Сверхчувствительные неизотопные водорастворимые нанокристаллы

007105 Данное изобретение относится к сверхчувствительным неизотопным растворимым в воде нанокристаллам для использования в системах неизотопного обнаружения, особенно в качестве зондов для биологических областей применения, причем эти зонды способны обеспечить различимый сигнал электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) или флуоресцентный сигнал или их сочетание в качестве отклика на воздействие электромагнитного излучения. Неизотопные системы обнаружения стали предпочтительным способом по сравнению с использованием радиоактивных маркеров в научных исследованиях и клинической диагностике для обнаружения биомолекул при различных анализах, например при определении последовательности ДНК, приращения нуклеиновых кислот, в иммуногистохимии и т.д. Полупроводниковые нанокристаллы (квантовые элементы) могут успешно использоваться в биологических областях применения, поскольку их можно сделать водорастворимыми, то есть достаточно растворимыми или способными образовывать суспензию в растворах на водной основе, например в воде,или в растворах на основе воды, или в буферных растворах, включая растворы, применяемые в биологических системах и системах обнаружения молекул. С этой целью в WO-A-0027365 предложен состав из нанокристаллов с функциональными группами,содержащих квантовые элементы, на поверхность которых нанесено покрывающее соединение, включающее меркаптокарбоновую кислоту, образующее первый слой, и второй слой, содержащий диаминокарбоновую кислоту, связанную с покрывающим соединением, и дополнительные слои, включающие аминокислоту или обеспечивающий сродство лиганд, химически связанный с диаминокарбоновой кислотой. В WO-A-00/58731 наночастицы сделаны водорастворимыми путем химического связывания с водорастворимым аминопроизводным полисахарида. В WO-A-00/28088 и WO-A-00/28089 описаны водорастворимые нанокристаллы того же типа, который описан в WO-A-0027365, имеющие ветви полинуклеотидов для образования дендримеров или нуклеиновых оснований, которые можно определить по флуоресцентной эмиссии. В WO-A-00/17656 описан водорастворимый полупроводниковый нанокристалл, содержащий в качестве солюбилизирующего агента SH(CH2)nX, где Х представляет собой карбоксилат или сульфонат. В WO-A-00/17655 описан водорастворимый полупроводниковый нанокристалл, содержащий в качестве солюбилизирующего агента молекулу, имеющую гидрофобную область и гидрофильную группу,представляющую собой карбоновую кислоту, карбоксилат, сульфонат, гидроксид, алкоксиды, соли аммония, фосфат, фосфонат, метакриловую кислоту, акриловую кислоту, гидрофилизированные производные стирола, или же молекулы, имеющие формулу (R1)a-R2-[(R3)b(R4)c]d, где R1 выбран из группы, состоящей из гетероалкила, гетероалкенила, гетероалкинила, -OR, -SR, -NHR, -NR'R", -N(O)HR, -N(O)R'R",-PHR, -PR'R", -P(NR'R")NR'R", -P(O)(NR'R")NR'R", -P(O)(OR')OR", -P(O)OR, -P(O)NR'R", -P(S)(OR')OR" и -P(S)OR, где R, R' и R" независимо выбраны из группы, состоящей из Н, разветвленного или неразветвленного алкила, разветвленного или неразветвленного алкенила, разветвленного или неразветвленного гетероалкила, разветвленного или неразветвленного гетероалкенила и разветвленного или неразветвленного гетероалкинила при условии, что если а превышает 1, то группы R1 могут быть одинаковыми или различными, или же могут быть связаны, образуя шести-, семи-, восьми-, девяти- или десятичленный циклоалкил, циклоалкенил, гетероциклическую группу, арил, гетероарил или шести-тридцатичленный краун-эфир или гетерокраун-эфир; R2 выбирают из (химической) связи, разветвленного или неразветвленного алкилена, разветвленного или неразветвленного гетероалкилена, циклоалкила, циклоалкенила, гетероциклического арила или гетероарила; R3 выбирают из разветвленного или неразветвленного алкилена,разветвленного или неразветвленного алкенилена, разветвленного или неразветвленного гетероалкилена,разветвленного или неразветвленного гетероалкенилена, циклоалкила, циклоалкенила, циклоалкинила,гетероциклического арила и гетероарила; R4 выбирают из группы, состоящей из водорода, карбоксилата,тиокарбоксилата, амина, амида, имина, гидразина, сульфоната, сульфоксида, фосфата, фосфоната, фосфония, спирта, тиола, аммония, алкиламмония, нитрата, группы сахара и пяти-, шести-, семи-, восьми-,девяти-, десятичленного циклоалкила, циклоалкенила, циклоалкинила, гетероциклического