Усеченный по амино-концу хемокин rantes и способы его использования

1 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к усеченным по амино-концу RANTES, у которых отсутствуют NН 2-концевые аминокислоты, соответствующие аминокислотным остаткам 1-2 природного RANTES, и которые обладают антагонистической активностью против хемокинов; а также к кДНК-последовательностям, кодирующим такие RANTES, к их применению для лечения и/или диагностики заболеваний, терапия которых основана на антагонистической активности в отношении хемокинов МСР-3,MCP-1, MCP-1 и RANTES, и к фармацевтическим композициям, содержащим указанныеRANTES. Предпосылки создания изобретения Хемокины представляют семейство малых провоспалительных цитокинов, обладающих свойствами, стимулирующими хемотаксис и активацию лейкоцитов. В зависимости от положения первых цистеинов, это семейство хемокинов может быть подразделено на С-С-, С-ХС- и С-Х 3-С-хемокины (Baggiolini M. et al., 1994;Baggiolini M. et al., 1997 и Taub D. et al., 1996). Многие С-Х-С-хемокины, такие как интерлейкин-8 (IL-8), являются факторами, вызывающими хемотаксис нейтрофилов, тогда как СС-хемокины, такие как моноцитарный хемотаксический белок-3 (МСР-3), являются активными по отношению к ряду лейкоцитов, включая моноциты, лимфоциты, эозинофилы, базофилы,NK-клетки и дендритные клетки.NH2-концевой домен хемокинов, участвующий в связывании с рецептором и NH2 концевом процессинге, может либо активировать хемокины, снижать активность хемокинов,либо делать хемокины полностью неактивными. Основный белок тромбоцитарного С-Х-Схемокина становится хемотаксическим пептидом для нейтрофилов (NAP-2) только после удаления 24 NН 2-концевых остатков (Walz A. etal., 1989 и Van Damme J. et al., 1990). Делеция вплоть до 8 NН 2-концевых остатков у IL-8 приводит к увеличению хемотаксической активности, но дополнительное отщепление мотива Glu-Leu-Arg, который расположен перед первым Суs во всех нейтрофильных хемотаксических С-Х-С-хемокинах, приводит к их полной инактивации (Clark-Lewis I. etat., 1991). Аналогичный NH2-концевой протеолиз(вплоть до 8 аминокислот) другого С-Х-Схемокина, гранулоцитарного хемотаксического белка-2 (GCP-2), не оказывает влияния на хемотаксическую активность нейтрофилов (Proost P.RANTES (акроним "Regulated upon Activation, Normally T Expressed and presumably Secreted") представляет собой С-С-хемокин,кДНК-клон которого был выделен из кДНКбиблиотеки, обогащенной Т-клеточно-специфическими последовательностями (Schall T.J. et al.,1988).NН 2-концевых аминокислот, являются неактивными по отношению к моноцитам и могут быть использованы как антагонисты рецепторов(Gong J. et al., 1996; и Gong J. et al., 1995). Удлинение RANTES на один метионин приводит к полной инактивации молекулы, иMet-RANTES начинает действовать как антагонист для аутентичного RANTES (Proudfoot A.E.et al., 1996). Описание изобретения Главной целью настоящего изобретения является получение усеченного по амино-концуRANTES, у которого отсутствует NH2-концевые аминокислоты, соответствующие аминокислотным остаткам 1-2 природного RANTES, и который обладает антагонистической активностью против хемокинов. Конкретной целью настоящего изобретения является получение RANTES (3-68), у которого отсутствуют первые 2 аминокислоты, как показано на фиг. 1 и в SEQ ID No: 2. Такой усеченный по амино-концу RANTES настоящего изобретения может присутствовать в гликозилированной или в негликозилированной форме. Термин "антагонист хемокинов" означает"антагонист, который оказывает антагонистическое действие на зрелые полноразмерные природные хемокины". Другой целью настоящего изобретения является получение ДНК-молекул, содержащих ДНК-последовательности, кодирующие усеченный по амино-концу RANTES настоящего изобретения, включая нуклеотидные последовательности, кодирующие, в основном, тот жеRANTES. кДНК-последовательность интактного RANTES описана Schall T.J. et al. (1988), а кДНК усеченного RANTES может быть легко выведена. Термин "нуклеотидные последовательности, кодирующие, в основном, тот же RANTES",означает все другие нуклеотидные последовательности, которые вследствие вырожденности генетического кода также кодируют данные аминокислотные последовательности. Настоящее изобретение также относится к экспрессирующим векторам, которые содержат вышеуказанные ДНК, к клеткам-хозяевам,трансформированным такими векторами, и к способу получения указанных усеченных по амино-концу RANTES настоящего изобретения путем культивирования указанных трансформированных клеток в соответствующих культуральных средах. ДНК-последовательность,кодирующая белки настоящего изобретения, может быть встроена и лигирована в соответствующую плазмиду. После ее продуцирования, экспрессирующий вектор вводят в подходящую клетку 3 хозяина, которая затем экспрессирует вектор(ы) с получением нужного белка. Экспрессия любого рекомбинантного белка настоящего изобретения, упоминаемого в данном описании, может быть осуществлена в эукариотических клетках (например, в клетках дрожжей, насекомых или млекопитающих) или в прокариотических клетках с использованием подходящих экспрессирующих векторов. В этих целях может быть использован любой метод,известный специалистам. Например, ДНК-молекулы, кодирующие белки, полученные любым из вышеуказанных методов, встраивают в соответствующим образом сконструированные экспрессирующие векторы способами, хорошо известными специалистам (см. Sambrook et al., 1989). Двухцепочечную кДНК присоединяют к плазмидным векторам путем гомополимерного наращивания или путем рестрикционного лигирования, включая методы с использованием синтетических ДНКлинкеров или методы лигирования по тупым концам, т.