Аттенуированный микроорганизм salmonella и способы его применения

1 Область техники Данное изобретение относится к аттенуированным (ослабленным) микроорганизмам,которые можно использовать в вакцинных композициях для предупреждения или лечения бактериальных или вирусных инфекций. Предпосылки к созданию изобретения Установлено, что живые ослабленные микроорганизмы являются высокоэффективными вакцинами; иммунные ответы, вызываемые такими вакцинами, часто являются более выраженными и более продолжительными, чем иммунные ответы, вызываемые нереплицирующимися иммуногенами. Одним из объяснений такого явления может служить то, что живые ослабленные штаммы вызывают у хозяина ограниченные инфекции и имитируют ранние стадии спонтанной инфекции. Кроме того, в отличие от убитых препаратов, живые вакцины способны вызывать сильные клеточно-опосредованные ответы, которые могут быть связаны с их способностью реплицироваться в антигенпредставляющих клетках, таких как макрофаги. Известна длительная история применения аттенуированных вакцин Salmonella как безопасных и эффективных вакцин для предупреждения сальмонелеза у животных и человека. Действительно, доказано, что живая аттенуированная противобрюшнотифозная вакцина для перорального применения, Ту 21 а (Vivotif), которую производят в Швейцарском Институте сывороточных вакцин, является очень эффективной вакциной для предупреждения брюшного тифа и признана во многих странах, включая США и Европу. Однако ослабления вирулентности указанного штамма достигали, используя способы химического мутагенеза, и сущность аттенуации штамма полностью не установлена. Поэтому вакцина не является идеальной с точки зрения количества доз (в настоящее время четыре) и количества живых организмов, которое следует вводить в каждой дозе. Современные методы молекулярной биологии в сочетании с увеличивающимися знаниями о патогенности Salmonella позволили идентифицировать несколько генов, которые являются существенными для роста и выживаемости организмов in vivo. Это предоставляет новые гены-мишени для аттенюирования, приводя к общему представлению о том, что будущие вакцинные штаммы можно будет рационально ослаблять путем введения определенных необратимых мутаций в выбранные гены, о которых известно, что они вовлечены в вирулентность. Такой подход будет способствовать разработке улучшенных вакцин, в частности, с точки зрения иммуногенности, а поэтому - и количества доз, которые следует вводить. Хотя в настоящее время известно множество ослабленных штаммов Salmonella, только немногие из них квалифицируются как кандида 004921 2 ты на роль возможных вакцин для применения на человеке. Это отчасти может быть обусловлено необходимостью уравновешивания иммуногенности вакцины и возможности микроорганизма Salmonella реактивироваться. Ясно, что селекция подходящих мишеней для аттенюирования, в результате которой обнаруживается подходящий кандидат на роль вакцины, не является прямой и не может быть легко предсказана. Многие факторы могут оказывать влияние на пригодность аттенюированного штамма в качестве подходящей вакцины, и осуществляются многочисленные исследования для идентификации подходящих штаммов. Например, многие аттенюированные штаммы, испытанные в качестве вакцинных кандидатов,приводили к вакцинемии или абсцессам у пациентов. Поэтому желательно разработать вакцину,которая имеет высокую степень иммуногенности и пониженную способность штамма микроорганизма к реактивации и которая также обладает надежным профилем безопасности и ограниченными побочными эффектами. Краткое изложение изобретения Данное изобретение основано на открытии, что две специфические аттенюирующие мутации, введенные в микроорганизм Salmonella, дают возможность производить вакцину,характеризующуюся высокой степенью иммуногенности и низким риском реверсии микроорганизма в реактивную форму. Полученные вакцинные штаммы обладают приемлемым профилем побочных эффектов. Первая мутация заключена в области островка два патогенности Salmonella (Spi2); вторая является ауксотрофной мутацией, то есть мутацией, которая нарушает экспрессию гена,который кодирует белок, необходимый в биосинтетическом пути. В соответствии с первым аспектом изобретения микроорганизм Salmonella имеет аттенюирующую мутацию, которая нарушает экспрессию аппаратного гена, локализованного в островке патогенности Spi2, и независимую ауксотрофную мутацию. Предпочтительная аттенюирующая мутация находится в аппаратном гене ssaV, а предпочтительная ауксотрофная мутация находится в аrоС. Кроме того, микроорганизм предпочтительно содержит один или более гетерологичных антигенов или терапевтических белков,например антигены патогенной Е. coli, Shigella,гепатитов А, В или С, вируса простого герпеса и вируса папилломы человека. Поэтому микроорганизм может действовать как доставочный носитель для иммунизации против инфекций, помимо Salmonella. Микроорганизм Salmonella можно использовать в производстве лекарственных средств для внутривенного или перорального способов доставки для лечения бактериальной или вирус 3 ной инфекции, например