Синтез пептидов с использованием энзиматической активации и конденсации

СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭНЗИМАТИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ И КОНДЕНСАЦИИ Квадфлиг Петер Ян Леонард Марио,Нйенс Тимо (NL), Кузан Клаудиа(DE), Шеперс Катарина Хюбертина Мария (NL) Саломатина И.С. (RU) Способ энзиматического синтеза пептидов, включающий энзиматическое получение эфира или тиоэфира из (i) защищенной с N-конца аминокислоты, С-концевого эфира защищенной с Nконца аминокислоты, защищенного с N-конца пептида или С-концевого эфира защищенного с Nконца пептида и (ii) спирта, представленного формулой HO-CX2-Z, или же тиола, представленного формулой HS-CX2-Z, где каждый X независимо означает атом галогена или атом водорода; a Z выбирается из группы sp3-гибридизованных атомов углерода, содержащих по меньшей мере два заместителя, содержащих гетероатом, присоединенный непосредственно к sp3-гибридизованному углероду, и sp2-гибридизованных атомов углерода, содержащих один или два заместителя,содержащих гетероатом, присоединенный непосредственно к sp2-гибридизованному углероду,причем получение эфира или тиоэфира осуществляется в реакционной среде, содержащей 2 мас.% или меньше воды, исходя из массы жидкости в реакционной среде; и энзиматическое присоединение полученного эфира или тиоэфира к необязательно защищенной с С-конца аминокислоте или необязательно защищенному с С-конца пептиду, при этом пептид синтезируется в реакционной среде, содержащей 2 мас.% или меньше воды, исходя из общей массы реакционной среды.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) Изобретение касается способа энзиматического синтеза пептидов. Пептиды, в частности олигопептиды, имеют много применений, например в качестве фармацевтических препаратов, пищевых или кормовых ингредиентов, агрохимических или косметических ингредиентов. В настоящем изобретении пептиды означают любую цепь из двух или больше аминокислот. В настоящем изобретении "олигопептиды" означают пептиды, состоящие из 2-200 аминокислот, в частности из 2-100 аминокислот, в частности из 2-50 аминокислот, предпочтительно любые линейные цепи из 2200 аминокислот, более предпочтительно из 2-100 или 2-50 аминокислот Термин "полипептиды" применяется для пептидов, состоящих из большего числа аминокислот, чем это указано для олигопептидов. Хемо-энзиматический синтез пептидов, который для настоящего изобретения определяется как синтез пептидов, в которых одна или несколько пептидных связей образуются при энзиматической реакции конденсации, имеет несколько преимуществ перед химическим синтезом пептидов. К примеру, стоимость в случае масштабного производства снижается вследствие того, что не требуется или требуется лишь ограниченная защита боковых цепей аминокислот. Этот способ также и более экологичен. К примеру, не требуются стехиометрические количества таких токсических химических реагентов, как дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDC) или 1(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид метиодид (EDCI). Кроме того, такой способ может выполняться с использованием меньшего количества органических растворителей. Более того, катализируемая ферментами конденсация не приводит к рацемизации (к примеру, см. N. Sewald and H.-D. Jakubke, in"Peptides: Chemistry and Biology", 1st reprint, Ed. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim 2002, p. 250), что дает более чистые продукты и/или облегчает выделение. В отношении хемо-энзиматического способа присоединения существуют две возможности образования пептидной связи. В так называемом термодинамическом (или равновесно-контролируемом) подходе карбоксильный компонент, а именно компонент, который должен присоединяться по С-концу, несет свободную функциональную карбоксильную группу, тогда как в кинетически контролируемом подходе применяется реактивный карбоксильный компонент типа первичного н-алкильного эфира. Термодинамический подход имеет три основных недостатка: i) равновесие обычно сдвинуто в сторону расщепления пептидной связи, так что выход при конденсации будет небольшим; ii) обычно требуется большое количество фермента; iii) скорость реакции обычно очень низка. В кинетически контролируемом подходе в качестве исходного материала нужны алкильные эфиры, но требуется гораздо меньшее количество фермента, время реакции значительно короче и, прежде всего, максимально получаемый выход обычно значительно выше. Таким образом, для промышленного применения наиболее привлекательным является энзиматический синтез пептидов на основе кинетического подхода, т.е. с использованием активированного карбоксильного компонента (к примеру, см. N. Sewald and H.-D. Jakubke, in "Peptides: Chemistry and Biology", 1st reprint, Ed. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim 2002, раздел 4.6.2). Хемо-энзиматический синтез пептидов может осуществляться поэтапно с С-конца в направленииN-конца или с N-конца в направлении С-конца, но также может включать энзиматическое соединение фрагментов, которые были индивидуально синтезированы методом химического синтеза или комбинацией химических и хемо-энзиматических стадий. Chen et al. описали конденсацию в "маловодных" органических растворителях с помощью протеазы, активной и стабильной в органическом растворителе (J.Org. Chem. 1992, 57, 6960-65; Biomed. Biochim. Acta 1991, 50, 181; Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991, 1, 445). Недостатками описанных там способов является то, что лишь немногие ферменты активны и стабильны в маловодных условиях, и они обладают ограниченным субстратным диапазоном в способах, описанных в этих публикациях. Таким образом, обычно требуется большая продолжительность реакций и большой избыток аминокислотных или пептидных нуклеофилов. К тому же иногда бывает гидролиз в других положениях пептида, и часто происходит трансамидирование существующих пептидных связей в одном из фрагментов (= катализируемая ферментом нуклеофильная атака аминокислотного или пептидного нуклеофила по одной из существующих пептидных связей). Поэтому выход зачастую мал. К тому же очистка продуктов часто затруднительна. Другим подходом является использование так называемых "субстратных миметиков", как описано в обзоре F. Bordusa et al., in Current Protein and Peptide Science 2002, 3, 159-180. В этом подходе Сактивированная аминокислота или пептид имеет сложноэфирную группировку, которая похожа на определенную аминокислоту в такой степени, что фермент, который избирателен для этой конкретной аминокислоты, быстро реагирует с любой аминокислотой, несущей сложноэфирную группировку. Хорошим примером является применение 4-гуанидилфениловых (Gp) эфиров, открытое Bordusa et al., которые похожи на Arg в такой степени, что трипсин, который по своим гидролитическим свойствам специфичен для последовательностей Arg-X (в которых X означает любую белковую аминокислоту), может соединять почти любой С-конец (несущий Gp-эфир) с различными аминокислотными и пептидными нуклеофилами. К примеру, N-блокированный D-Ala-OGp может соединяться с различными аминокислотными или пептидными нуклеофилами, как показано М. Thormann et al., Biochem. 