Вакцины против гриппа со сниженным количеством сквалена

ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГРИППА СО СНИЖЕННЫМ КОЛИЧЕСТВОМ СКВАЛЕНА Изобретение относится к применению вакцины против вируса гриппа для индукции иммунного ответа у пациента в возрасте 5 лет или младше, содержащей: (а) гемагглютинин, по меньшей мере, (i) штамма H1N1 вируса гриппа А; (ii) штамма H3N2 вируса гриппа А; (iii) линии вируса гриппа В B/Victoria/2/87 и (iv) линии вируса гриппа В B/Yamagata/16/88, где концентрация гемагглютинина на штамм по меньшей мере 12 мкг/мл; и (b) адъювант в виде эмульсии "маслов-воде" с субмикронными масляными каплями, содержащий сквален, где концентрация сквалена составляет меньше 19 мг/мл, а минимальное количество сквалена составляет 0,5 мг на дозу, где штамм вируса гриппа В включает линию вируса гриппа В B/Victoria/2/87 и линию вируса гриппа В B/Yamagata/16/88. По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США 61/207385, поданной 10 февраля 2009 г., содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области вакцин для защиты от инфицирования вирусом гриппа и, в частности, к вакцинам, содержащим пониженные количества сквалена по сравнению с вакцинами,существующими на рынке. Предшествующий уровень техники Вакцины против гриппа, как правило, не содержат адъювант, за исключением продукта PREPANDRIX (GlaxoSmithKline) и продукта FLUAD (Novartis Vaccines). В моновалентной сезонной вакцине, применяемой перед началом пандемии, адъювант PREPANDRIX представляет собой эмульсию типа "масло-в-воде". Антиген и адъювант в виде эмульсии поставляют в отдельных на 10 доз флаконах для смешивания непосредственно перед применением в объемном соотношении 1:1. В описании продукта указано, что каждая доза имеет объем 0,5 мл и содержит 3,75 мкгHA с 10,68 мг сквалена и 4,85 мг полисорбата 80. В трехвалентной сезонной вакцине FLUAD адъювант представляет собой эмульсию "масло-вводе". Антиген и адъювант в виде эмульсии поставляют в форме для предварительного смешивания в предварительно наполненном шприце. В описании продукта указано, что каждая доза имеет объем 0,5 мл и содержит 15 мкг гемагглютинина (HA) на штамм с 9,75 мг сквалена и 1,175 мг полисорбата 80. Как описано в ссылке 1, вакцину получают путем смешивания 2 эмульсии с 2 раствором антигена в объемном отношении 1:1 с получением конечного раствора, содержащего и эмульсию, и антиген в концентрации 1. Такое соотношение 1:1 для компонентов смеси дополнительно описано в главе 10 ссылки 75. Модификации такого смешивания описаны в ссылке 2. По сравнению с продуктом FLUAD ссылка 3 описывает трехвалентные вакцины против гриппа со сниженным количеством HA (35 мкг HA/дозу) и со сниженным количеством сквалена (5,35 мг/дозу). В вакцину включают консервант тиомерсал и при применении человеком вводят в дозе 0,5 мл. Целью изобретения является получение дополнительных и улучшенных составов вакцин против гриппа с адъювантами и, в частности, сезонных вакцин против гриппа. Описание изобретения В одном из вариантов осуществления изобретение относится к применению вакцины против вируса гриппа для индукции иммунного ответа у пациента в возрасте 5 лет или младше, содержащей: (а) гемагглютинин, по меньшей мере, (i) штамма H1N1 вируса гриппа А; (ii) штамма H3N2 вируса гриппа A; (iii) линии вируса гриппа В B/Victoria/2/87 и (iv) линии вируса гриппа В B/Yamagata/16/88, где концентрация гемагглютинина на штамм по меньшей мере 12 мкг/мл; и (b) адъювант в виде эмульсии "масло-в-воде" с субмикронными масляными каплями, содержащий сквален, где концентрация сквалена составляет меньше 19 мг/мл, а минимальное количество сквалена составляет 0,5 мг на дозу, где штамм вируса гриппа В включает линию вируса гриппа В B/Victoria/2/87 и линию вируса гриппа В B/Yamagata/16/88. Также изобретение относится к применению такой вакцины, где вакцина имеет объем однократной дозы 0,5 мл,имеет форму расщепленных вирионов или очищенных поверхностных антигенов, концентрация гемагглютинина на штамм составляет по меньшей мере 25 мкг/мл, концентрация сквалена составляет меньше 10 мг/мл, весовое соотношение сквалена к гемагглютинину в композиции по изобретению находится в диапазоне от 20 до 180. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к применению вакцины, которая представляет собой четырехвалентную инактивированную вакцину против гриппа, содержащую штамм A/H1N1, штамм A/H3N2, штамм вируса гриппа В линии B/Yamagata/16/88 и штамм вируса гриппа В линии B/Victoria/2/87, с концентрацией гемагглютинина приблизительно 30 мкг/мл на штамм, концентрацией сквалена приблизительно 9,75 мг/мл и объемом единичной дозы приблизительно 0,5 мл. Изобретение также относится к способу повышения иммунного ответа у пациента в возрасте 5 лет или младше, включающему стадию введения вакцины, указанной в любом из предшествующих пунктов, пациенту в возрасте 5 лет или младше. Получение вакцины В настоящее время доступны различные формы вакцин против вируса гриппа, и вакцины, как правило, основаны либо на живых вирусах, либо на инактивированных вирусах. Инактивированные вакцины могут быть основаны на целых вирионах, на частях вирионов или на очищенных поверхностных антигенах. Антигены вируса гриппа также могут быть в форме виросом. Настоящее изобретение можно использовать с любым из этих типов вакцин, но, как правило, используют с инактивированными вакцинами. Если используется инактивированный вирус, то вакцина может содержать целый вирион, части вириона или очищенные поверхностные антигены (в том числе гемагглютинин и, как правило, также нейраминидаза). Химические средства инактивации вируса включают обработку эффективным количеством одного или нескольких следующих соединений: детергентами, формальдегидом, -пропиолактоном, метиленовым синим, псораленом, карбоксифуллереном (С 60), бинарным соединением этиламина, ацетилэ-1 023662 тиленимина или их сочетаниями. К известным в данной области нехимическим способам инактивации вируса относятся, например, ультрафиолетовое облучение или -облучение. Вирионы можно собрать различными способами из жидкостей, содержащих вирусы. Например,процесс очистки может включать зональное центрифугирование с использованием линейного градиента раствора сахарозы, содержащего детергент для разрушения вирионов. Затем после необязательного разведения антигены могут быть очищены с помощью диафильтрации. Расщепленные вирионы получают путем обработки очищенных вирионов детергентами (например,этиловым эфиром, полисорбатом 80, дезоксихолатом, три-N-бутилфосфатом, Triton X-100, Triton N101,цетилтриметиламмоний бромидом, Tergitol NP9 и т.п.) с получением субвирионных препаратов, включая процесс расщепления с помощью "Tween-простой эфир". Способы расщепления вирусов гриппа хорошо известны в данной области, например, см. ссылки 4-9 и т.п. Расщепление вируса, как правило, осуществляют путем разрушения или фрагментирования целого вируса, являющегося инфекционным или неинфекционным, с помощью вызывающей разрушение концентрации фрагментирующего соединения. В результате фрагментации происходит полное или частичное растворение белков вируса, нарушение целостности вируса. Предпочтительные фрагментирующие соединения представляют собой неионные и ионные (например, катионные) поверхностно-активные вещества, например алкилгликозиды, алкилтиогликозиды, ацильные производные сахаров, сульфобетаины, бетаины, полиоксиэтиленалкиловые эфиры,N,N-диалкилглюкамиды, Hecameg, алкилфеноксиполиэтоксиэтанолы, четвертичные аммониевые соединения, саркозил, СТАВ (цетилтриметиламмоний бромиды), три-N-бутилфосфат, цетавлон, соли миристилтриметиламмония, липофектин, липофектамин и DOT-MA, октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (например, Triton, поверхностно-активные вещества, такие как Triton X-100 или Triton N101),сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (поверхностно-активные вещества Tween), простые эфиры полиоксиэтилена, сложные эфиры полиоксиэтилена и т.