лечения брюшного тифа. Аттенюированные микроорганизмы Salmonella согласно данному изобретению составляют вакцины, которые неожиданно стимулируют иммунитет слизистых, а также системный иммунитет. Кроме того, микроорганизмы не вызывают, в отличие от мутантов с единственной мутацией, возникновение абсцессов селезенки на животной модели. Упомянутый факт представляет собой особое преимущество двойных мутаций, что отмечено в описании. Подробное описание изобретения Микроорганизмы и вакцинные композиции согласно данному изобретению можно получать с помощью известных способов. Отбор определенного микроорганизмаSalmonella и выбор подходящей мутации может быть осуществлен специалистом без чрезмерного экспериментирования. Предпочтительным микроорганизмом является Salmonella typhimurium. Первая мутация может быть введена в аппаратный ген, локализованный в области островка 2 патогенности Salmonella, упомянутая область описана в международной заявке WOA-9617951. Островок 2 патогенности Salmonella (Spi2) является одним из двух классических островков патогенности, локализованных на хромосомеSalmonella. Spi2 содержит несколько генов, которые кодируют систему секреции типа III, вовлеченную в транспортировку кодируемых белков Spi2, ассоциированных с вирулентностью(так называемых эффекторных белков), за пределы бактерии Salmonella и, возможно, непосредственно в клетки-мишени хозяина, такие как макрофаги. Часть Spi2 (аппаратные гены) кодируют аппарат секреции системы III типа.Spi2 является безусловно существенным для патогенности и вирулентности Salmonella у мышей - наблюдения, которые в настоящее время подтверждены несколькими различными группами из разных стран мира. Мутанты Spi2S. typhimurium оказываются сильно аттенюированными у мышей, которых заражали, используя пероральный, внутривенный и внутрибрюшинный способы введения. В настоящее время аппаратные гены, локализованные в Spi2, хорошо охарактеризованы; для примера см. Hensel et al, Molecular Microbiology (1997); 24(1): 155-167. Гены, подходящие для применения в данном изобретении, включают в себя гены ssaV, ssaJ, ssaK, ssaL, ssaM,ssaO, ssaP, ssaQ, ssaR, ssaS, ssaT, ssaU и ssaH. Мутации в области Spi2 не обязательно должны быть в гене, чтобы нарушить функцию. Например, мутация в регуляторной области также может нарушать экспрессию гена, приводя к аттенуации. Мутации в межгенной области также могут быть достаточными, чтобы нарушить функцию гена. 4 В предпочтительном аспекте изобретения,аппаратным геном является ssaV. В отдельном предпочтительном аспекте мутация локализована в межгенной области между ssaJ и ssaK. Вторая мутация названа "ауксотрофной мутацией", так как она нарушает ген, который является существенным в биосинтетическом пути. Биосинтетический путь, имеющийся уSalmonella, отсутствует у млекопитающих. Поэтому мутанты не могут зависеть от метаболитов, обнаруженных у леченых пациентов, чтобы расстроить эффект мутации. Подходящие гены для ауксотрофной мутации включают в себя любой ген аrо, например, aroA, aroC, aroD и аrоЕ. В предпочтительном аспекте изобретения вакцинная композиция содержит микроорганизм Salmonella, имеющий аттенюирующие мутации в ssaV и аrоС. Мутации можно вводить в микроорганизм,используя любой известный способ. Предпочтительно, если мутация представляет собой делеционную мутацию, при которой нарушение гена вызывают вырезанием нуклеиновых кислот. Альтернативно, мутации можно вводить инсерцией нуклеиновых кислот или точечными мутациями. Способы введения мутаций в специфические области будут очевидны специалистам. Кроме двух мутаций микроорганизм Salmonella также может содержать гетерологические антигены. Поэтому аттенюированный микроорганизм может действовать как доставочный носитель для введения антигенов против других бактериальных или вирусных инфекций. Антигены, которые подходят для применения таким образом, будут очевидны специалистам и включают в себя: Антигены патогенной Е. coli, то есть ЕТЕС Антигены гепатитов А, В и С Антигены болезни Лайма Антигены холерного вибриона Антигены Helicobacter Антигены вируса простого герпеса Антигены вируса папилломы человека В описанной системе также предусмотрена возможность доставки терапевтических белков,например цитокинов, для лечения пациентов,например пациентов, инфицированных гепатитом. Специалистам будут понятны способы доставки гетерологических антигенов или терапевтических белков с использованием вакцинных композиций. Вакцины, созданные с использованием микроорганизмов согласно изобретению, находят применение для лечения инфекций человека и для лечения ветеринарных инфекций. Двойная мутация обеспечивает эффективные способы снижения вирулентности микроорганизма, чтобы предоставить кандидата на роль безопасной вакцины. Вакцинные композиции обеспечивают эффективную защиту даже у пациентов с ослаб 5 ленным иммунитетом и, что важно, представляют низкий риск развития абсцессов селезенки. Абсцессы селезенки были идентифицированы при использовании вакцин на основе единственной мутации, и поэтому предлагаемые композиции могут представлять