Способ подавления роста опухоли путем блокирования рецептора фактора роста фибробластов и способ диагностики злокачественных новообразований

СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ОПУХОЛИ ПУТЕМ БЛОКИРОВАНИЯ РЕЦЕПТОРА ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ Изобретение относится к медицине и включает способ подавления роста опухоли, основанный на блокировании пути "человеческий фактор роста фибробластов/человеческий рецептор 1 типа фактора роста фибробластов (домены II и IIIc)", а также способ диагностики злокачественных новообразований. Указанный патологический путь приводит к избыточной пролиферацией опухолевых клеток и образованию новых сосудов, что сопровождается ростом первичной опухоли и метастазов. Кроме того, описанный путь является независимым механизмом устойчивости опухоли к препаратам, воздействующим на другие патологические пути. Блокирование пути"фактор роста фибробластов/рецептор 1 типа фактора роста фибробластов" различными субстанциями, нейтрализующими рецептор через связывание только с его доменами II и IIIc,приводит к остановке или замедлению роста опухоли. Кроме того, данный рецептор может использоваться как мишень для целенаправленной доставки диагностических препаратов, т.к. находится в большом количестве на клетках многих опухолей. Преимущество изобретения заключается в разработке новых препаратов для диагностики и лечения заболеваний, связанных с избыточной пролиферацией и неоваскуляризацией. Тимофеев Илья Валерьевич (RU) 016172 Краткое описание изобретения Изобретение относится к медицине и включает способ подавления роста опухоли, основанный на блокировании пути "человеческий фактор роста фибробластов/человеческий рецептор 1 типа фактора роста фибробластов (домены II и IIIc)", а также способ диагностики злокачественных новообразований. Указанный патологический путь приводит к избыточной пролиферацией опухолевых клеток и образованию новых сосудов, что сопровождается ростом первичной опухоли и метастазов. Кроме того, описанный путь является независимым механизмом устойчивости опухоли к препаратам, воздействующим на другие патологические пути. Блокирование пути "фактор роста фибробластов/рецептор 1 типа фактора роста фибробластов" различными субстанциями, нейтрализующими рецептор через связывание только с его доменами II и IIIc, приводит к остановке или замедлению роста опухоли. Кроме того, данный рецептор может использоваться как мишень для целенаправленной доставки диагностических препаратов, т.к. находится в большом количестве на клетках многих опухолей. Преимущество изобретения заключается в разработке новых препаратов для диагностики и лечения заболеваний, связанных с избыточной пролиферацией и неоваскуляризацией. Полное описание изобретения Известно, что в основе развития злокачественных новообразований лежит избыточная пролиферация клеток, а также образование кровеносных сосудов в опухоли, через которые происходит ее питание(ангиогенез). Образование новых кровеносных сосудов происходит из уже существующего эндотелия и является важным компонентом многих заболеваний и нарушений, в том числе таких, как рост и метастазирование опухолей, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабетическая ретинопатия, ретролентальная фиброплазия, неоваскулярная глаукома, гемангиомы, иммунное отторжение трансплантированной роговицы и других тканей, а также хронические воспаления. В случае роста опухолей ангиогенез имеет особенно важное значение при переходе от гиперплазии к неоплазии, а также для обеспечения питания растущей солидной опухоли (J. Folkman et al. Nature; 339,58 (1989). Ангиогенез также позволяет опухолям находиться в контакте с кровеносной системой хозяина,в результате чего могут быть определены направления метастазирования для клеток опухоли. Данные,подтверждающие роль ангиогенеза в метастазировании клеток опухоли, были получены, в частности, в результате исследований, показавших зависимость между количеством и плотностью микрососудов в инвазивном рака молочной железы и фактическим наличием дистантных метастазов (N. Weidner et al.New Eng. J. Med., 324: 1 (1991). По многочисленным имеющимся данным пролиферация клеток опухоли, равно как и эндотелиальных клеток может быть вызывана различными полипептидами, которые естественным образом встречаются в природе. Одним из них является семейство факторов роста фибробластов (ФРФ). Впервые ФРФ был обнаружен в экстрактах гипофиза в 1973 году (H. Armelin. PNAS 70, 9 (1973). ФРФ относятся к семейству гепарин-связывающих полипептидов, модулирующих функции различных клеток. ФРФ оказывает сильное влияние на пролиферацию и дифференцировку опухолевых и эндотелиальных клеток. В настоящее время выделяют 23 члена семейства ФРФ (ФРФ 1-23). Каждый член семейства имеет свои функциональные особенности. Наиболее хорошо изучены ФРФ 1 и 2 типов (кислый и основной). Для того чтобы оказать воздействие на клетки, ФРФ должен связаться с рецептором на ее поверхности. Существуют 4 типа рецепторов ФРФ (ФРФР 1-4). С ФРФР 1 связываются не только ФРФ 1 и 2, но и большинство других членов этого семейства, поэтому роль этого рецептора в проведении сигнала в клетку считается наиболее значимой. ФРФР 1 состоит из надмембранной, внутримембранной и внутриклеточной частей. Надмембранная часть рецептора состоит из 3 доменов (Д I-III), подобных иммуноглобулину. ФРФ, как правило, взаимодействуют с Д II и III; гепаран-сульфат, участвующий в формировании комплекса ФРФ/ФРФР 1, взаимодействует с Д 3. Альтернативный мРНК сплайсинг способствует образованию на поверхности клетки нескольких вариантов ФРФР 1 (D Johnson, L. Williams. J Adv.Cancer Res., 60, 1 (1993); McKeehan et al. J Prog Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 59, 135 (1998). Внутриклеточная часть рецептора представлена тирозинкиназой, при аутофосфорилировании которой происходит дальнейшее проведение сигнала в ядро и деление клетки. Исследования Бюро по изучению рака почки Изучая в рандомизированном исследовании эффекты низкомолекулярного гепарина (НМГ) у пациентов с метастатическим почечноклеточным раком (ПКР), нами было доказано, что гепарин влияет на выживаемость пациентов и частоту ответов на иммунотерапию. Мы предположили, что НМГ может связывать ФРФ, взаимодействовать с его рецептором (ФРФР 1), другими гепаран/гепарин-связываюшими факторами (И.