арила или гетероарила, причем а равно 1, 2, 3 или 4; b равно 0, 1, 2 или 3; с равно 0, 1, 2 или 3; d равно 0,1,2 или 3. В WO-A-00/17642 описан состав, содержащий флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы, связанные с каким-либо соединением; причем спектр испускания этих нанокристаллов обеспечивает информацию о биологическом состоянии или событии, и эти нанокристаллы являются водорастворимыми из-за наличия лиганда, имеющего, по меньшей мере, обеспечивающую связь группу, связанную с нанокристаллом, и гидрофильную группу. В WO-A-00/29617 описан водорастворимый люминесцентный квантовый элемент и биомолекулярное соединение, в состав которого он входит, для сверхчувствительного неизотопного определения invitro и in vivo. Этот водорастворимый люминесцентный квантовый элемент включает ядро, состоящее из полупроводника с размерами наночастиц (CdS или CdSe), покрытия, состоящего из полупроводника,отличного от полупроводника ядра (ZnS или CdS), и гидрофильной соединительной группы, состоящей из любой органической группы, которую можно присоединить к поверхности покрытия и которая делает-1 007105 квантовый элемент водорастворимым. Связь между покрытием и гидрофильной соединительной группой осуществляется через атом серы. Этот водорастворимый люминесцентный полупроводниковый квантовый элемент затем можно непосредственно или опосредованно связать с биомолекулой, такой как протеин, фрагмент протеина или нуклеиновая кислота, с помощью гидрофильной соединительной группы. Задачей данного изобретения является водорастворимый нанокристалл, полученный с новыми солюбилизирующими агентами, и способ перевода этих нанокристаллов в водорастворимое состояние. Предложены также водорастворимые полупроводниковые нанокристаллические зонды для биологического применения, причем эти зонды способны обеспечить различимый сигнал электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) или флуоресцентный сигнал или их сочетание в качестве отклика на воздействие электромагнитного излучения. Водорастворимый полупроводниковый нанокристалл согласно данному изобретению содержит полупроводниковое ядро и оболочку, а также покрытие из одного или более дополнительных соединений,включающих агенты, способствующие растворению в воде, и характеризуется тем, что агент, способствующий растворению в воде, выбран из группы, состоящей из гидроксаматов или производных гидроксамовой кислоты или их сочетания. Ядро представляет собой полупроводниковую наночастицу. Хотя можно использовать любое ядро из полупроводников IIA-VIB, IIIA-VB или IVA-VIB, это ядро должно быть таким, чтобы при сочетании с оболочкой обеспечивать люминесцентный квантовый элемент. Предпочтительно ядро представляет собой CdSe или ZnSe. Оболочка представляет собой полупроводник, который отличается от полупроводника ядра и связан с ядром, и предпочтительно представляет собой полупроводник IIA-VIB с шириной запрещенной зоны, превышающей ширину запрещенной зоны ядра, предпочтительно ZnS, CdS или ZnSe. Предпочтительно нанокристаллы согласно данному изобретению легируют парамагнитными ионами, такими как Mn2+ и другие ионы переходных или редкоземельных элементов. В данном изобретении предложен также водорастворимый нанокристаллический зонд, содержащий полупроводниковый нанокристалл, агент, способствующий растворению в воде, связующий агент и обеспечивающий сродство компонент, который способен к специфичному связыванию с обнаруживаемыми биологическими веществами, характеризующийся тем, что этот водорастворимый нанокристалл представляет собой нанокристалл согласно данному изобретению. В соответствии с одним из вариантов выполнения, связующий агент способен связывать водорастворимый нанокристалл или полимерную гранулу, содержащую внедренные в нее один или более нанокристаллов совместно с обеспечивающими сродство молекулами, включающими пептиды, протеины(белки), моноклоновые или поликлоновые антитела и их функциональные фрагменты, олигонуклеотиды,РНК, одиночные или двойные скрученные ДНК, химерные молекулы РНК-ДНК, триплексы и мультиплексы ДНК и углеводы, которые способны специфично связываться с определяемыми биологическими веществами, например протеинами, олигонуклеотидами, ДНК, РНК, вирусами, бактериями, клетками,включая живые клетки и ткани. Предпочтительно агент, способствующий растворению в воде, является также и связующим агентом. Согласно изобретению предложен способ получения