е. для лигирования ДНК-молекул используют ДНК-лигазы, а нежелательное связывание предотвращают путем обработки щелочной фосфатазой. Для экспрессии нужного белка, экспрессирующий вектор должен также включать специфические нуклеотидные последовательности,содержащие транскрипционные и трансляционные регуляторные элементы, присоединенные к ДНК, кодирующей нужный белок так, чтобы обеспечивалась экспрессия гена и продуцирование белка. Сначала для того чтобы происходила транскрипция гена, необходимо, чтобы ему предшествовал промотор, который распознается РНК-полимеразой и с которым связывается эта полимераза, что приводит, тем самым, к инициации процесса транскрипции. Существует ряд подходящих для использования промоторов,которые действуют с различной эффективностью (сильные и слабые промоторы). Для эукариотических хозяев могут быть использованы различные транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности в зависимости от вида хозяина. Они могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирус, вирус коровьей папилломы,обезьяний вирус или т.п., где указанные регуляторные сигналы ассоциированы с конкретным геном, имеющим высокий уровень экспрессии. В качестве примеров могут служить промотор ТК вируса герпеса, ранний промотор SV40,промотор гена gal 4 дрожжей и т.п. Могут быть выбраны регуляторные сигналы инициации транскрипции, обеспечивающие подавление и активацию так, чтобы экспрессия генов могла быть модулирована. ДНК-молекулу, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок настоящего изобретения, встраивают в вектор(ы), содержащий правильно присоединенные 4 сигналы регуляции транскрипции и трансляции,и способный интегрировать нужные генные последовательности в клетку-хозяина. Клетки, которые были стабильно трансформированы введенной ДНК, могут быть отобраны посредством введения одного или нескольких маркеров, позволяющих проводить отбор клеток-хозяев, содержащих этот экспрессирующий вектор. Указанный маркер может также наделять ауксотрофного хозяина фототрофией, резистентностью к биоцидам, например к антибиотикам, или к тяжелым металлам,таким как медь и т.п. Ген селективного маркера может быть непосредственно присоединен к ДНК-последовательности экспрессируемого гена или введен в ту же самую клетку путем котрансфекции. Для оптимального синтеза белков настоящего изобретения могут быть также использованы дополнительные элементы. Важными факторами при отборе конкретного плазмидного или вирусного вектора являются легкость, с которой клетки-реципиенты,содержащие указанный вектор, могут быть идентифицированы и отделены от тех клетокреципиентов, которые не содержат указанного вектора; число копий вектора, которое должно присутствовать в данном хозяине; и требование к способности данного вектора реплицироваться в клетках-хозяевах разных видов. После получения вектора(ов) или ДНКпоследовательности,содержащей конструкцию(и), предназначенную для экспрессии, эта ДНК-конструкция(и) может быть введена в соответствующую клетку-хозяина различными подходящими методами, такими как трансформация, трансфекция, конъюгирование, слияние протопластов, электропорация, преципитация фосфатом кальция, прямая микроинъекция и т.п. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими. Предпочтительными являются эукариотические хозяева, например, клетки млекопитающих, такие как клетки человека, обезьяны, мыши и клетки яичника китайского хомячка (СНО), поскольку они позволяют вносить посттрансляционные модификации в молекулы белка, включая соответствующую укладку или гликозилирование в нужных сайтах. Дрожжевые клетки также могут вносить посттрансляционные пептидные модификации, включая гликозилирование. Существует ряд технологий рекомбинантных ДНК, где используются последовательности сильных промоторов и высококопийное число плазмид,которые могут быть использованы для продуцирования нужных белков в дрожжах. Дрожжи распознают лидерные последовательности на клонированных продуктах генов млекопитающих и секретируют пептиды, несущие лидерные последовательности (т.е. препептиды). После введения указанного вектора(ов),клетки-хозяева культивируют в селективной среде, которая обеспечивает селективный рост 5 векторсодержащих клеток. Экспрессия клонированной генной последовательности(ей) приводит к продуцированию нужных белков. Усеченный по амино-концу RANTES настоящего изобретения может быть получен любыми другими хорошо известными методами, а в частности, хорошо разработанными методами химического синтеза с использованием автоматических синтезаторов для твердофазного пептидного синтеза с последующей хроматографической очисткой. Хемокины настоящего изобретения могут быть, например, синтезированы с использованием групп(9-флуоренилметоксикарбонила) и t-Boc (т-бутоксикарбонила) или любым другим аналогичным методом химического синтеза с использованием или без использования соответствующих боковых защитных групп на различных аминокислотах. Аминокислоты с соответствующими боковыми защитными группами или без них предварительно активируют, например, группами HBTU/HOBt [2(1 Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат(1-гидроксибензотриаол)] и присоединяют к растущей пептидной цепи. Перед добавлением следующего остатка, защитную группу (например, Fmoc) отщепляют от-аминогруппы. После синтеза все защитные группы удаляют, интактные полноразмерные пептиды очищают и химически или ферментативно укладывают (включая образование дисульфидных мостиков между цистеинами) с получением соответствующих хемокинов настоящего изобретения. Очистку природных, синтетических или рекомбинантных белков осуществляют любым из хорошо известных методов, используемых для этих целей, т.