Добавка к культуральной среде для производства вируса

ДОБАВКА К КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЕ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВИРУСА Изобретение раскрывает применение амфотерицина В в качестве добавки в культуральную среду для стимуляции роста вируса и способ культивирования вируса в присутствии амфотерицина В. Предложенный способ применим как для ДНК-, так и для РНК-содержащих вирусов. Амфотерицин В используется в концентрации между 0,5 нг/мл и 5 мкг/мл, при этом увеличение вирусного роста составляет 0,1 log 10 - 2,5 log 10.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: АВИР ГРИН ХИЛЗ БАЙОТЕКНОЛОДЖИ РИСЕРЧ ДИВЕЛОПМЕНТ ТРЕЙД АГ (AT) Данное изобретение обеспечивает применение амфотерицина В в качестве добавки к культуральной среде для размножения вируса. Дополнительно описывается способ культивирования вируса в присутствии амфотерицина В и способ идентификации вируса. В настоящее время многие вирусные вакцины, за исключением гриппозной, производят с применением первично-трипсинизированных клеток, например клеток из почек обезьян и почек кроликов и хомяков (см., например, WO 9738094). Первичные диплоидные клеточные культуры имеют определенные преимущества, такие как легкое приготовление с применением простой среды и бычьей сыворотки и чувствительность к широкому диапазону множества вирусов. Однако первичные диплоидные клетки имеют недостатки, такие как комбинация с различными случайными агентами, вариабельное качество и чувствительность и трудность получения подходящей ткани для культивирования (например, почек обезьяны). Напротив, преимуществами применения стабильных клеточных линий являются сохранение ими природных антигенных характеристик инфекционного вируса, стандартизация, высокая восприимчивость к вариантам одного и того же вируса и способность к выращиванию в виде большой массы клеток с применением систем ферментров с микроносителями или суспензиями. Однако эти преимущества сами по себе делают такие клеточные линии пригодными для применения в производстве вакцин. Mizrahi, ed., Viral Vaccines, Wiley-Liss, New York (1990), pp. 39-67. Например,вирус гриппа А, выделенный и перевиваемый исключительно на культурах клеток млекопитающих, как было найдено, в некоторых случаях сохраняет большинство своих исходных антигенных характеристик,что является чертой, обеспечивающей большие преимущества при производстве вакцины (Romanova J. etal., Virology, 2003, 307(l):90-7; Romanova J. et al., Virus Res. 2004, 103:187-93). Однако первичные диплоидные культуры клеток млекопитающих представляют трудности в качестве системы клетки-хозяина при производстве вакцины. Это обусловлено такими проблемами, как контаминация клеточной культуры случайными агентами, вариабельное количество клеток в клеточной культуре, различная чувствительность клеток к вариантам одного и того же вируса, низкие титры вируса и высокая стоимость и трудность получения и подготовки таких клеточных культур. Далее, как сообщалось, среди анализированных стабильных клеточных линий только MDCK клетки(Мадин Дарби линия клеток почки собаки) поддерживают потенциально достаточный рост и выделение вирусов (Frank et al., J. Clin. Microb. 10:3236 (1979); SchepetinkKok, J. Virol. Methods 42:241-250(1993. Две других стабильных клеточных линии - клеток почек африканских зеленых мартышек (Vero) и почек детенышей хомяков (BK-21) - охарактеризованы, утверждены и сертифицированы Всемирной организацией здравоохранения (WHO) для производства вакцин для человека. Однако клетки Vero, несмотря на сертификацию, ранее были признаны нестабильными для крупномасштабного производства вакцин из вируса гриппа человека. Например, рост гриппа В на клетках Vero был значительно ограничен по сравнению с клетками MDCK (Nakamura et al., J. Gen. Virol. 56:199-202 (1981. Кроме того, попытки применения клеток Vero для оценки чувствительности к римантадину вируса гриппа А человека H1N1 иH3N2 дали сомнительные результаты из-за низких титров вируса, вырабатывающегося в этих клетках, по сравнению с клетками MDCK (Gorvakova E.A. et al., J. Virol., 1996, 70:5519-24). Таким образом, эти и другие исследования указывают, что вирус гриппа ранее плохо воспроизводился в клетках Vero, что делает его непригодным для крупномасштабного производства вакциныKaverin N.V. и Webster R.G. (J. Virol., 1995, 69(4):2700-3) описывают необходимость повторного добавления трипсина в культуральную среду для клеток Vero, инфицированных вирусом гриппа, для восстановления полицикличного типа роста штаммов вируса гриппа А. Тем не менее, необходимое повторное добавление трипсина является достаточно трудоемким и занимает много времени, поскольку трипсин нужно добавлять на различных стадиях культивирования (см. также Gorvakova E.A. et al., J. Infect.Dis., 1995, 172:250-3). Члены семейства ДНК-вирусов содержат геномы с двойной цепью. Семейство парвовирусов является единственным исключением. Большинство ДНК-геномов являются не просто линейными молекулами. Например, геномы паповавирусов являются ковалентно закрытыми двухцепочечными кольцами, а геномы гепаднавирусов являются двусторонними кольцами, в которых одна цепь содержит однонитевой разрыв, а другая содержит двухнитевой разрыв. Концы двухцепочечного генома поксвирусов ковалентно соединены, в то время как геномы герпесвирусов содержат терминальные и внутренние дупликации. ДНК-вирусы классифицируются на следующие