Биохимический синтез 1,4-бутандиамина
Номер патента: 11232
Опубликовано: 27.02.2009
Авторы: Носсин Петрус Мартинус Матеус, Эппельман Катрин, Вубболтс Марсель Герхардус, Кремер Сусанна Мария
Формула / Реферат
1. Способ биохимического синтеза 1,4-бутандиамина в микроорганизме, имеющем повышенный уровень активности орнитиндекарбоксилазы (повышенная активность ODC) по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазной активности, в котором повышенную орнитиндекарбоксилазную активность по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазной активности микроорганизма получают путем сверхэкспрессии гена, кодирующего орнитиндекарбоксилазу, с увеличенной трансляционной и/или транскрипционной эффективностью по сравнению с трансляционной и/или транскрипционной эффективностью при нативном уровне орнитиндекарбоксилазной активности микроорганизма, и 1,4-бутандиамин, продуцируемый микроорганизмом, секретируется в среду ферментации, и его извлекают из среды ферментации, характеризующийся тем, что увеличенную трансляционную и/или транскрипционную эффективность получают путем применения сильного регулируемого промотора, предпочтительно путем применения сильного индуцибельного промотора, выбранного из группы, состоящей из сильного промотора, индуцируемого изопропил-b-D-тиогалактозидом (IPTG), промоторов Т7, Т5, ptac и plac.
2. Способ по п.1, в котором ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, имеет сайт связывания рибосом (RBS), расположенный выше (up-stream) кодирующей области названного гена, и RBS адаптирован для достижения лучшего распознавания матрицы РНК рибосомами.
3. Способ по п.1 или 2, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы speF или speC (каждая из которых принадлежит к КФ 4.1.1.17).
4. Способ по п.3, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы speF.
5. Способ по любому из пп.3 или 4, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы speF или speC, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia и Shewanella.
6. Способ по п.5, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis и Shewanella oneidensis.
7. Способ по п.6, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном speF, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Salmonella typhimurium и Shewanella oneidensis.
8. Способ по любому из пп.1-7, в котором дополнительно к увеличенной активности орнитиндекарбоксилазы получают также увеличенную активность по меньшей мере для двух других ферментов посредством сверхэкспрессии либо (i) гена speA, кодирующего аргининдекарбоксилазу (принадлежащую к КФ 4.1.1.19), и гена speB, кодирующего агматиназу (принадлежащую к КФ 3.5.3.11), также называемого геном, кодирующим агматинуреагидролазу, или (ii) гена speA, кодирующего аргининдекарбоксилазу (принадлежащую к КФ 4.1.1.19), и гена aguA, кодирующего агматиниминогидролазу (принадлежащую к КФ 3.5.3.12), называемого также геном, кодирующим агматиндеиминазу, и гена aguB, кодирующего N-карбамоилпутресцинамидогидролазу (принадлежащую к КФ 3.5.1.53), и необязательно также гена speB, кодирующего агматиназу (принадлежащую к КФ 3.5.3.11).
9. Способ по п.8, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу, является геном speA аргининдекарбоксилазы, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Pasteurella и Neisseria.
10. Способ по п.9, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу, является геном speA аргининдекарбоксилазы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis, Pasteurella multocida и Neisseria meningitidis.
11. Способ по п.10, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиназу, является геном speB агматиназы, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio и Neisseria.
12. Способ по п.11, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиназу, является геном speB агматиназы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Shigella enterica, Proteus mirabilis, Photorhabdus lunimescens, Vibrio cholerae и Neisseria meningitidis.
13. Способ по п.12, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиниминогидролазу, и/или сверхэкспрессированный ген, кодирующий N-карбамоилпутресцинамидогидролазу, являются геном aguA агматиниминогидролазы и/или геном aguB N-карбамоилпутресцинамидогидролазы, происходящими из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium и Bacillus.
14. Способ по п.13, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиниминогидролазу, и/или сверхэкспрессированный ген, кодирующий N-карбамоилпутресцинамидогидролазу, являются геном aguA агматиниминогидролазы и/или геном aguB N-карбамоилпутресцинамидогидролазы, происходящими из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans, Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium aromaticivorans и Bacillus cereus.
15. Способ по любому из пп.1-14, который проводят при обеспечении повышенного внутриклеточного уровня орнитина.
16. Способ по любому из пп.1-15, который проводят в микроорганизме, выбранном из группы, состоящей из Saccharomyces sp., Bacillus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp. и Pichia sp.
17. Способ по любому из пп.1-16, который проводят в микроорганизме, выбранном из группы, состоящей из Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium sp., Escherichia sp., где микроорганизм имеет увеличенный уровень активности (i) аргининдекарбоксилазы и агматиназы или (ii) аргининдекарбоксилазы, агматиниминогидролазы и N-карбамоилпутресцинамидогидролазы по сравнению с нативным уровнем активности микроорганизма.
18. Микроорганизм, несущий один или более ферментов при повышенном уровне активности по сравнению с нативным уровнем активности одного или более ферментов в микроорганизме, упомянутых в одном или более из пп.1-17.