е. любым стандартным методом, включая экстракцию, преципитацию, хроматографию, электрофорез и т.п. (см., например,Proost et al., 1996). Дополнительной процедурой очистки, которая может быть предпочтительно использована для очистки белка настоящего изобретения, является аффинная хроматография с использованием моноклональных антител или аффинности к гепарину, где указанные антитела или гепарин связываются с целевым белком и где их продуцируют и иммобилизуют на гелевой матрице, находящейся в колонке. Препараты, содержащие белки с примесями, пропускают через колонку. Этот белок связывается с колонкой посредством гепарина или посредством специфического антитела, а примеси проходят через колонку. После промывки белок элюируют из геля путем изменения рН или ионной силы. Усеченные по амино-концу RANTES настоящего изобретения могут быть использованы для лечения и/или диагностики заболеваний,терапия которых основана на антагонистической активности в отношении хемокинов МСР 003940 3, MCP-1, МСР-1 и RANTES. Примерами таких заболеваний являются воспалительные заболевания; заболевания, ассоциированные с ангиогенезом и гемопоэзом: опухоли; инфекционные заболевания, включая ВИЧ-инфекцию,аутоиммунные заболевания, атеросклероз, легочные заболевания и кожные болезни. Предпочтительным является использование для лечения ВИЧ-инфекций. Поэтому в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению белка настоящего изобретения для изготовления лекарственного средства для лечения вышеупомянутых заболеваний. Лекарственное средство предпочтительно изготавливают в форме фармацевтической композиции, содержащей белки настоящего изобретения в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или наполнителями. Такие фармацевтические композиции входят в еще один аспект настоящего изобретения. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ лечения вышеупомянутых заболеваний, предусматривающий введение фармакологически активного количества усеченных по амино-концу RANTES настоящего изобретения пациентам с риском развития таких заболеваний или пациентам, у которых уже имеются указанные патологии. Было также обнаружено, что CD26/DPP IV способен генерировать усеченный по NH2-концуRANTES in vitro. RANTES представляет собой первый цитокин, о котором сообщалось, что его биологическая активность может быть модулирована CD26/DPP IV. Поэтому в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применениюCD26/DPP IV для лечения и/или диагностики заболеваний, при которых требуется антагонистическая активность против действия хемокинов, направленная, в частности, против воспалительных, иммунных и инфекционных заболеваний. Таким образом, был представлен первый пример идентифицированного механизма эндогенно регулируемой модификации хемокина с образованием антагониста, аналогичный физиологическому процессингу, но опосредованный другими факторами (протеазами). Применение таких факторов (протеаз) для лечения и/или диагностики вышеуказанных заболеваний также входит в объем настоящего изобретения. Настоящее изобретение описано в нижеследующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения. Ниже представлено конкретное описание чертежей. Описание чертежей На фиг. 1 показаны аминокислотные последовательности RANTES. Сигнальные последовательности указаны курсивом, а С-остатки 7 указаны жирным шрифтом. Стрелками показаны первые аминокислоты усеченного по аминоконцу RANTES настоящего изобретения, называемого также RANTES (3-68). На фиг. 2 проиллюстрировано сравнение хемотаксической активности интактной и усеченной по NН 2-концу форм природного или рекомбинантного RANTES по отношению к моноцитам ТНР-1 в анализе с использованием микрокамеры Бойдена: природный RANTES (168) ; природный усеченный RANTES (3-68); и рекомбинантный RANTES (3-68), расщепленный CD26/DPP IV . Результаты представляют собой среднее значение хемотаксического индексаср.кв.ош. из четырех или более независимых экспериментов. На фиг. 3 проиллюстрировано действие природного RANTES (3-68) , природного(1-68)и рекомбинантного RANTES (3-68),обработанного CD26/DPP IV , на [Ca2+]i в клетках ТНР-1. Результаты представляют собой среднее значение увеличения [Са 2+]iср.кв.ош. из трех или более независимых экспериментов. На фиг. 4 показана десенсибилизация Са 2+мобилизирующей активности интактногоrecRANTES (1-68) под действием RANTES (368). Клетки ТНР-1 сначала стимулировали буфером или различными концентрациями рекомбинантного RANTES (1-68) или RANTES (3-68). Результаты представляют собой среднее значение увеличения [Ca2+]Iср.кв.