Способ получения биологически активного рекомбинантного г-ксф человека

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ГКСФ ЧЕЛОВЕКА Предусмотрен способ получения биологически активного рекомбинантного Г-КСФ человека из телец включения, согласно которому процессы солюбилизации и рефолдинга можно осуществлять при температуре окружающей среды, а этап очистки включает хроматографию с обращенными фазами (ОФ), в частности ОФ-ВЭЖХ. Препарат Г-КСФ, полученный таким способом, отличается высокой чистотой и гомогенностью. Область техники Настоящее изобретение относится к способу получения колониестимулирующего фактора гранулоцитов (Г-КСФ), в частности рекомбинантного Г-КСФ человека (рчГ-КСФ), в высоко активной и чистой форме. Этого добиваются путем рефолдинга солюбилизированного Г-КСФ, содержащегося в тельцах включения, в подходящей окислительно-восстановительной системе при температурах окружающей среды и применения по меньшей мере одного этапа хроматографии с обращенными фазами (ОФ) в процессе очистки. Уровень техники Г-КСФ (колониестимулирующий фактор гранулоцитов) представляет собой гемопоэтический цитокин, высвобождаемый преимущественно мононуклеарными клетками и фибробластами, который стимулирует пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников гранулоцитарной линии дифференцировки и активацию функционально зрелых нейтрофилов. Благодаря описанным свойствам Г-КСФ стали использовать в различных областях медицины, например для восстановления нормальной популяции клеток крови после химиотерапии или облучения, или для стимулирования иммунного ответа на инфекционные патогены. Таким образом, в клинической практике Г-КСФ преимущественно используют в противоопухолевой терапии, в частности для лечения нейтропении вследствие химиотерапии, и, кроме того, используют при пересадке костного мозга и для лечения инфекционных заболеваний. Первый доступный для приобретения препарат Г-КСФ на основе рекомбинантного Г-КСФ произвела и стала распространять компания Amgen под торговым названием Нейпоген. Г-КСФ человека во встречающейся в природе форме представляет собой гликопротеин, обладающий молекулярной массой приблизительно 20000 Да, который содержит пять остатков цистеина. Четыре из данных остатков образуют два внутримолекулярных дисульфидных мостика, которые имеют важное значение для активности белка. Рекомбинантные формы Г-КСФ, преимущественно используемые для получения лекарственных средств, которые, например, можно получить путем экспрессии в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО (клетки яичника китайского хомячка), или в прокариотических клетках, таких как клетки Е. coli. При экспрессии рекомбинантных белков в прокариотах такие белки часто получают внутри клетки-хозяина в виде, по меньшей мере, частично неактивных нерастворимых агрегатов (рефрактильные тельца, тельца включения (ТВ. Перед тем как такие белки можно будет использовать, их необходимо перевести в активную форму. Образование указанных телец включения приводит к необходимости солюбилизации и ренатурирования белков после выделения телец включения путем центрифугирования при умеренной скорости с помощью подходящих средств, чтобы сохранить их активную конфигурацию. Процессы ренатурирования рекомбинантных белков, полученных из телец включения, широко известны и описаны, например, в ЕР 0114506, WO 84/03711, US 4530787 и ЕР 0241022. Вдобавок, основные методики, относящиеся к солюбилизации и ренатурированию денатурированных белков, были описаны в ЕР 0512097, ЕР 0364926, ЕР 0219874 и WO 01/87925, и, более того, их можно взять из научной литературы и стандартных работ по белковой химии. В ЕР 0500108 описан способ активирования рекомбинантного Г-КСФ человека, выделенного в неактивной форме из телец включения, путем применения системы смещения окислительновосстановительного равновесия с помощью восстановленного глутатиона (GSH) и окисленного глутатиона (GSSH) и анализа кинетики реактивации Г-КСФ при определенных условиях. Тем не менее, дальнейший процесс очистки не описан. В ЕР 0719860 тельца включения, содержащие Г-КСФ, солюбилизировали с помощью Nлауроилсаркозина (саркозила), а затем добивались рефолдинга путем окисления на воздухе с использованием сульфата меди. К недостаткам данного способа относятся побочные реакции, например образование супероксидных радикалов на боковых цепях аминокислот. Более того, процесс рефолдинга трудоемок, и сложно получить стандартизированные параметры рефолдинга. Наконец, удаление денатурирующего агента, включающее хроматографический этап, приводит к потере приблизительно 20% общего выхода белка. Полученный Г-КСФ впоследствии очищают с помощью анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии. В ЕР 1630173 и ЕР 1837346 описаны способы получения рекомбинантного Г-КСФ человека из телец включения путем применения системы смещения окислительно-восстановительного равновесия с помощью восстановленного глутатиона (GSH) и окисленного глутатиона (GSSH), в которых этап рефолдинга осуществляют при низких температурах в течение более чем половины дня. Следовательно, в промышленном масштабе данный процесс энергоемок и, таким образом, требует больших затрат вследствие охлаждения больших объемов раствора белка в течение многих часов. Полученный в результате этого ГКСФ впоследствии очищают с помощью катионообменной хроматографии. В WO 2007/009950 способ очистки Г-КСФ, описанный в ЕР 1630173, дополнительно уточнен в отношении хроматографических этапов в том, что последовательно осуществляют катионообменную хроматографию и хроматографию гидрофобных взаимодействий без какого-либо промежуточного этапа между ними. В частности, процедура хроматографической очистки включает последовательность двух этапов катионообменной хроматографии, которые осуществляют перед и после хроматографии гидро-1 022821 фобных взаимодействий соответственно. Тем не менее, несмотря на то что средства и способы получения очищенного Г-КСФ терапевтической степени чистоты представляют собой известный уровень техники, процессы получения Г-КСФ из телец включения, доступные на сегодняшний день, особенно в промышленном масштабе, как правило,требуют больших затрат времени, труда и средств. Эта технологическая проблема решена в вариантах реализации, охарактеризованных в формуле настоящего изобретения и дополнительно описанных ниже. Кроме того, ниже дополнительно описано, что указанные варианты реализации обеспечивают отделение конформационной изоформы Г-КСФ и, следовательно, получение высоко гомогенного Г-КСФ. Краткое описание изобретения Согласно настоящему изобретению предложен способ выделения и очистки колониестимулирующего фактора гранулоцитов (рчГ-КСФ) из рекомбинантной клетки, продуцирующей Г-КСФ. Указанный способ включает осуществление солюбилизации рекомбинантного белка из телец включения, восстановление трехмерной конформации (рефолдинг) молекулы Г-КСФ путем разбавления солюбилизата в буфере для рефолдинга при умеренных температурах, предпочтительно 10 С, и очистку свернутого Г-КСФ с помощью хроматографии, при этом по меньшей мере один этап хроматографии включает хроматографию с обращенными фазами (ОФ). Указанный способ в целом характеризуется: (а) осуществлением солюбилизации Г-КСФ, содержащегося в тельцах включения, с помощью солюбилизирующего буфера,содержащего денатурирующий агент и восстановитель, (b) осуществлением рефолдинга Г-КСФ путем разбавления солюбилизата в буфере для рефолдинга, содержащем восстановленный и окисленный глутатион, при температуре 10 С; и (с) осуществлением очистки свернутого Г-КСФ с помощью по меньшей мере одного этапа хроматографии, предпочтительно включающего хроматографию с обращенными фазами (ОФ). В частности, в одном аспекте настоящее изобретение основано на процессе рефолдинга в подходящей окислительно-восстановительной системе, который осуществляют при температурах выше 10 С в течение менее чем половины дня и предпочтительно при комнатной температуре, т.