1999, 38, 6056. При этом также энзиматически могут быть включены D-аминокислоты и небелковые аминокислоты с высокой эффективность, причем не происходит гидролиз пептидных связей во фрагментах за исключением пептидной связи, для которой данный фермент специфичен (например, связи Arg-X в случае трипсина). Недостатками подхода с субстратными миметиками является то, что субстратные миметики (типа Gp-эфиров) требуют трудоемкого многоступенчатого химического синтеза, который с трудом поддается увеличению масштаба и при котором зачастую происходит рацемизация аминокислот; к тому же субстратные миметики нестабильны, поэтому с ними трудно работать в больших объемах, и растворимость их в водном растворе бывает низкой. В работе Liu and Tam, Organic Letters, 2001, vol. 3, no. 26, p. 4157-4159, приведен способ, в котором используется субтилизин Carlsberg для катализа образования С-концевых 3-гидроксипропиловых или 4 гидроксибутиловых эфиров некоторых Вос-защищенных по N-концам аминокислот и незащищенных пептидов в 1,3-пропандиоле и в 1,4-бутандиоле, содержащих 1-2,5% воды. Далее описано энзиматическое присоединение аминокислоты (лейцина) или пептида к полученному эфиру в реакционной среде,которая отличается от среды, в которой происходило образование эфира. Реакционная среда, в которой происходит присоединение, содержит значительное количество воды. В работе Mitin et al., Biotechnology and Bioengineering, 1997, vol. 54, no. 3, p. 287-290, приведен способ, в котором используется папаин для катализа образования С-концевых глицериловых эфиров Boc- иCbz-защищенных по N-концам аминокислот и пептидов в глицерине, содержащем по меньшей мере 10 мас.% воды, что дает максимальный выход эфиров в 70%. Применение растворов, содержащих менее 10 мас.% воды, приводит к гораздо меньшему выходу эфира вследствие денатурации папаина. Еще один подход заключается в использовании "активированных" эфиров, как то карбамоилметиловых (Cam) эфиров (как описано, к примеру, в Т. Miyazawa et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 2002, 390395) или 2,2,2-трифторэтиловых (Tfe) эфиров (как описано в A. Yan et al., Tetrahedron, 61, 2005, 59335941). Эти эфиры обычно намного легче получить, и они более стабильны, чем миметики "настоящих" субстратов, но все же они требуют химических стадий, более дорогих и экологически небезопасных. К тому же получение этих эфиров часто приводит к некоторой рацемизации аминокислот. Например, Camэфиры могут быть получены обработкой Cs-солей донора ацила 2-хлорацетамидом, а Tfe-эфиры могут быть получены методами карбодиимидной химии. Cam- и Tfe-эфиры обычно соединяются с аминокислотными или пептидными нуклеофилами с помощью дешевых и легкодоступных протеаз, таких как папаин и субтилизин. При этом в пептиды могут быть включены и D-аминокислоты (хотя Pro еще не был включен). В общем, остается потребность в альтернативных способах синтеза пептидов и/или получения промежуточных соединений, которые могут использоваться для синтеза пептидов. Такие способы могут, к примеру, обеспечить дополнительную методологию, которая увеличит гибкость при синтезе пептидов и/или позволит синтез специфических пептидов, которые невозможно или сравнительно трудно получить по известной методологии. К примеру, все еще трудной задачей является энзиматическое присоединение различных аминокислот с хорошим выходом в приемлемое время. Таким образом, все еще существует потребность в усовершенствовании методологии для присоединения не только белковых, но также и небелковых аминокислот, как то Dаминокислот, -аминокислот, фенилглицина, DOPA, алкилированных аминокислот или пептидов, у которых N-концевой аминокислотный остаток представляет собой остаток любой из этих аминокислот, через N-концевую аминогруппу к С-концевой карбоксигруппе другой аминокислоты или пептида. Также существует потребность в усовершенствовании технологии для присоединения не только белковых, но и небелковых аминокислот, как то Dаминокислот,-аминокислот, фенилглицина, DOPA, -алкилированных аминокислот или пептидов, у которых Сконцевой аминокислотный остаток представляет собой остаток любой из этих аминокислот, через Сконцевую карбоксигруппу к N-концевой аминогруппе другой аминокислоты или пептида. Далее, в частности, существует потребность в усовершенствовании методологии в отношении энзиматического присоединения любой аминокислоты или пептида через N-концевую аминогруппу к Сконцевой карбоксигруппе стерически заторможенной аминокислоты типа валина или изолейцина либо пептида, у которого остаток С-концевой аминокислоты представлен стерически заторможенной аминокислотой типа валина или изолейцина. Далее все еще остается потребность в новых относительно простых способах, которые будут экологически безопасными. Теперь же оказалось возможным представить такую методологию путем сочетания энзиматического получения активированного С-концевого эфира или активированного С-концевого тиоэфира аминокислоты или пептида и энзиматического присоединения такого активированного эфира или активированного тиоэфира к другой аминокислоте или пептиду специфическим образом. Соответственно, настоящее изобретение касается способа энзиматического синтеза пептидов,включающего энзиматическое получение эфира или тиоэфира из (i) защищенной с N-конца аминокислоты, С-концевого эфира защищенной с N-конца аминокислоты, защищенного с N-конца пептида или Сконцевого эфира защищенного с N-конца пептида и (ii) спирта, представленного формулой НО-СХ 2-Z,или тиола, представленного формулой HS-CX2-Z, где каждый X независимо означает атом галогена или атом водорода;a Z выбирается из группы sp3-гибридизованных атомов углерода, содержащих по меньшей мере два заместителя, содержащих гетероатом, присоединенный непосредственно к sp3-гибридизованному углероду, и sp2-гибридизованных атомов углерода, содержащих по меньшей мере два заместителя, содержащих гетероатом, присоединенный непосредственно к sp2-гибридизованному углероду,причем получение эфира или тиоэфира осуществляется в реакционной среде, содержащей 2 мас.% или меньше воды, исходя из массы жидкости в реакционной среде; и энзиматическое присоединение полученного эфира или тиоэфира к необязательно защищенной с С-конца аминокислоте или необязательно защищенному с С-конца пептиду, при этом пептид синтезируется в реакционной среде, содержащей 2 мас.% или меньше воды, исходя из общей массы реакционной среды. Термин "защищенная с С-конца" применяется здесь для обозначения того, что С-концевая карбоксильная группа снабжена защитной группой, которая, в общем, практически защищает карбоксильную группу от связывания с аминогруппой другой молекулы. В частности, С-концевая защитная группа может представлять собой С-концевой эфир, в котором С-концевая карбоксильная группа по меньшей мере существенно защищена от связывания с амином в используемых условиях синтеза пептидов. Обычно в качестве защитной группы используется трет-алкильная группа. Термин "защищенная с N-конца" применяется здесь для обозначения того, что N-концевая аминогруппа снабжена защитной группой, которая в общем практически защищает N-концевую аминогруппу от участия в связывании С-концевой карбоксильной группы с N-концевой аминогруппой. Эфир или тиоэфир, полученный способом изобретения, может соответственно обозначаться как"активированный эфир" или "активированный тиоэфир", так как подобный эфир способен участвовать в реакции присоединения. Напротив, свободная С-концевая карбоксикислота или эфир, которые могут использоваться для получения активированного эфира, не способны участвовать в присоединении или,по крайней мере, обладают значительно меньшей реактивностью в реакции присоединения, например меньше половины реактивности, меньше одной десятой реактивности или меньше одной сотой реактивности активированного эфира, полученного энзиматически способом изобретения. В частности, для аминокислот, С-концевых аминокислотных остатков или N-концевых аминокислотных остатков, которые обычно соединяются с трудом (обладают низкой скоростью присоединения), способом изобретения может быть достигнуто сильное повышение скорости присоединения благодаря активации аминокислоты или С-концевого аминокислотного остатка. Типичными примерами затрудненного