Полипептиды с повышенной экспрессией

010374 Данное изобретение относится к молекулам полипептидов, которые подвергаются модификации с целью улучшения их экспрессионных характеристик. Модифицированные молекулы полипептидов приобретают более высокие показатели экспрессии, чем соответствующие им партнеры, т.е. молекулы полипептидов, которые не модифицированы (на уровне нуклеиновой кислоты). Данное изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим такие полипептиды. Наконец, в данном изобретении предлагается способ получения модифицированных молекул полипептидов, упомянутых выше. Во всем последующем описании при упоминании составных полипептидов подразумеваются как полипептид сам по себе, так и при необходимости соответствующая последовательность нуклеиновых кислот, что будет понятно читателю, сведущему в данной области. То же самое относится к исходному полипептиду и домену, повышающему экспрессию. Экспрессия рекомбинантных полипептидов в системах микробных хозяев является эффективным способом получения больших количеств желаемого полипептида. Когда получаемый полипептид предназначен для применения в качестве диагностического и/или терапевтического средства, часто необходима дальнейшая модификация экспрессируемого полипептида. Например, полипептид, предназначенный для применения в качестве диагностического средства, должен быть модифицирован таким образом,чтобы он мог связываться на твердой основе. Альтернативно, может возникнуть необходимость связывания полипептида с агентом, позволяющим его визуализацию каким-либо известным способом получения изображения. Полипептид, предназначенный для введения пациенту в процессе лечения, необходимо модифицировать для того, чтобы изменить его жизненные свойства, например его фармакокинетические свойства. Дериватизация (получение производных) полипептида, полученного путем рекомбинирования,наиболее часто выполняется с помощью химической реакции между химическим веществом ("дериватизирующим компонентом") и реакционноспособной боковой группой одной или нескольких аминокислот,содержащихся в данном полипептиде. В результате появляется ковалентная связь дериватизирующего компонента с полипептидом, причем местоположение и валентность такой связи(ей) обусловлены соответствующим местоположением и количеством реакционноспособных аминокислот в полипептиде. Это значит, что в полипептиде с множеством реакционноспособных аминокислот химическая связь дериватизирующего компонента с полипептидом будет происходить много раз с местоположениями по всему объему полипептида, соответствующими местоположениям реакционноспособных аминокислот. Для этих целей может быть желательной многовалентная сайт-неспецифичная связь дериватизирующих компонентов с полипептидом, но чаще это нежелательно. Например, в процедуре диагноза для точного количественного выражения измерений может быть важным ограничить количество процессов дериватизации на молекулу полипептида до одного. Подобным образом, успешное терапевтическое применение полипептида in vivo часто зависит от способности практикующего врача точно прогнозировать и регулировать биологическую активность этого полипептида. В такой ситуации изменения, вызываемые нерегулируемой и сайт-неспецифичной дериватизацией применяемого полипептида, могут, понятно,оказаться несовместимыми с намеченным курсом лечения. Вдобавок, сайт-неспецифичная связь терапевтического или диагностического полипептида с дериватизирующим компонентом может привести к снижению необходимой активности полипептида. Это может произойти, например, в случае, когда полипептид с одноцепочным антителом дериватизируется сайт-неспецифично таким образом, что участок связывания антигена пространственно и/или электростатически предотвращается от связывания с антигеном или уменьшается его активность связывания. В таком случае желательный терапевтический или диагностический эффект одноцепочного антитела может быть уничтожен или, по меньшей мере, ослаблен. Кроме того, часто возникает необходимость выполнения рекомбинантных полипептидов таким образом, чтобы дериватизация была возможна только на предопределенных участках или только на одном заранее определенном участке молекулы полипептида. Валентность связи можно выбрать путем регулирования количества реакционноспособных аминокислот в полипептиде, а желаемая активность полипептида и/или химические характеристики можно модулировать путем планирования мест расположения таких связей с тем, чтобы не нарушить физически взаимодействие полипептида с другими молекулами в окружающей среде. Одной из аминокислот, полезных в этом отношении, является цистеин. Значимость его в стабилизации белковой структуры путем образования дисульфидных связей обусловливается тем, что цистеин обычно встречается в полипептидах только в определенных местоположениях. Путем введения одного цистеина в "мягкую" (benign) область полипептида, что не требуется для непосредственного достижения необходимой активности полипептида, можно использовать преимущество реакционноспособной сульфгидрильной боковой цепочки в качестве естественной точки привязки необходимой дериватизации без значительного влияния на активность исходного полипептида или с таким влиянием (Volkel T. et al.(2004) Biochim. Biophis. Acta, 1663, 158-66). Однако введение дополнительных остатков цистеина в полипептиды с целью дериватизации имеет определенные недостатки. Часто исходный полипептид уже имеет остатки цистеина в своей аминокислотной последовательности для стабилизации структуры. Добавочный цистеин, введенный с целью дериватизации полипептида с помощью дериватизирующего компонента, в этом случае может образовать-1 010374 нежелательные дисульфидные связи с такими уже имеющимися в наличии остатками цистеина, разрушая структуру полипептида, необходимую для желаемой активности. Даже если исходный полипептид сам по себе в своей аминокислотной последовательности не содержит никаких остатков цистеина, введение остатков цистеина может, тем не менее, привести к проблемам. Вслед за экспрессией в организме хозяина полипептиды, содержащие аминокислотный остаток цистеина, могут образовать друг с другом полипептидные димеры посредством межмолекулярных дисульфидных связей между триольными (т.е. сульфгидрильными) группами двух остатков цистеина в соответствующих полипептидах (Albrecht H., et al. (2004) Bioconjug. Chem. 15, 16-26; Olafsen Т., et al.(2004), Protein Eng. Des. Sel. 17, 21-7). Эта опасность особенно велика при использовании прокариотных экспрессионных систем для получения полипептида. Это происходит потому, что в таких системах белки постепенно переносятся в периплазматическое пространство микробного хозяина, где преобладают окислительные условия. В то время как такие окислительные условия обязательны для образования необходимых дисульфидных связей, стабилизирующих структуру зарождающейся полипептидной цепочки, они также содействуют образованию нежелательных межмолекулярных дисульфидных связей между свободными остатками цистеина, представляющих собой пункты последующей дериватизации в двух соответствующих полипептидах. Вышеуказанными источниками не ограничиваются сведения об экспрессии в прокариотах. В Luo etal. (1997), J. Biochem. 121, 831-4 описаны эксперименты по сравнению количества экспрессируемого дрожжами мономерного и димерного (т.е. имеющего межмолекулярные дисульфидные связи) полипептида scFv в зависимости от того, содержит ли этот полипептид scFv один или два остатка цистеина наC-конце. Установлено, что scFv с одиночным остатком цистеина на C-конце более подходит для существования в виде димера, a scFv с двумя остатками цистеина на C-конце - в виде мономера. Из этой публикации также ясно, что общее количество экспрессируемого полипептида остается почти одинаковым безотносительно к распределению изоформ. Вдобавок, обнаружено, что структура двух остатков цистеина (которая проявляет тенденцию к образованию межмолекулярной дисульфидной связи) проявляет только слабую интенсивность сцепления. При экспрессировании полипептидов, предназначенных для терапевтического применения, часто оказывается важным исходя из гомогенности продукта вырабатывать мономерную, а не димерную изоформу. Кроме того, предшествующий уровень знания, представленный в вышеупомянутой публикацииLuo et al., обеспечивает исследователя, интересующегося экспрессией мономерного полипептида, дериватизируемого цистеином, определенными средствами для достижения этой цели. Однако из предшествующего уровня знания не известно средства, пригодного для экспрессирования мономерной изоформы в приемлемом количестве и с приемлемой эффективностью связывания. Таким образом, целью данного изобретения является разработка структуры ДНК, позволяющей высокопроизводительную экспрессию соответствующего полипептида, проявляющего приемлемую эффективность связывания, при которой(экспрессии) данный полипептид преимущественно получается в виде мономерного полипептида. Изобретение достигает этой цели путем обеспечения нуклеиновой кислоты, кодирующей так называемый составной полипептид в соответствии с данным изобретением, как описано в его формуле. Нуклеиновая кислота, если она экспрессирована соответствующим образом, обеспечивает составной полипептид, причем упомянутый составной полипептид содержит исходный полипептид и домен, повышающий экспрессию (EED), упомянутый EED содержит первый и второй аминокислотные остатки цистеинаCys1 и Cys2 соответственно, Cys1 располагается ближе к N-концу молекулы рекомбинантного полипептида, чем Cys2, и Cys1 и Cys2 разделяются полипептидным линкером. Упомянутый линкер свободен от цистеина и пролина; определяет длину, достаточную для того, чтобы позволить Cys1 и Cys2 образовывать внутримолекулярную дисульфидную связь друг с другом, и имеет гибкую полипептидную конформацию, по существу, свободную от вторичной полипептидной структуры в водном растворе, и по крайней мере один из Cys1 и Cys2 дериватизируется с помощью дериватизирующего компонента. Путем введения в EED не одного, а двух цистеиновых остатков Cys1 и Cys2 и посредством регулирования длины и точного определения природы полипептидной линкерной последовательности, располагаемой между ними, чтобы способствовать образованию внутримолекулярной дисульфидной связи между Cys1 и Cys2, такая дисульфидная связь образуется, делая Cys1 и Cys2 неспособными соучаствовать в нежелательных межмолекулярных или внутримолекулярных дисульфидных перемычках, как описано выше. В известном смысле, каждый из Cys1 и Cys2 становится соответствующей защитной группой другого. Когда внутримолекулярный дисульфидный контур между Cys1 и Cys2 выполнен, Cys2 можно рассматривать как дериватизирующий компонент для Cys1. Наоборот, Cys1 можно рассматривать как дериватизирующий компонент для Cys2. Составные полипептиды, созданные на уровне нуклеиновых кислот и содержащие два цистеиновых остатка, как описано выше, обладают тем преимуществом, что имеют химические точки привязки для последующей (т.