В. Тимофеев и соав. Российский онкологический журнал, 5 (2008); I. Tsimafeyeu et al. J.Clin. Oncology 25, 18S (2007). В другом исследовании мы показали, что у пациентов с метастатическим ПКР в 40% случаев встречаются нарушения в системе гемостаза, что также может быть вызвано повышенным образованием ФРФ и экспрессией ФРФР 1 (I. Tsimafeyeu et al. J. ExperimentalClinical CancerResearch, 28, 30 (2009). В дальнейших собственных исследованиях KCRB-L01 и KCRB-L02 мы изучали значение комплекса ФРФ/ФРФР 1 в развитии ПКР.KCRB-L01: Изучение экспрессии ФРФР у пациентов с ПКР. Иммуногистохимический анализ про-1 016172 водили на срезах с парафиновых блоков опухолей 140 больных ПКР. Результаты сравнивали с экспрессией ФРФР у 40 здоровых доноров, которым ранее была произведена биопсия почки по разным причинам без последующего обнаружения заболеваний органа. Нами выявлена экспрессия ФРФР 1 в 98% случаев на клетках первичной опухоли почки и в 82,5% случаев на клетках метастазов ПКР. Во всех случаях интенсивность окрашивания при иммуногистохимическом анализе была высокой (3+), что свидельствует о сильной экспрессии рецептора. В 68% - получено ядерное окрашивание. Экспрессия ФРФР 1 на клетках здоровой ткани почки выявлена в 1 случае (2,5%) за счет окрашивания сосудов. Таким образом, данное исследование подтвердило предположение о появлении и высокой экспрессии ФРФР 1 как на клетках первичной опухоли, так и в метастазах ПКР (I. Tsimafeyeu et al. ESMO-ECCO 09 (2009): табл. 1. В исследовании KCRB-L02 мы определяли концентрацию ФРФ 1 и 2, как основных факторов, обладающих митогенной активностью при связывании с ФРФР 1, в плазме крови 38 больных метастатическим ПКР до начала таргетной терапии, при прогрессировании болезни на таргетной терапии, а также в плазме крови 38 здоровых добровольцев (методом ELISA). Нами установлено, что в крови здоровых людей уровни обоих ФРФ были достоверно ниже по сравнению с больными метастатическим ПКР (табл. 2). Наибольшие различия были продемонстрированы для ФРФ 2 (p0,001). При прогрессировании заболевания на таргетной терапии (сунитиниб, сорафениб) происходило достоверное повышение ФРФ 2 - более чем на 50% (p0,001) и ФРФ 1 -более чем на 30% (p0,05) по сравнению с исходным уровнем ФРФ. При эффективности таргетной терапии изменение уровня обоих ФРФ достоверно не наблюдалось (p=0,3). Медиана концентрации ФРФ 2 в плазме пациентов при прогрессировании болезни и без -достоверно отличалась(p0,001, фиг. 1). Кроме того, в этом исследовании анализировался уровень мишени для сунитиниба/сорафениба фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС). Статистических различий в концентрации ФРЭС в плазме пациентов с ПКР при прогрессировании болезни на терапии и исходным уровнем (p=0,2), а также корреляции с обоими ФРФ (р 0,1) не выявлено. Таким образом, результаты исследований KCRB-L01 и KCRB-L02 свидетельствуют о том, что патологический путь ФРФ/ФРФР 1 является не только независимым в развитии ПКР, но может определять устойчивость к существующей таргетной терапии опухолей. Другие авторы также показали значение ФРФ/ФРФР 1 при развитии таких опухолей, как немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы,рак желудка и пищевода, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, опухоли головы и шеи, меланома (C. Behrens et al. J Clinical cancer research 14, 19 (2008); M. Koziczak et al. J Oncogene, 23,20 (2004);Ophthalmology and Visual Science 50 (2009). Основываясь на вышеизложенном, мы предположили, что блокирование пути ФРФ/ФРФР 1 может привести к нарушению пролиферации опухолевых клеток и ингибированию ангиогенеза. Антагонисты ФРФР 1, в том числе человеческие моноклональные антитела,могут быть использованы для подавления роста опухоли и ее метастазов. Кроме того, создание конъюгатов моноклонального антитела (его фрагментов) к ФРФР 1 и контрастных веществ, может использоваться в диагностике злокачественных и других образований, клетки которых экспрессируют ФРФР 1 в большом количестве. Целью изобретения являлся способ подавления роста опухоли, заключающийся в блокировании (нейтрализации) доменов II и IIIc ФРФР 1, а также способ диагностики опухолей, клетки которых экспрессируют ФРФР 1. Для проверки гипотезы и достижения целей были проведены исследования KCRB-L03, KCRB-L04 и KCRB-L05. Во всех указанных исследованиях для блокирования ФРФР 1 (под ФРФ/Ч далее понимается рецептор, соответствующий регистрационным номерам в международных, базах Uniprot - P11362 и Entrez 2260, а именно его домены II и IIIc (аминокислотная последовательность которых представлена на фиг. 2) в качестве веществ-антагонистов использовались синтезированные нами высокоспецифичные нейтрализующие моноклональные антитела: 1) против доменов ФРФР 