Способ получения липосомальной формы оксалиплатина

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ОКСАЛИПЛАТИНА Изобретение относится к фармацевтике. Способ включает получение эмульсии оксалиплатина и липидной пленки на основе фосфолипида и холестерина, их перемешивание, гомогенизацию по меньшей мере в два цикла, фильтрацию, ультрафильтрацию, стерилизацию и лиофилизацию. Достигаемый результат состоит в стандартности и стабильности полученного препарата липосом (размер липосом представлен в узком диапазоне), содержащих оксалиплатин, высокой инкапсуляции оксалиплатина в липосомы, стабильности продукта в процессе хранения. Шоболов Дмитрий Львович (RU),Краснопольский Юрий Михайлович(UA), Ульянов Андрей Михайлович,Натыкан Алексей Андреевич, Тарасов Вадим Владимирович, Балабаньян Вадим Юрьевич, Швец Виталий Иванович (RU) Ермакова Е.А. (RU) Хорошо известно использование препаратов платины [3, 11, 16-18], в частности оксалиплатина, в качестве противоопухолевого агента для лечения больных онкологическими заболеваниями: метастазирующий рак толстой и прямой кишки в качестве монотерапии или в составе комбинированной терапии,для лечения рака яичников в качестве второй линии терапии. Оксалиплатин представляет собой вещество с химической формулой C8H14N2O4Pt, (М.м. 397,0): Как и другие препараты платины, оксалиплатин обладает уникальным механизмом действия и широким спектром противораковой активности. Препарат взаимодействует с ДНК, образуя внутри - и межспиральные сшивки, что блокирует е синтез и последующую репликацию. Оксалиплатин эффективен для некоторых линиях опухолей резистентных к цисплатину и карбоплатину. В то же время, оксалиплатин отличает высокая токсичность, проявляющаяся в побочных действиях: со стороны системы кроветворения (очень часто: анемия, лейкопения, нейтропения, тромбоцитопения; часто: сепсис на фоне нейтропении, фибрильная нейтропения и др.); со стороны системы пищеварения(очень часто: тошнота, рвота, диарея, стоматит, боли в области живота, потеря аппетита; часто: диспепсия, кишечное кровотечение, икота, панкреатит и др.); со стороны нервной системы: очень часто нейропатия, головная боль, астения; часто депрессия, бессонница, головокружение и др.; наблюдаются также побочные действия со стороны костно-мышечной и сердечно-сосудистой систем, органов зрения, дыхания, кожи и др [3]. Одним из приоритетных направлений развития современных фармацевтических технологий является разработка и создание терапевтических систем направленного действия. Для решения этой задачи с успехом применяются наносомальные носители лекарственных веществ, которые способны увеличивать нацеленность действия и обеспечивают повышение биодоступности. За последние годы появились сообщения о включении препаратов платины в наночастицы из различных полимерных носителей, пегилированных частиц и в липосомы из природных и синтетических липидов [4, 5, 9, 12-14]. Опухолевые клетки имеют особенность в строении кровеносных капилляров - их эндотелиальные клетки не плотно прилегают друг к другу, давая возможность частицам до 200 нм проникать в межклеточное пространство. Этот факт, а так же замедленный лимфатический дренаж внутри опухоли создат возможности для целевого накопления липосом с цитотоксическим лекарственным средством внутри опухолей, с последующим высвобождением содержимого. Такой эффект дат повышение концентрации активной субстанции в органе, нуждающемся в терапии, в сравнении с остальными тканями организма,что ведт к снижению токсичности. В литературе описано множество попыток преодоления липосомальными лекарственными составами побочного действия. Известны лекарственные препараты на основе липосомальных композиций, в состав которых включены гидрофобные и гидрофильные противоопухолевые лекарственные субстанции[1, 2, 19, 20]. Проведенные клинические исследования липосомальных препаратов на основе различных субстанций продемонстрировали высокую фармакологическую активность в пульмонологии, онкологии,кардиологии, нефрологии, офтальмологии и других направлениях медицины [1-5]. Применение липосомальных форм цитостатиков [10, 12-14] является перспективным направлением для преодоления лекарственной устойчивости к химиопрепаратам, а также снижения токсического действия по сравнению со свободными формами противоопухолевых препаратов на органы и ткани [6-8]. Резистентность к препаратам платины приводит к снижению внутриклеточного накопления цитостатика, что обуславливает большое количество неудач в клинической практике. При этом увеличение дозы цитостатика неизбежно приводит к росту токсических эффектов (нефротоксичность, нейротоксичность, кардиотоксичность,тошнота, рвота и т.