е. производимой после экспрессирования и выделения) дериватизации. В то же самое время резко уменьшается опасность образования нежелательных межмолекулярных дисульфидных свя-2 010374 зей; по существу, опасность в этом случае возникает, главным образом, со стороны других цистеиновых остатков, присутствующих в исходном полипептиде с целью дисульфидной стабилизации полипептидной структуры. Такие дисульфидные связи обычно образуются в окислительной среде во время и/или вслед за трансляцией, когда образующийся полипептид постепенно растет. По существу, любая свободная сульфгидрильная группа цистеина, необходимого для стабилизации полипептидной структуры,обычно относительно быстро находит своего дисульфидного партнера и таким образом ограждается от дальнейших нежелательных реакций. Введение линкера, оптимизированного по длине, химическим и пространственным свойствами, чтобы позволить Cys1 и Cys2 образовать взаимную дисульфидную связь,гарантирует, что Cys1 и Cys2 будут реагировать только друг с другом и не будут реагировать с пространственно отдаленным остатком цистеина в полипептиде, который необходим для стабилизации полипептидной структуры, но который еще не реагировал с предназначенным для него дополняющим цистеиновым остатком. Короче, линкер гарантирует, что Cys1 и Cys2 всегда будут ближе друг к другу, чем любой из них к любому другому цистеиновому остатку в полипептиде. После экспрессирования и выделения такой составной полипептид, выказывающий дисульфидную связь между Cys1 и Cys2, может быть подвергнут воздействию восстановительных условий для ослабления факторов, достаточных для разрыва (только) дисульфидной связи между Cys1 и Cys2. Вслед за этим можно выполнять дериватизацию Cys1 и/или Cys2 с применением дериватизирующих компонентов иных, чем соответствующие другие Cys1 или Cys2. Вдобавок к преимуществу, заключающемуся в получении дериватизированного полипептида (который может быть повторно дериватизирован после выделения) без указанных выше недостатков, также было неожиданно установлено, что полипептиды, построенные с включением EED (т.е. составные полипептиды в пределах смысла данного изобретения), проявляют более высокий уровень полной экспрессии из-за соответствующих нуклеиновых кислот по сравнению с полипептидами, которые не содержат EED. В то время как в составном полипептиде по данному изобретению можно ожидать меньшего содержания нежелательного димера, чем в полипептиде без EED, совершенной неожиданностью, основанной на данных предшествующего знания (например, публикации Luo et al., цитированной выше) является то, что общая экспрессия получаемого в итоге полипептида с приемлемой активностью связей в соответствии с данным изобретением может быть повышена путем введения EE. Кроме того, составной полипептид по данному изобретению можно получать с более высоким выходом по сравнению с исходным полипептидом без EED, причем отношение мономерного составного полипептида к димерному составному полипептиду повышается по сравнению с отношением, наблюдаемым при получении полипептида с недостатком EED. Таким образом, мономерный полипептид не только предпочтителен димерному полипептиду, но общее большее количество полипептида результируется во много большем (более чем 5-кратном) количестве мономерного полипептида, который затем при необходимости можно повторно дериватизировать. Не ограничиваясь теорией, изобретатели полагают, что наблюдаемое неожиданное повышение общего количества экспрессированного полипептида происходит, по крайней мере, частично, вследствие тенденции Cys1 и Cys2 в EED образовывать дисульфидную связь друг с другом. Объяснению такого положения поможет рассмотрение того, что случается во время последующей экспрессии двух идентичных полипептидов, не содержащих EED, как описано выше. Для предварительного обсуждения эти идентичные полипептиды поименованы как PP1 и PP2, и каждый из них содержит один и тот же полипептид, а также C-конец только с одним остатком цистеина (т.е. ни PP1, ни PP2 не содержат EED). Цифры 1 и 2 обозначают здесь не различные виды полипептидов, но скорее временной порядок, в котором идентичные полипептиды экспрессируются. Допустим теперь, что PP1 экспрессируется раньше PP2, и он (PP1) постепенно переносится в окислительную клеточную окружающую среду в направлении NC, означая, что аминокислотное окончание этого полипептида будет первым концом, возникающим в упомянутой окислительной среде. Возникающий таким образом остаток цистеина в исходном полипептиде, который будет соучаствовать в стабилизирующей структуру дисульфидной связи, вынужден только ожидать своего партнера - цистеиновый остаток, причем последний находится ближе к C-концу полипептида, чтобы появиться в окислительной окружающей среде для образования упомянутой дисульфидной связи. Этот процесс продолжается непрерывно до тех пор, пока не образуются дисульфидные связи, необходимые для структурной стабилизации в исходном полипептиде. Когда компонент PP1 исходного полипептида возникнет полностью (и надлежащим образом сложится), появится C-концевая часть PP1 только с одним остатком цистеина. Однако здесь не существует цистеина-партнера, с которым этот одиночный цистеин может реагировать для образования дисульфидной связи; таким образом, этот единичный остаток цистеина остается без пары. Когда PP1 полностью выделится, полипептидная часть PP1 надлежащим образом складывается и стабилизируется дисульфидом, а C-концевая часть молекулы несет единичный цистеиновый остаток с реакционноспособной сульфгидрильной группой. Допустим теперь, что PP2 начинает экспрессироваться в ту же самую окружающую среду, в которой находится завершенный PP1, при этом первоначально возникнет N-конец PP2. Первый цистеиновый остаток в полипептидной части PP2 возникает, но еще не может образовать планируемую структуроста-3 010374 билизирующую дисульфидную связь, поскольку его цистеиновый реакционноспособный партнер в полипептидной части PP2 еще не возник. Однако единичный непарный цистеиновый остаток в полипептидной части PP2 может реагировать с единичным непарным цистеиновым остатком в C-концевой части уже завершенного PP1. Таким образом, между первым остатком цистеина в полипептидной части PP2 и непарным цистеиновым остатком в C-концевой части PP1 образуется нежелательная дисульфидная связь. При таком развитии событий второй цистеиновый остаток в полипептидной части PP2 будет реагировать с непарным цистеиновым остатком в C-концевой части PP2 или другим цистеиновым остатком в полипептидной части PP2. Любым путем множество дисульфидных связей с большой степенью вероятности возникнет в неправильно построенном комплексе лишенного биологической активности исходного полипептида. Такой неправильно построенный полипептид, вероятно, может быть распознан как таковой и подвергнут деградации с помощью внутриклеточной протеиназы, уменьшив тем самым общее количество полипептида. В случае, когда такой неправильно построенный полипептид деградирует таким способом недостаточно интенсивно, он, возможно, существует в виде нерастворимой совокупности с другими неправильно сформированными полипептидами этого типа и может быть удален из правильно построенного полипептида путем обычных процедур выделения полипептида. В любом случае полипептид, построенный неправильно, будет обладать тенденцией уменьшения количества правильно построенного полипептида, получаемого в конечном итоге с помощью обычных процедур выделения полипептида. Наоборот, составной полипептид в соответствии с данным изобретением содержит не только два цистеиновых остатка (Cys1 и Cys2) в EED, но также и линкер, расположенный между ними, причем этот линкер оптимизирован с целью образования дисульфидной связи между Cys1 и Cys2. B свете вышеприведенных соображений, касающихся PP1 и PP2, и допуская теперь, что PP1 и PP2 являются составными полипептидами, предлагаемыми в данном изобретении (т.