Способ получения липидов из биомассы

ИСПРАВЛЕННОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ 2009.10.14 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДОВ ИЗ БИОМАССЫ Бьянки Даниеле, Францоси Джулиана, Романо Анна Мария (IT) Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU) Способ получения липидов из биомассы, содержащей по меньшей мере один полисахарид, в котором указанную биомассу подвергают кислотному гидролизу в присутствии водного раствора по меньшей мере одной органической кислоты, выбранной из алкил- или арилсульфоновых кислот, имеющих от С 7 до С 20 атомов углерода, предпочтительно от C9 до C15 атомов углерода,или из галогенированных карбоновых кислот, при температуре в интервале от 80 до 160C,предпочтительно от 100 до 150C, получая первую смесь, содержащую первую твердую фазу и первую водную фазу; подвергают указанную первую смесь ферментному гидролизу с получением второй смеси, содержащей вторую твердую фазу и вторую водную фазу; подвергают указанную вторую водную фазу ферментации в присутствии по меньшей мере одного вида олеогенных дрожжей, получая олеогенную клеточную биомассу, содержащую липиды. Липиды, полученные таким образом, можно преимущественно применять в получении биотоплива или экологического Примечание: библиография отражает состояние при переиздании топлива, которое можно использовать как таковое или в смеси с другими видами топлива для автомобилей. Примечание: библиография отражает состояние при переиздании Настоящее изобретение относится к способу получения липидов из биомассы, содержащей по меньшей мере один полисахарид. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения липидов из биомассы, содержащей по меньшей мере один полисахарид, в котором подвергают указанную биомассу кислотному гидролизу, подвергают смесь, полученную посредством указанного кислотного гидролиза, ферментативному гидролизу и подвергают сахара, полученные посредством указанного гидролиза, ферментации в присутствии по меньшей мере одного вида олеогенных дрожжей. Липиды, полученные таким образом, можно преимущественно применять в получении биотоплива или экологического топлива, которое можно использовать как таковое или в смеси с другими видами топлива для автомобилей. Вообще говоря, биомассой является любое вещество с органическим, растительным или животным матриксом, которое может быть предназначено для энергетических целей, например в качестве сырья для получения биотоплив или компонентов, которые могут быть добавлены к топливам. Таким образом,биомасса может образовывать возобновляемый источник энергии в качестве альтернативы традиционным видам ископаемого сырья, обычно используемым в получении топлив. Для этой цели особенно полезной является лигноцеллюлозная биомасса. Получение сахаров из биомассы, в частности лигноцеллюлозной биомассы, известно в данной области техники. Лигноцеллюлозная биомасса представляет собой комплексную структуру, содержащую три главных компонента: целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин. Их относительные количества варьируются в зависимости от типа используемой лигноцеллюлозной биомассы. В случае растений, например, указанные количества варьируются в зависимости от вида и возраста растения. Целлюлоза является наибольшей составляющей лигноцеллюлозной биомассы и обычно присутствует в количестве в интервале от 30 до 60 мас.%, в расчете на общую массу лигноцеллюлозной биомассы. Целлюлоза состоит из молекул глюкозы (от примерно 500 до 10000 единиц), связанных друг с другом посредством -1,4-гликозидной связи. Образование водородных связей между цепочками вызывает образование кристаллических доменов, которые придают устойчивость и эластичность растительным волокнам. В природе ее можно найти в ее чистом состоянии только в однолетних растениях, таких как хлопчатник и лен, тогда как в древесных растениях она всегда сопровождается гемицеллюлозой и лигнином. Гемицеллюлоза, которая обычно присутствует в количестве от 10 до 40 мас.%, в расчете на общую массу лигноцеллюлозной биомассы, присутствует в виде смешанного полимера, относительно короткого(от 10 до 200 молекул) и разветвленного, состоящего как из сахаров с шестью атомами углерода (глюкоза, манноза, галактоза), так и из сахаров с пятью атомами углерода (ксилоза, арабиноза). Некоторые важные свойства растительных волокон связаны с присутствием гемицеллюлозы, из которых главным свойством является способствование впитыванию влаги указанными растительными волокнами в присутствии воды, что вызывает их набухание. Гемицеллюлоза также обладает адгезивными свойствами и поэтому имеет тенденцию склеиваться или образовывать роговидную консистенцию, следствием чего является то, что указанные растительные волокна становятся твердыми и впитывают медленнее. Лигнин обычно присутствует в количестве в интервале от 10 до 30 мас.%, в расчете на общую массу лигноцеллюлозной биомассы. Его главная функция заключается в связывании и склеивании различных растительных волокон друг с другом, что придает растению компактность и устойчивость, а также обеспечивает защиту от насекомых, патогенных агентов, повреждений и ультрафиолетового света. Его используют главным образом в качестве топлива, но в настоящее время также широко применяют в промышленности в качестве диспергатора, отвердителя, эмульгатора, для слоистых пластиков, картонов и промышленных резиновых изделиях. Также его можно химически обрабатывать с получением ароматических соединений, ванилина, сирингальдегида, пара-гидроксибензальдегидного типа, которые можно применять в фармацевтической химии или в косметической и пищевой промышленности. Для того чтобы оптимизировать преобразование лигноцеллюлозной биомассы в продукты для энергетического использования, известно, что указанную биомассу подвергают предварительной обработке для отделения лигнина и гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы до простых сахаров, таких как, например, глюкоза и ксилоза. Эти сахара в присутствии микроорганизмов можно использовать в качестве источников углерода в ферментационных процессах для получения спиртов и/или липидов. В патентной заявке US 2008/0102176, например, описан способ экстракции растительных масел,включающий распыление сырья, содержащего целлюлозу, с целью получения частиц с диаметром 1-2 мм; погружение частиц в серную кислоту с концентрацией, равной 