Стабильные жидкие составы ботулинического токсина
Формула / Реферат
1. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция на основе ботулинического токсина, содержащая
фармацевтически приемлемый буфер, обеспечивающий получение буферных значений pH в диапазоне примерно от pH 5 до pH 6, и
изолированный ботулинический токсин,
и являющаяся устойчивой в жидком виде в течение, по меньшей мере, одного года при температуре примерно от 0 до 10шC.
2. Композиция по п.1, для которой указанная температура составляет порядка 5+3шC.
3. Композиция по п.1, для которой указанная температура составляет порядка 4+2шC.
4. Композиция по любому из пп.1-3, в которой указанный буфер имеет рК в диапазоне значений pH 4,5-6,5.
5. Композиция по любому из пп.1-4, которая является устойчивой в жидком виде в течение, по меньшей мере, двух лет.
6. Композиция по любому из пп.1-5, для которой указанный диапазон буферных значений рН составляет приблизительно pH 5,6+0,2.
7. Композиция по любому из пп.1-6, для которой указанный буфер выбирается из группы, включающей фосфатный буфер, фосфатно-цитратный буфер и сукцинатный буфер.
8. Композиция по любому из пп.1-7, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин серотипа, выбранного из группы, включающей серотипы A, B, C1, C2, D, E, F и G.
9. Композиция по п.8, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин типа B, присутствующий в диапазоне концентраций примерно 100-20000 ед./мл.
10. Композиция по п.9, в которой указанный ботулинический токсин типа B присутствует в диапазоне концентраций примерно 1000-5000 ед./мл.
11. Композиция по п.9 или 10, в которой указанный ботулинический токсин типа B присутствует в виде комплекса с высокой молекулярной массой, составляющей порядка 700 кДа.
12. Композиция по п.8, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин типа A, присутствующий в диапазоне концентраций примерно 20-2000 ед./мл.
13. Композиция по п.12, в которой указанный ботулинический токсин типа A присутствует в диапазоне концентраций примерно 100-1000 ед./мл.
14. Композиция по любому из пп.1-13, которая дополнительно содержит белок-наполнитель.
15. Композиция по п.14, в которой указанный белок-наполнитель выбран из группы, включающей сывороточный альбумин, рекомбинантный альбумин из человеческой сыворотки и желатин.
16. Стабильная жидкая фармацевтическая композиции на основе ботулинического токсина, содержащая
фармацевтически приемлемый буфер, обеспечивающий получение буферных значений pH в пределах от pH 5 до pH 6, и
изолированный ботулинический токсин,
и являющаяся устойчивой в жидком виде в течение, по меньшей мере, 6 месяцев при температуре от 10 до 30шC.
17. Композиция по п.16, для которой указанная температура составляет порядка 25шC.
18. Композиция по любому из пп.16 и 17, в которой указанный буфер имеет pK в диапазоне значений pH 4,5-6,5.
19. Композиция по любому из пп.16-18, для которой указанный буфер выбирается из группы, включающей фосфатный буфер, фосфатно-цитратный буфер и сукцинатный буфер.
20. Композиция по любому из пп.16-19, для которой указанный диапазон буферных значений pH составляет приблизительно pH 5,6+0,2.
21. Композиция по любому из пп.16-20, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин серотипа, выбранного из группы, включающей серотипы A, B, C1, C2, D, E, F и G.
22. Композиция по п.21, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин типа B, присутствующий в диапазоне концентраций примерно 100-20000 ед./мл.
23. Композиция по п.22, в которой указанный ботулинический токсин типа B присутствует в диапазоне концентраций примерно 1000-5000 ед./мл.
24. Композиция по п.22 или 23, в которой указанный ботулинический токсин типа B присутствует в виде комплекса с высокой молекулярной массой, составляющей порядка 700 кДа.
25. Композиция по п.21, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин типа A, присутствующий в диапазоне концентраций примерно 20-2000 ед./мл.
26. Композиция по п.25, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин типа A, присутствующий в диапазоне концентраций примерно 100-1000 ед./мл.
27. Композиция по любому из пп.16-26, которая дополнительно включает белок-наполнитель.
28. Композиция по п.27, в которой указанный белок-наполнитель выбран из группы, включающей сывороточный альбумин, альбумин из человеческой сыворотки и желатин.
29. Способ лечения пациента, страдающего болезнью, при которой он нуждается в ингибировании передачи холинергического импульса к отдельной мышце, группе мышц, железе или органу, включающий этап введения в отдельную мышцу, группу мышц, железу или орган пациента фармацевтически эффективной дозы жидкой композиции на основе ботулинического токсина по любому из пп.1-28.
30. Способ по п.29, отличающийся тем, что упомянутая болезнь выбрана из группы, включающей мышечную спастичность, блефароспазм, косоглазие, спазм мышц половины лица, дистонию, отит среднего уха, спастический колит, анизм, асинергию детрузора-сфинктера мочевого пузыря, стискивание челюстей и искривление позвоночника.
31. Способ по п.30, отличающийся тем, что указанный пациент страдает мышечной спастичностью, которая вызвана одним или большим числом факторов, входящих в группу, включающую удар, повреждение спинного мозга, закрытую черепно-мозговую травму, корковый паралич, рассеянный склероз и болезнь Паркинсона.
32. Способ по п.30, отличающийся тем, что указанный пациент страдает дистонией, выбранной из группы, которая включает спастическую кривошею (шейную дистонию), спастическую дисфонию, дистонию конечностей, дистонию гортани и нижнечелюстную дистонию (дистонию Мейджа).
33. Способ по п.29, отличающийся тем, что указанная отдельная мышца или группа мышц создает морщину или борозды на брови.
34. Способ по п.29, отличающийся тем, что указанной мышцей является промежностная мышца, а указанным пациентом является женщина во время родов.
35. Способ по п.29, отличающийся тем, что указанный пациент страдает от состояния, входящего в группу, которая включает миофасциальные боли, головную боль при мигрени, сосудистые расстройства, невралгию, невропатию, артритную боль, боль в спине, гипергидроз, ринорею, астму, повышенное слюноотделение и избыточное выделение желудочного сока.
36. Способ по любому из пп.29-35, отличающийся тем, что указанный пациент невосприимчив к серотипу A ботулинического токсина и указанный ботулинический токсин в указанной композиции выбран из группы, включающей серотипы B, C1, C2, D, E, F и G.
37. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанный ботулинический токсин в указанной композиции представляет собой ботулинический токсин типа B.
38. Способ по любому из пп.29-35, отличающийся тем, что указанный пациент невосприимчив к серотипу B ботулинического токсина и указанный ботулинический токсин в указанной композиции выбран из группы, включающей серотипы A, C1, C2, D, E, F и G.
39. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанный ботулинический токсин в указанной композиции представляет собой ботулинический токсин типа A.
40. Применение устойчивой жидкой композиции на основе ботулинического токсина по любому из пп.1-28 для приготовления медикамента, подлежащего использованию в лечении пациента, нуждающегося в ингибировании передачи холинергического возбуждения к отдельной мышце, группе мышц, железе или органу.
41. Применение по п.40, отличающееся тем, что указанный пациент страдает расстройством, входящим в группу, которая включает мышечную спастичность, блефароспазм, косоглазие, спазм мышц половины лица, дистонию, отит среднего уха, спастический колит, анизм, асинергию детрузора-сфинктера мочевого пузыря, стискивание челюстей и искривление позвоночника.
42. Применение по п.41, отличающееся тем, что указанэыщ пациент страдает мышечной спастичностью, которая вызвана одним или большим числом факторов, входящих в группу, включающую удар, повреждение спинного мозга, закрытую черепно-мозговую травму, корковый паралич, рассеянный склероз и болезнь Паркинсона.
43. Применение по п.41, отличающееся тем, что указанный пациент страдает дистонией, входящей в группу, которая включает спастическую кривошею (шейную дистонию), спастическую дисфонию, дистонию конечностей, дистонию гортани и нижнечелюстную дистонию (дистонию Мейджа).
44. Применение по п.40, отличающееся тем, что указанная отдельная мышца или группа мышц создает морщину или борозды на брови.
45. Применение по п.40, отличающееся тем, что указанной отдельной мышцей является промежностная мышца, а указанным пациентом является женщина во время родов.
46. Применение по п.40, отличающееся тем, что указанный пациент страдает от состояния, входящего в группу, которая включает миофасциальные боли, головную боль при мигрени, сосудистые расстройства, невралгию, невропатию, артритную боль, боль в спине, гипергидроз, ринорею, астму, повышенное слюноотделение и избыточное выделение желудочного сока.
47. Применение по любому из пп.40-46, отличающееся тем, что указанный пациент невосприимчив к ботулиническому токсину типа A и указанный ботулинический токсин в указанной композиции выбран из группы, включающей серотипы B, C1, C2, D, E, F и G.
48. Применение по п.47, отличающееся тем, что указанный ботулинический токсин в указанной композиции представляет собой ботулинический токсин типа B.
49. Применение по любому из пп.40-46, отличающееся тем, что указанный пациент невосприимчив к ботулиническому токсину типа B и указанный ботулинический токсин в указанной композиции выбран из группы, включающей серотипы A, C1, C2, D, E, F и G.
50. Применение по п.49, отличающееся тем, что указанный ботулинический токсин в указанной композиции представляет собой ботулинический токсин типа A.