п. В одном из подходящих способов фрагментирования используют последовательные эффекты действия дезоксихолата натрия и формальдегида, и фрагментирование можно проводить в течение начальной очистки вирионов (например, в растворе градиента плотности сахарозы). Таким образом, в процессе фрагментирования можно проводить очистку материала, содержащего вирионы (для удаления невирионных продуктов), концентрирование собранных вирионов (например, используя способ адсорбции, такой как адсорбция с помощью CaHPO4), отделение целых вирионов от невирионных продуктов, фрагментирование вирионов с использованием фрагментирующих соединений на этапе центрифугирования в градиенте плотности (например, используя градиент сахарозы, содержащий соединение для фрагментирования, такое как дезоксихолат натрия), и затем фильтрацию (например, ультрафильтрацию) для удаления нежелательных продуктов. Фрагментированные вирионы, как правило, можно ресуспендировать в изотоническом буферном растворе хлорида натрия с фосфатом натрия. Продукты PREPANDRIX, BEGRIVAC, FLUARIX, FLUZONE и FLUSHIELD являются сплит-вакцинами. Вакцины на основе очищенных поверхностных антигенов содержат поверхностные антигены вируса гриппа гемагглютинин и, как правило, также нейраминидазу. Способы получения этих белков в очищенной форме хорошо известны. Примерами являются продукты FLUVIRIN, FLUAD, AGRIPPAL и INFLUVAC. Другой формой антигена инактивированного вируса гриппа является виросома [10] (вирусоподобные липосомные частицы без нуклеиновых кислот), как в продуктах INFLEXAL V и INVAVAC. Виросомы могут быть получены путем солюбилизации вируса гриппа с помощью детергента, с последующим удалением нуклеокапсида и восстановлением мембраны, содержащей вирусные гликопротеины. Альтернативный способ получения виросом включает добавление гликопротеинов вирусной мембраны к избытку фосфолипидов для получения липосом с вирусными белками в мембране. Выбор штамма. Вакцины по изобретению включают гемагглютинин по меньшей мере из одного штамма вируса гриппа А и по меньшей мере из одного штамма вируса гриппа В. Как правило, разные штаммы выращивают раздельно, а затем смешивают после сбора вирусов и получения антигенов. Таким образом, в способ по изобретению можно включать этапы смешивания антигенов из более чем одного штамма вируса гриппа. Штаммы по изобретению могут иметь природный HA, обнаруженный в вирусе дикого типа, или модифицированный HA. Например, известно, что модифицирование HA путем удаления детерминант(например, гиперосновные области возле сайта расщепления HA1/HA2), вызывает высокую патогенность вируса у разных видов птиц. Гемагглютинины вирусов гриппа В, используемые по изобретению, предпочтительно содержат аминокислоту Asn в положении 197, обеспечивая сайт гликозилирования [11]. Вирус гриппа, используемый по изобретению, может быть реассортантным штаммом и может быть получен генетическими способами с обратной транскрипцией. Генетические способы с обратной транскрипцией [например, 12-16] позволяют in vitro получать вирусы гриппа с желаемыми сегментами генома,используя плазмиды или другие искусственные векторы. Как правило, к ним относятся экспрессирующие (а) молекулы ДНК, кодирующие желаемые вирусные молекулы РНК, например, из промоторов polI или промоторов РНК полимеразы бактериофага, и (b) молекулы ДНК, кодирующие белки вируса, например, из промоторов polII, так что экспрессия обеих типов ДНК в клетке приводит к сборке полноразмерного интактного инфекционного вириона. ДНК, предпочтительно дает все вирусные РНК и белки, но также возможно использовать хелперные вирусы для получения некоторых РНК и белков. Можно использовать способы, основанные на плазмидах, используя отдельные плазмиды для получения каждой вирусной РНК [17-19], и эти способы также предусматривают использование плазмид для экспрессии всех или некоторых (например, только белков РВ 1, РВ 2, РА и NP) вирусных белков, в некоторых способах используют до 12 плазмид. Для уменьшения числа необходимых плазмид в одном из существующих способов [20] объединяют множество транскрипционных кассет РНК полимеразы I (для синтеза вирусной РНК) на одной и той же плазмиде (например, последовательности, кодирующие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 сегментов вирусной РНК вируса гриппа А), и множество областей, кодирующих белки, с промоторами РНК полимеразы II на другой плазмиде (например, последовательности, кодирующие 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 или все 8 мРНК транскриптов вируса гриппа А). Предпочтительные аспекты способа, описанного в ссылке 20, включают: (а) области РВ 1, РВ 2 и РА, кодирующие мРНК, на одной плазмиде; и (b) все 8 сегментов, кодирующих вирусную РНК, на одной плазмиде. Введение сегментов NA и HA в одну плазмиду,а шесть других сегментов в другую плазмиду также может облегчить задачу. В качестве альтернативы применения промоторов polI, кодирующих сегменты вирусной РНК, можно использовать промоторы полимеразы бактериофагов [21]. Например, подходящими для использования являются промоторы полимераз SP6, T3 или Т 7. Из-за видовой специфичности промоторов polI,промоторы полимеразы бактериофагов могут быть более удобны для большого числа клеток (например,MDCK), хотя клетка также должна быть трансфицирована плазмидой, кодирующей экзогенный фермент полимеразу. В других способах можно использовать двойные промоторы polI и polII, одновременно кодирующие вирусные РНК, для экспрессируемых мРНК из одной матрицы [22, 23]. Таким образом, вирус гриппа А может включать один или несколько сегментов РНК вирусаA/PR/8/34 (как правило, 6 сегментов из A/PR/8/34 с сегментами HA и N штамма вакцины, т.е. реассортант 6:2). Он также может содержать один или несколько сегментов РНК вируса A/WSN/33 или любого другого штамма вируса, подходящего для получения вирусов-реассортантов для получения вакцины. Вирус гриппа А может содержать менее 6 (т.е. 0, 1, 2, 3, 4 или 5) вирусных сегментов вируса гриппа АА/6/60 (A/Ann Arbor/6/60). Вирус гриппа В может включать менее 6 (т.е. 0, 1, 2, 3, 4 или 5) вирусных сегментов вируса гриппа АА/1/66 (В/Ann Arbor/1/66). Как правило, изобретение обеспечивает защиту против штамма, который способен передаваться от человека к человеку, и, таким образом, геном штамма, как правило, содержит по меньшей мере один сегмент РНК, происходящий из вируса гриппа млекопитающего (например, человека). Он может включать сегмент NS, который происходит из птичьего вируса гриппа. Штаммы, антигены которых можно вводить в композиции, могут быть устойчивы к противовирусной терапии (например, устойчивы к осельтамивиру [24] и/или занамивиру), в том числе устойчивые пандемические штаммы [25]. Особенно предпочтительными штаммами являются штаммы, которые не пассировали в яйцах на любой стадии от выделения из пациента до осуществления репликации в системе клеточной культуры,включительно. Клетки MDCK можно использовать исключительно на всех стадиях от выделения до репликации вируса. В некоторых вариантах осуществления используемые по изобретению штаммы имеют гемагглютинин, который предпочтительно связывается с олигосахаридами, содержащими концевой дисахарид Sia(2,6) Gal, по сравнению с содержащим концевой дисахарид Sia (2,3) Gal. Вирусы гриппа человека связываются с олигосахаридами рецепторов с концевым дисахаридом Sia (2,6) Gal (сиаловая кислота, присоединенная к галактозе через -2,6), но яйца и клетки Vero имеют олигосахариды рецептора с концевым дисахаридом Sia (2,3) Gal. Рост вирусов гриппа человека в клетках, таких как MDCK, обеспечивает селекционное давление на гемагглютинин для поддержания природного связывания с Sia (2,6) Gal в отличие от пассирования в яйцах. Для определения того, имеет ли вирус свойства связываться с олигосахаридами с концевым дисахаридом Sia (2,6) Gal, а не с олигосахаридами с концевым дисахаридом Sia (2,3) Gal, можно использовать различные анализы. Например, в ссылке 26 описан твердофазный иммуноферментный анализ для определения рецептор-связывающей активности вируса гриппа, позволяющий осуществлять точные и количественные измерения констант сродства. В ссылке 27 используют твердофазный анализ, который позволяет оценить связывание вирусов с двумя различными сиалогликопротеинами (овомукоид с детерминантами Sia (2,3) Gal и 2-макроглобулин свиньи с детерминантами Sia (2,6) Gal), также описан анализ, который позволяет оценить связывание вируса относительно двух аналогов рецептора: свободной сиаловой кислоты (Neu5Ac) и 3'-сиалиллактозы (Neu5Ac2-3Gal1-4Glc). В ссылке 28 сообщают об анализе с использованием гликановой матрицы, что позволяет четко различить предпочтения рецептора для связи с 2,3 или 2,6. В ссылке 29 сообщают об анализе, основанном на агглютинации эритроцитовSia (2,3) Gal. В зависимости от типа анализа его можно проводить непосредственно с самим вирусом или проводить опосредованно с гемагглютинином, выделенным из вируса. В некоторых вариантах осуществления штаммы вируса гриппа, использующиеся по изобретению,имеют гликопротеины (включая гемагглютинин) с различными наборами характеристик гликозилирования вирусов, полученных с помощью инкубирования в яйцах. Таким образом, гликопротеины включают гликоформы, которые не встречаются в куриных яйцах. В настоящее время выделяют шестнадцать подтипов HA вируса гриппа A: H1, Н 2, Н 3, Н 4, Н 5, Н 6,Н 7, Н 8, Н 9, Н 10, Н 11, Н 12, Н 13, Н 14, Н 15 и Н 16. С помощью настоящего изобретения можно осуществлять защиту от одного или нескольких из этих подтипов. С помощью настоящего изобретения можно осуществлять защиту от одного или нескольких подтипов NA вируса гриппа А: N1, N2, N3, N4, N5, N6,N7, N8 или N9. В настоящем документе вакцины содержат антиген по меньшей мере из одного штамма вируса гриппа А и, как правило, включают антиген по меньшей мере из двух штаммов вируса гриппа А,например из 2 или 3 штаммов вируса гриппа А. В случае, когда включают два штамма вируса гриппа А,это, как правило, штамм H1 и штамм Н 3. В случае, когда включают три штамма вируса гриппа А, это,как правило, штамм H1, штамм Н 3 и штамм, связанный с пандемией. В некоторых вариантах осуществления штамм H3 осуществляет перекрестное взаимодействие с A/Moscow/10/99; в других вариантах осуществления штамм H3 осуществляет перекрестное взаимодействие с A/Fujian/411/2002. В ссылке 30 описаны вакцины, содержащие антигены A/H1N1, A/H3N2, A/H5N1 и В. Свойствами штаммов вируса гриппа, связанных с пандемиями, являются: (а) содержание нового гемагглютинина по сравнению с гемагглютининами штаммов человека, циркулирующих в настоящее время, т.