присоединения аминокислот или аминокислотных остатков являются D-аминокислоты или их аминокислотные остатки и другие небелковые аминокислоты или их аминокислотные остатки. Другие примеры включают стерически заторможенные аминокислоты, например валин и изолейцин, либо их аминокислотные остатки. Энзиматическое получение эфира или тиоэфира, соответственно, может в дальнейшем обозначаться как эстерификация или тиоэстерификация соответственно. Этот термин охватывает случай, когда получение (тио)эфира включает реакцию защищенной с N-конца аминокислоты или С-концевого эфира пептида с (тио)спиртом. Более конкретно такая реакция известна как транс(тио)эстерификация. В одном воплощении способ изобретения выгоден тем, что он дает возможность применения способа изобретения для соединения различных аминокислот или различных пептидов, отличающихся по концевым аминокислотным остаткам, которые должны участвовать в реакции, включая пролин и небелковые аминокислоты или пептиды, содержащие пролин, или небелковые концевые аминокислотные остатки для участия в присоединении. В одном воплощении способ изобретения выгоден тем, что в нем активированные (тио)эфиры синтезируются с высоким выходом без рацемизации или других побочных реакций, экологически безопасным способом, т.е. не давая стехиометрических количеств отходов. В одном воплощении способ изобретения выгоден тем, что в нем обеспечивается высокая стабильность и/или активность используемого в этом способе фермента. В одном воплощении способ изобретения выгоден тем, что степень гидролиза полученного энзиматически эфира мала (в типичных временных рамках получения (тио)эфира и присоединения); по крайней мере в нескольких воплощениях заметного гидролиза эфира не наблюдалось. В одном воплощении способ изобретения выгоден тем, что степень гидролиза полученного энзиматически пептида мала; по меньшей мере в нескольких воплощениях не наблюдалось заметного гидролиза полученного энзиматически пептида. В одном воплощении способ изобретения выгоден тем, что он дает высокую общую скорость реакции, т.е. высокую скорость превращения исходных соединений - защищенной с N-конца аминокислоты или пептида - в синтезированные пептиды, что приводит к относительно малому времени реакции для достижения определенного выхода. В частности, способ изобретения позволяет соединить аминокислоту или пептид с другой аминокислотой или пептидом без необходимости в большом избытке одного из партнеров для получения синтезированного пептида с приемлемым выходом на основе другого партнера реакции за относительно короткое время. Молярное отношение защищенной с N-конца аминокислоты, С-концевого эфира защищенной с N-конца аминокислоты, защищенного с N-конца пептида или С-концевого эфира защищенного с N-конца пептида, из которого получают (активированный) (тио)эфир, к необязательно защищенной с С-конца аминокислоте или пептиду обычно выбирают в пределах от 2:1 до 1:3, в частности от 1:1 до 1:2,предпочтительно от 1:1 до 1:1,5. В особенно предпочтительном способе данное молярное отношение находится в пределах от 1:1 до 1:1,1. Способ изобретения особенно выгоден тем, что стало возможным энзиматическое получение активированных С-концевых эфиров или тиоэфиров защищенной с N-конца аминокислоты или защищенного с N-конца пептида, в частности С-концевых карбамоилметиловых эфиров (Cam) или С-концевых 2,2,2 трифторэтиловых (Tfe) эфиров защищенной с N-конца аминокислоты или защищенного с N-конца пептида, как составной части хемо-энзиматического синтеза пептидов. В частности, неожиданно оказалось,что Cam- и Tfe-эфиры могут быть получены энзиматически с высоким выходом с помощью протеазы или липазы, а еще лучше то, что стадия активации с помощью протеазы или липазы может выполняться одновременно со стадией образования пептидной связи с помощью протеазы, получая продукт конденсации (синтезируемый пептид) без заметных побочных реакций с выходом более 90% даже при использовании эквимолярных количеств соединяемых аминокислот или пептидов, т.е. без необходимости в избытке аминокислоты или пептида, действующих в качестве нуклеофила. Далее оказалось, что можно синтезировать пептиды без заметной рацемизации также и в том случае, когда с одной или с обеих сторон соединяемой пептидной связи присутствует такая "трудная" аминокислота, как пролин, или небелковая аминокислота, например D-аминокислота. Способ по изобретению, в частности, является сравнительно простым способом, так как он дает возможность проводить (тио)эстерификацию так называемым "совмещенным" способом. В "совмещенном" способе (тио)эстерификация и конденсация имеет место без проведения стадии выделения (полученного эфира или тиоэфира) в промежутке между этими реакциями. Способ по изобретению даже может выполняться при включении всех субстратов (как то соединяемых аминокислот или их эфиров и/или пептидов или их эфиров, спирта/тиола, растворителя и фермента) с самого начала реакции, что может быть особенно полезным при получении синтезируемого пептида с высоким выходом за сравнительно короткое время. Соответственно, в одном особенно подходящем совмещенном способе изобретения получение эфира или тиоэфира осуществляется в присутствии необязательно защищенной с С-конца аминокислоты или необязательно защищенного с С-конца пептида, с которым будет соединяться получаемый эфир или тиоэфир. В другом совмещенном способе изобретения (тио)эстерификация и конденсация происходят последовательно, т.е. необязательно защищенная с С-конца аминокислота или необязательно защищенный с С-конца пептид добавляется после того, как получен эфир или тиоэфир. В следующем совмещенном способе изобретения сначала проводится получение (тио)эфира с помощью липазы или эстеразы, а затем добавляется фермент (обычно протеаза), катализирующий реакцию конденсации. Такой подход, в частности, может применяться в том случае, если фермент, катализирующий присоединение, мешает получению (тио)эфира, например, если он оказывает отрицательное влияние на активность или стабильность фермента, катализирующего получение (тио)эфира. Также можно использовать промежуточную форму таких совмещенных способов, как то сначала внести только часть одного или нескольких субстанций, используемых в способе изобретения, а остальную добавить позже. В частности, можно постепенно или по частям добавлять необязательно защищенную с С-конца аминокислоту или необязательно защищенный с С-конца пептид, с которым будет соединяться получаемый эфир или тиоэфир. В принципе фермент, катализирующий (тио)эстерификацию, и фермент, катализирующий присоединение, может быть один и тот же, в частности одна и та же липаза, эстераза или протеаза. Например,для такого воплощения можно использовать субтилин Carlsberg или липазу В Candida antarctica. Особенно выгодным для получения синтезируемых пептидов за сравнительно короткое время оказалось использование по меньшей мере двух ферментов, а именно по меньшей мере одного фермента из числа липаз и эстераз и по меньшей мере одной протеазы. Предусматривается, что в совмещенном способе изобретения липаза или эстераза (преимущественно) катализирует (тио)эстерификацию, а протеаза(преимущественно) катализирует реакцию конденсации. Защищенная с N-конца аминокислота или защищенный с N-конца пептид, подлежащий(тио)эстерификации, в принципе может представлять собой любую аминокислоту, белковую или небелковую, или любой пептид на основе белковых и/или небелковых аминокислот. В предпочтительном воплощении изобретение касается способа по изобретению, в котором для энзиматического получения эфира или тиоэфира (i) защищенная с N-конца аминокислота или защищенный с N-конца пептид реагирует со (ii) спиртом, представленным формулой HO-CX2-Z, или тиолом, представленным формулой HS-CX2-Z. В частности, защищенная с N-конца аминокислота или защищенный с N-конца пептид может представлять собой соединение формулы I При этом Р означает N-концевую защитную группу. Подходящими N-концевыми защитными группами являются такие N-блокирующие группы, которые могут использоваться для синтеза (олиго)пептидов. Такие группы известны специалистам. Примеры подходящих N-блокирующих групп включают защитные группы карбонильного типа, например Cbz (т.