Текст
1 Область техники Изобретение относится к лечебным композициям на основе ботулинического токсина,устойчивым при хранении в жидком виде при температурах 0-10 С в течение, по меньшей мере, 1-2 лет. Список литературыTsui, J.K.C. (1986), Lancet 2: 245-247. Предпосылки создания изобретения Ботулинический токсин представляет собой полипептидный продукт жизнедеятельности анаэробной бактерии Clostridium botulinum. Этот токсин вызывает у млекопитающих мышечный паралич в результате блокирования высвобождения ацетилхолинового нейромедиатора пресинаптическими клетками в нервномышечном соединении. Хотя действие этого токсина долгое время ассоциировалось с ботулизмом со смертельным исходом, в последние 2 годы он используется в терапевтических целях для лечения некоторых непроизвольных нарушений мышечных движений, в том числе очаговых дистоний (таких как косоглазие, эссенциальный блефароспазм и спазм мышц половины лица), а также сегментарных дистоний (типа кривошеи, нижнечелюстной дистоний и спастической дисфонии) и мышечной спастичности. Он нашел также применение по ряду косметических показаний, в частности в консервативном сокращении количества "морщин угрюмости" на лице, а также при лечении гипергидроза(усиленной потливости). В настоящее время существуют два препарата на основе ботулинического токсина типа А,одобренных для терапевтического использования на людях, - это "ВОТОХ" (Oculinum; Allergan Inc., Irvine, CA) и "DYSPORT" (Spexwood Pharmaceuticals. Ltd.; U.K.). Обе эти композиции поставляются врачам в лиофилизированном виде (после сублимационной сушки) и подлежат восстановлению непосредственно перед использованием. Учитывая различия между отдельными пациентами в необходимой дозировке, возможна существенная разница в дозах, назначаемых каждому конкретному пациенту. Кроме того, по ряду показаний врачи могут назначать лишь небольшую часть содержимого приготовленной ампулы в течение довольно длительного времени, который может составлять до нескольких часов. Несмотря на то, что в одном из опубликованных исследований указано, что жидкие композиции на основе ботулинического токсина можно повторно замораживать и оттаивать с сохранением практически неизменного действия (Шанц и Коттер, 1978), в более поздних работах, посвященных оценке активности восстановленного токсина, доказано, что "ВОТОХ" теряет, по меньшей мере, 44% эффективности после восстановления и хранения в стандартном холодильнике (порядка 4 С) в течение 12 ч. Более того, в случае хранения восстановленной композиции в низкотемпературной камере при температуре -70 С она по прошествии двух недель теряет порядка 70% эффективности (Гартлан и Хоффман, 1993). По этой причине рекомендуется не использовать такие композиции позднее, чем через 4 ч после восстановления, так как это может привести к существенной убыли лекарства с соответствующим увеличением затрат для пациента. Учитывая вышесказанное, возникает потребность в готовой к употреблению жидкой композиции на основе ботулинического токсина, которая была бы пригодной к удобной отгрузке, хранению и применению в соответствии с нуждами практических врачей. Такая композиция и предлагается в соответствии с настоящим изобретением. 3 Краткое изложение сущности изобретения Целью изобретения является получение устойчивых жидких композиций на основе ботулинического токсина для использования в составе фармацевтических препаратов. Преимущество предлагаемых композиций состоит в том, что в отличие от некоторых уже имеющихся на рынке, они демонстрируют устойчивость в жидком виде при хранении в течение длительного времени (год и более) при стандартных температурах холодильника (приблизительно 42 С, или порядка 2-8 С, или, в более общем случае, в пределах от 0 до 10 С). В соответствии с одним из признаков изобретения, композиции устойчивы в жидком виде в случае хранения при комнатной температуре (порядка 25 или, в более общем случае, в пределах от 10 до 30) в течение, по меньшей мере, полугода. Такие композиции особенно эффективны в условиях,когда лечебный эффект достигается благодаря снижению или подавлению передачи импульса от холинергических нервных волокон в какуюлибо область, в частности к мышце или группе мышц, железе или органу. Ниже по тексту описания приводятся некоторые примеры таких композиций. В соответствии с одним из признаков изобретения, предлагается устойчивая жидкая фармацевтическая композиция, включающая изолированный ботулинический токсин и буферное вещество, обеспечивающее получение буферной области значений рН примерно от рН 5 до рН 6. Согласно этому основному варианту осуществления, токсин смешивается с буферной жидкостью с образованием жидкой композиции,имеющей рН от 5 до 6, в частности примерно от 5,4 до 5,8, а предпочтительнее -примерно от 5,5 до 5,6. Получаемая таким образом композиция оказывается устойчивой в течение, по меньшей мере, года, а также в течение, по меньшей мере,двух лет при температурах от 0 до 10 С или, по меньшей мере, 6 месяцев при более высоких температурах. В принципе, согласно изобретению можно вводить в предлагаемые композиции любые из известных серотипов ботулинического токсина (напр., серотипы А, В, С 1, С 2, D,Е, F или G) либо другие серотипы с аналогичной биологической активностью. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления, используемый в композиции ботулинический токсин представляет собой токсин серотипа А или В, выделенный из Clostridium botulinum. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления, ботулинический токсин типа В присутствует в композиции в виде комплекса с молекулярной массой 700 кДа в концентрации порядка 100-20 000 ед./мл, в частности, порядка 1000-5000 ед./мл. При использовании же токсина типа А он применяется, как правило, в концентрации порядка 20-2000 ед./мл, в частности, порядка 100-1000 ед./мл. 4 Если в композиции применено сочетание разных серотипов, то их полезную дозировку или пределы концентрации можно определить путем соотнесения с дозами и концентрациями, приведенными в качестве примеров в описании, с учетом их соответствующей биологической активности. Что касается буферных веществ, то для предлагаемых композиций используются физиологические буферы, которые считаются безопасными при инъекции в ткани млекопитающих, в частности человека. В качестве наиболее типичных буферов можно назвать, хотя возможный перечень ими не ограничивается,фосфатные, фосфат-цитратные, сукцинатные,ацетатные, нитратные, аконитатные, малатные и карбонатные системы. Целесообразно включить также в состав композиции какой-нибудь инертный белковый наполнитель типа альбумина из человеческой сыворотки или желатина. Следует иметь в виду, что специалистами в данной области признаны и используются ряд аналогов, приведенных выше в качестве примера буферных веществ и белковых наполнителей. Композиции токсина согласно изобретению можно помещать в любую из традиционных емкостей или ампул, надежно сохраняя при этом их эффективность. В соответствии с одним из сопутствующих признаков изобретения, заявляется способ лечения пациентов, нуждающихся в подавлении передачи импульса от холинергических волокон,например, к отдельной мышце или группе мышц либо в область какой-либо конкретной железы, напр., к потовым железам, либо к отдельному органу с холинергической иннервацией. Кроме того, изобретение предусматривает использование предлагаемых композиций в получении медикаментов для лечения подобных заболеваний. Ниже приведены примеры терапевтических и косметических показаний к применению композиции на основе ботулинического токсина. В качестве первых можно назвать, хотя ими возможный перечень не ограничивается, блефароспазм, косоглазие, спазм мышц половины лица, отит среднего уха, спастический колит,анизм, асинергия детрузора-сфинктера мочевого пузыря, стискивание челюстей, искривление позвоночника, мышечная спастичность, в частности обусловленная такими взятыми по отдельности или в сочетании признаками, как удар, повреждение спинного мозга, закрытая черепно-мозговая травма, корковый паралич,рассеянный склероз и болезнь Паркинсона, а также дистония (напр., спастическая кривошея,или шейная дистония, спастическая дисфония,дистония конечностей, дистония гортани и нижнечелюстная дистония, или болезнь Мейджа). Можно также вводить композицию в промежность (промежностные мышцы) пациенток во время родов с целью расслабления этих 5 мышц. Что касается косметических показаний к применению композиции, то они могут включать ее введение в мышцы, отвечающие за образование морщин на лице или борозд на бровях. Кроме того, применение композиции показано при миофасциальных болях, головной боли при мигрени, сосудистых расстройствах, невралгии,невропатии, артритных болях, болях в спине,усиленной потливости, ринорее (истечении слизи из носа), астме, повышенном слюноотделении и избыточном выделении желудочного сока. В качестве конкретных путей введения композиций согласно изобретению используются внутримышечный, подкожный или с использованием электрофореза. Так, например, в ходе исследований, проведенных в целях подтверждения идеи изобретения, было обнаружено,что ботулинический токсин типа В демонстрирует высокую эффективность в лечении шейной дистонии при внутримышечном введении в разделенных на курс лечения или разовых суточных дозах в пределах от 5000 до 10 000 единиц. В соответствии с другим аспектом изобретения, предлагается способ лечения пациентов,обладающих повышенным иммунитетом или резистентностью к какому-либо конкретному серотипу ботулинического токсина, с помощью устойчивой жидкой композиции, включающей другой серотип. Так, например, пациента, невосприимчивого к серотипу А ботулинического токсина, можно лечить устойчивой жидкой композицией, содержащей любой из серотипов В, С 1, С 2, D, Е, F или G, а пациента, невосприимчивого к серотипу В - композицией, содержащей любой из серотипов А, С 1, С 2, D, Е, F иG, с получением пролонгированной эффективности. Указанные и другие цели и признаки изобретения с большей очевидностью явствуют из нижеследующего детального описания в сочетании с прилагаемыми иллюстрациями. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение направлено на получение устойчивых жидких фармацевтических композиций на основе ботулинического токсина, а также на некоторые применения таких композиций. Хотя в настоящее время на рынке имеются препараты на основе ботулинического токсина для самого разнообразного применения в терапии и косметике, учитывая неустойчивость активного токсинного ингредиента раствора, приходится восстанавливать композиции из лиофилизированных ингредиентов, к которым предъявляются строгие требования в отношении хранения. Так, например, "ВОТОХ" выпускается в виде лиофилизированного порошка, который необходимо отгружать и хранить в морозильной камере при температуре-5 С или ниже с последующим восстановлением путем добавления отмеренного количества солевого раствора непосредственно перед приме 003367 6 нением. Рекомендуется вводить композицию пациенту не позднее, чем через 4 ч после восстановления, а также охлаждать в течение этого времени любой восстановленный продукт (PDR,1997); замораживание и оттаивание такого продукта не рекомендуются (Хоффман, 1993). Согласно изобретению заявляется устойчивая жидкая композиция, содержащая ботулинический токсин и демонстрирующая устойчивость в жидком виде в течение, по меньшей мере, одного года при стандартных температурах холодильника, а также в течение, по меньшей мере, шести месяцев при комнатной температуре. Преимущество такой композиции состоит в том, что она не требует каких-либо особых мер по хранению или транспортировке и, кроме того, позволяет уменьшить вероятность ошибочного разведения токсина, которая могла бы привести к передозировке.I. Определения Используемый в описании термин "стабильный" или "устойчивый" подразумевает сохранение биологической активности или эффективности биологически активного вещества,более конкретно ботулинического токсина, в течение заданного или неопределенного времени. Термин " ботулинический токсин" относится к биологически активному белку или белковому комплексу, который получают, как правило, из бактерии Clostridium botulinum. Он применим к любому из, по меньшей мере, восьми известных разных в серологическом отношении токсинов (А, В, С 1, С 2, D, Е, F и G), а также к любым другим ботулиническим токсинам, обладающим такой же общей способностью к подавлению передачи от холинергических нервных волокон и формирующим активную молекулу. В ряде случаев этот термин можно также отнести к белку-носителю, который выводится тоже из С. botulinum и образует комплекс с активной молекулой, как описано ниже в разделе IIIA. Как показано ниже, разные серотипы ботулинического токсина связаны между собой фармакологически, но различаются в иммунологическом плане. Как правило,активная молекула токсина имеет размеры приблизительно от 145 до 170 кДа. Применительно к настоящему изобретению, будем считать, что белок токсина включает токсины и белкиносители, изолированные от естественных источников, а также соответствующие токсины и белки-носители, которые получают путем рекомбинации с использованием известных технологий. Кроме того, термин "ботулинический токсин" охватывает белки, содержащие аминокислотные последовательности, которые включают консервативные аминокислотные замены,в том числе делении, по сравнению с известными последовательностями ботулинического токсина, как это будет показано ниже."Биологическую активность" ботулинического токсина следует понимать как его способность блокировать передачу нервного возбуждения в зонах синапсов, имеющих ацетилхолиновые рецепторы, посредством блокирования выхода ацетилхолина из нервных окончаний. В нижеследующем тексте этот термин используется попеременно с терминами "подавление холинергической передачи", "подавление холинергического импульса", "редукция холинергического импульса", а также с их различными видоизменениями. Анализы in vitro для оценки биологической активности токсина включают в себя, как показано ниже, пробу на LD50 (полулетальную дозу) на мышах. "Единица" активности определяется в рамках такой пробы как количество белка токсина, необходимое для того, чтобы вызвать гибель 50% мышей, тестированных с такой дозировкой. Функциональное определение этого термина приведено ниже в примере 2. Наиболее распространенные аминокислоты обозначаются здесь через их одно- или трехбуквенные сокращения: аланин (А, Аlа), цистеин (С, Cys), аспаргиновая кислота (D, Asp), глутаминовая кислота (Е, Glu), фенилаланин (F,Phe), глицин (G, Gly), гистидин (Н, His), изолейцин (I, Ile), лизин (К, Lys), лейцин (L, Leu),метионин (М, Met), аспарагин (N, Asn), пролин(Р, Pro), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg),серин (S, Ser), треонин (Т, Thr), валин (V, Val),триптофан (W, Тrр), тирозин (Y, Туr). Термин "жидкие фармацевтические композиции" относится к фармацевтически активным составам лекарства или биопрепарата, которые можно хранить в жидком фармацевтическом наполнителе типа буферированного солевого раствора или физиологического буферного вещества, в течение достаточно длительного времени. Композиция может представлять собой концентрированный состав, который перед употреблением разбавляют в такой же или другой жидкости. Термин "буфер" (буферное вещество) относится к соединению (обычно соли), которое при его растворении в водной среде служит для поддержания концентрации свободного иона водорода в растворе в пределах определенного диапазона значений рН, когда ионы водорода добавляются к раствору или выводятся из него. Если соль или раствор выполняет эту функцию,считается, что они обладают "буферным действием" или "буферируют" раствор в таком диапазоне. Как правило, буферное вещество обладает надлежащей буферной емкостью в пределах 1 единицы рН от его рК. "Физиологическим буферным веществом" считается такое буферное вещество, которое нетоксично для млекопитающих, в частности людей, при его введении в составе фармацевтического препарата. Ниже приведен ряд примеров физиологических буферных веществ, пригодных для целей изобретения."Фармацевтически приемлемой жидкостью" является такая жидкость, которая считается безопасной при употреблении или введении в организм млекопитающих, в частности людей. Термин "белок-наполнитель" в том понимании, как он используется в тексте описания,относится к белкам, которые вводятся в фармацевтически активный препарат, не добавляя ему в сколько-нибудь существенной степени биологической активности. В качестве примеров белков-наполнителей можно назвать, хотя ими возможный перечень не ограничивается, сывороточные альбумины, в частности альбумин из человеческой сыворотки, и желатин. Такие белки должны быть предпочтительно не иммуногенными для видов млекопитающих, которым назначается фармацевтическая композиция. Используемый ниже по тексту и, в частности, в пунктах формулы изобретения термин"характеризующийся наличием". Какой-либо состав или способ, "содержащий" элементы А,В и С, может включать, в дополнение к А, В и С, другие ранее не указанные элементы, например, Х или Y. Понятие "около" в том смысле, в каком оно используется ниже по тексту и, в частности,в пунктах формулы изобретения, означает "приблизительно" или "близко к". Применительно к численным значениям, его можно интерпретировать, не будучи связанными каким-либо точным численным выражением, как некоторое оценочное значение, составляющее 10% от ранее указанного значения или диапазона. Что касается всех остальных используемых в описании терминов, то их следует толковать с учетом обычных определений, известных специалистам в данной отрасли знаний или приводимых в общепринятых медицинских или научных словарях.II. Ботулинический токсин Как было сказано выше, ботулинический токсин представляет собой полипептидный продукт, получаемый из различных штаммов бактерии Clostridium botulinum. Эти штаммы продуцируют, по меньшей мере, восемь известных токсинов, различающихся в серологическом отношении (А, В, С 1, С 2, D, Е, F и G). Каждый из штаммов С. barati m и С. butyricum продуцируют единственный серотип, подобный, соответственно, серотипам Е и F (Симпсон, 1993). Как правило, молекула токсина имеет размеры от 145 до 170 кДа. В некоторых случаях активная молекула токсина состоит из двух цепей с дисульфидной связью, образованных из полипептида-предшественника. Так, например, ботулинический токсин типа В продуцируется из одиночного полипептида-предшественника в 150 кДа, который разрывается с образованием двух фрагментов с дисульфидной связью - тя 9 желой цепи (Н-цепи) в 100 кДа и легкой цепи(L-цепи) в 50 кДа при максимальной активности. Встречающийся в природе токсин демонстрирует нековалентную связь с нетоксичными белками-носителями, также продуцируемыми бактерией С. botulinum. Эти белки-носители связываются с цепями токсина с образованием комплексов, имеющих массу до 900 кДа (Тип А) и предпочтительно порядка 700 кДа для типа В. Белки-носители претерпевают совместную очистку с токсином, образуя оптимальную составную часть описываемых здесь композиций. Разные серотипы ботулинического токсина демонстрируют различную специфичность по связывании в клетках. Так, например, токсины типа А и типа Е связываются, по-видимому, с одним и тем же синаптосомальным центром связывания, тогда как токсин типа В связывается с отличным от него центром и не создает конкуренции в связывании в центре, свойственном для типов А/Е (Меллинг, 1988). Не ограничиваясь лишь какой-то конкретной теорией или механизмом действия, укажем тем не менее,что, по-видимому, Н-цепь токсина обеспечивает нейронное цитосвязывание и пенетрационную активность, в то время как действие L-цепи направлено на ингибирование выделения ацетилхолина в зоне синапса. Кроме того, можно полагать, что ботулинические токсины типов А и В используют несколько разные механизмы для подавления выхода ацетилхолина: тип А расщепляет синаптически ассоциированный белок-25(SNAP-25), в то время как тип В расщепляет везикулярно ассоциированный мембранный белок (VAMP, или синаптобревин), причем оба указанных белка являются компонентами выделения синаптических пузырьков из синапсов. Все серотипы токсина С. botulinum дают применительно к млекопитающим одинаковый физиологический результат, подавляя или блокируя деятельность холинергического синапса,что приводит к частичному или полному параличу мышц, либо к блокаде, либо к подавлению функции органа или железы, в зависимости от места введения. Соответственно, композицию согласно изобретению можно использовать с любым из серотипов ботулинического токсина,получаемых из Clostridium botulinum, которые характеризуются описанным выше биологическим действием. Последовательности аминокислот большинства известных сегодня серотипов также известны или могут быть определены традиционными способами. Следует понимать,что применительно к настоящему изобретению композиция на основе ботулинического токсина должна также включать получаемый рекомбинантной инженерией ботулинический токсин,содержащий консервативные аминокислотные замены по сравнению с известными последовательностями. Как правило, эти замены можно произвести, исходя из стандартных заменяющих классов встречающихся в природе аминокислот. 10 Так, например, в качестве стандартных заменяющих классов могут выступать шесть классов, основанных на наличии общей боковой цепи и наивысшей частоте замещений в природных гомологичных белках, как это определено, например, известной специалистам стандартной матрицей частоты замещений типа матрицы Дайхоффа. В рамках этой матрицы,например, существуют следующие классы: класс I: Cys; класс II: Ser, Thr, Pro, Hyp, Ala иGly, имеющие небольшие алифатические боковые цепи и боковые цепи с ОН-группами; классIII: Asn, Asp, Glu и Gln, имеющие нейтральные или отрицательно заряженные боковые цепи,способные к образованию водородных связей; класс IV: His, Arg и Lys, имеющие основные полярные боковые цепи; класс V: Ilе, Val и Leu,имеющие разветвленные алифатические боковые цепи, и Met; класс VI: Phe, Туr и Тrр,имеющие ароматические боковые цепи. Кроме того, каждая группа может включать аналоги аминокислот, такие как орнитин, гомоаргинин,N-метиллизин, диметиллизин или триметиллизин в классе IV и галогенированный тирозин в классе VI. Далее, в указанные классы могут входить как L-, так и D-стереоизомеры, хотя для замен предпочтительны L-аминокислоты. В качестве примера консервативной замены можно указать замену Asp на какой-либо другой остаток класса III, например, Asn, Gln или Glu. Хотя активность ботулинического токсина можно определить с использованием традиционного электрофизиологического анализа, ее измеряют, как правило, путем введения токсина в организм мелких животных типа мышей с последующим определением дозы токсина, необходимой для умерщвления в среднем 50% тестируемых животных. Эта доза называется "половинной летальной дозой" (LD50) и задается в качестве единицы биологической активности. Дозы, применяемые в терапевтических целях,условно приводятся к указанным единицам. Как более детально показано ниже в разделе IIIB,разные серотипы могут демонстрировать различную эффективность при лечении людей, выражаемую в единицах LD50. Лечебные дозы можно титровать на основе этих данных, пользуясь известными специалистам методами.III. Приготовление ботулинического токсина В этом разделе описываются способы приготовления ботулинического токсина, подлежащего использованию в составе композиции согласно