ош. (из трех или более независимых экспериментов) в ответ на воздействие 30 нг/мл интактного рекомбинантного RANTES как второго стимулятора. На фиг. 5 приведено сравнение хемотаксической способности усеченного RANTES (3-68) со способностью интактного RANTES (1-68). Эозинофильную гранулоцитарную хемотаксическую активность природного (nat) и рекомбинантного (rес) усеченного RANTES, интактногоRANTES и синтетического МСР-3 определяли в анализе с использованием микрокамеры. Результаты представляют собой среднее значение хемотаксического индекса (ХИ)ср.кв.ош. из двух или более независимых экспериментов(каждый проводили в тройном дубликате). На фиг. 6 показана десенсибилизация мобилизации кальция интактным RANTES в CCRтрансфектантах. Эксперименты по мобилизации кальция проводили на клетках HOS, трансфецированных CD4 и рецепторами СС-хемокинаCCR1 или CCR5. Сначала клетки стимулировали различными концентрациями интактного или усеченного RANTES с последующей стимуляцией 100 нг/мл интактного RANTES. Показан процент ингибирования увеличения [Са 2+]i, индуцированного вторым стимулятором. Этот процент вычисляли путем сравнения ответа на 100 нг/мл интактного RANTES после добавления RANTES (1-68) или RANTES (3-68) с отве 003940 8 том после стимуляции буфером (100%). Результаты представляют собой среднее значение процента ингибированияср.кв.ош. из двух или более экспериментов. На фиг. 7 показано сильное ингибирующее действие RANTES (3-68) на инфицирование мононуклеарных клеток вирусом ВИЧ-1. ФГАактивированные МКПК были инфицированы Мтропным штаммом ВИЧ-1 Ba-L в присутствии различных концентраций RANTES (1-68) илиRANTES (3-68) (0-1000 нг/мл добавляли во время инфицирования). Через десять дней прослеживали выход вируса в клеточном супернатанте в условиях p-24-Ag-ELISA (один репрезентативный эксперимент из четырех проведенных экспериментов). На фиг. 8 показано действие RANTES (168) и RANTES (3-68) на инфицирование штаммом SF162 вируса ВИЧ-1 в ФГА-активированных МКПК. Выход вируса прослеживали через десять дней после инфицирования в клеточном супернатанте в условиях p-24-Ag-ELISA. Показаны результаты одного репрезентативного эксперимента из трех проведенных экспериментов, внизу означает предел детекции p-24-AgELISA (5 пг/мл). На фиг. 9 показана экспрессия CD26 на клетках HOS.CD4.CCR5, U87.CD4.CCR5 и свежевыделенных ПКМК. В каждой гистограмме показан процент (%) СD26-позитивных клеток. На фиг. 10 показано действие RANTES (168), RANTES (1-68) плюс sCD26 (50 ед./л) иHOS.CD4.CCR5 штаммом BaL ВИЧ-1. Выходы вируса прослеживали через 8 дней после инфицирования в клеточном супернатанте в условияхp-24-Ag-ELISA. Показаны результаты одного репрезентативного эксперимента из трех проведенных экспериментов. Примеры Пример 1. Усеченный по амино-концуRANTES. Материалы и методы. Реагенты. Природный RANTES человека продуцировали в клетках гепатосаркомы Малаву (Malavu),в клетках остеосаркомы MG-63 или в лейкоцитах периферической крови (Центры по переливанию крови в Антверпене и Лвене) и очищали методом, описанным ранее (Proost Р. et al., 1996 иProost P. et al., 1993). МСР-2, МСР-3 и GCP-2 синтезировали методом химического синтеза с использованием Fmoc (Proost P. et al., 1995 и WuytsA. et al., 1997), рекомбинантный RANTES человека получали от Peprotech (Rocky Hill, NJ), a рекомбинантный MCP-1 был любезно предоставлен Dr.J.J. Oppenheim (NCI-NIH, Frederick, MD). Клетки остеосаркомы человека (HOS),трансфецированные CD4 и одним из рецепторов СС-хемокина CCR1, CCR3 или CCR5 (Deng H.,et al., 1996), культивировали в DMEM с глутамаксом. В эту среду добавляли пуромицин (1 9 мкг/мл) в качестве селективного агента. Все культуральные среды (Gibco BRL/Life Technologies, Paisley, UK) обогащали 10% FCS.CD26/DPP IV человека получали из простасом, органелл, происходящих из предстательной железы, которые в свободном состоянии находятся в семенной плазме. Этот фермент очищали до гомогенности, как описано ранее, с использованием ионообменной хроматографии с последующей аффинной хроматографией на аденозин-дезаминазе (De Meester I. et al., 1996). Инкубирование хемокинов с CD26/DPP IV и детектирование протеолитического процессинга. 100-1000 молярного избытка хемокинов инкубировали в течение ночи с CD26/DPP IV в 100 мМ Трис/НСl рН 7,7. Хемокины отделяли отCD26/DPP IV посредством электрофореза в ПААГ с ДСН на трис/трицин-гелевой системе,как описано ранее (Proost P. et аl., 1996). Белки подвергали электроблоттингу на ПВДФ-(поливинилиденфторидных) мембранах(Problott, Perkin Elmer, Foster City, CA) и окрашивали кумасси бриллиантовым голубым R250. После обесцвечивания, мембраны промывали,по крайней мере, 5 раз сверхчистой водой (MiiliQ; Millipore, Bedford, MA). Для получения достаточных количеств чистого усеченного хемокина для биологических анализов, приблизительно 50 мкг рекомбинантного хемокина обрабатывалиCD26/DPP IV и продукт расщепления подкисляли 0,1% трифторуксусной кислотой (TFA). Для предотвращения прилипания хемокинов к пробиркам добавляли Твин 20 (0,01%). Хемокины отделяли от CD26/DPP IV в градиенте ацетонитрила на колонке AquaporeRP-300 с С-8 (150 мм) (Perkin Elmer). Фракции,содержащие белки, анализировали посредством электрофореза в ПААГ с ДСН и окрашивали серебром, как было описано ранее.CD26/DPP IV-обработанные хемокины,очищенные с помощью ОФ-ВЭЖХ или вырезанные из ПВДФ-блотов, подвергали NH2 концевому секвенированию посредством деградации по Эдману на импульсном жидкофазном секвенаторе 477 А/120 А для секвенирования белков (Perkin Elmer) с использованием Nметилпиперидина в качестве связывающего основания. Детекция хемотаксической активности. Хемокины тестировали на их хемотаксическую способность по отношению к свежевыделенным нейтрофильным гранулоцитам периферической крови (106 клеток/мл) или культивированным моноцитам ТНР-1 (0,5106 клеток/мл) в микрокамере Бойдена (Proost P. et аl., 1996 10 ки, которые мигрировали через поликарбонатные мембраны с порами размером 5 мкм, подсчитывали в десяти полях объектива микроскопа с масляной иммерсией. Хемотаксический индекс (Х.