значительную пользу для пациентов. Для приготовления вакцинных композиций мутантные микроорганизмы могут находиться в композиции вместе с любым подходящим фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или наполнителем. Подходящие технологии приготовления будут очевидны специалистам в данной области. Композиции могут быть разработаны для любого подходящего способа введения. Предпочтительное введение представляет собой пероральный или внутривенный способы, а вакцины являются живыми аттенюированными микроорганизмами вида Salmonella. Количество микроорганизмов,которое должно присутствовать в композициях,может быть установлено и оптимизировано специалистом. Однако, в основном, пациенту можно вводить приблизительно 107 - 1010 КОЕ (колониеобразующих единиц), предпочтительно приблизительно 108 - 109 КОЕ в одной стандартной дозе. Следующие примеры иллюстрируют изобретение. Пример 1. В примере описано получение мутантного штамма, обозначаемого ZH9, который проявляет активность вакцины против брюшного тифа человека для перорального введения. Штамм получен из вирулентного штамма S. typhi Ty2,первоначально выделенного у пациента с брюшным тифом. Полученный штамм имеет определенную мутацию в purA и аrоА. Ту 2 для конструирования ZH9 Впервые S. typhi Ty2 выделили у индивидуума с брюшным тифом в 1916 году и использовали для производства всех лицензированных брюшнотифозных вакцин. Штамм получали из Национальной коллекции культур PHLS (лабораторная служба общественного здравоохранения) при Colindale. Штаммы получали в виде лиофилизированной культуры, имеющей номер 8385 NCTC (Национальная коллекция типовых культур микроорганизмов, Лондон, Великобритания). Клонирование гена aroC S. typhi из S. typhi Ту 2S. typhi Ty2 получали из запаса популяции и выращивали в течение ночи на питательной среде Луриа-Бертани (LB; Luria Bertani). Клетки собирали и получали всю клеточную ДНК. Фрагменты ДНК S. typhi Ty2 получали частичным расщеплением ферментом рестрикцииSau3A и полученные фрагменты лигировали с рНС 7 9, расщепленным по BamH1, чтобы образовать космидную библиотеку ДНК S. typhi Ty2,используя Е. coli HU835 в качестве реципиента. Чтобы выделить ДНК, кодирующую аrоС, из 6 ДНК S. typhi, использовали космидную библиотеку для трансдукции Е. coli AB2849, которая включает мутацию в гене аrоС и рост которой зависит от ароматических компонентов. Трансдуцирующую смесь помещали в минимальную среду, не содержащую ароматические соединения, и инкубировали при 37 С. После инкубации в течение ночи изучали ряд изолированных колоний. Описанные бактерии преимущественно возникали в результате комплементации мутации аrоС в АВ 2849 посредством коллекции космидного клона, содержащего интактный ген аrоС. Очищали космидную ДНК из одного из упомянутых штаммов. Фрагмент HindIII 5,2 т.н. из описанной космиды клонировали в pUC18,чтобы получить плазмиду рТАС 2, которая способна дополнить делецию аrоС в АВ 2849, демонстрируя, что она содержит ген аrоС S. typhi. Образование определенной делеции клонированного S. typhi Ту 2 аrоС Определенную делецию, 600 пар оснований, создавали в клонированном гене аrоС,применяя PCR (полимеразно-цепьевая реакция). Использованные в PCR олигопептидные праймеры составляли, используя опубликованную последовательность ДНК гена S. typhi аrоС(Асс.М 27715). ДНК 5' в гене аrоС амплифицировали из рТАС 2, используя праймеры SEQ IDNO. 3 и SEQ ID NO. 1. SEQ ID NO. 3 отжигали на векторной ДНК, SEQ ID NO. 1 отжигали на 5'-области аrоС. 3'-конец ДНК в гене аrоС амплифицировали, используя праймеры SEQ IDNO.4 и SEQ ID NO. 2. SEQ ID NO. 4 отжигали на векторной ДНК, SEQ ID NO. 2 отжигали на 3'-области аrоС. Полученные продукты PCR содержали Xbal-сайты, введенные в 5'-концы,чтобы способствовать клонированию. Фрагменты клонировали в векторную pUC18. Конечная плазмидная конструкция,обозначаемая рМIАС 23, содержала определенную делецию аrоС (положение 544 до 1143) на фрагментеHindIII-сайт pUC18. Единственный Xbal-сайт присутствовал на участке аrоС-делеции. Введение мутации аrоС в геном S. typhi Ty2 Суицидную плазмиду pCVD442 (DonnenbergKaper, Infection and Immunity, 1991; 59: 4310-4317) использовали в качестве вектора,чтобы ввести делецию аrоС в геном S. typhi Ty2. Фрагмент HindIII 4,8 т.н., содержащий делецию аrоС, изолировали из рМIАС 23, а концы затупляли, используя шлифующий набор ДНК Stratagene. Плазмиду pCVD442 линеаризировали перевариванием посредством Sm.al, обрабатывали щелочной фосфатазой и сшивали с фрагментами с затупленными концами. Требуемую конструкцию выделили и обозначили pYCVC21.pYCVC21 вводили в S. typhi Ty2, используя стандартный протокол электропорации. Плазмида была способна интегрироваться в геном Ту 2 после рекомбинации между гомологичными областями плазмиды и генома, чтобы 7 дать ампициллин-резистентные трансформанты. Полученные трансформанты содержали копию как исходного дикого типа аrоС, так и делеционного гена аrоС. Выращивая описанные штаммы в отсутствие ампициллина, учитывали второе рекомбинантное событие, которое приводило к потери последовательностей