Применение сирамезина в лечении злокачественных опухолей
Номер патента: 11170
Опубликовано: 27.02.2009
Авторы: Яттела Марья, Андерсен Мария Стампе, Ляйст Марсель, Томсен Христиан
Формула / Реферат
1. Применение сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления фармацевтической композиции для использования в лечении злокачественной опухоли.
2. Применение сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для увеличения и/или обеспечения усиленного эффекта химиотерапевтического средства в лечении злокачественной опухоли.
3. Применение сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления фармацевтической композиции для использования в комбинации с химиотерапевтическим средством в лечении злокачественной опухоли.
4. Применение сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления фармацевтической композиции для использования в лечении злокачественной опухоли, где фармацевтическая композиция дополнительно включает другое химиотерапевтическое средство.
5. Применение по любому из пп.1-4, где злокачественная опухоль выбрана из рака легкого, рака предстательной железы, рака молочной железы, глиомы, нейробластом, меланомы, лейкоза, опухоли костного мозга или рака кожи.
6. Применение по любому из пп.2-4, где химиотерапевтическое соединение выбрано из этопозида, доксорубицина, стауроспорина, винкристина и тамоксифена или их фармацевтически приемлемых солей.
7. Применение по любому из пп.1-6, где указанное лечение рака комбинировано с лучевой терапией.
8. Применение по любому из пп.1-7, где сирамезин используется как соль-фумарат или гидрохлорид.
9. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение пациенту эффективного количества сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли.
10. Способ по п.9, где злокачественная опухоль выбрана из рака легкого, рака предстательной железы, рака молочной железы, глиомы, нейробластом, меланомы, лейкоза, опухоли костного мозга или рака кожи.
Текст
011170 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к применению сирамезина для приготовления лекарственных средств, эффективных для лечения злокачественных опухолей. Уровень техники изобретения Опухолевые клетки часто имеют приобретенную устойчивость к классическим лечебным методикам, таким как классический апоптоз, опосредованный каспазой. Однако все еще остается большая неудовлетворенная потребность в новых эффективных лекарственных средствах для лечения злокачественных опухолей. Известно, что в клетках, представляющих много различных типов злокачественных опухолей, стимулированы сигма 2-рецепторы (Bern и другие 1991 г., Cancer Res. 51, 6558; Vilner и др. 1995 г., Cancer Res. 55, 408), и, кроме того, что лиганды сигма 2-рецепторов могут ингибировать клеточную пролиферацию и индуцировать апоптоз в опухолевых клетках (BrentPang, 1995 г., Eur. J. Pharmacol. 278, 151; CrawfordBowen, 2002 г., Cancer Res. 62, 313). Дополнительно было показано, что сигма 2 лиганды могут потенцировать активность противоопухолевых препаратов (CrawfordBowen, 2002 г.,Cancer Res. 62, 313). Международная патентная публикацияWO 92/22554 описывает ряд лигандов сигма-рецепторов, считающихся эффективными для лечения ряда психических и неврологических нарушений. Связь структуры этих соединений с их активностью была также исследована Perregaard, J. и др.,J. Med. Chem., 1995, 38, 11, с. 1998-2008. Среди других многочисленных соединений в WO 92/22554 раскрыто соединение 1'-[4-[1-(4 фторфенил)-1H-индол-3-ил]-1-бутил]спиро[изобензофуран-1(3H)4'-пиперидин](сирамезин), новое применение, которое является предметом настоящего изобретения. Авторами изобретения неожиданно обнаружено, что сирамезин обладает значительно более мощной противоопухолевой активностью, чем сигма 2-лиганды согласно вышеприведенной ссылке. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к лекарственному средству для лечения злокачественной опухоли. Лиганды сигма 2-рецепторов были известны как средства, индуцирующие апоптоз в опухолевых клетках различного происхождения. Авторами изобретения неожиданно обнаружено, что, согласно изобретению, сирамезин, когда применяется отдельно, более мощно индуцирует апоптоз в опухолевых клетках, чем сигма 2-активные соединения согласно вышеприведенной ссылке, такие как галоперидол. Кроме того, авторы наблюдали значимый синергический эффект сирамезина, применяемого в комбинации с известными химиотерапевтическими соединениями, такими как этопозид, доксорубицин, стауроспорин, винкристин и тамоксифен. Поэтому настоящее изобретение демонстрирует, что сирамезин может быть применен для производства фармацевтических композиций для лечения злокачественной опухоли и что такие композиции могут быть применены в комбинации с другими химиотерапевтическими противоопухолевыми препаратами, и/или в комбинации с лучевой терапией. При комбинированном применении сирамезина и противоопухолевых химиотерапевтических препаратов лекарственные средства могут вводиться одновременно или последовательно. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли вместе с химиотерапевтическим средством в синергической эффективной дозе для приготовления фармацевтической композиции, как указано выше, которая адаптирована для одновременного введения активных ингредиентов. В частности, такие фармацевтические композиции могут содержать активные ингредиенты в одной и той же стандартной дозированной форме,например в одной и той же таблетке или капсуле. Такие стандартные дозированные формы могут содержать активные ингредиенты в виде гомогенной смеси или в отдельных отсеках стандартной дозированной формы. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли вместе с химиотерапевтическим средством в синергической эффективной дозе для приготовления фармацевтической композиции или набора, как указано выше, которые адаптированы для последовательного введения активных ингредиентов. В частности, такие фармацевтические композиции могут содержать активные ингредиенты в отдельных стандартных дозированных формах, например отдельных таблетках или капсулах, содержащих любой из активных ингредиентов. Эти отдельные стандартные дозированные формы могут содержаться в одном и том же контейнере или пакете, например блистерной упаковке. Применяемый здесь термин набор обозначает фармацевтическую композицию, содержащую каждый из активных ингредиентов, но в отдельных стандартных дозированных формах. Применяемый здесь термин синергическая эффективная дозировка обозначает дозировки сирамезина и химиотера-1 011170 певтических средств, в которых их комбинированное применение обеспечивает синергический эффект,предпочтительно максимальный достижимый синергический эффект. Согласно изобретению фармацевтическая композиция или набор могут быть адаптированы для одновременного введения активных ингредиентов или для последовательного введения активных ингредиентов, как описано выше. В частности, настоящее изобретение относится к новому применению сирамезина, имеющего общую формулу или его фармацевтически приемлемых солей для приготовления лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, включающему введение индивидууму, нуждающемуся в этом, фармацевтически приемлемого количества сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли. В еще одном аспекте изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, включающему введение сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли индивидууму, который подвергался или подвергается лечению химиотерапевтическим средством. Согласно изобретению соединение 1'-[4-[1-(4-фторфенил)-1H-индол-3-ил]-1-бутил]спиро[изобензофуран-1(3H),4'-пиперидин] (сирамезин) может быть применено в виде основания или в виде фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли или в виде ангидрата или гидрата такой соли. Соли соединения, применяемые в изобретении, представляют собой соли, образованные с нетоксичными органическими или неорганическими кислотами. Из таких органических солей используются соли с малеиновой, фумаровой, бензойной, аскорбиновой, янтарной, щавелевой, бисметиленсалициловой, метансульфоновой, этандисульфоновой, уксусной, пропионовой, винной, салициловой, лимонной, глюконовой,молочной, яблочной, миндальной, коричной, цитраконовой, аспарагиновой, стеариновой, пальмитиновой, итаконовой, гликолевой, пара-аминобензойной, глутаминовой, бензолсульфоновой и теофиллинуксусной кислотами, так же как 8-галогентеофиллины, например 8-бромтеофиллин. Из таких неорганических солей используются соли с соляной, бромисто-водородной, серной, сульфаминовой, фосфорной и азотной кислотами. Предпочтительно соединение применяется в виде фумарата или хлористоводородной соли. Фумарат 1'-[4-[1-(4-фторфенил)-1H-индол-3-ил]-1-бутил]спиро[изобензофуран-1(3H),4'пиперидина] может