1-2% для подкисления указанных частиц с целью усиления гидролиза целлюлозы и доведения pH до значения 4,5+0,5; удаление частиц,подкисленных серной кислотой, и добавление последовательно целлюлазы и олеогенных дрожжей к подкисленным частицам, и ферментацию в течение 8-9 суток при температуре 25-30C и влажности 8590%; добавление алифатического углеводорода в качестве растворителя к продуктам ферментации с целью экстракции масел с получением экстракционной смеси; удаление подкисленных частиц, оставшихся в экстракционной смеси, и отделение масел от растворителя посредством дистилляции с получением неочищенного масла. Целлюлаза предпочтительно представляет собой Trichoderma viride, и олеогенные дрожжи представляют собой Rhodotorula glutinis. Полученные масла можно превращать в биотопливо после этерификации. В Dai et al. описано получения биотоплива из олеогенных дрожжей в статье: Biodiesel generationJournal of Biotechnology" (2007), vol. 6 (18), pages 2130-2134. В указанной статье лигноцеллюлозную биомассу измельчают и подвергают кислотному гидролизу в присутствии серной кислоты. Полученные таким образом сахара используют в качестве источников углерода в ферментационном процессе в присутствии предварительно выбранного штамма Rhodotorula glutinis, способного также использовать пентозы,в частности ксилозу, с целью получения масел, которые затем экстрагируют экстракцией по Сокслету и подвергают трансэтерификации с целью получения биотоплива. Однако вышеуказанные способы могут иметь различные недостатки. Чтобы гидролизовать оба полисахаридных компонента биомассы (например гемицеллюлозу и целлюлозу), в частности, например, в присутствии разбавленной серной кислоты (например с концентрациями в интервале от 0-5 до 11%), необходимо действовать при высоких температурах (например, выше 160C). При указанных температурах происходит образование побочных продуктов, получаемых в результате дегидратации сахаров и в результате частичной деполимеризации лигнина. Такие побочные продукты, в частности фурфурол, гидроксилметилфурфурол, фенольные соединения, могут действовать в качестве ингибиторов роста микроорганизмов, обычно используемых в последующих процессах ферментации сахара. Кроме того, в присутствии разбавленной серной кислоты выход сахара, в частности глюкозы, обычно низкий (например ниже 50%). Кроме того, перед тем как подвергать сахара ферментации, может быть необходимо нейтрализовать серную кислоту, чтобы довести pH до значений, приемлемых для последующей ферментации. Нейтрализации обычно достигают путем добавления оксидов и/или гидроксидов, таких как, например, оксид кальция, гидроксид кальция или гидроксид бария, с последующим образованием солей (например сульфата кальция, дигидросульфата кальция ("гипс")/сульфат бария), которые осаждаются и поэтому должны быть отделены от сахаров перед тем, как последние будут подвергнуты ферментации. Кроме того, эти соли затем должны быть отделены с помощью подходящей обработки с последующим увеличением затрат на получение. Кроме того, невозможно извлекать и повторно использовать указанную неорганическую кислоту. В настоящее время заявитель обнаружил, что получение липидов из биомассы, в частности из биомассы, содержащей по меньшей мере один полисахарид, можно выгодно осуществить с помощью способа, в котором подвергают указанную биомассу кислотному гидролизу в присутствии водного раствора по меньшей мере одной органической кислоты, при температуре ниже или равной 160C, подвергают смесь,полученную в результате указанного кислотного гидролиза, ферментативному гидролизу, и подвергают сахара, полученные в результате этих гидролизов, ферментации в присутствии по меньшей мере одних олеогенных дрожжей. Данный способ обеспечивает многочисленные преимущества. Указанный способ, например, позволяет получить высокий выход получаемых пентозных и гексозных сахаров, производимых в результате кислотного гидролиза указанной биомассы, которые затем можно использовать в качестве источников углерода в ферментационных процессах получения липидов. Указанные липиды можно выгодно использовать в получении биотоплива или экологического топлива, которое можно применять, как таковое или в смеси с другими видами топлива для автомобилей. Кроме того, возможность действовать при температуре не выше, то есть ниже или равной 160C,позволяет уменьшить образование побочных продуктов, таких как, например, фурфурол, гидроксилметилфурфурол, фенольные соединения, которые могут действовать в качестве ингибитора роста микроорганизмов, обычно используемых в последующих процессах ферментации сахаров. Другое важное преимущество состоит в том, что указанный способ позволяет извлекать органическую кислоту, которую затем можно повторно использовать в указанном выше способе, в частности в кислотном гидролизе биомассы. Указанное извлечение также позволяет избежать стадии нейтрализации и, следовательно, получения солей и их последующего устранения. Дополнительное важное преимущество состоит в том, что влажную твердую фазу, содержащую клеточный дебрис, в частности белки и полисахариды, содержащиеся в клеточной мембране используемых олеогенных дрожжей, которую получают в конце ферментации, можно извлекать и использовать в вышеуказанном способе, в частности ее можно использовать в кислотном гидролизе. Кислотный гидролиз данной влажной твердой фазы позволяет получать аминокислоты из белков и сахара из полисахаридов, которые затем отправляют на стадию ферментации, позволяя, таким образом, уменьшить количество азота, которое обычно должно добавляться в культуральную среду, в которой происходит ферментация, и обеспечить дополнительные сахара для ферментации. Объект настоящего изобретения, таким образом, относится к способу получения липидов из биомассы, содержащей по меньшей мере один полисахарид, в котором подвергают указанную биомассу кислотному гидролизу в присутствии водного раствора по мень-2 019318 шей мере одной органической кислоты, выбранной из алкил- или арилсульфоновых кислот, имеющих отC7 до C20 атомов углерода, предпочтительно от C9 до C15 атомов углерода, или из галогенированных карбоновых кислот, при температуре в интервале от 80 до 160C, предпочтительно от 100 до 150C, получая первую смесь, содержащую первую твердую фазу и первую водную фазу; подвергают указанную первую смесь ферментативному гидролизу с получением второй смеси, содержащей вторую твердую фазу и вторую водную фазу; подвергают указанную вторую водную фазу ферментации в присутствии по меньшей мере одного вида олеогенных дрожжей, получая олеогенную клеточную биомассу, содержащую липиды. Для целей настоящего описания изобретения и следующей формулы изобретения определение интервалов числовых значений всегда включает крайние значения, если не указано иное. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанный полисахарид может быть выбран из целлюлозы, гемицеллюлозы или их смесей. Целлюлоза или смеси гемицеллюлозы и целлюлозы, являются особенно предпочтительными. Согласно еще одному предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанная биомасса представляет собой лигноцеллюлозную биомассу. Как указано выше, лигноцеллюлозная биомасса включает три компонента: гемицеллюлозу, целлюлозу и лигнин. Указанную лигноцеллюлозную биомассу предпочтительно выбирают из продуктов культур, специально культивируемых для энергетического применения (например, мискантус, просо, обычный тростник), включая побочные продукты, остатки и отходы указанных культур или их переработки; продуктов сельскохозяйственной культивации, лесоразведения и лесоводства, содержащих древесину, растения, остатки и побочные продукты сельскохозяйственной переработки, лесоразведения и лесоводства; побочных продуктов сельскохозяйственного производства пищевых продуктов, предназначенных для зоотехники и питания людей; не обработанных химически остатков бумажной промышленности; отходов производства, получаемых от раздельного сбора твердых бытовых отходов (например, бытовых отходов растительного происхождения, бумаги). Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанную биомассу до кислотного гидролиза можно подвергать процессу предварительного измельчения. Указанную биомассу предпочтительно измельчают до получения частиц, имеющих диаметр в интервале от 0,1 до 10 мм, более предпочтительно в интервале от 0,5 до 4 мм. Частицы, имеющие диаметр менее 1 мм, являются особенно предпочтительными. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанная биомасса присутствует в реакционной смеси в количестве в интервале от 5 до 40 мас.%, предпочтительно от 20 до 35 мас.%, в расчете на общую массу реакционной смеси. Для целей настоящего описания изобретения и следующей формулы изобретения термин "реакционная смесь" означает смесь, содержащую биомассу и водный раствор указанной по меньшей мере одной органической кислоты. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанная по меньшей мере одна органическая кислота является растворимой в воде и экстрагируемой органическим растворителем,не растворимым в воде. Для целей настоящего изобретения и следующей формулы изобретения термин "органическая кислота, растворимая в воде" означает органическую кислоту, имеющую растворимость в дистиллированной воде при 25C по меньшей мере 0,5 г/100 мл дистиллированной воды, предпочтительно по меньшей мере 2 г/100 мл дистиллированной воды. Для целей настоящего изобретения и следующей формулы изобретения термин "органическая кислота, экстрагируемая органическим растворителем, не растворимым в воде" означает органическую кислоту, которую можно экстрагировать органическим растворителем, не растворимым в воде, с выходом по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, где указанный выход рассчитывают в расчете на общее количество органической кислоты, присутствующей в водном растворе. Для целей настоящего изобретения и следующей формулы изобретения термин "органический растворитель, не растворимый в воде" означает органический растворитель, который имеет растворимость в дистиллированной воде при 25C ниже 4 об.%, предпочтительно ниже 2 об.%. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанные алкил- или арилсульфоновые кислоты могут быть выбраны из додецилсульфоновой кислоты, пара-толуолсульфоновой кислоты,1-нафталинсульфоновой кислоты,2-нафталинсульфоновой кислоты,1,5 нафталиндисульфоновой кислоты или их смесей. Пара-толуолсульфоновая кислота, 2 нафталинсульфоновая кислота, 1,5-нафталиндисульфоновая кислота или их смеси являются особенно предпочтительными. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанные галогенированные карбоновые кислоты могут быть выбраны из кислот с количеством атомов углерода не выше 20, пред-3 019318 почтительно в интервале от 2 до 15, таких как, например, трифторуксусная кислота, дихлоруксусная кислота, трихлоруксусная кислота, перфтороктановая кислота или их смеси. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанная по меньшей мере одна органическая кислота присутствует в водном растворе в концентрации в интервале от 0,1 до 5 мас.%, предпочтительно от 0,5 до 2,5 мас.%, в расчете на общую массу водного раствора. Указанная органическая кислота действует в качестве катализатора для кислотного гидролиза указанной биомассы. В частности, если исходная биомасса представляет собой лигноцеллюлозную биомассу, то указанная органическая кислота специфически действует в качестве катализатора кислотного гидролиза гемицеллюлозы. Следует заметить, что способ, являющийся объектом настоящего изобретения,когда исходная биомасса представляет собой лигноцеллюлозную биомассу, не только делает возможным кислотный гидролиз получаемой гемицеллюлозы, но, благодаря улучшенной деструкции исходной биомассы, также улучшает предрасположенность целлюлозы, остающейся, по существу, негидролизованной, к последующему ферментативному гидролизу. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанный кислотный гидролиз можно выполнять в течение промежутка времени от 20 мин до 6 ч, предпочтительно от 30 мин до 3 ч. Указанный кислотный гидролиз можно выполнять в реакторах, известных в данной области техники, таких как, например, автоклавы или экструдеры. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанная первая твердая фаза содержит лигнин и целлюлозу и указанная первая водная фаза содержит по меньшей мере один сахар,имеющий от C5 до C6 атомов углерода, и указанную по меньшей мере одну органическую кислоту. Указанный сахар предпочтительно представляет собой ксилозу. Указанную ксилозу предпочтительно получают кислотным гидролизом гемицеллюлозы. Указанный кислотный гидролиз позволяет получить с высоким выходом по меньшей мере один сахар, имеющий от C5 до C6 атомов углерода, в частности ксилозу, получаемую кислотным гидролизом гемицеллюлозы. Более конкретно, указанный кислотный гидролиз позволяет получить выход ксилозы выше или равный 80%, где указанный выход рассчитывают в расчете на общее количество ксилозы, присутствующей в исходной биомассе. Указанный кислотный гидролиз также позволяет получить высокие выходы целлюлозы и лигнина. Для извлечения указанной по меньшей мере одной органической кислоты указанную первую смесь можно подвергать экстракции органическим растворителем, растворимым в воде. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения в указанном способе также подвергают указанную первую смесь экстракции по меньшей мере одним органическим растворителем,не растворимым в воде. Предпочтительно, указанный органический растворитель, не растворимый в воде, может быть выбран из галогенированных углеводородов, таких как, например, метиленхлорид, монохлорбензол, дихлорбензол или их смеси; ароматических углеводородов, таких как, например, толуол,ксилол или их смеси; алифатических спиртов, имеющих от C4 до С 6 атомов углерода, таких как, например, н-бутанол, н-пентанол или их смеси; или их смесей. Смеси толуола и н-бутанола являются особенно предпочтительными. Указанный органический растворитель, не растворимый в воде, затем выпаривают, получая дополнительную твердую фазу, содержащую указанную по меньшей мере одну органическую кислоту. Как указано выше, способ, являющийся объектом настоящего изобретения, позволяет извлечь указанную по меньшей мере одну органическую кислоту с высоким выходом, в частности с выходом по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, где указанный выход рассчитывают в расчете на общее количество органической кислоты, присутствующей в указанном водном растворе. Следовательно, указанную по меньшей мере одну органическую кислоту можно затем использовать повторно в зависимости от способа, являющегося объектом настоящего изобретения. Следует отметить, что, если извлечение указанной по меньшей мере одной органической кислоты равно 100%, то указанная первая водная фаза не будет содержать указанную по меньшей мере одну органическую кислоту. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанный способ также включает повторное использование указанной по меньшей мере одной органической кислоты в указанном кислотном гидролизе. Для целей способа, являющегося объектом настоящего изобретения, указанный ферментативный гидролиз можно выполнять согласно методикам, известным в данной области техники, как описано, например, в US 5628830, US 5916780 и US 6090595, используя имеющиеся в продаже ферменты, такие как например, Celluclast 1.5L (Novozymes), Econase СЕ (Rohm Enzymes), Spezyme (Genecor), Novozym 188(Novozymes), используемые по отдельности или в смеси друг с другом. Для регулирования pH до значений в интервале от 4 до 6, предпочтительно от 4,5 до 5,5, можно добавлять ледяную уксусную кислоту к указанной первой смеси перед ферментативным гидролизом в таком количестве, чтобы получать нужное значение pH. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанная вторая твердая фаза содержит лигнин и указанная вторая водная фаза содержит по меньшей мере один сахар, имеющий от С 5 до С 6 атомов углерода, предпочтительно ксилозу, глюкозу, целлобиозу или их смеси. В частности, ука-4 019318 занная вторая водная фаза содержит ксилозу, полученную посредством кислотного гидролиза гемицеллюлозы, глюкозу и целлобиозу, произведенные посредством ферментативного гидролиза целлюлозы. В частности, такой ферментативный гидролиз позволяет получить высокий выход получаемой глюкозы, более конкретно, выход глюкозы, который выше или равен 90%, где указанный выход рассчитывают в расчете на общее количество глюкозы, присутствующей в исходной биомассе. Количества сахаров, содержащихся в исходной биомассе, а также количества сахаров, полученных после гидролиза (кислотного и/или ферментативного гидролиза), можно определять с помощью известных в данной области техники способов, таких как, например, высокоэффективная жидкостная хроматография - ВЭЖХ. Указанную вторую твердую фазу и указанную вторую водную фазу можно разделять способами,известными в данной области техники, такими как, например, фильтрация, центрифугирование. Указанные фазы предпочтительно разделяют фильтрацией. Указанную вторую твердую фазу, содержащую лигнин, можно усовершенствовать в виде топлива,например в качестве топлива для получения энергии, необходимой, чтобы поддерживать процессы обработки биомассы. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанную ферментацию можно выполнять при температуре в интервале от 20 до 40C, предпочтительно от 25 до 35C. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанную ферментацию можно выполнять в течение промежутка времени от 3 до 10 суток, предпочтительно от 4 до 8 суток. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанную ферментацию можно выполнять при pH в интервале от 4,5 до 6,5, предпочтительно от 5 до 6. Для поддержания pH в пределах желательных интервалов к культуральной среде, используемой для ферментации, можно добавлять водный раствор по меньшей мере одного неорганического основания, такого как, например, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция, гидроксид магния или их смесей, в таком количестве, чтобы получать нужное значение рН. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанные олеогенные дрожжи могут быть выбраны из Rhodotorula glutinis, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula graminis, Lypomices starkeyi,Lypomices lipofer, Trigonopsis variabilis, Candida kefyr, Candida curvata, Candida lipolytica, Pichia stipitis,Torulopsis sp. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанная ферментация представляет собой периодическую ферментацию с подпиткой. Перед использованием в указанной ферментации указанные олеогенные дрожжи предпочтительно выращивают в культуральной среде, содержащей ксилозу, целлобиозу, глюкозу или их смеси, с концентрацией предпочтительно в интервале от 1 до 2 мас.%, в расчете на общую массу указанной культуральной среды. Указанную ферментацию можно преимущественно выполнять в ферментаторах, известных в данной области техники, в присутствии культуральных сред, обычно используемых для этой цели, содержащих питательные вещества, такие как, например, азот, фосфат калия, магний, соли, витамины. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения в указанном способе также подвергают указанную олеогенную клеточную биомассу механической обработке. Указанную механическую обработку можно осуществлять, используя оборудование и способы, известные в данной области техники. Указанную механическую обработку можно преимущественно осуществлять, например, используя гомогенизаторы высокого давления предпочтительно при давлении в интервале от 300 до 500 бар (30-50 МПа) (например, гомогенизатор Polytron) или используя "Френч-пресс". Механическую обработку предпочтительно осуществляют, применяя "Френч-пресс", работающий при давлении в интервале от 20 до 50 килофунтов на квадратный дюйм (137,9-344,8 МПа), предпочтительно от 35 до 45 килофунтов на квадратный дюйм (241,3-310,3 МПа). С целью концентрирования олеогенной клеточной биомассы перед механической обработкой указанную биомассу можно центрифугировать. Указанное центрифугирование можно осуществлять в течение промежутка времени от 5 до 30 мин,предпочтительно от 15 до 25 мин, при скорости вращения в интервале от 3000 до 9000 об./мин, предпочтительно от 4000 до 8000 об./мин. С целью дезактивирования липолитичеких ферментов (например липазы) указанную олеогенную клеточную биомассу перед механической обработкой можно подвергать термической обработке. Указанную термическую обработку можно выполнять при температуре в интервале от 70 до 90C, предпочтительно от 75 до 85C, в течение промежутка времени от 30 мин до 3 ч, предпочтительно от 1 до 2 ч. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения в указанном способе указанную олеогенную клеточную биомассу после механической обработки также подвергают центрифугированию. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанное центрифугирование можно выполнять в течение промежутка времени от 5 до 30 мин, предпочтительно от 10 до 25 мин, при скорости вращения в интервале от 3000 до 9000 об./мин, предпочтительно от 4000 до 8000 об./мин. В конце центрифугирования получают следующие фазы:(2) водную фазу, содержащую следовые количества неотделенных липидов и неферментированных сахаров;(3) влажную твердую фазу, содержащую клеточный дебрис и следовые количества неотделенных липидов. Способ, являющийся объектом настоящего изобретения, позволяет извлекать липиды с выходом в интервале от 50 до 90%, предпочтительно от 55 до 80%, где указанный выход рассчитывают в расчете на общее количество липидов, присутствующих в олеогенной клеточной биомассе, полученной после ферментации. Липиды, включенные в указанную масляную фазу (1), предпочтительно представляют собой триглицериды, более предпочтительно сложные эфиры глицерина с жирными кислотами, имеющими от C14 до C20 атомов углерода, такими как, например, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, олеиновая кислота, -линолевая кислота, в количестве выше или равном 80 мас.%, предпочтительно выше или равном 90 мас.%, в расчете на общую массу липидов. Другие липиды, которые могут присутствовать в указанной масляной фазе, представляют собой фосфолипиды, моноглицериды, диглицериды или их смеси. Количество липидов, содержащихся в олеогенной клеточной биомассе, полученной после ферментации, также как и количество липидов, содержащихся в указанной масляной фазе, можно определять способами, известными в данной области техники, таких как, например, колориметрический способ, который основан на взаимодействии липидов с фосфорной кислотой и фосфованилином: дополнительные подробности, относящиеся к данному способу, можно найти, например, в следующей статье: "Chemicalin "Clinical Chemistry" (1972), vol. 18, No. 3, pages 199-202. Как уже указано выше, влажную твердую фазу (3), содержащую клеточный дебрис, в частности белки и полисахариды, которые содержатся в клеточной мембране используемых олеогенных дрожжей,можно извлекать и использовать в способе, являющемся объектом настоящего изобретения, в частности ее можно направить на кислотный гидролиз. Белки и полисахариды мембраны затем гидролизуют до аминокислот и простых сахаров (например, глюкозы, маннозы), которые затем можно использовать в качестве источника азота и углерода в последующей ферментации. Следует отметить тот факт, что извлечение и использование указанной влажной твердой фазы (3) делает возможным добавление азота к культуральной среде, используемой для ферментации, в результате, понижая количество азота, обычно добавляемого к культуральной среде, в которой происходит ферментация, и обеспечивая дополнительные сахара для ферментации. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанный способ также включает направление указанной влажной твердой фазы (3) на кислотный гидролиз. В этом случае указанная первая водная фаза, кроме указанного по меньшей мере одного сахара, имеющего от С 5 до C6 атомов углерода, и указанной по меньшей мере одной органической кислоты, содержит аминокислоты и простые сахара (например глюкозу и маннозу), полученные в результате кислотного гидролиза белков и полисахаридов мембраны; тогда как указанная первая твердая фаза содержит, кроме целлюлозы и лигнина, негидролизованный клеточный дебрис. С целью получения более высокого выхода липидов, то есть выхода выше 90%, указанную водную фазу (2) и/или указанную влажную твердую фазу (3) можно подвергать экстракции растворителем или смесью спирт/растворитель. Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения указанный способ также включает экстракцию указанной водной фазы (2) и/или указанной влажной твердой фазы (3) по меньшей мере одним растворителем, который может быть выбран из алифатических углеводородов, имеющих от С 3 доC10 атомов углерода, таких как, например, пентан, н-гексан, октан или их смесей; или смесью, содержащей по меньшей мере один алифатический спирт, имеющий от C3 до C5 атомов углерода, которые могут быть выбраны, например, из изопропанола, н-бутанола или их смесей, и по меньшей мере один алифатический углеводород, имеющий от C3 до C10 атомов углерода, выбранный из описанных выше. Указанный органический растворитель и/или указанную смесь затем упаривали, получая дополнительную масляную фазу, содержащую липиды, дополнительную водную фазу, содержащую неферментированные сахара, и дополнительную влажную твердую фазу, содержащую клеточный дебрис. Как описано выше для влажной