водорастворимого нанокристалла, при котором порошок нанокристаллов растворяют в алифатическом растворителе, а затем смешивают с водным раствором производного гидроксамовой кислоты, алифатический слой, содержащий нанокристаллы, экстрагируют, и нанокристаллы осаждают путем добавления спиртового растворителя, а осадок затем сушат до порошка или растворяют в воде. Согласно изобретению предложен также способ изготовления нанокристаллов, легированных парамагнитными ионами, при котором триоктилфосфиноксид (ТОФО) сушат и дегазируют при 180 С приблизительно в течение 1 ч в атмосфере аргона, к этому расплаву при 350 С добавляют раствор одноэлементных полупроводников и парамагнитных ионов в три-н-октилфосфине (ТОФ), затем реакционную смесь охлаждают до 300 С и добавляют второй раствор полупроводников, а затем реакционную смесь охлаждают до 105 С; наконец, полупроводниковое ядро и оболочку, легированную парамагнитными ионами, осаждают, промывают метанолом и растворяют в гексане, гептане или тетрагидрофуране или сушат до порошка. Нанокристаллические зонды, состоящие из полимерных гранул, должны иметь такую же область применения, как и широко применяемые и известные Нанофлуоросферы, содержащие молекулы органических красителей, внедренные в полимерные гранулы. Полимерные гранулы с внедренными в них нанокристаллами, легированными или не легированными парамагнитными ионами, имеют следующие преимущества по сравнению с нанофлуоросферами: 100-кратное увеличение стабильности нанокристаллов в отношении фотообесцвечиеания по сравнению с органическими красителями; возможность применения многоцветных меток при использовании нанокристаллов различного диаметра и с различными ядрами и оболочками;-2 007105 возможность использования зондов, содержащих нанокристаллы, легированные парамагнитными ионами, в качестве флуоресцентных или магнитно-резонансных зондов или их сочетания. Кроме того, данное изобретение включает способ обнаружения биологических материалов путем регистрации сигнала ЭПР от парамагнитных ионов, введенных в нанокристаллы, или флуоресцентного сигнала от нанокристаллов, или их сочетания, или путем построения изображений биологических материалов с помощью флуоресцентной или ЭПР-микроспектроскопии или путем их сочетания. Биологическое изображение получают путем сканирования объекта следующими способами: посредством регистрации пространственного распределения флуоресценции нанокристаллов с помощью флуоресцентной микроскопии,посредством регистрации сигнала ЭПР с высоким пространственным разрешением с помощью способа, аналогичного сканирующей туннельной микроскопии с иглой из ферромагнитного кристалла, создающей локальное магнитное поле (Hochi A., Furusawa M., Ikeya M., Applications of microwave scanningESR microscope: human tooth with metal (Применения микроволнового сканирующего ЭСР микроскопа: зуб человека с металлом). Appl. Radial Isot. 1993 Jan-Feb; 44 (1-2): 401-405), или методом пустот с применением узкого отверстия для проникновения микроволнового электромагнитного поля в объект; посредством одновременного определения сигнала ЭПР с высоким пространственным разрешением и флуоресцентного сигнала с высоким пространственным разрешением. Далее данное изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры и приложенные чертежи, где фиг. 1 представляет собой схематическое изображение легированных нанокристаллов согласно данному изобретению; фиг. 2 представляет собой схематическое изображение перевода нанокристаллов в водорастворимую форму с помощью гидроксаматов аминокислот или с помощью соединений, обладающих функциональной группой гидроксамовой кислоты; фиг. 3 представляет собой схематическое изображение иммобилизации молекул, обеспечивающих сродство, на водорастворимых нанокристаллах, покрытых гидроксаматом аминокислоты или соединениями, обладающими функциональными группами гидроксамовой кислоты; фиг. 4 представляет собой схематическое изображение применения зонда на водорастворимых нанокристаллах согласно данному изобретению, связанного с обеспечивающей сродство молекулой, для сверхчувствительного неизотопного определения и анализа обнаруживаемого вещества в биологическом материале с помощью флуоресценции или метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), или их сочетания; фиг. 5 а, 5 б, 5 в представляют собой примеры применения водорастворимых нанокристаллических зондов согласно данному изобретению для определения биологических объектов. Следующие примеры служат для иллюстрации данного изобретения и не предполагают ограничение объема данного изобретения. Пример 1. Изготовление нанокристаллов согласно данному изобретению, легированных ионами Mn2+. 