Смесь ферментов, выделенных из бактерий clostridium histolyticum

1 Настоящее изобретение относится к ферментам, используемым для воспроизводимого,стандартизированного выделения клеток или фрагментов ткани из животных или человеческих тканей, более конкретно к смеси ферментов, выделенных из бактерий Clostridium histolyticum. Способы выделения клеток из тканей должны быть воспроизводимыми и гарантировать по возможности незначительное повреждение извлечнных клеток. До настоящего времени обычно применялись содержащие коллагеназу препараты из Clostridium histolyticum,неопределенного состава, с помощью которых не могут быть наджно получены клетки. Другие ферментные препараты или неферментные методы не используются или дают плохие результаты (1), (9). Обычно используемые и рекомендованные для применения препараты, содержащие коллагеназу (2), получают из фильтратов культур штамма бактерий Clostridium histolyticum и содержат наряду с различными коллагеназами и протеазами (3 а), (3 б) образованные в результате протеолиза продукты расщепления этих ферментов, а также другие, отчасти нежелательно действующие и неизвестные составные части. На основании существующего уровня знаний невозможно с помощью одного единственного фермента получить жизнеспособные клетки с хорошим выходом. Скорее всего должны совместно действовать различные ферменты указанных выше бактерий, чтобы обеспечить эффективное разрушение ткани. Во всяком случае до настоящего времени ещ не было известно, какое для этого нужно количественное соотношение ферментов. Смеси ферментов из Clostridium histolylicum являются пока недоступными для пользователя. В связи с вышеизложенной проблемой различные рабочие группы пытались использовать очищенные ферменты для выделения клеток из тканей. Однако для этого никогда не применяли точно определнные ферменты, и,соответственно, смеси точно определнных ферментов. Суггс и др. (4) выделили человеческие клетки венозного эндотелия с помощью смеси, состоящей из очищенной фракции коллагеназы и очищенного трипсина из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Однако использованная обогащнная коллагеназой фракция не была определена по составу в отношении различных ферментов и содержала, например, ещ незначительное количество клострипаина. Результат выделения незначительно отличался от полученного при использовании неопределнных по составу препаратов, содержащих коллагеназу. С помощью отдельных компонентов смеси не достигалась удовлетворительная дезинтеграция ткани. Использование трипсина для выделения клеток также является проблематичным, так как он воздействует на 2 протеолитические ферменты мембранных протеинов. Так, например, оказывается негативное влияние на связывание инсулина с мембранами печени и адипоцитами (5). Хефлей (6), (7) использовал для выделения костных клеток из крыши черепа мышей смеси очищенных фракций коллагеназы (6). Ранее (7) автор описывал, что для успешного выделения этих клеток может быть использована смесь очищенной фракции коллагеназы с нейтральной протеазой. Однако в обеих работах использовались элюаты после колоночного фракционирования, состав которых в отношении различных неодинаковых по их специфичности к субстрату коллагеназ и прочих компонентов не был известен. Вольтере и др. (8) использовали для выделения клеток островков Рейля из поджелудочной железы крыс смеси из нейтральной протеазы и "коллагеназы типа VII" фирмы Сигма, о которых, однако, неизвестно,какие типы коллагеназ и в каком количестве они содержат. Кроме того, смеси имели незначительное содержание клострипаина и неспецифической протеазы. Нейтральная протеаза использовалась в высокоочищенной форме. Смеси обоих названных компонентов обеспечивали хорошие выходы жизнеспособных клеток островка Рейля. Объектом изобретения является смесь ферментов, выделенных из бактерий Clostridiumhistolyticum, содержащая следующие компоненты: коллагеназу HP с минимальной удельной активностью 20 Ед./мг, определенной по методу Грассмана и Нордвига при использовании в качестве субстрата синтетического гексапептидаZ-GLY-PRO-GLY-GLY-PRO-ALA, которая способна лишь в незначительной степени взаимодействовать с денатурированными коллагенами,такими как желатина и азоколл, и в значительной степени взаимодействовать с коллагенами сухожилий крупного рогатого скота, имеет молекулярную массу около 106 000 Да, определенную электрофорезом в геле агарозы в присутствии додецилсульфата натрия, и изоэлектрическую точку 5,8 - 6,0; коллагеназу AZ с минимальной удельной активностью 10 Ед./мг, определенной по методу Мандля при использовании в качестве субстрата азаколла, которая способна эффективно взаимодействовать с денатурированными коллагенами,такими, как желатина и азоколл, а также с коллагеном сухожилий крупного рогатого скота, но не взаимодействует с небольшими синтетическими белками, такими, как 2-фуран-акрилоилLEU-GLY-РРО-АLA, 4-фенил-азабензолоксикарбонил-PRO-LEU-GLY-PRO-ARG и Z-GLYPRO-GLY-GLY-PRO-ALA, имеет молекулярную массу около 111 000 Да, определенную электрофорезом