е. при 202 С, в течение от 3 до 4 ч. Помимо того, что при данных условиях можно добиться эффективной и правильной ренатурации молекул Г-КСФ, также удается избежать недостатков предшествующих способов, описанных в известном уровне техники, приведенном выше. Так, способ согласно настоящему изобретению легко осуществить, он менее трудоемок и не предполагает использование энергопотребляющих систем охлаждения. Более того, способ согласно настоящему изобретению основан на неожиданном наблюдении, состоящем в том, что во время процедуры получения и выделения Г-КСФ образуется по меньшей мере одна изоформа Г-КСФ, которая обладает несколько меньшей гидрофобностью, чем основная форма, и которую становится видно лишь при применении аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенными фазами (ОФ-ВЭЖХ) при 60 С; см. фиг. 3. Структурную природу данной дополнительной неправильно свернутой изоформы Г-КСФ детально исследовали и дополнительно охарактеризовали, как описано ниже. Максимальное содержание дополнительной изоформы Г-КСФ во всем препарате могло составлять до 7% общего выхода белка Г-КСФ. Обстоятельный анализ с применением спектроскопии кругового дихроизма выявил, что изоформа Г-КСФ отличается от исходного Г-КСФ более высоким содержанием -спиральных структур (66% в изоформе и 52% в исходном Г-КСФ). Одной отличительной особенностью данной дополнительной изоформы является е более низкая гидрофобность по сравнению с исходным стандартным Г-КСФ и основной фракцией препарата Г-КСФ согласно настоящему изобретению, в связи с чем е можно отделить и, таким образом, почти полностью исключить из препарата. В результате, введение в процесс этапа ОФ-хроматографии и, в частности этапа ОФВЭЖХ, в соответствии со способом согласно настоящему изобретению позволяет получить улучшенный,т.е. лучше очищенный препарат Г-КСФ, который, по существу, свободен от такой изоформы и других связанных с продуктом примесей, т.е. содержание менее гидрофобной изоформы Г-КСФ остается ниже 1% общего содержания белка Г-КСФ. В данном контексте ОФ-хроматографию следует отличать от хроматографии гидрофобных взаимодействий (ХГВ), которая не представляет собой предпочтительный вариант реализации способа согласно настоящему изобретению. Следовательно, что касается очистки ГКСФ ОФ-хроматографию и ОФ-ВЭЖХ соответственно до настоящего времени применяли исключительно для аналитических целей; см., например, WO 2007/009950. Специалисты также определенно понимают отличия упомянутых принципов хроматографии (см., например, Bioanalytik, F. Lottspeich, H. Zorbas(ред.), Хайдельберг, Берлин, Германия, Spektrum Akad. Verlag 1998). Например, тогда как при ХГВ обычно используют воду в качестве элюента, при ОФ-хроматографии в качестве элюента используют растворитель, такой как ацетонитрил или этанол, при этом элюирование осуществляют градиентом с увеличением концентраций растворителя. Предпочтительно хроматографические этапы включают ОФвысокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) при подходящих условиях, которой предшествует применение катионообменной хроматографии (КОХ). В данном контексте разумно предположить, что при осуществлении способов получения Г-КСФ из телец включения, известных из уровня техники, также образуются изоформы Г-КСФ, но до настоящего времени они не были обнаружены, так как при условиях аналитической ОФ-ВЭЖХ, используемой в из-2 022821 вестном уровне техники, указанные изоформы не различимы. Более того, так как существование таких изоформ Г-КСФ не было известно, не было оснований их искать. Соответственно способ согласно настоящему изобретению, в частности препаративный этап ОФхроматографии и этап ОФ-ВЭЖХ, соответственно можно внедрить в процессы очистки Г-КСФ, особенно Г-КСФ, полученного из телец включения, после солюбилизации/ренатурации в подходящей окислительно-восстановительной системе, такой как описанная в документах, указанных выше. Более того, в комбинации с предшествующим этапом катионообменной хроматографии (КОХ) данных двух этапов хроматографии достаточно для очистки рекомбинантного Г-КСФ человека до степени чистоты, которой достаточно для применения полученного Г-КСФ в качестве лекарственного средства. Таким образом, несмотря на то что способ согласно настоящему изобретению можно предпочтительно осуществить, как описано на фиг. 1 и проиллюстрировано в примерах, для специалиста в данной области должно быть очевидно, что для получения Г-КСФ терапевтической степени чистоты достаточно осуществления катионообменной хроматографии и последующей ОФ-ВЭЖХ, тогда как любые другие этапы очистки можно изменить или вообще пропустить. Таким образом, предусмотрен способ получения чистого биологически активного рекомбинантного Г-КСФ человека, который можно осуществить с минимальным количеством этапов производственного процесса, сохраняя низкий уровень технической сложности, а также энергозатрат, и при котором полученный препарат Г-КСФ, по существу, аналогичен коммречески доступным эталонным препаратам и свободен от дополнительных изоформ Г-КСФ. Таким образом, препарат Г-КСФ, полученный в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, обладает преимуществом в отношении чистоты по сравнению с таковыми, полученными в соответствии со способами, известными из уровня техники, согласно которым не применяется ОФВЭЖХ, т.е. в указанном препарате молекулы белка Г-КСФ более гомогенны. Более того, благодаря гомогенности препарата Г-КСФ согласно настоящему изобретению разумно ожидать, что активность in vivo препарата Г-КСФ согласно настоящему изобретению по меньшей мере аналогична, если не улучшена по сравнению с продуктами рекомбинантного Г-КСФ, доступными для приобретения до настоящего времени. Это также подразумевает, что в остальном фармакокинетические и фармакодинамические свойства будут аналогичны таковым у промышленных продуктов. Г-КСФ, полученный в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, таким образом, является особенно подходящим для применения в медицине человека. Кроме того, препарат Г-КСФ согласно настоящему изобретению особенно подходит для дальнейшего получения производных, так как в этом случае химически модифицированный продукт сохранит высокую чистоту и гомогенность препарата Г-КСФ. Следовательно, в дополнительном варианте реализации, способ согласно настоящему изобретению дополнительно включает химическую модификацию ГКСФ, полученного в соответствии с указанным способом, например, путем ковалентного присоединения к Г-КСФ водорастворимого полимера, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Более того, в свете описанных выше аспектов согласно настоящему изобретению предложен способ получения фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный Г-КСФ или его производное, и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как буферы, соли и стабилизаторы, при этом указанный способ включает способ получения Г-КСФ, описанный в данной заявке и, в частности, в примерах. Предпочтительно очищенный биологически активный Г-КСФ или его производное, например пегилированный Г-КСФ, вводят в состав лекарственной формы с 10 мМ уксусной кислоты при рН, равном 4,0, 0,0025% полисорбата 80 и 50 г/л сорбита. Фармацевтические композиции, полученные таким образом, также представляют собой предмет настоящего изобретения. Краткое описание фигур Фиг. 1 - блок-схема, иллюстрирующая процедуру выделения и очистки Г-КСФ в соответствии со способом согласно настоящему изобретению. Показано, что в одном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения способ очистки и получения биологически активного Г-КСФ человека из телец включения включает следующие этапы: а) Ферментацию и сбор:a. культивирование рекомбинантных клеток, продуцирующих рчГ-КСФ, при этом сверхэкспрессированный рчГ-КСФ накапливается с высокой плотностью в тельцах включения;c. осуществление солюбилизации телец включения путем применения денатурирующего буфера с восстановителем, а затем фильтрации;d. рефолдинга добиваются путем добавления буфера для рефолдинга и переноса солюбилизированной смеси в указанный буфер для рефолдинга в одностадийном процессе разведения, при этом используют окислительно-восстановительную систему на основе окисленного и восстановленного глутатиона(GSH/GSSH) в слабощелочном буфере на основе гидрохлорида аргинина, и инкубируют при температурах выше 10 С в течение по меньшей мере 3 ч, чтобы получить биологически активный растворимый рчГ-КСФ в емкости из нержавеющей стали, а затем осуществляют фильтрацию;a. этап ультра- и диафильтрации для замены буфера, уменьшения концентрации денатурирующего агента и концентрирования свернутого Г-КСФ, предпочтительно с применением фильтра с размером порMWCO 10 кДа, после которого осуществляют фильтрацию;b. катионообменную хроматографию для удаления агрегированных веществ, а также белков и ДНК хозяина, замены буфера и концентрирования фракции Г-КСФ путем уменьшения объема;c. этап микрофильтрации для удаления нерастворимых примесей;d. этап очистки с помощью ОФ-ВЭЖХ при подходящих условиях при температурах окружающей среды осуществляли с помощью, например, Jupiter C4, чтобы удалить менее гидрофобную изоформу ГКСФ, которая элюируется перед основной фракцией Г-КСФ; и удаление окисленной и восстановленной производных Г-КСФ;e. этап ультра- и диафильтрации (например, тангенциальная поточная фильтрация) для концентрирования очищенного Г-КСФ и включения Г-КСФ в желательную лекарственную форму, предпочтительно с применением фильтра с размером пор MWCO 5 кДа, после которого осуществляют фильтрацию;f. Хранение очищенного Г-КСФ предпочтительно при 2-8 С. Отдельные этапы способа и очистки дополнительно объясняются в описании и примерах. Фиг. 2. - анализ методом вестерн-блот очищенного рчГ-КСФ, выделенного из телец включения. Очищенные белки Г-КСФ разделяли с помощью 4-20% ПААГ/ДСН с трис-глициновым буфером и подвергали блоттингу. Вестерн-блот инкубировали с первичным антителом против Г-КСФ и проявляли с помощью вторичного репортерного антитела. В каждый карман загружали 0,1 мкг белка. 