12 г ТОФО, помещенного в трехгорлую колбу, сушили и дегазировали при 180 С приблизительно в течение 1 ч в атмосфере аргона. К этому расплаву при 350 С добавили при интенсивном перемешивании раствор элементарного селена, диметилкадмия и бис(фенилселенида марганца) в 1,2 мл ТОФ. Относительная мольная концентрация Cd/Se/Mn в ТОФ составляет 1,0/0,9/0,05. Содержание кадмия в ТОФ находится в пределах 0,1 ммоль. После добавления раствора в ТОФ, реакционную смесь охлаждают до 300 С и добавляют второй раствор диметилцинка и гексаметилдисилтиана в 2 мл ТОФ. Относительная мольная концентрация Cd/Zn в конечной смеси составляет около 1/4. После добавления второго раствора в ТОФ реакционную смесь охлаждают до 105 С и оставляют при перемешивании еще на 1,5 ч. В итоге нанокристаллы CdSe, легированные ионами Мn и покрытые оболочкой ZnS, осаждают метанолом, промывают метанолом и растворяют в гексане, гептане, тетрагидрофуране или высушивают до порошка(фиг. 1). Пример 2. Обеспечение водорастворимости нанокристаллов, покрытых гидроксаматом глицина, и их связывание с биологическими молекулами, обеспечивающими сродство. Несколько миллиграммов порошка нанокристаллов растворяют в гептане и смешивают с водным раствором гидроксамата глицина (0,1-0,001 М) при интенсивном перемешивании. Приблизительно через 1 ч нанокристаллы экстрагируют из алифатического слоя в результате образования связей гидроксамата с атомами Zn на поверхности нанокристалла. Далее алифатический слой удаляют, а нанокристаллы осаждают путем добавления метанола, этанола, пропанола или ацетона. Осадок высушивают до порошка или растворяют в свежей порции воды для дальнейших манипуляций (фиг. 2 а). Связывание таких водорастворимых нанокристаллов с интересующими биомолекулами, такими как аминокислоты, пептиды, протеины, моноклоновые и поликлоновые антитела и их функциональные фрагменты, олигонуклеотиды, РНК, отдельная или скрученная из двух нитей ДНК, химерообразные молекулы РНК-ДНК, триплексы и мультиплексы ДНК и углеводы, например, сиаловые кислоты и т.д., может быть далее осуществлено так, как это описано в "Bioconjugate techniques" (Методы биологического сопряжения), 1996, ред. Hermanson, Academic Press, с использованием свободной NН 2-группы присоеди-3 007105 ненного к нанокристаллу гидроксамата в качестве активной связующей (линкерной) группы, как это представлено на фиг. 3 а, где нанокристаллический зонд реагирует с активированными аминокислотами,пептидами или полипептидами, и R представляет собой аминокислоты, пептиды, протеины, моноклоновые или поликлоновые антитела и их функциональные фрагменты, олигонуклеотиды, РНК, отдельную или скрученную из двух нитей ДНК, химерообразные молекулы РНК-ДНК, триплексы и мультиплексы ДНК и углеводы, например сиаловую кислоту, и т.д. Пример 3. Применение водорастворимых легированных или нелегированных нанокристаллических сенсоров для обнаружения биологических материалов, а также приготовление образцов, содержащих нанокристаллические зонды согласно данному изобретению, и регистрация флуоресцентного изображения биологических объектов (живых клеток или in vitro иммунологических анализов). Фиг. 5 а, 5 б и 5 в изображают примеры применения водорастворимых нанокристаллов согласно данному изобретению для получения флуоресцентного ex-vivo изображения биологического объекта (моноцитов, обработанных нанокристаллами в водорастворимой форме) и результаты применения конъюгатовblot) и анализ точек-пятен - для сверхчувствительного определения биологических материалов. Эти образцы были получены с применением обычных способов, условия эксперимента представлены на фигурах. Мечение клеток с помощью квантовых элементов по данному изобретению проиллюстрировано на фиг. 5 а. Как видно на фиг. 5 в, в анализе Вестерн-блот применяют конъюгаты антитела-нанокристаллы. Пятно Вестерн-блот обрабатывали I-специфичными антителами первичной топоизомеразы, а затем обрабатывали конъюгатами квантовых элементов диаметром 4 нм с вторичными антителами. Как видно на фиг. 5 б, конъюгаты антитела-нанокристаллы применяют при анализе точек-пятен в иммунологических анализах для сверхчувствительного определения биологических материалов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Водорастворимый полупроводниковый нанокристалл, включающий полупроводниковое ядро и оболочку, а также покрытие из одного или более дополнительных соединений, включающих агенты,способствующие растворению в воде, отличающийся тем, что агент, способствующий растворению в воде, выбран из группы, состоящей из гидроксаматов или производных гидроксамовой кислоты или их сочетания. 