1 II и IIIc (IO-1); 2) против ФРФР 1 и гепаран-сульфата (IO-2). Термин "моноклональное антитело" используется здесь и далее для обозначения антитела, полученного из популяции достаточно однородных антител, т. е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны в своей специфичности и сродству, за исключением возможных, естественно встречающихся мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Необходимо обратить внимание на то, что в результате подобных, естественно встречающихся, мутаций состав моноклональных антител в данном изобретении, которое в большинстве своем содержит антитела, способные специфически связывать ФРФР 1 или же комплекс ФРФР 1/гепаран-сульфат или комплексы ФРФ/ФРФР 1 или препятствовать связыванию ФРФ с ФРФР 1. Таким образом, термин "моноклональное" указывает на характер антитела, происходящего из достаточно однородной популяции антител, но здесь не имеется в виду, что антитела должны производиться каким-либо определенным путем. Например, моноклональные антитела, описанные в данном изобретении, могут быть получены гибридомным методом (G. Khler, C.Milstein. J Nature 256, 495 (1975) или с применением методов, использующих рекомбинантную ДНК (S.Cabilly et al. U.S. Patent N 4816567). При получении моноклональных антител гибридомным методом-2 016172 мышь или другое подходящее животное-хозяин иммунизируется антигеном посредством подкожной,внутриперитонеальной или внутримышечной инъекции с целью выявить лимфоциты, которые производят или же способны производить антитела, специфически связывающиеся с белком(ами), использованным(и) для иммунизации. В качестве альтернативы, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы с использованием соответствующего агента, например такого, как полиэтиленгликоль, чтобы создать гибридомную клетку (J. Goding. Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). В данном изобретении таким антигеном является ФРФР 1 (домены II и IIIc) или же комплекс ФРФР 1/гепаран-сульфат. Антиген может представлять собой фрагмент или часть ФРФР 1, обладающие одним или несколькими аминокислотными остатками, которые участвуют в связывании ФРФ. Приготовленные таким образом гибридомные клетки высеваются и выращиваются в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно должна содержать одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, родительских клеток миеломы. Например, в случае, если в родительских клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза(ГГФРТ или ГФРТ), культуральная среда для гибридом обычно будет содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), каковые вещества препятствуют росту клеток, не обладающих ГГФРТ. Предпочтительно выбирать такие клетки миеломы, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильный высокий уровень экспрессии антител в отобранных клетках, производящих антитела, и являются чувствительными к средам, таким, например, как среда HAT. Среди таких клеток предпочтительными клеточными линиями являются: мышиные линии миеломы, такие как линии, происходящие от мышиных опухолей МОРС-21 и MPC-11, которые можно получить из Центра распределения клеток Института им. Солка в Сан-Диего (Калифорния, США); клетки SP-2, которые можно получить из Американской коллекции типовых культур в Роквилле (Мэриленд, США); и клетки P3X63Ag8U.l, описанные Йелтоном и др. (J Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1 (1978). Кроме того, были описаны клеточные линии человеческой миеломы и человеческо-мышиной гетеромиеломы, способные производить человеческие моноклональные антитела (D. Kozbor et al. J Immunol. 133, 3001 (1984); B. Brodeur, P. Tsang Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker Inc., New York, 1987). Культурная среда, в которой выращиваются клетки гибридомы, подвергается анализу для производства моноклональных антител, направленных против соответствующего антигена. Предпочтительно,чтобы специфичность связывания моноклональных антител, производимых клетками гибридомы, была высокой. Данное изобретение включает те моноклональные антитела (IO-1/IO-2), которые показали высокую специфичность (не менее 5109) связывания с указанными антегенами, определенную по стандартной методике "BIOCORE". Другими словами, антитела связывают по меньшей мере один из этих антигенов при анализе связывания и способны ингибировать биологическую активность ФРФР 1. Высокая специфичность и сильное блокирование пути обеспечиваются благодаря одновременному связыванию с доменами II и IIIc данного рецептора. После определения клеток гибридомы, которые производят антагонистические антитела желаемой специфичности, сродства и активности, клоны могут быть субклонированы методом ограниченных разбавлений и выращены стандартными методами (J. Goding. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,pp. 59-103 (Academic Press, 1986). К подходящим культуральным средам относятся, например, среда Игла, модифицированная Дулбекко (СИМД), или среда RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут выращиваться in vivo в животных как асцитные опухоли. Моноклональные антитела, продуцированные субклонами, отделяются от культуральной среды, асцитной жидкости или плазмы путем использования обычных методов иммуноглобулинной очистки, таких как, например, белок A-Сефароза, гидроксилапатитная хроматография, электрофорез в гелях, диализ или аффинная хроматография. ДНК, кодирующая моноклональные антитела, описанные в данном изобретении, может быть с легкостью выделена и секвенирована обычными методами (например, с использованием олигонуклеотидных проб, способных связываться специфически с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепу мышиных антител). В качестве источника ДНК использовались клетки гибридомы. После выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфецируются в клетки хозяина, такие как обезьяньи клетки линии COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые в иной ситуации не продуцируют иммуноглобулинный белок, для того чтобы достигнуть синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках хозяина. ДНК может быть модифицирована по выбору для того, чтобы изменить характер иммуноглобулина, продуцируемого экспрессией этой ДНК. Так,например, гуманизированные формы мышиных антител могут быть получены путем замещения комплементарной определяющей области (CDR) вариабельного домена мышиного антитела на соответствующую область человеческого антитела. В некоторых вариантах отдельные аминокислоты из базовой области (FR) мышиного антитела также замещаются на соответствующие аминокислотные остатки человеческого антитела (P. Carter et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 89, 4285 (1992); P. Carter et al. J Biotechnology 10, 163(1992). Химерные формы мышиных антител могут быть получены также путем замещения гомологичных мышиных последовательностей ДНК на последовательность, кодирующую отдельные области чело-3 016172 веческих постоянных цепей иммуноглобулина (тяжелой и легкой) (S. Cabilly et al. U.S. Patent N 4816567;S. Morrison et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984). Антитела, использующиеся для проверки задач данного изобретения, включают мышиные антитела (IgG). Однако могут быть получены другие формы антител "гуманизированные", а также полностью человеческие, что лишь отражает процент человеческого белка и не влияет на специфичность связывания с антигеном, т.е. доказательства способа настоящего изобретения. Кроме того, для блокирования ФРФР 1 и его доменов могут быть легко получены все виды, классы антител (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM) и подклассы иммуноглобулинов, а также и фрагменты антител (например, Fab, F(ab')2 и Fv), пока они обладают способностью связывать ФРФР 1 и пока они проявляют антагонизм по отношению к биологической активности пути ФРФ/ФРФР 1, которая проверена в данном изобретении. В случае предпочитаемого варианта данного изобретения моноклональные антитела будут проявлять сродство к иммунизирующему антигену в размере по меньшей мере 109 литров/моль (P. Munson, D.Rodbard. J Anal. Biochem. 107, 220 (1980). Кроме того, моноклональные антитела обычно будут ингибировать митогенную или ангиогенную активность ФРФР 1 по крайней мере на 90%, как определяется, например, анализом выживания или пролиферации клеток in vitro, подобно описанному в наших исследованиях KCRB-L03 (пример 1) и KCRB-L04 (пример 2). Для терапевтических и диагностических применений желательно, чтобы моноклональные антитела реагировали не со всеми компонентами и молекулярными формами ФРФР 1. Например, желательно получить моноклональное антитело, которое способно специфически связываться только с доменами ФРФР 1 II и IIIc, а не с доменом I или другими доменами и изоформами рецептора. Для этого иммунизация производилась экстрацеллюлярной частью ФРФР 1, включающей домены II и IIIc. Необходимые молекулярные формы антитела легко определяются путем сравнения анализов ELISA или путем сравнения иммуноприпитации различных полипептидов ФРФР 1. Это дает возможность иммунизации различными изоформами ФРФР 1. ФРФР 1 может быть заблокирован и другими известными способами, в частности, ингибиторами,созданными путем химического синтеза. Терапевтическое использование способа блокирования пути ФРФ/ФРФР 1 Для использования способа, описанного в настоящем изобретении, в терапевтической практике любые антагонисты ФРФ/ФРФР 1 вводятся млекопитающему, предпочтительно человеку, в фармацевтически приемлемой форме, включая введение внутривенно, а также следующими путями: внутримышечной, интраперитонеальным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным,внуртисиновиальным, внутриоболочечным, оральным, локальным или ингаляционным. Антагонисты также могут вводиться внутриопухолевым, околоопухолевым, внутриочаговым и околоочаговым путями для обеспечения локального действия наряду с системным терапевтическим действием. Подобные формы введения включают фармацевтически приемлемые носители, которые по своей природе не обладают ни токсическим, ни терапевтическим действием. Примерами таких носителей являются ионообменные вещества, квасцы, стеарат алюминия, лецитин, белки плазмы (такие, как белок плазмы человека), буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия,частичные глицеридные смеси насыщенных овощных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидная окись кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества с целлюлозной основой и полиэтиленгликоль. Носители для локальной или основанной на геле форм антагонистов включают полисахариды, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или метилцеллюлозы, поливинилпирролидон,полиакрилаты, полимеры полиоксиэтиленполиоксипропиленового блока, полиэтиленгликоль и спирты. Для введения во всех случаях используются обычные лекарственные формы, получаемые со складов. К таким формам относятся, например, микрокапсулы, нанокапсулы, липосомы, пластыри, ингаляционные препараты, аэрозоли, подъязычные таблетки и препараты с постоянным высвобождением вещества. Антагонист в таких препаратах будет обычно содержаться в концентрации