3, 7, 9 и 13 пустые дорожки; 2, 8 и 14 - маркер молекулярной массы (Magic Mark XP); 4-6 - Г-КСФ, полученный с помощью способа, проиллюстрированного в примерах; 10-12 -Нейпоген в качестве контроля. Нейпоген и Г-КСФ дали полосы на уровне приблизительно 18 кДа на дорожках 4-6 по сравнению с дорожками 10-12. В результате, у Г-КСФ, полученного в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, очевидно отсутствуют дополнительные полосы, и он сравним с Нейпогеном. Фиг. 3 - анализ методом аналитической ОФ-ВЭЖХ препарата рчГ-КСФ перед или после препаративного этапа очистки методом ОФ-ВЭЖХ в соответствии со способом согласно настоящему изобретению. После рефолдинга и очистки с помощью катионообменной хроматографии образцы Г-КСФ отбирали перед (А) или после (В) этапа очистки с помощью препаративной хроматографии ОФ-ВЭЖХ и подвергали анализу методом аналитической ОФ-ВЭЖХ при 60 С, чтобы определить состав образцов. ГКСФ обозначает менее гидрофобную изоформу Г-КСФ, тогда как Г-КСФ обозначает основную фракцию. Следует отметить, что в (А) для образца, отобранного перед этапом очистки с помощью ОФ-ВЭЖХ, наблюдается дополнительный пик перед пиком основной фракции (указан стрелкой). В (В) для образца,отобранного после этапа очистки с помощью ОФ-ВЭЖХ, наблюдается основной пик, тогда как второй пик, соответствующий менее гидрофобной изоформе Г-КСФ, обозначенный стрелкой в (А), практически полностью отсутствует. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение в целом относится к способу крупномасштабного получения особо чистого и гомогенного препарата Г-КСФ с минимизированными количествами менее гидрофобной изоформы ГКСФ по сравнению с эталонным Г-КСФ. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения Г-КСФ из рекомбинантной клетки, продуцирующей Г-КСФ, такой как Е. coli, включающему осуществление солюбилизации рекомбинантного белка Г-КСФ из телец включения, восстановление трехмерной конформации (рефолдинг) молекулы Г-КСФ путем разбавления солюбилизата в буфере для рефолдинга при температурах окружающей среды, предпочтительно 10 С, и очистку свернутого Г-КСФ с помощью хроматографии, при этом по меньшей мере один этап хроматографии включает хроматографию с обращенными фазами (ОФ-хроматографию). Другими словами, способ согласно настоящему изобретению относится к способу получения биологически активного Г-КСФ человека из телец включения,включающему следующие этапы:(a) осуществление солюбилизации Г-КСФ, содержащегося в тельцах включения, с помощью солюбилизирующего буфера, содержащего денатурирующий агент и восстановитель;(b) осуществление рефолдинга Г-КСФ путем разбавления солюбилизата в буфере для рефолдинга,содержащем восстановленный и окисленный глутатион, при температуре 10 С; и(c) очистку свернутого Г-КСФ с помощью по меньшей мере одного этапа хроматографии, включающего хроматографию с обращенными фазами (ОФ). Согласно настоящему изобретению подразумевают, что термин "биологически активный Г-КСФ человека" обозначает препарат Г-КСФ, который был очищен с помощью способа согласно настоящему изобретению и который способен усиливать дифференцировку и пролиферацию гемопоэтических клеток-предшественников и активацию некоторых зрелых клеток гемопоэтической системы. Таким образом,Г-КСФ, полученный с помощью способа согласно настоящему изобретению, подходит для лечения состояний, при которых полезно введение Г-КСФ. Должно быть очевидно, что термин "биологически активный Г-КСФ человека" также включает мутанты и модификации Г-КСФ, последовательности аминокислот которых изменены по сравнению с последовательностью дикого типа, но которые обладают биологическими активностями, аналогичными Г-КСФ дикого типа. То же самое относится к конъюгатам Г-4 022821 КСФ. Обычно Г-КСФ представляет собой рекомбинантный Г-КСФ человека. Предпочтительно Г-КСФ,который нужно очистить, представляет собой метионил-Г-КСФ (Met-Г-КСФ) человека, полученный в клетках Е. coli. Термин "менее гидрофобная изоформа" в данной заявке относится к препарату/фракции Г-КСФ, который обладает такой же массой, изоэлектрической точкой и идентичным пептидным картированием,включая дисульфидные мостики, что определяют, например, по гелям после деградации по Эдману и изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) или с помощью масс-спектрометрии. Более того, с помощью масс-спектрометрии в нем не детектированы ни липидные аддукты, ни изоаспартат. Менее гидрофобную изоформу Г-КСФ можно охарактеризовать по отличию ее спектра кругового дихроизма от такового для исходного Г-КСФ в ближнем УФ-диапазоне (OD 260-320 нм), что свидетельствует о более высоком содержании -спиральных структур (66% в изоформе и 52% в исходном Г-КСФ). Вдобавок, различие в гидрофобности между обсуждаемым Г-КСФ и его изоформой можно продемонстрировать с помощью аналитической ОФ-ВЭЖХ при 60 С. Данные различия объясняют, почему менее гидрофобная изоформа элюируется в более ранней фракции по сравнению с исходным Г-КСФ при ОФ-ВЭЖХ хроматографии,которую осуществляют при 60 С. Таким образом, изоформу Г-КСФ согласно настоящему изобретению можно определить по ее отличным свойствам, которые включают меньшую гидрофобность и элюирование в отличных фракциях при ОФ-ВЭЖХ, которую осуществляют при 60 С, при этом указанная изоформа Г-КСФ элюируется перед основным пиком обсуждаемого Г-КСФ; см. фиг. 3. Методики, которые применяли для характеристики образцов, включают ПААГ/ДСН, ИЭФ, УФ, КД, флуоресцентную спектроскопию и ЯМР; см. также выше и примеры. Суммируя всю информацию, лучшим объяснением появления менее гидрофобной изоформы Г-КСФ является вариант укладки, обладающий слегка измененной трехмерной структурой, которая расценивается как неправильно свернутая форма. Ее удаление должно приводить к получению более эффективных и безопасных лекарственных продуктов. Уже упоминалось, что препарат Г-КСФ согласно настоящему изобретению, по существу, свободен от менее гидрофобной изоформы Г-КСФ. Термин "по существу свободный" от менее гидрофобной изоформы Г-КСФ или "с минимизированным количеством" менее гидрофобной изоформы Г-КСФ означает,что препарат Г-КСФ согласно настоящему изобретению, как правило, содержит менее чем 5% менее гидрофобной изоформы Г-КСФ, предпочтительно менее 1%, предпочтительно менее 0,2% менее гидрофобных изоформ Г-КСФ. Согласно настоящему изобретению термин "тельца включения" относится к внутриклеточным нерастворимым плотным агрегатам неправильно уложенных или частично правильно уложенных рекомбинантно экспрессированных белков, которые можно выделить в виде фракции частиц путем центрифугирования клеточных лизатов. Термин "солюбилизация" в данной заявке означает, что Г-КСФ, который образует тельца включения, растворяется после обработки денатурирующим агентом, например разобщающим агентом и восстановителем, с помощью которого разрушаются меж- и внутримолекулярные взаимодействия, которые отсутствуют в интактном белке, в результате чего получают дисперсию мономерного рекомбинантного Г-КСФ. Согласно настоящему изобретению термин "денатурирующий агент" относится к агенту, который способен нарушать укладку белка, таким образом приводя к сокращению или потере нативной конформации белка. Для применения в буферах для солюбилизации подходящие разобщающие агенты или денатурирующие агенты представляют собой мочевину, гуанидин-HCl, аргинин, тиоционат натрия, агенты с предельными рН (разбавленные кислоты или основания), детергенты (например ДСН, саркозил), соли(хлорид, нитраты, тиоционаты, трихлорацетат), агенты, полученные путем химической дериватизации(сульфитолиза, реакций оснований с цитраконовым ангидридом), растворители (2-амино-2-метил-1 пропанол или спирты, ДМСО, ДМС) или сильные анионообменные смолы, такие как Q-сефароза. Подходящие концентрации мочевины включают 1-9 мол./л, предпочтительно 5-9 мол./л. Подходящие концентрации гуанидин-HCl включают 1-8 мол./л, предпочтительно 4-8 мол./л. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения денатурирующий агент представляет собой гуанидин-HCl,предпочтительно концентрация гуанидин-HCl равна 6,0 мол./л; см. также примеры. Обычно, солюбилизирующий буфер в способе согласно настоящему изобретению содержит восстановитель, вдобавок к денатурирующему агенту. Подходящие восстановители представляют собой восстановленный глутатион (GSH), дитиотреитол (DTT), дитиоэритритол (DTE), цистеин, 13 меркаптоэтанол. Предпочтительно восстановитель в способе согласно настоящему изобретению представляет собой DTT. В одном варианте реализации настоящего изобретения концентрация восстановителя в солюбилизирующем буфере составляет от 1 до 100 ммол./л, предпочтительно от 1 до 10 ммол./л, и ее можно изменять в соответствии с примерами. Согласно настоящему изобретению подходящий буферный компонент солюбилизирующего буфера может представлять собой трис(гидроксиметил)аминометан или фосфат, который должен обладать основным значением рН, чтобы позволить восстановление дисульфидных мостиков. Чтобы обеспечить эффективную и полную солюбилизацию, требуется подходящее соотношение телец включения и солюбилизирующего буфера. Согласно настоящему изобретению используют от 10-5 022821 до 100 мл солюбилизирующего буфера на грамм телец включения, предпочтительно от 1 до 80 мл, наиболее предпочтительно от 1 до 40 мл, более предпочтительно 20 мл/г и обычно 30 мл на грамм телец включения. Более того, в одном варианте реализации настоящего изобретения в солюбилизирующий буфер и/или буфер для рефолдинга добавляют хелатирующий агент, например этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) или диметиламиноэтанол (ДМАЭ), чтобы связать ионы металлов из водного раствора. Как только они связались с ЭДТА, данные ионы металлов больше не смогут помешать действию детергентов и больше не смогут окислять восстановитель. Вдобавок, хелатирующие агенты ингибируются металлозависимыми протеазами. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения солюбилизирующий буфер и/или буфер для рефолдинга содержит динатрий-ЭДТА предпочтительно в концентрации между 0,5 и 10 мМ. Согласно настоящему изобретению, чтобы обеспечить эффективную и полную солюбилизацию,время солюбилизации в способе согласно настоящему изобретению составляет от 1 до 10 ч, предпочтительно от 4 до 8 ч, наиболее предпочтительно 61 ч или от 5,5 до 6,5 ч. В дополнительном предпочтительном варианте реализации процесс солюбилизации осуществляют при температурах окружающей среды выше 10 С, предпочтительно между 15 и 30 С, наиболее предпочтительно при 202 С, т.е. при такой же или аналогичной температуре, что и процесс рефолдинга; см. выше и примеры. Согласно настоящему изобретению обломки клеток-хозяев следует убрать из солюбилизированного Г-КСФ, чтобы обеспечить отсутствие мешающих веществ, препятствующих процессу рефолдинга. Следовательно, солюбилизат предпочтительно подвергают фильтрации перед разбавлением в буфере для рефолдинга. Например, солюбилизированный белок Г-КСФ отделяют от обломков клеток-хозяев, агрегированного несвернутого белка, димеров, мультимеров и/или несвернутого белка Г-КСФ путем фильтрации через 1,5 мкм фильтр. Образование внутримолекулярных дисульфидных связей в белке Г-КСФ вызывают путем добавления буфера для рефолдинга, содержащего окислительно-восстановительную пару. "Окислительновосстановительная пара" относится к смеси восстановленных и окисленных тиольных реагентов и включает, например, восстановленный и окисленный глутатион (GSH/GSSG), цистеин/цистин, цистеамин/цистамин, DTT/GSSG и DTE/GSSG, a также смеси любых из указанных компонентов окислительновосстановительной пары; см., например, Clark, Cur. Op. Biotech. 12 (2001), 202-207. В одном варианте реализации настоящего изобретения окислительно-восстановительная пара представляет собойGSH/GSSG, при этом концентрация каждого из восстановленного и окисленного глутатиона сотавляет от 0,1 до 20 ммол./л, предпочтительно от 0,5 до 10 ммол./л, наиболее предпочтительно от 0,2 до 10 ммол./л; см. также примеры. Рефолдинг для получения биологически активного Г-КСФ можно осуществить в буферах с нейтральным или основным рН. Предпочтительно процесс рефолдинга осуществляют при значении рН,приблизительно равном 8. Буферы для рефолдинга могут включать другие вспомогательные вещества для улучшения рефолдинга, например L-аргинин или гидрохлорид аргинина (0,4-1 мол./л); ПЭГ; низкие концентрации денатурирующих агентов, таких как мочевина (1-2 мол./л) и гуанидин-НС 1 (0,5-1,5 мол./л); и детергенты (например, 3-[(3-холамидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфонат (ХАПС),ДСН, цетилтриметиламмония бромид (ЦТАБ), лаурилмальтозид, полисорбат 80/Tween 80 и Triton Х 100). В одном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения буфер для рефолдинга дополнительно включает аргинин-НС 1. Среди известных стратегий рефолдинга разведение все еще представляет собой наиболее простую методику. Для применения в промышленном масштабе для рефолдинга рекомбинантных белков, экспрессированных в тельцах включения, обычно используют разведение. Как правило, разведение осуществляют одностадийно путем смешивания/разбавления раствора, содержащего солюбилизированный белок, разбавителем, содержащим солюбилизирующий агент в количестве, необходимом для достижения оптимального уровня разведения. Если концентрация солюбилизирующего агента ниже некоторого порогового уровня, белок начинает восстанавливать свою биологически активную трехмерную конформацию. В зависимости от конкретного белка и выбранных условий сворачивания рефолдинг начинается в течение времени от миллисекунд до секунд. В этой начальной быстрой фазе белок сильно подвержен агрегированию. Чтобы минимизировать агрегирование, должна поддерживаться довольно низкая концентрация белка, предпочтительно ниже 2 мг/мл. После этой начальной фазы рефолдинга белок образует более компактную структуру и, наконец, принимает нативную конформацию белка, которая менее подвержена агрегированию. Полного рефолдинга Г-КСФ, включая образование дисульфидных мостиков,можно добиться за несколько часов. Чтобы обеспечить эффективную и полную ренатурацию, требуется подходящее соотношение солюбилизата и буфера для рефолдинга. Согласно настоящему изобретению солюбилизат разбавляют буфером для рефолдинга в соотношении 1:100, предпочтительно 1:40, наиболее предпочтительно 1:20; см. также примеры. Термин "разбавление буфером для рефолдинга", используемый в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, в принципе, включает разбавление солюбилизата в заранее определенном-6 022821 количестве буфера для рефолдинга и добавление буфера для рефолдинга в солюбилизированный образец. Предпочтительно солюбилизат добавляют к буферу для рефолдинга при перемешивании. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения процесс разбавления продолжается приблизительно один час. Выше упоминалось, что в способе согласно настоящему изобретению процесс рефолдинга в подходящей окислительно-восстановительной системе можно осуществить при температурах окружающей среды, т.е. обычно выше 10 С, в течение менее чем половины дня и предпочтительно при комнатной температуре, т.е. при 202 С в течение от 3 до 4 ч. Температура окружающей среды может изменяться между 10 и 30 С и предпочтительно находится между 15 и 25 С, более предпочтительно между 17 и 23 С и особенно предпочтительно между 19 и 21 С. Время рефолдинга может быть ориентировано на условия, проиллюстрированные в примерах. Таким образом, тогда как процесс рефолдинга при приблизительно 202 С длится приблизительно от 3 до 4 ч, можно использовать либо такой же временной интервал, либо на один или два часа больше или меньше, в зависимости от того, осуществляют ли процесс рефолдинга при температуре ниже 18 С или выше 22 С. В любом случае продолжительность процесса рефолдинга меньше чем 12 ч. Применяя способ согласно настоящему изобретению 70% всего содержащегося в тельцах включения белка Г-КСФ можно осуществить рефолдинг в биологически активную форму Г-КСФ. Процесс рефолдинга можно остановить путем уменьшения рН буфера для рефолдинга в сторону кислого рН. В одном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения для уменьшения рН до 3,0-6,5, предпочтительно до 3,5-5,5, наиболее предпочтительно до 4,0 используют уксусную кислоту. Как только был осуществлен рефолдинг белка Г-КСФ, в образец белка можно добавить тензид или поверхностно-активное вещество. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения к образцу свернутого белка Г-КСФ добавляют неионный детергент, предпочтительно полисорбат 20 или 80, наиболее предпочтительно полисорбат 80 (Tween 80) до конечной концентрации, равной от 0,001 до 1%, предпочтительно от 0,05 до 0,1%, наиболее предпочтительно до конечной концентрации от 0,05 до 0,06% или равной 0,01% в зависимости от дальнейшего применения Г-КСФ. Во многих случаях будет полезно после осуществления рефолдинга перед дальнейшей обработкой подвергнуть смесь фильтрации, чтобы удалить высокомолекулярные частицы, которые часто представляют собой белковые агрегаты, образовавшиеся в процессе сворачивания. В одном предпочтительном варианте реализации способа согласно настоящему изобретению раствор свернутого белка фильтруют через каскад фильтров, предпочтительно через каскад фильтров с размерами пор 10 и 1,2 мкм. После фильтрации раствор можно хранить на этапе выдерживания, при этом температуры окружающей среды около 222 С являются предпочтительными; см. также фиг. 1 и табл. 1 в прилагаемом примере 6 настоящего изобретения. Для достижения более высокой концентрации продукта в препарате Г-КСФ, полученном после рефолдинга, белок Г-КСФ можно диализировать или подвергнуть диафильтрации для удаления окислительно-восстановительной пары и/или других нежелательных буферных компонентов. Соответственно в данной заявке предусмотрен процесс фильтрации для удаления обломков клеток, нерастворимых контаминирующих белков и преципитата нуклеиновых кислот. Данный этап обеспечивает удобный способ экономичного удаления обломков клеток, контаминирующих белков и преципитата. При выборе фильтра или схемы фильтра необходимо обеспечить устойчивую эффективность в случае, если происходят изменения или отклонения в предшествующих процессах. Поддержание баланса между хорошей эффективностью очистки от примесей и выходом на этапе требует исследования большого разнообразия типов фильтров и различных фильтрационных сред. В подходящих типах фильтров для достижения эффективного удаления могут использоваться целлюлозные фильтры, восстановленные целлюлозные волокна,целлюлозные волокна, объединенные с неорганическими фильтрующими добавками (например, диатомитовой землей, перлитом, коллоидной двуокисью кремния), целлюлозные волокна, объединенные с неорганическими фильтрующими добавками и органическими смолами, или любая комбинация перечисленных фильтров, и полимерные фильтры (примеры включают, но не ограничены перечисленными, нейлон, полипропилен, полиэфирсульфон). В одном варианте реализации этап фильтрации, например этап ультра- и диафильтрации, осуществляют с применением 5-10 кДа ультрафильтрационной мембраны и приблизительно 8 х замену буфера, при этом буфер заменяют на ацетат Na и неионный детергент, например полисорбат 80, при рН 4. Диафильтрация представляет собой процесс фракционирования, при котором меньшие молекулы вымываются через мембрану, а большие интересующие молекулы остаются в ретентате. Это удобная и эффективная методика для удаления соли или солевого обмена, удаления детергентов, отделения свободных молекул от связанных, удаления низкомолекулярных веществ или быстрого изменения ионной среды или рН. В данном процессе обычно используют микрофильтрационную мембрану, чтобы удалить интересующий продукт из взвеси, при этом сохранив концентрацию взвеси на постоянном уровне. Выше описано, что необходимый этап хроматографической очистки в способе согласно настояще-7 022821 му изобретению включает хроматографию с обращенными фазами (ОФ), в особенности этап высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенными фазами (ОФ-ВЭЖХ) в промышленном масштабе. С помощью аналитической ОФ-ВЭЖХ при 60 С можно визуализировать примесь менее гидрофобной изоформы Г-КСФ в образце Г-КСФ, полученном после процесса рефолдинга, которую описывают содержанием 66% -спиралей и профилем элюирования, показанным на фиг. 3. В известном уровне техники упоминалось, что для очистки Г-КСФ осуществляли различные этапы ионообменной или гидрофобной хроматографии, тогда как ОФ-ВЭЖХ не предусматривалась как этап очистки в промышленном масштабе. Средства и способы осуществления хроматографии с обращенными фазами (ОФ) хорошо известны специалисту в данной области. Предпочтительно этап хроматографии с обращенными фазами (ОФ) представляет собой высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенными фазами (ОФВЭЖХ). Обычно, ОФ-ВЭЖХ осуществляют с помощью смол, которые содержат метальные, бутильные,фенильные, пропильные и/или октальные группы в качестве функциональных групп, и используют системы подвижной фазы, содержащие органический растворитель. В предпочтительном варианте реализации способа согласно настоящему изобретению ОФ-ВЭЖХ осуществляют с доступным для приобретения материалом С 4 для хроматографии с обращенными фазами. Типичные материалы для хроматографии с обращенными фазами представляют собой: Vydac 214 ТРВ 1015, С 4, доступный от Grace Davison;Phenomenex. В особенно предпочтительном варианте реализации способа согласно настоящему изобретению для ОФ-ВЭЖХ используют хроматографическую смолу Jupiter C4, а для ОФ-хроматографии используют хроматографическую смолу Source 15 RPC или Source 30 RPC (поставщик GE Healthcare). Jupiter C4 состоит из частиц силикагеля, на поверхностях которых находятся С 4-алкильные цепи. Согласно настоящему изобретению наиболее предпочтительно использовать хроматографическую смолу Jupiter C4; см. также примеры. Отделение Г-КСФ от белковых примесей основано на различиях в силе гидрофобных взаимодействий. Элюирование осуществляют менее полярным растворителем, чем вода, например градиентом ацетонитрила, этанола или метанола в воде, предпочтительно применяют ацетонитрил в присутствии разбавленной трифторуксусной кислоты. Таким образом, менее гидрофобную изоформу Г-КСФ можно отделить от Г-КСФ путем элюирования различными фракциями подвижной фазы. Обычно менее гидрофобная изоформа общего препарата Г-КСФ элюируется с более ранней фракцией, чем стандарт Г-КСФ. Г-КСФ и менее гидрофобную изоформу Г-КСФ можно элюировать линейным градиентом органического растворителя, например, от 0 до 90% ацетонитрила в воде, т.е. в воде для инъекций (WFT), содержащим приблизительно 0,1% ТФУ. Предпочтительно ОФ-ВЭЖХ осуществляют, как описано в примерах. Элюат предпочтительно собирают в пробирки, предварительно наполненные буфером, содержащим полисорбат 80; см. также выше и примеры. Выше пояснялось и в примерах проиллюстрировано, что в способе согласно настоящему изобретению этапу ОФ-хроматографии обычно предшествует ионообменная хроматография. Таким образом, в предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения Г-КСФ очищают, применяя один этап ионообменной хроматографии, чтобы удалить все примеси, такие как белки клетки-хозяина, в частности эндотоксины, и ДНК клетки-хозяина. В принципе, можно применять катионообменную хроматографию или анионообменную хроматографию. В особенно предпочтительном варианте реализации способа согласно настоящему изобретению катионообменную хроматографию (КОХ) осуществляют после ультра- и диафильтрации Г-КСФ, который предварительно подвергли рефолдингу. В примерах показано, что осуществляли этап КОХхроматографию с выбранным материалом (КМ-сефарозой FF), которая позволяет обеспечить особенно высокие скорости потока и высокую степень извлечения продукта. Благодаря тому, что он положительно заряжен в кислой среде, Г-КСФ сильно связывается и элюируется линейным градиентом хлорида натрия при кислотном рН в малом объеме при высокой концентрации в желательном буфере. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением этап КОХ осуществляют перед ОФ-хроматографией, в частности перед ОФ-ВЭЖХ, для замены буфера, концентрирования Г-КСФ и удаления агрегатов Г-КСФ. Средства и способы осуществления катионообменной хроматографии хорошо известны специалисту в данной области; см. также известный уровень техники, цитированный выше в разделе Уровень техники, или у поставщика GE Healthcare. Например, можно использовать обычные доступные для приобретения матрицы. В данной заявке Г-КСФ связывается с катионообменной матрицей в пределах определенного диапазона рН вследствие его положительного суммарного заряда, тогда как большинство контаминирующих веществ, таких как нуклеиновые кислоты, липополисахариды и белки из клеток-хозяев, а также ионные изомеры Г-КСФ и измененные формы Г-КСФ, обладающие отличными значениями рН, не способны связываться и появляются в проточной фракции или удаляются при промывке. Подходящие катионообменные матрицы включают, но не ограничены перечисленными, карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлозу),AG 50 W, Bio-Rex 70, карбоксиметил-сефадекс (КМ-сефадекс), сульфопропил-сефадекс (СП-сефадекс),-8 022821 карбоксиметил-сефарозу (КМ-сефарозу) CL-6B, КМ-сефарозу HP, Hyper D-S ceramic (Biosepra) и сульфонат-сефарозу (С-сефарозу), СП-сефарозу FF, СП-сефарозу HP, СП-сефарозу 15 XL, КМ-сефарозу FF,TSKgel SP 5PW, TSKgel SP-5PW-HR, Toyopearl SP-650M, Toyopearl SP-650S, Toyopearl SP-650C,Toyopearl CM-650M, Toyopearl CM-650S и т.