е. бензилоксикарбонил), Вос (т.е. третбутилоксикарбонил), For (т.е. формил), Fmoc (т.е. 9-фторенилметоксикарбонил) и PhAc (т.е. фенацетил). Группы For и PhAc могут вводиться и отщепляться энзиматически с помощью фементов пептиддеформилазы или PenG-ацилазы соответственно. Методы химического отщепления хорошо известны в данной области. При этом n означает целое число не менее 1. В частности, n может означать по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10. В частности, n может означать 100 или меньше, 75 или меньше,50 или меньше, 25 или меньше, 20 или меньше, 15 или меньше или 10 или меньше, например 5 или меньше. Каждый RA и каждый RB независимо означает Н либо органическую группировку, предпочтительно боковую цепь аминокислоты. Таким образом, RA не обязательно должен быть одинаковым во всех n аминокислотных звеньях. Точно так же RB не обязательно должен быть одинаковым во всех n аминокислотных звеньях. В контексте изобретения "боковая цепь аминокислоты" означает боковую цепь любой белковой или небелковой аминокислоты. Реакционноспособные группы в боковых цепях аминокислот могут быть блокированы защитными группами боковых цепей аминокислот или могут быть не заблокированы. Подходящие защитные группы для боковых цепей аминокислот известны специалистам. В частности, можно снабдить защитными группами все или часть кислых или щелочных боковых групп для того, чтобы улучшить растворимость аминокислоты или пептида, если нужно. Белковыми аминокислотами являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом. К белковым аминокислотам относятся аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин, метионин, цистеин,аспарагин, глутамин, тирозин, триптофан, глицин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, гистидин, лизин, аргинин, пролин и фенилаланин. Небелковые аминокислоты, в частности, могут быть выбраны из числа D-аминокислот, фенилглицина, DOPA (3,4-дигидрокси-L-фенилаланина), -аминокислот, 4-фторфенилаланина или алкилированных аминокислот. В конкретном воплощении защищенная с N-конца аминокислота или защищенный с N-конца пептид, используемый для получения того эфира или тиоэфира, который должен участвовать в реакции конденсации, представляет собой С-концевой эфир, отличный от того (тио)эфира, который должен быть получен, к примеру трет-алкиловый эфир или другой эфир, который, в общем, не проявляет существенной активности в энзиматической реакции конденсации для синтеза пептидов или, по крайней мере, меньшую активность, чем получаемый (тио)эфир. В таком случае получение (тио)эфира может называться транс(тио)эстерификацией. В одном воплощении, в котором получаемое соединение, которое должно реагировать со спиртом или тиолом, представляет собой сложный эфир, как правило, эфир аминокислоты или пептида, как описано выше. Следовательно, этот эфир можно представить формулой II Этот эфир, как правило, менее реакционноспособен, чем эфир или тиоэфир, получаемый энзиматически в способе изобретения. В общем, это значит, что группа RC не является притягивающей электроны группой или же меньше притягивает электроны, чем группа CX2-Z спирта или тиола, используемого при получении эфира или тиоэфира. Обычно RC представляет собой углеводородную группу либо углеводородную группу, содержащую заместитель на углероде в у положении относительно эфира или еще более удаленном от сложноэфирной группировки. В частности, RC может представлять собой алкильную группу, предпочтительно группу C1-C6-алкила, более предпочтительно группу метила, этила, первичного пропила, вторичного пропила, первичного бутила, вторичного бутила или третичного бутила. Р, RA, RB и n уже идентифицированы выше. Спирт HO-CX2-Z или тиол HS-CX2-Z, используемый при получении (тио)эфира, представляет собой активирующий спирт или тиол. Активирующим спиртом или тиолом является такой спирт или тиол, который обеспечивает активированную С-концевую карбокси(тио)эфирную группу после (тио)эстерификации,т.е. карбокси(тио)эфирную группу, которая может участвовать в реакции конденсации. Как указано выше,спирт представлен формулой HO-CX2-Z, а тиол представлен формулой HS-CX2-Z. При этом каждый X независимо означает атом галогена (F, Cl, Br, I) или атом водорода. В том случае, когда X означает атом галогена, им предпочтительно является F. В способе изобретения хорошие результаты достигались тогда, когда оба X представляли собой водород. Обычно Z означает притягивающую электроны группу. Не придерживаясь какой-либо теории, полагаем, что это выгодно в отношении скорости реакции конденсации.Z означает sp2- или sp3-гибридизованный атом углерода, содержащий один или несколько заместителей, содержащих гетероатом. Обычно бывает трудно или, по меньшей мере, трудоемко получить Сконцевые (тио)эфиры защищенных с N-конца аминокислот или защищенных с N-конца пептидов и таких спиртов или тиолов. Поэтому настоящее изобретение также особенно выгодно тем, что представлен сравнительно простой способ получения таких эфиров. В конкретном воплощении Z выбирается из группы sp3-гибридизованных атомов углерода, содержащих один заместитель, содержащий гетероатом, причем гетероатом непосредственно связан с sp3 гибридизованным атомом углерода. В предпочтительном воплощении Z выбирается из группы sp3-гибридизованных атомов углерода,содержащих два или три заместителя, содержащих гетероатом, причем данный гетероатом у каждого из заместителей непосредственно связан с sp3-гибридизованным атомом углерода, в частности два или три галогеновых заместителя, предпочтительно два или три галогеновых заместителя, выбранных из группыF и Cl, к примеру Z, может означать трифторметильную группу или трихлорметильную группу. Так, хорошие результаты достигались с 2,2,2-трифторэтиловым спиртом (X = Н, Z = CF3), особенно в способе, в котором используется и липаза, и протеаза. Особенно неожиданно то, что можно энзиматически получить трифторэтиловый эфир защищенной с N-конца аминокислоты или С-концевой 2,2,2 трифторэтиловый эфир защищенного с N-конца пептида из защищенной с N-конца аминокислоты или защищенного с N-конца пептида, а затем использовать в способе энзиматического присоединения, а еще более то, что можно осуществить это совмещенным способом с хорошим выходом. В другом предпочтительном воплощении Z выбирается из группы sp2-гибридизованных атомов углерода, содержащих по меньшей мере один заместитель, содержащий гетероатом, причем гетероатом непосредственно связан с sp2-гибридизованным атомом углерода. В частности, такой Z может представлять собой -(C=O)R1 или -(C=S)R1. A R1, в частности, может быть выбран из группы таких аминогрупп,как -NH2, NHCH3 или N(CH3)2, (необязательно) защищенных с С-конца -аминокислот или (необязательно) защищенных с С-конца пептидов, предпочтительно -NH2; -ОН или таких его солей, как соли щелочных металлов или аммония; алкильных или арильных групп; замещенных алкильных или арильных групп, в частности замещенных алкильных или арильных групп, содержащих один или несколько галогеновых заместителей; -OR2; -SR2. Группа R2 обычно представляет собой углеводород или замещенный углеводород, в частности алкил, замещенный алкил (как то алкил, содержащий один или несколько галогеновых