изобретению. А. Очистка ботулинического токсина из С.botulinum. Здесь приводятся общие методы приготовления очищенного ботулинического токсина из культивированной бактерии Clostridium botulinum на примере ботулинического токсина типа В. Кроме перечисленных здесь конкретных методов, специалистам известны и иные технологии приготовления ботулинического токсина 11 типов А и В, а также других известных серотипов. Как уже было показано выше, активным ингредиентом в композициях согласно изобретению является белковый компонент экстрактов"ботулинический токсин", активный компонент которого имеет молекулярную массу от 145 до 175 кДa и который присутствует обычно в природном белковом комплексе с гораздо большей молекулярной массой. В этом разделе приводятся примеры методов очистки различных ботулинических токсинов, причем особое внимание уделяется серотипам А и В ботулинического токсина. Следует иметь в виду, что в общенаучной литературе даются указания по альтернативным методам очистки токсинов, так что специалисты легко смогут выбрать нужный метод и применить его к данному конкретному токсину,который предполагается использовать в композициях, приготовленных в соответствии с изобретением. В общем случае ботулинический токсин типа В выделяют в виде комплекса из процесса ферментации с высоким титром культур Clostridium botulinum с использованием хорошо известных технологий. В Соединенных Штатах исходные культуры могут получить организации, владеющие лицензией, выданной Центром по борьбе с заболеваниями (CDC) или другим полномочным органом в соответствии с национальными нормами по распределению микроорганизмов. Подходящими исходными материалами для очистки ботулинического токсина типа В являются Clostridium botulinum Okra илиBean В. Замороженные исходные культуры засевают в контрольные пробирки, в которых содержится культуральная среда типа тиогликолята или триптиказ-пептона, а также культуры,выращенные и обработанные с применением технологии, описанной ниже и более подробно изложенной в патенте США 5696077, включенном в список использованной литературы. Если говорить коротко, культуры выращивают с использованием известных способов до получения достаточного количества бактериального исходного материала с целью добиться нужного выхода токсина. Как правило, для получения 0,5 г токсина требуется около 20 л бактериальной культуры. Температуру культуры доводят до комнатной и производят регулировку ее рН на значение 3,5 с помощью серной или другой подходящей кислоты. Дают отстояться образовавшемуся остатку и супернатант декантируют. Затем к осадку добавляют хлорид кальция при перемешивании и увеличивают объем с помощью деионизированной воды, так чтобы конечная концентрация СаСl2 составила порядка 150 мМ. Повышают рН примерно до уровня нейтральности (6,5) и осветляют раствор токсина центрифугированием. Производят повторное осаждение токсина путем доведения рН до 3,7. 12 Дают образовавшемуся осадку отстояться и собирают центрифугированием токсичный осадок,после чего его повторно растворяют в буферном веществе (рН 5,5) и в течение ночи производят его исчерпывающий диализ против того же буферного вещества. Далее центрифугируют диализированный токсин и супернатант хроматографируют на анионообменной колонке(DEAE). Собирают не связавшуюся фракцию и проверяют ее на содержание белка. Осаждают из этой фракции комплексы токсина путем добавления сульфата аммония до примерно 60%ного насыщения. Осадок растворяют в фосфатном буферном веществе и диализуют против того же буферного вещества (рН 7,9). Полученный очищенный препарат токсина можно использовать для приготовления композиции. Методика приготовления ботулинического токсина типа А также хорошо известна специалистам в данной области. Так, например,Хемблтон с соавторами (1981) и Меллинг с соавторами (1988) (соответствующие работы приведены в списке литературы) описывают получение и очистку ботулинического токсина типа А из Clostridium botulinum типа A NCTC 2916. Культуры бактерий выращивают из прошедшего проверку исходного раствора и засевают в 30-литровый ферментер, работающий в анаэробных условиях, с использованием традиционных стандартных режимов. Непрерывно контролируют выход токсина (например, посредством определения LD50), и по достижении максимального выхода (ориентировочно 2 х 106LD50/мл для мышей) подкисляют культуру (создавая значение рН=3,5 с помощью 3 N Н 2SO4),после чего собирают токсин центрифугированием. Этот осевший неочищенный токсин повторно растворяют и экстрагируют фосфатным буфером с концентрацией 0,2 М (рН 6,0), а затем производят обработку рибонуклеазой (100 мкг/мл при 34) и осаждение с использованиемNH4SO4 (60%-ное насыщение при 25). Далее осадок ресуспендируют и подвергают ионообменной хроматографии DEAE-Sephacel при рН 5,5 (после предварительной адсорбции). Производят контроль фракций на активность, а активные фракции подвергают повторному осаждению с использованием NH4SО 4 (60%-ное насыщение при 25). Осадок можно сохранить и повторно растворить для получения композиции согласно изобретению, как описано ниже. Предлагаемые композиции предпочтительно содержат связывающий комплекс токсина типа приготавливаемых с использованием методов, описанных выше применительно к ботулиническим токсинам типов А и В, либо в них применяются эквивалентные формы ботулинического токсина типов С 1, С 2, D, Е, F илиG, приготавливаемых в соответствии с известными методами. Титр токсина определяют путем последовательного разведения восстановленного связывающего комплекса токсина в 13 белке-наполнителе, например в альбумине из человеческой сыворотки, с предотвращением образования пузырьков и слишком интенсивного взбалтывания, как при вихревом перемешивании. В соответствии с оговоренной методикой, титр определяется в ходе испытания на летальность мышей, такого как испытания наLD50, описанного в примере 2. Берут рабочий экземпляр культуры, который разбавляют, разбивают на аликвотные части и лиофилизируют для целей хранения. Этот исходный раствор проверяют в ходе анализов на определение концентрации белка, LD50, чистоты и фармацевтической пригодности с использованием известных методов, описанных ниже в примере 2.IV. Устойчивые композиции на основе ботулинического токсина В ходе работы над настоящим изобретением было неожиданно обнаружено, что ботулинический токсин можно приготавливать и хранить в виде устойчивой жидкой композиции,которая сохраняет свою эффективность в течение длительного времени, например, по меньшей мере, порядка 1-2 лет, при температурах холодильника (т.е. порядка 53 С, конкретнее порядка 42 С или, в более общем случае, 010 С) либо в течение, по меньшей мере, 6 месяцев при комнатной температуре (т.е. порядка 25 С или, в более общем случае, 10-30 С). Такую композицию можно назначать человеку или другим видам млекопитающих в виде фармацевтического препарата без необходимости дополнительного восстановления силами врачей. Композиция характеризуется значениями рН от 5 до 6, предпочтительнее от 5,5 до 5,6, которые поддерживаются благодаря применению соответствующих буферных растворов. Композиция может также включать один или более белковнаполнителей. В примере 1 приведено детальное описание процесса приготовления композиции на основе ботулинического токсина (типа В) с концентрацией 5000 ед./мл. Совершенно очевидно,что такие режимы приготовления можно применить и к другим серотипам ботулинического токсина, например к ботулиническому токсину типа А, с концентрациями, требуемыми для этих серотипов, с тем чтобы получить устойчивые композиции в удобных лекарственных формах. Если говорить коротко, концентрированный препарат ботулинического токсина наподобие очищенных препаратов токсина, описанных выше применительно к типам А и В, примешивают к разбавителю типа сукцинатного буфера с рН от 5 до 6, предпочтительнее порядка 5,6. В случае с токсином типа В желательно иметь концентрацию порядка 5000 ед./мл (по результатам оценки в ходе пробы LD50 на мышах),однако, необходимой или желательной может оказаться и любая концентрация примерно в пределах 100-20 000 ед./мл или даже выше, в 14 зависимости от отпускаемой дозы. В случае с токсином типа А выгоднее работать с концентрациями в пределах от 20 до 2000, предпочтительнее порядка 100-1000 ед./мл. Для целей изготовления фармацевтических препаратов берут пробу композиции и тестируют ее на предмет наличия возможных микробных загрязнителей("биологического груза"), после чего подвергают стерильной фильтрации в стеклянных или полипропиленовых сосудах для последующего отпуска пациентам. Конечный продукт можно хранить в жидком виде в течение, по меньшей мере, одного года, предпочтительнее более двух лет при температуре 0-10 С без сколько-нибудь существенной потери биологической эффективности, как это видно из пробы LD50 на мышах(пример 2), где потери составили 20%. В качестве упомянутого выше разбавителя можно использовать любую фармацевтически приемлемую жидкость, которая не оказывала бы неблагоприятного действия на устойчивость комплекса и позволяла бы поддерживать устойчивые значения рН в пределах от 5 до 6. В качестве примеров особо устойчивых буферов можно назвать сукцинатные и фосфатные буферы; однако, специалистам должно быть понятно,что применение буферов для композиций согласно изобретению не ограничивается какимто конкретным из них, при условии, что буфер будет обеспечивать приемлемый уровень стабильности рН, или "буферной емкости", в указанном диапазоне значений. Как правило, буфер имеет надлежащую емкость в пределах единицы рН от его рК (Лечмен с соавт., 1986). Применительно к настоящему изобретению, сюда относятся буферы со значениями рК в примерном диапазоне от 4,5 до 6,5. Пригодность буфера можно оценить на основе публикуемых таблиц значений рК или определить эмпирически с использованием широко известных методик. Кроме уже упоминавшихся сукцинатных и фосфатных буферов, возможно применение других фармацевтически пригодных буферов, в том числе ацетатных, нитратных, аконитатных, малатных и карбонатных (Лечмен). Значение рН раствора можно отрегулировать на требуемую конечную точку в пределах данного диапазона с использованием фармацевтически приемлемой кислоты, например соляной или серной, либо основания, например едкого натра. В качестве белка-наполнителя, добавляемого к композиции, можно брать любой из множества фармацевтически приемлемых белков или пептидов. Предпочтительнее выбирать белок-наполнитель по его пригодности к введению в организм млекопитающего без риска иммунной реакции. Так, например, альбумин из человеческой сыворотки прекрасно подходит для фармацевтических композиций, назначаемых людям, и наоборот, при лечении крупного рогатого скота следует предпочесть бычью сыворотку. Для этих целей можно также использо 15 вать другие известные фармацевтические белковые наполнители, такие как желатин. Наполнитель вводят в композицию в концентрации,достаточной для предотвращения адсорбции белкового комплекса токсина на рабочем сосуде или пробирке. Концентрация наполнителя изменяется в соответствии с его видом и концентрацией комплекса токсина в композиции. В качестве примера можно указать, что в ходе исследований, проведенных в целях подтверждения идеи, положенной в основу изобретения, было установлено, что концентрация альбумина из человеческой сыворотки, равная 0,5 мг/мл, достаточна для работы с композициями с содержанием ботулинического токсина типа В 5000 ед./мл и в то же время не вызывает сколько-нибудь заметной иммунной или аллергической реакции у большей части людей; в общем случае, достаточная защита обеспечивается при выборе концентраций в пределах 0,05-1 мг на 100 ед. токсина В. В литературе описаны также подходящие концентрации наполнителя для стабилизации