д.). Именно резистентность и высокая токсичность комплексных соединений платины привели к многочисленным попыткам создания липосомальных форм различных соединений платины и их использования в эксперименте и клинике. Известны способы получения липосомальных форм препаратов платины [21, 22]. За прошедшее время были предложены различные способы получения липосом, содержащих соединения платины [1618]. Липосомальные препараты платины проявляют гораздо меньшую токсичность в нормальных клетках по сравнению со свободной формой. Также установлена более высокая противоопухолевая активность липосомальной формы препаратов платины [16-20]. Известен способ получения липосомальной композиции на основе природных и синтетических липидов и оксалиплатина, которая обладает противоопухолевой активностью [15]. Способ [15] выбран нами наиболее близким аналогом по сумме признаков, а именно: сутью и последовательностью выполнения основных операций и приемов, химической природой фосфофолипидов и оксалиплатина, липосомальной организацией целевого продукта и близостью его фармакотерапевтических проявлений. Известный способ [15] предусматривает следующие операции: оксалиплатин смешивают с дипальмитоилфосфатидилглицерином (или другими кислыми фосфолипидами) в молярном соотношении 1:1 или 1:2 в 20-40 % этаноле, 0,1 М трис HCl pH-6,5-8,0 в конечной концентрации оксалиплатина 5 мг/мл инкубируют в течение 20 мин - 3 ч. В этих условиях положительно заряженные аминогруппы на молекулах оксалиплатина вступают во взаимодействие с отрицательно заряженными группами на молекуле дипальмитоилфосфатидилглицерина, образуя в этанольных растворах обратные мицеллы. Полученные обратные мицеллы оксалиплатин - отрицательно заряженный липид преобразуют в липосомы, инкапсулируя монослой оксалиплатин- отрицательно заряженный липид путем быстрого смешивания с предварительно образованными липосомами, состоящими из холестерина, фосфатидилхолина и метоксиполиэтиленгликольдистеароил-фосфатидилэтаноламина (ПЭГ-2000), с последующим диализом против 0,9% натрия хлорида и экструзией через мембраны для уменьшения размера частиц до 80-120 нм. При этом инкапсуляция составила 50-100%. Однако, способ [15] предусматривает операции и методы, которые затрудняют его реализацию и способствуют снижению качества итогового липосомального продукта. Во-первых, это связано с использованием в составе липосом ПЭГ-2000. Согласно имеющимся в литературе данным [10] выявлено два главных дозолимитирующих фактора: стоматит и кожная токсичность (подошвенно-ладонная дисэстезия или Hand-Foot syndrome), связанные с присутствием в липосомальных препаратах ПЭГ-2000. Во вторых,в составе указанного продукта отсутствует криопротектор, что исключает возможность последующей лиофилизации, а следовательно не предусматривает длительного хранения препарата. В третьих, в способе [15] предусмотрено получение водно-спиртовых растворов цитостатика и отрицательно заряженного липида, что в свою очередь требует гарантированного удаления органических растворителей перед экструзией и получением липосом. Осуществление такого процесса возможно в лабораторных условиях,но крайне затруднительно в промышленных. Кроме того, предлагаемая в [15] температура 30-60C и буферная смесь с pH 6,5-8,0 отрицательно влияет на сохранность липидов и оксалиплатина. Обращает внимание также факт низкого включения в способе [15] цитостика в липосомы (от 50 до 100%). Все вышеперчисленное снижает эффективность способа-прототипа в процессе его воспроизводства,а также стабильность целевого продукта как химиотерапевтического средства. Задачей заявленного способа является упрощение процесса получения и повышение качества липосомального препарата по показателям стабильности как липосомальной структуры, так и стабильности фармакологически активной субстанции оксалиплатина. При этом результат, полученный при решении поставленной задачи, состоит в стандартности и стабильности полученного препарата липосом (размер липосом представлен в узком диапазоне), содержащих оксалиплатин, высокой инкапсуляции оксалиплатина в липосомы, стабильности продукта в процессе хранения. Кроме того, предлагаемый способ является высоко технологичным и может применяться для промышленного получения липосомальной формы оксалиплатина с содержанием включенного оксалиплатина не менее 90%. Для достижения поставленного результата предлагается способ получения противоопухолевого препарата в липосомальной форме, включающий получение эмульсии оксалиплатина и липидной пленки на основе фосфолипида и холестерина, их перемешивание, гомогенизацию, по меньшей мере, в два цикла, фильтрацию, ультрафильтрацию, стерилизацию и лиофилизацию, при этом эмульсию оксалиплатина получали из раствора оксалиплатина и липидной плнки из отрицательно заряженных фосфолипидов,фосфатидилхолина и холестерина в соотношении (0,5-0,95):(6-8):1, соответственно, дополнительно вели дробное добавление криопротектора - до гомогенизации или экструдирование и после ультрафильтрации до конечной концентрации не менее 8,0%, а ультрафильтрацию вели через мембраны 10 кДа. В качестве отрицательно заряженных фосфолипидов возможно использование кардиолипина сердечной мышцы крупного рогатого скота, фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты яичного желтка,дипальмитоилфосфатидилглицерина, фосфатидилхолина или их смеси; в качестве криопротектора - лактозу, трегалозу, сахарозу, мальтозу, маннит или их смеси. Изобретение иллюстрируется графиками усредннных фармакокинетических профилей оксалиплатина в печени, мозге, почках и сердце крыс (фиг. 1-4, соответственно). Эффективность заявляемого способа по качественной и количественной идентификации в готовом