ДНКpCVD442 и одной копии гена аrоС, или копии дикого типа, или делеционной копии. БактерииS. typhi Ty2, которые подвергали второй рекомбинации, идентифицировали как ампициллинчувствительные производные, которые способны расти в присутствии 5% сахарозы (pCVD442 содержит ген sacB, который при экспрессии давал в результате чувствительный к сахарозе фенотип). Штаммы, которые содержали только делеционный ген аrоС, первоначально идентифицировали как штаммы, неспособные расти на чашках с минимальной средой в отсутствие добавок с ароматическими соединениями. Генотип аrоС подтверждали, применяя анализ PCR. Праймеры, имеющие SEQ ID NO. 5 и SEQ IDNO 6, давали продукт из 994 пар оснований для дикого типа аrоС и 400 пар оснований для делеционного гена аrоС. Анализ последовательностей полученных продуктов PCR подтвердил присутствие требуемой делеции в 5 индивидуальных изолятах, обозначенных DTY6, DTY7,DTY8, DTY9 и DTY10. Полученные штаммы хранили в ампулах микробанка при -70 С в течение длительного срока хранения. ШтаммDTY8 был отобран для дальнейших манипуляций. Введение мутации ssaV в мутант DTY8 S.typhi aroC Фрагмент Pst1 в 7,5 т.н., содержащий область ssaV S. typhi, амплифицировали из препарата тотальной ДНК, используя PCR, и клонировали в векторную pCR2.1 (Invitrogen). Используемые для PCR олигонуклеотидные праймеры, имеющие SEQ ID NO. 7 и SEQ ID NO. 8,отбирали по последовательности S. typhimuriumSP12. Полученную плазмидную конструкцию обозначили pTYSV21. Плазмидную конструкцию, содержащую делецию гена ssaV, получали из pTYSV21, используя PCR обратной ориентации. Праймеры,обожженные на 5'-(SEQ ID NO. 9) и 3'-(SEQ IDNO. 10) областях открытой рамки считыванияssaV, отбирали по последовательности S. typhimurium Spi2. Сайт рестрикции AvrII вводили в 5'-область каждого праймера, сайт Xbal вводили в SEQ ID NO. 10. Сайт Xbal служил в качестве метки для мутации ssaV, так, что он легко мог быть определен рестрикционнным анализом. Полученный продукт PCR подвергали перевариванию посредством AvrII, а скелетные плазмидные ДНК очищали элетрофоретически на агарозном геле. Повторное кольцевание полученных фрагментов по липким концам AvrII дало требуемую делецию pYDSVl. pYDSVl содержал фрагмент Pstl в 5,5 т.н. с определенной 8 делецией 1894 пар оснований в открытой рамке считывания ssaV. Суицидальную плазмиду pCVD442 использовали в качестве вектора для введения делеции ssaV в геном мутанта DTY8 S. typhi Ту 2. Фрагмент Pstl в 5,5 т.н., содержащий делециюssaV, изолировали из pYDSVl и затупляли концы обработкой ДНК-полимеразой Кленова (Klenow). Плазмиду pCVD442 линеаризировали перевариванием Smal, обрабатывали щелочной фосфатазой и лигировали с фрагментами с затупленными концами. Требуемую конструкцию изолировали и обозначили pYDSV214.pYDSV214 вводили в S. typhi DTY8, используя электропорацию. Выбирали ампициллин-резистентные трансформанты, а затем выращивали в отсутствие ампициллина с учетом потери последовательностей ДНК pCVD442 и одной копии гена ssaV, или копии дикого типа,или делеционной копии. Штаммы, которые подвергали второй рекомбинации, идентифицировали как ампициллин-чувствительные, сахарозорезистентные колонии. Штаммы, которые сохранили только делеционный ген ssaV, идентифицировали с помощью PCR-анализа. С праймерами, имеющими SEQ ID NO. 11 и SEQ IDNO.12, получили продукт из 2485 пар оснований для дикого типа и 591 пар оснований для делеционного гена ssaV. Анализ последовательностей полученных продуктов PCR подтвердил присутствие требуемой делеции в 5 индивидуальных изолятах, ZH2, ZH4, ZH6, ZH7 и ZH9. Штамм ZH9 был выбран для создания CGMPmaster клеточного банка. Пример 2. В примере описано получение мутантного штамма S. typhimurium, обозначенного WTO5,который проявляет вакцинную активность против гастроэнтерита человека. Штамм получен из известного человеческого вирулентного штаммаTML впервые был выделен у пациента,страдавшего гастроэнтеритом, и идентифицирован в лабораториях Dr John Stevens Бирмингенского Университета. Штамм лиофилизировали в Wellcome Research Laboratories и ему был присвоен номер культуры BRD 519. Культура получена из Бирмингенского Университета. Получение определенной делеции клонированного гена S. typnimurium ssaV Плазмиду (плазмида 7-2, Shea et al.; PNAS,1996; 93: 2593-2597) получали путем клонирования фрагмента Pstl 7,5 т.н., выделенного из S.typhimuriura LT2, в pUC18 на сайте Pstl. ssaV помещали центрально на описанный фрагмент. Плазмидную конструкцию, содержащую определенную делецию открытой рамки считыванияssaV, получали из плазмиды 7-2, используя PCR обратной ориентации. Праймеры, обожженные на 5'-(SEQ ID NO. 13) и 3'-(SEQ ID NO. 14) об 9 ластях открытой рамки считывания ssaV, отбирали по последовательности S. typhimuriumSpi2. Сайт рестрикции AvrII вводили в 5'область каждого праймера, и сайт XbaI вводили в SEQ ID NO. 14. Сайт Xbal служил в качестве метки для мутации ssaV так, что он легко мог быть определен рестрикционным анализом. Полученный продукт PCR подвергали перевариванию посредством AvrII, и скелетные плазмидные ДНК очищали электрофоретически на агарозном геле. Повторное кольцевание полученных фрагментов по липким концам AvrII дало требуемую делеционную конструкцию, обозначенную pMDSVl. pMDSVl содержала фрагментPstI 5,5 т.