е. гемаглютинина, который не выявляли в популяции человека в течение более десяти лет (например, Н 2) или ранее вообще не выявляли в популяции человека (например, Н 5, Н 6 или Н 9, которые,как правило, обнаруживали только в популяциях птиц), так что вакцинируемый реципиент и популяция человека, в целом, с иммунологической точки зрения не "встречались" с гемагглютинином штаммов; (b) способность к горизонтальному распространению в популяции человека и (с) патогенность для людей. Штамм вируса гриппа, связанный с пандемиями, используемый по изобретению, как правило, относится к подтипу Н 2, Н 5, Н 7 или Н 9, например H5N1, H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 или H7N7. Предпочтительными являются штаммы H5N1. Пандемические штаммы могут относиться к подтипу H1 (например, H1N1); например HA может иммунологически перекрестно взаимодействовать со штаммом A/California/04/09. Для вируса гриппа В в настоящий момент не выделяют различных подтипов HA, но штаммы вируса гриппа В относятся к двум различным линиям. Эти линии возникли в поздних 1980-х и обладают HA,которые отличаются друг от друга на уровне антигенов и/или генетически [31]. В настоящее время штаммами вируса гриппа В являются либо штаммы, подобные B/Victoria/2/87, либо штаммы, подобныеB/Yamagata/16/88. Эти штаммы, как правило, отличаются друг от друга на уровне антигенов, но различия в последовательностях аминокислот также были описаны для двух различающихся линий, например штаммы, подобные B/Yamagata/16/88 часто (но не всегда) имеют белки HA с делециями остатка аминокислоты в положении 164, пронумерованного относительно последовательности HA 'Lee40' [32]. В некоторых вариантах осуществления композиции по изобретению содержат антиген из одного штамма вируса гриппа В, и этот штамм может быть штаммом, подобным штамму B/Victoria/2/87 или подобным B/Yamagata/16/88. Однако в других вариантах осуществления композиции по изобретению содержат антиген двух штаммов вируса гриппа В, и такими штаммами, как правило, являются штаммы,подобные B/Victoria/2/87 и B/Yamagata/16/88. Предпочтительные вакцины по изобретению содержат антиген двух штаммов вируса гриппа А и двух штаммов вируса гриппа В (вакцины "АВВА"). Таким образом, предпочтительные вакцины АВВА по изобретению будут содержать гемагглютинин: (i) штамма H1N1; (ii) штамма H3N2; (iii) штамма, подобного B/Victoria/2/87; и (iv) штамма, подобного B/Yamagata/16/88. В некоторых вариантах осуществления АВВА по меньшей мере два штамма вируса гриппа В могут обладать различными гемагглютининами, но сходными типами нейраминидазы. Например, оба штамма могут иметь нейраминидазу штамма, подобного B/Victoria/2/87 [33], или оба могут иметь нейраминидазу штамма, подобного B/Yamagata/16/88. Например, из двух видов нейраминидаз штамма, подобногоB/Victoria/2/87, оба могут обладать одним или несколькими из следующих свойств последовательности:(1) в положении 27 находится не серин, а предпочтительно лейцин; (2) в положении 44 находится не глутаминовая кислота, а предпочтительно лизин; (3) в положении 46 находится не треонин, а предпочтительно изолейцин; (4) в положении 51 находится не пролин, а предпочтительно серин; (5) в положении 65 находится не аргинин, а предпочтительно гистидин; (6) в положении 70 находится не глицин, а предпочтительно глутаминовая кислота; (7) в положении 73 находится не лейцин, а предпочтительно фенилаланин; и/или (8) в положении 88 находится не пролин, а предпочтительно глутамин. Аналогично, в некоторых вариантах осуществления в последовательности, кодирующей нейраминидазу, в положении 43 может быть делеция или треонин; делеция в положении 43, возникшая в результате делеции тринуклеотида в гене NA, описанная как характерная для штаммов, подобных B/Victoria/2/87, хотя современные штаммы вновь приобрели Thr-43 [33]. С другой стороны, безусловно, противоположными свойствами могут обладать оба типа нейраминидаз штаммов, подобных B/Yamagata/16/88, например S27, Е 44, Т 46,Р 51, R65, G70, L73 и/или Р 88. Эти аминокислоты пронумерованы относительно последовательности нейраминидазы 'Lee40' [34]. Таким образом, для вакцины АВВА можно использовать два штамма В, которые отличаются по свойствам антигенов в отношении HA (одна из штамма, подобного B/Yamagata/16/88,одна из штамма, подобного B/Victoria/2/87), но являются родственными в отношении NA (оба из штамма, подобного B/Yamagata/16/88 или оба из штамма, подобного B/Victoria/2/87). Настоящее изобретение не ограничено 3-валентными и 4-валентными вакцинами, а включают 5 валентные, 6-валентные, 7-валентные и т.п. вакцины. Пример 5-валентной вакцины может включать три штамма вируса гриппа А (например, один штамм H1 и два штамма Н 3, как указано выше) плюс два штамма вируса гриппа В. Например, вакцина А-А-А-В-В может содержать гемагглютинин (i) штамма(iv) штамма, подобного B/Victoria/2/87; и (v) штамма, подобного B/Yamagata/16/88. Другая вакцина А-АА-В-В может содержать гемагглютинин (i) штамма H1N1; (ii) штамма H3N2; (iii) штамма Н 5 вируса гриппа А, такого как штамм H5N1; (iv) штамма, подобного B/Victoria/2/87; и (v) штамма, подобногоB/Yamagata/16/88. Вакцина А-А-А-А-В может включать гемагглютинин (i) штамма H1N1; (ii) штамма,подобного A/Moscow/10/99 H3N2; (iii) штамма, подобного A/Fujian/411/2002 H3N2; (iv) штамма Н 5 вируса гриппа А, такого как штамм H5N1; и (v) штамма вируса гриппа В. Вакцина А-А-А-А-В-В может включать гемагглютинин (i) штамма H1N1; (ii) штамма, подобного A/Moscow/10/99 H3N2; (iii) штамма,подобного A/Fujian/411/2002 H3N2; (iv) штамма Н 5 вируса гриппа А, такого как штамм H5N1; (v) штамма, подобного B/Victoria/2/87; и (vi) штамма, подобного B/Yamagata/16/88. Дозирование гемагглютинина. Гемагглютинин (HA) является главным иммуногеном в современных инактивированных вакцинах против вируса гриппа, дозы вакцин являются стандартизированными на основании уровней HA, как правило, измеряемых с помощью SRID. Существующие вакцины, как правило, содержат приблизительно 15 мкг HA на штамм в дозе 0,5 мл, хотя можно использовать более низкие дозы, например, для детей (как правило, доза в 0,25 мкл при такой же концентрации HA), или при пандемиях, или при применении адъюванта. Также используют фракционированные дозы, такие как 1/2 (т.е. 7,5 мкг HA на штамм), 1/4 и 1/8,так как они обладают более высокими дозами (например, дозами 3 или 9 [35, 36]). Как правило, количество HA на дозу может находиться в диапазоне 0,1 и 150 мкг на штамм, предпочтительно от 0,1 до 50 мкг, например 0,1-20 мкг, 0,1-15 мкг, 0,1-10 мкг, 0,1-7,5 мкг, 0,5-5 мкг и т.п. Конкретные дозы включают, например, приблизительно 45, приблизительно 30, приблизительно 15, приблизительно 10, приблизительно 7,5, приблизительно 5, приблизительно 3,8, приблизительно 1,9, приблизительно 1,5 мкг на штамм и т.д. В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрацияHA на штамм в композиции составляет по меньшей мере 12 мкг/мл (т.е. по меньшей мере 6 мкг на штамм в объеме 0,5 мл, т.е. более высокая концентрация, чем концентрация, используемая в ссылке 3). Как правило, концентрация составляет 15 мкг/мл, например 20 мкг/мл, 25 мкг/мл, 30 мкг/мл или выше. Концентрация из 15 мкг/мл на штамм или 30 мкг/мл на штамм является стандартной. Как правило, концентрация HA остается одинаковой для каждого из штаммов в композиции. В некоторых вариантах осуществления, однако, все концентрации являются кратными самой низкой концентрации. Например, если наименьшая концентрация HA для конкретного штамма составляет 15 мкг/мл, то другие концентрации HA в композиции составят 15, 30, 45 или 60 мкг/мл. Как указано выше, изобретение, как правило, может использоваться в инактивированных вакцинах. В некоторых вариантах осуществления, однако, изобретение можно использовать в живых вакцинах. Вместо стандартизации по содержанию HA, дозирование живых вакцин измеряют с помощью средней дозы, инфицирующей культуру ткани (TCID50). TCID50, находящаяся в диапазоне от 106 до 108 (предпочтительно, от 106,5 до 107,5) на штамм, является стандартной. Вирус гриппа может быть ослаблен. Вирус гриппа может быть чувствительным к температуре. Вирус гриппа может быть адаптирован к холоду. Клеточные линии. При получении вакцин, использующихся по изобретению в качестве субстрата для роста вируса,можно использовать яйца SPF, причем вирус собирают из инфицированной аллантоисной жидкости куриных яиц. В качестве альтернативы, однако, можно использовать клеточные линии, поддерживающие репликацию вируса гриппа. Клеточные линии, как правило, являются клетками млекопитающих. Подходящие клетки, происходящие из клеток млекопитающих, включают, но ими не ограничиваются, клетки хомяка, крупного рогатого скота, приматов (включая людей и обезьян) и собак, хотя использование клеток приматов не является предпочтительным. Можно использовать различные типы клеток, такие как клетки почки, фибробласты, клетки сетчатки, клетки легких и тому подобное. Примерами подходящих клеток хомяка являются клеточные линии, обозначенные как BHK21 или HKCC. Подходящими клетками обезьян являются, например, клетки африканской зеленой мартышки, такие как клетки почки, как в клеточной линии Vero [37-39]. Подходящими клетками собаки являются, например, клетки почки, как в клеточных линиях CLDK и MDCK. Таким образом, подходящие клеточные линии включают, но ими не ограничиваются, MDCK; CHO;CLDK; HKCC; 293 Т; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6 [40]; FRhL2; WI-38 и т.