ботулинического токсина типа А. Так, например, "ВОТОХ" стабилизируют добавлением 0,5 мг альбумина на 100 единиц активности токсинаV. Практическое применение А. Использование композиций на основе ботулинического токсина в лечебных и косметических целях. Фармацевтические композиции согласно изобретению можно использовать по целому ряду показаний, когда желательно добиться подавления или блокирования передачи нервного возбуждения от холинергических волокон, и в частности (но не только), такой передачи, которая связана с регулированием работы гладких или скелетных мышц. В этом разделе приводятся примеры расстройств, для лечения которых можно использовать предлагаемые композиции,однако, следует понимать, что возможности применения изобретения не ограничиваются этими примерами. Ниже в части В приведены типовые дозировки и способы введения композиций для некоторых из рассматриваемых показаний. Ботулинический токсин, и в частности токсин типа А, показал себя эффективным средством лечения спастических мышечных нарушений. Применив схему одноразового лечения(которая может включать многократные внутримышечные инъекции), можно добиться снятия неконтролируемого мышечного спазма на период до нескольких месяцев. Так, например,Управление США по контролю за продуктами и лекарствами допустило "ВОТОХ" (ботулинический токсин типа А) к применению при локальных инъекциях в глазную впадину для лечения блефароспазма. Среди других показаний можно назвать другие очаговые дистонии, такие как дистония гортани, синдром Мейджа (дисто 003367 16 ния нижней челюсти; челюстно-лицевая дистония), спастическая кривошея (Хардман с соавт.,1996), дистония конечностей, анизм и асинергия детрузора-сфинктера мочевого пузыря, блефароспазм, косоглазие, спазм мышц половины лица, а также ринорея, отит среднего уха, повышенное слюноотделение, астма, спастический колит, избыточное выделение желудочного сока(см., напр., патент США 5766005), головная боль при мигрени, сосудистые нарушения, невралгия или невропатия (патент США 5714468;WO 953041), артритные боли (WO 9517904),расстройства желудочно-кишечного тракта с вовлечением поперечно-полосатой или гладкой мышцы (патент США 5674205), расслабление промежности при родах (патент США 5562899) или ослабление стискивания челюстей (патент США 5298019). Проводились также местные инъекции ботулинического токсина типа А для достижения косметического ослабления мышечного тонуса, вызывающего эффект "морщин угрюмости" на лице, и для "выправления бровей" (Френкель, 1998); кроме того, установлено,что он показан при подкожных инъекциях для лечения гипергидроза (усиленной потливости;WO 9528171; патент США 5766605), а также для лечения юношеского искривления позвоночника (патент США 5053005), коркового паралича в подростковом и взрослом возрасте (патент США 5298019; WO 9305800), а также спазмов и непроизвольных сокращений, вызываемых корковым параличом, рассеянным склерозом или болезнью Паркинсона (патент США 5183462). Все вышеперечисленные источники целиком приведены здесь в качестве справочных материалов. В ходе опытов, проведенных для подтверждения идеи, положенной в основу изобретения, было проведено тестирование устойчивых жидких композиций, содержащих ботулинический токсин типа В, которые оказались эффективными при лечении шейной дистонии, известной также под названием "кривошея", т.е. такого состояния, при котором больной испытывает непроизвольные спазмы и мышечные сокращения в области головы, шеи и позвоночника, что проявляется в поворотах или качаниях головы. Кроме того, такое состояние часто сопровождается дрожанием и мышечно-скелетными болями. В целом этиология этого расстройства неизвестна, однако, можно предполагать, что оно является следствием нарушения функции центральной нервной системы, приводящего к повышенной активности задействуемой при этом мускулатуры. Современные схемы лечения, включая применение антихолинергических и дофаминергических средств, миорелаксантов, спазмолитиков и противосудорожных средств, не дают сколько-нибудь длительного облегчения. Ботулинический токсин типа В оказывается эффективным при лечении этого состояния благодаря тому, что он вызывает ло 17 кальный паралич или парез, характеризующийся временем начального развития, равным, как правило, примерно 1 неделе после инъекции, и продолжительностью реакции от 1 до 4 месяцев. Композиции на основе других серотипов ботулинического токсина полезны при первичном лечении любого из состояний, описанных ранее применительно к типу А. Кроме того, как сказано выше, ботулинический токсин типов BG может быть также применен для лечения пациентов, которые оказались невосприимчивыми к ботулиническому токсину типа А вследствие их иммунной реакции на этот токсин. И наоборот, серотип А можно использовать для пациентов, невосприимчивых к серотипу В или к любому из других серотипов токсина. В соответствии с изобретением, возможно приготовление и использование композиций на основе одного или более серотипов ботулинического токсина. Вообще говоря, следует иметь в виду, что учитывая их сходное биологическое действие,разные типы ботулинического токсина можно использовать как взаимозаменяемые средства лечения различных нарушений, в частности,связанных с мышечной спастичностью. Тем не менее, как это показано ниже на примере типов А и В, эффективные дозы (выражаемые в LD50 или в единицах биологической активности) могут существенно меняться от одного серотипа к другому. Оценки эквивалентных дозировок можно произвести на основе известных доз,описанных применительно к любому из тестированных токсинов. В. Дозировка и способы введения. Известно, что ботулинический токсин является мощным и в ряде случаев смертельным токсином для животных. Тем не менее, как сказано выше, его можно безо всякого риска применять для лечения людей при условии соблюдения достаточных мер предосторожности в выборе способа введения и назначении дозы. Дозы различных форм ботулинического токсина могут меняться в зависимости от используемого серотипа токсина. Так, например, в ходе опытов, проведенных в целях подтверждения идеи, положенной в основу изобретения,было установлено, что при сравнении в терминах единиц LD50 для мышей токсин типа А("ВОТОХ") оказался в 4-6 раз эффективнее токсина типа В при индукции паралича у обезьян, как это следует из электрофизиологических замеров на отобранных скелетных мышцах. Это наблюдение согласуется с экспериментальными результатами, полученными на крысах, которые демонстрируют значительные различия в количествах этих двух токсинов, требуемых для того, чтобы вызвать паралич конечностей у крыс(Селлин; Джексон). Принимая во внимание указанные наблюдения, можно получить оценочные значения эквивалентных доз или определить их эмпирически силами квалифицированных врачей-практиков. 18 Рекомендуемая доза может также изменяться в соответствии с историей болезни пациента. Так, отмечается, что пациенты, получившие многократные дозы, например, токсина А,оказались "резистентными" к дальнейшему лечению, требуя более значительных доз для достижения аналогичного эффекта с течением времени. Не ограничиваясь лишь каким-то конкретным механизмом действия, укажем, тем не менее, что это явление связано с развитием у пациента иммунной реакции, специфичной к определенному серотипу. Приводимые значения образования антител у пациентов, подвергнутых многократной терапии с использованием токсина типа А, колеблются примерно от 3 до 57%. Соответственно, рекомендуется, чтобы в случае,когда врач выбирает методику смены серотипов в процессе реализации данной схемы лечения,начальная доза нового серотипа рассчитывалась не на основе имеющегося лекарственного анамнеза, а исходя из условий для пациента, еще не подвергавшегося лечению. В качестве необходимых способов введения могут быть выбраны любые из них, которые способны обеспечить подачу активного ингредиента токсина к пораженной ткани без возникновения тяжелых побочных эффектов для пациента. В число этих методов входят, без какихлибо ограничений, внутримышечные инъекции,местное введение, подкожное и периневральное введение, электрофорез и пр. Специалистам хорошо известны специальные процедуры введения ботулинических токсинов, в том числе приемы, направленные на ограничение системного распределения активных компонентов. Можно применить электромиографию для идентификации и более точной локализации специфических групп мышц, в частности для лечения с участием мышц, идентификация которых затруднена, например, мышц в глазной впадине, гортани и в крыловидной зоне, а также мышц пациентов, страдающих ожирением. Лечение дистоний осуществляется обычно посредством ведения токсина поблизости от иннервированных зон пораженной мышцы, чаще всего с помощью иглы для внутримышечных инъекций. Как правило, создаваемый при этом местный паралич может дать пациенту облегчение на период до 3 или 4 месяцев. Можно произвести тестирование пациентов на меньших дозах с их последующим индивидуальным титрованием до оптимальной дозировки, с тем чтобы добиться нервно-мышечной блокады, достаточной для коррекции любой дисфункции без возникновения выраженного паралича. Если пациент оказывается невосприимчивым к действию токсина, может быть показано изменение дозы. Преимущество настоящего изобретения как раз и состоит в том, что оно позволяет устранить традиционную проблему дозировки, связанную с неустойчивостью токсинного материала в растворе, способной привести к допол 19 нительной неопределенности в выборе нужной дозы. Рекомендуемые дозы ботулинического токсина типа А хорошо известны специалистам в данной области; они были определены для целого ряда показаний. Так, например, для лечения косоглазия рекомендуется вводить дозу ботулинического токсина типа А, равную 1,252,5 ед., в вертикальные мышцы при горизонтальном косоглазии менее 20 диоптрий, а при горизонтальном косоглазии более 20 призменных диоптрий следует брать дозу в 2,5-5 ед.(Physician's Desk Reference, 51st Edition). Ботулинический токсин типа А используют также для лечения блефароспазма с использованием доз в 1,25-2,5 ед., инъецируемых с помощью иглы калибра 27-30 в медиальную и боковую претарзальную области orbicularis oculi верхнего века и в боковую претарзальную область orbicularis oculi нижнего века. Ожидается,что последствия такого лечения будут длиться в течение около 3 месяцев; при повторном лечении дозу можно увеличить вплоть до двукратной величины, в зависимости от реакции пациента. Рекомендуется в течение 30-дневного периода вводить суммарную дозу не более 200 ед. токсина типа A (Physician's Desk Reference, 51stEdition). В примере 3 приведены типовые результаты исследования пределов дозировки при использовании токсина типа В для лечения шейной дистонии (кривошеи) с помощью композиции согласно изобретению. В ходе этих исследований, содержание которых также изложено ниже, в распоряжение лечащих врачей была предоставлена жидкая композиция на основе ботулинического токсина типа В согласно изобретению с указаниями по ее хранению в больничном холодильнике с регулированием температуры в пределах от 2 до 8 С. Как правило,композицию брали из партий, приготовленных и хранившихся при рекомендуемой температуре в течение 6-12 месяцев. Врачи получали примерно 6-месячный запас композиции. Если говорить коротко, пациентам вводили различные дозы токсина путем внутримышечной инъекции в 2-4 группы поверхностных мышц шеи и/или плеча, определяемые в соответствии с врачебной оценкой поражения мышцы данным расстройством. В ходе одного из исследований вводили индивидуальные разделенные дозы порядка 100-1200 ед. с получением суммарных доз, равных 270-2280 ед. в течение периода до 398 суток. Все пациенты почувствовали улучшение состояния за время эксперимента, причем