н. с определенной делецией из 1894 пар оснований в открытой рамке считыванияssaV, AvrII и рестрикционный сайт XbaI были локализованы на сайте делеции. Суицидную плазмиду pCVD442 использовали в качестве вектора для введения делецииpMDSVl, и концы затупляли обработкой ДНКполимеразой Кленова. Плазмиду pCVD4 42 линеаризировали перевариванием Smal, обрабатывали щелочной фосфатазой и лигировали с фрагментами с затупленными концами. Требуемую конструкцию выделяли и обозначилиpMDSV22 вводили в S. typhimurium TML,используя конъюгирование. С этой целью конструкцию трансформировали в штамм S17-1pir E. coli. Конъюгирование проводили в соответствии со стандартными способами. ПлазмидаTML после рекомбинации между гомологичными областями на плазмиде и геноме с образованием ампициллин-резистентных трансконъюгатов. Трансконъюгат, обозначенный mdsv-WT2,был выбран для дальнейших манипуляций. Полученный трансконъюгат содержал копию как исходного ssaV дикого типа, так и делеционный ген ssaV. Трансконъюгат выращивали в отсутствие ампициллина с учетом осуществления второй рекомбинации, которая приводит к потере последовательностей ДНК pCVD442 и одной копии гена ssaV, или копии дикого типа, или делеционной копии. Изоляты, которые подвергали описанной второй рекомбинации, идентифицировали как ампициллин-чувствительные производные, способные расти в присутствии 5% сахарозы (pCVD442 несет ген ssaV, который, когда экспрессировался, приводил к сахарозо-чувствительному фенотипу). Штаммы,которые сохранили только делеционный генSEQ ID NO. 15 и SEQ ID NO. 16, получали продукт из 2485 пар оснований для дикого типаssaV и 591 пары оснований для делеционного гена ssaV. Анализ последовательностей полученных продуктов PCR подтвердил присутствие 10 требуемой делеции в 4 индивидуальных изолятах, ZH20, ZH23, ZH25 и ZH26. Полученные штаммы хранили в LB плюс 15% глицерин при-80 С в течение длительного периода хранения. Штамм ZH26 был выбран для дальнейших манипуляций. Клонирование гена S. typhimurium aroC изS.typhimurium TML Геномную ДНК выделяли из S.typhimuriumTML и расщепляли с помощью HindIII. Фрагменты HindIII с величинами в диапазоне от 5 до 6 т.н. очищали и пришивали к pBluescript, расщепленному по HindIII-сайту. Лигирующую смесь использовали, чтобы трансформировать мутант E.coli aroC, AB2849, и клоны, содержащие ген S. typhimurium aroC, отбирали по их способности дополнять описанный штамм. Анализ одного клона, pDACl, показал, что клон содержит фрагмент HindIII в 5,2 т.н. Определенная делеция из 600 пар оснований была создана в клонированном гене aroC с использованиемPCR. Олигонуклеотидные праймеры отбирали по опубликованной последовательности ДНК гена S. typhi aroC (Асc. М 27715). ДНК 5' в гене aroC амплифицировали из pDACl, используя праймеры, имеющие SEQID NO. 19 и SEQ ID NO. 17. SEQ ID NO. 19 отжигали на векторной ДНК, SEQ ID NO. 17 отжигали на 5'-области aroC. 3'-конец ДНК в генеID NO. 20 отжигали на векторной ДНК, SEQ IDaroC (Асc. М 27715 положение 544 до 1143) на фрагменте HindIII в 4,8 т.н. Фрагмент HindIII вставляли в сайт HindIII pUC18. Единственный сайт XbaI присутствует на участке делеции. Введение мутации aroC в мутант ZH26S. typhimurium ssaV Суицидную плазмиду pCVD442 использовали в качестве вектоpa, чтобы ввести делецию аrоС в геном S. typhimurium TML. Фрагмент HindIII в 4,8 т.н., содержащий делецию аrоС, изолировали из рМIАС 8 и концы затупляли, используя шлифующий набор ДНК Stratagene (Part No. 200409). Плазмиду pCVD442 линеаризировали путем переваривания посредством SmaI, обрабатывали щелочной фосфатазой и лигировали с фрагментами с затупленными концами. Требуемую конструкцию изолировали и обозначили pMCVC16. pMCVC16 вводили в S. typhimurium ZH26 с использованием электропорации. Отбирали ампициллинрезистентные трансформанты и выращивали в отсутствие ампициллина с учетом потери последовательностей ДНК pCVD442 и одной копии гена аrоС, или копии дикого типа или делеционной копии. Штаммы, которые подвергали описан 11 ной второй рекомбинации, идентифицировали как ампициллин-чувствительные производные, которые способны расти в присутствии 5% сахарозы. Штаммы, которые сохранили только делеционнй ген аrоС, первоначально идентифицировали как штаммы, которые не способны расти на чашках с минимальной средой в отсутствие добавки ароматических соединений. Генотип аrоС подтвердилиPCR анализом. Праймеры, имеющие SEQ ID NO. 21 и SEQ ID NO. 22, дали продукт из 994 пар оснований для дикого типа аrоС и 400 пар оснований для делеционного гена аrоС. Анализ последовательностей полученных продуктов PCR подтвердил присутствие требуемой делеции в 4 индивидуальных изолятах, обозначенных WTO5,WTO9, WTO10 и WTO12. Штамм WTO5 был выбран для создания клеточного банка CGMP master. Пример 3. Следующую конструкцию получали для исследования вакцин с двойной мутацией на животной модели. Использовали штамм