в геле агарозы в присутствии додецилсульфата натрия, и изоэлектрическую 3 точку 5,9 - 6,1 и эластазу с минимальной удельной активностью 2 Ед./мг, определенной при использовании в качестве субстрата эластина из швейной связки крупного рогатого скота, которая имеет молекулярную массу около 35 000 Да,определенную электрофорезом в геле агарозы в присутствии додецилсульфата натрия, причем указанные ферменты взяты в следующем соотношении (Ед./смесь): Коллагеназа HP 60300 Коллагеназ AZ 1 - 20 Эластаза 5 - 70 Указанное соотношение определяет количество, которое содержится в одной единице смеси, например в одной ампуле. Смесь ферментов согласно изобретению можно применять для выделения клеток или фрагментов ткани из человеческих или животных тканей, а также для медицинских целей,например, для лечения ран. При применении для дезинтеграции тканей смеси ферментов выпускают в лиофилизованной форме в ампулах в таком количестве, чтобы его было достаточно для дезинтеграции одной печени крысы (около 9-11 г влажного веса органа). Существенное преимущество смеси ферментов согласно изобретению заключается в том, что теперь не являются необходимыми связанные с денежными и временными затратами испытания сырья, так как при получении клеток используются очищенные ферменты с известными свойствами. Благодаря этому отпадает или сводится к минимуму работа по функциональной характеристике клеток. По этой причине намного может быть уменьшено число испытаний на животных. Использование не так хорошо очищенного фермента или фермента с незначительной удельной активностью приводит, как правило, к худшему выходу клеток, а также к проблемам недостаточной воспроизводимости успешноговыделения, стандартизации сырья и наличию неизвестных, возможно негативно действующих компонентов. Многие описанные в литературе результаты испытаний очень сложно интерпретировать из-за происходящего при получении, очистке и характеристике разложения фермента сопутствующими протеазами. Определение вклада отдельных ферментов в успех испытания при выделении клеток осложняется также тем, что образованные из коллагеназ, эластазы и протеаз фрагменты сохраняют частично их ферментную активность. Однако ещ неясно, насколько при этом изменяются специфичности субстратов. Во многих коммерческих препаратах, содержащих коллагеназу, содержатся иногда только продукты разложения первоначальных коллагеназ. Итак, по состоянию существующего уровня техники, невозможна однозначная стандартизация содержащих коллагеназу препаратов, как 4 для изготовителя препаратов, так и для исследователей выделяющих клетки. При использовании смесей из очищенных ферментов, полученных согласно изобретению вследствие их широкой тканеразрушающей активности, пригодны все человеческие и животные ткани и клетки, предпочтительно фрагменты тканей или клеток: желчных путей, кровеносной системы, желез, сосудистой системы,мозга, кожи, сердца, кишечника, островков Лангерганса, печени, лгких, желудка, селезнки,мускулов, пуповины, нервов, поджелудочной железы, спинного мозга, щитовидной железы,подвздошной кишки, опухолевых тканей, матки,пищеварительного тракта и языка. С помощью предлагаемой смеси выделенные клетки или фрагменты тканей особенно пригодны для использования при клеточной и тканевой трансплантации, а также в генотерапии (например, островки Лангерганса, клетки островков Рейля, гепатоциты, опухолевые клетки, адипоциты), в иммунотерапии или при лечении ран. Особое значение имеет использование смеси ферментов по изобретению при выделении гепатоцитов, клеток островков Лангерганса,клеток эндотелия, клеток эпителия, адипоцитов,ооцитов и опухолевых клеток. В этих областях применения стандартизация и улучшение методик имеют особое значение. Смесь ферментов по изобретению можно с успехом применять и для выделения гепатоцитов из печени крыс (примеры 1,3,4) и печени человека (пример 5), для выделения клеток эпителия желчных путей из печени крыс (пример 6), клеток эндотелия из человеческих пуповин(пример 7), а также для выделения опухолевых клеток из опухолей человека (пример 8) и клеток островка Рейля из поджелудочной железы свиньи (пример 9). По сравнению с наиболее эффективными содержащими коллагеназу ферментными препаратами неопределнного состава достигается лучший или минимум такой же результат выделения. Смеси согласно изобретению могут применяться в качестве замены для всех обычно используемых содержащих коллагеназу препаратов, так как они содержат необходимые для дезинтеграции тканей компоненты. Недостатки применяющихся до настоящего времени препаратов устраняются благодаря определнному составу смесей. Важной областью применения предлагаемой смеси является воспроизводимое, стандартизованное выделение гепатоцитов из печени по известному методу Берри и Фринда (9), (10), по которому до сих пор работали с содержащими коллагеназу ферментными препаратами неопределнного состава, а также более эффективное выделение клеток островка Рейля в неповрежднном виде из тканей поджелудочной железы. 