п. Подходящие клеточные линии свободно доступны, например, из американской коллекции типовых культур (АТСС) [41], из CoriellCell Repositories [42] или из европейской коллекции культур клеток (ЕСАСС). Например, в АТСС имеются различные клетки Vero под номерами CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 и CRL-1587 и клетки MDCK под номером CCL-34. Линия PER.C6 доступна из ЕСАСС и имеет депозитарный номер 96022940. Наиболее предпочтительными клеточными линиями являются линии, у которых гликозилирование сходно с гликозилированием млекопитающих. Менее предпочтительной альтернативой клеточным линиям млекопитающих являются клеточные линии птиц, в которых можно выращивать вирус [например,ссылки 43-45], в том числе клеточные линии, полученные от уток (например, сетчатка утки) или куриц. Примеры клеточных линий птиц включают эмбриональные стволовые клетки птиц [43, 46] и клетки сетчатки утки [44]. Подходящие эмбриональные стволовые клетки птиц включают клеточную линию Ebx,полученную из эмбриональных стволовых клеток курицы, ЕВ 45, ЕВ 14 и ЕВ 14-074 [47]. Также можно использовать эмбриональные фибробласты цыпленка (CEF). Однако в случае применения клеток млекопитающих, а не клеток птиц, в вакцине может отсутствовать ДНК птиц и белки яйца (такие как овальбумин и овомукоид), что снижает аллергенность. Наиболее предпочтительными клеточными линиями для выращивания вирусов гриппа являются клеточные линии MDCK [48-51], полученные из почки собак Madin Darby. Исходная клеточная линияMDCK доступна в АТСС как CCL-34, также можно использовать производные этой клеточной линии и другие клеточные линии MDCK. Например, в ссылке 48 описана клеточная линия MDCK, адаптированная для роста в суспензионной культуре ('MDCK 33016', депозитарный номер DSM АСС 2219). Аналогично, в ссылке 52 описана клеточная линия, полученная из MDCK, которую выращивают в суспензионной культуре без сыворотки ('В-702', депозитарный номер FERM ВР-7449). В ссылке 53 описаны неканцерогенные клетки MDCK, в том числе 'MDCK-S' (АТСС РТА-6500), 'MDCK-SF101' (АТСС РТА-6501),'MDCK-SF102' (АТСС РТА-6502) и 'MDCK-SF103' (РТА-6503). В ссылке 54 описаны клеточные линииMDCK, которые являются высокочувствительными к инфекции, в том числе клетки 'MDCK.5F1' (АТССCRL-12042). Можно использовать любую указанную клеточную линию MDCK. Вирус можно выращивать в клетках в адгезионной культуре или в суспензии. Также можно использовать культуры с микроносителем. В некоторых вариантах осуществления клетки можно адаптировать для роста в суспензии. Клеточные линии предпочтительно выращивают в бессывороточной среде и/или безбелковой среде. В контексте настоящего изобретения под средой понимают бессывороточную среду, в которой отсутствуют добавки сыворотки человека или сыворотки животного. Клетки, которые выращивают в таких культурах, сами от природы содержат белки, а под безбелковыми средами понимают среды, в которых размножение клеток (например, до инфицирования) происходит в отсутствие белков, факторов роста,других белковых добавок и несывороточных белков, но которые необязательно могут включать белки,такие как трипсин, или другие протеазы, которые могут быть необходимы для роста вируса. Линии клеток, поддерживающие репликацию вируса, предпочтительно растут при температуре ниже 37 С [55] (например, 30-36 С или приблизительно при 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 С) в процессе репликации вируса. Способы размножения вируса гриппа в культивируемых клетках, как правило, включают стадии инокулирования культуры клеток инокулятом выращиваемого штамма, культивирования инфицированных клеток в течение желаемого периода для размножения вируса, например определяемого по титру вируса или экспрессии антигена (например, от 24 до 168 ч после инокулирования), и сбора размножившегося вируса. Культивируемые клетки инокулируют вирусом (как измерено PFU или TCID50) до соотношения с клетками 1:500-1:1, предпочтительно 1:100-1:5, более предпочтительно 1:50-1:10. Вирус добавляют в суспензию клеток или наносят на клеточный монослой, и вирус абсорбируется на клетках по меньшей мере в течение 60 мин, но, как правило, менее 300 мин, предпочтительно от 90 до 240 мин при температуре от 25 до 40 С, предпочтительно от 28 до 37 С. Инфицированную клеточную культуру (например, монослой) можно отделить либо с помощью замораживания-оттаивания, либо с помощью ферментативного воздействия для повышения содержания вируса в супернатанте собранной культуры. Собранные жидкости затем либо инактивируют, либо хранят замороженными. Культивируемые клетки можно инфицировать с помощью множественного заражения ("m.o.i.") с показателем приблизительно 0,000110, предпочтительно 0,002-5, более предпочтительно 0,001-2. Еще более предпочтительно клетки инфицируют m.o.i, составляющим приблизительно 0,01. Инфицированные клетки можно собирать через 30-60 ч после инфицирования. Предпочтительно клетки собирают через 34-48 ч после инфицирования. Еще более предпочтительно клетки собирают через 38-40 ч после инфицирования. Протеазы (обычно - трипсин), как правило, добавляют в процессе культивирования клеток для высвобождения вируса, и протеазы могут быть добавлены на любой подходящей стадии культивирования, например до инокулирования, во время инокулирования или после инокулирования [55]. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления, в частности с клетками MDCK, клеточ-6 023662 ную линию не пассируют до тех пор, пока популяция исходного рабочего банка клеток не удвоится в 40 раз. Вирусный инокулят и культура вируса предпочтительно не содержат (т.е. были проанализированы на отсутствие с получением отрицательного результата на наличие загрязнения) вирус простого герпеса,респираторно-синцитиальный вирус, вирус парагриппа 3, коронавирус SARS, аденовирус, риновирус,реовирусы, полиомавирусы, бирнавирусы, цирковирусы и/или парвовирусы [56]. Особенно предпочтительным является отсутствие вирусов простого герпеса. ДНК клетки-хозяина. Если вирус выращивают в клеточной линии, то по стандартной практике осуществляют минимизирование количества остаточной ДНК клеточной линии в конечной вакцине для минимизации любой онкогенной активности ДНК. Таким образом, композиция вакцины по изобретению предпочтительно содержит менее чем 10 нг(предпочтительно менее 1 нг и более предпочтительно менее 100 пг) остаточной ДНК клетки-хозяина на дозу, хотя ДНК клетки-хозяина может присутствовать в следовых количествах. Предпочтительными являются вакцины, содержащие 10 нг (например, 1 нг, 10 0 пг) ДНК клетки-хозяина на 15 мкг гемагглютинина, а также вакцины, содержащие 10 нг (например, 1 нг, 100 пг) ДНК клетки-хозяина на объем 0,25 мл. Более предпочтительными являются вакцины, содержащие 10 нг(например, 1 нг, 100 пг) ДНК клетки-хозяина на 50 мкг гемагглютинина, а также вакцины, содержащие 10 нг (например, 1 нг, 100 пг) ДНК клетки-хозяина на объем 0,5 мл. Предпочтительно средняя длина любой остаточной ДНК клетки-хозяина составляет менее 500 п.о.,например менее 400 п.о., менее 300 п.о., менее 200 п.о., менее 100 п.о. и т.п. Загрязняющую ДНК можно удалить в процессе получения препарата вакцины, используя стандартные способы очистки, например хроматографию и т.п. Качество удаления загрязняющей ДНК клеткихозяина можно повысить обработкой нуклеазой, например, используя ДНКазу. Подходящий способ уменьшения количества загрязняющей ДНК клетки-хозяина описан в ссылках 57 и 58 и предусматривает двухстадийную обработку, сначала используя ДНКазу (например, бензоназу (Benzonase, которую можно использовать в процессе роста вируса, а, затем катионный детергент (например, СТАВ), который можно использовать в процессе разрушения вириона. Также можно использовать обработку пропиолактоном для удаления. Измерение остаточной ДНК клетки-хозяина в настоящий момент является рутинным требованием для биологических препаратов и хорошо известно специалисту в данной области. Анализ, используемый для измерения ДНК, как правило, является достоверным анализом [59, 60]. Характеристики достоверного анализа могут быть представлены в математических и количественных терминах, и возможные источники ошибок могут быть определены. Анализ, как правило, рассматривают с точки зрения точности, воспроизводимости, специфичности. После калибровки анализа (например, по известным стандартным количествам ДНК клетки-хозяина) и анализа осуществляют рутинное количественное измерение ДНК. Можно использовать три основных способа количественного определения ДНК: способы гибридизации,такие как блоттинг по Саузерну или слот-блоттинг [61]; способы иммунологического анализа, такие как система Threshold [62]; количественную ПЦР [63]. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области, хотя точные характеристики каждого способа могут зависеть от конкретной клеткихозяина, например, при выборе зондов для гибридизации, выборе праймеров и/или зондов для амплификации и т.