д. Сульфопропиловые матрицы, в частности продукты СПсефароза XL и СП-сефароза FF (Fast Flow) и С-сефароза FF, доступны от Amersham Biosciences, Фрайбург, Германия (сейчас GE Healthcare). В одном варианте реализации катионообменный материал представляет собой сульфопропиловый катионообменный материал. В предпочтительном варианте реализации способа согласно настоящему изобретению ионообменная хроматография представляет собой катионообменную хроматографию (КОХ), и ее осуществляют с КМ-сефарозой FF; см. также примеры 6 и 7. Подходящие буферы для катионообменной хроматографии включают буферы на основе малеата,малоната, цитрата, лактата, уксусной кислоты, ацетата, фосфата, REPES, Bistris и Bicin. В предпочтительном варианте реализации в качестве буферного компонента используют уксусную кислоту. Предпочтительно концентрация буфера находится в диапазоне между 10 и 100 мМ, предпочтительно между 20 и 50 мМ. Согласно настоящему изобретению в состав буфера также включают тензид, предпочтительно полисорбат 20 или 80, наиболее предпочтительно используют полисорбат 80; см. также выше. Очистку препарата Г-КСФ осуществляют с помощью буфера, значение рН которого не выше чем 6,0,предпочтительно не выше чем 5,5. Последующую промывку колонки, с которой связан Г-КСФ, как правило, осуществляют пятью объемами колонки (CV) равновесного буфера, состоящего из уксусной кислоты, полисорбата 80 при рН 5,5. Г-КСФ можно элюировать с колонки путем замены буфера в случае катионообменной хроматографии путем повышения значения рН или повышения ионной силы. Предпочтительно элюирование осуществляют путем повышения ионной силы, предпочтительно путем применения линейного градиента хлорида натрия. Подходящие условия катионообменной хроматографии можно найти в соответствующей литературе, такой как, например, руководство "Ion-Exchange Chromatography - Principles and Methods" отAmersham Biosciences, Фрайбург, Германия (сейчас GE Healthcare), 2002 г., и в примере 7. В особом предпочтительном варианте реализации способа согласно настоящему изобретению процесс очистки включает: (i) стадию ультра/диафильтрации; (ii) стадию катионообменной хроматографии(КОХ): (iii) стадию микрофильтрации; (iv) стадию хроматографии с обращенными фазами (ОФ); и (v) стадию ультра/диафильтрации. Данный вариант реализации также показан на фиг. 1 и проиллюстрирован в примерах. В первом (i) этапе ультра/диафильтрации буфер заменяют на ацетат Na, полисорбат 80 при кислом рН. Наконец, полученный раствор фильтруют через каскад фильтров 10 и 1,2 мкм. После фильтрации раствор можно хранить при 222 С (этап выдерживания). Этапы хроматографической очистки разработаны для удаления культуральных компонентов, примесей бактериальных клеток и связанных с продуктом и процессом примесей и для того, чтобы убедиться, что содержания Г-КСФ достаточно для дальнейших процессов. Обогащение особо чистого Г-КСФ в соответствии с настоящим изобретением осуществляют на последующих этапах фильтрации и хроматографии; см. также фиг. 1. В дополнительном варианте реализации способа согласно настоящему изобретению препарат Г-КСФ, полученный в результате этапа (ii) катионообменной хроматографии (КОХ), подвергают этапу микрофильтрации (iii), на котором из гомогената клеток удаляют растворимые примеси. Для получения чистого препарата Г-КСФ, в котором отсутствует менее гидрофобная изоформа, дополнительно осуществляют этап (iv) ОФ-ВЭЖХ. Впоследствии осуществляют заключительный этап ультра/диафильтрации для окончательной обработки и помещения Г-КСФ в желательный буфер. Это удовлетворяет потребность в получении малого конечного объема препарата,т.е. концентрация Г-КСФ после ОФ-ВЭЖХ должна быть сильно увеличена, и в помещении Г-КСФ после ОФ-ВЭЖХ в подходящий буфер для дополнительного стабилизирования очищенного Г-КСФ. После осуществления различных этапов очистки согласно настоящему изобретению чистота Г-КСФ достаточно высока и достигает чистоты, превышающей по меньшей мере 98% или даже 99% общего содержания белка, что определили с помощью ОФ-ВЭЖХ и гель-электрофореза в ПААГ/ДСН соответственно; см. также фиг. 2. Более того, содержание димеров/мультимеров в очищенном препарате Г-КСФ согласно настоящему изобретению, как правило, составляет 2%, предпочтительно 1%, тогда как содержание остальных примесей ДНК клетки-хозяина 100 ч./млн, или содержание белка клетки-хозяина 200 ч./млн соответственно. Более того, в одном предпочтительном варианте реализации загрязнение эндотоксинами составляет 5 ЕЭ/мг, общее содержание биомассы составляет 1 КОЕ/10 мл. Более того,конечное содержание остаточной трифторуксусной кислоты (ТФУ) и ацетонитрила составляет 30 ч./млн и 410 ч./млн соответственно. Благодаря высокой чистоте и гомогенности препарата Г-КСФ, полученного в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, препарат Г-КСФ согласно настоящему изобретению особенно подходит для дальнейшего получения производных. Следовательно, в дополнительном варианте реализации способ согласно настоящему изобретению дополнительно включает химическую модификацию ГКСФ, полученного в соответствии с указанным способом, например, путем ковалентного присоединения-9 022821 к Г-КСФ водорастворимого полимера, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Конъюгирование полиэтиленгликоля (ПЭГ) с белками представляет собой важную методику получения молекул с пролонгированным временем полужизни в организме человека. Присоединение молекулы ПЭГ с молекулярной массой от 10 до 30 кДа к Г-КСФ может обеспечить (1) предотвращение преципитации белка благодаря тому, что повышается растворимость белков, и (2) снижение скорости агрегирования по сравнению с Г-КСФ,вследствие того, что растворимость ПЭГ-Г-КСФ опосредована активной сольватацией молекул воды вокруг группы ПЭГ. Термин "водорастворимый" относится к молекулам, которые обладают детектируемой степенью растворимости в воде. Типичные водорастворимые полимеры включают пептиды, сахариды, поли(эфиры), поли(амины), поли(карбоновые кислоты) и тому подобные полимеры. Полимерный остов водорастворимого полимера может представлять собой поли(этиленгликоль) (т.е. ПЭГ). Термин "водорастворимый полимер", ковалентно присоединенный к Г-КСФ, относится к конъюгату полипептида Г-КСФ и по меньшей мере одного полимера, при этом конъюгаты образуются путем образования ковалентной связи между функциональной группой полимера и функциональной группой полипептида. Конъюгаты могут включать одну или более полимерных молекул. Несколько подходящих полимерных молекул или полимеров включают поли(алкиленгликоли), такие как ПЭГ и полипропиленгликоль (ППГ), гидроксиалкиловые крахмалы, такие как гидроксиэтилкрахмал (ГЭК). В предпочтительном варианте реализации указанный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль(ПЭГ). Такой пегилированный Г-КСФ включает монопегилированный Г-КСФ и Г-КСФ, модифицированный двумя или более молекулами ПЭГ. В дополнительном предпочтительном варианте реализации указанный ковалентно присоединенный полимер обладает молекулярной массой приблизительно от 10 до 30 кДа, предпочтительно 20 кДа. Способы химической модификации Г-КСФ, в частности пегилирования, хорошо известны специалисту в данной области и описаны, например, в WO2008/124406. Настоящее изобретение также относится к препарату Г-КСФ, полученному с помощью способа согласно настоящему изобретению, описанного выше. Таким образом, препарат Г-КСФ согласно настоящему изобретению особенно подходит для применение в терапии. В данном контексте настоящее изобретение также относится к процессу производства фармацевтической композиции, указанный процесс включает подготовку и выделение Г-КСФ, как описано выше, и смешивание полученного и выделенного таким образом Г-КСФ с фармацевтически приемлемым носителем. Предпочтительный вариант реализации представляет собой способ получения фармацевтической композиции из рекомбинантного Г-КСФ и фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, таких как буферы, соли и стабилизаторы, при этом указанный способ включает способ получения Г-КСФ согласно настоящему изобретению, описанный выше. Г-КСФ, полученный согласно настоящему изобретению, можно либо (i) непосредственно использовать, либо (ii) дополнительно обработать, например пегилировать, как описано выше или в WO 2008/124406, а затем хранить в виде лиофилизата или в жидкой форме. Г-КСФ в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции можно вводить обычным способом с помощью внутривенного, интраартериального, интраперитонеального, внутристернального,трансдермального, назального, ингаляционного, топического, ректального, перорального, внутриглазного или подкожного пути. Способ введения особо не ограничен, но предпочтительно введение не пероральным путем, и более предпочтительно подкожное или внутривенное введение. Подходящие адъюванты для лекарственных форм рекомбинантно экспрессированного Г-КСФ представляют собой, например, стабилизаторы, такие как сахар и сахарные спирты, аминокислоты и тензиды, такие как, например, полисорбат 20/80, а также подходящие буферные вещества. Описание