семейства: Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae,Hepadnaviridae, Herpesviridae, Iridoviridae, Bacuoloviridae и Poxviridae. Двухцепочечные РНК-вирусы классифицируются на две группы: Reoviridae и Birnaviridae. Семейства вирусов, содержащих покрытую оболочкой одноцепочечную РНК из отрицательносмыслового генома, классифицируются на группы, имеющие несегментированные геномы (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae и вирус болезни Борна, Togaviridae) или имеющие сегментированные геномы (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae). Семейство Orthomyxoviridae включает вирусы гриппа типов А, В и С, а также вирусы Тогото и Дхори и вирус инфекционной анемии лосося. Вирионы гриппа состоят из внутренней рибонуклеопротеиновой сердцевины (геликального нуклеокапсида), содержащей одноцепочечный РНК-геном, и внешней липопротеиновой оболочки, выстланной внутри матриксным белком (M1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из восьми молекул (семи для гриппа С) из линейной, с отрицательной полярностью, одноцепочечной РНК, кодирующей десять полипептидов, включая РНК-зависимые РНК полимеразные белки (РВ 2, РВ 1 и РА) и нуклеопротеин (NP), образующий нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (M1, М 2); два поверхностных гликопротеина, выступающих из содержащей липиды оболочки: гемагглютинин (HA) и нейраминидазу(NA); неструктурный белок (NS1) и ядерный экспортный белок (NEP). Транскрипция и репликация генома осуществляется в ядре, а сборка проходит посредством почкования на плазматической мембране. Вирусы могут пересортировывать гены при смешанных инфекциях. Вирус гриппа абсорбируется посредством HA на сиалилолигосахаридах гликопротеинов и гликолипидов клеточной мембраны. После эндоцитоза вириона происходят конформационные изменения в молекулеHA в клеточной эндосоме, облегчающие слияние мембраны, таким образом запуская декапсидацию. Нуклеокапсид мигрирует к ядру, где вирусная мРНК транскрибируется. Вирусная мРНК транскрибируется с помощью уникального механизма, при котором вирусная эндонуклеаза расщепляет закрытый 5'конец клеточной гетерологичной мРНК, которая служит в качестве праймера для транскрипции шаблонов вирусной РНК вирусной транскриптазой. Транскрипты заканчиваются на участках 15-22 основания от конца их шаблонов, где олиго (U) последовательности действуют как сигналы для добавления поли(A) участков. Из восьми молекул вирусной РНК, произведенных таким образом, шесть являются полицистронными транскриптами, которые транслируются непосредственно в белки, представляющие НА, NA,NP и вирусные полимеразные белки, РВ 2, РВ 1 и РА. Два других транскрипта подвергаются сплайсингу,где каждый дает две мРНК, которые транслируются в различные рамки считывания для выработки M1,М 2, NS1 и NEP. Другими словами, восемь вирусных РНК сегментов кодируют одиннадцать белков: девять структурных и неструктурный, и недавно идентифицированный PB1-F2 белок. Учитывая трудности производства большого количества вирусных частиц. необходимых, главным образом, для профилактического и лечебного применения, задачей данного изобретения является обеспечение новых способов культивирования и добавок, способных увеличить выход и качество вируса,размножаемого в стабильных клеточных линиях. Проблему решают путем применения амфотерицина В в качестве культуральной добавки для размножения вируса. В соответствии с предшествующим уровнем техники известно, что амфотерицин В демонстрирует противогрибковые свойства и широко применяется для лечения и профилактики грибковых инфекций у животных и человека. Помимо уже известных свойств амфотерицина В авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что амфотерицин В можно также применять для культивирования и размножения вирусных частиц, которые часто трудно культивировать, и которые требуются в больших количествах для различных целей, таких как профилактическое, лечебное и промышленное применение. Амфотерицин В метиловый эфир, производное амфотерицина В, как было описано, повышает инфицирующую способность РНК вируса энцефаломиокардита и ДНК вируса SV40 (Borden E. et al., J. gen.Virol., 1979, 42,297-303; Borden E. et al., Archives of Virology, 1981, 69, 161-165), но до сих пор в предшествующем уровне техники нет указаний или свидетельств его применения с целью культивирования вирусов. При использовании амфотерицина В в соответствии с данным изобретением можно увеличить рост вируса, что может также привести к увеличению инфицирующей способности вирусных частиц даже при низкой множественности заражения. В соответствии с данным изобретением вирусы, которые можно успешно культивировать, являются ДНК- или РНК-вирусами, предпочтительно РНК-вирусами, более предпочтительно относящимися к семействам Orthomyxoviridae, Picornaviridae и Paramyxoviridae. Даже более предпочтительно вирусами являются вирус гриппа А, вирус гриппа В, вирус гриппа С, риновирус и вирус парагриппа и их производные, или аналоги, или фрагменты. Альтернативно, вирусы кори, свинки, краснухи и бешенства также могут быть подходящими системами для культивирования в соответствии с данным изобретением. В альтернативном воплощении культивированные вирусы могут содержать модификации в нескольких структурных и неструктурных генах, предпочтительно модификации в генах NS1 и/или РВ 1. Модификациями могут быть делеции, замены или вставки по крайней мере одной нуклеиновой кислоты. Альтернативно, вирусами, культивируемыми в среде, содержащей