п. Систему Molecular Devices Threshold, которая является способом количественного анализа общей ДНК до уровня пикограмм, используют для контроля уровня загрязняющей ДНК в биофармацевтической продукции [62]. Стандартный анализ включает независимое от последовательности формирование реакционного комплекса между биотинилированным белком, связывающим оцДНК, конъюгированными с уреазой антителами против оцДНК и ДНК. Все компоненты анализа входят в состав полного набора для анализа общей ДНК, доступного от производителя. Различные коммерческие производители предлагают различные виды анализов для определения остаточной ДНК клетки-хозяина на основе количественной ПЦР, например AppTec Laboratory Services, BioReliance, Althea Technologies и т.п. Сравнение хемилюминесцентного анализа гибридизации и системы общей ДНК Threshold для измерения уровня загрязняющей ДНК клетки-хозяина в вакцине человека, основанной на вирусе, можно найти в ссылке 64. Фармацевтические композиции. Вакцины, использующиеся в настоящем изобретении, как правило, содержат дополнительные компоненты помимо антигенов вируса гриппа, например они, как правило, включают один или несколько фармацевтических носителя(ей) и/или эксципиента(ов). Подробное описание таких компонентов доступно в ссылке 65. В большом числе вариантов осуществления также могут быть включены адъюванты. Для простоты введения, композиции, как правило, находятся в водной форме. Композиция может содержать консерванты, такие как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. В некоторых вариантах осуществления, однако, вакцины, в отличие от продукта PREPANDRIX, по существу, не содержат ртутные соединения, например, не содержат тиомерсал [8, 66]. Вакцины без ртути являются наиболее предпочтительными, а -токоферолсукцинат можно включить в качестве альтернативы ртутным соединениям [8]. Особенно предпочтительными являются вакцины без консервантов. Для контроля тоничности предпочтительно вводить физиологическую соль, например соль натрия. Хлорид натрия (NaCl) является предпочтительным и может присутствовать в концентрации от 1 до 20 мг/мл. Другие соли, которые также могут присутствовать, включают хлорид калия, калий дигидрофосфат, двунатриевый фосфат и/или хлорид магния и тому подобное. Если адъювант находится в отдельном от антигенов контейнере, то хлорид натрия может присутствовать в обеих контейнерах. Значение осмоляльности композиций может находиться в пределах от 200 до 400 мОсм/кг, предпочтительно 240-360 мОсм/кг, возможно 290-310 мОсм/кг. Композиции могут модержать один или несколько буферов. Стандартные буферы содержат фосфатный буфер; буфер Tris; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер (в частности, с гидроксидом алюминия в качестве адъюванта) или цитратный буфер. Концентрация буферов, как правило, находится в диапазоне от 5 до 20 мМ. Значение рН композиции, как правило, находится в пределах от 5,0 до 8,1, как правило, от 6,0 до 8,0, например от 6,5 до 7,5 или от 7,0 до 7,8. Композиция предпочтительно является стерильной. Композиция предпочтительно не является пирогенной, например содержит 1 EU (единица эндотоксина, стандартное значение) на дозу и предпочтительно 0,1 EU на дозу. Композиция предпочтительно не содержит глютена. Композиции по изобретению могут содержать детергенты, например, в качестве поверхностноактивного вещества сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана (известный как 'Tween'), октоксинол (например, октоксинол-9 (Triton X-100) или т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол), цетилтриметиламмония бромид ('СТАВ') или дезоксихолат натрия, особенно, в случае сплит-вакцины или вакцины на основе поверхностных антигенов. Детергент может присутствовать только в следовых количествах. Таким образом, вакцина может содержать менее 1 мг/мл каждого из октоксинола-10 и полисорбата 80. Другими остаточными компонентами в следовых количествах могут быть антибиотики (например, неомицин, канамицин, полимиксин В). Если адъювант находится в отдельном контейнере от антигенов, то этот детергент, как правило, находится в емкости, содержащей антиген (например, антиген с полисорбатом 80 и октоксинолом 10). Композиция может включать вещество для однократной иммунизации или можно включать вещество для многократной иммунизации (т.е. "мультидозовый" набор). Для устройств с мультидозами предпочтительно вводить в состав консерванты. В качестве альтернативы (или в дополнение) для введения в состав консерванта в композиции с мультидозами композиции можно хранить в емкости с асептическим устройством для извлечения вещества. Вакцины против вируса гриппа человека, как правило, вводят внутримышечной инъекцией в объеме однократной дозы приблизительно из 0,5 мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения однако можно использовать однократную дозу с половиной данного объема (т.е. приблизительно 0,25 мл). Этот сниженный объем дозировки особенно подходит для детей. Даже более низкие дозы (например, 0,1 или 0,2 мл) могут быть эффективны, например, для внутрикожных инъекций. Вакцины предпочтительно хранят при температуре от 2 до 8 С. Их не следует замораживать. В идеальном варианте их следует беречь от прямого света. Вакцины можно поставлять в любом подходящем контейнере, либо в форме, готовой для введения,или в наборе из частей для непосредственного смешивания перед введением, например, в виде отдельных компонентов-антигена и адъюванта (как в продукте PREPANDRIX). Подходящие контейнеры включают флаконы, шприцы (например, шприц-тюбик), назальные спреи и тому подобное. Эти контейнеры должны быть стерильными. Если композиция/компонент находится во флаконе, то флакон предпочтительно сделан из стекла или пластика. Флакон предпочтительно стерилизуют перед добавлением в него композиции. Для решения проблемы пациентов, чувствительных к латексу, флаконы предпочтительно закрывают пробкой, не содержащей латекс, и предпочтительно латекс отсутствует во всех упаковочных материалах. Во флаконе может содержаться однократная доза вакцины или может содержаться более одной дозы ("мультидозовый" флакон), например 10 доз. Предпочтительные флаконы сделаны из бесцветного стекла. Флакон может иметь крышку (например, люэровский наконечник), подходящий для того, чтобы в крышку можно было вставить шприц. Флакон может иметь крышку, которая позволяет асептически удалить его содержимое, в частности для мультидозовых флаконов. Если компонент заключен в шприце, то шприц может иметь иглу, прилагаемую к нему. Если игла не прилагается, то игла может быть приложена к шприцу для сборки и применения. Такая игла может быть упакована. Предпочтительными являются безопасные иглы. Стандартными являются иглы в 1-дюйм размер 23, в 1-дюйм размер 25 и в 5/8-дюйма размер 25. Шприцы могут иметь отрывные этикетки, на которых указан номер партии, сезон гриппа и срок годности содержимого для облегчения ведения учета. Поршень в шприце предпочтительно имеет стопор для предотвращения случайного извлечения поршня во время аспирации. Шприц может иметь резиновую крышку из латекса и/или поршень. Одноразовые шприцы содержат одну дозу вакцины. Шприц, как правило, имеет защитный колпачок для герметизации кончика шприца до подсоединения иглы, и защитный колпачок предпочтительно сделан из бутилкаучука. На емкость можно наносить маркировку, указывающую половину объема дозы, чтобы облегчить использование у детей. Например, шприц, содержащий 0,5 мл дозы, может иметь маркировку, показывающую объем 0,25 мл. Таким образом, вакцину можно упаковать с объемом однократной дозы из 0,5 мл, но можно вводить в объеме однократной дозы из 0,25 мл, таким образом, дозирование пополам можно облегчить посредством маркировками емкости. Если используется стеклянный контейнер (например, шприц или флакон), то предпочтительно использовать контейнер, сделанный из борсиликатного стекла, а не из натровой извести. Контейнер можно упаковывать (например, в ту же коробку) с аннотацией, включающей подробные сведения о вакцине, например инструкции по введению, сведения об антигенах, содержащихся в вакцине, и т.п. Инструкции также могут содержать предупреждения, например в случае анафилактического шока после проведения вакцинации следует иметь под рукой адреналин и тому подобное. Адъюванты. Для удобства использования вакцины по изобретению могут предпочтительно включать адъювант,действие которого усиливает иммунный ответ (гуморальный и/или клеточный), индуцируемый у пациентов, получающих композицию. Было показано, что при наличие адъюванта в виде эмульсии "масло-вводе" (в частности, адъюванта, содержащего сквален) происходит усиление перекрестной реактивности иммунного ответа на штаммы в вакцинах сезонных [67] и пандемических [68, 69] вирусов гриппа. Эмульсии "масло-в-воде", которые можно использовать в изобретении, как правило, включают по меньшей мере один вид масла и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, причем масло(а) и поверхностно-активное вещество(а) являются биодеградируемыми (метаболизируемыми) и биологически совместимыми. Диаметр масляных капель в эмульсии, как правило, составляет менее 5 мкм и даже может быть субмикронным, такого небольшого размера они достигают с помощью микрофлюидайзера, обеспечивающего стабильные эмульсии. Капли, размером менее 220 нм, являются предпочтительными, так как их можно стерилизовать фильтрацией. Изобретение можно использовать с такими маслами, как масла, полученные из животных (например, рыбы) или из растительных источников. Источники растительных масел включают орехи, семена и злаки. Арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло легко доступны и являются примерами ореховых масел. Можно использовать масло жожоба, например, полученное из орехов жожоба. К маслам, получаемым из семян, относятся сафлоровое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло,кунжутное масло и т.