2. Водорастворимый полупроводниковый нанокристалл по п.1, отличающийся тем, что этот нанокристалл легирован парамагнитными ионами, такими как Mn2+ и другие ионы переходных или редкоземельных металлов. 3. Водорастворимый нанокристаллический зонд, содержащий полупроводниковый нанокристалл,агент, способствующий растворению в воде, связующий агент и обеспечивающую сродство группу, которая способна к специфичному связыванию с обнаруживаемыми биологическими материалами, отличающийся тем, что водорастворимый нанокристалл является нанокристаллом по п.1 или 2. 4. Зонд по п.3, отличающийся тем, что связующий агент способен соединять водорастворимый нанокристалл с молекулами, обеспечивающими сродство, включающими пептиды, протеины, моноклональные или поликлональные антитела и их функциональные фрагменты, олигонуклеотиды, РНК, отдельную или скрученную из двух цепочек ДНК, химерную молекулу РНК-ДНК, триплексы и мультиплексы ДНК, и углеводы, которые способны к специфичному связыванию с обнаруживаемыми биологическими материалами, например протеинами, олигонуклеотидами, ДНК, РНК, вирусами, бактериями,клетками, включая живые клетки и ткани. 5. Зонд по пп.3 и 4, отличающийся тем, что агент, способствующий растворению в воде, является также связующим агентом. 6. Способ получения водорастворимого нанокристалла по пп.1 и 2, отличающийся тем, что порошок нанокристаллов растворяют в алифатическом растворителе, а затем смешивают с водным раствором производного гидроксамовой кислоты, алифатический слой, содержащий нанокристаллы, экстрагируют,и нанокристаллы осаждают путем добавления спиртового растворителя, причем осадок затем сушат до порошка или растворяют в воде. 7. Способ получения легированных нанокристаллов с парамагнитными ионами по п.2, отличающийся тем, что триоктилфосфиноксид сушат и дегазируют при 180 С приблизительно в течение 1 ч в атмосфере аргона, к этому расплаву при 350 С добавляют раствор одноэлементных полупроводников и парамагнитных ионов в триоктилфосфине, затем реакционную смесь охлаждают до 300 С и добавляют второй раствор полупроводников, а затем реакционную смесь снова охлаждают до 105 С, наконец, полупроводниковое ядро и оболочку, легированную парамагнитными ионами, осаждают, промывают метанолом и растворяют в гексане, гептане или тетрагидрофуране или сушат до порошка. 8. Способ обнаружения биологических материалов путем регистрации сигнала ЭПР от парамагнитных ионов, введенных в нанокристаллы по п.2.-4 007105 9. Способ обнаружения биологических материалов путем регистрации флуоресцентного сигнала от нанокристалла по п.1 или 2. 10. Способ обнаружения биологических материалов путем регистрации сочетания флуоресцентного сигнала и сигнала ЭПР от парамагнитных ионов, введенных в нанокристаллы по п.1 или 2. 11. Способ обнаружения биологических материалов путем построения изображений биологических материалов с помощью флуоресцентной или ЭПР микроспектроскопии или их сочетания от нанокристаллов по п.1 или 2. Фиг. 4 Мечение клеток с помощью квантовых элементов Фагоцитоз водорастворимой формы наночастиц моноцитами-6 007105 Представление топоизомеразы I ДНК человека в sf9 клетках насекомых в системе бакуловируса, полученное для соединений вторичных антител с квантовыми элементами диаметром 4 нм Точки-пятна лизатов клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусным переносчиком инфекции с геном топоизомеразы I ДНК человека. Вторичные антитела (поликлональные иммуноглобулины, Сигма) были восстановлены 2-меркаптоэтиламином (Pierce), конъюгированным с квантовыми элементами, и использованы для определения в разбавлениях 1:100 (1), 1:200 (2), 1:300 (3),1:400 (4), 1:500 (5) и 1:1000 (6) Фиг. 5 б Электрофорез геля полиакриламида (слева) и Вестерн-блот (справа) лизата клеток sf9 насекомых, представляющее топоизомеразу I ДНК человека в системе бакуловируса Вестерн-блот был обработан специфичными по отношению к первичной изомеразе I антителами, а затем соединениями квантовых элементов диаметром 4 нм со вторичными антителами