дополнительных вариантов реализации лекарственных форм Г-КСФ согласно настоящему изобретению можно найти, например, в WO 2009/027437 и WO 2008/124406, содержание которых включено в данную заявку посредством ссылки. Примеры лекарственных форм также можно найти в "ROTE LISTE 2004", см. торговые продукты Нейпоген и Граноцит. В предпочтительном варианте реализации в соответствии со способом согласно настоящему изобретению очищенный биологически активный Г-КСФ входит в состав лекарственной формы в 10 мМ уксусной кислоте при рН, равном 4,0, 0,0025% полисорбате 80 и 50 г/л сорбита. Активность Г-КСФ, полученного в соответствии со способом согласно настоящему изобретению,можно определить с помощью биологического анализа и сравнить с активностью стандартного доступного для приобретения Г-КСФ. Для этого культивируют линию клеток мыши NFS-60, которая чувствительна к Г-КСФ, в среде RPMI 1640 (Bachern, Хайдельберг, Германия), которая содержит 1,5 г/л карбоната натрия, 4,5 г/л глюкозы, 10 мМ Hepes и 1,0 мМ пируват натрия, и дополнена 2 мМ глутамином, 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанолом и 60 нг/мл Г-КСФ. Для теста на активность клетки дважды промывают средой без Г-КСФ, помещают в 96-луночные планшеты при концентрации 2104 клеток на лунку и инкубируют в течение трех дней при 37 С и 4,5% СО 2 с различными концентрациями очищенного Г-КСФ и стандарта соответственно. Впоследствии клетки окрашивают реагентом ХТТ и измеряют поглощение на 450 нм в планшет-ридере.- 10022821 Согласно настоящему изобретению можно показать, что клетки, обработанные Г-КСФ, очищенным согласно настоящему изобретению, растут точно так же или лучше, чем клетки, которые были обработаны стандартом. В частности, полученные результаты показывают, что очищенный Г-КСФ, полученный в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, обладает биологической активностью порядка 80-125% по сравнению с международным референсным стандартом ВОЗ в тесте на пролиферациюNFS-60. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению отличаются тем, что они стерильны и апирогенны. В данной заявке "фармацевтическая композиция" включает лекарственные формы для применения у человека и в ветеринарии. Способы получения фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению находятся в рамках компетенции в данной области и, например, описаны вRemington's Pharmaceutical Science, 17-e изд., Mack Publishing Company, Истон, Пенсильвания. (1985), и в версии Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000), доработанной Университетом наук Филадельфии, ISBN 0-683-306472, описания обоих документов полностью включены в данную заявку посредством ссылки. Эти и другие варианты реализации раскрыты и входят в объем описания и примеров настоящего изобретения. Дополнительную литературу, касающуюся любого из материалов, способов, применений и соединений, которые необходимо использовать в соответствии с настоящим изобретением, можно найти в публичных библиотеках и базах данных, например, с помощью электронных устройств. Например,можно использовать общедоступную базу данных "Medline", которая размещена на ресурсе National Center for Biotechnology Information, и/или National Library of Medicine на ресурсе National Institutes of Health. Дополнительные базы данных и веб-адреса, такие как в European Bioinformatics Institute (EBI), который является частью European Molecular Biology Laboratory (EMBL), известны специалисту в данной области,и их также можно найти с помощью поисковых систем интернета. Обзор патентной информации по биотехнологиям и обзор соответствующих источников патентной информации, полезной для ретроспективного поиска и для сигнальной патентной информации, приведен в Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364. Приведенное выше описание в общем смысле описывает настоящее изобретение. Если не указано иначе, термин, используемый в данной заявке, имеет определение, приведенное в Оксфордском словаре биохимии и молекулярной биологии, Oxford University Press, 1997, переработанном 2000 г. и перепечатанном в 2003 г., ISBN 0 19 850673 2. В тексте настоящего описания цитируется несколько документов. Содержания всех цитируемых документов (включая справочную литературу, выпущенные патенты,опубликованные заявки на патент, цитируемые в настоящем описании, и спецификации, инструкции производителя и т.д.) настоящим явно включены посредством ссылки; тем не менее, отсутствует допущение, что любой цитированный документ в действительности представляет собой известный уровень техники для настоящего изобретения. Более полное понимание можно получить, обратившись к следующим конкретным примерам, которые приведены в данной заявке исключительно с целью иллюстрирования и не предполагаются ограничивающими объем настоящего изобретения. В частности, примеры относятся к предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения. Примеры Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют те же значения, которые обычно понимает средний специалист в данной области (например, в области молекулярной генетики, химии нуклеиновых кислот, методик гибридизации, белковой химии и биохимии). Для молекулярных, генетических и биохимических способов (см., как правило, Sambrook и др.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, и Ausubel и др., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4-е изд., John WileySons, Inc., и полная версия, озаглавленная Current Protocols in Molecular Biology, которые включены в данную заявку посредством ссылки), а также химических способов применяются стандартные методики. Пример 1. Исходный материал. Г-КСФ экспрессировали в 03-221 С-pHIP, векторе экспрессии, полученном из pBR322. Хозяйский штамм BNN93 Е. coli трансформировали данной плазмидой для ее продуцирования. BNN93 представляет собой производный штамм K12 Е. coli. Синтез Г-КСФ регулировали с помощью промотора фага лямбда,и индуцировали его сдвигом температуры с 30 до 42 С, что приводило к повышенной экспрессии первичного нерастворимого Г-КСФ в тельцах включения. Пример 2. Ферментация. Содержимое одной пробирки из Рабочего банка клеток (WCB), разбавленное 1000 мл комплексной среды без канамицина, использовали для получения "разбавленного Рабочего банка клеток" для предварительной ферментации. Разведение осуществляли в ламинарном боксе (LAF) класса А в чистом помещении класса В. Предварительную культуру асептически переносили непосредственно в 20 л ферментер для предварительной ферментации. Культуру вели при 301 С при встряхивании со скоростью 250 об/мин в течение от 6 до 12 ч до достижения оптической плотности OD600 от 0,3 до 0,6. Весь ферментативный бульон переносили в 1000 л ферментер, предварительно заполненный комплексной средой без- 11022821 канамицина. Культуру инкубировали при 301 С при встряхивании 200 об/мин, чтобы обеспечить парциальное давление кислорода pO230%, и рН 7,00,2 в течение от 9 до 11 ч до достижения OD600 от 5 до 7. Пример 3. Экспрессия Г-КСФ в тельцах включения. Экспрессию Г-КСФ индуцировали путем повышения температуры до 42 С и дополнительного инкубирования в течение от 6,75 до 7,25 ч при встряхивании при 200 об/мин, чтобы обеспечить рО 230%. Бактериальные клетки собирали при комнатной температуре с помощью дискового сепаратора со скоростью 150 л/ч с получением приблизительно 100 л концентрированной суспензии клеток. Пример 4. Выделение телец включения. Концентрированную суспензию клеток разбавляли до 200 л и гомогенизировали при 500 бар путем трех последовательных прогонов в 20 мМ фосфате Na, pH 8,0, при 300 л/ч через гомогенизатор высокого давления. Высвобожденные тельца включения впоследствии собирали путем центрифугирования в цилиндрическом сосуде при 17000 об/мин при скорости 50 л/ч. После ресуспендирования в 18 мМ фосфатеNa, 2 мас./об.% Triton Х-100, 5 мМ ЭДТА, рН 8,0, в течение 10 мин, тельца включения повторно центрифугировали при 17000 об/мин при скорости 50 л/ч. Полученный в результате этого осадок промывали 18 мМ фосфатом Na, pH 8,0, в течение 10 мин, а затем снова центрифугировали при 17000 об/мин при скорости 50 л/ч. Осадок ресуспендировали в воде для инъекций (WFI) и разделяли на три равные аликвоты. Тельца включения затем хранили при -15 С (этап выдерживания). Пример 5. Осуществление солюбилизации телец включения и рефолдинга Г-КСФ. После размораживания одной трети всего количества телец включения, полученных из 1000 л ферментации, тельца включения солюбилизировали путем инкубирования в 25 мМ Трис, 6 М гуанидин-HCl,1 мМ ЭДТА, рН 8,0, в течение от 5,5 до 6,5 ч при перемешивании, а затем фильтровали с помощью 1,5 мкм фильтра, например, путем глубинной фильтрации (осветляющей фильтрации). Затем осуществляли рефолдинг Г-КСФ путем разведения в 25 мМ трис, 0,8 М аргинин, 1 мМ глутатион (восстановленный), 1 мМ глутатион (окисленный), 10 мМ ЭДТА, рН 8,0, при 202 С. Затем добавляли полисорбат 80 до конечной концентрации 0,01 мас./об.