быть приготовлен, как описано у Perregaard, J. и др., J. Med. Chem., 1995 г., 38, 11,1998-2008 (соединение 14f), а основа и другие фармацевтически приемлемые соли могут быть получены там в соответствии со стандартными процедурами. Таким образом, согласно изобретению соли с добавлением кислоты могут быть получены путем обработки 1'-[4-[1-(4-фторфенил)-1H-индол-3-ил]-1-бутил]спиро[изобензофуран-1(3H),4'-пиперидина] кислотой в инертном растворителе с последующими преципитацией, изоляцией и, необязательно, рекристаллизацией известными способами и, если желательно, микронизацией кристаллического продукта влажным или сухим измельчением, или другим удобным процессом, или приготовлением частиц от процесса эмульгирования растворителя. Предпочтительно преципитация соли выполняется в инертном растворителе, например инертном полярном растворителе, таком как спирт (например, этанол, 2-пропанол и н-пропанол). Согласно изобретению 1'-[4-[1-(4-фторфенил)-1H-индол-3-ил]-1-бутил]-спиро[изобензофуран 1(3H),4'-пиперидин] или его фармацевтически приемлемая соль могут вводиться любым подходящим путем, например перорально или парентерально, и они могут быть представлены в любой подходящей форме для такого введения, например в форме таблеток, капсул, порошков, сиропов или растворов или дисперсий для инъекции. Предпочтительно и в соответствии с задачей настоящего изобретения соединение согласно изобретению вводится в форме твердого фармацевтического объекта, соответственно в виде таблетки или капсулы, или в форме суспензии, раствора или дисперсии для инъекции. Науке хорошо известны способы приготовления твердых фармацевтических препаратов. Таким образом, таблетки могут быть приготовлены путем смешивания активных ингредиентов с обычными адъювантами и/или разбавителями и впоследствии компрессией смеси в удобной таблетировочной машине. Примеры адъювантов или разбавителей включают: кукурузный крахмал, лактозу, тальк, магния стеарат,желатин, лактозу, смолы и подобное. Любой другой адъювант или добавка, такие как красители, ароматические вещества, консерванты и т.д., также могут применяться при условии, что они совместимы с активными ингредиентами. Применяемый здесь термин композиция обозначает продукт, включающий определенные ингре-2 011170 диенты в определенных количествах, так же как любой продукт, который прямо или косвенно является результатом комбинации определенных ингредиентов в определенных количествах. Фармацевтические композиции, содержащие активный ингредиент, могут быть в форме, пригодной для перорального применения, например, в виде разных видов таблеток, водных или масляных суспензий, дисперсных порошков или гранул, эмульсий, твердых или мягких капсул, или сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального применения, могут быть приготовлены в соответствии с любым известным науке способом производства фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать одно или более средств, выбранных из группы, состоящей из подслащивающих веществ, вкусовых добавок,красителей и консервирующих средств, для обеспечения фармацевтически приятных и приемлемых препаратов. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми наполнителями, которые подходят для производства таблеток. Эти наполнители могут быть, например, инертными разбавителями, такими как кальция карбонат, натрия карбонат, лактоза, кальция фосфат или натрия фосфат; гранулирующими и дезинтегрирующими средствами, например микрокристаллической целлюлозой, натрия кросскармеллозой, кукурузным крахмалом или альгиновой кислотой; связующими веществами, например крахмалом, желатином, поливинилпирролидоном или гуммиарабиком, и смазывающими средствами, например магния стеаратом, стеариновой кислотой или тальком. Согласно изобретению композиции могут быть применены для лечения злокачественной опухоли у млекопитающих, предпочтительно у людей. Сирамезин или его соль для применения согласно изобретению наиболее удобно вводится перорально в стандартных дозированных формах, таких как таблетки или капсулы, содержащие активный ингредиент (рассчитанный как свободная форма) в количестве от примерно 0,01 до 100 мг/кг/день, предпочтительно от 0,01 до 30 мг/кг/день массы тела, наиболее предпочтительно от 0,5 до 7,0 мг/день/кг массы тела. Когда сирамезин комбинирован с другими соединениями, чтобы получить увеличенный эффект или, чтобы дать возможность применению субнормальной дозы другого соединения для минимизации побочных эффектов, тогда для лечения могут быть применены субнормальные дозы сирамезина и/или другого соединения. Расчет определенных доз для пациентов является обычной практикой для специалистов в данной области. Фармацевтические композиции и способы согласно настоящему изобретению считаются особенно эффективными для лечения злокачественных опухолей, включая солидные опухоли,такие как карциномы кожи, молочной железы, мозга, шейки матки, карциномы яичек, и т.