5 Другой важной областью применения является лечение ран. Для этого используют ферменты максимально возможной чистоты. Получение и характеристика ферментов изClostridium histolyticum 1. Коллагеназа HP. а. Получение. Фракционированное осаждение белка сульфатом аммония Все операции при очистке фермента проводились при 4-8 С. 200 г сырой коллагеназы растворяли в 3 л воды и затем в полученный раствор вносили 680 г порошкообразного сульфата аммония. Выпавший осадок белка А 1 отделяли центрифугированием; к надосадочной жидкости прибавляли дополнительно 420 г сульфата аммония. Осажднную при этом фракцию белка А 2 отделяли центрифугированием,осадок растворяли в 1 л воды и подвергали диализу против воды. После этого концентрировали с помощью мембраны для ультрафильтрации(границы пропускания 10.000 Да) до конечного объема около 100 мл. Затем концентрат лиофилизировали. Полученная таким образом порошкообразная белковая фракция А 2 содержала коллагеназу HP и коллагеназу AZ в качестве основных компонентов. Хроматографическое разделение коллагеназ HP и AZ с помощью аффинной хроматографии с комплексами металлов Хроматографическое разделение коллагеназ HP и AZ осуществляли на хелатирующей сефарозе 6 В с ионами цинка. Для этого помещали материал слоем 70 см на колонку (5 х 100 см) и уравновешивали стартовым буфером (500 мМ ацетат натрия + 20 мМ ацетат кальция, рН 8,0). Затем около 1,2 г белковой фракции А 2, растворнной в 15 мл стартового буфера, рН которого был доведен до 8,4 с помощью Триса [трис(гидроксиметил)-аминометана], наносили на колонку и элюировали стартовым буфером различные составные части белковой фракции А 2 из колонки. При последующей элюции буфером А (500 мМ ацетат натрия + 20 мМ ацетат кальция с рН 6,3, доведенным уксусной кислотой) собирали сначала коллагеназу AZ и затем коллагеназу HP в раздельных фракциях. Обе раздельные ферментные фракции коллагеназы HP и коллагеназы AZ концентрировали с помощью мембраны для ультрафильтрации(границы пропускания 10.000 Да) до конечного объема 50-100 мл. Затем подвергали диализу против воды и опять концентрировали с помощью мембраны для ультрафильтрации (границы пропускания 10.000 Да) до конечного объема около 10 мл. Тонкая очистка коллагеназы HP Тонкая очистка коллагеназы HP происходила на анионообменнике (HR 10/10, фирмы Фармация) с помощью прибора для жидкостной экспресс-хроматографии белков фирмы Фарма 000583 6 ция. Для этого на колонку, уравновешенную буфером Б (20 мМ Трис/соляная кислота, рН 7,5), наносили смесь из 1 мл буфера Б и 2 мл содержащей коллагеназу HP фракции, полученной ранее путем хроматографии. После промывки буфером Б коллагеназу HP элюировали буфером В (20 мМ Трис/соляная кислота + 200 мМ хлористый натрий, рН 7,5) в очищенном виде. б. Свойства. Коллагеназа HP получила обозначение"HP" вследствие е свойства особенно эффективно расщеплять пептид Z-Gly-Pro-Gly-GlyPro-Ala. Коллагеназа HP отличается тем, что она может взаимодействовать с денатурированными коллагенами, такими как желатина или азоколл,лишь в незначительной степени. Однако она воздействует на сухожилие крупного рогатого скота и расщепляет в высокой степени приведенные ниже в разделе 2.б синтетические пептиды между двумя глицинами или между глицином и любой аминокислотой. Особенно следует подчеркнуть, что коллагеназа HP вместе с коллагеназой AZ (и наоборот, т.е. любые смеси коллагеназы HP и AZ) оказывают сверхсуммарный эффект на расщепление нативного коллагена. Этот синергетический эффект наблюдается также при использовании дезинтеграции ткани (см. пример 6). Удельная активность коллагеназы HP составляет максимально 146 Ед./мг в опыте с синтетическим субстратом Z-Gly-Pro-Gly-Gly-ProAla (11). Это соответствует 100-кратному повышению е удельной активности по сравнению с исходным материалом. Очищенная коллагеназа HP образует как при гельэлектрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия, так и при изоэлектрическом фокусировании и электрофорезе в геле агарозы лишь единственную полосу. Е молекулярный вес, измеренный с помощью гельэлектрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, составляет около 106.000 Да. Изоэлектрическая точка лежит в области рН 5,8-6,0. 2. Коллагеназа AZ. а. Получение. Все операции по очистке фермента проводили при 4-8 С. Обе первые операции по очистке коллагеназы AZ (фракционированное осаждение белка и аффинная хроматография с комплексами металлов) описаны в разд.1. Тонкая очистка коллагеназы AZ Тонкая очистка коллагеназы AZ происходила на анионообменнике (HR 10/10, фирмы Фармация) с помощью прибора для жидкостной экспресс-хроматографии белков фирмы Фармация. Для этого на колонку, уравновешенную буфером Г (20 мМ ацетат кальция, рН 7,2), наносили смесь из 1 мл буфера Г и 1 мл содержащей коллагеназу AZ фракции, полученной ранее 7 путем хроматографии. После промывки буфером Г коллагеназу AZ элюировали с колонки буфером Д (20 мМ ацетат кальция, рН 5,0). б. Свойства. Коллагеназа AZ получила обозначение"AZ" вследствие е свойства особенно эффективно расщеплять азоколл. Она отличается тем,что может