продукте липидного компонента - фосфатидилхолина, отрицательно заряженных фосфолипидов и холестерина оценивали методом тонкослойной хроматографии на пластинках по хроматограмме раствора целевого продукта в метаноле, на которой основные пятна желтого цвета находится на уровне основных пятен растворов стандартных образцов липидов; индекс окисленности липидов определяли УФспектроскопией при двух длинах волн: 233 и 215 нм. Качество полученного продукта оценивалось методом гель-фильтрации на колонке 4,6250 мм Hypersil BDS C18 (5 мкм) или аналогичный в среде ацетонитрила и гептонатсульфоната с щавелевой кислотой для определения инкапсуляции. Количественное определение и определение состава примесей проводили высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке заполненной октадецилсиликагелем (на приборе Shimadzu LC-20, при длине волны 215 нм). Размер частиц оценивался на приборе фирмы Malvern Zetasizer nano ZS, методом фотонной корелляционной спектроскопии. Размер частиц измерялся при помощи полупроводникового лазера при длине волны 375 ни. Нижеследующие конкретные примеры иллюстрируют процесс получения липосомальной композиции согласно заявленному способу, (примеры 1-8) и способу, согласно прототипу (пример 9) Пример 1. Оксалиплатин в количестве 1,0 г растворяют в 300 мл буферной смеси с pH 6,4, в которой находился криопротектор - лактоза. Раствор фильтруют через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Кардиолипин 0,5 г и фосфатидилхолин - 4 г растворяли в 100 мл этанола, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и кардиолипин,добавляли стерильный раствор оксалиплатина. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 2 ч. Контроль эмульсии: концентрация 3,29 мг/мл оксалиплатина. Фосфатидилхолин - 4 г и холестерин 1 г растворяли в 100 мл этанола, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 90 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и холестерин, прибавляли липидную эмульсию оксалиплатина Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 1,5 ч. Контроль эмульсии: концентрация 3,26 мг/мл оксалиплатина. Полученную эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 40-44C. Первоначальное давление (2 цикла) 500 атм. Продолжали гомогенизацию при 800-1000 атм до размера частиц не более 170 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 280 мл фильтровали не более,чем за 15 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 162,4 нм - 93,5%, 67,78 - 6,5%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 3,12 мг/мл. Включение после стерилизующей фильтрации 77,6%. Объем стерильной эмульсии 265,0 мл. Не включенный в липосомы оксалиплатин отделяли ультрафильтрацией через мембраны 10 кДа,добавляли криопротектор до конечной концентрации не менее 8,0%, проводили стерилизующую фильтрацию, розлив во флаконы по 10 мл и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы почти белого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне от 160,0 до 200 нм, pH 6,55. Включение не менее 97,5%. Хранение препарата при температуре от 2 до 8C в течение 4 месяцев продемонстрировало стабильность продукта. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции оксалиплатина. Массовое соотношение компонентов в препарате: кардиолипин - фосфатидилхолин - холестерин в соотношении (0,5:8:1) и оксалиплатин - кардиолипин (1:0,5). Пример 2. Оксалиплатин в количестве 1,0 г растворяют в 300 мл буферной смеси с pH 6,5, в которой находился криопротектор - лактоза. Раствор фильтруют через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Фосфатидилглицерин - 0,75 г и фосфатидилхолин - 3 г растворяли в 100 мл этанола, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и фосфатидилглицерин, добавляли стерильный раствор оксалиплатина Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 2 ч. Фосфатидилхолин - 5 г и холестерин 1 г растворяли в 100 мл этанола,фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 4245C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и холестерин прибавляли липидную эмульсию оксалиплатина Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 1 ч. Контроль эмульсии: концентрация 3,23 мг/мл оксалиплатина. Полученную эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 40-44C. Первоначальное давление (2 цикла) 500 атм. Продолжали гомогенизацию при 800-1000 атм до размера частиц не более 170 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 285 мл фильтровали не более,чем за 15 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 172,4 нм - 100%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 3,08 мг/мл. Включение после стерилизующей фильтрации 73,1%. Объем стерильной эмульсии 270,0 мл. Не включенный в липосомы оксалиплатин отделяли ультрафильтрацией через мембраны 10 кДа,добавляли криопротектор до конечной концентрации не менее 8,0%, проводили стерилизующую фильтрацию, розлив во флаконы по 20 мл и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы почти белого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне от 177,0 до 205 нм, pH-6,35. Включение не менее 98,1%. Хранение препарата при температуре от 2 до 8C в течение 4 месяцев продемонстрировало стабильность продукта. Количество примесей липосомального продукта на уровне исходной субстанции оксалиплатина. Массовое соотношение компонентов в препарате: фосфатидилглицерин фосфатидилхолин - холестерина в соотношении (0,75:8:1) и оксалиплатин - фосфатидилглицерин(1:0,75). Пример 3. Оксалиплатин в количестве 1,0 г растворяют в 300 мл буферной смеси с pH 6,3, в которой находился криопротектор - трегалоза. Раствор фильтруют через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Дипальмитоилфосфатидилглицерин - 0,95 г и фосфатидилхолин - 4 г растворяли в 150 мл смеси хлороформа и этанола (6:1), фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и дипальмитоилфосфатидилглицерин, добавляли стерильный раствор оксалиплатина. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 2 ч. Фосфатидилхолин - 3 г и холестерин 1 г растворяли в 100 мл этанола, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 90 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и холестерин,прибавляли липидную эмульсию оксалиплатина Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 1 ч. Контроль эмульсии: концентрация 3,25 мг/мл оксалиплатина. Полученную эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 40-44C. Первоначальное давление (2 цикла) 500 атм. Продолжали гомогенизацию при 800-1000 атм до размера частиц не более 170 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров с финишным фильтром 0,22 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 285 мл фильтровали не более, чем за 15 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 172,4 нм - 100%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 3,12 мг/мл. Включение после стерилизующей фильтрации 83,1%. Объем стерильной эмульсии 270,0 мл. Не включенный в липосомы оксалиплатин отделяли ультрафильтрацией через мембраны 10 кДа,добавляли криопротектор до конечной концентрации не менее 8,0%, проводили стерилизующую фильтрацию, розлив во флаконы по 20 мл и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы почти белого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне от 177,0 до 205 нм, pH-6,35. Включение не менее 98,1%. Хранение препарата при температуре от 2 до 8C в течение 4 месяцев продемонстрировало стабильность продукта. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции оксалиплатина. Массовое соотношение компонентов в препарате: дипальмитоилфосфатидилглицерин - фосфатидилхолин - холестерина в соотношении (0,95:8:1) и оксалиплатин - дипальмитоилфосфатидилглицерин (1:0,95). Пример 4. Оксалиплатин в количестве 1,0 г растворяют в 300 мл буферной смеси с pH 6,5, в которой находился криопротектор - трегалоза. Раствор фильтруют через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Фосфатидную кислоту - 0,95 г и фосфатидилхолин - 5 г растворяли в 100 мл смеси хлороформа и этанола (6:1),фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 4245C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и фосфатидную кислоту, добавляли стерильный раствор оксалиплатина. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 2 ч. Фосфатидилхолин - 3 г и холестерин 1 г растворяли в 100 мл этанола, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и холестерин, прибавляли липидную эмульсию оксалиплатина Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 1 ч. Контроль эмульсии: концентрация 3, 26 мг/мл оксалиплатина. Полученную эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 40-44C. Первоначальное давление (2 цикла) 500 атм. Продолжали гомогенизацию при 800-1000 атм до размера частиц не более 170 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила удовлетворительно: 295 мл фильтровали не более, чем за 15 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 152,4 нм - 100%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 2,95 мг/мл. Включение после стерилизующей фильтрации 68,1%. Объем стерильной эмульсии 277,0 мл. Не включенный в липосомы оксалиплатин отделяли ультрафильтрацией через мембраны 10 кДа,добавляли криопротектор до конечной концентрации не менее 8,0 %, проводили стерилизующую фильтрацию, розлив во флаконы по 20 мл и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофили-4 023757 зации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы почти белого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне от 167,0 нм до 200 нм, pH-6,45. Включение не менее 96,3%. Хранение препарата при температуре от 2 до 8C в течение 4 месяцев продемонстрировало стабильность продукта. Количество примесей липосомального продукта на уровне исходной субстанции. Массовое соотношение компонентов в препарате: фосфатидная кислота фосфатидилхолин - холестерина в соотношении (0,95:8:1) и оксалиплатин - фосфатидная кислота (1:0,95). Пример 5. Оксалиплатин в количестве 1,0 г растворяют в 300 мл буферной смеси с pH 6,3, в которой находился криопротектор - лактоза. Раствор фильтруют через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Дипальмитоилфосфатидилглицерин - 0,4 г и фосфатидилхолин - 4 г растворяли в 150 мл смеси хлороформа и этанола(6:1), фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке,содержащей фосфатидилхолин и дипальмитоилфосфатидилглицерин, добавляли стерильный раствор оксалиплатина. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 2 ч. Фосфатидилхолин- 4 г и холестерин 1 г растворяли в 100 мл этанола, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и холестерин, прибавляли липидную эмульсию оксалиплатина Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 1 ч. Контроль эмульсии: концентрация 3,22 мг/мл оксалиплатина. Полученную эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 40-44C. Первоначальное давление (2 цикла) 500 атм. Продолжали гомогенизацию при 800-1000 атм до размера частиц не более 170 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,22 мкм. Фильтрация проходила неудовлетворительно: 285 мл фильтровали более,чем 20 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 172,6 нм - 95%, 45 нм -5,0% Концентрация после стерилизующей фильтрации 3,00 мг/мл. Включение после стерилизующей фильтрации 53,1%. Объем стерильной эмульсии 250,0 мл. Не включенный в липосомы оксалиплатин (46,9%) отделяли ультрафильтрацией через мембраны 10 кДа, добавляли криопротектор до конечной концентрации не менее 8,0%, проводили стерилизующую фильтрацию, розлив во флаконы по 20 мл и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы почти белого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне от 187,0 нм до 200,0 нм, pH-6,5. Включение не менее 96,1%. Хранение препарата при температуре от 2 до 8C в течение 4 месяцев продемонстрировало стабильность продукта. Количество примесей липосомального продукта на уровне исходной субстанции оксалиплатина. Массовое соотношение компонентов в препарате: дипальмитоилфосфатидилглицерин - фосфатидилхолин - холестерина в соотношении (0,4:8:1) и оксалиплатин - дипальмитоилфосфатидилглицерин (1:0,4). Как видно из приведенных данных, снижение количества дипальмитоилфосфатидилглицерина в образцах приводит к снижению включения оксалиплатина в липосомы, затруднению при проведении стерилизующей фильтрации, повышению стоимости продукта т.к. значительно повышаются потери целевого продукта при ультрафильтрации. Пример 6. Оксалиплатин в количестве 1,0 г растворяют в 300 мл буферной смеси с pH 6,3, в которой находился криопротектор - лактоза. Раствор фильтруют через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Кардиолипин 1,2 г и фосфатидилхолин - 4 г растворяли в 150 мл смеси хлороформа и этанола (6:1), фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (6080 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и кардиолипин, добавляли стерильный раствор оксалиплатина. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 2 ч. Фосфатидилхолин - 3 г и холестерин 1 г растворяли в 100 мл этанола, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и холестерин, прибавляли липидную эмульсию оксалиплатина Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 1 ч. Полученную эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 40-44C. Первоначальное давление (2 цикла) 500 атм. Продолжали гомогенизацию при 800-1000 атм до размера частиц 200-220 нм. Дальнейшая гомогенизация не приводила к снижению размера. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,2 мкм. Фильтрация проходила неудовлетворительно: 275 мл фильтровали более 30 мин (приходилось дважды заменять фильтры). Размер частиц после стерилизующей фильтрации 215,4 - 86,5%, 132 нм - 13,5%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 2,87 мг/мл. Включение после стерилизующей фильтрации 77,1%. Объем стерильной эмульсии 230,0 мл. Не включенный в липосомы оксалиплатин отделяли ультрафильтрацией через мембраны 10 кДа,добавляли криопротектор до конечной концентрации не менее 8,0%, проводили стерилизующую фильтрацию, розлив во флаконы по 20 мл и лиофилизацию. Флаконы герметизировали ватмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы почти белого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне от 187,0 нм до 245,5 нм, pH 6,35. Включение не менее 96,1%. Хранение препарата при температуре от 2 до 8C в течение 4 месяцев продемонстрировало стабильность продукта. Количество примесей липосомального продукта на уровне исходной субстанции оксалиплатина. Массовое соотношение компонентов в препарате: кардиолипин - фосфатидилхолин - холестерина в соотношении (1,2:8:1) и оксалиплатин - кардиолипин (1:1,2). Как видно из приведенных данных, увеличение количества кардиолипина в образцах приводит к увеличению размера липосом(при таком же количестве циклов), затруднению при проведении стерилизующей фильтрации и большим потерям эмульсии, нестабильности липосом при лиофилизации - размеры до 245,5 нм. Пример 7. Оксалиплатин в количестве 1,0 г растворяют в 300 мл буферной смеси с pH 6,3, в котором находился криопротектор - лактоза. Раствор фильтруют через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Дипальмитоилфосфатидилглицерин - 0,95 г и фосфатидилхолин - 2 г растворяли в 150 мл смеси хлороформа и этанола (6:1), фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и дипальмитоилфосфатидилглицерин, добавляли стерильный раствор оксалиплатина. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 2 ч. Фосфатидилхолин - 4 г и холестерин 1 г растворяли в 100 мл этанола, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и холестерин,прибавляли липидную эмульсию оксалиплатина Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 1 ч. Контроль эмульсии: концентрация 3,18 мг/мл оксалиплатина. Полученную эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 40-44C. Первоначальное давление (2 цикла) 500 атм. Продолжали гомогенизацию при 800-1000 атм до размера частиц не более 170 нм. Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,22 мкм. Фильтрация проходила неудовлетворительно: 285 мл фильтровали более, чем за 25 мин. Размер частиц после стерилизующей фильтрации 162,8 нм - 100%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 3,08 мг/мл. Включение после стерилизующей фильтрации 63,1%. Объем стерильной эмульсии 270,0 мл. Не включенный в липосомы оксалиплатин отделяли ультрафильтрацией через мембраны 10 кДа,добавляли криопротектор до конечной концентрации не менее 8,0%, проводили стерилизующую фильтрацию, розлив во флаконы по 20 мл и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы почти белого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне от 180,0 нм до 235 нм, pH 6,35. Включение не менее 96,4%. Хранение препарата при температуре от 2 до 8C в течение 4 месяцев продемонстрировало стабильность продукта. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции оксалиплатина. Массовое соотношение компонентов в препарате: дипальмитоилфосфатидилглицерин - фосфатидилхолин - холестерина в соотношении (0,95:6:1) и оксалиплатин - дипальмитоилфосфатидилглицерин (1:0,95). Как видно из приведенных данных, уменьшение количества фосфатидилхолина в образцах приводит к увеличению размера липосом (при таком же количестве циклов), затруднению проведения стерилизующей фильтрации и большими потерями эмульсии, нестабильности липосом при лиофилизации - размеры до 235 нм. Пример 8. Оксалиплатин в количестве 1,0 г растворяют в 300 мл буферной смеси с pH 6,3, в котором находился криопротектор - лактоза. Раствор фильтруют через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Дипальмитоилфосфатидилглицерин - 0,75 г и фосфатидилхолин - 6 г растворяли в 150 мл смеси хлороформа и этанола (6:1), фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и дипальмитоилфосфатидилглицерин, добавляли стерильный раствор оксалиплатина. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 2 ч. Фосфатидилхолин - 3 г и холестерин 1 г растворяли в 100 мл этанола, фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 42-45C в течение 90 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. К липидной пленке, содержащей фосфатидилхолин и холестерин,прибавляли липидную эмульсию оксалиплатина Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 1 ч. Полученную эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию при температуре 40-44C. Первоначальное давление (2 цикла) 500 атм. Продолжали гомогенизацию при 800-1000 атм до размера частиц около 200 нм (дальнейшее проведение гомогенизации не приводило к существенному уменьшению размера). Эмульсию фильтровали через каскад фильтров, с финишным фильтром 0,22 мкм. Фильтрация проходила с значительными трудностями и потерей эмульсии (за счет многократной замены фильтров) Размер частиц после стерилизующей фильтрации 192,4 нм 88,0%, 139,5 - 12%. Концентрация после стерилизующей фильтрации 2,75 мг/мл. Включение после стерилизующей фильтрации 70,1%. Объем стерильной эмульсии 212,0 мл. Не включенный в липосомы оксалиплатин отделяли ультрафильтрацией через мембраны 10 кДа,добавляли криопротектор до конечной концентрации не менее 8,0%, проводили стерилизующую фильтрацию, розлив во флаконы по 20 мл и лиофилизацию. Флаконы герметизировали в атмосфере инертного газа (азота). По результатам контроля продукта, полученного по предлагаемому способу, после лиофилизации установлено, что препарат представлен в виде легкой аморфной массы почти белого цвета с характерным запахом; размер частиц сохранен в нанодиапазоне от 225,0 нм до 265,0 нм, pH 6,25. Включение не менее 92,1%. Хранение препарата при температуре от 2 до 8C в течение 4 месяцев продемонстрировало стабильность продукта. Количество примесей в липосомальном продукте на уровне исходной субстанции оксалиплатина. Массовое соотношение компонентов в препарате: дипальмитоилфосфатидилглицерин - фосфатидилхолин - холестерина в соотношении (0,75:10:1) и оксалиплатин - дипальмитоилфосфатидилглицерин (1:0,75). Как видно из приведенных данных, увеличение количества фосфатидилхолина в образцах приводит к увеличению размера липосом (при таком же количестве циклов), затруднению проведения стерилизующей фильтрации и большими потерями эмульсии, нестабильности липосом при лиофилизации - размеры до 265 нм. Пример 9 (согласно способу прототипа). Оксалиплатин в количестве 1,0 г растворяют в 100 мл натрий-фосфатного буфера (50 мМ) с pH 7,5(концентрация оксалиплатина - 10,0 мг/мл). Раствор фильтруют через мембраны с размером пор 0,22 мкм. Дипальмитоилфосфатидилглицерин (ДПФГ) растворяют в безводном этаноле при 65C. Полученный раствор смешивают с раствором оксалиплатина таким образом, чтобы конечная концентрация оксалиплатина составляла 5 мг/мл, в молярном соотношении оксалиплатин : ДПФГ (1:1). При этом