е. каждый из них содержит EED), становится ясно, что ни Cys1, ни Cys2 в каждом из EED не остается непарным, поскольку Cys1 и Cys2 в соответствующем EED образовывают дисульфидную связь друг с другом. Неправильно построенные полипептиды устраняются, в результате чего продукты не деградируют под воздействием внутриклеточной протеиназы и/или не образуют агрегатов. В конечном итоге, количество экспрессируемого и выделяемого составного полипептида значительно возрастает. Короче, экспрессия составного полипептида, предлагаемого в данном изобретении, результируется в увеличении соотношения мономер:димер в полипептиде. В то же время уровни получаемого полипептида - безотносительно к его изоформам - также возрастают по сравнению с полипептидом без EED, как описано выше. Чистым результатом является то, что очень малое количество димерного и/или мультимерного полипептида и значительно большее количество мономерного полипептида получается с помощью составного полипептида, содержащего EED, как описано выше, по сравнению с полипептидом, в котором EED отсутствует. В пределах смысла данного изобретения следует понимать термины "N-конец " и "C-конец " так,как это принято в биохимии: N-конец полипептида является концом полипептидной цепи в аминогруппе,а C-конец полипептида является концом полипептидной цепи в карбоксильной группе. Тот факт, чтоCys1 располагается ближе к N-концу, чем Cys2, определяет ориентацию Cys1 и Cys2 относительно друг друга в полипептидной цепи. Таким путем также определяется ориентация EED, в котором находятсяCys1 и Cys2. В пределах смысла этого варианта осуществления изобретения полипептидный линкер с "гибкой полипептидной структурой" является полипептидным линкером, имеющим при каждой ковалентной связи в полипептидной цепи степень свободы вращения, достаточную для приведения полипептидного линкера в состояние неограниченного в значительной степени (т.е. ограниченного только его длиной) изменения формы, которую он может принимать в трехмерном пространстве. Можно представить в воображении полипептидный линкер, закрепленный за один конец в воображаемой точке в трехмерном пространстве и определяющий сферу вокруг этой точки с радиусом, соответствующим длине полностью растянутого полипептидного линкера, если этот линкер имеет "гибкую полипептидную структуру", периферический конец этого линкера (т.е. свободный, незакрепленный конец) должен обладать способностью перемещаться одинаково легко в любую точку трехмерного пространства, расположенную на упомянутой сфере или в ее пределах. Эта модель приводит к выводу, что такой полипептидный линкер с"гибкой полипептидной структурой" должен также быть "по существу, свободен от вторичной полипептидной структуры", например растяжений альфа-спирали или бета-пластины. Любое предрасположение полипептидного линкера к идее вторичной структуры полипептида будет неизбежно ограничивать степень пространственной свободы, присущей свободному концу линкера, сдерживая достижение этим концом точек в пределах вышеописанной сферы. Эта гибкость позволяет линкеру сдваиваться, вследствие чего Cys1 и Cys2 могут образовывать внутримолекулярную дисульфидную связь. Нежелательная вторичная структура может быть упорядоченной (как в случае альфа-спирали или бета-пластины, упомянутых выше) или может быть беспорядочной, как можно ожидать, если, скажем, в последовательности линкера присутствовал остаток пролина (кольцо, заключенное в пролин, известно как вызывающее изгибы полипептидной основы). Не ограничиваясь теорией, изобретатели предположи-4 010374 ли, что эта гибкость линкера между Cys1 и Cys2 является главным детерминантом образования дисульфидной связи между этими двумя остатками цистеина и что эффективное образование дисульфидного соединения связывается с заметным усилением общей наблюдаемой экспрессии полипептида (смотри приведенные выше рассуждения). По этому соображению важно устранить включение аминокислот, например пролина, в последовательность линкера, поскольку такое включение ограничивает свободное перемещение линкера, необходимое для перемещения Cys1 и Cys2 вблизи друг от друга, чтобы образовать желаемую дисульфидную связь. Аминокислотные остатки, наличие которых допускается в линкере в соответствии с данным изобретением, могут содержать (но не ограничиваться) Gly, Ala, Val, Leu, Ile,Ser, Thr, Met, Tyr, Asn и Gln. В пределах смысла данного изобретения под термином "дериватизация" следует понимать ситуацию, при которой один или оба аминокислотных остатка Cys1 и Cys2 вступают в реакцию с дериватизирующим компонентом. Дериватизирующий компонент может быть, например, соединением, содержащим малеимидную группу (имид малеиновой кислоты), в частности молекулу PEG (полиэтиленгликоль),содержащую малеимидную группу. В этом частном иллюстративном неограничивающем случае результирующий дериватизируемый Cys1 и/или Cys2 будет дериватизирован с помощью молекулы PEG через ковалентную связь S-C, возникающую в результате нуклеотидного разрушения атомом серы в Cys1 и/или Cys2 с одним из атомов ненасыщенного углерода в малеимидном кольце. Другим примером дериватизирующего компонента может быть молекула, которая сама по себе содержит сульфгидрильную группу, так что результирующий дериватизированный Cys1 и/или Cys2 будет дериватизирован с помощью этой молекулы через ковалентную, т.е. дисульфидную связь S-S. В пределах смысла термина "дериватизация " находится тот факт, что Cys1 и/или Cys2 может реагировать с другим цистеиновым остатком в той же самой или другой полипептидной цепочке. Специфически образование желаемой внутримолекулярной дисульфидной перемычки между Cys1 и Cys2, как описано выше, следует понимать в данном изобретении как выпадение в пределах смысла термина "дериватизация"; в этом случае Cys1 будет дериватизирован с помощью Cys2 и наоборот. В общем, с точки зрения Cys1 понятие "дериватизация" охватывает все действия, при которых Cys1 участвует в ковалентной химической реакции с веществами иными, чем оно само (например, с Cys2). Подобным образом понятие "дериватизация" покрывает все действия, при которых Cys2 участвует в ковалентной химической реакции с веществами иными, чем оно само (например, с Cys1). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения по меньшей мере 75% аминокислотных остатков в линкере выбираются из Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Met, Tyr,Asn и Gln. Наиболее предпочтительными являются Gly, Ser, Ala и Thr. Эти аминокислоты либо незаряжены,либо хорошо или умеренно хорошо растворимы в воде, либо и то, и другое. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения составной полипептид является одноцепочным полипептидом; это значит, что все аминокислоты присутствуют в одиночной полипептидной цепочке с пептидными связями. Преимущество этого варианта заключается в том, что может быть достигнуто очень эффективное продуцирование желаемого одноцепочного полипептидного продукта, поскольку надлежащая конформация продукта будет зависеть только от создания необходимых вторичной и третичной полипептидных структур; четвертичную полипептидную структуру, в которой отдельные полипептиды, проявляющие признаки третичной структуры, связываются межмолекулярно, нет необходимости рассматривать, когда экспрессируемый составной полипептид является одноцепочным составным полипептидом. В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения EED может располагаться на C- или N-конце составного полипептида. Каждое местоположение влечет за собой определенные преимущества, описанные выше, главным образом, наблюдаемое повышение общего количества экспрессированного составного полипептида. Расположенный на C-конце EED будет экспрессирован последним, т.е. после исходного полипептида, с тем результатом, что любые дисульфидные связи в этом полипептиде будут иметь время для формирования как необходимые для стабилизации белка до синтезаEED. Это означает, что когда EED будет полностью синтезирован, желаемая дисульфидная связь междуCys1 и Cys2 в EED будет последней по времени образования дисульфидной связью и что структура исходного полипептида будет уже стабилизирована с помощью внутренних дисульфидных связей. Следовательно, сводится к минимуму опасность образования нежелательных дисульфидных связей междуCys1 или Cys2 в части EED составного полипептида и другими остатками цистеина в исходном полипептиде. Расположение EED на N-конце составного полипептида имеет следствием то, что нуклеиновая кислота, кодирующая EED, будет транслироваться до нуклеиновой кислоты, кодирующей исходный полипептид. Это означает, что дисульфидная связь между Cys1 и Cys2 в EED может образоваться до трансляции любого другого цистеинового остатка в исходном полипептиде. Здесь снова оказывается минимальной опасность нежелательной дисульфидной связи между Cys1 и Cys2 в части EED составного полипептида и остатком цистеина в исходном полипептиде.-5 010374 Следовательно, расположение EED на N- или C-конце составного полипептида может определяться соображениями того, где следует привязать дериватизирующие компоненты к EED, чтобы создать наименьшую вероятность нарушения биологической активности исходного полипептида. Этим путем достигается высокая степень экспериментальной гибкости; экспериментатор имеет возможность выбора местоположения EED, которое позволит исходному полипептиду проявить наивысшую активность в конечном дериватизированном составном состоянии без потери преимуществ, обусловленных наличиемEED. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения EED составного полипептида имеет вид-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m,где n является любым целым числом от 2 до 20;Xaa допускается в каждом положении, будучи любой из встречающихся в природе аминокислот,причем по меньшей мере 75%, даже лучше 80 или 90% остатков Xaa выбираются из Gly, Ala, Val, Ley,Ile, Ser, Thr, Met, Tyr, Asn и Gln. В предпочтительном варианте осуществления все Xaa являются Gly, Ser, Ala или Thr. При допущении переменного n в диапазоне от 2, предпочтительно от 3, до 20 линкер между Cys1 и Cys2 остается достаточно коротким, чтобы способствовать образованию дисульфидной связи между Cys1 и Cys2, но достаточно длинным, чтобы складываться вдвойне. Обнаружено, что для создания дисульфидных связей между Cys1 и Cys2 эффективна длина линкера 4-5, причем для этой цели наиболее предпочтителен линкер длиной в 4 аминокислоты. Обнаружено, что для этой цели из перечисленных выше в этом абзаце аминокислот наиболее подходят Gly и Ser как по отдельности, так и в смеси. Без ограничения теорией изобретатели предполагают это на основании того факта, что Gly является как химически нейтральной,так и слабой, вследствие чего уменьшается склонность линкера к участию в нежелательных химических реакциях при сохранении максимальной степени беспрепятственной пространственной гибкости. Предполагается, что аминокислота Ser благодаря ее гидроксильной группе адекватной степени гидрофильности может помочь предохранению слишком гидрофобного линкера от вовлечения в нежелательные гидрофобные взаимодействия с гидрофобными зонами исходного полипептида. Следует заметить, что в случае, когда EED располагается на N-конце составного полипептида, равенство m нулю может быть преимуществом. Данный вариант исполнения изобретения также позволяет связывать пептидом остаток Pro с Cys2 на C-конце последнего, хотя присутствие Pro и не требуется (т.