п. В группе зерновых наиболее доступным является кукурузное масло, но также можно использовать масла других злаков, таких как пшеница, овес, рожь, рис, метличка, тритикале и т.п. 6-10-Углеродные эфиры жирных кислот глицерина и 1,2-пропандиола, которые и не являются природными маслами, получаемыми из семян, можно получить гидролизом, разделением и этерификацией подходящих веществ, происходящих из ореховых масел и масел из злаков. Жиры и масла молока млекопитающих являются метаболизируемыми и, таким образом, их можно использовать в практике изобретения. Способы разделения, выделения, омыления и другие средства, необходимые для получения чистых масел животного происхождения, хорошо известны в данной области. Большинство рыб содержат метаболизируемые жиры, которые могут быть легко получены. Например, рыбий жир, жиры из печени акулы и китовые жиры, такие как спермацетовые жиры, являются примерами жиров, получаемых из рыб, которые можно использовать в настоящем изобретении. Некоторые жиры с разветвленной цепью синтезируют биохимически из 5-углеродных молекул изопрена и, как правило, их обозначают как терпеноиды. Жиры печени акулы содержат разветвленный ненасыщенный терпеноид, известный как сквален, 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексан. Также можно использовать сквалан, насыщенный аналог сквалена. Жиры, получаемые из рыб, в том числе сквален и сквалан, легко доступны из коммерческих источников или могут быть получены способами, известными в данной области. Предпочтителен сквален. Эмульсии, содержащие сквален, уже включены в продукты FLUAD и PREPANDRIX. В вакцинеFLUAD общее количество HA составляет 45 мкг (315 мкг), а общее количество сквалена составляет 9,75 мг в общем объеме дозировки из 0,5 мл (т.е. 19,5 мг/мл сквалена). В вакцине PREPANDRIX общее количество HA составляет 3,75 мкг (моновалентный) и общее количество сквалена составляет 10,68 мг,также в общем объеме дозировки из 0,5 мл (т.е. 21,4 мг/мл сквалена). Во многих вариантах осуществления изобретения концентрация сквалена составляет менее чем 19 мг/мл, тогда как все еще сохраняет эффект адъюванта, и концентрация может составлять 10 мг/мл, например 5, 2, 5 мг/мл. Подходящим является минимальное количество из 0,5 мг сквалена на дозу (например, см. ссылку 3). Примеры количества на дозу включают 5,3, 4,9, 2,7, 2,4, 1,2 мг и т.п. Другими подходящими маслами являются токоферолы, которые предпочтительно вводят в вакцины для использования у пожилых пациентов (например, возрастом 60 лет или старше), так как известно, что витамин Е оказывает положительное действие на иммунный ответа у пациентов этой группы [70]. Токоферолы также обладают свойствами антиоксидантов, которые способствуют стабилизации эмульсий[71]. Существуют различные токоферолы (, , , ,или ), но, как правило, используют . Предпочтительным -токоферолом является DLтокоферол. Известно, что -токоферола сукцинат совместим с вакцинами против гриппа и может использоваться в качестве консерванта, в качестве альтернативы соединениям ртути [8]. Можно использовать смеси масел, например сквален и -токоферол. Как правило, содержание масел находится в диапазоне 2-20 об.%. Поверхностно-активные вещества могут быть классифицированы по их 'HLB' (гидрофильно/липофильному балансу). Предпочтительные поверхностно-активные вещества по изобретению имеют величину HLB, равную по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15 и более предпочтительно по меньшей мере 16. В изобретении можно использовать поверхностно-активные вещества, включая, но ими не ограничиваясь, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (обычно, обозначаемый Tween), особенно, полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (ЕО), пропиленоксида (РО) и/или бутиленоксида(ВО), продаваемые под торговыми названиями DOWFAX, такие как линейные блок-сополимеры ЕО/РО; октоксинолы, которые могут отличаться количеством повторяющихся групп этокси(окси-1,2 этандиил), октоксинолом-9 (Triton X-100 или т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол), имеющим особый интерес; (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); нонилфенол, этоксилаты, такие как Tergitol NP; простые эфиры жирного полиоксиэтилена, полученные из лауриловых, цетиловых, стеариловых и олеиловых спиртов (известных как поверхностно-активные вещества Brij), таких как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (Brij 30); и сложные эфиры сорбитана (общеизвестные как SPAN), такие как сорбитан триолеат (Span 85) и сорбитанмонолаурат. Предпочтительными являются неионные поверхностно-активные средства. Наиболее предпочтительным поверхностно-активным веществом для введения в состав эмульсии является полисорбат 80 (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат; Tween 80). Можно использовать смеси поверхностно-активных веществ, например смеси Tween 80/Span 85. Также подходящим является сочетание сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана и октоксинола. Другое подходящее сочетание содержит лаурет 9 плюс сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол. Предпочтительными количествами поверхностно-активных веществ (мас.%) являются сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (таких как Tween 80) от 0,01 до 1%, в частности приблизительно 0,1%; октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (такие как Triton X-100 или другие детергенты группы Triton) от 0,001 до 0,1%, в частности от 0,005 до 0,02%; простые эфиры полиоксиэтилена (такие как лаурет 9) от 0,1 до 20%, предпочтительно от 0,1 до 10% и, в частности, от 0,1 до 1% или приблизительно 0,5%. Предпочтительными являются эмульсии "масло-в-воде", содержащие сквален, в частности содержащие полисорбат 80. Соотношение по массе сквален:полисорбат 80 может составлять от 1 до 10, например от 2 до 9, например приблизительно 2,2 или приблизительно 8,3. Конкретные адъюванты в виде эмульсии "масло-в-воде", подходящие по изобретению, включают в качестве неограничивающих примеров субмикронную эмульсию сквалена, полисорбата 80 и сорбитантриолеата. По объему композиция эмульсии может содержать приблизительно 5% сквалена, приблизительно 0,5% полисорбата 80 и приблизительно 0,5% Span 85. В весовых значениях эти соотношения составляют 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% Span 85. Этот адъювант известен как "MF59" [72-74], как подробно описано в гл. 10 ссылке 75 и гл. 12 ссылке 76. Эмульсия MF59 преимущественно содержит ионы цитрата, например 10 мМ буфера цитрата натрия; субмикронную эмульсию сквалена, токоферола и полисорбата 80. Эти эмульсии могут содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% токоферола и от 0,3 до 3% полисорбата 80, и соотношение по весу сквален:токоферол предпочтительно составляет 1 (например, 0,90), что может давать более стабильную эмульсию. Сквален и полисорбат 80 могут присутствовать в объемном соотношении приблизительно 5:2 или в весовом соотношении приблизительно 11:5. Одна из таких эмульсий может быть получена путем растворения Tween 80 в PBS с получением 2% раствора, а затем посредством смешивания 90 мл раствора со смесью (5 г DLтокоферола и 5 мл сквалена), а затем микрофлюидизированием смеси. Полученная эмульсия содержит субмикронные масляные капли, например, со средним диаметром от 100 до 250 нм,предпочтительно приблизительно 180 нм. Эмульсия также может включать 3-де-О-ацилированный монофосфорил липид A (3d-MPL). Другая подходящая эмульсия такого типа может содержать на дозу для человека 0,5-10 мг сквалена, 0,5-11 мг токоферола и 0,1-4 мг полисорбата 80 [3]; эмульсию сквалена, токоферола и детергента Triton (например, Triton X-100). Эмульсия также может включать 3d-MPL (см. ниже). Эмульсия может содержать фосфатный буфер; эмульсию, содержащую полисорбат (например, полисорбат 80), детергент Triton (например, TritonX-100) и токоферол (например,-токоферолсукцинат). Эмульсия может включать эти три компонента в весовом соотношении приблизительно из 75:11:10 (например, 750 мкг/мл полисорбата 80, 110 мкг/млTriton X-100 и 100 мкг/мл -токоферола сукцинат), и эти концентрации включают любую долю этих компонентов из антигенов. В эмульсию также можно вводить сквален. В эмульсию также можно вводить 3d-MPL. Водная фаза может содержать фосфатный буфер; эмульсию из сквалена, полисорбата 80 и полоксамера 401 ("Pluronic L121"). Эмульсия может быть получена в фосфатно-солевом буфере, рН 7,4. Эта эмульсия является подходящим носителем