И.) образца(тройные дубликаты в каждой камере) подсчитывали как число клеток, мигрировавших в образец, деленное на число клеток, мигрировавших в контрольную среду. Для экспериментов на десенсибилизацию клетки инкубировали с биологически инактивированными вариантами хемокинов в течение 10 мин при 37 С перед переносом в камеру. Для оценки десенсибилизации хемотаксиса вычисляли % ингибирования Х.И., полученного при десенсибилизации с использованием HBSSобработанных контрольных клеток. Детекция внутриклеточных концентраций Са 2+. Внутриклеточные концентрации кальция([Са 2+]i) измеряли, как описано ранее (Wuyts A.et al., 1997). Вкратце, очищенные клетки инкубировали с флуоресцентным индикатором фура 2 (фура-2/АМ, 2,5 мкМ; молекулярные зонды.Molecular Probes Europe BV, Leiden, The Netherlands) и 0,01% плюроника F-127 (Sigma, St.Louis МО). После выдерживания в течение 30 мин клетки два раза промывали, ресуспендировали вHBSS с 1 мМ Са 2+ и инкубировали в течение 10 мин при 37 С, а затем измеряли фура-2 флуоресценцию в люминесцентном спектрофотометре LS50B (Perkin Elmer). После возбуждения при 340 и 380 нм, флуоресценцию детектировали при 510 нм. Уровень [Са 2+]i вычисляли по уравнению Гринкевича (Grynkewicz et al.,1985). Для определения Rmax, клетки лизировали 50 мкМ дигитонином. Затем рН доводили до 8,5 с использованием 20 мМ Триса, и величину Rmin получали при добавлении 10 мМ EGTA к лизированным клеткам. Величина Кd, используемая для калибрации, составляла 224 нМ. Для экспериментов на десенсибилизацию, клетки сначала стимулировали буфером или хемокином в различных концентрациях. Хемокины в качестве второго стимулятора добавляли в концентрации,индуцирующей значимое увеличение [Ca2+]i после предварительной стимуляции буфером. Вычисляли процент ингибирования увеличения[Са 2+]i в ответ на предварительную стимуляцию клеток вторым стимулятором. Ингибирование ВИЧ-1-инфекции. М-тропные штаммы ВИЧ-1, BaL и SF162 были получены в соответствии с программойMRC по изучению СПИД-реагентов (Herts, UK). Мононуклеарные клетки периферической крови(МКПК), взятые от здоровых доноров, выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности (5,23) и стимулировали ФГА при 1 мкг/мл(Sigma, Bornem, Belgium) в течение 3 дней при 37 С. Активированные клетки (ФГА-стимули 11 рованные бласты) три раза промывали PBS и инфицировали вирусом, как описано ранее(Schols D. et al., 1997). ВИЧ-1-инфицированные или псевдоинфицированные ФГА-стимулированные бласты культивировали в присутствии 25 ед./мл IL-2 и различных концентраций RANTES (1-68) или RANTES (3-68). На 10-й день собирали клеточные супернатанты и коровий антиген ВИЧ-1 в супернатанте анализировали с помощью набора для(DuPont/NEN Life Science Products, Brussels,Belgium). Результаты Идентификация и биологическая характеризация природного усеченного по NН 2-концуRANTES. Были предварительно выделены различные усеченные по NH2-концу формы GCP-2 человека (Proost P. et al., 1993). Наиболее усеченнуюGCP-2-форму расщепляли в сайте после Pro в предпоследнем положении [GCP-2(3-75)]. С использованием аналогичной стандартной процедуры очистки, С-С-хемокин RANTES выделяли из лейкоцитов периферической крови или из клеток саркомы (Proost P. et al., 1996). В частности, кондиционированные среды от клеток MG-63 или клеток саркомы Малаву,индуцированных смесью цитокинов, фракционировали для выделения природных вариантов хемокинов. Эти хемокины последовательно очищали с помощью аффинной хроматографии с использованием антитела или гепарина, катионнообменной хроматографии (моно-S-ЖЭХБ) и ОФ-ВЭЖХ, и иммунореактивные формы детектировали с помощью хемокинспецифического ELISA. Было обнаружено, что на катионообменной колонке IL-8 элюируется в непосредственной близости от RANTES (между 0,7 и 0,75 М NaCl). Тем не менее, оба хемокина отделяли друг от друга с помощью ОФ-ВЭЖХ(RANTES и IL-8 элюировались при 27,5 и 30% ацетонитрила соответственно). Анализ аминокислотных последовательностей очищенных белков подтвердил, что IL-8 встречается в различных усеченных по NH2-концу формах, которые были ранее выделены, исходя из их хемотаксической активности (Van Damme J. et al.,1989). Однако для RANTES была выделена только одна форма, в которой, по сравнению с интактным RANTES, отсутствовали два NH2 концевых остатка. Для проверки его хемотаксической активности в отношении моноцитов и эозинофилов этот RANTES (3-68) был проанализирован более тщательно на частоту его встречаемости. В частности, RANTES (3-68) был протестирован на хемотаксическую активность и/или на активность высвобождения внутриклеточного Са 2+ и его биологическую эффективность по сравнению с эффективностью соответствующих интактных хемокинов. 