амфотерицин В, могут быть также онколитические вирусы. Вирусные производные, аналоги или фрагменты могут, например, быть любой вирусной частицей, которая все ещ может применяться с целью вакцинирования или демонстрировать онколитические свойства. Вирусы обычно культивируют с применением инфицированных вирусами клеток, которые, как было показано, могут применяться с целью размножения вирусных частиц. Изобретение также обеспечивает способ инфицирования клеток для культивирования вируса с применением амфотерицина В, включающий следующие этапы:a) клетки инфицируют по крайней мере одной инфекционной вирусной частицей;b) амфотерицин В добавляют в инокулят и/или культуральную среду вместе с трипсином;d) сбором полученного вируса и дополнительноe) очисткой и/или определением характеристик вирусов. Удивительно, что было показано, что применение добавки или смеси добавок в соответствии с данным изобретением может увеличивать рост вируса по крайней мере в 0,1 log 10, предпочтительно по крайней мере в 0,5 1og 10, предпочтительно в 1 log 10, более предпочтительно по крайней мере в 2 log 10, даже более предпочтительно по крайней мере в 2,5 log 10, даже более предпочтительно по крайней мере 5 log 10. Дополнительно данное изобретение можно также применять для выделения или титрования вирусных частиц. Это особенно важно, поскольку инфицирование клеток для культивирования вируса часто требует высоких количеств вируса из-за отсутствия достаточного процента заражения и неэффективных механизмов репликации. Количество вируса может быть значительно снижено путем добавления по крайней мере одного амфотерицина В незадолго до, или одновременно, или вскоре после процесса инфицирования. Описание чертежей Фиг. 1 показывает влияние амфотерицина В на рост вируса гриппа. Субконфлюэнтный монослой клеток Vero имел различную множественность заражения (MOI)(0,001, 0,0001 и 0,00001). Среда для роста вируса содержала 5 мкг/мл трипсина и 0 или 250 нг/мл амфотерицина В. Для каждого значения MOI вирус (с амфотерицином В или без) собирали, когда цитопатический эффект или резкое увеличение скорости роста вируса достигали от 50 до 95%. Для всех вирусов,инкубированных в присутствии амфотерицина В, цитопатический эффект и, следовательно, вирусный титр развивался быстрее, чем у тех, что были выращены без амфотерицина В. Сравнивали титрыTCID50. Фиг. 1 а показывает влияние на штамм H1N1. Фиг. 1b показывает влияние на штамм H3N2. Фиг. 1 с показывает влияние на штамм гриппа В. Фиг. 2 показывает результаты титрования в присутствии и при отсутствии амфотерицина В.b) (А/Новая Каледония/20/99(H1N1)-подобный NS1 вирус серийно разводили и титровали параллельно в присутствии и при отсутствии 250 нг/мл амфотерицина В путем анализа TCID50. Спустя 3 суток инкубации при 37C в ячейках оценивали цитопатический эффект и подсчитывали титры. Фиг. 3 показывает исследования с увеличением дозы амфотерицина В. Субконфлюэнтный монослой клеток(А/Висконсин/67/2005-подобным) (H3N2) с множественностью заражения 0,001. После инфицирования в среду для выращивания добавляли различные концентрации амфотерицина В (0, 31.25, 62.5, 125, 250,500 и 1000 нг/мл соответственно). Вирус собирали спустя 48 ч и титровали с помощью анализа TCID50 в присутствии амфотерицина В. Применение концентраций в диапазоне от 250 до 500 нг/мл приводило к наивысшему титру вируса. Амфотерицин В в соответствии с данным изобретением можно в целом разделить на триены, тетрены, пентены, гексены и гептены по числу конъюгированных двойных связей, которыми они обладают, и в соответствии с наличием или отсутствием связанного посредством гликозида углевода. Для обзора см.Hamilton-Miller J.M.T., Bacteriol. Reviews, 1973, 37, 166-196. Амфотерицин может быть произведен путем культивирования организма, такого как Streptomycesnodosus, и экстрагирован из культуры. Амфотерицин В является, по существу, макроциклическим лактоном с высокой молекулярной массой, обладающим хромофором из 7 конъюгированных двойных связей. В дополнение к большому лактонному ядру амфотерицин В имеет другие характеристические группы,включающие аминосахар. Производные или аналоги могут быть любого вида, обеспечивающего характеристики, необходимые для применения в качестве культивационной добавки для культивирования вирусов. Например, это может быть N-ацетилирование, N-сукцинилирование, этерификация или комплексообразование с CaCl2. Например, это может быть метиловый эфир амфотерицина В или липосомальная формула, содержащая амфотерицин В. В соответствии с альтернативным воплощением смеси амфотерицина В с его производными или различные смеси производных амфотерицина В также могут применяться в качестве добавки для культивирования вирусов и в способах по данному изобретению. В соответствии с изобретением амфотерицин В применяют в концентрации, достаточной для стимуляции культивирования вирусов. Предпочтительно концентрация составляет между 0,5 нг/мл и 5 мкг/мл, предпочтительно между 0,5 нг/мл и 2,5 мкг/мл, предпочтительно между 10 и 900 нг/мл, более предпочтительно между 100 и 500 нг/мл, более предпочтительно между 200 и 400 нг/мл. В соответствии с данным изобретением амфотерицин В может применяться для культивирования любого ДНК- или РНК-вируса. В предпочтительном воплощении вирусом является РНК-вирус. Семейства вирусов, содержащих покрытую оболочкой одноцепочечную РНК из их отрицательно-смыслового генома, классифицируют на три группы, имеющие несегментированные