в этот период не наблюдалось ослабления эффективности композиции. Дальнейшие исследования, проведенные в подтверждение идеи, положенной в основу изобретения, показали, что пациентов, которые оказались невосприимчивыми к действию токсина типа А, можно лечить токсином типа В. В 20 этом случае пациенты, участвовавшие в эксперименте, продемонстрировали пониженную реактивность к токсину типа А и считались надежно вылеченными, если по окончании терапии наблюдался, по меньшей мере, 25%-ный спад суммарного показателя (спад = улучшение) по шкале оценок спастической кривошеи Toronto Western (TWSTRS; Конски, 1994) по отношению к показателям, соответствующим исходной позиции. Вводили индивидуальные дозы токсина типа В в пределах от 150 до 1430 ед. с получением суммарных доз, равных 300-12 000 ед. в течение периода до 117 суток, как детально показано в примере 3. В целом пациенты чувствовали улучшение в ходе этого исследования,особенно при введении более значительных доз,причем нет никаких свидетельств развития блокирующих антител к токсину типа В, а также снижения эффективности композиции. В ходе другого исследования периодически вводили индивидуальные дозы токсина типа В, равные 0,400, 1200 и 2400 ед. в течение времени до 203 суток, при этом достигалось успешное лечение кривошеи, как описано выше. Ниже приводятся примеры, служащие лишь для иллюстрации изобретения, но никоим образом не ограничивающие возможности его применения. Примеры Материалы Если не оговорено иное, все рассматриваемые здесь реагенты могут быть получены от любого признанного поставщика, осуществляющего продажи реагентов для использования в химической, биохимической, биотехнологической или фармацевтической отрасли, в зависимости от конкретных потребностей. Пример 1. Приготовление устойчивой композиции на основе ботулинического токсина. А. Приготовление сукцинатного буфера. Сукцинатный буфер приготавливали партиями по 3 л с концентрацией динатрийсукцината 2,7 мг/мл и хлорида натрия 5,8 мг/мл с добавлением 0,5 мг/мл альбумина из человеческой сыворотки (Мичиганский институт биопродуктов). Использовали концентрированную соляную кислоту для регулировки значения рН буфера на 5,6. Буфер фильтровали через фильтр 0,2 мкм в герметичный контейнер типа автоклава. Перед употреблением отбирали пробу буфера и проверяли ее на рН, бактериальный эндотоксин и биологические примеси. В. Приготовление композиции на основе ботулинического токсина. Нужную аликвотную часть концентрированного токсина типа В разбавляли примерно в 1000 раз с использованием сукцинатного буфера(рН 5,6) до получения концентрации 50001000 ед./мл. Разбавленный токсин хранили в 2 литровых запаянных стеклянных сосудах в качестве "основного раствора". Затем его хранили 21 при температуре 53 С до отгрузки материала на разливку. Перед разливкой отбирали пробу основного раствора и проверяли ее на наличие микробного загрязнения (биологических примесей) в соответствии с известными стандартными методами. Затем раствор перекачивали перистальтическим насосом по трубам медицинского назначения и подвергали стерильной фильтрации (0,2 мкм) в стерильный сборник основного раствора,находящийся внутри разливочного бокса. Получаемый стерильно отфильтрованный основной раствор разливали в стеклянные флаконы емкостью 3,5 см 3 аликвотными частями по 0,5 мл(2500 ед.), 1 мл (5000 ед.) или 2 мл (10 000 ед.). Состав конечного продукта в контейнере приведен в табл. 1. Таблица 1.Состав композиции на основе ботулинического токсина В Активный Инертные ингредиенты Концентрация ингредиент Ботулинический 50001000 токсин типа ВLD50 ед./мл Сукцинат,10 мМ Фармакопея США Хлорид натрия,100 мМ Фармакопея США Человеческий альбумин,разрешен Управлением по контролю за качест 0,5 мг/мл вом пищевых и фармацевтических продуктов Соляная кислота,Для регулиNF ровки рН Пример 2. Испытание композиции на основе ботулинического токсина на устойчивость. А. Показатели устойчивости. Ботулинический токсин типа В изготавливали, разбавляли в соответствии с описанной выше методикой до получения концентрации 2500 ед./мл и хранили аликвотными частями по 1 мл в стеклянных флаконах емкостью 5 мл при температуре 5 С в течение времени до 30 месяцев включительно. Через 0, 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 и 30 месяцев после первоначального хранения производили произвольный отбор аликвотных частей и проверяли их на эффективность в ходе определения LD50 на мышах. Растворы осматривали также на предмет их внешнего вида и проверяли на рН с использованием стандартных методик. В табл. 2 приведены результаты тестирования аликвотных частей, отобранных в разные моменты времени. Из этих результатов видно,что композиции, приготовленные в соответствии с изобретением, устойчивы; это подтверждается сохранением эффективности в пределах диапазона, указанного для нулевого момента, в течение, по меньшей мере, 30 месяцев в случае хранения при температуре 5 С. 22 Таблица 2. Устойчивость композиции при 5 С Время хранения (в Эффективность Внешний рН месяцах)a Пригодна = прозрачный раствор от бесцветного до светло-желтого, практически без видимых частиц. В табл. 3 приведены результаты тестирования аликвотных частей композиции на основе ботулинического токсина типа В, приготовленной и разбитой на аликвотные части в соответствии с описанным выше, но хранившейся при температуре 25 С. Из этих результатов видно,что композиция устойчива в течение, по меньшей мере, 6 месяцев при температуре 25 С, что подтверждается сохранением средней эффективности на уровне, по меньшей мере, порядка 90%, предпочтительнее, по меньшей мере, 95%,после 6-месячного хранения и на уровне, по меньшей мере, порядка 75% от ее первоначальной эффективности после 9-месячного хранения при температуре 25 С. Таблица 3. Устойчивость композиции при 25 С Время хранения (в Эффективность Внешний рН месяцах)a Пригодна = прозрачный раствор от бесцветного до светло-желтого, практически без видимых частиц. В. Испытания на устойчивость. 1. Определение рН композиции на основе ботулинического токсина. Значение рН композиции на основе токсина типа В измеряли рН-метром производства фирмы Fisher Scientific Accumet модели 50 с использованием датчика с автоматической температурной компенсацией. В качестве электрода применяли комбинированный электрод производства фирмы Orion Ross с КСl электродом сравнения. Определение рН осуществляли по методу стандартной двухточечной калибровки(рН 4,0, рН 7,0) согласно указаниям производителя. Проводили по три измерения для каждой пробы. Значения рН регистрировали с точностью до 2-х значащих цифр и вычисляли среднюю величину. 2. Испытание на эффективность, выражаемую в LD50, на мышах. Для определения LD50 брали здоровых мышей, ранее не повергавшихся испытаниям,обоего пола весом от 18 до 22 г. По каждому 23 разливаемому продукту проводили тестирование мышей воздействием 5-ти доз композиции на основе токсина типа В. Каждое испытание повторяли пятикратно. Из испытываемой пробы приготавливали два исходных раствора. Исходный раствор А получали разбавлением испытываемой пробы до примерной концентрации 750 ед./мл с помощью желатино-фосфатного буфера с рН 6,2. Исходный раствор В получали 10-кратным разбавлением раствора А до 75 ед./мл. Из исходного раствора В приготавливали следующие испытательные разведения: 1:7,5, 1:10, 1:13,5, 1:18 и 1:24,3. Мышам производили внутрибрюшинные инъекции 0,2 мл композиции с необходимым разведением. Их выдерживали в течение 4 суточного постинъекционного периода, осуществляя ежедневное наблюдение. Регистрировали все летальные случаи. По прошествии четырех суток наблюдение прекращали. Общую смертность (CD - cumulativedeaths) для разных уровней разведения рассчитывали путем суммирования количества летальных случаев от максимального разведения в сторону увеличения. Общую выживаемость (CS- cumulative survivors) рассчитывали путем суммирования количества выживших особей от минимального разведения в сторону уменьшения. Процентную величину CD определяли какCD/(CD+CS)x100% для каждого разведения. Разведение, соответствующее LD50, определяли методом пропорционального расстояния (PD) по Риду и Мюнчу, используя разведения, дающие такие значения % CD, которые находятся по разные стороны от 50%-ной общей смертности. Полученное значение PD умножали на разность логарифмов между уровнями разведения, которые находятся по разные стороны от 50%-ной общей смертности. Это значение прибавляли к логарифму разведения со смертностью (CD), превышающей 50, с тем, чтобы получить разведение, соответствующее LD50. Вычисляли антилогарифм этого разведения для получения количества единиц LD50 токсина на инъецируемый объем (0,2 мл). Далее умножали это количество на 5, получая количество единиц LD50 на мл токсина исходного раствора В. Единицы LD50 на мл исходного раствора В умножали на коэффициент разбавления (т.е. разбавление, необходимое для достижения примерной эффективности 75 ед./мл) для получения эффективности пробы. Затем рассчитывали среднее арифметическое и стандартное отклонение количества единиц LD50 на мл для 5-ти достоверных опытов. 24 3. Внешний вид композиции. Внешний вид оценивали путем визуального осмотра на черном и белом фоне под ярким светом после создания слабого завихрения. При этом принимали во внимание все необходимые признаки - цвет, прозрачность и наличие видимых частиц. Пример 3. Лечение шейной дистонии(ШД). А. Разведение, расчет, путь введения и схема дозировки лекарства. 1. Обработка лекарства. Заполняли флаконы лекарством для отпуска 2,0 мл (10 000 ед.), 1,0 мл (5000 ед.) и 0,5 мл(2500 ед.) не разбавленного опытного лекарства. На всех этапах приготовления старались избегать интенсивного взбалтывания и выделения пузырьков, поскольку в обоих этих состояниях возможна денатурация ботулинического токсина. Извлекали композицию из флакона, пользуясь 1-миллилитровым туберкулиновым шприцем с соблюдением максимально возможной точности экстрагируемого объема. 2. Расчет лекарства. Пациентов, страдающих шейной дистонией (ШД), лечили токсином типа В путем введения содержимого соответствующего флакона(ов) с получением доз, указанных в приведенной ниже таблице. Расчет мышиных единиц(ед.) для постепенного увеличения дозы ведется описанным ниже способом, при этом 1 ед. представляет собой количество токсина, присутствующего в дозе, которая соответствует значению LD50, определенному для мышей согласно изложенному в примере 2. По каждому сеансу дозировки вводили токсин типа В согласно стандартным процедурам, подробно описанным ниже. Инъекции композиции производил врач-невропатолог,прошедший предварительное обучение терапевтическому применению ботулинического токсина для лечения больных, страдающих ШД. Пациентам рекомендовали как можно больше расслабиться, с тем чтобы можно было беспрепятственно наблюдать положение головы и шеи в состоянии покоя. Выявляли шейные мышцы,участвующие в развитии ШД, с подтверждением результата пальпацией этих мышц. В случае,если исследователь находил это нужным, производили ЭМГ-анализ с целью дополнительной локализации пораженных мышц. В данном протоколе подлежащими лечению названы следующие мышцы: поднимающая мышца лопатки, средняя и передняя лестничные, полуостистая, ремнная, грудино-ключично-сосцевидная и трапециевидная. Производили инъекции в 1-5 участков каждой из этих мышц. Суммарный инъецируемый объем, приходящийся на один участок, брали меньшим или равным 1,0 мл во избежание местной деформации ткани, но не меньше 0,1 мл для облегчения точного отмеривания объема с помощью стандартного 1 25 миллилитрового шприца. Вначале пациенты получали суммарную дозу в 5000 ед. с дальнейшим увеличением приблизительно до 15 000 единиц во время их последующих посещений клиники. В. Клинические исследования шейной дистонии (ШД). 