S. typhimurium SL 1344, имеющий единственную и двойную мутации, которым инфицировали мышей. Мутация ssaVaph (неполярная) из S. typhimurium 12023s была Р 22-трансдуцирована вSL 1344, чтобы получить мутант Spi2 с единственной мутацией. Содержащую делецию aroC/суицидную векторную pCVD422 pMCVC16 электропорировали в штамм LB5010 S. typhimurium, и получили меродиплоиды. Меродиплоид с делецией аrоС был затем Р 22-трансдуцирован из меродиплоида LB5010 в SL 1344. Меродиплоид SL 1344 затем отделяли, используя селекцию сахарозой, чтобы получить мутант аrоС с единственной мутацией. Двойной мутант получали трансдукцией Р 22 меродиплоида с делецией аrоС из LB5010 вSL 1344 ssaVaph. Плазмидные последовательности отделяли от меродиплоида, оставляя штамм 3 с делеционной мутацией аrоС в генетической среде SL 1344 ssaVaph. Предклинические фармакодинамические исследования на определенных мутантах aroC/ssaVSalmonella Проведено обширное исследование мутантов Salmonella (штамм SL 1344), содержащих определенные мутации либо в аrоС, ssaV, либо комбинацию обеих, на мышах BALB/C, чтобы оценить аттенуацию, персистенцию организмов и возможность иммунизации против заражения штаммом дикого типа. Пример 4. Животные, иммунизированные внутривенным способом. Исследования защиты Группу из десяти мышей BALB/C иммунизировали внутривенно дозой 105 и 106 организмов SL 1344 аrоС, SL 1344 ssaV и SL 1444aroC:ssaV, выращенных в течение ночи в питательной среде LB и повторно суспендированных в физиологическом растворе для введения. 12 Мышей заражали через 6 недель внутривенным введением 105 организмов дикого типа. Десяти организмов из названного штамма дикого типа оказалось достаточно, чтобы убить мышей. Все мыши, получившие мутанты с единственной мутацией аrоС или ssaV, были надежно защищены после заражения каждой дозой и оставались здоровыми на протяжении всего эксперимента, не проявляя никаких признаков заболевания. Что касается двойных мутантов, 90% животных, которые получили иммунизацию 106 организмов, были надежно защищены. Одно из животных погибло на 8 день после заражения. Что касается животных, которые были иммунизированы более низкой дозой, то лишь 1 из мышей осталась в живых после заражения. Эксперименты показали, что иммунизация мутантами ssaV Salmonella, либо индивидуально,либо в комбинации с мутацией аrоС, позволяет добиться выработки иммунитета у мышей против заражения штаммом Salmonella дикого типа. Персистенция штаммов Группам мышей вводили дозу 106 организмов трех мутантов Salmonella, описанных выше. Четырех мышей умерщвляли в различные периоды времени вплоть до 14 дня и проводили подсчет организмов в печени и селезенке. Количества всех трех мутантов сравнивали вплоть до 10 дня, когда количество составило приблизительно 5 х 105 организмов в каждом органе. На 14 день были выявлены различия между мутантами с единственной и двойной мутациями, при этом в логарифмической зависимости уменьшалось количество организмов с двойной мутацией как в печени, так и в селезенке. Другое важное различие между мутантами с единственной мутацией и двойным мутантомaroC/ssaV заключается в том, что не было обнаружено никаких абсцессов печени ни в один из периодов времени в процессе эксперимента у двойных мутантов. Однако у мышей, инфицированных мутантом с единственной мутацией,были обнаружены абсцессы печени на 10 и 14 дни. Представленные данные важны и серьезно указывают на целесообразность применения описанной комбинации мутаций для оценки препаратов вакцин. Иммуногенность У мышей, иммунизированных, как описано выше, брали кровь и определяли титры антител против целой клетки Salmonella, используяELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). Показано, что все три штамма являются высоко иммуногенными, с высокими титрами циркулирующего IgG против Salmonella. Пример 5. Животные, иммунизированные пероральным способом. Персистенция штаммов Группы мышей, иммунизированных перорально 5 х 105 организмов каждого из трех мутантов Salmonella, умерщвляли через определенные интервалы и оценивали количество ор 13 ганизмов в печени и селезенке. Что касается мутанта с единственной мутацией аrо и с единственной мутацией ssaV, их количества в печени и селезенке составляли, соответственно, 103 и 102 приблизительно вплоть до 21 дня. Затем количество организмов снижалось. Что касается мышей,получивших двойные мутантыaroC:ssaV, после пероральной иммунизации организмы достоверно не определялись ни в печени, ни в селезенке. Иммунизация пероральным способом и внутривенное заражение мышей A-J, вакцинированных Salmonella typhimurium TMLaroC/ssaV (WTO5) Цель описываемого эксперимента заключалась в выяснении протективной эффективности 5 х 109 мутантов aroC/ssaV S. typhimuriumTML при пероральной вакцинации мыши ityr и на внутривенно зараженной модели. Упомянутая модель в большей степени напоминает ответную реакцию человека на Salmonella тем, что названные животные являются менее чувствительными, чем itys-фенотип. 