Текст
011232 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к новому способу биохимического синтеза 1,4-бутандиамина(номер CAS 110-60-1; соединение обозначается также как тетраметилендиамин; в биохимической литературе чаще называется путресцином) в микроорганизме, имеющем повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной активности по сравнению с исконно присущим уровнем орнитиндекарбоксилазной активности. Орнитиндекарбоксилазу ниже мы будем обозначать как ODC. Повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной активности ниже будем обозначать как повышенный уровень активности ODC. Известно, что в основном микроорганизмы, имеющие активность ODC, способны производить полиамины, такие как спермидин и спермин (общепринятые названия для продуктов N-(3-аминопропил)-1,4 бутандиамин и N,N'-бис-(3-аминопропил)-1,4-бутандиамин соответственно). Такие соединения, также как и сами различные короткие линейные диамины, такие, например, как 1,4-бутандиамин и 1,5 пентандиамин (называемый также кадаверином) в биохимических исследованиях часто называют полиаминами, хотя исходя из точного химического определения полиаминов следовало бы ожидать большего числа аминогрупп. Однако для целей настоящей патентной заявки будет применяться термин полиамины в его биохимическом значении, и, таким образом, он включает 1,4-бутандиамин. Уровень техники Соединение 1,4-бутандиамин является важным исходным материалом для производства некоторых основных инженерных пластмасс: полиамида-4,6 эфира либо в форме гомополимера или сополимеризованного, например, с 5 вес.% полиамид-6 мономером (капролактам). Гомополимер полиамид-4,6 (нейлон-4,6) был описан еще в 1938 г. (US-A-2, 130948, Carothers). Он представляет собой продукт поликонденсации мономеров 1,4-бутандиамина и адипиновой кислоты. В настоящее время соединения полиамида-4,6 производятся и продаются главным образом в Нидерландах под торговым названием STANYL. Для синтеза 1,4-бутандиамина известен ряд химических путей. Все эти химические способы имеют недостаток, заключающийся в том, что стартовые материалы должны быть получены из источников, которые рассматриваются как невозобновляемые. Однако существует реальная потребность в обеспечении новыми и подходящими способами синтеза 1,4-бутандиамина из возобновляемых источников углерода и в применении биохимических способов (также называемых биотрансформацией) в живых клетках. В основном полиамины рассматриваются как токсические соединения для любой клетки или микроорганизма, которые применяются в биохимическом производстве. Таким образом, до настоящего времени считали, что такие новые пути биохимического синтеза являются непривлекательными. Это, например, можно видеть из следующих ссылок: Fukuchi et al., J. Biol. Chem., т. 270 (1995), стр. 18831-18835; и Suzuki et al., Proc. Natl. Sci. USA, т. 91 (1994), стр. 8930-8934. Фукуши четко описал снижение жизнеспособности клеток (и синтеза почти всех видов белков),обусловленное аккумуляцией спермидина в дефицитных по спермидинацетилтрансферазе клетках Е. coli(то есть в клетках, где нет ацетилтрансферазы SpeG). Спермидин является продуктом, который в клетках продуцируется из 1,4-бутандиамина, используемого в качестве интермедиата. Соответственно, биосинтез 1,4-бутандиамина неминуемо приводит также к образованию спермидина. Сузуки и соавт., с одной стороны, также продемонстрировали (на клетках мышей), что сверхпродукция ODC приводит к аккумуляции полиаминов, особенно спермидина, и что при добавлении малых количеств спермидина уже наблюдается смерть клеток, даже в клетках, которые не дефицитны по speG. Необходимо отметить, что Лимсувум и соавт. (Limsuvum et al. J. Bacterid, т. 182 (2000) стр. 53735380) показали, что при низких температурах таких проблем можно избежать за счет сверхэкспрессии специально предназначенного гена speG. Сузуки и соавт. (цитировано выше) предположили, что при низких температурах пониженная жизнеспособность клеток обусловлена недостаточным ингибированием по пути обратной связи ODC антизимами, и это можно преодолеть путем сверхпродукции подходящего антизима. Такая сверхпродукция антизимов будет затем снижать продукцию полиаминов в клетках и, таким образом, этот путь не является реально возможным для продукции 1,4-бутандиамина. Кроме того, как описали Кашиваги и соавт. (Kashiwagi et al., J. Bacteriol. т. 170 (1988) стр. 31313135), содержание полиаминов в Е. coli может быть изменено за счет сверхэкспрессии гена, кодирующего ODC , в частности, конститутивно экспрессируемого speC. Для этих экспериментов при клонировании была применена плазмида pODC, произведенная Бойлем и соавт. (Boyle et al., Methods in Enzymology, т. 94 (1983), стр. 117-121). Как показали Кашиваги и соавт., даже 70-кратная сверхпродукция ODC specC при исходном контроле транскрипции и трансляции (то есть при применении нативных генетических элементов, включая сайт связывания рибосом (RBS) и промотор) приводит лишь к небольшому увеличению уровней суммарного содержания вне- и внутриклеточного 1,4-бутандиамина. Как можно видеть из цитированной работы Кашиваги и соавт., эти авторы не смогли достичь более высоких уровней продукции 1,4-бутандиамина, чем 25 мг/л (без подпитывания культуры орнитином). Более того, они показали,что сверхпродукция ODC приводит к существенному уменьшению содержания орнитина в клетках(примерно от 65 мкмоль/л менее чем до 1 мкмоль/л), и заключили, что клетки становятся дефицитными по орнитину в случае сверхпроизводства ODC. Кашиваги и соавт. попытались преодолеть наблюдаемое ограничение в уровне орнитина путем подпитывания клеток орнитином извне, но, хотя небольшое улучшение и было достигнуто, уровни продукции 1,4-бутандиамина не достигли более высоких значе-1 011232 ний, чем примерно 30 мг/л. Из-за описанного выше ограничения запаса предшественника при сверхэкспрессии ODC и, а поскольку и более того, из-за ожидания, что более высокие уровни белков, подобныхODC, будут вызывать возрастающие эффекты токсичности в клетках, обусловленные присутствием более высоких количеств полиаминов, специалист, с точки зрения цитированных выше работ, мог бы предположить, что будет невозможно обеспечить способы биохимического синтеза для продукции 1,4 бутандиамина со значительно более высоким уровнем чем 30 мг/мл. До сих пор ЕР-А-072640 является одним из немногих патентов, относящихся к биохимическому синтезу полиаминов, включая 1,4-бутандиамин. Однако он описывает, между прочим, продукцию 1,4 бутандиамина путем ферментации природных продуктов, включающих белки в качестве основного компонента. В названном способе природные продукты сначала обрабатывали путем проведения частичной или полной деградации, а затем любые нежелательные соединения (например, Hg, Cr, As, Cd, Se и Pb),ингибиторы роста клеток, пестициды, антибиотики, детергенты, мыла, жиры, масла, цианиды и фенолы удаляли до стадии ферментации. Путресцин и другие диамины, произведенные таким путем, повторно применяются как удобрения, но включает такое большое количество других субстратов, что они могут быть нежелательными в качестве исходного материала для продукции, например, полиамида-4,6. Соответственно сохраняется потребность в эффективном биосинтетическом пути для синтеза 1,4 бутандиамина со значительно более высоким титром чем 30 мг/л, предпочтительно даже без подпитки извне