е. переменное m может также равняться нулю). Наличие Pro обнаружено в некоторых случаях при дальнейшем возрастающем количестве производимой экспрессии составного полипептида. Без ограничения теорией изобретатели полагают, что это является следствием способности пролина ингибировать деградацию протеиназы составного полипептида из C-конца последнего. В особо предпочтительном варианте данного изобретения n=4, а (Xaa)4 представляет собой (Gly)4,(Gly)3Ser, (Gly)2SerGly, GlySer(Gly)2 или Gly(Ser)3. В другом особо предпочтительном варианте данного изобретения n=5, а (Xaa)5 представляет собой (Gly)5, (Gly)4Ser, (Gly)3SerGly, (Gly)2Ser(Gly)2,GlySer(Gly)3 или Ser(Gly)4. Особые преимущества использования Gly и Ser в линкере EED как по отдельности, так и вместе приведены выше. Как отмечено выше, длина линкера в 4 аминокислоты вызывает наиболее эффективное образование дисульфидного пептидного контура между Cys1 и Cys2. В следующем примере осуществления данного изобретения EED присутствует в виде(His)j-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m или Cys1-(Xaa)n-Cys2-(His)j-(Pro)m,где j - любое целое число от 2 до 15;C-стороне Cys2 влечет за собой некоторые преимущества. Во-первых, уже известно (Porath J. et al.(1975), Nature 258, 598-9; Sulkowski E. (1985), Trends in Biotech 3, 1-12), что His-оконечность может быть бесценным инструментом при выделении экспрессированного полипептида с помощью иммобилизированной никелевой колонки, а также при последующем выявлении полипептида. Но, вероятно, более полезным для составного полипептида по данному изобретению является особое воздействие, котороеHis-оконечность оказывает на образование дисульфидной связи между Cys1 и Cys2 и тем самым на общее количество составного полипептида, получаемого при экспрессии. Это воздействие особенно ясно выражается, когда EED располагается на C-конце исходного полипептида с His-оконечностью наC-конце Cys2 - в каждом случае His-оконечность располагается на поверхности раздела EED и исходного полипептида. Без ограничения теорией изобретатели полагают, что это особое воздействие можно объяснить следующим образом: гистидин обычно несет положительный заряд, поэтому отдельные остатки гистидина в повторяющемся гистидиновом лейтмотиве имеют тенденцию отталкиваться друг от друга,что приводит к растяжению полипептидной цепочки в области гистидиновых остатков. Путем размещения этого гистидинового лейтмотива в пределах EED на поверхности раздела между исходным полипеп-6 010374 тидом и EED эти два компонента составного полипептида оказываются оттянутыми настолько далеко друг от друга, насколько позволяет длина His-оконечности. Это является следствием уменьшение вероятности нежелательных взаимодействий между частью EED, содержащей Cys1 и Cys2, с одной стороны,и исходным полипептидом - с другой. В то же время при физическом отделении EED от исходного полипептида возрастает вероятность образования дисульфидной связи между Cys1 и Cys2. Это происходит потому, что Cys1 и Cys2 существуют в этом плане в большей или меньшей физической изоляции от образующегося составного полипептида; в отсутствие любых других сульфгидрильных групп, конкурирующих с Cys1 или Cys2 при образовании дисульфидной связи, более вероятно, что эта связь образуется в желаемой форме между соответствующими сульфгидрильными группами на Cys1 и Cys2. В особенно предпочтительном варианте осуществления данного изобретения j=6, т.е. EED находится в виде(His)6-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m или Cys1-(Xaa)n-Cys2-(His)6-(Pro)m,где Xaa, m и n определены выше. В следующем варианте осуществления данного изобретения дериватизированные Cys1 и/или Cys2 являются продуктами реакции остатка (остатков) Cys1 и/или Cys2 с дериватизирующим компонентом,содержащим, например, малеимидную группу, сульфгидрильную группу или пиридилдисульфидную группу. Все эти химические группы ковалентно реагируют с сульфгидрилом. Преимущество этого варианта осуществления данного изобретения состоит в том, что большинство дериватизирующих компонентов, которые выгодны в использовании для дериватизации составного полипептида, пригодны в виде,функционализированном с одной из этих групп. По существу, составной полипептид, предлагаемый в данном изобретении, можно дериватизировать с помощью широкого разнообразия различных реагентов для различных терапевтических и диагностических целей. Среди указанных выше групп особенно предпочтительна малеимидная группа. Малеимидная группа реагирует почти полностью с сульфгидрилом при умеренных условиях реакции, которые не приносят вред исходному полипептиду в составном полипептиде; в результате создается сильная ковалентная химическая связь между атомом серы цистеина и одним из двух атомов ненасыщенного углерода в кольце малеимидной группы. В особо предпочтительном варианте осуществления данного изобретения дериватизирующий компонент, содержащий малеимидную группу, выбирают из полиэтиленгликольмалеимида (PEG-MAL), малеимид-функционализированного флуоресцентного маркера, малеимид-функционализированного маркера аналитического обнаружения, малеимид-функционализированного радиоактивного индикатора, малеимид-функционализированного белкового сшивающего агента, малеимид-функционализированного хемотерапевтического агента или малеимид-функционализированного токсина, например малеимидфункционализированного иммунотоксина. Соответствующими примерами PEG-MAL являются метоксиPEG-MAL 5 кДа, метокси-PEG-MAL 20 кДа, метокси-(PEG)2-MAL 40 кДа, метокси-PEG-(MAL)2 5 кДа,метокси-PEG-(MAL)2 20 кДа, метокси-PEG-(MAL)2 40 кДа или любая их комбинация. Любой из этих реагентов может использоваться в качестве дериватизирующего компонента, внося известные преимущества полиэтиленгликолизации, включая увеличение периода полувыведения сыворотки и снижение иммуногенности составного полипептида, предлагаемого в данном изобретении. Соответствующими примерами малеимид-функционализированного флуоресцентного маркера являются биотин-малеимид и диоксигенин-малеимид. Соответствующими примерами малеимид-функционализированного радиоактивного индикатора является DTPA-малеимид [DTPA - диэтилентриаминпентауксусная кислота, примеч. перев.]. Соответствующим примером малеимид-функционализированного сшивающего агента являетсяN-гидроксисукцинимидилмалеимидное сшивающее вещество, которое реагирует своей гидроксисукциимидильной частью со свободной аминогруппой другого химического вещества для спаривания, а своей малеимидной частью по меньшей мере с одним из Cys1 и Cys2 на составном полипептиде, предлагаемом в данном изобретении. Сшивающее вещество может преимущественно использоваться, чтобы производить своей N-гидроксисукцинимидильной частью, например, гликосилирование, силилирование или пектинилирование составного полипептида, предлагаемого в данном изобретении. В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения Cys1 и Cys2 дериватизируют компонентом, содержащим сульфгидрильную группу; в частности, упомянутым дериватизирующим компонентом является Cys2, соединенный с Cys1 дисульфидной связью. Процесс, в которомCys1 образует дисульфидную связь с Cys2, описан выше. Примером дериватизации Cys1 и Cys2 с помощью дериватизирующего компонента, содержащего сульфгидрильную группу, является следующее: дериватизирующий компонент является полипептидом или белком, иным, чем составной полипептид по данному изобретению, а дериватизация выполняется путем образования дисульфидной связи, с одной стороны, между Cys1 и/или Cys2 составного полипептида, предлагаемого в данном изобретении, а с другой стороны - остатком Cys другого полипептида или белка. Дополнительным вариантом дериватизирующего компонента, содержащего сульфгидрильную группу, является компонент, содержащий 5-тиол-2-нитробензойнокислотную группу ("TNB-thiol"). В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения как Cys1, так и Cys2 дериватизируют с помощью дериватизирующих компонентов. Это приводит к двум дериватизирующим компонентам на молекулу предлагаемого составного полипептида. Такая дериватизация обладает осо-7 010374 быми преимуществами, когда ей подвергают составной полипептид, предназначенный для использования в качестве визуализирующего реактива. Это является следствием того, что двойная дериватизация на молекулу составного полипептида должна приводить к удвоенному сигналу визуализации с такой же интенсивностью, как и в результате использования составного полипептида, дериватизированного только одним компонентом на молекулу. Двойная дериватизация также обладает преимуществами при некоторых условиях, когда составной полипептид предназначен для использования в качестве терапевтического средства. Например, если желательно перед лечебным приемом полиэтиленгликолизировать составной полипептид и общая молекулярная масса PEG должна составлять 40 кДа, лучше всего дериватизировать