10 мышей A-J в возрасте 6-8 недель вакцинировали перорально через желудочный зонд 5 х 109 S. typhimurium TML aroC/ssaV в объеме 0,2 мл PBS и оставляли на 8 недель. Двум мышам вводили только PBS в те же периоды времени и они служили в качестве контрольных животных. Через 8 недель две иммунизированные группы заражали внутривенно 107 S. typhimurium TML дикого типа. За мышами наблюдали в течение 30 дней после заражения. Все животные оказались надежно защищенными против заражения диким типом (100% выживание, живые 10/10 животных). Мыши,получившие только PBS и затем зараженные диким типом S. typhimurium TML, погибли на 6 день после заражения. Оказалось, что у ityr-фенотипа двойной S.typhimurium TML aroC/ssaV защищает мышей,получивших пероральную дозу 5 х 109. Описанный факт может быть важным в случае человека, так как мыши ityr являются лучшей моделью сальмонелеза человека с точки зрения чувствительности к инфекции. Также были проведены исследования с целью выяснения персистентности двойных мутантов в печени и селезенке мышей. Обнаружено, что двойные мутанты сохраняются при низких уровнях около 21 дня. К 28 дню происходило удаление мутантной линии. Пример 6. Клиническое испытание на человеке. 18 здоровых волонтеров было привлечено для обширного исследования без контроля плацебо. После соответствующего скрининга каждый из 3 волонтеров получал однократную пероральную дозу или 107, 108 или 109 КОЕ S. typhi ZH9 или S. typhimurium WTO5. Микроорганизмы, приготовленные, как описано выше, повторно суспендировали до соответствующих(мас./об.) раствора двууглекислого натрия, чтобы нейтролизовать желудочную кислоту. Полученную жидкую суспензию вводили волонтерам перорально. Затем волонтеров изолировали в течение 72 ч, тщательно наблюдая за ними после иммунизации в отношении безопасности и иммуногенности. У волонтеров оценивали реактогенность и другие неблагоприятные явления, связанные с вакцинацией, посредством наблюдения, врачебного осмотра и составления диарейных карт,кроме того, собирали культуры крови, испражнений и мочи, чтобы исследовать вакцинемию,потерю и устойчивость вакцинных штаммов. Дополнительные данные относительно безопасности были получены в результате измерения уровней С-реактивного белка (CRP) и ферментов функции печени (ALT) в крови, общего количества белых клеток крови (WBC) и скорости оседания эритроцитов (ESR), используя стандартные способы. Перечисленные параметры измеряли в крови, которую брали ежедневно до 7 дня, и потом - с еженедельными интервалами до 28 дня. Анализ ответных реакций слизистых и системного иммунного ответа Образцы крови и слюны собирали до иммунизации и потом -на 7, 14, 21 и 28 день после иммунизации. Слюну и сыворотку замораживали при -70 С до исследования, проводимого методом ELISA. Мононуклеарные клетки периферической крови собирали и исследовали присутствие в них клеток, секретирующих антителаWTO5 хорошо переносились всеми волонтерами. Никаких серьезных неблагоприятных явлений ни у кого из волонтеров не наблюдали ни на одном из 3 уровней доз, а культуры крови и мочи оставались негативными у всех вакцинированных во всех временных точках исследования. Таким образом, иммунизация как S. typhiZH9, так и S. typhimurium WTO5 не приводила к вакцинемии. Ни у кого из волонтеров не обнаруживали ни вызванной штаммами диареи, ни устойчивой интенсивной лихорадки, что указывает на безопасность вакцинных штаммов. Ни устойчивой экскреции, ни вакцинемии после 7 дня ни у одного из волонтеров 3 дозовых группS. typhi ZH9, а также группы низкой дозы (107)S. typhimurium WTO5 не наблюдали. Слизистые и системные иммунные ответные реакции, выявленные с помощьюS. typhi ZH9 Пероральная иммунизация однократной низкой дозой (1 х 107 КОЕ) S. typhi ZH9 приводила к появлению S. typhi-специфических IgAсекретирующих ASC у 2 из 3 волонтеров, определяемых на 7 день после иммунизации. Последующее тестирование на 14 и 21 дни показало, 15 что IgA-ASC еще определялись, но в значительно меньшей степени, и исчезали к 28 дню. Почти у всех отвечающих вакцинированных количество ASC было более высоким на 7 день. Неожиданно прием внутрь более высокой дозыIgA-ASC только у одного из трех волонтеров. Прием внутрь наиболее высокой дозы (1 х 109 КОЕ) индуцировал IgA-ASC у 2 из 3 волонтеров. Ответ Salmonella-специфических сывороточных антител При пероральной иммунизации однократной низкой дозой (1 х 107 КОЕ) S. typhi ZH9 не удалось выявить S. typhi-LPS-специфический сывороточный IgG (несмотря на образованиеIgA-ASCs у 2/3 вакцинированных), когда исследовали на 7, 14, 21 и 28 дни. Аналогично, только 1/3 продуцировала очень низкие уровни флагелла-специфического IgG. Однако прием внутрь 108 КОЕ приводил к продукции высоких уровней как LPS, так и флагелла-специфических IgG у всех 3 волонтеров. Увеличенные уровни S.typhi-LPS-специфического и флагелласпецифического IgG определяли уже на 7 день после вакцинации, они возрастали к 14 дню и сохранялись высокими на 28 день. Наиболее высокая доза 109 КОЕ также стимулировалаLPS- и флагелла-специфический IgG у 2 из 3 вакцинированных, что обнаруживали на 7 и 14 дни, соответственно. Выводы Представленное исследование продемонстрировало