примерно от 0,1 мг/мл до 100 мг/мл. Подходящие примеры препаратов с постоянным высвобождением вещества включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антагонист; подобные матрицы имеют определенную форму, например это могут быть пленки или микрокапсулы. К примерам матриц с постоянным высвобождением относятся полиэфиры, гидрогели [например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат)],описанные Лангером и др. (J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 (1981) и Лангером (Chem. Tech. 12 (1982), или поли(винилалкоголь), полилактиды (Патент США N 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гаммаэтил-L-глутамата, описанные Сидман и др. (Biopolymers 22, 547 (1983), недеградируемый этиленвинилацетат (Лангер и др. см. выше), деградируемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как Lupron Depot (инъецируемые микросферы, состоящие из полимеров молочной и гликолевой кислот и ацетата лейпролида), и поли-D-(-)- 3-гидроксибутировой кислоты. В то время, как такие полимеры, как этиленвинилацетат и сополимер молочной и гликолевой кислот, способны к постоянному высвобождению молекул в течение более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки за более короткие периоды времени. Когда инкапсулированные полипептидные антагонисты остаются в организме на дол-4 016172 гое время, они могут денатурировать или агрегироваться в результате воздействия влаги при температуре 37C, что ведет к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. С целью стабилизации могут быть разработаны разумные стратегии, в зависимости от действующего механизма. Например, если обнаружен механизм агрегации, выражающийся в формировании межмолекулярной S-S-связи посредством тиодисульфидного обмена, стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации с целью удаления кислых растворов, контролирования влажности, использования соответствующих добавок и разработки специфических полимерных матричных составов. Антагонистические составы с постоянным высвобождением анти-ФРФР 1 агента включают также антагонистические антитела, заключенные в липосомах. Липосомы, содержащие антагонисты, могут быть получены известными в данной области методами, например, описанными Эпстейном и др. (Proc.Nat. Acad. Sci. 82, 3688 (1985); Хуанг и др. (Procc. Nat. Acad. Sci. 77, 4030 (1980); Патент США N 4485045 и Патент США N 4544545. Липосомы, как правило, имеют небольшую величину (величиной около 200800 ангстрем) и принадлежат к однослойному типу, в котором содержание липидов выше, чем 30 мол.% холестерина; выбранное соотношение может изменяться для подбора оптимальных условий терапии. Липосомы с продолжительным сроком циркуляции покрываются Патентом США N 5013556. Еще одним путем использования данного изобретения является инкорпорирование антагониста пути ФРФ/ФРФР 1 внутрь изделий, имеющих определенную форму. Такие изделия могут быть использованы для модулирования роста клеток эндотелия и ангиогенеза. Кроме того, такие изделия могут быть использованы для модулирования инвазии опухолей и метастазов. Возможна конъюгация антагониста пути ФРФ/ФРФР 1 и другого лечебного средства. При профилактике или лечении заболевания необходимая доза антагониста будет зависеть от типа заболевания, от его степени серьезности и протекания, от того, вводятся ли антитела с профилактической или терапевтической целью, от предыдущей терапии, от истории болезни пациента и его реакции на антагонист и от указаний лечащего врача. Антагонист может вводиться пациенту различными способами, единовременно или в качестве серии назначений. Антагонисты ФРФ/ФРФР 1 могут быть использованы для лечения различных неопластических и ненеопластических заболеваний и нарушений. Неоплазмы и близкие состояния, которые поддаются такому лечению, включают почечноклеточный рак, рак легких, рак желудка, рак пищевода, колоректальный рак, рак печени, рак яичников, рак шейки матки, рак эндометрия, гиперплазию эндометрия, эндометриоз, фибросаркомы, хориосаркомы, опухоли головы и шеи, гепатобластому, саркому Капоши, меланому, рак кожи, гемангиому, кавернозную гемангиому, гемангиобластому, рак поджелудочной железы,ретинобластомы, астроцитому, глиобластому, шванному, олигодендроглиому, медуллобластому, нейробластому, рабдомиосаркому, остеогенную саркому, лейомиосаркому, рак мочевого пузыря и другие уротелиальные опухоли, опухоль Вильмса, рак предстательной железы, аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами. Возможно применение способа при неонкологических заболеваниях, которые поддаются лечению,включая такие как ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабетические и другие ретинопатии,фиброплазии, неоваскулярную глаукому, тироидные гиперплазии (в том числе болезнь Граве), трансплантацию роговицы и других тканей, хронические воспаления, воспаление легких, нефротический синдром, асцит, преэклампсию, перикардиальный выпот (например, связанный с перикардитом) и плевральный выпот. В зависимости от типа заболевания и от степени его серьезности первоначальная доза для введения пациенту будет составлять от 1 мкг/кг до 15 мг/кг и может вводиться путем одного или многих отдельных введений или путем постоянного вливания. Обычная дневная доза может варьировать примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг и более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного введения в течение нескольких дней и более, в зависимости от условий, лечение повторяется, пока не достигается желаемое подавление симптомов болезни. Однако могут