д. В частности,злокачественные опухоли, которые могут быть подвергнуты лечению соединениями, композициями и способами согласно изобретению, включают, но не ограничены ими: Сердечные: саркому (ангиосаркому,фибросаркому, рабдомиосаркому, липосаркому), миксому, рабдомиому, фиброму, липому и тератому; Легкочные: бронхогенную карциному (плоскоклеточную, недифференцированную мелкоклеточную, недифференцированную крупноклеточную, аденокарциному), альвеолярную (бронхиолярную) карциному,бронхиальную аденому, саркому, лимфому, хондроматозную гамартому, мезотелиому; Гастроинтестинальные: пищевода (плоскоклеточную карциному, аденокарциному, лейомиосаркому, лимфому), желудка (карциному, лимфому, лейомиосаркому), поджелудочной железы (протоковую аденокарциному, инсулиному, глюкагоному, гастриному, карциноидные опухоли, випому), тонкой кишки (аденокарциному,лимфому, карциноидные опухоли, саркому Капоши, лейомиому, гемангиому, липому, нейрофиброму,фиброму), толстой кишки (аденокарциному, тубулярную аденому, ворсинчатую аденому, гамартому,лейомиому); Мочеполового тракта: почки (аденокарциному, опухоль Вильмса [нефробластому], лимфому, лейкоз), мочевого пузыря и мочеиспускательного канала (плоскоклеточную карциному, переходноклеточную карциному, аденокарциному), предстательной железы (аденокарциному, саркому), яичка (семиному, тератому, эмбриональную карциному, тератокарциному, хориокарциному, саркому, промежуточноклеточную карциному, фиброму, фиброаденому, аденоматоидные опухоли, липому; Печени: гепатому (гепатоцеллюлярную карциному), холангиокарциному, гепатобластому, ангиосаркому, гепатоцеллюлярную аденому, гемангиому; Кости: остеогенную саркому (остеосаркому), фибросаркому, злокачественную фиброгистиоцитому, хондросаркому, саркому Юинга, злокачественную лимфому (ретикулярноклеточную саркому), множественную миелому, злокачественную гигантоклеточную опухолевую хордому, остеохрондрому (костно-хрящевые экзостозы), доброкачественную хондрому, хондробластому,хондромиксофиброму, остеоидостеому и гигантоклеточные опухоли; Нервной системы: черепа (остеому,гемангиому, гранулему, ксантому, деформирующий остит), оболочек (менингиому, менингиосаркому,глиоматоз), мозга (астроцитому, медуллобластому, глиому, эпендимому, герминому [пинеалому], глиобластому многообразную, олигодендроглиому, шванному, ретинобластому, врожденные опухоли), спинномозговую нейрофиброму, менингиому, глиому, саркому); Гинекологические: матки (эндометриальную карциному), шейки матки (цервикальную карциному, предопухолевую цервикальную дисплазию), яичников (яичниковую карциному [серозную цистаденокарциному, муцинозную цистаденокарциному, неклассифицированную карциному], опухоли из клеток гранулезной оболочки, опухоли из клеток СертолиЛейдига, дисгерминому, злокачественную тератому), вульвы (плоскоклеточную карциному, интраэпителиальную карциному, аденокарциному, фибросаркому, меланому), влагалища (светлоклеточную карциному, плоскоклеточную карциному, смешанную мезодермальную опухоль (эмбриональную рабдомиосаркому), маточных труб (карциному); Гематологические: крови (миелоидный лейкоз [острый или хро-3 011170 нический], острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, миелопролиферативные заболевания, множественную миелому, миелодиспластический синдром), болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому [злокачественную лимфому]; Кожи: злокачественную меланому, базальноклеточную карциному, плоскоклеточную карциному, саркому Капоши, заносы диспластических невусов,липому, ангиому, дерматофиброму, келоиды, псориаз; и Надпочечников: нейробластому. Таким образом,термин злокачественная клетка, как здесь предусмотрено, включает клетку, поражаемую любым из идентифицированных выше состояний, и термин злокачественная опухоль включает