твердой фазы (3), указанную дополнительную влажную твердую фазу, полученную после указанной экстракции, также можно извлекать и направлять на кислотный гидролиз. Липиды, полученные способом по настоящему изобретению, можно подвергать этерификации в присутствии спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, предпочтительно метанола, этанола, и кислотного или основного катализатора с целью получения глицерина и алкиловых эфиров, в частности метиловых эфиров или этиловых эфиров (биотоплива). Альтернативно, указанные липиды можно подвергать гидрированию/дезоксигенированию в при-6 019318 сутствии водорода и катализатора с целью получения экологического топлива. Способы гидрирования/дезоксигенирования известны в данной области техники и описаны, например, в заявке на европейский патент EP 1728844. Далее настоящее изобретение будет описано в иллюстративной форме со ссылкой на чертеж, представленный здесь. В соответствии с типичным воплощением способа, являющегося объектом настоящего изобретения,биомассу (например предварительно измельченную лигноцеллюлозную биомассу) подвергают кислотному гидролизу в присутствии органической кислоты (например 2-нафталин-сульфоновой кислотой),получая первую смесь, содержащую первую водную фазу, включающую ксилозу, полученную в результате гидролиза гемицеллюлозы, и указанную органическую кислоту, и первую твердую фазу, содержащую лигнин и целлюлозу. Как представлено на чертеже, указанную первую смесь экстрагируют органическим растворителем,нерастворимым в воде (например, смесями толуола и н-бутанола) с целью извлечения указанной органической кислоты и ее повторного использования, после выпаривания растворителя, в указанном кислотном гидролизе. После экстракции растворителем указанные первые смеси подвергают ферментативному гидролизу в присутствии фермента (например, водного раствора Celluclast 1,5L и Novozym 188), получая вторую смесь, содержащую вторую водную фазу, включающую ксилозу, полученную в результате кислотного гидролиза гемицеллюлозы, глюкозу и целлобиозу, полученные в результате ферментативного гидролиза целлюлозы, и вторую твердую фазу, включающую лигнин. До ферментативного гидролиза к указанной первой смеси можно добавлять ледяную уксусную кислоту, чтобы довести pH до значений в интервале от 4 до 6 (не представлено на чертеже). Указанную вторую водную фазу и указанную вторую твердую фазу разделяли фильтрацией (не представлено на чертеже). Указанную вторую водную фазу подвергают ферментации в присутствии олеогенных дрожжей (например, Lypomyces starkey NRRL 1389). В конце ферментации получают олеогенную клеточную биомассу, которую подвергают механической обработке (например с помощью Френч-пресса) и последующему центрифугированию, получая следующие три фазы: 1) масляную фазу, содержащую липиды; 2) водную фазу, содержащую следовые количества неотделенных липидов и неферментированных сахаров; 3) влажную твердую фазу, содержащую клеточный дебрис и следовые количества неотделенных липидов. С целью концентрирования олеогенной клеточной биомассы до механической обработки, указанную биомассу можно подвергать центрифугированию (не представлено на чертеже). С целью дезактивирования липолитичеких ферментов (например липазы) до механической обработки указанную олеогенную клеточную биомассу можно подвергать термической обработке (не представлено на чертеже). Как представлено на чертеже, указанную влажную твердую фазу (3) направляют на кислотный гидролиз. Для получения более высоких выходов липидов, указанную водную фазу (2) и указанную влажную твердую фазу (3) можно подвергать экстракции в присутствии смеси, содержащей по меньшей мере один алифатический спирт и по меньшей мере один алифатический углеводород (например смесь изопропанола и н-гексана) (не представлено на чертеже). Для лучшего понимания настоящего изобретения и для его осуществления предлагаются некоторые иллюстративные и неограничивающие примеры. Пример 1. Кислотный гидролиз биомассы 300 г предварительно измельченной (диаметр частиц 1 мм) древесины хвойных пород добавляли к раствору 20 г 2-нафталинсульфоновой кислоты в 1 л воды. Состав исходной биомассы представлял собой следующее: 50 мас.% целлюлозы, 25 мас.% гемицеллюлозы, 25 мас.% лигнина в расчете на общую массу исходной биомассы. Полученную таким образом реакционную смесь поддерживали при перемешивании в автоклаве при 140C в течение 1 ч, получая первую смесь, содержащую 225 г (сухая масса) первой твердой фазы (содержащей целлюлозу и лигнин) и 1095 г первой водной фазы (содержащей ксилозу, полученную в результате гидролиза гемицеллюлозы, и 2-нафталинсульфоновую кислоту). После охлаждения до 25C указанную первую смесь подвергали экстракции 1 л смеси толуола и нбутанола (3/1 по объему). Затем смесь толуола и н-бутанола разделяли и упаривали при пониженном давлении, получая дополнительную твердую фазу, содержащую 19,6 г (сухая масса) 2-нафталинсульфоновой кислоты (процент извлечения 98%, рассчитанный в расчете на общее количество кислоты, присутствующей в водном растворе). После отделения кислоты к указанной первой смеси добавляли ледяную уксусную кислоту вплоть до получения pH указанной первой водной фазы, равного 5. Затем добавляли водный раствор фермента Celluclast 1,5 L (Novozymes), соответствующий 1485 ед. ЦлА (Filter Paper Units, единиц целлюлозной активности), и фермента Novozym 188 (от Novozymes), соответствующий 18000 BGU (бета-глюканазные единицы). Полученную таким образом суспензию поддерживали при перемешивании в течение 72 ч при 45C. В конце ферментативного гидролиза 90 г (сухая масса) второй твердой фазы, содержащей лигнин(75 г - сухая масса) и негидролизованную целлюлозу (15 г - сухая масса), и 1200 г второй водной фазы,содержащей глюкозу (152 г - сухая масса) и ксилозу (72 г - сухая масса), разделяли фильтрацией. Ферментация 250 мл указанной второй водной фазы, полученной, как описано выше, содержащей 200 г/л сахаров,подходящим образом разбавляли дистиллированной водой до получения раствора, имеющего конечную концентрацию сахаров, равную 50 г/л. К данному раствору добавляли следующие питательные вещества: сульфат аммония 0,1%, KH2PO4 0,1%, MgSO47H2O 0,005%, NaCl 0,001%, CaCl2 0,001%, дрожжевой экстракт 0,1%. Полученный таким образом ферментационный бульон (культуральную среду) инокулировали в ферментатор с дрожжевыми клетками (Lypomices starkey NRRL 1389) (инокулят, равный 2,5 г/л - сухая масса) до объема ферментации, равного 1 л, и pH поддерживали при 5,5 путем добавления водного раствора NaOH 0,1 М. Дрожжевые клетки выращивали при перемешивании со скоростью 500 об./мин при 30C, аэрация 0,5 л/мин стерильного воздуха. В ферментатор добавляли еще 250 мл указанной второй водной фазы, содержащей 200 г/л сахаров,полученной в результате гидролиза биомассы, подходящим образом разбавленную дистиллированной водой до получения раствора, имеющего конечную концентрацию сахаров, равную 50 г/л. Через 150 ч дрожжевые клетки собирали и центрифугировали при 7000 об./мин в течение 20 мин,получая 52 г (сухая масса) олеогенной клеточной биомассы. Извлечение липидов Полученную таким образом олеогенную клеточную биомассу поддерживали при 80C в течение 2 ч, чтобы ингибировать липолитические ферменты, и затем ресуспендировали в 200 мл воды. Полученную таким образом суспензию подвергали механической обработке с помощью "Френчпресса", при давлении 39 килофунтов на квадратный дюйм (269 МПа) с получением клеточного лизата. Указанный клеточный лизат центрифугировали при 7000 об./мин в течение 20 мин, получая три фазы: масляную фазу, не растворимую в воде, водную фазу и влажную твердую фазу. Масляную фазу, не растворимую в воде, отделяли и сушили в печи при 60C, получая 19 г (сухая масса) масляного остатка, содержащего липиды. Водную фазу, содержащую следовые количества неотделенных липидов и неферментированных сахаров, и влажную твердую фазу, содержащую клеточный дебрис и следовые количества неотделенных липидов, экстрагировали 50 мл смеси, содержащей н-гексан и изопропанол в пропорции 3:1. Смесь растворителей разделяли и упаривали при пониженном давлении, получая 12,2 г (сухая масса) дополнительного масляного остатка, содержащего липиды, дополнительную влажную твердую фазу и дополнительную водную фазу. Общее количество полученных липидов соответственно равно 31,2 г (сухая масса) (процент извлечения 60%, рассчитанный в расчете на общее количество олеогенной клеточной биомассы, полученной после ферментации). Липиды определяли с помощью колориметрического способа, который основан на взаимодействии липидов с фосфорной кислотой и фосфованилином. Дополнительную влажную твердую фазу, полученную после экстракции липидов, содержащую воду и клеточный дебрис, содержащую 42 мас.% (сухая масса) полисахаридов и 45 мас.% белков (сухая масса), отделяли центрифугированием от дополнительной водной фазы, содержащей неферментированные сахара. Пример 2. Дополнительную влажную твердую фазу, полученную после экстракции липидов, как описано в примере 1, направляли на кислотный гидролиз, действуя в условиях, указанных ниже. 42 г (сухая масса) указанной дополнительной влажной твердой фазы и 260 г предварительно измельченной (частицы диаметром 1 мм) древесины хвойных пород добавляли к раствору 20 г 2 нафталинсульфоновой кислоты в 1 л воды. Состав исходной биомассы был следующим: 50 мас.% целлюлозы, 25 мас.% гемицеллюлозы, 25 мас.% лигнина в расчете на общую массу исходной биомассы. Полученную таким образом реакционную смесь поддерживали при перемешивании в автоклаве при 140C в течение 1 ч, получая первую смесь, содержащую 198 г (сухая масса) первой твердой фазы (содержащей целлюлозу, лигнин и клеточный дебрис) и 1100 г первой водной фазы (содержащей ксилозу,полученную в результате гидролиза гемицеллюлозы, глюкозу, маннозу и аминокислоты, полученные в результате гидролиза полисахаридов и мембранных белков, включенных в клеточный дебрис, и 2-8 019318 нафталинсульфоновую кислоту). После охлаждения до 25C указанную первую смесь подвергали экстракции 1 л смеси толуола и нбутанола (3/1 об.). Смесь толуола и н-бутанола затем разделяли и упаривали при пониженном давлении, получая дополнительную твердую фазу, содержащую 19,5 г (сухая масса) 2-нафталинсульфоновой кислоты (процент извлечения 98%, рассчитанный в расчете на общее количество кислоты, присутствующей в водном растворе). После отделения кислоты к указанной первой смеси добавляли ледяную уксусную кислоту до получения pH указанной первой водной фазы, равного 5,0. Затем добавляли водный раствор фермента Celluclast 1,5L (Novozymes), соответствующего 1400 ед. ЦлА (Filter PaperUnits), и фермента Novozym 188 (от Novozymes), соответствующего 18000 BGU (бетаглюканазные единицы). Суспензию, полученную таким образом, поддерживали при перемешивании в течение 72 ч при 45C. В конце ферментативного гидролиза 80 г (сухая масса) второй твердой фазы, содержащей лигнин(65 г - сухая масса), негидролизованную целлюлозу(13 г - сухая масса) и клеточный дебрис (2 г - сухая масса), и 1220 г второй водной фазы, содержащей глюкозу (139 г - сухая масса), маннозу (9 г - сухая масса), ксилозу (67 г - сухая масса) и аминокислоты (20 г - сухая масса), разделяли фильтрацией. Указанную вторую водную фазу можно подвергать ферментации, действуя, как описано в примере 1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения липидов из биомассы, содержащей по меньшей мере один полисахарид, при котором подвергают указанную биомассу кислотному гидролизу в присутствии водного раствора по меньшей мере одной органической кислоты, выбранной из алкил- или арилсульфоновых кислот, содержащих от C7 до C20 атомов углерода, или из галогенированных карбоновых кислот с количеством атомов углерода не выше 20, при температуре в интервале от 80 до 160C, с получением первой смеси, содержащей первую твердую фазу и первую водную фазу,подвергают указанную первую смесь ферментативному гидролизу, получая вторую смесь, содержащую вторую твердую фазу и вторую водную фазу,подвергают указанную вторую водную фазу ферментации в присутствии по меньшей мере одних олеогенных дрожжей с получением олеогенной клеточной биомассы, содержащей липиды. 2. Способ по п.1, где указанные алкил- или арилсульфоновые кислоты содержат от C9 до C15 атомов углерода. 3. Способ по любому из пп.1 или 2, где указанные температуры изменяются от 100 до 150C. 4. Способ по любому из пп.1-3, где указанный полисахарид выбран из целлюлозы, гемицеллюлозы или их смесей. 5. Способ по любому из пп.1-4, где указанная биомасса представляет собой лигноцеллюлозную биомассу. 