Cys1 и Cys2 составного полипептида с помощью двух молекул PEG-MAL по 20 кДа, чем Cys1 или Cys2 с помощью только одной молекулы PRG-MAL 40 кДа. В общем, дериватизацию на Cys1 и Cys2 можно выполнить путем реагирования составного полипептида, предлагаемого в данном изобретении, с молярным избытком дериватизирующего компонента. В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения либо Cys1, либоCys2 дериватизируют с помощью первого дериватизирующего компонента, а соответствующие другиеCys2 и Cys1 дериватизируют с помощью второго дериватизирующего компонента, причем вторая дериватизация не проявляет какой-либо иной функциональности, кроме блокады/защиты остатка Cys, с которым она связана. Следовательно, в описанном выше процессе иногда может быть выгодным или необходимым дериватизировать составной полипептид, предлагаемый в данном изобретении, только единожды,например когда составной полипептид используется в качестве диагностического реактива в той ситуации, когда между биологической активностью исходного полипептида в составном полипептиде и измеряемым сигналом необходима корреляция 1:1. Можно представить себе подобный процесс, в котором,скажем, желательно или необходимо полиэтиленгликолизировать составной полипептид, предлагаемый в данном изобретении, лишь на одной позиции. В таких случаях составной полипептид может быть инкубирован при умеренных условиях восстановления, чтобы восстановить дисульфидную связь, существующую между Cys1 и Cys2, но не любые другие дисульфидные связи, существующие по всей структуре исходного полипептида, чтобы стабилизировать структуру последнего. Такое избирательное восстановление при умеренных условиях, как правило, бывает возможным, поскольку дисульфидные связи, участвующие в стабилизации структуры полипептида, обычно скрыты в этой структуре и, следовательно,труднодоступны для восстановительных агентов в растворе, тогда как незащищенный EED на C-конце более доступен. Вслед за разрывом дисульфидной связи в EED составной полипептид, предлагаемый в данном изобретении, может затем реагировать с первым дериватизирующим компонентом таким образом, что молярная концентрация первого дериватизирующего компонента будет равной или несколько меньшей, чем молярная концентрация предлагаемого составного полипептида. Точное стехиометрическое корректирование этого соотношения может оказаться необходимым в зависимости от используемого первого дериватизирующего компонента, но такое корректирование хорошо укладывается в пределы компетенции квалифицированных практикующих врачей. Вслед за реакцией либо Cys1, либо Cys2 с первым дериватизирующим компонентом единожды дериватизируемый составной полипептид может быть выделен обычными способами и подвергнут следующей реакции со вторым дериватизирующим компонентом. Роль второго дериватизирующего компонента заключается в деактивации остаточной свободной сульфгидрильной группы недериватизированного цистеинового остатка в EED. Для гарантии того, что реакция со вторым дериватизирующим компонентом будет эффективной, эта реакция должна преимущественно выполняться с молярным избытком второго дериватизирующего компонента относительно составного полипептида. В этом смысле второй дериватизирующий компонент может быть любым компонентом, который ковалентно реагирует со свободным цистеиновым остатком в EED и может служить любым из химических соединений, указанных выше в контексте первого дериватизирующего компонента. Поскольку функция второго дериватизирующего компонента состоит всего лишь в том, чтобы сделать остаток цистеина в EED химически инертным, второй дериватизирующий компонент не должен быть помехой ожидаемой активности исходного полипептида или первого дериватизирующего компонента, соединенного с другим цистеиновым остатком в EED. С этой целью второй дериватизирующий компонент должен быть химически и электростатически инертным и настолько слабым, насколько возможно. Особо предпочтительным вторым дериватизирующим компонентом является этилмалеимид. Этот второй дериватизирующий компонент будет реагировать со свободной сульфгидрильной группой цистеинового остатка в EED, чтобы образовать уже описанную ковалентную C-S-связь. В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения исходный полипептид может быть любым полипептидом, для которого желательна соответствующая экспрессия. Сюда включаются все молекулы белка и полипептида различных размеров (т.е. молекулярной массы), независимо от изоэлектрических точек, последовательностей первичных аминокислот или желаемых посттрансляционных модификаций, таких как гликосилирование или фосфорилирование. Исходный полипептид может быть преимущественно рецепторной, лигандной или соединительной молекулой. Он может быть экспрессирован в прокариоты или эукариоты и может быть сам по себе природного или рекомбинантного происхождения.-8 010374 В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения исходный полипептид имеет четное количество цистеиновых остатков, необходимых для стабилизации структуры полипептида. Это является нормальным в случае, когда исходный полипептид существует в виде одноцепочного полипептида (т.е. не будет взаимодействовать в последующей экспрессии с любой другой полипептидной цепочкой, чтобы образовать многоцепочный полипептид), поскольку каждая дисульфидная связь, необходимая для стабилизации структуры полипептида, требует присутствия двух цистеиновых остатков. В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения исходный полипептид является соединительной молекулой в виде антитела. Понятие "антитело " в этом варианте осуществления данного изобретения означает одноцепочные моно- и биспецифичные антитела, а также антитела, содержащие множественные полипептидные цепочки, такие как молекулы иммуноглобулина (в которых может быть выгодно экспрессировать каждую его составляющую полипептидную цепочку с помощью своего собственного EED или диатела (diabodies, в которых две молекулы scFv,каждая со своим собственным EED, связываются линейно "голова к хвосту", образуя молекулярную разновидность, способную связывать два различных антигена. Такие молекулы иммуноглобулина могут быть либо моноспецифичными (т.е. каждый из двух связывающих отростков иммуноглобулина присоединяется к одному и тому же антигену), либо биспецифичными (т.е. два связывающих отростка иммуноглобулина присоединяются к разным антигенам); такие биспецифичные иммуноглобулины получают,например, из гибрид-гибридомы. В особо предпочтительном варианте осуществления данного изобретения исходный полипептид является моноспецифичным одноцепочным антителом. В пределах смысла данного изобретения термин"моноспецифичное одноцепочное антитело" можно понимать как одинарную цепочку полипептида, содержащую по крайней мере один вариабельный участок антитела. Этот один вариабельный участок антитела может быть представлен в природе, например в библиотеке антител природного происхождения,либо может быть синтезирован, при этом он будет содержать элементы, обнаруженные в природе или полученные из природных источников, но эти элементы будут присутствовать в сочетаниях, не встречающихся в природе. Альтернативно, моноспецифичное одноцепочное антитело может содержать как природные, так и синтезированные элементы. Точно попадают в пределы смысла термина "моноспецифичное одноцепочное антитело" однодоменные антитела, молекулы scFv, а также "смягченные" и/или деиммунизированные их варианты. В соответствии со следующим особенно предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения исходный полипептид может быть биспецифичным одноцепочным антителом. В пределах смысла данного изобретения термин "биспецифичное одноцепочное антитело" следует понимать как два описанных выше моноспецифичных одноцепочных антитела, существующих в одинарной полипептидной цепочке и предпочтительно отделенных друг от друга соответствующей полипептидной разделительной последовательностью. Примеры таких спейсеров можно найти в BP 623679 B1 и US 5258498. По существу, составной полипептид может преимущественно представлять собой дериватизированное биспецифичное антитело. В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения биспецифичное одноцепочное антитело содержит первое моноспецифичное одноцепочное антитело (первую связывающую часть), специфично связывающееся с антигеном-эффектором, и второе моноспецифичное одноцепочное антитело (вторую связывающую часть), специфично связывающееся с антигеном-мишенью. Эта основная конструкция имеет то преимущество, что исходный полипептид может специфично связываться своей первой связывающей частью с антигеном-эффектором таким образом, что связанный антигенэффектор, например, становится активированным. Биологическая активность, возбуждаемая этим антигеном-эффектором, затем может быть направлена, например, на клетку, несущую антиген-мишень, с которым связывается вторая часть биспецифичного одноцепочного антитела. Здесь следует понять, что термины "первый" и "второй" не подразумевают ограничения, касающегося расположения частей антитела относительно N- или C-конца полипептида. Следовательно, в пределах объема этого варианта осуществления изобретения составной полипептид содержит исходный полипептид, в котором первая связывающая часть, специфичная к антиген-эффектору, может располагаться в направлении N- или C-конца исходного полипептида. В особо предпочтительном варианте осуществления данного изобретения антиген-эффектор выбирают из антигена CD3, антигена CD64, антигена CD89 и антигена NKG2D. В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения антиген-мишень выбирают из EpCAM, CCR5, CD19,HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (муцин), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC,MUC5B, MUC7, hCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, ганглиозида