в значительной степени взаимодействовать с денатурированными коллагенами, как желатина или азоколл, но также и с коллагеном сухожилий крупного рогатого скота. Однако она не взаимодействует с небольшими синтетическими пептидами, такими как 2-фуранакрилоил-Lеu-Glу-Рго-Аla, 4-фенил-азабензилокси-карбонил-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg и Z-Gly-ProGly-Gly-Pro-Ala. Удельная активность коллагеназы AZ составляет максимально 82 Ед./мг в опыте по Мандлю (11) с использованием в качестве субстрата азоколла. Это соответствует 80-кратному повышению е удельной активности по сравнению с исходным материалом. Очищенная коллагеназа AZ образует как при гельэлектрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия, так и при изоэлектрическом фокусировании и электрофорезе в геле агарозы лишь единственную полосу. Е молекулярный вес, измеренный с помощью гельэлектрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, составляет около 111.000 Да. Изоэлектрическая точка лежит в области рН 5,9-6,1. 3. Эластаза а. Получение. Все операции по очистке фермента проводили при 4-8 С. Первую операцию по очистке эластазы проводили путм осаждения белка сульфатом аммония, как описано в разд. 1 а. Осадок белка А 1 растворяли в 1 л, подвергали концентрации с помощью мембраны ультрафильтрации (границы пропускания 10.000 Да) до конечного объема около 170 мл и подвергали диализу против 0,1 мМ раствора ацетата кальция. Затем ферментный раствор снова концентрировали с помощью мембраны ультрафильтрации (границы пропускания 10.000 Да) до конечного объема около 50 мл и затем лиофилизировали. Тонкая очистка проходила путм гелевой хроматографии на Сефадексе G100 или G200(фирмы Фармация). б. Свойства. Эластаза отличается тем, что она с высокой степенью эффективности может расщеплять эластин. Е удельная активность (см. разд. 3 в.) составляет 18 Ед./мг. Это соответствует 80 кратному повышению удельной активности по сравнению с исходным материалом. Очищенная эластаза образует как при гельэлектрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия, так и при изоэлектрическом фоку 000583 8 сировании и электрофорезе в геле агарозы лишь единственную полосу. Е молекулярный вес, измеренный с помощью гельэлектрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, составляет около 35.000 Да. в. Определение активности. Определение ферментной активности осуществляли с помощью субстрата эластина. 20 мг тонкораспыленного эластина из шейной связки крупного рогатого скота (Сигма) подвергали предварительному инкубированию в 0,4 мл буфера (50 мМ Трис/соляная кислота +10 мМ ацетат кальция, рН 7,2) в течение 5 мин на водяной бане при 37 С при встряхивании. Затем реакцию начинали добавлением эластазы, растворнной в 0,1 мл буфера, и продолжали встряхивать смесь 10 мин при 37 С (высота подъма 25 мм, частота 150 мин-1). Затем добавляли 3,5 мл ледяной воды и непрореагировавший эластин сразу же отделяли фильтрацией. Экстинкцию Е фильтрата измеряли спектрофотометром при длине волн 280 нм. Экстинкцию в слепом опыте (ЕС) определяли таким же образом, но раствор эластазы к смеси добавляли лишь после удаления эластина. ЕС этого фильтрата также определяли при 280 нм. Активность эластазы выражается в единицах (Ед). Одной единицей ферментной активности считается такая активность, которая в указанных экспериментальных условиях растворяет 1 мг эластина в минуту. Растворнное количество эластина определяют в фильтрате опытной смеси путм измерения экстинкции при 280 нм. Расчт удельной активности происходит по следующей формуле: Е х F х объм х фактор разбавленияF =1,376 При определении фактора F 10 мг эластина полностью растворяют с помощью эластазы и измеряют соответствующую разность экстинкций Е. Перемножением фактора F и разницы экстинкций получают растворнное количество мг эластина на мл опытной смеси. 4. Клострипаин. а. Получение. Выделение клострипаина проходило по методу, описанному Ульманом и Якубке (14). Удельную активность определяют с помощью синтетического субстрата этилового эфира-N-бензоил-L-аргинина после предварительного 3-х часового активирования раствора клострипаина с 2 мМ раствором 1,4-дитиоэритрита(15). Она составляет около 83 Ед./мг. б. Свойства. Тиолпротеаза клострипаин отличается тем,что она специфически расщепляет полипептид 9 ные цепи синтетических субстратов после аминокислоты L-аргинина. Е молекулярный вес, измеренный гельэлектрофорезом в присутствии додецилсульфата натрия, составляет 55.000 Да. Примеры применения предлагаемой смеси ферментов Нижеследующие примеры 1 - 9 иллюстрируют использование некоторых смесей очищенных ферментов для выделения клеток и фрагментов тканей из животных и человеческих тканей. Примеры 10 и 11 раскрывают пригодность очищенных ферментов для лечения ран. Пример 1. Выделение гепатоцитов печени с помощью смесей из трх ферментов. Гепатоциты выделяли по стандартному методу Берри и Фринда (9) и модифицированному методу Сеглена (16). Крыс линии Вистар(200-280 г) усыпляли внутрибрюшинной инъекцией нембутала (35 мг пентобарбитала/кг веса). После вскрытия брюшины вводили канюлю в воротную вену и при постоянном гидростатическом давлении (12 см водяного столба, переменная скорость протекания) вводили после открытия нижней полой вены следующие, насыщенные карбогеном растворы с рН = 7,40,05 при температуре 36-36,8 С: Перфузия: 1. 