6. Способ по п.5, где указанная лигноцеллюлозная биомасса выбрана из следующего: продукты культур, специально выращиваемых для энергетического применения (например, мискантус, просо, обычный тростник), включая побочные продукты, остатки и отходы указанных культур или их переработки; продукты сельскохозяйственной культивации, лесоразведения и лесоводства, содержащие древесину, растения, остатки и побочные продукты сельскохозяйственной переработки, лесоразведения и лесоводства; побочные продукты сельскохозяйственного производства пищевых продуктов, предназначенные для зоотехники и питания людей; не обработанные химически остатки бумажной промышленности; отходы производства, получаемые от раздельного сбора твердых бытовых отходов. 7. Способ по любому из пп.1-6, где перед кислотным гидролизом указанную биомассу подвергают процессу предварительного измельчения. 8. Способ по п.7, где указанную биомассу измельчают до получения частиц, имеющих диаметр в интервале от 0,1 до 10 мм. 9. Способ по п.8, где указанную биомассу измельчают до получения частиц, имеющих диаметр менее 1 мм. 10. Способ по любому из пп.1-9, где указанная биомасса присутствует в реакционной смеси в количестве от 5 до 40 мас.% в расчете на общую массу реакционной смеси. 11. Способ по любому из пп.1-10, где указанная по меньшей мере одна органическая кислота растворима в воде и экстрагируется органическим растворителем, нерастворимым в воде. 12. Способ по любому из пп.1-11, где указанные алкил- или арилсульфоновые кислоты выбраны из додецилсульфоновой кислоты, паратолуолсульфоновой кислоты, 1-нафталинсульфоновой кислоты, 2-9 019318 нафталинсульфоновой кислоты, 1,5-нафталиндисульфоновой кислоты или их смесей. 13. Способ по п.12, где указанная по меньшей мере одна органическая кислота выбрана из паратолуолсульфоновой кислоты, 2-нафталинсульфоновой кислоты, 1,5-нафталиндисульфоновой кислоты или их смесей. 14. Способ по любому из пп.1-11, где указанные галогенированные карбоновые кислоты выбраны из трифторуксусной кислоты, дихлоруксусной кислоты, трихлоруксусной кислоты, перфтороктановой кислоты или их смеси. 15. Способ по любому из пп.1-14, где указанная по меньшей мере одна органическая кислота присутствует в водном растворе в концентрации в интервале от 0,1 до 5 мас.% из расчета на общую массу водного раствора. 16. Способ по любому из пп.1-15, где указанный кислотный гидролиз выполняют в течение промежутка времени от 20 мин до 6 ч. 17. Способ по любому из пп.1-16, где указанная первая твердая фаза содержит лигнин и целлюлозу. 18. Способ по любому из пп.1-17, где указанная первая водная фаза содержит по меньшей мере один сахар, содержащий от С 5 до C6 атомов углерода, и указанную по меньшей мере одну органическую кислоту. 19. Способ по п.18, где указанный по меньшей мере один сахар представляет собой ксилозу. 20. Способ по любому из пп.1-19, где указанную первую смесь подвергают экстракции органическим растворителем, нерастворимым в воде. 21. Способ по п.20, где указанный нерастворимый в воде органический растворитель выбран из галогенированных углеводородов, выбранных из метиленхлорида, монохлорбензола, дигидробензола или их смесей; ароматических углеводородов, выбранных из толуола, ксилола или их смесей; алифатических спиртов, содержащих от С 4 до C6 атомов углерода, выбранных из н-бутанола, н-пентанола или их смесей; или их смесей. 22. Способ по п.21, где указанный органический растворитель, нерастворимый в воде, выбран из смесей толуола и н-бутанола. 23. Способ по любому из пп.20-22, где указанный органический растворитель, не растворимый в воде, выпаривают с получением дополнительной твердой фазы, содержащей указанную по меньшей мере одну органическую кислоту. 24. Способ по любому из пп.1-23, где указанный способ включает повторное использование указанной по меньшей мере одной органической кислоты в указанном кислотном гидролизе. 25. Способ по любому из пп.1-24, где указанная вторая твердая фаза содержит лигнин. 26. Способ по любому из пп.1-25, где указанная вторая водная фаза содержит по меньшей мере один сахар, имеющий от С 5 до С 6 атомов углерода. 27. Способ по любому из пп.1-26, где указанная вторая водная фаза содержит ксилозу, глюкозу и целлобиозу. 28. Способ по любому из пп.1-27, где указанную ферментацию выполняют при температуре в интервале от 20 до 40C. 29. Способ по любому из пп.1-28, где указанную ферментацию выполняют в течение промежутка времени от 3 до 10 суток. 30. Способ по любому из пп.1-29, где указанную ферментацию выполняют при pH в интервале от 4,5 до 6,5. 31. Способ по любому из пп.1-30, где указанные олеогенные дрожжи выбраны из Rhodotorula glutinis, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula graminis, Lypomices starkeyi, Lypomices lipofer, Trigonopsis variabilis,Candida kefyr, Candida curvata, Candida lipolytica, Pichia stipitis, Torulopsis sp. 32. Способ по любому из пп.1-31, где указанная ферментация представляет собой периодическую ферментацию с подпиткой. 33. Способ по любому из пп.1-32, где указанную олеогенную клеточную биомассу подвергают механической обработке. 34. Способ по п.33, где указанную механическую обработку выполняют, используя "French presscell" (Френч-пресс), работающий при давлении в интервале от 20 до 50 кфунтовкв.дюйм (137,9-344,8 МПа). 35. Способ по любому из пп.33 или 34, где указанную олеогенную клеточную биомассу подвергают центрифугированию после механической обработки. 36. Способ по п.35, где указанное центрифугирование выполняют в течение периода времени от 5 до 30 мин. 37. Способ по любому из пп.35 или 36, где указанное центрифугирование выполняют со скоростью вращения в интервале от 3000 до 9000 об./мин. 38. Способ по любому из пп.35-37, где в конце центрифугирования получают следующие три фазы:(2) водную фазу, содержащую следовые количества неотделенных липидов и неферментированных сахаров;(3) влажную твердую фазу, содержащую клеточный дебрис и следовые количества неотделенных липидов. 39. Способ по п.38, где указанную влажную твердую фазу (3) передают на кислотный гидролиз. 40. Способ по п.38, где указанную водную фазу (2) и/или указанную влажную твердую фазу (3) подвергают экстракции по меньшей мере одним растворителем, который может быть выбран из алифатических углеводородов, имеющих от C3 до C10 атомов углерода; или смесью, содержащей по меньшей мере один алифатический спирт, имеющий от С 3 до С 5 атомов углерода, и по меньшей мере один алифатический углеводород, имеющий от С 3 до C10 атомов углерода.