12 моноцитарной хемотаксической активности и Са 2+-высвобождающей активности. По сравнению с интактным природным RANTES (минимальная эффективная доза 3-10 нг/мл), природный RANTES (3-68) оказался полностью неактивным при тестировании в концентрациях вплоть до 300 нг/мл в микрокамере Бойдена(фиг. 2). Кроме того, для достижения Са 2+ответа, аналогичного ответу RANTES (1-68),для природного RANTES (3-68) потребовались в 10 раз более высокие концентрации (фиг. 3).CD26/DPP IV способствует удалению NH2 концевых дипептидов хемокинов. Для того чтобы определить, является ли аминопептидаза CD26/DPP IV ответственной заNH2-концевое усечение RANTES, интактный хемокин инкубировали в течение ночи сCD26/DPP IV, блотировали на ПВДФ-мембраны, окрашивали Кумасси синим и подвергали автоматической деградации по Эдману.CD26/DPP IV-обработка RANTES приводила к удалению NH2-концевых дипептидов. Параллельное инкубирование хемокина с буфером безCD26/DPP IV не дало эффекта. Поскольку другие хемокины содержали консенсусную последовательность для CD26/DPP IV-расщепления и поскольку было показано, что NH2-конец МСР играет решающую роль в биологической активности (Gong J. et al., 1996 и Gong J. et al., 1995), то MCP-1, МСР-2 и МСР 3 были также инкубированы с CD26/DPP IV. После обработки МСР блотировали на ПВДФ-мембранах и окрашивали кумасси синим для подтверждения того, что для деградации по Эдману было выделено достаточное количество белка. Однако NH2-концевая последовательность не могла быть обнаружена, что указывает на то,что CD26/DPP IV не модифицирует NН 2-конец МСР, который блокируется пироглутаминовой кислотой при деградации по Эдману. Сравнение биологической активности интактного и CD26/DPP IV-обработанного RANTES. Аналогично природному RANTES (3-68),С-8-ОФ-ВЭЖХ-очищенный, CD26/DPP IVобработанный рекомбинантный RANTES был неактивным в микрокамере Бойдена в экспериментах по хемотаксису с использованием в концентрациях вплоть до 1 мкг/мл, тогда как при концентрациях интактного рекомбинантногоRANTES от 30 до 100 и выше наблюдался значимый хемотаксический ответ моноцитов (фиг. 2). При оценке эффекта усечения, проведенной в анализе на мобилизацию Ca2+, RANTES(3-68) при концентрации 100 нг/мл индуцировал низкое, но значимое увеличение мобилизации Са 2+, однако, интактный RANTES становился активным уже при 10 нг/мл (фиг. 3). И наконец,несмотря на то, что были удалены только дваRANTES при этом снижалась в 10-100 раз.RANTES (3-68) является природным антагонистом хемотаксиса по сравнению с интактным RANTES. Принимая во внимание отсутствие активности RANTES (3-68) в экспериментах по хемотаксису моноцитов, авторы провели анализ для того, чтобы определить, может ли этот усеченный RANTES действовать как антагонист.RANTES (3-68) при концентрации 1 мкг/мл почти полностью (82%) десенсибилизировал хемотаксическое действие 100 нг/мл интактногоRANTES ингибировался приблизительно на 5070%. RANTES (3-68) при 300 нг/мл еще был способен ингибировать приблизительно 30% хемотаксического ответа в направлении равной концентрации интактного RANTES. В экспериментах на мобилизацию Са 2+ в клетках ТНР-1 (фиг. 4), интактный RANTES при 30 нг/мл способен десенсибилизировать действие 30 нг/мл интактного RANTES на 395%. Для достижения того же самого уровня десенсибилизации необходимо использовать приблизительно в 10 раз большие концентрации RANTES (3-68). Однако при 300 нг/мл, RANTES (368) сам дает значимый Са 2+-ответ. Этот Са 2+ответ сопоставим с ответом, полученным с использованием 30 нг/мл интактного RANTES.cp.кв.ош. 300 1000 12,5 7,5 27,5 50,5 2510 678 300 22,0 20,5 72,5 79,5 4916 3113 0 41,0 46,0 71,5 97,0 6413 0 100 1000 4,0 3,0 13,5 11,0 83 824 300 7,5 7,0 29,0 33,0 197 5311 0 24,0 21,5 50,0 44,5 357 0 1 Результаты представляют собой хемотаксический индекс (Х.И.) из четырех (A-D) независимых экспериментов (включая среднее значениеср.кв.ош.) и процент (%) ингибирования (среднее значениеср.кв.ош. % ингибирования из четырех экспериментов) хемотаксического ответа на RANTES (1-68) после предварительного инкубирования клеток ТНР-1 с неактивным RANTES (3-68) или с буфером. Пониженная хемотаксическая активностьRANTES (3-68) для моноцитов и эозинофилов человека. В табл. 2 хемотаксическую способность природного RANTES (3-68) сравнивают со способностью моноцитарного хемотаксического белка МСР-3 и интактного RANTES (1-68). Как можно видеть, МСР-3 и RANTES (1-68) при концентрациях 3 и 30 нг/мл соответственно, еще обладают хемотаксической активностью для свежевыделенных моноцитов периферической крови, тогда как природный RANTES (3-68) остается неактивным при 100 нг/мл. Пониженная хемотаксическая способность этого природного варианта была подтвержденаRANTES (3-68) обладал слабой хемотаксической активностью для моноцитов (при 1 мкг/мл), однако, он обнаруживал специфическую активность, которая была в 10 раз ниже,чем активность интактного рекомбинантногоRANTES (3-68) была подтверждена на эозинофилах человека, которые были еще восприимчивыми к 100 нг/мл интактного RANTES и 30 нг/мл МСР-3 (фиг. 5). Аналогично моноцитам,миграция эозонофилов стимулировалась лишь Таблица 2 Сравнение моноцитарной хемотаксической активности RANTES (3-68) с активностьюa) среднее значение хемотаксического индекса (Х.И.)ср кв.