дорогим орнитином. Эта потребность в улучшении доступности 1,4-бутандиамина основана, главным образом, на намерении применять его в качестве стартового материала, например, для производства полиамида-4,6. В основном, пути получения 1,4-бутандиамина, известные на сегодняшний день, достаточно трудоемки и хлопотливы, и могут приводить к получению количества названного продукта, которое без дополнительной очистки трудно будет применять в производстве нейлона. Известные химические способы получения 1,4-бутандиамина требуют относительно дорогих исходных материалов и реактантов (включая реактанты, с которыми трудно обращаться) и относительно жестких условий реакции(температура и давление) с многостадийным и многореакторным дизайном, а также применение дорогих систем катализа. Соответственно сохраняется потребность в альтернативных способах получения 1,4 бутандиамина, предпочтительно из менее дорогих исходных материалов, и устранения проблем обращения с реактантами, подобными цианисто-водородной кислоте. Хорошо известно, что природные выращиваемые и, таким образом, возобновляемые материалы из сельскохозяйственной продукции являются основой для источников углерода, таких как глюкоза (или других подходящих источников углерода и их смесей), которые могут быть применены в ферментации. Такие возобновляемые материалы являются относительно дешевыми и доступными в больших количествах. В основном, рассматривается как очень выгодное, если возобновляемые материалы могут быть применены в качестве исходного материала для получения всех видов химических материалов. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенных возможностей для крупномасштабного промышленного производства 1,4-бутандиамина путем биотрансформации. Раскрытие изобретения Неожиданно изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что эта цель достигается с применением нового способа биохимического синтеза 1,4-бутандиамина в микроорганизме, имеющем повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной активности (повышенная активность ОДС) по сравнению с исходно присущим уровнем активности ODC, где увеличенная активность ODC получена посредством сверэкспрессии гена, кодирующего ODC, который имеет повышенную транскрипционную и/или трансляционную эффективность, и что 1,4-бутандиамин, производимый таким микроорганизмом путем биотрансформации, выделяется в ферментационную среду, и его извлекают из ферментационной среды. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением обеспечивается улучшенный биохимический способ для синтеза 1,4-бутандиамина, и полученный 1,4-бутандиамин великолепно подходит в качестве исходного материала, например, для производства полиамида-1,6. Осуществление изобретения Как предназначено в настоящей патентной заявке, термин биохимический синтез (термин, который в контексте этой патентной заявки рассматривается как биотрансформация) включает не только способы, в которые вовлечены (кроме ряда чисто химических реакционных стадий) одна или более биохимическая реакция с применением целых клеток подходящих для продукции штаммов, но также чисто биохимические процессы, применяющие целые клетки подходящих для продукции штаммов. Такие чисто биохимические способы рассматриваются соответственно как ферментации, в случае, если биохимический синтез начинается с подходящего источника углерода, или рассматривается как ферментации предшественника в случае, если биохимический синтез начинается от промежуточного продукта, уже имеющего углеродный скелет, из которого может быть получена молекула-мишень, которая должна быть синтезирована. Эти способы могут быть осуществляться либо в аэробных, либо в анаэробных условиях. Биокаталитические реакции в биохимических синтезах настоящего изобретения могут быть проведены либо in vivo, либо in vitro. В основном, способы in vivo являются способами, осуществляемыми в том случае, когда применяются живые клетки (термин живые клетки включает здесь также так назы-2 011232 ваемые покоящиеся клетки); способы in vitro, с другой стороны, обычно проводятся с применением лизатов клеток или (частично) очищенных ферментов. В соответствии с настоящим изобретением биохимический синтез проводится в микроорганизме. Это может быть сделано с применением целых клеток подходящих для продукции штаммов, но также может осуществляться с применением пермеабилизованных клеток; дифференциация между in vivo и in vitro не имеет, однако, большого смысла для способов, проводимых с пермеабилизованными клетками или с иммобилизованными клетками-хозяевами. Однако будет очевидно, что индивидуальные биокаталитические стадии способа изобретения, когда они проводятся, например, с применением иммобилизованных ферментов, и тому подобное, рассматриваются как эквиваленты таких стадий в биохимическом синтезе, как предназначено в настоящей заявке. Орнитиндекарбоксилазы (то есть ферменты, имеющие орнитиндекарбоксилазную активность, илиODC) являются ферментами, относящимися к классу К.Ф. 4.1.1.17. При суперпродукции уровень активности ODC можно легко сравнить с нативным (то есть не сверхпродуцированным) уровнем активностиODC в стандартных условиях (при 37 С в присутствии орнитина и PLP) в бесклеточных экстрактах, с применением в наборе реактивов Sigma Diagnostics для обнаружения двуокиси углерода, анализ описан у Остермана и coaвт. (Osterman, A.L. et al., 1994, Biochemistry 33, стр. 13662-12667). Специалист, соответственно, может легко установить, имеет ли применяемая ODC увеличенный уровень активности ODC,основанный на повышенной транскрипционной и/или трансляционной эффективности по сравнению с исходным уровнем активности ODC у микроорганизма, измеряя содержание белка или определяя уровень РНК. Различные стандартные способы определения содержания белка, например, колориметрический, а также спектроскопический, описаны у Лоттцпейха и Зорбаса (Lottspeich and Zorbas, Bioanalytik,Spekctrum Akademisher Verlag GmbH, Heidelberg/Berlin, ISBN 3-8274-0041-4 (1998), гл. 3, 5, 21, 22 и 24). Способы определения концентрации белка, а также уровня РНК, например, Нозерн-гибридизация, обратная транскрипция-ПЦР-анализ (RT-PCR) и многие другие методы описаны Самбруком и совт. (J.Harbor Laboratory Press, ISBN 0-879-309-6, 1989). Однако специалисту известны многие другие стандартные способы, применяемые в этой аналитической области, и нет потребности об их упоминании здесь. Подходящими орнитиндекарбоксилазами, которые могут быть применены в способе изобретения,являются все ферменты и мутанты этого, которые способны декарбоксилировать орнитин. Любой такой фермент может быть применен в способе изобретения при повышенном уровне активности, то есть в сверхпродуцированной форме, полученной путем сверхэкспрессии гена ODC с повышенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью. Кроме того, необходимо отметить, что термин повышенный уровень активности, как он применяется здесь для любой специфически названной ферментативной активности, предназначен для включения таких ситуаций, где такая ферментивная активность,например ODC, вообще не представлена в природном источнике микроорганизма, где реакция имеет место, но вводится туда преднамеренно путем генетической модификации с увеличенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью. Как упоминалось выше, в биохимическом синтезе 1,4-бутандиамина может