любое из идентифицированных выше состояний, но не ограничен ими. Любые из упомянутых выше состояний нужно рассматривать как отдельные варианты осуществления, и композиции, направленные на лечение каждого состояния, соответственно могут быть сформулированы индивидуально или могут быть включены в группу пунктов формулы изобретения, когда применяется термин злокачественная опухоль. Когда любое из указанных выше показаний для лечения злокачественной опухоли упоминается в отношении применения сирамезина, фармацевтической композиции, набора, способа лечения, имеется в виду индивидуальный вариант осуществления. Соответственно, каждое из указанных выше показаний может быть индивидуально сформулировано вместе с указанным применением сирамезина, фармацевтической композиции, набора, способа лечения и способа идентификации соединений, эффективных для лечения. Экспериментальная процедура Клеточная культура Клетки мышиной фибросаркомы WEHI-S, Wn902, Wn912 и WEHI-R4 представляют собой нормальные, вектор контролирующие, повышенно продуцирующие Hsp70 и устойчивые к hTNF клетки соответственно. Другие типы тестируемых клеток включают: типы опухолевых клеток молочной железы человека MCF7-S1 и MDA-MB-468, и неонкогенные бессмертные эпителиальные клетки молочной железы HBL100. MCF7 casp.3.1 и -3.3 и neo2 являются отдельными клонами клеток, экспрессирующих каспазу-3 и вектор. MCF7 рСЕР, -Bcl2 WT клеток, экспрессирующих вектор, дикий тип Bcl2, ограниченны, Bcl2 NT, -Bcl2 Acta и -Bcl2 Cb5 являются отдельными клонами, цитоплазмой Bcl2, ограниченный митохондриями Bcl2 и ограниченные ER Bcl2 (Maria Hyer Hansen, Apoptosis Laboratory, Danish Cancer Society). Клеточная линия нейробластомы человека SK-N-MC клетки (АТСС, США). В дополнение были протестированы клеточные линии карциномы шейки матки человека HeLa (любезно предоставленные доктором J.Lucas, Danish Cancer Society) и МЕ 180. Также были протестированы НЕК 2 93-А, клеточная линия злокачественной опухоли предстательной железы РС 3, и неонкогенная бессмертная эпителиальная клеточная линия предстательной железы PNT1A. Нетрансформированные NIH3T3 мышиные фибробласты были любезно предоставлены C.Holmberg (University of Copenhagen, Дания). Фибробласты были преобразованы pBabe-puro mock, -SV40LT, -v-Ha-ras, -c-src, как описано (Fehrenbacher и др., 2004 г.). Клетки были размножены в DMEM (Invitrogen, Paisly, Великобритания), дополненным 10% инактивированной высокой температурой сывороткой теленка (Biological Industries, Beit Haemek, Израиль), 0,1 мМ неосновными аминокислотами (Invitrogen) и антибиотиками или RPMI-1640 (Invitrogen), дополненным 6% инактивированной высокой температурой сывороткой теленка и антибиотиками, при 37 С в увлажненной воздушной атмосфере с 5% СО 2. Клетки были протестированы повторно и найдены негативными в отношении микоплазмы окрашиванием hoechst (H-33342, Molecular Probes, Eugene, OR). Связывание [3 Н]Сирамезина с клеточными мембранами или тканевыми мембранами Присутствие сирамезин-чувствительных связывающих участков на ткани, приготовленной из клеточных линий, как указано выше, или ткани от грызуна или человека, было продемонстрировано, применяя [3H]Lu 28-179 (сирамезин)связывающий тест, описанный ранее Sby, K. и др., Neuropharmacol., 2002 г., 42, 95-100. Вкратце, клетки были культивированы, как описано, собраны в фосфатном буферном солевом растворе, применяя скрабер, и центрифугированы (1000n, 10 мин). Получающиеся гранулы были применены для [3H]Lu 28-179-связывающих тестов, как описано у Sby и др., 2002 г. Апоптотические стимулы Были протестированы следующие апоптотические стимулы: Сирамезин (Lu 28-179), аналоги сирамезина: 28131 М, 28134 М, 292880, 32160F, 32124 С и 32168F и галоперидол (H.Lundbeck A/S, Копенгаген,Дания), человеческие TNF- (Strathmann Biotech Gmbh, Германия), тапсигарджин, этопозид, доксорубицин, стауроспорин, винкристин, тамоксифен (SIGMA-Aldrich, Сан-Луис, Миссури), конканамицин A(Alexis Biochemicals, Сан-Диего, Калифорния). Фармакологические ингибиторы и лекарственные средства Были применены следующие ингибиторы протеаз: zVAD-fmk, DEVD-fmk (Bachem Bubendorf,Швейцария), DEVD-CHO (Neosystems, Страсбург, Франция), LEHD-CHO, zFA-fmk (Enzyme System(Calbiochem, La Jolla, Калифорния), ТРСК (Boehringer Mannheim), пефаблок (AEB devices SF) (Roche Diagnostics, DK). Были применены следующие