5 мин, около 100 мл клеточного буфера без ионов кальция. 2. 5 мин, около 100 мл клеточного буфера без ионов кальция с этиленбис (оксиэтиленнитрило)-тетрауксусной кислотой (0,42 мМ). 3. 8 мин около 200 мл клеточного буфера без ионов кальция. 4. 5-30 мин около 100-600 мл клеточного буфера, в котором растворены лиофилизованные смеси очищенных ферментов. Клеточный буфер: 120,0 мМ NaCl2 1,29 мМ CaCl2 5,50 мМ D(+)-глюкоза 1,19 мМ КН 2 РO4 4,81 мМ KCI 1,20 мМ MgSO4 15,0 мМ NaHCO3 10,0 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота Карбоген: газовая смесь из 95% кислорода и 5% углекислого газа (об/об). Смесь ферментов представляла собой лиофилизат 130 Ед. коллагеназы HP, 5 Ед. коллагеназы AZ и 21 Ед. эластазы, который был растворн в 87,5 мл клеточного буфера. Перфузию заканчивали при размягчении ткани печени. После удаления глиссоновой капсулы гепатоциты выделяли из ткани печени и фильтровали через сито (размер ячеек 100 мкм). После фильтрования клетки подвергали встряхиванию в атмосфере карбогена на водяной бане в течение 20 мин при 37 С. Неповрежднные гепатоциты концентрировали путм трхкратного центрифугирования по 2 мин в клеточном буфере при 50-кратном конечном ускорении. Надосадочную жидкость, в которой находятся в 10 основном мртвые клетки, после каждого центрифугирования отбрасывали. Долю жизнеспособных гепатоцитов, пары клеток гепатоцитов или многоклеточные агрегаты из гепатоцитов после повторного суспендирования полученного осадка клеток определяли с помощью микроскопа в счтной камере Букера (окрашивание с 0,08%-ным трипановым синим, 2 мин.) Результат. В серии опытов (n=4) была получена с применением описанной смеси ферментов суспензия клеток, которая содержит в среднем 88,7% жизнеспособных клеток при выходе 360 х 106 клеток в расчете на одну печень. Сравнительные опыты с содержащим коллагеназу препаратом неопределнного состава с особенно высокой удельной коллагенолитической активностью приводили к сильным повреждениям клеток и и обеспечивали получение только 72,5% жизнеспособных клеток (n=4). Пример 2. Выделение гепатоцитов печени с помощью смеси из четырх ферментов. Эксперимент проводили, как описано в примере 1, но с применением следующей смеси ферментов: 30 Ед. коллагеназы HP, 5 Ед. коллагеназы AZ, 3 Ед. эластазы и 16 Ед. клострипаина. Получали суспензии клеток, которые содержали в среднем 83% жизнеспособных клеток при выходе 232 х 106 клеток (n=2). Пример 3. Определение достоверности результата выделения гепатоцитов печени крыс с помощью смеси из трх ферментов в четырх различных лабораториях в сравнении с содержащими коллагеназу препаратами неопределнного состава. Известны незначительные, но важные для результата выделения гепатоцитов, различия в методах выделения клеток в разных лабораториях. Чтобы проверить активность указанной в примере А смеси для выделения клеток независимо от использованной методики, было проведено большое число выделений гепатоцитов в четырх различных лабораториях. Используемой смесью ферментов был лиофилизат, содержащий 130 Ед. коллагеназыHP, 5 Ед. коллагеназы AZ и 21 Ед. эластазы в 87,5 мл клеточного буфера (аналогично примеру 1). Результат выделения гепатоцитов был определен на основании следующих пяти параметров: 1. определение с помощью микроскопа доли жизнеспособных гепатоцитов (в % от общего числа гепатоцитов в полученной суспензии клеток методом исключения трипанового синего); 2. определение общего числа выделенных гепатоцитов; 3. определение общего числа выделенных гепатоцитов на грамм веса животного; 4. определение доли отдельных клеток (в%, в расчете на все агрегатные формы в полу 11 ченной суспензии клеток, т.е. агрегаты из двух и более клеток гепатоцитов); 5. соблюдение времени перфузии, необходимого для успешной дезинтеграции ткани с помощью раствора коллагеназы. В этом опыте смеси ферментов согласно изобретению обнаружили в значительно большей степени воспроизводимые результаты,чем обычные препараты. Пример 4. Выделение гепатоцитов из печени крыс с помощью смеси из трх ферментов: определение функциональной активности клеток. Чтобы подтвердить пригодность заявленных смесей не только для простого выделения гепатоцитов, но и оценить функциональную активность клеток, были проведены различные опыты по выделению клеток с применением особенно эффективного, содержащего коллагеназу препарата неопределнного состава из печени крыс. Гепатоциты выделяли стандартными методами по Берри и Фринду (9) и модифицированным способом по Сеглену (16). Используемой смесью ферментов был лиофилизат, содержащий 130 Ед. коллагеназыHP, 5 Ед. коллагеназы AZ и 21 Ед. эластазы,который для выделения гепатоцитов из печени крыс был растворн в 87,5 мл клеточного буфера (аналогично примеру 