для мурамил-дипептидов, и ее используют вместе с треонил-MDP в адъюванте "SAF-1" [77] (0,05-1% ThrMDP, 5% сквалена, 2,5% Pluronic L121 и 0,2% полисорбата 80). Ее также можно использовать без ThrMDP, как в адъюванте "AF" [78] (5% сквалана, 1,25% Pluronic L121 и 0,2% полисорбата 80). Микрофлюидизация является предпочтительной; эмульсию, содержащую сквален, водный растворитель, алкиловый эфир полиоксиэтилена в качестве гидрофильного неионного поверхностно-активного вещества (например, полиоксиэтилен (12) цетостеариловый эфир) и гидрофобное неионное поверхностно-активное вещество (например, сложный эфир сорбитана или сложный эфир маннита, такие как сорбитан моноолеат или "Span 80"). Эмульсия предпочтительно является термообратимой и/или содержит по меньшей мере 90% масляных капель (по объему) размером менее 200 нм [79]. В эмульсию также можно включать один или несколько следующих веществ: алдитол, криозащитное соединение (например, сахар, такой как додецилмальтозид и/или сахароза) и/или алкилполигликозид. В эмульсию можно вводить агонист TLR4 [80]. Такие эмульсии могут быть лиофилизированы; эмульсию из сквалена, полоксамера 105 и Abil-Care [81]. Конечная концентрация (масса) этих компонентов в вакцинах с адъювантами составляет 5% сквалена, 4% полоксамера 105 (полиол-плюроник) и 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 диметикон; каприловый/каприевый триглицерид); эмульсию, содержащую от 0,5-50% масла, 0,1-10% фосфолипидов и 0,05-5% неионного поверхностно-активного средства. Как описано в ссылке 82, предпочтительными фосфолипидными компонентами являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, фосфатидная кислота, сфингомиелин и кардиолипин. Предпочтительными являются капли субмикронных размеров; субмикронную эмульсию "масло-в-воде" из неметаболизируемого масла (такого как легкое минеральное масло) и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество (такое как лецитин, Tween 80 или Span 80). Можно включать такие добавки, как сапонин QuilA, холестерин, липофильный конъюгат сапонин (такой как GPI-0100, описанный в ссылке 83, получаемый посредством добавления алифатического амина к дезацилсапонину через карбоксильную группу глюкуроновой кислоты), диметилдиоктадециламмония бромид и/или N,N-диоктадецил-N,N-бис (2-гидроксиэтил)пропандиамин; эмульсию, в которой сапонин (например, QuilA или QS21) и стерол (например, холестерин) ассоциированы в спиральные мицеллы [84]; эмульсию, содержащую минеральное масло, неионный липофильный этоксилированный жирный спирт и неионное гидрофильное поверхностно-активное вещество (например, этоксилированный жирный спирт и/или блок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен) [85]; эмульсию, содержащую минеральное масло, неионный липофильный этоксилированный жирный спирт и неионное липофильное поверхностно-активное вещество (например, этоксилированный жирный спирт и/или блок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен) [85]. В процессе получения вакцины эмульсии можно комбинировать с антигеном(и) или можно поставлять в качестве отдельных компонентов для смешивания с компонентом, содержащим антиген, немедленно перед применением (как в продукте PREPANDRIX). Если эти два компонента являются жидкостями, то объемное отношение двух этих жидкостей для смешивания может изменяться (например, от 5:1 до 1:5), но, как правило, составляет около 1:1. После смешивания антигена и адъюванта, антиген гемагглютинин, как правило, остается в водном растворе, но может распространяться вокруг границы масло/вода. В основном, в масляную фазу эмульсии попадает небольшое количество гемагглютинина. Соотношение по массе сквалена к гемагглютинину (общее количество) в композиции по изобретению может находиться в диапазоне от 20 до 180, например 25-30, 50-60, 105-115. Способы лечения и введения вакцины. Композиции по изобретению являются подходящими для введения человеку-пациенту, а изобретение относится к способу индукции у пациентов иммунного ответа, включающему стадию введения пациенту композиции по изобретению. Изобретение также относится к композиция по изобретению для использования в качестве лекарственного средства. Изобретение также относится к применению по меньшей мере одного антигена вируса гриппа А, по меньшей мере одного антигена вируса гриппа В и сквалена (например, в форме эмульсии "масло-вводе"), получения композиции для активной иммунизации против заболевания гриппом, где композиция представляет собой вакцину со свойствами, описанными выше. Эти способы и способы применения, как правило, используют для получения иммунного ответа,предпочтительно защитного иммунного ответа. Способы оценки иммунного ответа, способности к ней- 11023662 трализации и защиты после вакцинирования против вируса гриппа хорошо известны в данной области. Исследования на людях показали, что титры антител против гемагглютинина вируса гриппа человека коррелируют с защитой (титр, ингибирующий гемаглютинацию в образце сыворотки, приблизительно из 30-40, обеспечивает примерно 50% защиту от инфекции гомологичным вирусом) [86]. Виды иммунного ответа, как правило, измеряют с помощью ингибирования гемагглютинации, с помощью микронейтрализации, простой радиальной иммунодиффузии (SRID) и/или с помощью простого радиального гемолиза(SRH). Данные способы анализа хорошо известны в данной области. Композиции по изобретению можно вводить различными способами. Наиболее предпочтительным способом иммунизации является внутримышечная инъекция (например, в руку или ногу), но можно использовать другие доступные пути, которые включают подкожную инъекцию [87, 88], интраназальный[89-91], пероральный [92], буккальный, сублингвальный, чрескожный, трансдермальный [93] путь и тому подобное. Вакцины, полученные в соответствии с изобретением, можно использовать для лечения как детей,так и взрослых. Вакцины против вируса гриппа в настоящий момент рекомендованы для применения для иммунизации детей и взрослых, начиная с возраста 6 месяцев. Таким образом, возраст пациента может быть менее 1 года, -636 месяцев, 1-5 лет, 5-15 лет, 15-55 лет или по меньшей мере 55 лет. Предпочтительными пациентами для получения вакцин являются пожилые люди (например, 50 лет, 60 лет и предпочтительно 65 лет), молодые (например, 5 лет), госпитализированные пациенты, работники области здравоохранения, работники вооруженных сил и военнослужащие, беременные женщины, пациенты с хроническими заболеваниями и иммунодефицитными состояниями, пациенты, принимавшие противовирусные препараты (например, осельтамивир или занамивир; см. ниже) за 7 суток до введения вакцины, люди с аллергией на яйца и люди, отправляющиеся за границу. Однако вакцины можно применять не только в данных группах, а можно применять во всей популяции. Предпочтительные композиции по изобретению удовлетворяют 1, 2 или 3 критериям эффективности СРМР. Для взрослых (18-60 лет) этими критериями являются: (1) 70% уровень серопротекции; (2) 40% уровень серологической конверсии и/или (3) повышение GMT в 2,5-раза. У пожилых людей (60 лет) этими критериями являются: (1) 60% уровень серопротекции; (2) 30% уровень серологической конверсии и/или (3) повышение GMT в 2-раза. Эти критерии основаны на открытых исследованиях с участием по меньшей мере 50 пациентов. Лечение можно осуществлять в режиме введения однократной дозы или в режиме введения многократных доз. Многократные дозы можно использовать в режиме первичной иммунизации и/или в режиме бустер-иммунизации. В режиме многократной иммунизации различные дозы можно вводить одинаковыми или разными путями, например первично парентеральным путем, а повторная иммунизация через слизистую, первично через слизистую, а повторно парентеральным путем и т.д. Введение более чем одной дозы (как правило, двух доз) особенно эффективно для пациентов, не подвергавшихся иммунизации, например для людей, которые ранее никогда не получали вакцину против гриппа, или для вакцин,включающих новые подтипы HA. Многократные дозы, как правило, вводят, по меньшей мере, с интервалом в 1 неделю (например, приблизительно в 2 недели, приблизительно в 3 недели, приблизительно в 4 недели, приблизительно в 6 недель, приблизительно в 8 недель, приблизительно в 12 недель, приблизительно в 16 недель и т.