GD3, 9-0-ацетил-GD3, GM2, Globo H,фукозила GMI, Poly SA, GD2, карбоангидразы IX (MN/CA IX), CD44v6, Shh (Sonic Hedgehog), Wue-1,Plasma Cell Antigen, (мембранно-связанного) IgE, MCSP (Melanoma Chrondroitin Sulfate Proteoglycan),CCR8, предшественника TNF-, STEAP, мезотелина, антигена А 33, PSCA (Prostate Stem Cell Antigen),Ly-6; десмоглеина 4, E-cadherin neoepitope, Fetal Acetilcholine Receptor, CD25, маркера CA19-9, маркераTAG-72), FAP (Fibroblast Activation Antigen), эндосиалина, EGFRvIII, LG, SAS и CD63. Здесь все перечисленные антигены (как антигены-эффекторы, так и антигены-мишени) могут быть человеческими антигенами. В самом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения антиген-мишень является человеческим антигеном CD19, а антиген-эффектор является человеческим антигеном CD3. По существу, этот вариант придает дериватизированному составному полипептиду способность направлять цитотоксичный потенциал T-клеток против лимфоцитов B, несущих антиген CD19. Такое лекарственное средство имеет высокий потенциал как терапевтический агент при лечении злокачественного развитияB-клеток. В результате представляет большой интерес дериватизация такого составного полипептида в его EED с помощью одной или нескольких молекул полиэтиленгликоля (PEG), чтобы увеличить период полувыведения сыворотки с одновременным уменьшением иммуногенности составного полипептида. В другом самом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения антиген-мишень является человеческим антигеном EpCAM, а антиген-эффектор является человеческим антигеном CD3. По существу, этот вариант придает дериватизированному составному полипептиду способность направлять цитотоксичный потенциал T-клеток против клеток, несущих антиген EpCAM. Антиген EpCAM экспрессируется во многих человеческих злокачественных клетках; следовательно, такой дериватизированный составной полипептид имеет высокий потенциал для лечения широкого разнообразия злокачественных опухолей человека. Как и при составном полипептиде анти-CD3 анти-CD19, описанном выше,представляет большой интерес дериватизация такого составного полипептида в его EED одной или несколькими молекулами PEG. Дополнительный аспект данного изобретения относится к композиции, содержащей любой из вышеописанных составных полипептидов и приемлемый в фармакологии носитель. В дополнительном аспекте изобретения предлагается способ получения составного полипептида, в котором составной полипептид содержит исходный полипептид и экспрессируется с более высоким выходом, чем исходный полипептид; упомянутый способ содержит:B) введение в любой конец нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный полипептид,нуклеотидной последовательности, кодирующей домен, усиливающий экспрессию (EED), причем упомянутая нуклеотидная последовательность, кодирующая EED, содержит кодоны для первого и второго цистеиновых аминокислотных остатков Cys1 и Cys2 соответственно, при этом кодон для Cys1 располагается ближе к 5'-концу нуклеотидной последовательности, чем кодон для Cys2, в которой кодоны дляCys1 и Cys2 разделяются нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидный линкер,причем упомянутый линкер свободен от цистеина и определяет длину, достаточную для того, чтобы позволить Cys1 и Cys2 вступать во внутримолекулярную дисульфидную связь друг с другом;C) трансфекция нуклеотидной последовательности из этапа B в систему экспрессии хозяина в соответствующем векторе;D) инкубирование системы экспрессии хозяина при соответствующих условиях, чтобы иметь результатом экспрессию нуклеотидной последовательности из этапа B;E) выделение полипептида, экспрессированного на этапе D, чтобы получить составной полипептид. Предпочтительный вариант осуществления этого аспекта изобретения содержит дополнительный этап дериватизации составного полипептида, полученного на этапе E, на Cys1 и/или Cys2. Такую дериватизацию можно выполнять, как описано выше, а именно путем восстановления внутримолекулярной дисульфидной связи между Cys1 и Cys2 (эта внутримолекулярная дисульфидная связь сама по себе выглядит как дериватизация) при условиях восстановления (например, используя дитиотреитол или DTT) вслед за реакцией восстановления продукта с другим дериватизирующим компонентом, несущим химическую группу, которая реагирует по крайней мере с одной из свободных тиоловых групп Cys1 и Cys2. Данное изобретение будет описано теперь более подробно с помощью следующих неограничивающих чертежей и примеров. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Результаты антиген-специфичного иммуноферментного анализа (ИФА) в зависимости от длины линкера между Cys1 и Cys2. Фиг. 2. Результаты антиген-специфичного ИФА как измерение выходов экспрессии с помощью одного C-концевого цистеинового и двух C-концевых цистеиновых остатков, разделенных 4-глициновым линкером. Фиг. 3. Результаты вестерн-блоттинга как измерение выхода экспрессии с помощью одногоC-концевого цистеинового остатка и двух C-концевых цистеиновых остатков, разделенных 4-глициновым линкером. Фиг. 4. Результаты гель-фильтрационной хроматографии, показывающие профиль элюирования составного полипептида в соответствии с данным изобретением и профиль элюирования полипептида только с одним C-концевым цистеиновым остатком. Фиг. 5. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия(SDS-PAGE) мономерного и димерного видов scFv; результаты получены с помощью гель- 10010374 фильтрационной хроматографии и показаны при невосстановительных (слева) и восстановительных(справа) условиях. Фиг. 6. SDS-PAGE scFv с одним и двумя C-концевыми цистеиновыми остатками до и после реакции с 20 кДа PEG-малеимида. Изобретение будет теперь описано в дальнейших подробностях с помощью следующих неограничивающих примеров. Примеры Пример 1. Клонирование и экспрессия scFv с C-концевой оконечностью (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro(т.е. scFv с EED, как указывалось выше). В качестве образцовой молекулы для демонстрации данного изобретения использовали молекулу scFv, т.е. полипептида, объединяющего вариабельные участки антител с тяжелой и легкой цепочкой и полипептидный линкер, расположенный между ними. Эта scFv специфично связывается с заранее определенным антигеном, далее называемым "антиген". Молекула scFv с C-концевой оконечностью (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro сконструирована с помощью реакции синтеза цепи(PCR) со специфическими затравками VL, а нуклеотидная последовательность независимо расширялась с помощью каждой из соответствующих нуклеотидных последовательностей по основной схеме(A:TGGGGTGGCTGCCCGTAA,B:GCGGTGGCGGTTGCCCGTAA,C:TGCGGTGGCGGTGGCTGCCCGTAA, D:TGCGGTGGCGGTGGCTGCCCGTAA). Это четыре выходные нуклеотидные последовательности, кодирующие четыре отдельные scFv, каждая из которых снабжена C-концевой оконечностью, имеющей два цистеиновых остатка, разделенных глициновыми линкерами переменной длины. His-оконечность использовали на поздних этапах обнаружения и очистки. Результирующие VL-фрагменты субклонировали с помощью сайтов, узнаваемых рестрикционными энзимами SalI и NotI (вводимых с помощью PCR) в pBADpe1B (извлекаемого из вектора pBADMycA - His изInvitrjgen), содержащего соответствующий VH после ведущей последовательности pe1B для экспрессии периплазмы. После преобразования в компетентные к температурному шоку E.coli XLI Blue одиночный клон культивировали в элективных средах (LB 50 мг/мл карбенициллина) и обычными способами получали плазмиду. Успешное клонирование подтверждали определением последовательности аминокислот вставки (Sequiserve, Munich).E.coli BL21DE3 трансформировали с помощью кодирования экспрессионной плазмидой для соответствующей scFv с одним или двумя концевыми остатками Cys и выращивали на селективном агаре. Одну колонию использовали для окулирования 5 мл LB 50 г/мл карбенициллина на протяжении ночи при 37C. Для получения культуры 500 мл SB питательной среды, содержащей 20 мМ MgCl2 и 50 мг/мл карбенициллина в 2 встряхиваемых колбах, инокулировали бактерийной взвесью культуры, ранее инокулированной на протяжении ночи, и затем инкубировали при 37C до оптической плотности OD600 0,6-0,8. Продуцирование вызывали путем добавления L-арабинозы до конечной концентрации 0,2% и уменьшения температуры до 30C. После четырехчасовой фазы продуцирования при 30C бактерии собирали и ресуспендировали в 40 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Через четыре периода замораживания при -70C и отогревания при 37C внешняя мембрана разрушалась температурным шоком и растворенные белки периплазмы, включая фрагменты scFv, выпускались в жидкую среду. После устранения путем центрифугирования целых клеток и клеточных обломков надосадочную жидкость использовали для иммуноферментного анализа (ИФА). ИФА периплазматического препарата выполняли, используя ИФА-пластинку (Nunc MaxiSorp), покрытую ProteinL (2 мг/мл в PBS). Покрытие выполняли с ночной выдержкой при 4C. После промывки(BSA) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки добавляли 50 мл периплазмы, разбавляли постепенно до 1:3 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После дополнительного этапа промывки специфично выполняли обнаружение scFv, связанной с ProteinL, используя 50 млAntigen-Biotin (1,5 мг/мл содержания PBS, 1% BSA), обнаруживаемого с помощью стрептавидинпероксидазы хрена (Dako, 1 мг/мл в PBS, содержащий 1% BSA). Сигнал обнаруживали с помощью добавления 100 мл раствора ABTS (2,2'-азино-ди[3-этилбензтиазолин-сульфонат(6)]диаммониевая соль) в течение 15-30 мин. Величины оптической плотности измеряли на считывающем устройстве ИФА при длине волны 405 нм. Результаты показаны на фиг. 1, где "HCP", "CH2ClyCP", "HC3GlyCP", "HC4GlyCP" и "HC5GlyCP" соответственно относятся к молекулам scFv с C-концевыми оконечностями, содержащими(His)6-Cys-Pro, (His)6-Cys-(Gly)2-Cys-Pro, (His)6-Cys-(Gly)3-Cys-Pro, (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro, (His)6Cys-(Gly)5-Cys-Pro. Как можно видеть на фиг. 1, наибольшая степень связывания scFv с антигеном наблюдалась для конструкций с четырьмя глицинами, используемыми в качестве линкера между двумяC-концевыми остатками цистеина. Пример 2. Подтверждение более высокого выхода белка scFv с оконечностью (His)6-Cys-(Gly)4Cys-Pro (т.