ош. (n) для свежевыделенных моноцитов периферической крови.CCR5, но не посредством CCR1 и CCR3. Для объяснения пониженной хемотаксической активности RANTES (3-68) была проверена способность этого варианта хемокина связываться и передавать сигнал посредством известных рецепторов, "используемых" RANTES. В анализе на передачу сигнала, в котором измеряли повышение внутриклеточной концентрации кальция, были использованы клеткиHOS, трансфецированные хемокиновыми рецепторами CCR1, CCR3 или CCR5. При концентрациях вплоть до 300 нг/мл, RANTES (3-68) не дает увеличения [Ca+]i в клетках HOS, трансфецированных CCR1 (табл. 3) или CCR3 (данные не приводятся), тогда как концентрации 30 и 100 нг/мл интактного RANTES оказались достаточными для индуцирования увеличения [Са 2+]i в CCR1- и CCRS-трансфектантах соответственно. Однако как интактный, так и усеченныйRANTES были способны индуцировать значимое увеличение [Ca2+]i в CCR5-трансфектантах при 30 нг/мл. Кроме того, при предварительном инкубировании ССR5-трансфецированных клеток с 3-10-кратным избытком либо RANTES (368), либо интактного RANTES наблюдалось одинаковое ингибирование (около 75%) увели чения [Ca2+]i при последующей стимуляции интактным RANTES (100 нг/мл) (фиг. 6). В противоположность этому, 300 нг/млRANTES (3-68) давал лишь незначительную десенсибилизацию кальциевой реакции CCR1- иCCR3-трансфецированных клеток в ответ на 100 нг/мл интактного RANTES, тогда как 3-кратный избыток интактного RANTES, используемый в качестве первого стимулятора, почти полностью ингибировал повышение [Са 2+]i в этих клетках при последующей стимуляции RANTES (1-68). Исходя из этого, можно сделать вывод, что удаление двух NH2-концевых остатков у RANTES оказывает существенное влияние на передачу сигнала, в результате чего хемокиновые рецепторы CCR1 и CCR3 больше не могут функционально распознаваться. Поэтому пониженная хемотаксическая активность RANTES (3-68) может быть объяснена его неспособностью функционировать посредством CCR1 и CCR3. В противоположность этому, RANTES (3-68) полностью сохраняет способность к CCR5-опосредованной передаче сигнала, характерной для интактного RANTES. RANTES (3-68) может оказывать противовоспалительное действие посредством конкуренции с интактным RANTES,но он может действовать еще как ингибитор ВИЧ, благодаря сохранению своей способности к связыванию с CCR5.RANTES (3-68) 300 199 (3) 1195 (2) 100 150 (3) 764 (2) 30 15 (2) 5613 (2) 10 15 (1) а) среднее увеличение [Ca2+]i в нМср.кв.ош., полученное из двух или более независимых экспериментов. Ингибирование RANTES (3-68)-формой хемотаксиса, индуцированного СС-хемокином в клетках моноцитов человека. Для того чтобы подтвердить, происходит ли ингибирование передачи сигнала ССхемокином под действием RANTES (3-68) также в клетках моноцитов, были проведены эксперименты по ингибированию в клетках ТНР-1. Эсперимент показал, что RANTES (3-68) обна руживает в 10 раз более низкую способность к повышению [Са 2+]i в моноцитах по сравнению с интактным RANTES (данные не приводятся). Кроме того, хемотаксическое действие интактного RANTES (30 нг/мл) на моноциты ингибируется (71%) при инкубировании тестируемых клеток с 300 нг/мл RANTES (3-68), как показано в табл. 4. 17 Кроме того, RANTES (3-68) способствует снижению хемотаксической реакции в ответ на другие СС-хемокины, включая моноцитарный хемотаксический белок-3 (МСР-3) (67%), макрофагальный белок воспаления MIP-1 (61%) и МIP-1 (80%).(3-68) действует как ингибитор широкого спектра миграции клеток моноцитов, индуцированной другими СС-хемокинами. Таблица 4 Ингибирование RANTES (3-68) клеточного хемотаксиса моноцитов, вызываемого СС-хемокинами Ингибирование хемотаксиса клеток ТНР-1 Хемокинa) Конц., нг/мл Буферb,c)b) верхние лунки микрокамеры заполняли клетками ТНР-1, предварительно инкубированными (10 мин, 37 С) с 300 нг/мл RANTES (3-68) или с буфером.c) среднее ХИср.кв.ош. из четырех независимых экспериментов.CD26-специфическое усечение RANTES необходимо для его противовирусной активности. Сначала оценивали действие различных форм RANTES против двух различных Мтропных штаммов ВИЧ-1 (BaL и SF162) в МКПК человека, взятых из крови здоровых доноров. IC50 для интактного RANTES (1-68) по отношению к штамму BaL составлял 3,4 нМ, aIC50 для RANTES (3-68) составлял 0,39 нМ. Величина IC90 для RANTES (1-68) составляла 71 нМ, которая приблизительно в 10 раз превышала величину IC90 для RANTES (3-68). Что касается штамма SF162, то при оценке в ПКМК,RANTES (1-68) (IC50: 23 нМ; IC90: 95 нМ) был более чем в 10 раз менее активным, чем RANTES (3-68). (IC50: 2 нМ; IC90: 8,2 нМ) (табл. 5). Зависимое от концентрации действие обоих хемокинов при концентрациях в пределах от 133 до 0,2 нМ против репликации SF162 ВИЧ-1 в ПКМК проиллюстрировано на фиг. 8. Концентрация 5,2 нМ RANTES (3-68) оказалась достаточно эффективной для снижения репликации вируса, тогда как RANTES (1-68) был неактивен при этой концентрации. Какого-либо отличия в антивирусной активности между интактнымиSystems, не наблюдалось. Резкое различие в антивирусной активности между двумя формами RANTES было даже более заметно при тестировании в CCR5 трансфецированных клетках человека. В клетках U78.CD4.CCR5, IC50 для RANTES (1-68) иIС 90 для RANTES (1-68) составлял более чем 133 нМ, тогда как IC90 для RANTES (3-68) со ставлял 63 нМ. В табл. 5 также показано, чтоRANTES (1-68) был фактически неактивным в клетках