преимущество мутации ssaV в качестве компонента нового брюшнотифозного вакцинного штамма для перорального введения. Штамм S. typhi, содержащий только aroмутации, будет вызывать вакцинемию при вводимых дозах. Поэтому мутация ssaV обеспечивает дополнительный уровень безопасности единственной мутации аrо посредством устранения вакцинемии при использовании описанного ранее состава. Что касается обеспечения хорошей толерантности, также было продемонстрировано,что ZH9 оказался иммуногенным при всех трех введенных уровнях доз. Относительно стимулирования сывороточных антител доказано, что промежуточные (108 КОЕ) и наивысшие (109 КОЕ) дозы оказались высокоиммуногенными, в случае введения 108 КОЕ 3/3 вакцин и в случае введения 10 9 КОЕ 2/3 продемонстрировали высокие титры как S. typhi LPS, так и флагелласпецифического IgG. Описанные ответные реакции являются очень обнадеживающими, так как при пероральной вакцинации вообще трудно выявить сывороточные антитела. Что касается возникновения ответных реакций S. typhi-специфических сывороточных антител, ZH9 также инициировал IgA ASCs, что указывает на иммунную стимуляцию в слизистой кишечника. Всего у 5/9 волонтеров выяви 004921 16 ли ответ S. typhi LPS-специфических IgAсекретирующих клеток (ASC), который, как оказалось, не является дозозависимым. Оказалось, что WTO5 также хорошо переносится и не обнаружено никакой вакцинемии. Интересно, что никакой диареи или симптомов гастроэнтерита ни у кого из волонтеров не наблюдали. Предварительные данные, полученные с использованием мутантного штамма TML с единственной аrо- или Spi2-мутациями в S.typhimurium, введенными мышам, позволили предположить, что двойной мутант aroC/ssaV может вызывать некоторые местные кишечные проявления, например диарею, судороги у человека. Отсутствие названных проявлений дополнительно подтверждает преимущество комбинации мутаций аrоС и Spi2. Пример 7. Гетерологические антигенные носители. Чтобы продемонстрировать преимущество двойных мутантных штаммов ssaV:aroC для экспрессии и доставки чужеродных антигенов,WTO5 трансформировали плазмидой(pBRDO26), экспрессирующей ген субъединицы В термостабильного энтеротоксина E.coli (LTB). Мышей BALB/C (n = 10/группу) иммунизировали пероральным введением на 0 и 28 дни 109 КОЕ (200 мл в PBS) WTO5, экспрессирующего pBRDO26, или посредством векторного штамма WTO5 (контроль). Для сравнения (и в качестве положительного контроля) группу мышей (n = 5) иммунизировали перорально на 0 и 28 дни 10 мкг очищенного LT (Sigma). Негативных контрольных мышей (n = 5) иммунизировали перорально на 0 и 28 день 200 мкл PBS. У мышей брали кровь из хвостовой вены на 21,28, 35 дни и при пункции сердца на 42 день, а также собирали сыворотку и кишечную жидкость (только на 42 день) и хранили при -20 С. У всех мышей, кроме одной, иммунизированных WTO5/LT-B, выявили LT-специфический IgG (титры 3000 - 50000) на 28 день после однократной пероральной дозы. Ни у одной из контрольных мышей, иммунизированных перорально WTO5 или PBS, не выявили LTспецифический IgG. При пероральной иммунизации однократной дозой очищенного LT были обнаружены более высокие титры LTспецифических антител (титры 6000 - 50000). При исследовании изотипаLTспецифический IgG2a, что указывает на смещение в направлении иммунного ответа TH1-типа. В отличие от этого, мыши, иммунизированные очищенным LT (Sigma), продуцировали почти исключительно LT-специфический IgG1, что указывает на ответную реакцию ТН 2-типа. Следовательно, экспрессия LT-B в штаммеaroC/ssaV облегчает фундаментальную иммун 17 номодуляцию. TH1-смещение ответных реакций, генерируемых штаммом SalmonellaaroC/ssaV, имеют особое значение, когда экспрессируются антигены патогенных организмов, у которых ответные реакции типа ТН 1 являются защитными. СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 20 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Микроорганизм Salmonella, имеющий аттенуирующую мутацию, которая нарушает экспрессию гена ssaV, и мутацию, которая нарушает экспрессию гена аrоС. 2. Микроорганизм по п.1, который дополнительно содержит гетерологичный антиген или терапевтический белок. 3. Микроорганизм по п.2, в котором антиген является антигеном гепатита А, В или С. 4. Микроорганизм по любому из пп.1-3,который представляет собой Salmonella typhiTy2. 5. Применение микроорганизма по любому из пп.1-4 в терапии бактериальной или вирусной инфекции. 6. Вакцинная композиция, содержащая микроорганизм по любому из пп.1-4, а также адъювант и физиологически приемлемый разбавитель. 7. Композиция по п.6, которая содержит от 107 до 1010 КОЕ микроорганизма в однократной стандартной дозе. 8. Композиция по п.7, которая содержит 108-109 КОЕ микроорганизма. 9. Применение микроорганизма по любому из пп.1-4 в производстве лекарственного средства для внутривенного введения для лечения системной бактериальной инфекции. 10. Применение микроорганизма по любому из пп.1-4 в производстве перорального лекарственного средства для лечения системной бактериальной инфекции. 11. Применение по п.9 или 10 для лечения брюшного тифа.