е. с EED, как описано выше) по сравнению с scFv с оконечностью (His)6-Cys-Pro (т.е. без EED,как описано выше). Сравнивали уровни экспрессии белка scFv, расширенной с помощью оконечности (His)6-Cys(Gly)4-Cys-Pro (т.е. scFv с EED, как описано выше, обозначенной как "4Gly" на фиг. 2), и scFv, расши- 11010374 ренной с помощью C-концевой оконечности (His)6-Cys-Pro (т.е. scFv без EED, как описано выше, обозначенной как "HCP" на фиг. 2). Обе конструкции анализировали на малой шкале, используя штаммE.coli BL21DE3. В каждом случае 10 различных колоний инокулировали в 5 мл S B/20 мМ MgCl2/50 мг/мл карбенициллина в течение 4 ч при 37C во встряхиваемом инкубаторе. Опять-таки продуцирование белка инициировали с помощью добавления к клеточным культурам 0,2% L-арабинозы и понижением температуры до 30C. После ночного индукционного периода клетки собирали, ресуспендировали в 1 мл PBS и выделяли периплазматическую фракцию методом замораживания/отогревания, после чего проводили антиген-специфичный ИФА, как описано в примере 1. Результаты этого анализа показаны на фиг. 2. Результаты ИФА ясно показывают значительно увеличенный выход scFv с оконечностью(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro(4Gly) в сырой периплазме по сравнению с scFv, содержащей C-концевую(His)6-Cys-Pro, но не содержащей второй цистеиновый остаток. Ясно, кроме того, что способность образования регулируемой внутримолекулярной дисульфидной связи между двумя цистеиновыми остатками в C-концевой оконечности (т.е. EED, как указано выше) имеет решающее значение для достижения наблюдаемого повышенного продуцирования. Далее проводили анализ периплазматических фракций с помощью невосстанавливающегоHis-оконечностью выполняли, используя anti-penta His-антитело, Qiagen (1 мг/мл в PBS, содержащем 0,1% BSA), обнаруживаемый с помощью щелочного соединенного с фосфатазой антитела козы к мышиному, Sigma (1 мг/мл в PBS, содержащем 0,1% BSA). Белковое пятно развивали путем добавления основного раствора BCIP/NBT (Sigma, B-1911). Результаты показаны на фиг. 3. Зоны 1 и 2 на фиг. 3, определенные вестерн-блоттингом, показывают полосы scFv с (His)6-Pro наC-конце. В зонах 3 и 4, соответствующих scFv с (His)6-Cys-Pro на C-конце полипептида в интенсивности полос scFv в вестерн-блоттинге и, следовательно, в общем количестве экспрессированного полипептида,прослеживается крутой спад. Зоны 5 и 6, соответствующие scFv с (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro на C-конце полипептида, показывают интенсивность полос, которая сравнима с интенсивностью, видимой в зонах 1 и 2. Это ясно говорит о том, что потеря экспрессии белка, испытываемая при добавлении одного цистеинового остатка к C-концу полипептида scFv (зоны 3 и 4), восстанавливается путем добавления второго цистеинового остатка, отделенного от первого цистеинового остатка полипептидным линкером, позволяющим образование дисульфидной связи между двумя цистеиновыми остатками (зоны 5 и 6). В совокупности результаты ИФА (фиг. 2) и вестерн-блоттинга (фиг. 3) показывают более высокий выход белка/scFv при конструкции scFv с двумя C-концевыми цистеиновыми остатками по сравнению с конструкцией scFv с одним C-концевым остатком цистеина. Пример 3. Очистка scFv с оконечностью (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro (т.е. EED, как описано выше).E.coli BL21DE3 трансформировали с помощью экспрессионной плазмиды и выращивали на селективном агаре. Одну колонию использовали для инокулирования 5 мл LB 50 мг/мл карбенициллина в течение ночи при 37C. Для продуцирования культуры 50 мл SB/20 мМ MgCl2/50 мг/мл карбенициллина в 2 встряхиваемых колбах инокулировали бактерийной взвесью, ранее инокулированной на протяжении ночи, и выращивали при 37C до оптической плотности OD600 0,6-0,8. Продуцирование белка вызывали путем добавления L-арабинозы до конечной концентрации 0,2% и уменьшения температуры до 30C. После ночной фазы продуцирования при 30C бактерии собирали и ресуспендировали в 40 мл PBS. Внешнюю мембрану разрушали температурным шоком и растворенные белки периплазмы, включаяscFv-фрагмент, выпускали в жидкую среду. После устранения путем центрифугирования целых клеток и клеточных обломков надосадочную жидкость подвергали дополнительной очистке.SCA-молекулы первоначально очищали с помощью колонки для проведения хроматографии по сродству IMAC, воздействующей на C-концевую His-оконечность. Это выполняли, используя колонкуQiagen Ni-NTA в соответствии с методикой, представленной изготовителем. Колонку уравновешивали 20 мМ фосфата натрия 0,4 М NaCl, pH 7,2, и загружали в колонку периплазматический препарат (40 мл) со скоростью подачи 2 мл/мин. Затем колонку промывали 5 объемами колонки уравновешивающего буферного раствора, содержащего 0,025 M имидазола, чтобы удалить несвязанную пробу. Элюирование выполнялось с помощью уравновешивающего буферного раствора, содержащего 0,5 M имидазола в 5 объемах колонки. Элюированные фракции белка объединяли для дальнейших этапов очистки. Для того чтобы достичь разделения молекулярной массы, т.е. разделения на мультимерную, димерную и мономерную фракции, выполняли гель-фильтрационную хроматографию на колонке Superdex S75,уравновешиваемой PBS. Элюированный белок, отслеживаемый путем непрерывного измерения поглощения света 280 нм (скорость потока 1 мл/мин), подвергали обычному SDS-PAGE. Результаты показаны на фиг. 4. На фиг. 4 показаны два профиля элюирования A и B, причем более низкий (профиль A) является профилем элюирования scFv с C-концевым (His)6-Cys-Pro, а более высокий (профиль B) является профилем элюирования scFv с C-концевым (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro (т.е. scFv с EED, как описано выше). Как можно видеть, введение второго цистеинового остатка в C-концевую часть scFv при адекватном отделении ее от первого цистеинового остатка для образования дисульфидного контура приводит не только к более высокому соотношению мономер:димер, но и к более высокому выходу всего белка безотносительно к мономерной или димерной изоформе.- 12010374 Этот оптический анализ подтверждается концентрациями изоформ. Концентрации белка вычисляли, используя значения AUC (определяемые программным обеспечением UNICORN) и специфичного для последовательностей коэффициента поглощения. Полученные величины концентраций сведены в таблицу. Из таблицы можно сделать следующие выводы. Во-первых, соотношение мономер:димер для scFv с одиночным цистеиновым остатком в ее C-концевой части составляет около 1:2,25. Путем добавления второго цистеинового остатка в C-концевую часть scFv и размещения соответствующего линкера между первым и вторым цистеиновыми остатками стимулируется внутримолекулярная дисульфидная связь, а соотношение мономер:димер полученной scFv возрастает приблизительно в 5,5 раза до 1:0,4. С точки зрения полного выхода полипептида безотносительно к его изоформе возрастание выхода от 276,6 мкг для scFv с одиночным цистеиновым остатком до 775,2 для scFv с двумя цистеиновыми остатками представляет собой повышение экспрессии всего белка на 280% или почти в 3 раза. Анализ гель-фильтрованной мономерной и димерной фракции с помощью SDS-PAGE при невосстановительных и восстановительных условиях (фиг. 5) ясно показал, что приблизительно 80% димерной фракции scFv с одиночным цистеиновым остатком в ее C-концевой части являются димерными, сшитыми с помощью дисульфидной связи (фиг. 5, невосстанавливающий гель, зона 2), тогда как димерная фракция scFv с двумя цистеиновыми остатками в ее C-концевой части существует в основном как мономер вследствие образования дисульфидного контура между двумя C-концевыми цистеиновыми остатками (фиг. 5, невосстанавливающий гель, зона 4). Димерная дисагрегация в мономере (фиг. 5, невосстанавливающий гель, зона 4) является показателем того, что агрегация происходила только путем взаимодействия белок-белок, а не вследствие дисульфидного сшивания. Зоны 1 и 3 на фиг. 5 (восстановительные и невосстановительные условия ) показывают соответствующие мономерные фракции. Те же самые пробы были также испытаны с восстанавливающим гелем (фиг. 5). Относительно scFv без оконечности (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro зоны 2 показывают, что любой димер, присутствующий в невосстанавливающем геле, фактически возник вследствие образования нежелательных дисульфидных связей между цистеиновыми остатками в двух соответствующих полипептидных молекулах. То же самое справедливо для остаточного минимального количества димера scFv с оконечностью (His)6-Cys-(Gly)4Cys-Pro (зона 4). Условия восстановления в восстанавливающем геле достаточны для разрыва этих дисульфидных связей таким образом, чтобы только наблюдаемые полосы являлись мономерными видами полипептида scFv, в которых отсутствует цистеиновый остаток scFv, способный образовать дисульфидные связи с любым другим остатком цистеина. Пример 4. Побочное полиэтиленгликолирование scFv с C-концевой оконечностью (His)6-Cys(Gly)4-Cys-Pro и без нее. Результат полиэтиленгликолирования при свободных остатках цистеина должен выразиться в стабильном гомогенном конъюганте scFv-PEG. Два белковых раствора, содержащих, соответственно, очищенную scFv с C-концевой оконечностью (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro и scFv с C-концевой оконечностью(His)6-Cys-Pro инкубировали DTT при конечной концентрации 2 мМ в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы восстановить терминальную дисульфидную связь, результирующуюся в двух свободных сульфгидрильных группах. Затем выполняли гелевую фильтрацию (Sephadex G25M, Amersham) каждого полипептида отдельно, чтобы удалить остаточный DTT, используя в качестве буфера сополимер стирола и бутадиена (PBS). К первой половине каждой пробы полипептида добавляли mPEG-малеимид VW 20 кДа (Shearwater,2D2MOPO1) при 10-кратном молярном избытке молекул PEG. Термин "mPEG" имеет здесь известное значение, а именно "метоксиполиэтиленгликоль". Другую половину каждой пробы полипептида инкубировали с помощью 10 -кратного молярного избытка этилмалеимида (Sigma, E-1271) как контрольную. Каждую реакцию проводили в течение 2 ч с перемешиванием при комнатной температуре. Все пробы анализировали с помощью SDS-PAGE при невосстанавливающих условиях и окрашивали серебром в соответствии с обычной методикой (Invitrogen, каталогLC 6100). Результаты показаны на фиг. 6. В зоне 1 фиг. 6 показана scFv с (His)6-Cys-Pro на C-конце. Остаток цистеина блокировали реакцией с этилмалеимидом. В зоне 2 фиг. 6 показана scFv с (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro на C-конце, где оба остатка цистеина блокированы реакцией с этилмалеимидом. Относительные интенсивности полос в зонах 1 и 2(т.