1). Эффективность выделения гепатоцитов крыс определяли по следующим параметрам: доля жизнеспособных клеток по методу исключения трипанового синего, выход клеток на г печени, доля отдельных клеток (в %). Качество полученной суспензии клеток определялось далее с учтом функциональной активности гепатоцитов (21, 22) по следующим параметрам: содержание АТФ, энергетический заряд, лидокаиновый метаболизм моноэтилглицинксилидида и поглощение холилтаурина ,7, 12-тригидрокси-5-холан-24-оил)-2-аминоэтансульфокислота) при концентрации субстрата 21 мкМ. По всем этим параметрам не было отличий между обоими содержащими коллагеназу препаратами. Таким образом доказывается то, что выделенные с помощью предложенной смеси ферментов гепатоциты полностью неповреждены, о чем свидетельствуют не только оценка результатов выделения, но и оценка различных функций клеток, например, активностей по дифференцированному переносу веществ или определнных метаболических функций цитохромР 450-зависимых ферментов гепатоцитов. Пример 5. Выделение гепатоцитов из печени человека с помощью смеси из трх ферментов Гепатоциты выделяли по методу Берри и Фринда (9) и модифицированному способу Сег 000583 12 лена (16) с применением метода биопсииперфузионной техники (21). Используемой смесью ферментов был лиофилизат, содержащий 130 Ед. коллагеназыHP, 5 Ед., коллагеназы AZ и 21 Ед. эластазы,растворнный в 50 мл клеточного буфера. Результат выделения гепатоцитов человека определяли по следующим параметрам: доля жизнеспособных клеток по исключению трипанового синего и выход клеток на г печени. Было обнаружено, что с помощью смесей по изобретению могут бытьуспешно выделены гепатоциты из печени человека с воспроизводимыми результатами (доля жизнеспособных клеток 85-90%). Пример 6. Выделение клеток эпителия желчевыводящих путей из печени крыс. В ряде опытов (n=4) выделяли клетки эпителия желчевыводящих путей из печени крысы описанным в работе (18) способом. При этом сначала при дезинтеграции ткани с помощью фермента удаляли гепатоциты из тканевой связки и затем выделяли клетки эпителия трипсином из остатков ткани. Смесью ферментов для удаления гепатоцитов был лиофилизат, содержащий 130 Ед. коллагеназы HP, 5 Ед. коллагеназы AZ и 21 Ед. эластазы, который был растворн в 87,5 мл клеточного буфера. Доля жизнеспособных клеток эпителия составляла во всех препаратах выше 95%, выход клеток составлял 4-6 х 106 клеток на печень (n=4). Использование описанной смеси ферментов чрезвычайно облегчало выделение клеток эпителия из оставшейся системы сосудов с помощью трипсина, так как после первой процедуры полученный остаток ткани был практически свободен от гепатоцитов. При использовании известных до настоящего времени способов выделения клеток эпителия желчевыводящих путей, проблематичным было то, что остающиеся в клеточной суспензии гепатоциты, а так же клетки Купффера и другие типы клеток, как правило, трудно отделялись от клеток эпителия. Благодаря применению описанной смеси из чистых ферментов достигается экономия времени и расходов, так как происходит более эффективная практически полная дезинтеграция ткани печени. Тем самым обеспечивается необходимое удаление имеющихся обычно в большом количестве контаминирующих гепатоцитов. Пример 7. Выделение клеток эндотелия из человеческой пуповины с помощью смеси из трх ферментов. Человеческие клетки эндотелия выделяли из пуповины по методу Яффе (17). Для этого пуповины (длиной 20-30 см) разрезали пополам, попарно заполняли соответствующим ферментным раствором и инкубировали в течение 15 мин при 37 С и 5% углекислого газа в термостате. Дезинтегрированные 13 клетки отбирали и помещали для развития в первичную культуру. Выход жизнеспособных и способных к делению клеток определяли после вымывания неприкрепившихся спустя 4 дня клеток. Ферментная смесь представляла собой лиофилизат, содержащий 130 Ед. коллагеназыHP, 5 Ед. коллагеназы AZ и 21 Ед. эластазы,растворнный в 87,5 мл буфера выделенных клеток. Через день после высева клеток вымывали неприкрепившиеся клетки (эритроциты, макрофаги и др.). Среду меняли на четвртый день. Слияние происходит обычно на восьмой день после высева (105 клеток на см 2). Монослой клеток состоит более чем на 95% из клеток эндотелия, как показали исследования с использованием клеточного сортера и иммунофлоресценции с помощью антител против фактора VIII(фактор фон Виллебранда) или двум эндотелийспецифическим поверхностным антигенам(TN-4, PAL-E) или с флуоресцирующим лигандом "рецептора-мусорщика" (dil-Ac-LDL). Пoлyчaeмый при использовании нaзвaннoй смеси из очищенных ферментов выход клеток(n=2) превосходит выход, получаемый с помощью содержащего коллагеназу ферментного препарата неопределнного состава. Плотность клеток спустя 4 дня составляла 1,8 х 104 на см 2. При использовании известных способов получают значительно меньшую плотность клеток. Слияние монослоя достигалось при использовании названной смеси значительно раньше (уже после пяти-шести дней). При ферментном выделении клеток эндотелия с помощью различных