быть применен любой фермент ODC, который имеет увеличенную ODC активность, полученный путем сверхэкспрессии гена,кодирующего ODC, с увеличенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью. Предпочтительно увеличенная транскрипционная и/или трансляционная эффективность обеспечивается за счет применения сильного регулируемого промотора, предпочтительно применением сильного индуцибельного промотора. Более предпочтительно, если увеличенная транскрипционная и/или трансляционная эффективность получена благодаря применению сильного промотора, индуцируемого изопропилтиогалактопиранозидом (IPTG). Подходящие сильные промоторы описаны Самбруком и совт. (J. Sambrook, E.F.Press, ISBN 0-879-309-6, 1989). В частности, увеличенная транскрипционная и/или трансляционная эффективность получена благодаря применению промотора, выбранного из группы, включающей Т 7, Т 5, ptac и plac промоторы. Для специалиста будет ясно, что оптимальный выбор промотора будет зависеть от того, какой хозяин и реакционные условия будут применяться. В очень предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий ODC, имеет сайт связывания рибосом (RBS), расположенный выше кодирующей области названного гена, RBS которого адаптирован для достижения лучшего распознавания матричной РНК рибосомами. Адаптация RBS может быть проведена любым способом, известным специалисту, и будет принимать во внимание специфические свойства примененного хозяина и тому подобное. Более предпочтительно, когда сверхэкспрессированный ген, кодирующий ODC, является геномODC speF или speC (каждый из ферментов относится к К.Ф. 4.1.1.17). До настоящего времени в литературе имелось больше данных об исследовании SpeC, чем SpeF. Однако наиболее неожиданно и наиболее предпочтительно, что лучшие результаты в соответствии с настоящим изобретением были достигнуты в случае, когда это был ген ODC speF. Особенно предпочтительно, что сверхэкспрессированный ген, кодирующий ODC, примененный в-3 011232 способе в соответствии с изобретением, является геном speF или speC, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia и Shewanella. ODCODC, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Shigellaflexneri, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis и Shewanella oneidensis. Более предпочтительно, когда сверхэкспрессированный ген, кодирующий ODC, является геном speF, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Salmonella typhimurium и Shewanella oneidensis. При сравнении с результатами, полученными с сверхэкспрессией конститутивной ODC, кодируемой геном speC, безусловно наилучшие результаты в соответствии с изобретением были достигнуты, когда применяли speF. В частности, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены все орнитиндекарбоксилазы, которые имеют достаточную, то есть по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65% идентичность с ODC ферментом сравнения из Е. coli, и способные катализировать ODC реакцию. Известны многие ODC, имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. coli. Определение процента идентичности с ферментом сравнения может быть выполнено способами,известными специалисту, например, путем применения белковой последовательности фермента сравнения как последовательность запроса для выполнения поиска в опубликованных базах данных, например идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такие поиски могут быть выполнены с применением программ BLAST (версия 2.2) и параметров по умолчанию соответствующей программы. См.: http:/www.ncbi.nlm.nih.gov. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением обеспечен улучшенный биохимический способ синтеза 1,4-бутандиамина, и полученный 1,4-бутандиамин прекрасно подходит в качестве исходного материала для производства полиамида-4,6 и/или других полиамидов. Будет ясно, что (в контексте настоящего изобретения) любой ген, будучи гомологичным любому из генов, кодирующих вышеназванные ODC, и кодирующий ферменты, имеющие орнитиндекарбоксилазную активность, достаточно сравнимую с показанными орнитиндекарбоксилазами, должны рассматриваться как их эквивалент и как подходящие для способа изобретения. Такие эквивалентные гены могут быть подходящим образом получены с помощью любой соответствующей стратегии клонирования, известной специалисту, например, способами, описанными здесь в экспериментальной части. Альтернативно такие эквивалентные гены ODC могут быть также получены путем целенаправленного конструирования. В дополнительном предпочтительном воплощении настоящего изобретения способ биохимического синтеза 1,4-бутандиамина проводится в микроорганизме, где дополнительно к ODC активности посредством сверхэкспрессии получают также увеличенную ферментативную активность для по меньшей мере двух других ферментов, либо(i) гена speA, кодирующего аргининдекарбоксилазу (относятся к К.Ф.4.1.1.19), и гена speB, кодирующего агматиназу (относится к К.Ф.3.5.3.11; обозначается также как ген, кодирующий агматинуреагидролазу); или(ii) гена speA, кодирующего аргининдекарбоксилазу (относится к К.Ф.4.1.1.19), и гена aguA, кодирующего агматиниминогидролазу (относится к К.Ф. 3.5.3.12; обозначается также как ген, кодирующий агматиндеиминазу), и гена aguB, кодирующего N-карбамоилпутресцинамидогидролазу (относится к К.Ф. 3.5.1.53), и необязательно также гена speB, кодирующего агматиназу (относится к К.Ф.3.5.3.11). Сверхэкспрессия, как предназначено для применения здесь, для этого дополнительного увеличения ферментативных активностей может быть достигнута любым способом, известным специалисту; например, путем увеличения транскрипционной и/или трансляционной эффективности соответствующего гена, но также любыми другими известными способами, такими как увеличение количества копий гена,или путем увеличения эндогенной активности или структуры ферментов путем мутаций, или путем применения дерегулированных ферментов. Как предназначено в части (i) дополнительного предпочтительного воплощения, упомянутая здесь выше комбинации SpeA и SpeB предназначена для представления любой функциональной комбинации (либо в комбинированном слитом белке, либо в виде раздельных ферментативных активностей) SpeA и SpeB. Фактически эта комбинация может быть также обозначена как SpeAB. Часть (ii) здесь отражает, что в таких комбинациях SpeA и SpeB сама SpeB часть может быть заменена любой функциональной комбинацией (либо в комбинированном слитом белке, либо в виде раздельных ферментативных активностей) AguA и AguB. Яновиц и соавт. (Janowitz et al., FEBS Letters 544 (2003) 258-261) описали, что агматиндеиминазаal., Microbiology, 149 (2003), 707-714), что превращения, катализируемые SpeB, могут также катализироваться ферментами, имеющимися у растений, а именно: комбинированным действием агматиндеиминазыAguA и N-карбамоилпутресцинамидогидролазы AguB. Соответственно вместо этого, или даже в комбинации со SpeB в контексте настоящего изобретения могут быть применены также AguA и AguB. Источ-4 011232 никами таких aguA и aguB генов могут быть Arabidopsis thaliana и Lycopersicon esculentum, но сравнимые гены могу быть обнаружены у мутантов Pseudomonas aeruginosa. Будет ясно, что (в контексте настоящего изобретения) любой ген, гомологичный любым генам, кодирующим вышеупомянутые аргининдекарбоксилазы, соответствующие агматиназы или агматиниминогидролазы или