использоваться и другие режимы дозировки. Успех лечения легко определяется обычными методами и анализами, например методами рентгено- визуализации опухолей. В соответствии с другим применением изобретения эффективность антагониста пути ФРФ/ФРФР 1 в предотвращении или лечении болезней может быть улучшена путем введения антагониста серийно или же в комбинации с другим веществом, эффективным для данной цели, таким как фактор некроза опухоли, интерфероны, интерлейкины; антитела и ингибиторы, способный нейтрализовать или ингибировать ангиогенную активность фактора роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов и его рецепторов и/или фактора роста гепатоцитов и/или эпидермального фактора роста и его рецепторов и/или фактора роста плаценты и/или mTOR и/или других внутриклеточныз киназ или одно или более обычных терапевтических веществ, таких как, например, алкилирующие соединения, антагонисты фолиевой кислоты,антиметаболиты метаболизма нуклеиновых кислот, антибиотики, аналоги пиримидинов, 5 флюороурацил, пуриновые нуклеозиды, амины, аминокислоты, триазольные нуклеозиды или кортикостероиды. Подобные вещества могут присутствовать во вводимом составе или могут вводиться отдельно. Кроме того, антагонист пути ФРФ/ФРФР 1 может вводиться серийно или же в комбинации с радиологическим лечением, которое может включать как иррадиацию, так и введение радиоактивных веществ.-5 016172 В соответствии с одним из применений изобретения при комбинированной терапии подвергается атаке васкуляризация опухоли. Один или более антагонист ФРФ/ФРФР 1 вводятся пациенту с опухолью в терапевтически эффективных дозах, определенных, например, при наблюдении некроза опухоли или ее метастазных фокусов, если они имеются. Такая терапия продолжается до тех пор, пока перестает наблюдаться дальнейшее улучшение или клиническое обследование показывает, что опухоль или ее метастазы исчезли. При прогрессировании болезни вводится одно или несколько описанных выше веществ(о) или гипертермия и лучевая терапия. Поскольку эффективность дополнительных веществ будет варьировать,желательно сравнить их влияние на опухоль путем стандартного матричного скрининга. Производится повторное введение антагониста ФРФ/ФРФР 1 и дополнительного агента, пока не будет достигнут желаемый клинический эффект. В альтернативном случае антагонист(ы) ФРФ/ФРФР 1 вводятся совместно и, при желании, вместе с дополнительными веществами. Использование в диагностике В диагностике могут быть использованы антитела к ФРФР 1 и также к его доменам II и IIIc. Антитела обычно должны быть помечены остатком, который легко обнаружить. Это может быть любой остаток,который, прямо или косвенно, может продуцировать обнаруживаемый сигнал. Например, это могут быть радиоизотопы, такие как 3H, 14C, 32P, 35S, 125I; флюоресцентное или хемилюминесцентное соединение,такое как изотиоцианат флюоресцеина, родамин или люциферин; метки, помеченные радиоизотопами,такими как, например, 125I, 32P, 14C или 3H, или ферменты, такие как щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза или пероксидаза хрена. Здесь может применяться любой известный в данной области метод для конъюгирования отдельных антител к обнаруживаемым остаткам, включая описанные методы Хантером и др. (J Nature 144, 945(1962); Дэвидом и др. (J Biochemistry 13, 1014 (1974); Пейном и др. (J Immunol. Meth. 40, 219 (1981) и Нигреном (J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Антитела данного изобретения или ФРФР 1 могут быть использованы в диагностике опухолей человека и млекопитающих. При этом антитело или ФРФР 1,помеченные обнаруживаемым остатком, вводится пациенту, предпочтительно в кровеносную систему, и анализируется присутствие и местонахождение меченого антитела или рецептора в организме пациента. Такая визуализация может использоваться, например, при определении стадии заболевания и при лечении неоплазм. Антитело или ФРФР 1 метятся любым остатком, обнаружимым в организме млекопитающих, известными в этой области методами, например ядерным магнитным резонансом, радиологическим методом и т.д. Ниже в качестве примеров представлены некоторые доказательства способа подавления роста опухоли, заключающегося в блокировании (нейтрализации) ФРФР 1, а также способа диагностики опухолей, клетки которых экспрессируют ФРФР 1. Нижеследующие примеры предлагаются только в качестве иллюстрации и не должны восприниматься как в чем-либо ограничивающие настоящее изобретение. Пример 1 (Результаты исследования KCRB-L03): анализ выживания или пролиферации клеток in vitro, нарушение функции ФРФР 1 при добавлении моноклинального антитела, блокирующего ФРФP1 домены II и IIIc. Для выбора модели клеточной линии были изучены различные линии клеток на предмет гиперэкспрессии ФРФР 1: 1) человеческого почечноклеточного рака Caki-1; 2) человеческого рака молочной железы MCF7; 3) человеческого рака предстательной железы Du145; 4) человеческого немелкоклеточного рака легкого A549. Гиперэкспрессия ФРФР 1 на клетках определялась в стандартном анализе Вестерн-блоттинг. Общий уровень экспрессии ФРФР 1 на клетках составил 40%. Самый высокий уровень экспрессия ФРФР 1 был выявлен на клетках линии человеческого почечноклеточного рака Caki-1, самый низкий - на клетках человеческого рака предстательной железы Du145 (различия в 10 раз): фиг. 3. Основываясь на полученных данных, линия человеческого почечноклеточного рака Caki-1 была отобрана для дальнейших исследований. Клетки были высеяны с плотностью 104 клеток/мл в 6-луночных пластинках. В каждую лунку были добавлены