геномы (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae и вирус болезни Борна) или имеющие сегментированные геномы (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae). Семейство Orthomyxoviridae включает вирусы гриппа типов А, В и С, а также вирусы Тогото и Дхори и вирус инфекционной анемии лосося. Геном Orthomyxoviridae состоит из шести-восьми одноцепочечных молекул РНК с отрицательной полярностью (комплементарно мРНК). Вирионы гриппа состоят из внутренней рибонуклеопротеиновой сердцевины (геликального нуклеокапсида), содержащей одноцепочечный РНК-геном, и внешней липопротеиновой оболочки, выстланной внутри матриксным белком (M1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из восьми молекул (семи для гриппа С) из линейной, с отрицательной полярностью,одноцепочечной РНК, кодирующей десять полипептидов, включая РНК-зависимые РНК полимеразные белки (РВ 2, РВ 1 и РА) и нуклеопротеин (NP), образующий нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (M1, M2); два поверхностных гликопротеина, выступающих из содержащей липиды оболочки: гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA); неструктурный белок (NS1) и ядерный экспортный белок(NEP). Например, вирусы, применяемые для размножения или любых способов, как описано здесь, с применением амфотерицина В в качестве добавок к культуре, могут быть вирусами гриппа, респираторным синцитиальным вирусом (RSV), вирусом болезни Ньюкасл (NDV), вирусом везикулярного стоматита(VSV), риновирусом и вирусом парагриппа (PIV), вирусом кори, свинки, вирусом краснухи и вирусом бешенства. Вирусы, применяемые в изобретении, могут быть выбраны из природных штаммов, вариантов и мутантов; мутировавшими вирусами (например, созданными путем воздействия мутагенов, повторных пассажей и/или пассажей у непермиссивного хозяина); реассортантов (в случае сегментированных вирусных геномов); и/или генно-инженерных вирусов (например, с применением методик "обратной генетики"). Предпочтительно вирус, культивированный при добавлении амфотерицина В, выбран из группы,включающей вирус гриппа А, гриппа В или гриппа С. В соответствии с данным изобретением вирусы могут содержать модификации в геноме, ведущие к экспрессии и выработке производных или аналогов вирусов. В альтернативном воплощении модификация может быть в пределах гена NS1 и/или гена РВ 1. Это может приводить к выработке вируса, содержащего полностью удаленный или иначе модифицированный NS1 белок и/или полностью удаленный или модифицированный PB1-F2 белок или модифицированный РВ 2 белок, экспрессированный из РВ 1 фрагмента генома. Модификации в гене NS1 могут быть делениями, вставками или замещениями. Примеры таких модифицированных РНК вирусов раскрыты в WO 99/64068 и WO 99/64571, включенных здесь в ссылку, где модификации в гене NS1 ведут к выработке РНК вируса с фенотипом антагониста интерферона, ответственным за аттенуацию. Функция PB1-F2 была подробно описана Chen W. et al., Nat Med. 2001, 12:1306-12. Модификацииal, J. Virol., 2006, 80, 7976-7983. Альтернативно вирус также может быть онколитическим вирусом. Главной чертой, типичной для онколитических вирусов, является их условно реплицирующийся генотип, позволяющий им расти в злокачественных клетках, но не в нормальной ткани. В предпочтительном воплощении изобретения это может быть онколитический вирус гриппа А, имеющий модификацию в гене NS1, который не растет в IFNкомпетентной системе, но эффективно реплицируется в системах, не способных экспрессировать функциональный интерферон. Клетки, используемые для культивирования вирусов с применением культуральной среды с добавлением амфотерицина В, могут быть любыми клетками, которые могут расти in vitro на синтетической среде и могут применяться для размножения вирусов. В объеме данного изобретения термин "клетки" означает культивирование отдельных клеток, тканей, органов, клеток насекомых, клеток птиц, клеток млекопитающих, гибридомных клеток, первичных клеток, стабильных клеточных линий, и/или генноинженерных клеток, таких как рекомбинантные клетки, экспрессирующие вирус. Это могут быть, например, BSC-1 клетки (эпителиальные клетки почки африканской зеленой мартышки), LLC-MK клетки(эпителиальные клетки почки обезьяны резус), CV-1 клетки (линия клеток самца африканской зеленой мартышки), СНО клетки (линия клеток яичников китайского хомячка), COS клетки (линия фибробластоподобных клеток почки африканской зеленой мартышки), мышиные клетки, клетки человека, HeLa клетки (линия клеток человека), 293 клетки (эмбриональные клетки почки человеческого происхождения),Vero клетки (эпителиальные клетки почки африканской зеленой мартышки), MDBK клетки (Мадин Дарби линия клеток почки быка), MDCK клетки (Мадин Дарби линия клеток почки собаки), MDOK клеток(линия клеток почки овцы), CRFK клетки (эпителиальные клетки почки кошки), RAF клетки (линия клеток увеальной меланомы), ТСМК клетки (эпителиальные клетки почки мыши), LLC-PK клетки (эпителиальные клетки почки свиньи), PK15 клетки (линия эпителиальных клеток почки свиньи), W1-38 клетки(линия эпителиальных клеток дрозофилы), BHK клетки (линия фибробластов почки хомяка), SP2/0 клетки (линия лимфобластов селезенки мыши), NsO (линия клеток миеломы), PerC6 (клетки сетчатки человека), клетки яйца с развивающимся эмбрионом или их производные, клетки куриного яйца с развивающимся эмбрионом или их производные. Предпочтительно клеточной линией является клеточная линияVERO. Культуральной средой, используемой