N-карбамоилпутресцинамидогидролазы, и кодирующий соответствующие ферменты,имеющие аргининдекарбоксилазную (соответственно агматиназу или агматиниминогидролазу, или Nкарбамоилпутресцинамидогидролазу) активности, достаточно сравнимые с соответствующими ферментами (в зависимости от обстоятельств), должны рассматриваться как их эквиваленты и подходящими для этого предпочтительного воплощения способа изобретения. Такие эквивалентные гены могут быть получены соответствующим способом посредством любой подходящей стратегии клонирования, известной специалисту, например, способами, описанными здесь в экспериментальной части. Альтернативно такие эквивалентные гены могут быть также получены путем целенаправленного конструирования. Соответственно в этом предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения используются также дополнительные комбинации сверхэкспрессированных генов, кодирующих (i) аргинидекарбоксилазу и агматиназу или (ii) аргининдекарбоксилазу и агматиниминогидролазу и Nкарбамоилпутресцинамидогидролазу и необязательно агматиназу. В этом дополнительном предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий сверхэкспрессированную аргининдекарбоксилазу, является предпочтительно геном аргининдекарбоксилазы speA,происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Shigella, Salmonella,Yersinia, Pasteurella и Neisseria. Более предпочтительно ген, кодирующих сверхэкспрессированную аргининдекарбоксилазу, является геном аргинидекарбоксилазы speA, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis,Pasteurella multocida и Neisseria meningitidis. В частности, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены все аргининдекарбоксилазы, которые имеют достаточную, например по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65% идентичность с аргининдекарбоксилазой из Е. coli (фермент сравнения), способные катализировать аргининдекарбоксилазную реакцию. Известны многие аргинидекарбоксилазы, имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. coli. В этом дополнительном предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий сверхэкспрессированную агматиназу, является геном агматиназы speB, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio и Neisseria. Более предпочтительно ген, кодирующих сверхэкспрессированную агматиназу, является геном агматиназыspeB, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Shigellaenterica, Proteus mirabilis, Photorhabdus luminescens, Vibrio cholerae и Neisseria meningitidis. В частности, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены все агматиназы, которые имеют достаточную, например по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65% идентичность с агматиназой из Е. coli (фермент сравнения), способные катализировать агматиназную реакцию. Известны многие агматиназы, имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Е. coli. Более того, в этом дополнительном предпочтительном воплощении изобретения ген, кодирующий сверхэкспрессированную агматиниминогидролазу и/или сверхэкспрессированную N-карбамоилпутресцинамидогидролазу, является предпочтительно геном агматининиминогидролазы aguA и/или геном Nкарбамоилпутресцинамидогидролазы aguB, происходящими из одного из родов, выбранных из группы,состоящей из Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium и Bacillus. Более предпочтительно ген, кодирующий сверхэкспрессированную агматинимидогидролазу и/илиN-карбамоилпутресцинамидогидролазу, является геном агматинимидогидролазы aguA и/или геном Nкарбамоилпутресцинамидогидролазы aguB, происходящим из одного из видов, выбранных из группы,состоящей из Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans, Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium aromaticivorans и Bacillus cereus. В частности, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены все агматинимидогидролазы и/или N-карбамоилпутресцинамидогидролазы, которые имеют достаточную, например по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 65% идентичность с агматиниминогидролазой и/или N-карбамоилпутресцинамидогидролазой из Pseudomonas (фермент сравнения), способные катализировать агматиниминогидролазную реакцию и/или N-карбамоилпутресцинамидогидролазную реакцию. Известны многие агматиниминогидролазы и/или N-карбамоилпутресцинамидогидролазы, имеющие такой относительно высокий уровень идентичности с ферментом сравнения из Pseudomonas. Предпочтительно, что способ в соответствии с изобретением осуществляется, пока есть гарантия повышенного внутриклеточного уровня орнитина. Это может быть достигнуто, например, путем подпитки культуры орнитином извне. Способ изобретения может осуществляться в любом подходящем организме-хозяине. Хозяева мо-5 011232 гут быть выбраны из групп продуцирующих организмов (или клеток), в основном известных специалисту в биосинтезе. Такие организмы могут быть эукариотической природы, или, что более предпочтительно, прокариотического происхождения. Эукариотические клетки, например, могут быть клетками растений или грибов, и из различных других групп, собирательно называемых Протисты. В частности, предпочтительно, чтобы процесс в соответствии с изобретением проводился в организме-хозяине, выбранном из группы, состоящей из Saccharomyces sp., Bacillus sp., Corymbacterium sp.,Escherichia sp. и Pichia sp. В способе изобретения особенно предпочтительно, чтобы организм, применяемый в качестве хозяина, был способен производить аминокислоты орнитин и/или аргинин. Для большей части природных микроорганизмов это требование удовлетворяется, поскольку обычно такая способность является ценной во всех штаммах дикого типа, так как аргинин является незаменимой аминокислотой. Из этих видов Escherichia sp. является предпочтительными, поскольку с ними легко обращаться при генетических манипуляциях, для того чтобы обеспечить штаммы с желаемыми сверхэкспрессированными ферментативными активностями. Более того, Escherichia sp. уже в природе включает все вышеупомянутые ферментативные активности (то есть кроме генов agu из растений), так что большая часть сверхэкспрессированных генов может быть применена как гомологичные гены. Также Corybacterium sp. (хотя у него отсутствует природная орнитиндекарбоксилаза) является особенно предпочтительным, поскольку он является подходящим штаммом, производящим глутамат, с которым можно легко обращаться в процессах ферментации. В способе настоящего изобретения глутамат является очень подходящим предшественником. Соответственно, способ предпочтительно осуществляется в штамме хозяина, способном образовывать глутамат (например, Corynebacterium glutamaticum). Наилучшие результаты достигаются, когда способ в соответствии с изобретением осуществляется в организме-хозяине из группы, состоящей из Saccharomyces cereviciae, Corynebacterium sp. и Escherichiasp., где в микроорганизме-хозяине кроме активности ODC на высоком уровне представлены ферментативные активности аргининдекарбоксилазы и, по меньшей мере, агматиназы или агматиниминогидролазы и N-карбамоилпутресцинамидогидролазы по сравнению с исходным уровнем названных ферментативных активностей, представленных в микроорганизме-хозяине с увеличенным уровнем активности по сравнению с нативным уровнем названной ферментативной активности, являющейся гомологом в микроорганизме-хозяине. Будет ясно, что способ изобретения предпочтительно