концентрация этанола в смеси 40%, доводя объем смеси натрий-фосфатного буфера (50 мМ) с pH 7,5 до объема 200 мл (конечная концентрация оксалиплатина 5,0 мг/мл). Смесь инкубировали при температуре 50C в течение 2 ч. В этих условиях положительно заряженные аминогруппы на молекулах оксалиплатина вступают во взаимодействие с отрицательно заряженными группами на молекуле ДПФГ, образуя в этанольных растворах обратные мицеллы Полученные обратные мицеллы оксалиплатин - ДПФГ концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 65C до удаления этанола. Затем, полученную водную эмульсию обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) до полного удаления растворителя (время проведения процесса удаления этанола из водного раствора составляло для 200 мл не мнеее 5 ч). Фосфатидилхолин гидрогенизированный сои, холестерин и ПЭГ-2000 растворяли в 150 мл смеси хлороформа и этанола (6:1), фильтровали через мембраны 0,22 мкм и концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 60C в течение 120 мин. Затем, полученную липидную пленку обрабатывали газообразным азотом при перемешивании (60-80 об/мин) в течение 1 ч до полного удаления растворителя. Соотношение фосфатидилхолин: холестерин: ПЭГ-2000 (78,0%:16,0%:4,0%). Соотношение оксалиплатин:фосфолипиды (1:10). К липидной пленке, содержащей липиды прибавляли натрий-фосфатный буфер (50 мМ) с pH 7,5. Емкость с эмульсией перемешивали при 130-150 об/мин в течение 1 ч. Затем преобразуют в липосомы, инкапсулируя монослой оксалиплатин - ДПФГ путем быстрого смешивания с предварительно образованными липосомами, состоящими из холестерина, фосфатидилхолина и ПЭГ 200, с последующим диализом против 0,9% натрия хлорида. Полученную эмульсию переносили в гомогенизатор высокого давления и проводили гомогенизацию экструзией через мембраны для уменьшения размера частиц до 80-120 нм. При этом инкапсуляция составила 54,8%. Проводили стерилизующую фильтрацию, розлив продукта во флаконы во флаконы по 20 мл. Необходимо отметить, что несмотря на небольшой размер частиц, фильтрация проходила весьма медленно, что связано с высокой вязкостью эмульсии и вероятно присутствием ПЭГ-2000 на поверхности липосом. Хранение препарата при температуре от 2 до 8C в течение 4 месяцев продемонстрировало низкую стабильность продукта - в препарате появлялся осадок и размер частиц увеличивался до 180 нм,что свидетельствует о нестабильности продукта. Пример 10. При исследовании фармакокинетики липосомального и нелипосомального оксалиплатина при однократном инъекционном введении крысам наблюдается его быстрое выведение из плазмы крови с максимальной концентрацией около 500-1300 нг/мл. Уровни концентраций в плазме липосомального и нелипосомального оксалиплатина существенно не различались. Для нелипосомальной лекарственной формы величина AUC(72) составила 481,9 нгч/мл, для липосомальной - 305,5 нгч/мл. Существенные различия наблюдались при определении оксалиплатина в печени крыс. Cmax для липосомальной формы составляла около 20,8 мкг/г (Tmax - 0,25 ч), для нелипосомальной - около 58,3 мкг/г(Tmax - 8 ч). Липосомальный оксалиплатин практически полностью выводился из печени к 72 ч, в отличие от нелипосомального, который сохраняется в печени к 72 ч после введения на уровне 46,6 мкг/г, причем наблюдается тенденция к его кумуляции. Для липосомальной лекарственной формы величина AUC(72) составила 49,2 мкгч/мл, период полувыведения - 11,1 ч, MRT - 16 ч. Для нелипосомальной лекарственной формы величина AUC(72) составила 2465,8 мкгч/мл. Также различия наблюдались для мозга - липосомальный оксалиплатин практически не проникал через ГЭБ и обнаруживался в небольших (до 500 нг/г) не позднее 1,5 ч после введения. Нелипосомальный оксалиплатин обнаруживался в мозге крыс даже спустя 72 ч после введения в диапазоне концентраций 440 - 1940 нг/г). Схожие фармакокинетические профили наблюдались для почек: для липосомального оксалиплатина Cmax составила около 32 мкг/г, для нелипосомального - 25 мкг/г (Tmax - 0,25 ч в обоих случаях). Для липосомальной лекарственной формы величина AUC(72) составила 175 мкгч/мл, период полувыведения- 18,1 ч, MRT - 31,2 ч. Для нелипосомальной лекарственной формы величина AUC(72) составила 175 мкгч/мл. Аналогичная, как и для почек, картина наблюдалась и для сердца. Для липосомального оксалиплатина Cmax составила около 15 мкг/г, для нелипосомального - 9,2 мкг/г (Tmax - 0,25 ч в обоих случаях). Для липосомальной лекарственной формы величина AUC(72) составила 130,8 мкгч/мл, период полувыведения - 27,4 ч, MRT - 36,9 ч. Для нелипосомальной лекарственной формы величина AUC(72) составила 188 мкгч/мл, период полувыведения - 19,9 ч, MRT - 46,4 ч. Таким образом, в связи с низким проникновением липосомального оксалиплатина в печень и мозг,можно предположить о его потенциально низкой гепатотоксичности и нейротоксичности. Таким образом, результаты физико-химических исследований свидетельствуют о том, что продукт,полученный согласно заявленному способу - гомогенизация в два цикла: первоначально при 500 атм, и последующая при 800 атм до указанного размера; и соотношениях компонентов в итоговом препарате: массовое соотношение компонентов в препарате: отрицательно заряженный фосфолипид - фосфатидилхолин -холестерина в соотношении (0,5 - 0,95:7-8:1) и оксалиплатин - отрицательно заряженный фосфолипид (1:0,5 - 0,95) (см. примеры 1-4), обеспечивают стабильность композиции липосом с включенным в них оксалиплатином. Воспроизведение заявленного способа при изменении параметров (см. примеры 58), а также способ согласно прототипу (пример 9) влечет трудности в реализации собственно способа и снижение качества целевого продукта, а именно: увеличение размера и неоднородность дисперсионного состава липосом (пример 6, 7, 8); уменьшение включения оксалиплатина в липосомы и нестабильность размеров липосом (примеры 5,6,9); существенное увеличение времени фильтрации липосомальной эмульсии (пример 6, 7, 8, 9); трудоемкость и длительность проведения процесса (пример 8 и 9). Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии было проведено изучение стабильности оксалиплатина после лиофилизации в образцах липосом по сравнению с исходной субстанцией. Подтверждена идентичность качественного и количественного состава образцов оксалиплатина после высушивания и последующей регидратации образцов липосом. Содержание примесей и время их удерживания не изменились, что может свидетельствовать о стабильности оксалиплатина в процессе получения липосом и их последующего сублимационного высушивания. Таким образом, использование наночастиц, представляющих собой искусственные мембраны - липосомы, нагруженные гидрофильным цитостатиком оксалиплатином представляют несомненный интерес для дальнейшего изучения. Кроме того,введение в практику препарата имеющего двойное действие - противоопухолевое и мембранопротекторное позволяет улучшить качество лечения за счет снижения токсических проявлений и направленного действия. Список литературы 1. Григорьева А.С., Конахович Н.Ф., Стефанов А.В. Краснопольский Ю.М., Темиров Ю.П. Способ отримання липосомального гепатопротекторного засобу. Патент Украины 465282003. 2. Дудниченко О.С., Темиров Ю.П. Швец В.И., Краснопольский Ю.М. Спосиб одержання липосомального форми протипухлинного антибиотика. Патент Украины 64591 2005. 3. Компендиум - лекарственные препараты //пол ред. Коваленко В.Н.,Викторова А.П., Киев: изд. Морион. 2012, Т. 1. Т. 2. 4. Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Технологические аспекты получения липосомальных препаратов в условиях GMP. Биофармацевтический журнал. 2009. 1.3. С. 18-29. 5. Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Липидная технологическая платформа для создания новых лекарственных форм и транспорта фармацевтических субстанций. Биофармацевтический журнал. 2011.Т. 3.2. С. 10-18. 6. Кулик Г.И., Пономарева О.В., Король В.И., Чехун В.Ф. Токсичность и противоопухолевая активность липосомальной лекарственной формы доксорубицина. Онкология. 2004. 6.3. С. 1-4. 7. Кулик Г.И., Пивнюк В.М., Носко М.М., Тодор И.Н., Чехун В.Ф. Липосомальные препараты: путь к преодолению лекарственной устойчивости к цисплатину. Онкология. 2009. 11.1. С. 76-80. 8. Пивнюк В.М. Використання липосомальних форм химиопрепаратив у хворих на резистентний до доксорубицину рак молочнои залози / В.М. Пивнюк, Ю.О. Тимовська, О.В. Пономарева, Г.I. Кулик, Г.П. Олейшченко, М.Ф. Аникусько, Ю. М. Краснопольський, В.Ф. Чехун- Онкология. 2007. Т.9. 2.-С. 120124. 9. Швец В.И., Каплун А.П., Краснопольский Ю.М. От липосом 70-х к нанобиотехнологии 21 столетия. Российские нанотехнологии. //2008. Т. 3. С. 643-655. 10. Alberts D.S., Muggia F.M., Carmichael E.P. et al. // Оценка эффективности и безопасности липосомальных антрациклинов: данные клинических исследований I-II фаз // Современная онкология. 2006. Т. 8. С. 1-39. 11. Arienti C, Tessei A., Ravaioli A. et al. Activity of Lipoplatin in tumor and normal cell in vitro // Anticancer drug. 2008. V. 19. P. 983-990. 12. Boulikas P., Stathopoulos G.P., Volakakis N., Vougioka M. Systemic Lipoplatin infusion results inand method for preparation thereof. Application Number 12/994031. Publications Date 01/12/2012. A61 K 9/127, A61 K 9/133 A61 K 31/192 A61 K 31/203. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения противоопухолевого препарата в липосомальной форме, включающий получение эмульсии оксалиплатина и липидной пленки на основе фосфолипида и холестерина, их перемешивание, гомогенизацию по меньшей мере в два цикла, фильтрацию, ультрафильтрацию, стерилизацию и лиофилизацию, при этом эмульсию оксалиплатина получали из раствора оксалиплатина и липидной плнки из отрицательно заряженных фосфолипидов, фосфатидилхолина и холестерина в соотношении(0,5-0,95):(6-8):1, соответственно, дополнительно вели дробное добавление криопротектора до гомогенизации и после ультрафильтрации до конечной концентрации не менее 8,0%, а ультрафильтрацию вели через мембраны 10 кДа, при этом соотношение отрицательно заряженных фосфолипидов к оксалиплатину лежит в диапазоне (0,5-0,95):1. 2. Способ по п.1, в котором в качестве отрицательно заряженных фосфолипидов используют фосфатидилглицерины или кардиолипин, или фосфатидную кислоту, или их смеси. 3. Способ по п.1, в котором в качестве криопротектора используют лактозу, трегалозу, сахарозу,мальтозу, маннит или их смеси.