заместителей), незамещенный арил или замещенный арил (как то арил, содержащий один или несколько галогеновых заместителей). В частности, алкил или замещенный алкил в R1 или R2 может содержать 1-6 атомов углерода; незамещенный или замещенный арил может содержать 5-18 атомов углерода в кольце или кольцах, более предпочтительно 6-12. Например, хорошие результаты достигались с карбамоилметиловым спиртом (Z = -(C=O)NH2, карбамоил), особенно в способе, в котором используется и липаза, и протеаза. Особенно неожиданно то, что можно энзиматически получить С-концевой карбамоилметиловый эфир защищенной с N-конца аминокислоты или С-концевой карбамоилметиловый эфир защищенного с N-конца пептида из защищенной сN-конца аминокислоты или защищенного с N-конца пептида, а затем использовать в способе энзиматического присоединения, а еще более то, что это можно осуществить совмещенным способом с хорошим выходом. Необязательно защищенная с С-конца аминокислота или необязательно защищенный с С-конца пептид, которые должны соединяться с (тио)эфиром, в принципе может представлять собой любую аминокислоту, белковую или небелковую, или любой пептид на основе белковых и/или небелковых аминокислот. В частности, необязательно защищенная с С-конца аминокислота или пептид может представлять собой соединение формулы III При этом n, каждый RA и каждый RB уже определены выше. При этом Q означает амидогруппу или группировку OR (см. ниже). В том случае, когда Q означает амидогруппу, амидогруппа может быть представлена формулойNR1R2, в которой каждый R1 и R2 индивидуально может означать любой (замещенный) алкил или (замещенный) арил. В частности, один из R1 и R2 может представлять собой атом Н, а другой - замещенный алкил. Предпочтительно и R1, и R2 означают Н. В том случае, когда Q означает группировку OR, R может означать С-концевую защитную группу или катион, к примеру одновалентный катион, как то ион трех- или четырехзамещенного аммония или катион щелочного металла, либо Н. В том случае, когда R означает С-концевую защитную группу, она может представлять собой необязательно замещенный алкил. Предпочтительно это трет-алкильная группа, хотя в принципе это может быть любой другой защитный эфир, известный специалистам. В принципе трет-алкил может представлять собой любой защитный третичный алкил. Предпочтительно трет-алкил выбирается из группы трет-бутила (2-метил-2-пропила), трет-пентила (2-метил-2-бутила) и трет-гексила(2,3-диметил-2-бутила). В частности, хорошие результаты были достигнуты с трет-бутилом. Обычно для того, чтобы избежать нежелательных побочных реакций, предпочтительно, чтобы Q означал амидогруппу или группировку OR, в которой R является защитной группой. Однако по крайней мере в некоторых воплощениях такие побочные реакции адекватно предотвращаются иным образом. Как указано выше, в способе изобретения (тио)эстерификация аминокислоты или пептида катализируется ферментом, как и соединение образовавшегося (тио)эфира с другим пептидом или аминокислотой. В принципе можно использовать любой известный фермент, способный катализировать одну или обе эти реакции. При ссылке на фермент из определенного источника предусматривается, что рекомбинантные ферменты, происходящие из первого организма, но фактически произведенные во втором (генетически модифицированном) организме, считаются ферментами из этого первого организма. Примеры организмов, из которых может быть получен фермент, используемый в способе изобретения, включают такие виды Trichoderma, как Trichoderma reesei; такие виды Rhizopus, как Rhizopus oryzae; такие виды Bacillus, как Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus clausii,Bacillus lentis, Bacillus alcalophilus, Bacillus halodurans; такие виды Aspergillus, как Aspergillus oryzae илиAspergillus niger; такие виды Streptomyces, как Streptomyces caespitosus или Streptomyces griseus; различные виды Candida; грибов; Humicola; Rhzoctonia; Cytophagia; Mucor; и ткани животных, в частности, из поджелудочной железы, как то поджелудочной железы свиньи, быка или овцы. Рядовому специалисту в данной области должно быть ясно, что в способе по изобретению также могут использоваться мутанты природных ферментов (дикого типа). Мутанты ферментов дикого типа, к примеру, могут быть получены модификацией ДНК, кодирующей ферменты дикого типа, методами мутагенеза, известными специалистам (методом случайного мутагенеза, направленного мутагенеза, направленной эволюции, перетасовки генов и др.), с тем, чтобы ДНК кодировала фермент, отличающийся по меньшей мере одной аминокислотой от фермента дикого типа, или чтобы она кодировала фермент, более короткий по сравнению с диким типом, и осуществления экспрессии модифицированной таким образом ДНК в подходящих клетках (хозяина). Мутанты по ферменту могут обладать улучшенными свойствами,к примеру, в отношении одного или нескольких из следующих аспектов: диапазон субстратов, активность, стабильность, устойчивость к органическим растворителям, температурный профиль, соотношение синтез/гидролиз и профиль побочных реакций. В предпочтительном способе для катализа по меньшей мере одной из данных реакций используется липаза и/или протеаза. Подходящая липаза или эстераза выбирается из ферментов, классифицируемых под рубрикой Е.С. 3.1. В частности, может использоваться гидролаза карбоксильных эфиров (Е.С. 3.1.1) или гидролаза тиоловых эфиров (Е.С. 3.1.2). В предпочтительном способе используется липаза, выбранная из числа липаз из Candida. Хорошие результаты, в частности, в отношении катализа (тио)эстерификации достигались с липазой Candida antarctica, в частности с липазой В Candida antarctica. Подходящая протеаза выбирается из ферментов, классифицируемых под рубрикой Е.С. 3.4. Протеазы могут быть дополнительно разделены на два подкласса: экзопептидазы, действующие только возле самого конца пептида, и эндопептидазы, действующие внутри пептида. В одном воплощении настоящего изобретения энзиматическое получение эфира или тиоэфира катализируется липазой или эстеразой; а энзиматическое присоединение катализируется протеазой. Экзопептидазы, действующие с N-конца пептида, высвобождают только одну аминокислоту (аминопептидазы Е.С. 3.4.11) или дипептиды (дипептидазы Е.С. 3.4.13) либо дипептиды и трипептиды (ди-7 019536 пептидилпептидазы или трипептидилпептидазы, Е.С. 3.4.14). Пептидазы, действующие с С-конца пептида, именуются карбоксипептидазами и высвобождают только одну аминокислоту (карбоксипептидазы,Е.С. 3.4.16-180) или дипептид (пептидилдипептидазы, Е.С. 3.4.15). Карбоксипептидазы группируются в соответствии с их каталитическим механизмом, например карбоксипептидазы серинового типа (Е.С. 3.4.16), металлокарбоксипептидазы (Е.С. 3.4.17), карбоксипептидазы цистеинового типа (Е.С. 3.4.18),или отщепляют терминальные аминокислоты, которые являются замещенными, циклизованными или содержат изопептидные связи (пептидные связи, включающие боковую цепь) (омега-пептидазы, Е.С. 3.4.19). В частности, могут использоваться эндопептидазы, в особенности эндопептидазы, выбранные из группы сериновых эндопептидаз (Е.С. 3.4.21), цистеиновых эндопептидаз (Е.С. 3.4.22), аспартатных эндопептидаз (Е.С. 3.4.23) и металлоэндопептидаз (Е.