осуществляется в реакционных условиях, которые также являются обычными, как условия ферментации. Способ, таким образом, может быть осуществлен как периодический, но также (если желательно) как периодический с подпитыванием культуры. Можно для удобства обеспечить, чтобы организм, применяемый в качестве хозяина, имел или обеспечивался подходящей системой для экспорта образованного 1,4-диаминобутана, предпочтительно, чтобы такой системой для экспорта была нативная система. Настоящее изобретение, конечно, включает также все векторы, плазмиды и хозяев, несущих, при повышенных уровнях активности, одну или более вышеупомянутых ферментативных активностей в соответствии с прилагаемой формулой изобретения. Изобретение будет теперь разъяснено посредством некоторых экспериментальных результатов, которые приведены без намерения ограничить рамки изобретения. Экспериментальная часть Основные процедуры. Были применены стандартные процедуры для всех манипуляций с ДНК (Sambrook, J. et al. (1989),Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New-York). ДНК была амплифицирована из хромосомной ДНК Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al. (2000) J. Bacteriol. 182, 4443-4452), если не указано другое. ПЦР-амплификация была выполнена с применением ферментов с коррелирующей активностью SAWADY Pro-DNA-Polymerase (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Германия) или Platinum PfxDNA Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) в соответствии с протоколами производителей, в то время как верификация сконструированных штаммов была проведена путем ПЦР колоний с применением Taq полимеразы READYMIX (Sigma, Taufkirchen, Германия). Рестрикционные сайты для последующего клонирования, а также дополнительные мутации были введены с олигонуклеотидами, купленными у фирмы MWG-Biotech (Ebersberg, Германия). Фрагменты ДНК были очищены с применением набораMinElute Gel Extraction (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Приготовление плазмидной ДНК выполняли с применением набора QIAprep spin Miniprep (Qiagen, Hilden,Германия). Верификация сконструированных плазмид проводилась путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования (Agowa, Berlin, Германия). Конструирование плазмид.(i) Конструирование плазмиды pDAB3 (pJF119EH-speCnRBS). Ген speC E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры), кодирующий конститутивную биосинтетическую орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор pJF119EH (Furste,J.P. et al. (1986) Gene 48, 119-131), что позволяет обеспечить сильную экспрессию гена, основанную на-6 011232 транскрипционном контроле под изопропилД-тиогалактопиранозид (IPTG)-индуцибельным tac промотором и lac репрессорной системой (laclQ). Таким образом, кодирующий ген speC был клонирован с исходными RBS, стартовым и стоп-кодоном. Фрагмент ДНК, включающий speCnRBS из 2235 п.о., был амплифицирован из хромосомной ДНК Е.(мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Sphl - курсивом). После заключительной модификации эндонуклеазами Xbal и Sphl ПЦР-продукт был лигирован в плазмиду pJF119EH, которая была разрезана таким же образом. После трансформации в клетки Е. coliDH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, содержащим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды pDAB3 (pJF119EHspeCnRBS, 7491 bp) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.(ii) Конструирование плазмиды pDAB4 (pJF119EH-speCnRBS). Ген speC E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. общие методы), кодирующий конститутивную биосинтетическую орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор pJF119EH (Furste, J.P. etal. (1986) Gene 48, 119-131), что позволяет обеспечить сильную экспрессию гена, основанную на транскрипционном контроле под изопропилД-тиогалактопиранозид (IPTG)-индуцибельным tac промотором и lac репрессорной системой (laclQ). Таким образом, кодирующий ген speC был клонирован с оригинальным стартовым и стоп-кодоном. Поскольку для гена speC, применяемого в исследованиях in silico, не было определено консервативного RBS, к консенсусной последовательности Е. coli путем точечного мутагенеза был адаптирован RBS, расположенный на 7 п.о. выше стартового кодона SpeC. Фрагмент ДНК из 2235 п.о., включающий speCaRBS, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е.(мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Sphl - курсивом). После заключительной модификации эндонуклеазами Xbal и Sphl, продукт ПЦР был лигирован в плазмиду pJF119EH, которая была разрезана тем же способом. После трансформации клеток Е. coliDH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, содержащим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды pDAB4 (pJF119EHspeCnRBS, 7491 bp) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.(iii) Конструирование плазмиды pDAB2 (pJF119EH-speF). Ген speF E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры), кодирующий индуцибельную биодеградирующую орнитиндекарбоксилазу, был клонирован в экспрессионный вектор pJF119EH(Furste, J.P. et al. (1986) Gene 48, 119-131). Этот вектор позволяет обеспечить высокий уровень продукции белка, основанный транскрипционном контроле клонированных генов под изопропилДтиогалактопиранозид (IPTG)-индуцибельным tac промотором и lac репрессорной системой (laclQ). Для конструирования экспрессионной плазмиды pDAB2 (pJF119EH-speF) кодирующий ген speF был клонирован с исходными RBS (сайт связывания рибосом), стартовым и стоп-кодоном. Фрагмент ДНК из 2247 п.о., включающий speF, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е. coli(мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Xbal - курсивом). В заключении фрагмент был модифицирован эндонуклеазами Kpnl и Xbal и лигирован в экспрессионный вектор pJF119EH, который был разрезан тем же способом. После трансформации клеток Е. coliDH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, содержащим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды pDAB2 (pJF119EH speF,7502 bp) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.pJF119EH (Furste, J.P. et al. (1986) Gene 48, 119-131), что позволяет обеспечить высокий уровень продукции белка, что основано на транскрипционном контроле клонированных генов под изопропилДтиогалактопиранозид (IPTG)-индуцибельным tac промотором и lac репрессорной системой (laclQ). Этот путь позволяет сохранить оригинальную структуру оперона генов, а также RBS, стартовый и стопкодоны. Фрагмент ДНК из 3079 п.о., включающий speAB, был амплифицирован из хромосомной ДНК Е.(мутации показаны жирным шрифтом, рестрикционный сайт Sphl - курсивом). После заключительной модификации эндонуклеазами Xbal и Sphl, фрагмент ДНК был лигирован в экспрессионную плазмиду pJF119EH, которая была разрезана тем же способом. После трансформации клеток Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, содержащим 100 мг/л ампицилина. Верификацию полученной плазмиды pDAB7(pJFl 19EH speAB, 8339 bp) после приготовления проводили путем рестрикционного анализа и последующего секвенирования.(v) Конструирование плазмиды pDAB8 (pJF119EH-speF-speAB). Для того чтобы обеспечить параллельную продукцию орнитиндекарбоксилазы SpeF, аргининдекарбоксилазы SpeA и агматиназы SpeB, гены speAB E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см основные процедуры), были клонированы в экспрессионный вектор pDAB (см. iii). Путем расщепления плазмиды pDAB7 (см. iv) рестрикционными эндонуклеазами Xbal и Sphl, был отделен оперон, включающий гены speAB, размером 3067 п.