ферментных препаратов ни в одном случае не происходил разрыв пупочной вены. Выделенные дезинтеграцией клетки хорошо отделялись. Не наблюдалось никаких цитотоксических явлений. Спустя час констатировали прикрепление клеток эндотелия. Препарированные клетки испытывались в первом пассаже на функциональную активность(образование эндотелина, высвобождение лактатдегидрогеназы). При этом все значения лежали в области нормы. Функционально клетки не отличались от полученных в контрольных опытах, в которых использовали препараты,содержащие коллагеназу, неопределнного состава. Превосходство использованной смеси из очищенных ферментов состоит, таким образом,в более высоком выходе клеток, более быстром образовании слитого монослоя и оптимальной неповрежднности клеток (структуры и функции клеток). Сравнимые хорошие результаты получали в опытах при использовании вместо названных выше смесей также других смесей, состоящих,например, из коллагеназы HP и эластазы, из 14 коллагеназы HP, коллагеназы AZ, эластазы и клострипаина. Пример 8. Выделение опухолевых клеток из опухолей человека с помощью смеси из трх ферментов. Опухолевые клетки выделяли из опухолей человека по методике (23). Используемой смесью ферментов был лиофилизат, содержащий 130 Ед. коллагеназыHP, 5 Ед. коллагеназы AZ и 21 Ед. эластазы,растворнный в 28,4 мл буфера для выделения клеток (лактат Рингера/фосфатный буфер). Результат выделения определяли по доле жизнеспособных клеток в опыте с трипановым синим и подсчтом числа лимфоцитов. Были проведены сравнительные выделения клеток с применением смеси ферментов по изобретению и хорошо подходящего для этой цели препарата,содержащего коллагеназу, неопределнного состава на четырх различных опухолевых тканях. Результат. Смесь ферментов по изобретению может быть с успехом использована для выделения опухолевых клеток из человеческих опухолей. Результат выделения, с учтом принятых ошибок опыта, соответствует результату, полученному с особенно хорошо подходящими для выделения опухолевых клеток, содержащими коллагеназу препаратами неопределнного состава. Так как согласно представленным здесь результатам самые различные структуры соединительных тканей в опухоли человека могут быть дезинтегрированы не менее успешно, чем это известно из уровня техники (эффективность выделения, качество выделенных клеток), можно предположить, что ферментные смеси по изобретению пригодны для дезинтеграции также других тканей животных и человека. Пример 9. Выделение клеток островка Рейля из поджелудочной железы свиньи с помощью смеси из трх ферментов. Для выделения клеток островка Рейля из поджелудочной железы свиньи был использован известный препаративный метод Рикорди с некоторыми существенными модификациями (25),для более лучшего контроля результата выделения. Раствор коллагеназы действует более длительное время, особенно при хорошо стандартизированных условиях, на ткань поджелудочной железы после вливания через протоку поджелудочной железы. Уже отделнные островки Рейля непрерывно отводят в резервуар с более низкой температурой и после окончания дезинтеграции полностью отделяют уже частично освобожднные от матрикса островки Рейля с применением лгкой механической обработки и выделяют их. Выделение клеток островков Рейля из поджелудочной железы предъявляет исключительно высокие требования к содержащему кол 15 лагеназу препарату, так как принципы успешного выделения неповрежднных клеток островков Рейля из поджелудочной железы ещ не достаточно хорошо известны. Ниже экспериментально доказывается возможность использования определнной смеси ферментов, полученной согласно изобретению. Успешная дезинтеграция тканей с целью выделения больших нативных клеточных агрегатов (островков Рейля) может быть осуществлена и в отношении поджелудочной железы других видов (например, поджелудочной железы человека). Выделение островков Рейля из поджелудочной железы свиньи оценивается как более сложное, чем из поджелудочной железы других видов. Известно, например, (25), что островки Рейля из поджелудочной железы свиньи очень легко разрушаются до более мелких нежелательных фрагментов при использовании обычных содержащих коллагеназу препаратов неопределнного состава. Это объясняется особыми свойствами клеток в агрегатах островков Рейля, которые имеют многочисленные чувствительные к протеазе контактные зоны между клетками, как между эндокринными и экзокринными клетками, так и между эндокринными клетками и островками Рейля. Таким образом,целью улучшенного способа выделения может быть лишь получение более крупных неповрежднных клеточных агрегатов островков, причм агрегаты размером 100 мкм должны присутствовать лишь в незначительном количестве. Использованной в этом примере для выделения островков Рейля из поджелудочной железы свиньи смесью ферментов был лиофилизат, содержащий 130 Ед. коллагеназы HP, 5 Ед. коллагеназы AZ и 21 Ед. эластазы, растворнный в 10 мл буфера для выделения. К этому раствору прибавляли дезоксирибонуклеазу (0,4 мг/10 мл,440 единиц Кунитца/мг, Сигма). Результат