С. 3.4.24). В особенности подходят сериновые эндопептидазы, выбранные из группы субтилизинов. Такие ферменты оказались особенно подходящими для катализа присоединения. В данной области известны различные субтилизины, например, см. US 5316935 и приведенные в нем ссылки. Субтилизин А - это коммерчески доступный субтилизин фирмы Novozymes. Особенно предпочтителен субтилизин Carlsberg, который при использовании в комбинации с такой липазой, как липаза Candida antarctica, оказался особенно выгодным в отношении синтеза пептидов с хорошим выходом за относительно короткое время. Подходящим источником субтилизина Carlsberg является Alcalase. Этот препарат доступен отNovozymes (Bagsvaerd, Дания). Alcalase представляет собой дешевую и коммерчески доступную смесь протеолитических ферментов, вырабатываемых Bacillus licheniformis (содержащую субтилизин Carlsberg в качестве основного ферментного компонента). Коммерчески доступные ферменты типа Alcalase могут поставляться в виде жидкости, в частности водной жидкости. В таком случае фермент предпочтительно сначала выделяют из нежелательной жидкости, к примеру излишней воды или спиртов, вызывающих нежелательные побочные реакции. Это удобно осуществляется методом преципитации, за которой обычно следует отделение твердого вещества от жидкости и/или высушивание. Преципитация может осуществляться с помощью такого спирта, как н-бутанол, либо спирта или тиола, используемого в способе изобретения. При использования другого спирта или тиола нужно принимать меры, чтобы такой спирт или тиол не оказывал отрицательного влияния на реакцию(тио)эстерификации или реакцию присоединения. В предпочтительном воплощении по меньшей мере один из ферментов иммобилизирован на твердой подложке. По крайней мере в некоторых воплощениях это может привести к увеличению выхода синтезируемого пептида за относительно короткое время реакции, в частности в совмещенном процессе,где используется один фермент для катализа (тио)эстерификации и другой фермент для катализа реакции присоединения. При этом особенно предпочтительным является использование по меньшей мере одного иммобилизованного фермента для катализа (тио)эстерификации, в частности такой липазы, как липазаCandida antarctica, и такой протеазы, как субтилизин Carlsberg. Особенно хорошие результаты были получены со сшитыми агрегатами фермента алкалазы (Alcalase-CLEA), в которых алкалаза иммобилизована путем конденсации с глутаральдегидом. В специфическом воплощении используются по меньшей мере два различных фермента, по меньшей мере один катализирует получение (тио)эфира и по меньшей мере один другой катализирует присоединение, причем различные ферменты подвергаются иммобилизации на одной и той же подложке. Реакция может проводиться в смеси, включающей спирт для (тио)эстерификации и необязательно инертный органический растворитель, к примеру ацетонитрил, такой углеводород, как толуол, или такой эфир, как метил-трет-бутиловый эфир (МТВЕ). Преимуществом изобретения является то, что для получения (тио)эфира нет необходимости в большом избытке тиола или спирта по отношению к подлежащей эстерификации аминокислоте или пептиду. Например, молярное отношение данного тиола или спирта к данной аминокислоте или пептиду может составлять 50:1 или меньше, предпочтительно 25:1 или меньше, в частности 20:1 или меньше, более предпочтительно 10:1 или меньше. Обычно это отношение составляет по меньшей мере 1:1. Предпочтительно данное молярное отношение составляет по меньшей мере 3:1, в особенности по меньшей мере 5:1 с тем, чтобы реакция (тио)эстерификации протекала с выгодной скоростью. Способ изобретения выполняется в практически неводных условиях. Специалисты должны понимать, что небольшое количество воды может быть желательно в зависимости от фермента для того, чтобы фермент надлежащим образом осуществлял требуемую каталитическую активность. Для хорошей каталитической активности может быть желательно наличие следов воды, например по меньшей мере 0,005 мас.% от жидкой фазы. В частности, концентрация воды может составлять по меньшей мере 0,01 мас.% или по меньшей мере 0,03 мас.%. Желательный верхний предел для концентрации воды зависит от конкретного фермента, исполь-8 019536 зуемого тиола или спирта, природы синтезируемого пептида (например, размера, аминокислот, из которых состоит пептид), желательной конечной степени конверсии и желательной скорости реакции. Реакционная среда обычно содержит, по меньшей мере, в начале активации или(транс)эстерификации менее 2,0 мас.% воды от веса жидкости в реакционной среде. Реакционная среда может быть диспергирована во второй жидкой фазе, либо другая жидкая фаза может быть диспергирована в реакционной среде. В случае двойственной или мультифазной системы заданное содержание воды основывается на весе жидкости в той фазе, в которой протекает реакция (транс)эстерификации или активации - по меньшей мере, преимущественно. В частности, концентрация воды может составлять 1,0 мас.% или меньше, по крайней мере, в начале (тио)эстерификации. Предпочтительно способ может выполняться в среде, содержащей 0,5 мас.% воды или меньше, в частности 0,2 мас.% воды или меньше, более предпочтительно 0,1 мас.% или меньше,по крайней мере в начале реакции, при этом практически сохраняя требуемую активность фермента и низкий или даже незаметный уровень нежелательного гидролиза. Так, по крайней мере, в некоторых воплощениях, особенно в том воплощении, где используется липаза Candida antarctica и/или субтилизинCarlsberg, наблюдалось улучшение скорости синтеза пептидов в реакционной среде с очень низким содержанием воды, в частности в реакционной среде с содержанием воды менее 0,5 мас.% или менее 0,1 мас.% по сравнению со способом, выполняемым в реакционной среде, содержащей 1-2,5% воды. В предпочтительном способе вода, которая образуется, в частности, при (тио)эстерификации, может удаляться непрерывно или периодически. В принципе, удаление воды может осуществляться известным в данной области способом. В частности, хорошие результаты достигались с помощью молекулярных сит. Также для удаления хорошо подходит упаривание, как то азеотропное удаление с помощью вакуума или дистилляции. В принципе значение рН (постольку, поскольку в данное реакционной среде существует некоторый рН) можно выбирать в широких пределах, если только при выбранном значении рН фермент проявляет достаточную активность. Такое значение рН обычно известно для используемого фермента и может основываться на известной гидролитической активности в водном растворе или может быть установлено в рабочем порядке с использованием известного субстрата для фермента при известных условиях реакции. В частности, его можно выбрать в нейтральной области. Если нужно, можно использовать щелочные или кислые условия в зависимости от фермента. Если нужно, можно довести рН с помощью кислоты и/или основания или забуферить с помощью подходящей комбинации кислоты и основания. Подходящими кислотами и основаниями, в частности, являются те, которые растворимы в реакционной среде, например из группы аммиака и растворимых в спирте кислот, например уксусная кислота и муравьиная кислота. В принципе температура не играет решающей роли, если только при выбранной температуре используемые ферменты проявляют достаточную активность и стабильность. Такая температура обычно известна для используемых ферментов или может быть установлена в рабочем порядке с использованием известного субстрата для фермента при известных условиях реакции. В общем, температура может составлять по меньшей мере 0 С, в частности по меньшей мере 15 С или по меньшей мере 25 С. В частности, если один или несколько ферментов происходят из термофильного организма, то температура предпочтительно составляет по меньшей мере 40 С. Желательная максимальная температура зависит от фермента. В общем, такая максимальная температура известна, например указана в спецификации на препарат в случае коммерчески доступных ферментов или может быть установлена в рабочем порядке, исходя из общеизвестных сведений и приведенной информации. Обычно температура составляет 70 С или меньше, в частности 60 С или меньше, либо 45 С или меньше. Однако особенно при использовании одного