о., который был лигирован в плазмидуpDAB2 (см. iii), включающую speF. Далее плазмида была разрезана таким же образом. После трансформации в клетки Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Германия), трансформированные клетки были отобраны на чашках с LB агаром, содержащим 100 мг/л ампицилина. Полученная плазмида pDAB8(pJF119EH speFAB, 10547 bp), позволяющая обеспечить параллельную продукцию SpeFAB, была верифицирована после получения рестрикционным анализом. Пример 1. Улучшение продукции 1,4-бутандиамина благодаря сверхэкспрессии кодирующих орнитиндекарбоксилазу генов с увеличенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью. Пример 1.1. Продукция 1,4-бутандиамина путем сверхэкспрессии орнитиндекарбоксилазы (в качалочных колбах). Влияние сверхэкспрессии генов ODC speF или speC (с увеличенной транскрипционной и/или трансляционной эффективностью) на продукцию 1,4-бутандиамина было исследовано в штамме-хозяине Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см. основные процедуры), несущем плазмиду pDAB2 (см. (iii илиpDAB3 (см. (i или pDAB4 (см. (ii. Эти штаммы были тестированы в экспериментах с качалочными колбами с применением минимальной солевой среды, включающей MgSO47H2O (300 мг/л), CaCl2 или 2H2O (15 мг/л), KH2PO4 (3 г/л),K2HPO4 (12 г/л), NaCl (100 мг/л), (NH4)2SO4 (5 г/л), Na цитрат 3H2O (1 г/л), FeSO47H2O (75 мг/л), тиамин-HCl (витамин B1) (5 мг/л), а также микроэлементы Al2(SO4)318H2O (3 мг/л), CoCl26H2O (1,05 мг/л), CuSO45H2O (3,75 мг/л), H3BO3 (0,75 мг/л), MnCl24H2O (30 мг/л), Na2MoO42H2O (4,5 мг/л),NiSO46H2O (3 мг/л), ZnSO47H2O (22,5 мг/л). Основной раствор глюкозы (500 г/л) был автоклавирован отдельно и добавлен к стерилизованной среде до конечной концентрации 10 г/л. В прекультуру с минимальной солевой средой, включающей 100 мг/л ампицилина, добавляли 1-5 мкл/мл основного раствора микроорганизмов на мл и инкубировали при 33 С и 180 об./мин в течение 16 ч до оптической плотности 2 при 620 нм. 5 мл этой культуры впоследствии применяли для заражения основной культуры, включающей 50 мл той же среды, которую инкубировали в течение 24 ч при 33 С и 180 об./мин. Как только клетки достигали оптической плотности 1,5 при 620 нм (через 7 ч), была индуцирована экспрессия гена путем добавления 50 мкМ IPTG. Для того чтобы наблюдать продукцию 1,4-бутандиамина во времени, при культивации через различные интервалы времени были отобраны образцы. После отделения клеток центрифугированием разведенный супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения. Содержащиеся амины обнаруживали как производные ортофталевогодиальдегида при длине волны света 230 нм на приборе Hewlett-Packard серии 1100 с применением С 18-обращенно-фазовой колонки (Nucleosil 120-5 C18, MachereyNagel, Duren, Германия), уравновешенной 50% буфером В (буфер А, 0,1 М ацетат натрия, рН 7,2; буфер В метанол). Для разделения был применен следующий градиент: 1-7 мин линейный градиент буфера В от 50 до 70% со скоростью 0,5 мл/мин, 7-13 мин от 75 до 85% буфера В со скоростью 0,5 мл/мин, 13-14,5 мин от 85 до 50% буфера В со скоростью 1 мл/мин, 14,5-17 мин 50% буфера В-8 011232 со скоростью 15 мл/мин и 17-20 мин 50% буфер В со скоростью 0,5 мл/мин. С применением стандартных веществ для калибровки были определены следующие концентрации 1,4-бутандиамина (см. табл. 1), которые были верифицированы ЯМР-спектроскопией. Таблица 1 Образование 1,4-бутандиамина с применением суперпродукции ODC в Е. coli Пример 1.2. Продукция 1,4-бутандиамина путем суперпродукции ODC с культивацией в периодическом режиме с подпиткой (2 л). Потенциал ферментативной продукции 1,4-бутандиамина был исследован в условиях периодической культуры с подпиткой с применением штамма-продуцента LJ110 pDAB2, продуцирующего 1,4 бутандиамин в высоких концентрациях, в биореакторе Labfors (Infors, Einsbach, Германия). Поскольку рост штамма, продуцирующего 1,4-бутандиамин, не зависит от аминокислот, для того чтобы ограничить рост клеток, был применен разработанный протокол для культивации, лимитированной фосфатом. Таким образом, была применена минимальная солевая среда, ограниченная по фосфату, включающая MgSO47H2O (3 г/л), CaCl22H2O (15 мг/л), KH2PO4 (400 мг/л), NaCl (1 г/л), (NH4)2SO4 (5 г/л), а также микроэлементы Al2(SO4)318H2O (3 мг/л), CoCl26H2O (1,05 мг/л), CuSO45H2O (3,75 мг/л), H3BO3 (0,75 мг/л),MnCl24H2O (30 мг/л), Na2MoO42H2O (4,5 мг/л), NiSO46H2O (3 мг/л) и ZnSO47H2O (22,5 мг/л). После автоклавирования в стерильных условиях в биореактор были добавлены цитрат натрия 3H2O (1,5 г/л), FeSO47 H2O (112,5 мг/л), тиамин-HCl (витамин В 1) (7,5 мг/л), ампицилин (100 мг/л) и глюкоза (10 г/л). В прекультуру с минимальной солевой средой (см. 1.1), содержащей 100 мг/л ампицилина, добавляли 1-5 мкл основного раствора микроорганизмов на мл и инкубировали при 33 С и 180 об./мин до оптической плотности при 620 нм, равной 2. Затем эту культуру в соотношении 1:10 применяли для заражения основной культуры, содержащей 2 л ограниченной по фосфату минимальной солевой среды. Во время культивации температура постоянно поддерживалась равной 33 С, а рН - в пределах 6,80,1 за счет добавления 5N KOH. Во время роста была использована стабильная скорость перемешивания 1500 об./мин. Для того чтобы устранить ограничения в поступлении кислорода во время культивации, поток газа в сосуд был увеличен от 2,5 до 10 л/мин. Если было необходимо, то добавляли пеногасительDehysan. Клетки были индуцированы добавлением 50 мкм IPTG при оптической плотности (620 нм), равной 5, с последующей комбинированной подпиткой глюкозой (500 г/л)/сульфатом аммония (200 г/л), в то время как скорость подпитки была адаптирована, для того чтобы получить стабильную концентрацию глюкозы 10 г/л и 1,5 г/л аммония. Через 2 ч после индукции была начата подкормка фосфатом, включающая 18 г/л KH2PO4 со скоростью 7 мл/ч, которая продолжалась 8 ч. Этим способом рост клеток мог бы быть ограничен до достижения оптической плотности при длине волны 620 нм 50. Для того чтобы наблюдать зависимую от времени продукцию 1,4-бутандиамина, через различные временные интервалы во время инкубации были взяты образцы. После отделения клеток путем центрифугирования супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения (см. 1.1.), определяя 1,4-бутандиамин в количестве 5,1 г/л (0,403 г/г сухого веса биомассы) и верифицируя эти данные с применением ЯМР-спектроскопии. Пример 2. Продукция 1,4-бутандиамина в периодической культуре, начиная с орнитина и аргинина(качальная колба). Для демонстрации дополнительного улучшения образования 1,4-бутандиамина, начиная с ортинитина, а также с аргинина, было исследовано влияние комбинированной суперпродукции орнитиндекарбоксилазы SpeF (с повышенной транскрипционной эффективностью), аргининдекарбоксилазы SpeA и агматиназы SpeB. Поэтому была осуществлена культивация в качальных колбах в минимальной солевой среде (см. 1.1) штамма-хозяина Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., см общие методы), несущего плазмиду pDAB8 (см.(v. По этой причине предварительную культуру с минимальной солевой средой, содержащей 100 мг/л ампицилина, добавляли 1-5 мкл/мл основного раствора и проинкубировали при 33 С, 180 об./мин до оптической плотности при 620 нм, равной 2. 