выделения оценивают на основании распределения размеров полученных неповрежднных клеточных агрегатов и других обычных параметров. В качестве особого преимущества применения смеси ферментов по изобретению можно привести то, что может быть получено больше свободных островков Рейля размером выше 100 мкм, по сравнению с обычными препаратами. Пример 10. Экспериментальные исследования по лечению ран in vivo. Коллагеназы при лечении ран способствуют эффективному удалению разрушенной ткани, заполнению клетками области раны и формированию внеклеточной матрицы. На экспериментальной in vivo-модели на крысах для очистки ран по Вебстеру было испытано разрушающее ткани свойство очищенных ферментов. Взависимости от нанеснного количества очищенного фермента на ожог третьей степени наблюдалось ускоренное разрушение денатурированной ткани в течение 16 первых 16 ч. Ферменты наносили по отдельности или в комбинации с другими ферментами. Лучшие результаты были получены при нанесении смеси из коллагеназы HP (3-48 Ед./см 2,предпочтительно 16 Ед./см 2), коллагеназы AZ(0,2-3 Ед./см 2, предпочтительно 1 Ед./см 2) и эластазы (1-12 Ед./см 2, предпочтительно 3 Ед./см 2). При этом у 8 из 15 животных почти полностью была снята корка на ране и у 6 из 15 животных было достигнуто частичное снятие. В этих случаях некротические ткани исключительно легко удалялись механически, в противоположность к контрольному опыту. Спустя более короткое время после нанесения (4 ч) при равных нанеснных количествах было установлено размягчение некрозного материала и во всех случаях корка на ране легко удалялась (в противоположность контрольному опыту). Наряду с этой смесью успешно применялись другие смеси, например из коллагеназы HP(3-48 Ед./см 2) и эластазы (1-12 Ед./см 2). Пример 11. Экспериментальные исследования по лечению ран in vitro. Полученные результаты по разрушающему действию на некротическую ткань (пример 10) были подробно проверены на in vitro-модели. Встряхиванием в растворе буфера, благодаря воздействию коллагеназы HP, коллагеназы AZ и/или эластазы на упомянутую в примере 10 ожоговую корку, было достигнуто высвобождение 4-гидроксипролина (20) спустя 2, 4, 6 и 24 ч. Исследовались такие активности очищенных ферментов, которые были идентичны относительной активности (при сравнимом количестве) содержащего коллагеназу препарата. При таком упрощении не принимался во внимание соответствующий вклад в высвобождение гидроксипролина других компонентов в содержащем коллагеназу препарате. При использовании очищенных ферментов было показано во всех случаях прямая зависимость от времени высвобождения сравнимых количеств гидроксипролина, как при применении соответствующего количества содержащего коллагеназу препарата. Согласно этим результатам очищенные ферменты и их смеси согласно изобретению применимы также в терапии, например, при лечении ран, келлоидных рубцов или фиброзов,как путм наружного применения, так и в виде инъекций. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Смесь ферментов, выделенных из бактерий Clostridium histolyticum, содержащая следующие компоненты: коллагеназу HP с минимальной удельной активностью 20 Ед./мг, определенной по методу Грассмана и Нордвига при использовании в качестве субстрата синтетического гексапептидаZ-GLY-PRO-GLY-GLY-PRO-ALA, которая способна лишь в незначительной степени взаимодействовать с денатурированными коллагенами,такими как желатина и азоколл, и в значительной степени взаимодействовать с коллагеном сухожилий крупного рогатого скота, имеет молекулярную массу около 106 000 Да, определенную электрофорезом в геле агарозы в присутствии додецилсульфата натрия, и изоэлектрическую точку 5,8 - 6,0; коллагеназу AZ с минимальной удельной активностью 10 Ед./мг, определенной по методу Мандля при использовании в качестве субстрата азоколла, которая способна эффективно взаимодействовать с денатурированными коллагенами,такими как желатина и азоколл, а также с коллагеном сухожилий крупного рогатого скота, но не взаимодействует с небольшими синтетическими белками, такими как 2-фуран-акрилоилLEU-GLY-РRО-АLА,4-фенил-азабензолокси карбонил - PRO-LEU-GLU-PRO-ARG и Z-GLYPRO-GLY-GLY-PRO-ALA, имеет молекулярную массу около 111 000 Да, определенную электрофорезом в геле агарозы в присутствии додецилсульфата натрия, и изоэлектрическую точку 5,9-6,1 и эластазу с минимальной удельной активностью 2 Ед./мг, определенной при использовании в качестве субстрата эластина из швейной связки крупного рогатого скота, которая имеет молекулярную массу около 35 000 Да, определенную электрофорезом в геле агарозы в присутствии додецилсульфата натрия, причем указанные ферменты взяты в следующем соотношении (Ед./смесь): Коллагеназа HP 60300 Коллагеназа AZ 1-20 Эластаза 5-70 2. Смесь ферментов по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит тиоловую протеазу кластрипаин в количестве 10-280 Ед./смесь. 3. Смесь ферментов по п.1, отличающаяся тем, что содержит коллагеназу и эластазу в очищенной форме. Литература 1) Gerlauch J. С., Courtney J. M. и Neuhaus