для производства вирусов, может быть любая среда, известная в предшествующем уровне техники, применяемая для культивирования вирусов. Предпочтительно средой является синтетическая среда. Это могут быть, например, основные среды, такие как модифицированная среда Игла MEM, минимальная эссенциальная среда MEM, Дульбекко модифицированная среда Игла D-MEM, D-MEM-F12 среда, среда Вильямса Е, RPMI среда и их аналоги и производные. Это также могут быть специальные среды для культивирования клеток и выращивания вирусов, такие какVP-SFM, OptiPro SFM, AIM V среда, HyQ SFM4MegaVir, EX-CELL Vero SFM, EPISERF,ProVero, любые 293 или СНО среды и их аналоги и производные. В среды могут добавляться любые добавки, известные в предшествующем уровне техники, применяющиеся для культивирования клеток и вирусов, такие как, например, фракции сыворотки животных или их аналоги, аминокислоты, факторы роста, гормоны, буферы, микроэлементы, трипсин, пируват натрия, витамины, L-глутамин и биологические буферы. Предпочтительной средой является OptiPRO SFM с добавлением L-глутамина и трипсина. В частности, амфотерицин В также может применяться для повышения эффективности процента заражения. Для увеличения заражения клеток клетки контактируют одновременно с вирусными частицами и амфотерицином В. Альтернативно клетки могут быть предварительно обработаны амфотерицином В незадолго до, одновременно или вскоре после добавления вирусных частиц к клеткам. Предпочтительный диапазон времени составляет, таким образом, около 1 ч до или после инфицирования, более предпочтительно около 0,5 ч до или после инфицирования. Из предшествующего уровня техники хорошо известно, что высокий уровень множественности заражения (MOI) приводит к производству высокого количества дефектных вирусных частиц, демонстрирующих снижение или отсутствие инфективности. Таким образом, по экономическим и научным причинам является благоприятным обеспечение средств применения низкой (MOI 0,001), или даже лучше очень низкой MOI (MOI от 0,0001 до 0,00001), или даже более низкой MOI для инфицирования клеток. Применение добавки или смеси добавок в соответствии с данным изобретением может увеличивать вирусный рост по крайней мере на 0,1 log 10, по крайней мере на 0,5 log 10, предпочтительно по крайней мере на 1 log 10, более предпочтительно по крайней мере на 2 log 10, даже более предпочтительно по крайней мере на 2,5 log 10, даже более предпочтительно по крайней мере на 5 log 10. Данное изобретение также обеспечивает средства ускорения и увеличения качества и чувствительности стандартных TCID50, TCID50-основанных анализов или реакции розеткообразования. В соответствии с применением амфотерицина В для культивирования вируса рост вируса ускоряется, и таким образом анализы могут быть проведены раньше, и может быть достигнут более точный результат титрования в более ранний момент времени. Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ выделения вируса из клинических образцов, в котором клетки, например клетки Vero, инфицируют вирусными частицами из респираторного тракта пациента в присутствии амфотерицина В, инкубируют инфицированные клетки в подходящих условиях для стимуляции роста вируса в присутствии амфотерицина В и изолируют и характеризуют вирус. Программы надзора над вирусом гриппа требуют эффективных систем для выделения вирусов гриппа из клинических образцов. Обычно эта процедура включает инфицирование куриных яиц с развивающимся эмбрионом или MDCK клеток материалом, взятым из смывов с носоглотки. Эффективность процедуры варьирует от года к году в зависимости от типа вируса и клеточного субстрата. Известно, что выделение на яйцах, а иногда на MDCK может приводить к генерации вариант вируса, отличающихся от реальных вирусов, циркулирующих в популяции человека. Было показано, что клетки Vero могут быть лучшим субстратом для выделения вируса гриппа и определения его характеристик, поскольку свойства полученных из Vero вирусов наиболее близко отражают природу вирусов человека (Romanova J., et al. 2003). В то же время, к сожалению, чувствительность клеточной линии Vero для выделения вируса ниже,чем у MDCK клеток. В соответствии с изобретением амфотерицин В улучшает выделение вируса гриппа из клинических образцов на клетках Vero. Применение способа в соответствии с изобретением может обеспечить повышение процентов случаев положительного выделения, так как вирус очень трудно выделить повторно из клинических образцов на клетках Vero. Вышеизложенное описание становится более понятным при ссылке на следующие примеры. Такие примеры являются, однако, просто представлением способов осуществления одного или более воплощений данного изобретения и не могут считаться ограничивающими объем изобретения. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Пример 1. Целью данного изобретения является определение влияния амфотерицина В на различные вирусы гриппа при снижении множественности заражения. Три выбранных вируса отражают циркулирующие в настоящее время подтипы H1N1, H3N2 и В, а также рекомендованные ВОЗ для сезонной вакцины 2006/07 в северном полушарии (http://www.who.int/csr/disease/influenza/vaccinerecommendations1/en/). Субконфлюэнтный монослой клеток Vero без сыворотки инфицировали со снижением множественности заражения 0,001, 0,0001 или 0,00001. Использовали два образцовых вируса типа А, А/Новая Каледония/20/99(H1N1) и A/Вена/28/2006(H3N2) (А/Висконсин/67/2005-подобный), а также один кандидат вируса В, В/Вена/32/2006 (В/Малайзия/2506/2004-подобный). В питательную среду, добавляемую после инфицирования, вносили 5 мкг/мл трипсин, а также 0 или 250 нг/мл амфотерицина В соответственно. Собирали надосадочную жидкость от всех клеток, инфицированных с одной и той же множественностью заражения (0 и 250 нг/мл амфотерицина В), когда наблюдался цитопатический эффект 50% и более при быстрорастущем вирусе. Титры вируса определяли с помощью TCID50 анализа. Как показано на фиг. 1a, 1b и 1 с, для всех трех анализируемых вирусов отмечалось положительное влияние амфотерицина В на вирусную репликацию. Для вируса А/Новая Каледония/20/99(H1N1) наблюдалось влияние амфотерицина В на рост вируса. В присутствии амфотерицина В титры были в диапазоне от 8 Е+05 до 2 Е+07 TCID50/мл со сниженной MOI (множественностью заражения), при самой низкойMOI было получено на 1 log меньше вируса, когда не добавляли амфотерицин В. В случае А/Новая Каледония/20/99 наименьшая MOI 0,00001 кажется наиболее оптимальной с точки зрения вирусного роста и влияния амфотерицина В. Вирус А/Вена/28/2006 (H3N2) подтвердил результаты вируса H1N1, показав даже большую чувствительность к влиянию вещества. При всех трех анализируемых MOI наивысший титр вируса был получен минимум на 1 log меньше, чем при выращивании в присутствии амфотерицина В и сборе в тот же самый момент времени. Даже более поразительный эффект субстанции наблюдался для вируса В/Вена/32/2006(В/Малайзия/2506/2004-подобного). Титры, измеренные для вируса, выращенного в присутствии амфотерицина В, находились в диапазоне от 1E+07 (MOI 0,001) до 1 Е+06 (MOI 0,00001) TCID50/мл. Напротив, когда амфотерицин не добавляли, вирус плохо реплицировался, что приводило к титрам ниже 3 Е+05TCID50/мл, при наименьшей MOI совсем не было получено вируса. По сравнению с вирусами А вирус В показал наибольшую чувствительность к веществу. Это можно отчасти объяснить тем фактом, что он был адаптирован к росту на клетках Vero без сыворотки в присутствии амфотерицина В. В целом можно сделать вывод, что имеется ясное влияние амфотерицина В на вирусный рост всех трех обсужденных выше вирусных подтипов. Материалы и методы. Клетки и вирусы. Клетки Vero культивировали в бессывороточных условиях, применяли среду OptiPro SFM с добавлением 4 мМ L-глутамина. Клетки культивировали путем пассажа каждые 2-3 дня в отношении 1:3 1:4. Использовали питательную среду SFM с добавлением 4 мМ L-глутамина. А/Новая Каледония/20/99 получали от NIBSC, продукт номер 03/208, и пассировали 3 раза наMDCK клетки. Адаптацию к росту на клетках Vero без сыворотки проводили путем пассажей полученного из MDCK вируса 4 раза на клетках Vero при отсутствии амфотерицина В. А/Вена/28/2006(H3N2) и А/Висконсин/67/2005(H3N2)-подобный вирус выделяли из клинического образца и пассировали 1 раз на клетках MDCK с последующими 5 переносами на клетки Vero без сыворотки в присутствии и при отсутствии амфотерицина В. В/Вена/32/2006, В/Малайзия/2506/2004-подобный вирус выделяли из клинического образца наMDCK клетках (2 переноса), а затем адаптировали к росту на клетках Vero без сыворотки, пассируя 6 раз в присутствии амфотерицина В. Анализ активности. Титрование вирусов проводили с помощью анализа TCID50 (доза инфицирования клеточной культуры), теста на основе клеток, позволяющего проводить статистическое определение активности вируса на 96-луночном планшете. Готовили серийные разведения вируса, инфицировали субконфлюэнтный монослой клеток Vero (96-луночный планшет), выращивали вирус в присутствии 5 мкг/мл трипсина и 250 нг/мл амфотерицина В при 33C (В вирус) и 37C (А вирус). Спустя 3-6 дней инкубации проверяли цитопатический эффект в лунках и подсчитывали титр на основании формулы по Reed L.J. et al., 1938, Am. J.Hyg. 27:493-497. Пример 2. Вирус В (В/Малайзия/2506/2004-подобный) и вирус A/H1N1 (А/Новая Каледония/20/99(H1N1)подобный NS1) титровали двумя различными методами в присутствии и при отсутствии амфотерицина В. В обоих случаях отмечалось четкое влияние вещества на окончательный титр вируса, как показано на фиг. 2 а и b. На фиг. 2 а В/Вена/32/2006 (В/Малайзия/2506/2004-подобный) серийно разводили и титровали в параллелях в присутствии и при отсутствии 250 нг/мл амфотерицина В в реакции розеткообразования. Спустя 5 суток инкубации при 33C подсчитывали розетки и напрямую сравнивали их число. На фиг. 2b (А/Новая Каледония/20/99(H1N1)-подобный NS1 вирус серийно разводили и титровали в параллелях в присутствии и при отсутствии 250 нг/мл амфотерицина В с помощью TCID50 анализа. Спустя 3 суток инкубации при After 37C оценивали цитопатический эффект в лунках и подсчитывали титры. Как можно видеть на фиг. 2 а, был получен титр на 2 log выше, когда тот же самый вирус выращивали в присутствии амфотерицина В. В присутствии амфотерицина В был достигнут титр вируса В более 1 Е+08 БОЕ/мл. Этот результат четко показывает, что чувствительность реакции розеткообразования существенно возрастает при добавлении вещества. На фиг. 2b A/H1N1 вирус титровали путем TCID50 в присутствии и при отсутствии амфотерицина В. Также отмечено значительное повышение титра, достигнуто повышение чувствительности около 1log. Материалы и методы. Клетки и вирусы. Клетки Vero культивировали в бессывороточных условиях, используя среду OptiPro SFM с добавлением 4 мМ L-глутамина. Клетки культивировали путем пассажей каждые 2-3 дня в отношении 1:31:4 при 37C, 5% CO2. В/Вена/32/2006 получали из