д.). Вакцины, получаемые в соответствии с изобретением, можно вводить пациентам, по существу, одновременно с (например, одновременно с консультацией врача или во время визита к врачу или в центр вакцинирования) другими вакцинами, по существу, одновременно с вакциной против кори, вакциной против паротита, вакциной против краснухи, тривакциной MMR, вакциной против ветряной оспы, комбинированной вакциной MMRV, вакциной против дифтерии, вакциной против столбняка, вакциной против коклюша, вакциной АКДС, конъюгированной вакциной против Н.influenzae типа b, вакциной против инактивированного полиовируса, вакциной против гепатита В, конъюгированной вакциной против менингококковой инфекции (такой как четырехвалентная вакцина А-C-W135-Y), вакциной против респираторно-синцитиального вируса, конъюгированной вакциной против пневмококковой инфекции и тому подобное. По существу, одновременное введение вакцины против пневмококковой инфекции и/или вакцины против менингококковой инфекции особенно эффективно для пожилых пациентов. Аналогично, вакцины по изобретению можно вводить пациентам, по существу, одновременно (например, одновременно с консультацией врача или во время визита к врачу или в центр вакцинирования) с противовирусными средствами и, в частности, противовирусными средствами, активными в отношении вируса гриппа (например, осельтамивир и/или занамивир). Эти противовирусные средства содержат ингибиторы нейраминидазы, такие как (3R,4R,5S)-4-ацетиламино-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1 циклогексен-1-карбоновая кислота или 5-(ацетиламино)-4-(аминоиминометил)-амино]-2,6-ангидро-3,4,5 тридезокси-D-глицеро-D-галактонон-2-еноевая кислота, в том числе ее сложные эфиры (например,сложные этиловые эфиры) и ее соли (например, фосфатные соли). Предпочтительным противовирусным средством является фосфат этилового эфира (3R,4R,5S)-4-ацетиламино-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1 циклогексен-1-карбоновой кислоты (1:1), также известный как осельтамивир фосфат (TAMIFLU)."содержащая" X может состоять только из X или может что-то дополнительно включать, например X+Y. Выражение "по существу" не исключает "полностью", например композиция, которая "по существу не содержит" Y, может вообще не содержать Y. В случае необходимости выражение "по существу" можно пропустить из определений, приводимых в изобретении. Термин "приблизительно" по отношению к численному значению х является произвольным и обозначает, например, х 10%. Если не указано, процесс, предусматривающий стадию смешивания двух или более компонентов,не требует какого-либо определенного порядка смешивания. Таким образом, компоненты можно смешивать в любом порядке. При наличии трех компонентов, можно смешать друг с другом два компонента, а затем данную смесь можно смешать с третьим компонентом и тому подобное. При использовании соединений животного происхождения (и, в частности, из крупного рогатого скота) в культурах клеток их следует получать из источников, которые не имеют трансмиссивные виды губчатой энцефалопатии (TSE), и, в частности, не имеют губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE). В целом, предпочтительным является культивирование клеток при полном отсутствии веществ животного происхождения. При использовании клеточного субстрата для рекомбинации или генетических манипуляций с обратной транскрипцией или для вирусного роста предпочтительно использовать тот субстрат, который одобрен для использования при производстве вакцин для человека, например, как указано в Ph Eur глава 5.2.3. Способы осуществления изобретения 595 пациентов (дети мужского и женского пола от 6 до 36 месяцев) разбили на 17 групп по 35 человек в каждой. Каждая из групп получает либо трехвалентную (A/H1N1, A/H3N2, В) или четырехвалентную (A/H1N1, A/H3N2, B/Victoria, B/Yamagata) вакцины против гриппа. Вакцину вводят либо в объеме 0,5 мл (15 мкг/дозу/штамм; 45 мкг или 60 мкг в целом) или в объеме 0,25 мл (7,5 мкг/дозу/штамм; 22,5 мкг или 30 мкг в целом). Одна группа получает педиатрическую дозу существующей на рынке трехвалентной инактивированной вакцины. Вакцину вводят внутримышечно и представляют либо в предварительно заполненных шприцах или во флаконах. Тестируют адъювант в трех различных концентрациях(полученных посредством разведения). Трехвалентная вакцина содержит штаммы гриппа в соответствии с рекомендациями сезона гриппа 2008-2009 в северном полушарии: подобные A/Brisbane/59/2007, вирус, подобный A/Brisbane/10/2007 и подобный B/Florida/4/2006. Вирус, подобный B/Florida/4/2006, происходит из B/Yamagata, таким образом, четырехвалентная вакцина дополнительно содержит антиген из вируса, подобного B/Malaysia/ 2506/2004, происходящего из B/Victoria. Индивиды получают две дозы вакцины на 1 и 29 сутки (кроме двух групп, получающих однократную дозу в 1 сутки), а специфичные к гриппу виды иммунного ответа оценивают посредством анализа образцов крови, собранной в начале исследования (перед вакцинацией), на 28 и на 50 сутки. Сыворотку в образцах анализируют с помощью анализа ингибирования штамм-специфичной гемагглютинации (HI) против штаммов вируса A/H1N1, A/H3N2 и В, включая гомологичные и гетеровариантные штаммы. Таким образом, 17 групп представляют собой следующее: В дальнейшем исследовании 357 пациентов (мужчины и женщины 65 лет) разбивали на 8 групп. Каждая из групп посредством внутримышечной инъекции (0,5 мл) получала трехвалентную вакцину(A/H1N1, A/H3N2, В) с или без сквалена в водной эмульсии. Вакцину предоставляют в предварительно заполненных шприцах. Адъювант тестируют в трех различных концентрациях (полученных посредством разведения). Штаммы гриппа в соответствии с рекомендациями сезона гриппа 2008-2009 в северном полушарии: подобного A/Brisbane/59/2007, вирус, подобный A/Brisbane/10/2007 и подобный B/Florida/4/2006. Индивиды получали однократную дозу, а специфичные к гриппу виды иммунного ответа оценивали посредством анализа образцов крови, собранной в начале исследования (перед вакцинацией), на 7 сутки(сутки 8) и на 21 сутки (сутки 22) после вакцинации. Сыворотку в образцах анализировали с помощью анализа ингибирования штамм-специфичной гемагглютинации (HI) против штаммов вируса A/H1N1,A/H3N2 и В. Также анализируют виды клеточного иммунитета. Таким образом, восемь групп представляют собой следующее: Для обоих штаммов вируса гриппа А, группы пациентов С-Н (т.е. получавших вакцины с адъювантом) соответствуют всем трем критериям СНМР. Для штаммов вируса гриппа В, группы пациентов, получавших 4,88 мг сквалена или 9,75 мг сквалена, соответствуют всем трем критериям СНМР. В группе, получавшей вакцину без адъюванта, выполнялся только один критерий СНМР, а в группе, получавшей 2,44 мг сквалена, выполнялись два из трех критериев. Таким образом, даже низкие дозы сквалена в вакцине могут повышать иммунную защиту против штаммов вируса гриппа А и В. Понятно, что изобретение описано только в качестве примера, а модификации можно вносить в пределах объема и сущности изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение вакцины против вируса гриппа для индукции иммунного ответа у пациента в возрасте 5 лет или младше, содержащей:(iii) линии вируса гриппа В B/Victoria/2/87 и(iv) линии вируса гриппа В B/Yamagata/16/88,где концентрация гемагглютинина на штамм по меньшей мере 12 мкг/мл; и(b) адъювант в виде эмульсии "масло-в-воде" с субмикронными масляными каплями, содержащий сквален, где концентрация сквалена составляет меньше 19 мг/мл, а минимальное количество сквалена составляет 0,5 мг на дозу. 2. Применение вакцины по п.1, где вакцина имеет объем однократной дозы 0,5 мл. 3. Применение вакцины по п.1, где вакцина имеет объем однократной дозы 0,25 мл. 4. Применение вакцины по любому из пп.1-3, где гемагглютинины представлены в форме расщепленных вирионов или очищенных поверхностных антигенов. 5. Применение вакцины по любому из пп.1-4, где концентрация гемагглютинина на штамм составляет по меньшей мере 25 мкг/мл. 6. Применение вакцины по любому из пп.1-5, где концентрация сквалена составляет меньше 10 мг/мл. 7. Применение вакцины по любому из пп.1-6, где весовое соотношение сквалена к гемагглютинину в композиции по изобретению находится в диапазоне от 20 до 180. 8. Применение вакцины по любому из пп.1-7, где вакцина представляет собой четырехвалентную инактивированную вакцину против гриппа, содержащую штамм A/H1N1, штамм A/H3N2, штамм вируса гриппа В линии B/Yamagata/16/88 и штамм вируса гриппа В линии B/Victoria/2/87, с концентрацией гемагглютинина приблизительно 30 мкг/мл на штамм, концентрацией сквалена приблизительно 9,75 мг/мл и объемом единичной дозы приблизительно 0,5 мл. 9. Применение вакцины по любому из пп.1-7, где вакцина представляет собой четырехвалентную инактивированную вакцину против гриппа, содержащую штамм A/H1N1, штамм A/H3N2, штамм вируса гриппа В линии B/Yamagata/16/88 и штамм вируса гриппа В линии B/Victoria/2/87, с концентрацией гемагглютинина приблизительно 30 мкг/мл на штамм, с концентрацией сквалена приблизительно 9,75 мг/мл и объемом единичной дозы приблизительно 0,25 мл. 10. Применение вакцины по любому из пп.1-7, где вакцина представляет собой четырехвалентную инактивированную вакцину против гриппа, содержащую штамм A/H1N1, штамм A/H3N2, штамм вируса гриппа В линии B/Yamagata/16/88 и штамм вируса гриппа В линии B/Victoria/2/87, с концентрацией гемагглютинина приблизительно 30 мкг/мл на штамм, с концентрацией сквалена приблизительно 4,88 мг/мл и объемом единичной дозы приблизительно 0,5 мл. 11. Применение вакцины по любому из пп.1-7, где вакцина представляет собой четырехвалентную инактивированную вакцину против гриппа, содержащую штамм A/H1N1, штамм A/H3N2, штамм вируса гриппа В линии B/Yamagata/16/88 и штамм вируса гриппа В линии B/Victoria/2/87, с концентрацией гемагглютинина приблизительно 30 мкг/мл на штамм, с концентрацией сквалена приблизительно 4,88 мг/мл и объемом единичной дозы приблизительно 0,25 мл. 12. Способ повышения иммунного ответа у пациента в возрасте 5 лет или младше, включающий стадию введения вакцины, указанной в любом из предшествующих пунктов, пациенту в возрасте 5 лет или младше.