1. Исследование 1. 8 пациентов (3 мужчины и 5 женщин),имевших средний возраст 43,9 года, с индивидуальными клиническими диагнозами идиопатической ШД приняли участие в исследовании,в ходе которого им вводили композицию на основе токсина типа В в 2-4 группы поверхностных мышц шеи и/или плеча. Допускалось лечение этих пациентов с частотой каждые 4 недели,при условии, что не наблюдаются тяжелые осложнения или устойчивое клиническое улучшение на момент поступления. Пациенты участвовали в 1-5 сеансах дозировки. Индивидуальные дозы находились в пределах от 100 до 1200 ед. при суммарной дозировке 270-2280 ед. композиции на основе токсина типа В, рассматриваемой в данном описании. Оценивали эффективность с использованием шкалы кривошеи Цуя(Цуй Дж. К.К. (1986), Lancet 2: 245-247). Участие пациентов в исследовании длилось от 127 до 398 суток, при этом среднее время исследования составило 244,8 дня. Исходные показатели кривошеи были сходными, при этом все пациенты продемонстрировали ограниченный спад показателей (спад=улучшение) с некоторой тенденцией к зависимости от дозировки, выявленной при сравнении суммарных доз. В целом,пациенты почувствовали улучшение состояния. В ходе исследования не наблюдалось какихлибо признаков развития блокирующих антител. 2. Исследование 2. Задействованные в этом исследовании пациенты имели клинический диагноз идиопатической ШД (кривошеи) с выработавшейся резистентностью к токсину типа А. Им вводили внутримышечно композицию на основе токсина типа В согласно изобретению в 2-4 поверхностных мышцы шеи и плеча. Исследование от начала до конца прошли двенадцать пациентов, имевших средний возраст 52,3 года. Они участвовали в исследовании в течение 37-127 суток, при этом среднее время составило 65 дней. Лечение проводилось 1-3 дозами опытного лекарства. Пределы суммарных доз были равны 940-2100 ед., а индивидуальных доз -от 150 до 1430 ед. токсина типа В. Средний временной интервал между сеансами дозировки составлял 22,3 дня для пациентов,получивших меньшие дозы (всего 100-899 ед.),и 48,4 дня для получивших более значительные дозы (900-1500 ед.). Благоприятным клиническим воздействием считали, по меньшей мере, 25%-ный спад показателей по шкале оценок спастической кривошеи Toronto Western (TWSTRS) - Шкале тя 003367(спад=улучшение). Средние показатели были в исходной позиции примерно одинаковыми у всех пациентов. 56% пациентов, которые входили в группу с большей дозировкой, продемонстрировали спад показателей TWSTRS-тяжести по сравнению с 7% пациентов, входивших в группу, получившую меньшие дозы. Наблюдалось также умеренное улучшение показателейTWSTRS-болезненных ощущений, в особенности на ранних стадиях исследования. У этих пациентов не наблюдалось какихлибо признаков развития блокирующих антител к токсину типа В. 3. Исследование 3. 38 пациентов, имевших средний возраст 50,9 года, с подтвержденным диагнозом шейной дистонии получали инъекции композиции на основе токсина типа В в 2-4 поверхностных мышцы шеи и плеча с постепенным увеличением дозы с течением времени (до 1,5 раз в каждый последующий сеанс). Оценивали благоприятное клиническое воздействие на основе описанного выше теста TWSTRS-тяжести заболевания, при этом улучшением считалось 25%-ное снижение этих показателей. Пациенты участвовали в исследовании в течение 28-177 суток, при этом среднее время исследования составило 71,9 дня. Лечение проводилось 1-3 дозами композиции. Пределы суммарных доз были равны 1430-12000 ед., а индивидуальных доз - от 300 до 12000 ед. Для целей клинической оценки были выделены 4 группы по дозировке: 100-800 ед. (группа А),900-2399 ед. (группа В), 2400-5999 ед. (группа С) и 6000-12 000 ед. (группа D). Интервалы времени между сеансами дозировки находились в следующих пределах: для группы А 13-101 суток, в среднем 35,7 дня; для группы В 14-113 суток, в среднем 48,8 дня; для группы С 29-177 суток, в среднем 62,2 дня; для группы D 28-177 суток, в среднем 55,1 дня. Средние показатели, соответствующие исходной позиции, были сходными у всех пациентов во всех указанных группах дозировки, при этом во всех 4-х группах наблюдалось некоторое среднее снижение показателей (улучшение состояния) в ходе исследования. В целом можно сделать вывод, что средняя процентная величина улучшения по отношению к исходным показателям и средний коэффициент реакции по шкале тяжести заболевания были в ходе исследования наибольшими в группах С и D. Замеры среднего наибольшего улучшения, средней наибольшей процентной величины улучшения и среднего наибольшего коэффициента реакции дали более высокие значения в двух группах с большей дозировкой по сравнению с двумя дру 27 гими группами, получавшими меньшие дозы(8,1 и 6,8 против 2,1 и 3,6 для наибольшего улучшения; 43,9% и 35,5% против 10% и 16,1% для среднего наибольшего улучшения; 0,32 и 0,23 против 0,05 и 0,09 для среднего наибольшего коэффициента реакции). Процент пациентов,у которых имела место реакция на лечение, был более высоким в двух группах с большей дозировкой (С - 80%, D - 78%), чем в двух других группах с меньшими дозами (А - 0%, В - 27%). Средняя продолжительность реакции была также большей в первых двух группах (С - 47,6 дня, D - 38,1 дня) по сравнению с другими двумя группами (А - 0 дней, В - 31 день). Приведенные данные свидетельствуют о зависимости реакции на действие композиций на основе токсина типа В согласно изобретению от принятой дозировки. 4. Исследование 4. Было проведено тестирование трех доз композиции на основе токсина типа В по сравнению со случаем введения плацебо (индифферентного имитатора лекарства) в ходе исследования, в котором участвовали 85 пациентов,страдающих ШД, причем выбранный тип исследования характеризовался рандомизацией(использованием элементов случайности),двойным контролем, применением разовых доз,а также наличием 4-х ветвей, параллельных групп и множественных центров. Возраст пациентов находился в пределах от 18 до 80 лет. Дозы токсина типа В, равные 400, 1200 или 2400 ед., вводили в 2-4 группы поверхностных мышц шеи и/или плеча. Состояние пациентов оценивали по шкале показателей TWSTRS для исходной позиции и на 2-ю и 4-ю недели после лечения. Пациентов, у которых по прошествии 4 недель не наблюдалось 3-балльного или более существенного улучшения (20%) по шкалеTWSTRS тяжести заболевания, исключали из исследования как не прореагировавших. Пациентов же, продемонстрировавших реакцию на лекарство, вновь наблюдали для целей оценки состояния каждые 4 недели, до тех пор пока уровни их реагирования не падали более, чем на 50%. Все полученные показатели по шкалеTWSTRS свидетельствуют об улучшении состояния с увеличением дозы композиции на основе токсина типа В. На 4-й неделе наблюдалось статистически значимое улучшение у пациентов, входивших в группу с дозами 2400 ед.,по сравнению с пациентами, получавшими плацебо, по шкале TWSTRS оценок как показателей по болевым ощущениям, так и суммарных показателей, а процент пациентов, у которых наблюдалось улучшение, был более высоким в группе с дозами 2400 ед. Средние суммарные оценочные показатели на 2-й, 4-й и 8-й неделях были значительно более высокими в группе с дозами 2400 ед. по сравнению с любой из остальных участвовавших в исследовании групп; 28 анализы колебаний данных по 4-й неделе показали статистически значимое различие(р=0,0286) между разными группами. Наблюдались также существенные различия между группами, получавшими плацебо и дозу 2400 ед.(р=0,0050), а также по результатам анализа на зависимость от дозировки (р=0,0028). Анализы колебаний данных по 4-й неделе показали статистически значимое различие (р=0,0073) между разными группами, и кроме того, наблюдались существенные различия между группами, получавшими плацебо и дозу 2400 ед. (р=0,0015), а также по результатам анализа на зависимость от дозировки (р=0,0008). Продолжительность участия пациентов в этом исследовании составила от 25 до 203 суток, при этом среднее количество дней (61) было более значительным для группы, получавшей дозы 2400 ед. 5. Исследование 5. Это исследование также относилось к категории исследований амбулаторных больных,характеризующейся рандомизацией, двойным контролем, использованием плацебо, применением разовых доз, а также наличием 4-х ветвей,параллельных групп и множественных центров,и было направлено на изучение действия разового применения плацебо (группа А) либо одной из трех доз (2500 ед. для группы В, 5000 ед. для группы С и 10 000 ед. для группы D) композиции на основе токсина типа В, инъецируемой в 2-4 группы поверхностных мышц шеи и/или плеча пациентам с подтвержденным диагнозом ШД. Оценку состояния пациентов производили во время посещений через 2 и 4 недели после лечения. Пациентов, у которых наблюдалось более чем 20%-ное улучшение на 4-й неделе по сравнению с исходной позицией (по шкале"прореагировавшими" и просили их посещать клинику для повторных оценок состояния с интервалами в 4 недели в течение, самое большее,4-х месяцев либо до того момента, когда уровень их реагирования упадет более, чем на 50%. К участию в исследовании были привлечены 122 пациента, имевших возраст от 19 лет до 81 года. По периоду времени, в течение которого пациенты продолжали участвовать в этом исследовании, можно судить о времени, в течение которого они демонстрировали реакцию на действие опытного лекарства. Отдельные группы пациентов характеризовались сходным минимальным и максимальным количеством дней,в течение которых они продолжали участвовать в исследовании. Среднее время участия в исследовании увеличивалось с увеличением дозы от 45 дней для группы А, получавшей плацебо, до 61 дня (В), 67 дней (С) и 75 дней (D). Все полученные показатели по шкалеTWSTRS свидетельствуют об улучшении состояния пациентов всех групп за время от исходной позиции до 4-й недели. Все эти показа 29 тели демонстрируют тенденцию к улучшению с увеличением дозы композиции. Анализ колебаний показателей по шкале суммарных оценокTWSTRS, относящихся к 4-й неделе, показал статистически значимое общее различие(р=0,0001) между отдельными группами. Кроме того, значимыми оказались результаты анализа на зависимость от дозы (р=0,0001) и всех 3-х сравнений плацебо с группами активного лечения (р=0,0016 для плацебо против 2500 ед.,р=0,0005 для плацебо против 5000 ед., р=0,0001 для плацебо против 10 000 ед.). Процент пациентов, продемонстрировавших реакцию на 4-й неделе, был более высоким в группе D (10000 ед.), чем в любой другой группе, по шкалеTWSTRS для суммарных показателей, показателей по нетрудоспособности и по болевым ощущениям. Наблюдались значимые результаты по зависимости от дозы для каждого из четырех показателей шкалы TWSTRS (суммарные р 0,001; тяжесть заболевания - р=0,035; нетрудоспособность - р=0,002; болевые ощущения р=0,001). Показатели, относящиеся к болевым ощущениям, улучшились на 4-й неделе во всех группах до 67,5, 70,2 и 75,1 соответственно для групп В, С и D. Статистически значимыми были общие различия между отдельными группами(р=0,0049), результаты анализа на зависимость от дозы (р=0,0017) и сравнений плацебо со всеми тремя группами активного лечения(р=0,0149, 0,0084 и 0,0007 соответственно для групп В, С и D, сравнивавшихся с группой, получавшей плацебо). Пример 4. Физиологическая реакция человеческого организма на действие композиции на основе ботулинического токсина типа В. Проводили тестирование восемнадцати здоровых человек на реакцию экстензора digitalis brevis (EDB - extensor digitalis brevis) в виде изменения амплитуды М-колебания на действие токсина типа В с использованием известных специалистам стандартных электрофизиологических методов. Испытуемые имели возраст от 18 до 22 лет. Указанные электрофизиологические исследования проводили на 2-й, 4-й, 6-й, 9 й, 11-й, 13-й и 14-й день после внутримышечных инъекций доз композиции на основе токсина типа В в пределах от 1,25 до 480 ед. Результаты анализа полученных данных свидетельствуют об уменьшении амплитуды и площади Мколебания в EDB с увеличением дозы. Максимальный эффект от дозы в 480 ед. выразился в 75%-ном уменьшении амплитуды М-колебания по сравнению с исходной позицией. В ходе отдельного исследования были произвольно отобраны 10 лиц для инъекции дозы токсина типа В ("В") в один EDB и дозыEDB с использованием одной из пяти различных схем дозировки: 1,25 ед. А / 20 ед. В; 2,5 ед. А / 80 ед. В; 5 ед. А / 160 ед. В; 7,5 ед. А / 320 ед. В; 10 ед. А / 480 ед. В (по 2 человека на каж 003367 30 дую схему дозировки). Одному контрольному пациенту вводили в каждую мышцу EDB солевой раствор. Скорость уменьшения амплитуды и площади М-колебания оказалась одинаковой в обеих мышцах, причем максимальный эффект достигался примерно на 6-й день после инъекции. Действие обоих серотипов выразилось в уменьшении амплитуды М-колебания в зависимости от дозы. Наибольшее облегчение после снятия нагрузки наблюдалось для обоих типов токсина на 9-й день. Несмотря на то, что вышеприведенное описание касается конкретных способов применения и вариантов осуществления, совершенно очевидно, что возможны самые разнообразные модификации изобретения при условии сохранения его объема. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция на основе ботулинического токсина, содержащая фармацевтически приемлемый буфер,обеспечивающий получение буферных значений рН в диапазоне примерно от рН 5 до рН 6, и изолированный ботулинический токсин,и являющаяся устойчивой в жидком виде в течение, по меньшей мере, одного года при температуре примерно от 0 до 10C. 2. Композиция по п.1, для которой указанная температура составляет порядка 53C. 3. Композиция по п.1, для которой указанная температура составляет порядка 42C. 4. Композиция по любому из пп.1-3, в которой указанный буфер имеет рК в диапазоне значений рН 4,5-6,5. 5. Композиция по любому из пп.1-4, которая является устойчивой в жидком виде в течение, по меньшей мере, двух лет. 6. Композиция по любому из пп.1-5, для которой указанный диапазон буферных значений рН составляет приблизительно рН 5,60,2. 7. Композиция по любому из пп.1-6, для которой указанный буфер выбирается из группы, включающей фосфатный буфер, фосфатноцитратный буфер и сукцинатный буфер. 8. Композиция по любому из пп.1-7, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин серотипа, выбранного из группы, включающей серотипы А, В, С 1, С 2, D, Е, F и G. 9. Композиция по п.8, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин типа В, присутствующий в диапазоне концентраций примерно 100-20000 ед./мл. 10. Композиция по п.9, в которой указанный ботулинический токсин типа В присутствует в диапазоне концентраций примерно 10005000 ед./мл. 31 11. Композиция по п.9 или 10, в которой указанный ботулинический токсин типа В присутствует в виде комплекса с высокой молекулярной массой, составляющей порядка 700 кДа. 12. Композиция по п.8, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин типа А, присутствующий в диапазоне концентраций примерно 202000 ед./мл. 13. Композиция по п.12, в которой указанный ботулинический токсин типа А присутствует в диапазоне концентраций примерно 1001000 ед./мл. 14. Композиция по любому из пп.1-13, которая дополнительно содержит белокнаполнитель. 15. Композиция по п.14, в которой указанный белок-наполнитель выбран из группы,включающей сывороточный альбумин, рекомбинантный альбумин из человеческой сыворотки и желатин. 16. Стабильная жидкая фармацевтическая композиции на основе ботулинического токсина, содержащая фармацевтически приемлемый буфер,обеспечивающий получение буферных значений рН в пределах от рН 5 до рН 6, и изолированный ботулинический токсин,и являющаяся устойчивой в жидком виде в течение, по меньшей мере, 6 месяцев при температуре от 10 до 30 С. 17. Композиция по п.16, для которой указанная температура составляет порядка 25 С. 18. Композиция по любому из пп.16 и 17, в которой указанный буфер имеет рК в диапазоне значений рН 4,5-6,5. 19. Композиция по любому из пп.16-18,для которой указанный буфер выбирается из группы, включающей фосфатный буфер, фосфатно-цитратный буфер и сукцинатный буфер. 20. Композиция по любому из пп.16-19,для которой указанный диапазон буферных значений рН составляет приблизительно рН 5,60,2. 21. Композиция по любому из пп.16-20, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин серотипа, выбранного из группы, включающей серотипы А, В, С 1, С 2, D, Е, F и G. 22. Композиция по п.21, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин типа В, присутствующий в диапазоне концентраций примерно 10020000 ед./мл. 23. Композиция по п.22, в которой указанный ботулинический токсин типа В присутствует в диапазоне концентраций примерно 10005000 ед./мл. 24. Композиция по п.22 или 23, в которой указанный ботулинический токсин типа В присутствует в виде комплекса с высокой молекулярной массой, составляющей порядка 700 кДа. 32 25. Композиция по п.21, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин типа А, присутствующий в диапазоне концентраций примерно 202000 ед./мл. 26. Композиция по п.25, в которой указанный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин типа А, присутствующий в диапазоне концентраций примерно 1001000 ед./мл. 27. Композиция по любому из пп.16-26,которая дополнительно включает белокнаполнитель. 28. Композиция по п.27, в которой указанный белок-наполнитель выбран из группы,включающей сывороточный альбумин, альбумин из человеческой сыворотки и желатин. 29. Способ лечения пациента, страдающего болезнью, при которой он нуждается в ингибировании передачи холинергического импульса к отдельной мышце, группе мышц, железе или органу, включающий этап введения в отдельную мышцу, группу мышц, железу или орган пациента фармацевтически эффективной дозы жидкой композиции на основе ботулинического токсина по любому из пп.1-28. 30. Способ по п.29, отличающийся тем, что упомянутая болезнь выбрана из группы, включающей мышечную спастичность, блефароспазм, косоглазие, спазм мышц половины лица,дистонию, отит среднего уха, спастический колит, анизм, асинергию детрузора-сфинктера мочевого пузыря, стискивание челюстей и искривление позвоночника. 31. Способ по п.30, отличающийся тем, что указанный пациент страдает мышечной спастичностью, которая вызвана одним или большим числом факторов, входящих в группу,включающую удар, повреждение спинного мозга, закрытую черепно-мозговую травму, корковый паралич, рассеянный склероз и болезнь Паркинсона. 32. Способ по п.30, отличающийся тем, что указанный пациент страдает дистонией, выбранной из группы, которая включает спастическую кривошею (шейную дистонию), спастическую дисфонию, дистонию конечностей, дистонию гортани и нижнечелюстную дистонию(дистонию Мейджа). 33. Способ по п.29, отличающийся тем, что указанная отдельная мышца или группа мышц создает морщину или борозды на брови. 34. Способ по п.29, отличающийся тем, что указанной мышцей является промежностная мышца, а указанным пациентом является женщина во время родов. 35. Способ по п.29, отличающийся тем, что указанный пациент страдает от состояния, входящего в группу, которая включает миофасциальные боли, головную боль при мигрени, сосудистые расстройства, невралгию, невропатию,артритную боль, боль в спине, гипергидроз, ри 33 норею, астму, повышенное слюноотделение и избыточное выделение желудочного сока. 36. Способ по любому из пп.29-35, отличающийся тем, что указанный пациент невосприимчив к серотипу А ботулинического токсина и указанный ботулинический токсин в указанной композиции выбран из группы, включающей серотипы В, С 1, С 2, D, Е, F и G. 37. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанный ботулинический токсин в указанной композиции представляет собой ботулинический токсин типа В. 38. Способ по любому из пп.29-35, отличающийся тем, что указанный пациент невосприимчив к серотипу В ботулинического токсина и указанный ботулинический токсин в указанной композиции выбран из группы, включающей серотипы А, С 1, С 2, D, Е, F и G. 39. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанный ботулинический токсин в указанной композиции представляет собой ботулинический токсин типа А. 40. Применение устойчивой жидкой композиции на основе ботулинического токсина по любому из пп.1-28 для приготовления медикамента, подлежащего использованию в лечении пациента, нуждающегося в ингибировании передачи холинергического возбуждения к отдельной мышце, группе мышц, железе или органу. 41. Применение по п.40, отличающееся тем, что указанный пациент страдает расстройством, входящим в группу, которая включает мышечную спастичность, блефароспазм, косоглазие, спазм мышц половины лица, дистонию,отит среднего уха, спастический колит, анизм,асинергию детрузора-сфинктера мочевого пузыря, стискивание челюстей и искривление позвоночника. 42. Применение по п.41, отличающееся тем, что указанный пациент страдает мышечной спастичностью, которая вызвана одним или большим числом факторов, входящих в группу,включающую удар, повреждение спинного мозга, закрытую черепно-мозговую травму, корко 34 вый паралич, рассеянный склероз и болезнь Паркинсона. 43. Применение по п.41, отличающееся тем, что указанный пациент страдает дистонией,входящей в группу, которая включает спастическую кривошею (шейную дистонию), спастическую дисфонию, дистонию конечностей, дистонию гортани и нижнечелюстную дистонию(дистонию Мейджа). 44. Применение по п.40, отличающееся тем, что указанная отдельная мышца или группа мышц создает морщину или борозды на брови. 45. Применение по п.40, отличающееся тем, что указанной отдельной мышцей является промежностная мышца, а указанным пациентом является женщина во время родов. 46. Применение по п.40, отличающееся тем, что указанный пациент страдает от состояния, входящего в группу, которая включает миофасциальные боли, головную боль при мигрени, сосудистые расстройства, невралгию, невропатию, артритную боль, боль в спине, гипергидроз, ринорею, астму, повышенное слюноотделение и избыточное выделение желудочного сока. 47. Применение по любому из пп.40-46,отличающееся тем, что указанный пациент невосприимчив к ботулиническому токсину типа А и указанный ботулинический токсин в указанной композиции выбран из группы, включающей серотипы В, С 1, С 2, D, Е, F и G. 48. Применение по п.47, отличающееся тем, что указанный ботулинический токсин в указанной композиции представляет собой ботулинический токсин типа В. 49. Применение по любому из пп.40-46,отличающееся тем, что указанный пациент невосприимчив к ботулиническому токсину типа В и указанный ботулинический токсин в указанной композиции выбран из группы, включающей серотипы А, С 1, С 2, D, Е, F и G. 50. Применение по п.49, отличающееся тем, что указанный ботулинический токсин в указанной композиции представляет собой ботулинический токсин типа А.
МПК / Метки
МПК: A61P 25/00, A61K 38/16
Метки: составы, ботулинического, стабильные, жидкие, токсина
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/18-3367-stabilnye-zhidkie-sostavy-botulinicheskogo-toksina.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Стабильные жидкие составы ботулинического токсина</a>
Предыдущий патент: Антиидиотипические моноклональные антитела, их применение в активной иммунотерапии злокачественных опухолей и содержащие их композиции
Следующий патент: Способ получения водного раствора перекиси водорода непосредственно из водорода и кислорода и устройство для его осуществления
Случайный патент: Гипсовый строительный раствор с добавлением вспученного вермикулита и способ его получения