В/Малайзия/2506/2004-подобного клинического изолята, выделяли наMDCK клетках (2 переноса), а затем адаптировали к росту на клетках Vero без сыворотки, перенося 6 раз в присутствии амфотерицина В при 33C. А/Новая Каледония/20/99(H1N1)-подобный NS1 вирус содержит поверхностные белки НА и NA из вируса А/Новая Каледония/20/99(H1N1) и внутренние сегменты из А/Пуэрто-Рико/8/34, при отсутствии части NS (неструктурного) сегмента. Вирус получали методом "обратной генетики" и переносили на клетки Vero при отсутствии амфотерицина В при 37C. Анализ активности. Реакция розеткообразования. Титрование вируса проводили реакцией розеткообразования. Готовили серийные разведения вируса, инфицировали конфлюэнтный монослой клеток Vero в верхний слой, состоящий из питательной среды Vero, добавляли 0,01% ДЭАЭ декстран, 10DMEM, насыщенную гидрокарбонатом натрия, 5 мкг/мл трипсина и 0 или 250 нг амфотерицина В.TCID50 (дозы инфицирования клеточной культуры) анализ является тестом на основе клеток, позволяющим проводить статистическое определение активности вируса на 96-луночном планшете. Готовили серийные разведения вируса, инфицировали субконфлюэнтный монослой клеток Vero (96 луночный планшет), выращивали вирус в присутствии 5 мкг/мл трипсина и в присутствии или при отсутствии 250 нг/мл амфотерицина В при 37C. Спустя 3 дня инкубации проверяли цитопатический эффект в лунках и подсчитывали титр на основании формулы по Reed L.J. et al., 1938, Am. J. Hyg. 27:493497. Пример 3. В данном эксперименте различные дозы амфотерицина В добавляли после инфекции клеток Vero А/Висконсин/67/2005(H3N2)-подобным вирусом. При повышении концентрации амфотерицина В репликация вируса могла усиливаться, концентрации между 62,5 и 1000 нг/мл показали четкий эффект. Субконфлюэнтный монослой клеток Vero без сыворотки инфицировали А/Вена/28/2006(H3N2) А/Висконсин/67/2005-подобным вирусом при множественности заражения 0,001. Вирус выращивали в присутствии различных концентраций амфотерицина В, а именно 0, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 и 1000 нг/мл. Вирус собирали спустя 48 ч и титровали с помощью TCID50 анализа в присутствии 250 нг/мл амфотерицина В. Были получены титры в диапазоне от 8 Е+05 до 4 Е+07 TCID50/мл. При двух самых низких концентрациях (0 и 31,25 нг/мл) титры вируса были ниже 1 Е+06 TCID50/мл, при этом титры вируса возрастали до более 3 Е+07 TCID50/мл при 250 и 500 нг/мл амфотерицина В. Для иллюстрации результатов см. фиг. 3. Материалы и методы. Клетки и вирусы. Клетки Vero культивировали в условиях без сыворотки, используя среду OptiPro SFM с добавлением 4 мМ L-глутамина. Клетки культивировали путем пассажей каждые 2-3 дня в отношении 1:3-1:4 при 37C, 5% CO2.A/BeHa/28/2006(H3N2), А/Висконсин/67/2005(H3N2)-подобный вирус, полученный из клинического образца, переносили 1 раз на MDCK клетки с последующими 5 переносами на клетки Vero без сыворотки в присутствии и при отсутствии амфотерицина В. Анализ активности. Титрование вирусов проводили с помощью анализа TCID50 (доза инфицирования клеточной культуры), теста на основе клеток, позволяющего проводить статистическое определение активности вируса на 96-луночном планшете. Готовили серийные разведения вируса, инфицировали субконфлюэнтный монослой клеток Vero (96-луночный планшет), выращивали вирус в присутствии 5 мкг/мл трипсина и 250 нг/мл амфотерицина В при 33C (В вирус) и 37C (А вирус). Спустя 3-6 дней инкубации проверяли цитопатический эффект в лунках и подсчитывали титр на основании формулы по Reed L.J. et al., 1938, Am. J.Hyg. 27:493-497. Пример 4. Применение амфотерицина В для эффективного восстановления вируса после трансфекции. В данном примере свободные от сыворотки клетки Vero трансфицировали 8 плазмидами, кодирующими 8 сегментов А/Висконсин/67/2005(H3N2)-подобного вируса, как описано Hoffman et al., включая некоторые модификации (Hoffmann E. et al., ProcNatlAcadSci, 2002, 99:11411-6). Питательную среду,содержащую 250 нг/мл амфотерицина В и 5 мкг/мл трипсина, добавляли спустя 6 ч. Вирус частично собирали спустя 6 дней после трансфекции, когда наблюдался четкий цитопатический эффект трансфицирующего вируса, выращенного в присутствии амфотерицина В, и также были видны признаки цитопатического эффекта при отсутствии амфотерицина В. Вирус без амфотерицина В дополнительно контролировали еще 3 дня, при этом не наблюдалось каких-либо признаков нарастания цитопатического эффекта. Титр определяли с помощью TCID50 анализа в присутствии 250 нг/мл амфотерицина В. Как показано в табл. 1, в присутствии амфотерицина В получен титр 2 Е+04 TCID50/мл, в то время как при его отсутствии не обнаруживалось вируса. Этот пример четко указывает, что вирус, который иначе не растет, может быть эффективно восстановлен только в присутствии амфотерицина В. Материалы и методы. Клетки и вирусы. Клетки Vero культивировали в условиях без сыворотки, с применением среды OptiPro SFM с добавлением 4 мМ L-глутамина. Клетки культивировали путем пассажей каждые 2-3 дня в отношении 1:3 1:4 при 37C, 5% СО 2. А/Вена/28/2006(H3N2), являющийся А/Висконсин/67/2005(H3N2)-подобным вирусом, полученным из клинического образца, переносили 1 раз на MDCK клетки с последующими 5 переносами на клеткиVero без сыворотки в присутствии и при отсутствии амфотерицина В. Сегменты вируса клонированы в плазмиды, в одно и то же время делающие возможной транскрипцию вирусной РНК в качестве матрицы для генома, а также мРНК для дальнейшего процессинга для вирусного белка (Hoffmann et al.; Eight-plasmid system for the rapid generation of influenza virus vaccines, Vaccine (20). 