонстрировали, что скорость перфузии после инфицирования может быть ограничена двумя объемами сосуда в сутки без нарушения продукции вируса.- 16019928 Для годовой потребности примерно 1,51019 VP и при выходе примерно 21012 VP/мл понадобится переработать менее чем 7500 л собранных культивированных клеток. Эти объемы могут быть переработаны в установках емкостью 1000 л или менее и, таким образом, снизились бы прямые затраты во время разработки вакцины. Пример 8. Дальнейшие эксперименты инфицирования при более высоких уровнях плотности клеток вектором rAd35 в 50-литровом масштабе Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки оттаивали и размножали в бессывороточной культуральной среде в увлажненном инкубаторе при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование выполняли через каждые 3-4 дня до достижения достаточной плотности клеток для инокуляции 10-литрового биореактора при плотности клеток 0,52106 общего количества клеток/мл. Клетки размножались в 10-литровом биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Систему ATF запускали, когда достигалась плотность клеток приблизительно 5,3106 общего количества клеток/мл (через 4 дня после инокуляции). После 169 ч перфузии достигалась плотность клеток 77106 общего количества клеток/мл. В этот момент 10 л клеточной суспензии разбавляли свежей средой в 50-литровом биореакторе до плотности клеток 15,5106 общего количества клеток/мл (жизнеспособность 81%, следовательно, 12,6106 жизнеспособных клеток/мл). В последующем 50-литровый биореактор инфицировали Ad35.TB-S при M.OI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. Систему ATF запускали через 5 ч после инфицирования при скорости обновления среды 2 объема сосуда в сутки. Во 2-й и 3-й день после инфицирования из 50-литрового биореактора брали образцы для подсчета клеток и анализа продукции вируса анионообменной ВЭЖХ. Для высвобождения вируса 1 мл образца смешивали со 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 мкл бензоназы/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до анализа анионообменной ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 4. Таблица 4. Результаты примера 8 Результаты снова продемонстрировали, что инфицирование при величинах плотности клеток выше 10106 жизнеспособных клеток/мл осуществимо в 50-литровых биореакторах, соединенных с перфузионной системой, и что было возможно в 50-литровом масштабе увеличение волюметрического выхода почти в 10 раз, по сравнению с серийным способом (пример 2). В настоящем примере было показано, что масштаб разработанного способа может наращиваться. Объемы собранных культивированных клеток,которые должны перерабатываться в год, для удовлетворения годовой потребности могут быть получены с использованием способа по изобретению. Для годовой потребности примерно 1,51019 VP и при выходе примерно 21012 VP/мл понадобится переработать менее чем 7500 л собранных культивированных клеток. Эти объемы могут быть переработаны в установках емкостью 1000 л или менее и, таким образом,снизились бы прямые затраты во время разработки вакцины. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения по меньшей мере 11012 rAd35 вирусных частиц (VP)/мл рекомбинантного аденовируса серотипа 35 (rAd35), причем способ включает:a) культивирование продуцирующих клеток в суспензии перфузионной системой;b) инфицирование указанных клеток с помощью rAd35 при плотности от 10106 жизнеспособных клеток/мл до 16106 жизнеспособных клеток/мл;c) дальнейшее культивирование инфицированных клеток перфузионной системой для размножения указанного rAd35, где концентрация вирусных частиц rAd35 достигает по меньшей мере 11012 VP/мл; иd) сбор указанного rAd35. 2. Способ по п.1, где указанные клетки на стадии b) инфицируются rAd35 при плотности примерно от 10106 до 14106 жизнеспособных клеток/мл. 3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная перфузионная система на стадии с) представляет собой перфузионную систему с чередующимся тангенциальным потоком (ATF). 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий:e) очистку rAd35 и, необязательно,f) получение фармацевтической композиции, содержащей очищенный rAd35. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанный рекомбинантный аденовирус лишен по меньшей мере части области Е 1 и содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту. 6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная перфузионная система на стадии а) представляет собой перфузионную систему с чередующимся тангенциальным потоком (ATF). 7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия а) выполняется в первом биореакторе, а стадии b) и с) выполняются во втором биореакторе. 8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где отношение физической частицы к инфекционной частице (VP/IU) полученного rAd35 составляет менее чем 30:1, предпочтительно менее чем 20:1. 9. Биореактор, содержащий культуральную среду, продуцирующие клетки и вирусные частицы, где указанный биореактор имеет рабочий объем от 2 до 1000 л, предпочтительно от 50 до 500 л и отличается тем, что содержит по меньшей мере 11012 вирусных частиц rAd35 (VP)/мл. 10. Биореактор по п.9, соединенный с перфузионной системой ATF. 11. Биореактор по п.9 или 10, где вирусные частицы rAd35 имеют отношение VP/IU менее чем 30:1,предпочтительно менее чем 20:1. 12. Способ по любому из пп.1-8, где продуцирующие клетки представляют собой клетки PER.С 6. 13. Биореактор по любому из пп.9-11, где продуцирующие клетки представляют собой клетки