е. полоса в зоне 2 намного более интенсивна, чем полоса в той же позиции в зоне 1) являются мерой интенсивности повышенной экспрессии, достигаемой экспрессированием scFv с двумя C-концевыми цистеиновыми остатками по сравнению с экспрессированием scFv с одним C-концевым цистеиновым остатком. В зоне 3 фиг. 6 показан результат взаимодействия scFv с одним C-концевым цистеиновым остатком с PEG-малеимидом молекулярной массы 20 кДа. Как можно видеть, в верхней части зоны 3 получена только очень слабая полоса, слабость которой является показателем низкого выхода экспрессии и, следовательно, меньшего абсолютного количества scFv, полученного при использовании scFv только с однимC-концевым цистеиновым остатком. В виде резкого контраста в зоне 4 на фиг. 6 показаны две отдельные полосы, которые означают, что scFv с двумя C-концевыми цистеиновыми остатками, отделенными друг от друга 4-глициновым линкером, реагировала с 20 кДа PEG. Одна полоса, полученная при той же молекулярной массе, что и соответствующие непрореагировавшие образцы, показывает, что реакция с 20 кДаPEG не выполнялась. Другая полоса, расположенная выше и полученная при большей молекулярной массе, показывает, что 20 кДа PEG реагировали с обоими цистеиновыми остатками в C-концевой частиscFv, и продукт полиэтиленгликолирования scFv имеет большую молекулярную массу, чем тот же продукт только с одним C-концевым цистеиновым остатком. Следует подчеркнуть, что можно было получить достаточное количество исходного материала, содержащего цистеин, для последующей реакции полиэтиленгликолирования только путем введения в C-концевую часть scFv не одного, но двух цистеиновых остатков, отделенных друг от друга 4-глициновым линкером. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Составной полипептид, содержащий исходный полипептид и домен, усиливающий экспрессию(EED), где упомянутый EED содержит такие первый и второй цистеиновые аминокислотные остаткиCys1 и Cys2, что Cys1 располагается ближе к N-концу молекулы составного полипептида, чем Cys2, в котором Cys1 и Cys2 разделены полипептидным линкером, причем упомянутый линкер свободен от цистеина и пролина; определяет длину, достаточную для того, чтобы позволить Cys1 и Cys2 соединяться внутримолекулярной дисульфидной связью друг с другом; имеет гибкую полипептидную конформацию, по существу, свободную от вторичной полипептидной структуры в водном растворе, в котором по крайней мере один из Cys1 и Cys2 дериватизируется с помощью дериватизирующего компонента и в котором исходный полипептид является антителом. 2. Составной полипептид по п.1, в котором по крайней мере 75% аминокислотных остатков в линкере выбирают из Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Met, Tyr, Asn и Gln. 3. Составной полипептид по п.1 или 2, в котором составной полипептид является одноцепочным полипептидом. 4. Составной полипептид по любому из пп.1-3, в котором EED располагается на C- или N-конце составного полипептида. 5. Составной полипептид по любому из пп.1-4, в котором EED находится в виде-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m,где n является любым целым числом от 2 до 20;Xaa допускается в каждой позиции как Gly, Ala, Thr или Ser. 6. Составной полипептид по п.5, в котором n=4, а (Xaa)4 является (Gly)4, (Gly)3Ser, (Gly)2SerGly,GlySer(Gly)2 или Gly(Ser)3. 7. Составной полипептид по п.5, в котором n=5, а (Xaa)5 является (Gly)5, (Gly)4Ser, (Gly)3SerGly,(Gly)2Ser(Gly)2, GlySer(Gly)3 или Ser(Gly)4. 8. Составной полипептид по любому из пп.5-7, в котором EED находится в виде-Cys1-(Xaa)n-Cys2-His-His-His-His-His-His-(Pro)m. 9. Составной полипептид по любому из пп.1-8, в котором дериватизированный Cys1 и/или Cys2 является продуктом реакции остатка/остатков Cys1 и/или Cys2 с дериватизирующим компонентом, содержащим малеимидную группу, сульфгидрильную группу или пиридил-дисульфидную группу. 10. Составной полипептид по п.9, в котором дериватизирующий компонент, содержащий малеимидную группу, выбирают из PEG-малеимида (PEG-MAL), малеимид-функционализированного флуоресцентного маркера, малеимид-функционализированного маркера аналитического обнаружения, малеимид-функционализированного радиоактивного индикатора или малеимид-функционализированного белкового сшивателя. 11. Составной полипептид по п.10, в котором PEG-MAL выбирают из метокси-PEG-MAL 5 кДа; метокси-PEG-MAL 20 кДа; метокси-PEG-MAL 40 кДа;- 14010374 метокси-PEG-MAL2 5 кДа; метокси-PEG-MAL2 20 кДа; метокси-PEG-MAL2 40 кДа или их любых сочетаний. 12. Составной полипептид по п.9, в котором Cys1 или Cys2 дериватизируют с помощью дериватизирующего компонента, содержащего 5-тио-2-нитробензойную кислотную (TNB-тиол) группу или сульфгидрильную группу, причем, в частности, упомянутый дериватизирующий компонент являетсяCys2, соединенной с Cys1 дисульфидной связью. 13. Составной полипептид по любому из пп.1-12, в котором как Cys1, так и Cys2 дериватизируют с помощью дериватизирующего компонента. 14. Составной полипептид по любому из пп.1-12, в котором Cys1 или Cys2 дериватизируют с помощью первого дериватизирующего компонента, а соответствующую другую Cys2 или Cys1 соответственно дериватизируют с помощью второго дериватизирующего компонента. 15. Составной полипептид по п.14, в котором второй дериватизирующий компонент является этилмалеимидом. 16. Составной полипептид по любому из пп.1-15, в котором упомянутое антитело выбирают из моноспецифичного одноцепочного антитела или биспецифичного одноцепочного антитела. 17. Составной полипептид по п.16, в котором биспецифичное одноцепочное антитело содержит первую часть, специфично связывающуюся с антигеном-эффектором, и вторую часть, специфично связывающуюся с антигеном-мишенью. 18. Составной полипептид по п.17, в котором антиген-эффектор выбирают из человеческого антигена CD3, человеческого антигена CD64, человеческого антигена CD89 и человеческого антигенаNKG2D. 19. Составной полипептид по п.17 или 18, в котором антиген-мишень выбирают из EpCAM, CCR5,CD19, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (муцин), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC,MUC5B, MUC7, hCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, ганглиозида GD3, 9-0-ацетила-GD3, GM2, Globo H,фукозила GM1, Poly SA, GD2, карбоангидразы IX (MN/CA IX), CD44v6, Shh (Sonic Hedgehog), Wue-1,Plasma Cell Antigen, (мембранно-связанного) IgE, MCSP (Melanoma Chrondroitin Sulfate Proteoglycan),CCR8, предшественника TNF-, STEAP, мезотелина, антигена А 33, PSCA (Prostate Stem Cell Antigen),Ly-6, десмоглеина 4, E-cadherin neoepitope, Fetal Acetilcholine Receptor, CD25, маркера CA19-9, маркераTAG-72), FAP (Fibroblast Activation Antigen), эндосиалина, EGFRvIII, LG, SAS и CD63 и в котором все упомянутые антигены являются человеческими антигенами. 20. Композиция, содержащая составной полипептид по любому из предшествующих пунктов и приемлемый в фармакологии носитель. 21. Способ получения составного полипептида по любому из пп.1-19, в котором составной полипептид содержит исходный полипептид и экспрессируется с большим выходом, чем исходный полипептид, причем упомянутый способ содержит:B) введение в любой конец нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный полипептид,нуклеотидной последовательности, кодирующей домен, усиливающий экспрессию (EED), причем упомянутая нуклеотидная последовательность, кодирующая EED, содержит кодоны для первого и второго цистеиновых аминокислотных остатков Cys1 и Cys2 соответственно, при этом кодон для Cys1 располагается ближе к 5'-концу нуклеотидной последовательности, чем кодон для Cys2, в которой кодоны дляCys1 и Cys2 разделяются нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидный линкер,причем упомянутый линкер свободен от цистеина и определяет длину, достаточную для того, чтобы позволить Cys1 и Cys2 вступать во внутримолекулярную дисульфидную связь друг с другом;C) трансфекция нуклеотидной последовательности из этапа В в систему экспрессии хозяина в соответствующем векторе;D) инкубирование системы экспрессии хозяина при соответствующих условиях, чтобы иметь результатом экспрессию нуклеотидной последовательности из этапа В;E) выделение полипептида, экспрессированного на этапе D, чтобы получить составной полипептид. 22. Способ по п.21, содержащий дополнительный этап дериватизации составного полипептида, полученного на этапе E при Cys1 и/или Cys2.