2002), где плазмиды были соответственно модифицированы. Все 8 плазмид трансфицировали в клетки Vero путем электропорации. Спустя 6 ч после трансфекции добавляли среду без сыворотки, содержащую 5 мкг/мл трипсина, а также 0 и 250 нг/мл амфотерицина В соответственно. Трансфицированный вирус частично собирали спустя 6 суток и дополнительно наблюдали последующие 3 суток. Анализ активности. Титрование вируса проводили с помощью анализа TCID50 (доза инфицирования клеточной культуры), теста на основе клеток, позволяющего проводить статистическое определение активности вируса на 96-луночном планшете. Готовили серийные разведения вируса, инфицировали субконфлюэнтный монослой клеток Vero (96-луночный планшет), выращивали вирус в присутствии 5 мкг/мл трипсина и 250 нг/мл амфотерицина В при 33C (В вирус) и 37C (А вирус). После периода инкубации до 6 суток проверяли цитопатический эффект в лунках и подсчитывали титр на основании формулы по Reed L.J. et al.,1938, Am. J. Hyg. 27:493-497. В таблице показано восстановление вируса после трансфекции в присутствии и при отсутствии амфотерицина В. Клетки Vero трансфицировали 8 плазмидами, кодирующими 8 сегментов А/Висконсин/67/2005(H3N2)-подобного вируса. Спустя 6 ч после трансфекции добавляли среду, содержащую 5 мкг/мл трипсина и 0 или 250 нг/мл амфотерицина В. Вирус титровали с помощью TCID50 анализа. Пример 5. Выделение вируса из клинических образцов на клетках Vero с применением амфотерицина В. 9 клинических образцов от пациентов с подтвержденной инфекцией вирусом гриппа В оценивали на частоту вирусного выделения на клетках Vero в присутствии или при отсутствии амфотерицина В. Когда амфотерицин В не добавляли, вирус был успешно выделен только из 3 образцов. В то же самое время, когда в поддерживающую среду добавляли 500 нг/мл амфотерицина В, все 9 проб были положительными. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение амфотерицина В в качестве добавки в культуральную среду для стимуляции роста вируса. 2. Применение по п.1, в котором амфотерицин В находится в концентрации между 0,5 нг/мл и 5 мкг/мл. 3. Применение по п.2, в котором амфотерицин В находится в концентрации между 0,5 нг/мл и 2,5 мкг/мл. 4. Применение по п.2, в котором амфотерицин В находится в концентрации между 10 и 900 нг/мл. 5. Применение по п.2, в котором амфотерицин В находится в концентрации между 100 и 500 нг/мл. 6. Применение по п.2, в котором амфотерицин В находится в концентрации между 200 и 400 нг/мл. 7. Применение по любому из пп.1-6, в котором вирус является ДНК- или РНК-вирусом. 8. Применение по любому из пп.1-7, в котором вирус является членом семейства Orthomyxoviridae,Picornaviridae, Togaviridae или Paramyxoviridae. 9. Применение по любому из пп.1-7, в котором РНК-вирус выбран из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, вируса гриппа С, риновируса, вируса кори, вируса свинки, вируса краснухи,вируса бешенства или вируса парагриппа и их производных. 10. Применение по любому из пп.1-9, в котором РНК-вирус содержит модификацию в гене NS1 и/или РВ 1. 11. Применение по любому из пп.1-10, в котором вирус является онколитическим вирусом. 12. Применение по любому из пп.1-11, в котором клетки выбраны из группы, состоящей из BSC-1 клеток, LLC-MK cells, CV-1 клеток, СНО клеток, COS клеток, мышиных клеток, человеческих клеток,HeLa клеток, 293 клеток, VERO клеток, MDBK клеток, MDCK клеток, MDOK клеток, CRFK клеток, RAF клеток, ТСМК клеток, LLC-PK клеток, PK15 клеток, W-38 клеток, MRC-5 клеток, T-FLY клеток, BHK клеток, SP2/0 клеток, NS0, PerC6, клеток или производных куриного эмбриона, клеток оплодотворенных яиц, в том числе оплодотворенных куриных яиц. 13. Применение по любому из пп.1-12, в котором увеличение вирусного роста составляет 0,1 log 10. 14. Применение по любому из пп.1-12, в котором увеличение вирусного роста составляет 0,5 log 10. 15. Применение по любому из пп.1-12, в котором увеличение вирусного роста составляет 1 log 10. 16. Применение по любому из пп.1-12, в котором увеличение вирусного роста составляет 2 log 10. 17. Применение по любому из пп.1-12, в котором увеличение вирусного роста составляет 2,5 log 10. 18. Способ культивирования вируса в присутствии амфотерицина В, включающий:a) инфицирование клеток по крайней мере одной инфекционной вирусной частицей,b) добавление амфотерицина В в культуральную среду вместе с трипсином,c) инкубацию инфицированных клеток в культуральной среде, полученной на стадии b), в подходящих условиях в присутствии амфотерицина В иd) сбор полученного вируса. 19. Способ по п.18, дополнительно включающий очистку и/или определение характеристик вируса. 20. Способ культивирования вируса в присутствии амфотерицина В, включающий:a) добавление амфотерицина В в вирусный инокулят,b) инфицирование клеток указанным инокулятом,c) инкубацию инфицированных клеток в культуральной среде в подходящих условиях в присутствии амфотерицина В иd) сбор полученного вируса. 21. Способ по п.20, дополнительно включающий очистку и/или определение характеристик вируса. 22. Способ идентификации вируса, полученного из клинических образцов респираторного тракта пациента, включающий:a) инфицирование клеток вирусом, полученным из респираторного тракта пациента;b) инкубацию инфицированных клеток в культуральной среде в подходящих условиях в присутствии амфотерицина В;