%) и подводили рН до 4,0 с помощью уксусной кислоты. После рефолдинга осуществляли этапы ультрафильтрации и диафильтрации (MWCO 10 кДа, 8,4 м 2, приблизительно 8 х замена буфера), в которых буфер заменяли на 10 мМ ацетат Na, 0,01 мас./об.%) полисорбата 80, рН 4,0. Наконец, раствор фильтровали через каскад фильтров 10 и 1,2 мкм. После фильтрации раствор хранили при 222 С (этап выдерживания). Пример 6. Очистка Г-КСФ. Этапы хроматографической очистки были разработаны для удаления культуральных компонентов,примесей бактериальных клеток, связанных с продуктом и процессом примесей, и для обеспечения подходящего содержания Г-КСФ для получения фармацевтической формы или для последующего пегилирования; см. следующие примеры. Схема процесса согласно настоящему изобретению приведена на фиг. 1 и описана ниже в табл. 1. Более подробное описание осуществления катионообменной хроматографии и ОФ-ВЭЖХ предусмотрено в примере 7 в табл. 2 и 3. Таблица 1. Составы буферов, использованных на указанных этапах процесса Пример 7. Катионообменная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенными фазами. Полученный в результате диафильтрации концентрат загружали на колонку для катионообменной хроматографии (КМ-сефароза FF). После загрузки колонку промывали пятью объемами колонки (CV) равновесного буфера (20 мМ уксусная кислота, 0,004 мас./об.% полисорбата 80, рН 5,5), и связанный ГКСФ элюировали с КМ-колонки с помощью линейного градиента хлорида натрия в пакет, содержащий 20 мМ уксусную кислоту, рН 5,5, 0,004 мас./об.% полисорбата 80 и приблизительно 50-80 мг/мл сорбита. Профиль элюирования отслеживали путем детектирования в УФ (280, 260 и 215 нм), и градиент контролировали путем измерения электропроводности. Элюированный Г-КСФ идентифицировали на основании электропроводности и профиля поглощения. Концентрацию объединенной фракции Г-КСФ определяли по поглощению УФ на 280 нм и разбавляли Г-КСФ до 1,6 мг/мл. Таблица 2. Параметры для осуществления катионообменной хроматографии: КМ-сефароза-FF После фильтрации через фильтрующий элемент с размером пор 0,45 - 0,22 мкм раствор наносили на колонку для ОФ-ВЭЖХ, и фракции элюировали, используя градиент подкисленного (ТФУ) ацетонитрила в воде. Профиль элюирования отслеживали путем детектирования в УФ (280 нм). Пул ОФ-ВЭЖХ определяли по результатам измерения чистоты с помощью аналитической ОФ-ВЭЖХ (при 60 С) и указанный пул подвергали ультрафильтрации и диафильтрации путем тангенциальной поточной фильтрации с 10 мМ уксусной кислотой, 0,0025 мас./об.% полисорбата 80, 50 мг/мл сорбита, рН 4,0 (MWCO 5 кДа, 4,8 м 2,приблизительно 8 х замена буфера).- 13022821 Таблица 3. Параметры для осуществления хроматографии с обращенными фазами: Jupiter С 4 Пример 8. Заполнение, хранение и транспортировка. Полученный диафильтрат разбавляли тем же буфером до достижения концентрации белка 1,00,1 мг/мл, затем подвергали двойной фильтрации (два 0,22 мкм фильтра в каскаде) непосредственно в один пакет разового применения (первый фильтр соединяли с конечным контейнером в ламинарном боксе перед фильтрацией, последний фильтр заранее присоединяли к 50 л первичному пакету для упаковки,стерилизованному облучением и асептически отсоединенному путем запаивания после фильтрации и заполнения) для хранения при 53 С (этап выдерживания). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения биологически активного колониестимулирующего фактора гранулоцитов (ГКСФ) человека из телец включения, включающий следующие этапы:(a) осуществление солюбилизации Г-КСФ, содержащегося в тельцах включения, с помощью солюбилизирующего буфера, содержащего денатурирующий агент и восстановитель;(b) осуществление рефолдинга Г-КСФ путем разбавления солюбилизата в буфере для рефолдинга,содержащем восстановленный и окисленный глутатион, при температуре 10 С;(c) очистку подвергнутого рефолдингу Г-КСФ с помощью по меньшей мере одного этапа хроматографии, включающего хроматографию с обращенными фазами (ОФ), при этом происходит в существенной степени удаление менее гидрофобной изоформы Г-КСФ, которая содержит 66% структур -спиралей; и(d) получение препарата Г-КСФ, в котором содержание указанной менее гидрофобной изоформы ГКСФ составляет менее 1% от общего количества белка Г-КСФ. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что денатурирующий агент представляет собой гуанидин-HCl,при этом концентрация гуанидин-HCl предпочтительно составляет 4,0-8,0 мол./л. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что восстановитель представляет собой дитиотреитол(DTT). 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что концентрация восстановителя в солюбилизирующем буфере составляет 1-100 ммол./л, предпочтительно 1-10 ммол./л. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что используют 10-100 мл солюбилизирующего буфера на грамм телец включения. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что солюбилизирующий буфер и/или буфер для рефолдинга дополнительно содержит хелатирующий агент, предпочтительно динатрий-ЭДТА. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что время солюбилизации составляет 1-10,предпочтительно 4-8, наиболее предпочтительно составляет 60,5 ч. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что буфер для рефолдинга дополнительно содержит аргинин-HCl. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что концентрация восстановленного глутатиона составляет 0,2-10 ммол./л и концентрация окисленного глутатиона составляет также 0,2-10 ммол./л. 10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что солюбилизат разбавляют буфером для рефолдинга в соотношении 1:20. 11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что рефолдинг осуществляют при 202 С в течение по меньшей мере 3 ч. 12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что солюбилизат подвергают фильтрации перед разбавлением буфером для рефолдинга.- 14022821 13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что этап хроматографии с обращенными фазами (ОФ) представляет собой высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенными фазами(ОФ-ВЭЖХ). 14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что используют хроматографическую смолуJupiter C4, Source 15 RPC или Source 30 RPC. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что хроматографическую смолу Jupiter C4 используют для высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенными фазами (ОФ-ВЭЖХ). 16. Способ по любому из пп.1-15, отличающийся тем, что этапу ОФ-хроматографии предшествует ионообменная хроматография. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что ионообменная хроматография представляет собой катионообменную хроматографию (КОХ). 18. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что этап (с) включает: (i) стадию ультра/диафильтрации; (ii) стадию катионообменной хроматографии; (iii) стадию микрофильтрации; (iv) стадию ОФ-хроматографии и (v) стадию ультра/диафильтрации. 19. Способ по любому из пп.1-18, дополнительно включающий ковалентное присоединение к ГКСФ водорастворимого полимера. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ). 21. Способ по п.19 или 20, отличающийся тем, что молекулярная масса полимера составляет приблизительно 10-30 кДа, предпочтительно 20 кДа. 22. Применение этапа препаративной ОФ-хроматографии, описанного в любом из предшествующих пунктов, для получения биологически активного Г-КСФ человека. 23. Препарат биологически активного Г-КСФ человека, полученный с помощью способа по любому из пп.1-21 или вследствие применения по п.22, в котором содержание указанной менее гидрофобной изоформы Г-КСФ, которая содержит 66% структур -спиралей, составляет менее 1% от общего количества белка Г-КСФ. 24. Способ получения фармацевтической композиции из биологически активного рекомбинантного Г-КСФ человека и фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, таких как буферы, соли и стабилизаторы, при этом указанный способ включает способ получения биологически активного Г-КСФ человека по любому из пп.1-21 или применение по п.22. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что очищенный биологически активный Г-КСФ человека входит в состав лекарственной формы в 10 мМ уксусной кислоте при рН, равном 4,0, 0,0025% полисорбате 80 и 50 г/л сорбита. 26. Фармацевтическая композиция, содержащая препарат биологически активного Г-КСФ человека по п.23, или полученная с помощью способа по п.24 или 25, в которой содержание указанной менее гидрофобной изоформы Г-КСФ, которая содержит 66% структур -спиралей, составляет менее 1% от общего количества белка Г-КСФ.