или нескольких ферментов из термофильного организма может быть выбрана более высокая температура, например вплоть до 90 С. Оптимальные температурные условия для конкретного фермента могут быть легко установлены специалистом в рабочем порядке, исходя из общеизвестных сведений и приведенной информации. Например, для субтилизина, в частности субтилизина Carlsberg (например, Alcalase), температура может преимущественно составлять 25-60 С. В том случае, когда используется комбинация Alcalase и Cal-В,температура может предпочтительно составлять 30-55 С. Изобретение также касается всех возможных комбинаций различных воплощений и/или предпочтительных особенностей в соответствии со способом по изобретению, как описано в нем. Далее изобретение будет раскрываться на следующих примерах. Примеры Если не указано иначе, химикаты получали из коммерческих источников и использовали без дополнительной очистки. Спектры 1 Н-ЯМР снимали на ЯМР-спектрометре Bruker Avance 300 MHz NMR(300,1 МГц); химические сдвиги приводятся в ppmотносительно CDCl3 (7,26 ppm), если не указано иначе. Тонкослойную хроматографию (TLC) проводили на готовых пластинках из силикагеля 60 F254(Merck); пятна проявляли с помощью УФ-облучения или нингидрина. Молекулярные сита на 3 (8-12 меш, Acros) активировали при пониженном давлении при 200 С и на них хранили трет-бутанол (tBuOH). Перед использованием tBuOH нагревали до жидкого состояния(45 С). Колоночную хроматографию проводили на силикагеле Merck сорта 9385, 60. АналитическуюHPLC проводили на жидкостном хроматографе HP1090, используя обратнофазовую колонку (InertsilODS-3, С 18, 5 мкм, 1504,6 мм) при 40 С. Детектирование в УФ проводили при 220 нм на спектрометреUV-Vis 204 Linear. Профиль градиента: 0-25 мин при линейном градиенте от 5 до 98% элюента В и 25,130 мин при 5% элюента В (элюент А: 0,5 мл/л метансульфоновой кислоты (MSA) в H2O; элюент В: 0,5 мл/л MSA в ацетонитриле). Скорость протока составляла 1 мл/мин в течение 0-25,1 мин и 2 мл/мин в течение 25,2-29,8 мин, затем снова 1 мл/мин до прекращения через 30 мин. Вводимый объем составлял 20 мкл.Alcalase-CLEA приобретали у фирмы CLEA-Technologies, причем она содержала 3,5 мас.% воды; активность составляла 650 единиц AGE на 1 г (1 единица AGE катализирует образование 1 мкмоль Nацетилглицина из этилового эфира N-ацетилглицина при 40 С и рН 7,5). Перед использованием эту Alcalase-CLEA обрабатывали следующим образом: 1 г Alcalase-CLEA суспендировали в 20 мл tBuOH и дробили шпателем. После фильтрования эту процедуру повторяли с 20 мл МТВЕ.Cal-B (Novozymes, Novozym-435 из Candida antarctica, серия LC200204) использовали без какойлибо обработки. Контрольные соединения-дипептиды синтезировали химически следующим образом: 1,0 ммольHCl-соли амида аминокислоты или HCl-соли tBu-эфира аминокислоты растворяли в смеси из 10 млCHCl3 и 30 мл EtOAc, содержащей 355 мкл диизопропилэтиламина (DIPEA, 2,1 ммоль, 2,1 экв.). Этот раствор добавляли в раствор (0 С) из 1 ммоль N-Cbz-защищенной аминокислоты (1 экв.), 207 мг N-(3 диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида-HCl (EDCIHCl, 1,1 ммоль, 1,1 экв.) и 150 мг 7-аза-Nгидроксибензатриазола (HOAt, 1,2 ммоль, 1,2 экв.) в 20 мл CHCl3. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Раствор концентрировали in vacuo, остаток снова растворяли в EtOAc, промывали 20 мл водного раствора HCl (рН 3, три раза), 20 мл насыщенного NaCl, 20 мл насыщенного водного NaHCO3 (3 раза) и 20 мл насыщенного NaCl, сушили (Na2SO4) и концентрировали in vacuo. При необходимости проводили дополнительную колоночную хроматографию с использованием смеси EtOAc/нгептан, получая чистый дипептид. Метиловые эфиры N-Cbz-защищенных аминокислот синтезировали следующим образом: 100 мл МеОН охлаждали до -80 С в бане из сухого льда в ацетоне, а затем по каплям добавляли 4 мл SOCl2 (5,5 ммоль, 3,7 экв.). После этого добавляли 1,5 ммоль Cbz-защищенной аминокислоты, смесь вынимали из бани и перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Летучие вещества удаляли in vacuo, а оставшиеся в остатке летучие вещества удаляли вместе с МеОН (3 раза). Полученный остаток сушили в течение ночи in vacuo при комнатной температуре, получая чистый метиловый эфир N-Cbz-защищенной аминокислоты. Химический синтез карбамоилметиловых (Cam) или трифторэтиловых (Tfe) эфиров N-Cbzзащищенных аминокислот проводили следующим образом: 1,0 ммоль N-Cbz-защищенной аминокислоты растворяли в смеси из 30 мл EtOAc и 5 ммоль карбамоилметанола (CamOH) или 2,2,2-трифторэтанола(TfeOH) (5 экв.). После этого добавляли 207 мг EDCIHCl (1,1 ммоль, 1,1 экв.), 150 мг HOAt (1,2 ммоль,1,2 экв.) и 292 мкл три-этиламина (TEA, 1,1 ммоль, 1,1 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч. После этого добавляли 20 мл EtOAc и органическую смесь промывали 50 мл водного раствора HCl (рН 3, два раза), 50 мл деионизированной воды (2 раза) и 50 мл насыщенного NaCl, сушили (Na2SO4), концентрировали in vacuo и упаривали вместе с 10 мл толуола (2 раза). При необходимости проводили дополнительную колоночную хроматографию с использованием смеси EtOAc/н-гептан, получая чистый эфир. Данные 1 Н-ЯМР и HPLC по химически синтезированным исходным материалам и контрольным соединениямR1 и R2 = боковые цепи аминокислот X = СН 3, CH2C(O)NH2 или CH2CF3;Y = OtBu или NH2. Вносили 300 мг Alcalase-CLEA в смесь из 3 мл МТВЕ и 200 мг молекулярного сита на 3. После этого добавляли 100 мг эфира N-Cbz-защищенной аминокислоты и 1,0 экв. защищенной с С-конца аминокислоты. Смесь встряхивали при 50 С при 150 об/мин в течение 16 ч. После фильтрования твердые вещества промывали 10 мл EtOAc (3 раза). Объединенные органические слои промывали 25 мл насыщенного водного раствора NaHCO3 (3 раза), 25 мл водного раствора HCl (рН 3, три раза) и 25 мл насыщенного раствора NaCl, сушили (Na2SO4), концентрировали in vacuo и упаривали вместе с 20 мл толуола(2 раза) и 20 мл CHCl3 (2 раза). При необходимости проводили дополнительную колоночную хроматографию с использованием смеси EtOAc/н-гептан, получая чистый дипептид. Время удержания по HPLC и спектры 1 Н-ЯМР всех полученных дипептидов полностью соответствовали таковым у контрольных соединений. Выход полученных дипептидов приведен ниже в таблице.R = боковая цепь аминокислоты; X = CH2C(O)NH2 или CH2CF3. Синтезировали несколько Cam- и Tfe-эфиров по одной из методик 1, 2 или 3, приведенных ниже. Методика 1. Синтез Cam- или Tfe-эфиров с помощью алкалазы-CLEA. Вносили 300 мг Alcalase-CLEA в смесь из 3 мл МТВЕ, 200 мг молекулярного сита на 3, 200 мг карбамоилметанола или 2,2,2-трифторэтанола и 50 мг N-Cbz-защищенной аминокислоты. Смесь встряхивали при 50 С при 150 об/мин в течение 72 ч. После фильтрования твердые вещества промывали 10 млEtOAc (3 раза). Объединенные органические слои промывали 25 мл деионизированной воды (3 раза), 25 мл водного раствора HCl (рН 3, три раза) и 25 мл насыщенного раствора NaCl, сушили (Na2SO4), концентрировали in vacuo и упаривали вместе с 20 мл толуола (2 раза) и 20 мл CHO3 (2 раза). Методика 2. Синтез Cam- или Tfe-эфиров с помощью Cal-В. Вносили 100 мг Cal-В в смесь из 3 мл ацетонитрила, 100 мг молекулярного сита на 3, 200 мг карбамоилметанола или 2,2,2-трифторэтанола и 50 мг N-Cbz-защищенной аминокислоты. Смесь встряхивали при 50 С при 150 об/мин в течение 16 ч. После фильтрования твердые вещества промывали 10 млEtOAc (3 раза). Объединенные органические слои промывали 25 мл деионизированной воды (3 раза), 25 мл водного раствора HCl (рН 3, три раза) и 25 мл насыщенного раствора NaCl, сушили (Na2SO4), концентрировали in vacuo и упаривали вместе с 20 мл толуола (2 раза) и 20 мл CHCl3 (2 раза). При необходимости проводили дополнительную колоночную хроматографию