HOS.CD4.CCR5 (IC50 133 нМ), тогда как RANTES (3-68) оказался сильным ингибитором репликации BaL ВИЧ-1 в этих клетках(IC50: 5,5 нМ). Однако для обеих форм RANTES в этих клетках не были достигнуты значенияIC90. Противовирусная активность RANTES зависит от присутствия мембраноассоциированного или растворимого CD26 (sCD26). Была оценена экспрессия CD26 на двух различных ССR5-трансфецированных клеточных линиях и на свежевыделенных ПКМК. Трансфектанты HOS были негативными в отношении экспрессии CD26, как было определено путем анализа методом проточной цитометрии, тогда как трансфектанты U87 окрашивались слабо, но обнаруживали значимо позитивную реакцию с mAb против CD26 (фиг. 9). Кроме того, было обнаружено, что субпопуляция свежевыделенных МКПК оказалась в высокой степени положительной в отношении экспрессии CD26 (фиг. 9). Зависимое от концентрации действиеRANTES (1-68) и RANTES (3-68) на продуцирование вирусного р-24-Аg штаммом BaL в трансфецированных клетках HOS.CD4.CCR5 в присутствии sCD26 показано на фиг. 10. Добавление sCD26 вместе с RANTES (1-68) в начале ВИЧ-инфицирования значительно повышало антивирусную активность интактного RANTES в клетках HOS-CD4.CCR5. При добавленииRANTES составляло 13 нМ. Добавление только одного sCD26 не оказывало какого-либо влияния на репликацию вируса. Добавление sCD26 кRANTES (3-68) также не влияло на антивирусную активность RANTES (3-68) (данные не приводятся). Таким образом, присутствие CD26 играет важную роль в сообщении интактномуRANTES противовирусной активности. Усечение природного MIP-1 по аминоконцу не влияет на его анти-ВИЧ-1, хемотаксическую и Cа 2+-мобилизирукщую активность. Поскольку большинство природных MIP1 является усеченными по NH2-концу (на четыре аминокислоты), то авторами было проведено исследование для того, чтобы определить,имеет ли этот усеченный MIP-1 (5-70) измененную ВИЧ-1-ингибирующую способность. В отличие от результата, полученного для RANTES, какого-либо значимого различия в величинах IC50 для интактного MIP-1 и для MIP-1 20 Кроме того, был проведен сравнительный анализ влияния интактного MIP-1 и усеченногоMIP-1 (5-70) на хемотаксис моноцитов ТНР-1 и мобилизацию в них внутриклеточного Са 2+. В табл. 6 продемонстрировано, что минимальная эффективная доза MIP-1 (5-70), индуцирующая повышение [Са 2+]i, была лишь незначительно ниже, чем доза интактного MIP-1. Более того, хотя максимальная миграция, наблюдаемая при 0,13 нМ в анализе на хемотаксис, была выше для интактного MIP-1, однако, минимальные подавляющие концентрации обеих изоформ MIP-1 были почти аналогичными. В целом, можно сделать вывод, что NH2-концевой процессинг MIP-1, в отличие от RANTES,лишь незначительно ослабляет его противовоспалительную и анти-ВИЧ-1-активность.HOS.CD4.CCR5 ВаL 130 130 5,5 130 32 130 21 130 Мониторинг выхода вируса в бесклеточном супернатанте проводили через 8-12 дней после инфицирования вирусным р-24-Аg вELISA. Представлены средние величины IC50 иIC90 (в нМ). Данные представляют собой сред ние значения, полученные из 2-4 независимых экспериментов. Величина, обозначенная "130",указывает на то, что 50%- или 90%-ное ингибирование не достигалось при 130 нМ. ND - не определяли. Таблица 6 Отсутствие различия в биологических активностях интактного и усеченного MIP-1 Хемотаксис Увеличение в [Са 2+]i Хемокин нМ Х.И. нМ НМ [Са 2+]i 1,3 8,53,3 3,9 240/195MIP-1(5-70) 0,13 11,42,9 0,4 71/33 0,013 3,81,4 0,04 10/10 0,0013 2,10,6 Миграция моноцитов ТНР-1 через 5,0 мкм-поры в микрокамере. Результат представляет собой среднее значениеср.кв.ош. из трех независимых экспериментов.Детекция увеличения [Ca2+]i в клетках ТНР-1. Приводятся результаты, полученные из двух независимых экспериментов. ЛитератураRANTES, у которого отсутствуют NН 2 концевые аминокислоты, соответствующие аминокислотным остаткам 1-2 природногоRANTES, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID No:2, который обладает антагонистической активностью в отношении хемокинов МСР-3, MCP-1, MCP-1 и RANTES. 2. Усеченный по амино-концу RANTES по п.1 в гликозилированной форме. 3. Молекула ДНК, кодирующая усеченный по амино-концу RANTES по п.1 или 2. 4. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу ДНК по п.3. 5. Клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор по п.4. 6. Рекомбинантный способ получения белка по п.1 или 2, включающий культивирование клеток по п.5 в соответствующей питательной среде и выделение продукта экспрессии. 7. Применение белка по п.1 или 2 в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний, терапия которых основана на антагонистической активности в отношении хемокинов МСР-3, МСР-1, MCP-1 и RANTES. 8. Применение белка по п.1 или 2 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или диагностики заболеваний, терапия которых основана на антагонистической активности в отношении хемокинов МСР-3, MCP-1, MCP1 и RANTES. 9. Применение по п.8 для изготовления лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний, ВИЧ-инфекций, заболе 23 ваний, ассоциированных с ангиогенезом и гемопоэзом, и опухолей. 10. Фармацевтическая композиция, содержащая белок по п.1 или 2, в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями и/или наполнителями для лечения за 003940 24 болеваний, терапия которых основана на антагонистической активности в отношении хемокинов МСР-3, MCP-1, MCP-1 и RANTES.