5 мл этой культуры затем было использовано для заражения основной культуры, содержащей 50 мл той же среды, которую инкубировали в течение 24 ч при 33 С и 180 об./мин. Как только клетки достигали оптической плотности 1,5 при длине волны 620 нм (после 7 ч), была индуцирована экспрессия гена путем добавления 10 мкМ IPTG. Для наблюдения за продукцией 1,4-бутандиамина в зависимости от времени в различные моменты-9 011232 времени культивации были взяты образцы. После отделения клеток центрифугированием супернатант анализировали с применением жидкостной хроматографии высокого разрешения (ВЭЖХ) (см. 1.1). При применении для калибровки стандартных веществ были определены следующие концентрации 1,4 бутандиамина (см. табл. 2). Таблица 2 Образование 1,4-бутандиамина из орнитина, а также из аргинина в Е. coli. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ биохимического синтеза 1,4-бутандиамина в микроорганизме, имеющем повышенный уровень активности орнитиндекарбоксилазы (повышенная активность ODC) по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазной активности, в котором повышенную орнитиндекарбоксилазную активность по сравнению с нативным уровнем орнитиндекарбоксилазной активности микроорганизма получают путем сверхэкспрессии гена, кодирующего орнитиндекарбоксилазу, с увеличенной трансляционной и/или транскрипционной эффективностью по сравнению с трансляционной и/или транскрипционной эффективностью при нативном уровне орнитиндекарбоксилазной активности микроорганизма, и 1,4 бутандиамин, продуцируемый микроорганизмом, секретируется в среду ферментации, и его извлекают из среды ферментации, характеризующийся тем, что увеличенную трансляционную и/или транскрипционную эффективность получают путем применения сильного регулируемого промотора, предпочтительно путем применения сильного индуцибельного промотора, выбранного из группы, состоящей из сильного промотора, индуцируемого изопропилD-тиогалактозидом (IPTG), промоторов Т 7, Т 5, ptac и plac. 2. Способ по п.1, в котором ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, имеет сайт связывания рибосом (RBS), расположенный выше (up-stream) кодирующей области названного гена, и RBS адаптирован для достижения лучшего распознавания матрицы РНК рибосомами. 3. Способ по п.1 или 2, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы speF или speC (каждая из которых принадлежит к КФ 4.1.1.17). 4. Способ по п.3, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы speF. 5. Способ по любому из пп.3 или 4, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы speF или speC, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia и Shewanella. 6. Способ по п.5, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном орнитиндекарбоксилазы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis и Shewanella oneidensis. 7. Способ по п.6, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу, является геном speF, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichiacoli, Salmonella typhimurium и Shewanella oneidensis. 8. Способ по любому из пп.1-7, в котором дополнительно к увеличенной активности орнитиндекарбоксилазы получают также увеличенную активность по меньшей мере для двух других ферментов посредством сверхэкспрессии либо (i) гена speA, кодирующего аргининдекарбоксилазу (принадлежащую к КФ 4.1.1.19), и гена speB, кодирующего агматиназу (принадлежащую к КФ 3.5.3.11), также называемого геном, кодирующим агматинуреагидролазу, или (ii) гена speA, кодирующего аргининдекарбоксилазу(принадлежащую к КФ 4.1.1.19), и гена aguA, кодирующего агматиниминогидролазу (принадлежащую к КФ 3.5.3.12), называемого также геном, кодирующим агматиндеиминазу, и гена aguB, кодирующего Nкарбамоилпутресцинамидогидролазу (принадлежащую к КФ 3.5.1.53), и необязательно также гена speB,кодирующего агматиназу (принадлежащую к КФ 3.5.3.11). 9. Способ по п.8, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу, является геном speA аргининдекарбоксилазы, происходящим из одного из родов, выбранных из группы,состоящей из Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Pasteurella и Neisseria. 10. Способ по п.9, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий аргининдекарбоксилазу,является геном speA аргининдекарбоксилазы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы,состоящей из Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis, Pasteurella multocida иNeisseria meningitidis. 11. Способ по п.10, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиназу, является геном speB агматиназы, происходящим из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio и Neisseria. 12. Способ по п.11, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиназу, является ге- 10011232 ном speB агматиназы, происходящим из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Shigella enterica, Proteus mirabilis, Photorhabdus lunimescens, Vibrio cholerae и Neisseria meningitidis. 13. Способ по п.12, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиниминогидролазу,и/или сверхэкспрессированный ген, кодирующий N-карбамоилпутресцинамидогидролазу, являются геном aguA агматиниминогидролазы и/или геном aguB N-карбамоилпутресцинамидогидролазы, происходящими из одного из родов, выбранных из группы, состоящей из Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium и Bacillus. 14. Способ по п.13, в котором сверхэкспрессированный ген, кодирующий агматиниминогидролазу,и/или сверхэкспрессированный ген, кодирующий N-карбамоилпутресцинамидогидролазу, являются геном aguA агматиниминогидролазы и/или геном aguB N-карбамоилпутресцинамидогидролазы, происходящими из одного из видов, выбранных из группы, состоящей из Pseudomonas aeruginosa, Streptococcusmutans, Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium aromaticivorans и Bacillus cereus. 15. Способ по любому из пп.1-14, который проводят при обеспечении повышенного внутриклеточного уровня орнитина. 16. Способ по любому из пп.1-15, который проводят в микроорганизме, выбранном из группы, состоящей из Saccharomyces sp., Bacillus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp. и Pichia sp. 17. Способ по любому из пп.1-16, который проводят в микроорганизме, выбранном из группы, состоящей из Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium sp., Escherichia sp., где микроорганизм имеет увеличенный уровень активности (i) аргининдекарбоксилазы и агматиназы или (ii) аргининдекарбоксилазы,агматиниминогидролазы и N-карбамоилпутресцинамидогидролазы по сравнению с нативным уровнем активности микроорганизма. 18. Микроорганизм, несущий один или более ферментов при повышенном уровне активности по сравнению с нативным уровнем активности одного или более ферментов в микроорганизме, упомянутых в одном или более из пп.1-17.
МПК / Метки
МПК: C12N 9/88, C12P 13/00, C12N 9/10
Метки: 1,4-бутандиамина, синтез, биохимический
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/15-11232-biohimicheskijj-sintez-14-butandiamina.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Биохимический синтез 1,4-бутандиамина</a>
Предыдущий патент: Пролекарство возбуждающей аминокислоты и его применение
Следующий патент: Применение модифицированного вируса осповакцины анкара для вакцинации новорожденных
Случайный патент: Дозирующий насос