нейтрализующие моноклональные антитела IO-1 и IO-2 в равном объеме и различных концентрациях. Также в качестве контроля к части культуры было добавлено постороннее моноклонального антитела без нейтрализующей способности (приобретенное в Abcam). После инкубации в каждую лунку был добавлен ФРФ 2 по 10 нг/мл. В качестве дополнительного контроля часть клеток выращивалась в отсутствие как атител, так и ФРФ 2. После роста культуры в течение 3 недель клетки в каждой лунке были подсчитаны с помощью компьютерной программы на анализаторе Hewlett Packard Scanjet (США). Как показано на фиг. 4 и 5, оба моноклональных антитела (IO-1 и IO-2) полностью ингибировали способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание клеток линии почечноклеточного рака (более чем на 90%). Достоверных различий в активности IO-1 и IO-2 выявлено не было. Моноклональное антитело к ФРФР 1 без нейтрализующей способности (Abcam) не вызвало изменений в выживаемости клеток. В опыте было выявлено, что подавление митогенной активности зависит от дозы агента, блокирующего путь ФРФ/ФРФР 1 (чем выше доза, тем выше митогенная активность). Общий вывод по данному примеру: при одновременном блокировании доменов II и IIIc ФРФР 1 достигается сильное-6 016172 ингибирование роста опухолевых клеток. Также в данном примере мы показываем, что блокирование рецептора фактора роста фибробластов приводит к нарушению аутофосфорилирования рецептора, что отражает его функциональное значение. Для этого к описанным клеткам было добавлено антитело IO-1 и через 1,5 ч - ФРФ 2, 10 нг/мл. Культивирование происходило в течение 5 мин при температуре 37C. Затем клетки были промыты и лизированы в специальном буффере для лизиса (50 ммоль HEPES (pH 7,4), 150 ммоль NaCl, 10% глицерол, 1% Тритон X-100, 1,5 ммоль MgCl2, ингибиторы протеазы и 2 ммоль натрия ванадат). Инкубация лизата проводилась на льду в течении 30 мин, а затем он был центрифугирован (13000 оборотов/мин, в течение 10 мин при температуре 4C). Концентрация белка в лизате была измерена в анализе Кумасси Плюс (Pierce). После этого проводились иммунопреципитация/Вестерн-блоттинг. Эти методы выполнялись по стандартному протоколу (Santa Cruz Biotechnology, США) с использованием 1 мг моноклонального антитела для связывания ФРФР 1 (контрольное антитело; Santa Cruz Biotechnology), и антифосфотирозин (4G10) антител. Полученные пробы использовали для электрофореза с последующим выявлением копреципитированных белков в Вестерн-блоттинге. Часть клеток без добавления ФРФ 2 и антител использовалась для контроля. Результаты представлены на фиг. 6. Показано, что моноклональное антитело IO-1 вызывает нарушение процессов фосфорилирования ФРФР 1, тогда как контрольное антитело анти-ФРФР 1 (Santa CruzBiotechnology, США) не препятствовало нарушению фосфорилирования рецептора. Концентрации блокирующего агента (в данном случае IO-1) влияют на фосфорилирование ФРФР 1: чем выше концентрация, тем больше эффект. Таким образом, пример 1 (исследование KCRB-L03) показывает, что клетки человеческого почечноклеточного рака в присутствии ФРФ 2 пролифирируют, а при блокировании рецептора-мишени ФРФР 1 (только доменов II и IIIc) и нарушении его функции, перестают размножаться и теряют митогенную активность. Более того, в примере 1 продемонстрировано, что клетки в отсутствии ФРФ 2 также не пролиферируют и это свидетельствует о его митогенном значении (если ФРФ 2 связать,клетки также не будут пролиферировать). Пример 2 (Результаты исследования KCRB-L04): анализ выживания или пролиферации эндотелиальных клеток in vitro, нарушение функции ФРФР 1 на эндотелиоцитах при добавлении моноклонального антитела, блокирующего ФРФР 1. Для анализа выживания эндотелиальных клеток в среде ФРФ и при блокировании ФРФР 1 был проведен подобный эксперимент, что и при блокировании фактора роста эндотелиальных клеток сосудов,описанный в патенте США N 20090022716 (Rockwell; Patricia et al. US Patent 20090022716). В качестве модели эндотелиоцитов использовались бычьи клетки капиллярного эндотелия коры надпочечников (КЭКН) (N. Ferrara et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 5773 (1987). В начале мы выявили высокую экспрессию ФРФР 1 на КЭКН в стандартном анализе. Вестерн-блоттинг (фиг. 7). Затем КЭКН были высеяны с плотностью 5104 клеток/мл в 12-луночных пластинках. В каждую лунку было добавлено 10 нг/мл ФРФ 2 в присутствии или в отсутствие различных концентраций моноклональных антител к ФРФР 1, а также постороннего моноклонального антитела без нейтрализующей активности к ФРФР 1 (Abcam). После роста культуры в течение 5 дней клетки в каждой лунке были подсчитаны с помощью компьютерной программы на анализаторе Hewlett Packard ScanJet (США). В качестве дополнительного контроля КЭКН выращивались в отсутствие ФРФ 2. Как показано на фиг. 8, оба моноклональных антитела к ФРФР 1 ингибировали способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание бычьих КЭКН. Моноклональное антитело без нейтрализующей активности (Abcam) не оказывало никакого действия на клетки. Таким образом, пример 2 демонстрирует, что при блокировании пути ФРФ/ФРФР 1 эндотелиальные клетки перестают размножаться и теряют митогенную активность, что может приводить к нарушению ангиогенеза в опухоли. Пример 3 (Результаты исследования KCRB-L05): Ингибирование роста опухоли in vivo при блокировании пути ФРФ/ФРФР 1. Самкам мышей (Beige/nude) возрастом 5-6 недель (приобретенным в Harlan Sprague Dawley, Inc.