с использованием смеси EtOAc/н-гептан,получая чистый эфир. Методика 3. Синтез Tfe-эфиров с помощью Cal-В. Вносили 100 мг Cal-В в смесь из 3 мл МВТЕ, 100 мг молекулярного сита на 3, 200 мг 2,2,2 трифторэтанола и 50 мг N-Cbz-защищенной аминокислоты. Смесь встряхивали при 50 С при 150 об/мин в течение 64 ч. Конверсию в соответствующий Tfe-эфир определяли методом HPLC. Пример 3. Энзиматический синтез дипептидов с использованием Cam- и Tfe-спирта в качестве добавкиR1 и R2 = боковые цепи аминокислот; X = СН 3, CH2C(O)NH2 или CH2CF3. Синтезировали несколько дипептидов по одной из методик 1-3, приведенных ниже. Методика 1. Синтез дипептидов с использованием Cam- или Tfe-спирта в качестве добавки с помощью алкалазы-CLEA. Вносили 300 мг Alcalase-CLEA в смесь из 3 мл МТВЕ, 200 мг молекулярного сита на 3 и 200 мг соответствующего спирта. После этого добавляли 50 мг N-Cbz-защищенной аминокислоты и 1 экв. амида аминокислоты. Смесь встряхивали при 50 С при 150 об/мин в течение 16 ч. Методика 2. Синтез дипептидов с использованием Cam- или Tfe-спирта в качестве добавки с помощью Cal-В. Вносили 100 мг Cal-В в смесь из 3 мл ацетонитрила, 200 мг молекулярного сита на 3 и 200 мг соответствующего спирта. После этого добавляли 50 мг N-Cbz-защищенной аминокислоты и 1 экв. амида аминокислоты. Смесь встряхивали при 50 С при 150 об/мин в течение 16 ч. Методика 3. Синтез дипептидов с использованием Cam- или Tfe-спирта в качестве добавки с помощью алкалазы-CLEA и Cal-В. Вносили 300 мг Alcalase-CLEA и 100 мг Cal-В в смесь из 3 мл ацетонитрила, 200 мг молекулярного сита на 3 и 200 мг соответствующего спирта. После этого добавляли 50 мг N-Cbz-защищенной аминокислоты и 1 экв. амида аминокислоты. Смесь встряхивали при 50 С при 150 об/мин в течение 16 ч. После фильтрования фермент промывали 10 мл EtOAc (3 раза). Объединенные органические слои промывали 25 мл деионизированной воды (3 раза), 25 мл водного раствора HCl (рН 3, три раза) и 25 мл насыщенного раствора NaCl, сушили (Na2SO4), концентрировали in vacuo и упаривали вместе с 20 мл толуола (2 раза) и 20 мл CHCl3 (2 раза). Пример 4. Энзиматический синтез Tfe-эфиров ди- и трипептидов с помощью Cal-В. Вносили 100 мг Cal-В в смесь из 3 мл метил-трет-бутилового эфира, 100 мг молекулярного сита на 3, 200 мг 2,2,2-трифторэтанола и 50 мг N-Cbz-защищенного ди- или трипептида. Смесь встряхивали при 50 С при 150 об/мин. Конверсию в соответствующий С-концевой Tfe-эфир отслеживали методомHPLC. Во всех случаях исходное соединение превращалось только в соответствующий С-концевой Tfeэфир. Время удержания при HPLC исходных соединений и продуктов - Tfe-эфиров (Р) приведено ниже в таблице. Из реакционной смеси брали образцы через 1, и/или 2, и/или 3, и/или 7 дней. Содержание продуктов - Tfe-эфиров (%Р), приведенное ниже в таблице, рассчитывали по формуле[н/о = не определяли] Реакционную смесь при эстерификации Cbz-Ala-Ala в Cbz-Ala-Ala-OTfe подвергали следующей обработке. Реакционную смесь, полученную через 7 дней, фильтровали, а твердые вещества промывали 10 мл EtOAc (3 раза). Объединенные органические слои промывали 25 мл деионизированной воды (3 раза),25 мл водного раствора HCl (рН 3, три раза) и 25 мл насыщенного раствора NaCl, сушили (Na2SO4) и концентрировали in vacuo. Из полученного остатка удаляли летучие вещества упариванием вместе с 20 мл толуола (2 раза) и 20 мл CHCl3 (2 раза). При хроматографической очистке продукта получали чистыйCbz-Ala-Ala-OTfe с выходом 85%. 1 Н-ЯМР (300 МГц, CDCl3)= 1.32 (d, J=7.4 Гц, 3H, CH3), 1.37 (d, J=7.3 Гц, 3H, СН 3), 4.13-4.24 (m,1H, CH), 4.29-4.40 (m, 1H, CH), 4.49-4.61 (m, 2H, OCH2CF3), 5.05 (s, 2H, CH2OCO), 5.18 (bs, 1H, NH),6.41 (bs, 1H, NH), 7.28 (m, 5H, CArH); 13 С-ЯМР (75 МГц, CDCl3)= 16.7, 16.8, 46.9, 49.4, 60.0, 66.1, 119.8, 123.5, 127.1, 127.3, 127.6, 138.3,170.2, 170.9. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ энзиматического синтеза пептидов, включающий энзиматическое получение эфира или тиоэфира из (i) защищенной с N-конца аминокислоты, С-концевого эфира защищенной с N-конца аминокислоты, защищенного с N-конца пептида или С-концевого эфира защищенного с N-конца пептида и(ii) спирта, представленного формулой НО-CX2-Z, или же тиола, представленного формулой HS-CX2-Z,где каждый X независимо означает атом галогена или атом водорода; a Z выбирается из группы sp3 гибридизованных атомов углерода, содержащих по меньшей мере два заместителя, содержащих гетероатом, присоединенный непосредственно к sp3-гибридизованному углероду, и sp2-гибридизованных атомов углерода, содержащих один или два заместителя, содержащих гетероатом, присоединенный непосредственно к sp2-гибридизованному углероду,причем получение эфира или тиоэфира осуществляется в реакционной среде, содержащей 2 мас.% или меньше воды, исходя из массы жидкости в реакционной среде; и энзиматическое присоединение полученного эфира или тиоэфира к необязательно защищенной с С-конца аминокислоте или необязательно защищенному с С-конца пептиду, при этом пептид синтезируется в реакционной среде, содержащей 2 мас.% или меньше воды, исходя из общей массы реакционной среды. 2. Способ по п.1, в котором присоединение осуществляется в присутствии фермента, используемого для катализа получения эфира или тиоэфира. 3. Способ по п.1 или 2, в котором получение эфира или тиоэфира либо присоединение катализируется по меньшей мере одним ферментом, выбранным из числа липаз, эстераз и протеаз. 4. Способ по п.3, в котором используется протеаза и фермент, выбранный из числа липаз и эстераз,причем по меньшей мере один из этих ферментов катализирует получение эфира или тиоэфира, а другой катализирует присоединение. 5. Способ по п.3, в котором и получение эфира или тиоэфира и присоединение катализируется одним ферментом, выбранным из числа липаз, эстераз и протеаз. 6. Способ по любому из пп.3-5, в котором используется липаза, выбранная из числа липаз из Candida, предпочтительно из Candida antarctica, в частности липаза В Candida antarctica. 7. Способ по любому из пп.3-6, в котором протеаза выбирается из числа карбоксипептидаз серинового типа, металлокарбоксипептидаз, карбоксипептидаз цистеинового типа, сериновых эндопептидаз,цистеиновых эндопептидаз, аспартатных эндопептидаз и металлоэндопептидаз. 8. Способ по п.7, в котором протеаза является сериновой эндопептидазой, выбранной из числа субтилизинов, предпочтительно субтилизином Carlsberg. 9. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором используется по меньшей мере один иммобилизованный фермент. 10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором получение эфира и присоединение осуществляется в реакционной среде, содержащей 1,0 мас.% или меньше воды, в частности 0,5 мас.% воды или меньше, более предпочтительно 0,1 мас.% или меньше воды. 11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором Z означает карбамоил, трифторметильную группу или трихлорметильную группу. 12. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором оба X означают водород. 13. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором получение эфира или тиоэфира осуществляется в присутствии необязательно защищенной с С-конца аминокислоты или необязательно защищенного с С-конца пептида, с которым будет соединяться получаемый эфир или тиоэфир, и в присутствии фермента, катализирующего реакцию присоединения. 14. Способ по любому из пп.1-12, в котором необязательно защищенная с С-конца аминокислота или необязательно защищенный с С-конца пептид добавляются после того, как будет получен эфир или тиоэфир. 15. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором присоединение осуществляется без предварительного выделения полученного эфира или тиоэфира из реакционной среды.