(Индианаполис, США) были подкожно введены 2106 опухолевых клеток линии человеческого почечноклеточного рака Caki-1 в 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (ФРФБ). После того, как установился рост опухоли, мыши были разделены на 3 группы. Первой (лечебной) группе мышей вводили интраперитонеально 2 раза в неделю моноклональное антитело IO-1 к ФРФР 1 в дозе 100 мкг/кг. Второй (лечебной) группе мышей вводили интраперитонеально 2 раза в неделю моноклональное антитело IO-2 к ФРФР 1/гепаран-сульфату в дозе 100 мкг/кг. Третьей(контрольной) группе мышей вводился физиологический раствор. Каждая группа включала 15 мышей. Величина опухоли измерялась каждые 5 дней, и по завершении исследования опухоли были вырезаны и взвешены. Влияние моноклональных антител/физиологического раствора на рост (объем) опухолей показан на фиг. 9. На рисунке видно, что у тех мышей, которым были введены моноклональные антитела, блокирующие ФРФР 1, объем опухоли был значительно меньше, чем у мышей из контрольной группы.-7 016172 Вес (медиана) опухоли мышей контрольной группы был достоверно выше по сравнению с мышами лечебных групп (p0,001). Количество метастазов в легкие также было достоверно выше у мышей контрольной группы (p0,01). У тех мышей, которые получали нейтрализующие моноклональные антитела,начиная с первой недели после инокуляции клетками Caki-1, скорость роста опухолей была значительно более медленной, чем у мышей, которым вводили физиологический раствор. На основании этих данных был сделал вывод об эффективности способа подавления роста опухолиin vivo путем блокирования пути ФРФ/ФРФР 1 (через блокирование доменов II и IIIc ФРФР 1). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ подавления роста опухоли, отличающийся тем, что нейтрализуют домены II и IIIc рецептора типа 1 фактора роста фибробластов специфическим к данным доменам антителом. 2. Способ диагностики злокачественных новообразований, основанный на обнаружении в биологическом образце повышенной экспрессии рецептора типа 1 фактора роста фибробластов с помощью специфического антитела к доменам II и IIIc рецептора типа 1 фактора роста фибробластов, при этом антитело прямо или косвенно продуцирует обнаруживаемый сигнал. Таблицы и Фигуры Таблица 1. Экспрессия ФРФР 1 на клетках рака почки людей (первичная опухоль, метастазы). Сравнение с экспрессией ФРФР 1 на клетках паренхимы почки здоровых людей и экспрессией ФРФР 2 на клетках рака почки людей (первичная опухоль, метастазы) Таблица 2. Концентрация ФРФ 1 и 2 у пациентов с метатстатическим ПКР до начала лекарственного лечения и у здоровых добровольцев Различия в концентрации ФРФ 2 у пациентов с метастатическим ПКР с прогрессированием болезни и с клиническим эффектом при лечении таргетными препаратами Фиг. 1 Аминокислотная последовательность ФРФР 1 (домены II и IIIc)-8 016172 Отличия в экспрессии ФРФР 1 между человеческими клеточными линиями почечноклеточного рака (Caki-1) и рака предстательной железы (Du145). Анализ Вестерн-Блоттинг (по 3 уровня для каждой линии) Гиперэкспрессия ФРФР 1 на клетках определялась в стандартном анализе Вестерн-блоттинг. Самый высокий уровень экспрессия ФРФР 1 был выявлен на клетках линии человеческого почечноклеточного рака Caki-1 (более 95%), самый низкий - на клетках человеческого рака предстательной железы Du145 (различия в 10 раз). Фиг. 3 Ингибирование роста колоний клеток под действием моноклонального антитела против доменов II и IIIc ФРФР 1 Моноклональное антитело против доменов II и IIIc ФРФР 1 (IO-1) полностью ингибирует способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание клеток линии почечноклеточного рака (более чем на 90%). Моноклональное антитело к ФРФР 1 без нейтрализующей способности (Abcam) не вызвало изменений в выживаемости клеток. В опыте было выявлено, что подавление митогенной активности зависит от дозы агента, блокирующего путь ФРФ/ФРФР 1 (чем выше доза, тем выше митогенная активность). Фиг. 4 Ингибирование роста колоний клеток под действием моноклонального антитела против комплекса ФРФР 1 и гепаран-сульфата Моноклональное антитело против комплекса ФРФР 1 и гепаран-сульфата (IO-2) полностью ингибирует способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание клеток линии почечноклеточного рака (более чем на 90%). Моноклональное антитело к ФРФР 1 без нейтрализующей способности (Abcam) не вызвало изменений в выживаемости клеток. В опыте было выявлено, что подавление митогенной активности зависит от дозы агента, блокирующего путь ФРФ/ФРФР 1 (чем выше доза, тем меньше митогенная активность).-9 016172 Блокирование аутофосфорилирования ФРФР 1 Показано, что моноклональное антитело IO-1 вызывает нарушение процессов фосфорилирования ФРФР 1, тогда как контрольное антитело анти-ФРФР 1 (Santa Cruz Biotechnology, США) не препятствовало нарушению фосфорилирования рецептора. Концентрации блокирующего агента (в данном случае IO-1) влияют на фосфорилирование ФРФР 1: чем выше концентрация, тем больше эффект. Фиг. 6 Гиперэкспрессия ФРФР 1 на бычьих эндотелиальных клетках (метод Вестерн-блоттинга) Фиг. 7 Ингибирование роста колоний клеток под действием блокирующих моноклональных антител (IO-1 и IO-2). Оба моноклональных антитела к ФРФР 1 ингибировали способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание бычьих КЭКН. Моноклональное антитело без нейтрализующей активности (4) не оказывало никакого действия на клетки. Фиг. 8 Динамика роста опухоли у мышей из лечебных и контрольной групп У тех мышей, которым были введены моноклональные антитела, блокирующие ФРФР 1, объем опухоли был значительно меньше, чем у мышей из контрольной группы.