антиоксиданты: Бутилированный гидроксианизол (БГА),токоферол, -токоферол, глутатиона этиловый эфир (GSH), N-ацетилцистеин (NAC) (SIGMA-Aldrich,Сан-Луис, Миссури). Клетки были преинкубированы с ингибиторами и антиоксидантами за 1 ч до лекар-4 011170 ственного средства. В дополнение, были протестированы эффекты следующих лекарственных средств на цитотоксичность сирамезина: антагонистов сигма 2-рецепторов BD1047 (Tocris) и АС 927 (вкладW.Bowen, Brown University, США), 3-метиладенина, актиномицина D, циклогексамида и холестерина. Обнаружение гибели клеток Жизнеспособность клеток Жизнеспособность клеток была измерена, применяя испытание сокращения МТТ. Преобразование соли тетразолия 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразодия бромида (МТТ, SIGMA-Aldrich) в окрашенный в синий цвет продукт формазана было оценено спектрофотометрически путем абсорбции при 570 нм, применяя микрочашечное считывающее устройство Versamax (Molecular Devices). Выживаемость была определена как процент необработанных клеток или обработанных ингибитором клеток: Клетки были высеяны на 96-луночный планшет, содержащий 200 мкл среды, и на следующий день обработаны лекарственными средствами. Воздействие на жизнеспособность клеток было оценено через 24-60 часов после добавления лекарственного средства путем удаления 100 мкл среды и добавления 25 мкл раствора МТТ (1 мг/мкл в PBS, стерилизованном фильтрованием). После 3 часов инкубации при 37 С в темноте, применением 100 мкл буфера солюбилизации (20% SDS в 50% растворе диметилформамида) была усилена проницаемость клеток, и на следующий день они были проанализированы на спектрофотометре. Гибель клеток и цитотоксичность Гибель клеток и цитотоксичность были оценены, применяя лактатдегидрогеназу (ЛДГ) высвобождающую пробу (Roche, Mannheim, Германия). Разрушение плазматической мембраны, высвобождающее цитоплазматическую ЛДГ в питательную среду, является мерой цитотоксичности или лизиса клеток. Ферментативная активность ЛДГ, приводящая к окислению лактата до пирувата и восстановлению NAD+ до NADH+H+, была измерена спектрофотометрически путем преобразования соли тетразолия (желтой) в соль формазана (красную). Клетки были высеяны и обработаны, как описано для испытания МТТ. После анализа было удалено 50 мкл среды и смешано с 50 мкл буфера реакции. Оставшаяся среда была удалена и клетки лизированы в 1% Тритоне Х-100 в течение 20 мин при 37 С. Содержание ЛДГ также было измерено в клеточном лизате и была произведена оценка % высвобождения ЛДГ: Цитотоксичность (% высвобождения ЛДГ)=ЛДГв среде/(ЛДГв среде+ЛДГв лизате)100% Ядерное уплотнение Форма гибели клеток была оценена типом ядерного уплотнения при окрашивании hoechst (проницаемым в клетку hoechst 33342, SIGMA-Aldrich) обработанных лекарственным средством клеток. Непроницаемый в клетку Sytox Green (Molecular Probes) был применен для оценки потери целостности мембраны, и результаты были сравнены с морфологическими изменениями ядер, наблюдаемыми при использовании hoechst. Клетки были культивированы с 10,000 разведением 25 мг/мкл hoechst и/или 10,000 разведением 2 мМ sytox green в течение 5 мин при 37 С, после чего были проанализированы тип ядерного уплотнения и возможное соокрашивание, применяя инвертированный микроскоп OlympusIX-70. Электрофорез на геле для обнаружения расщепления ДНК Клетки были собраны и культивированы при 50 С в течение ночи в 120 мкл буфера лизиса (100 мМNaCl, 100 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 25 мМ EDTA, 0,5% SDS и 100 мгк/мл протеиназы К). Образцы были преципитированы 6 М NaCl и центрифугированы на 13,000 оборотах в минуту в течение 5 мин при 4 С. Геномная ДНК была впоследствии преципитирована от супернатанта 2,5 объемами 96% этанола. После центрифугирования на 20,000 оборотах в минуту в течение 10 мин при 4 С и промывания 70% этанолом,гранулы были растворены в 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и 1 мМ EDTA, содержащим 1 мкг/мл Rnase A. Образцы были культивированы при 37 С в течение 1,5 ч и была оценена концентрация ДНК по спектральной поглощательной способности (А) на 260 нм. Был проведен электрофорез ДНК (5 мкг/полоса) на 1,5% агарозном геле и ДНК визуализирована окрашиванием бромидом этидия. Активность каспазы и катепсина Для измерения активности цитозольного фермента цистеинкатепсина субсливающиеся клетки, высеянные на 24-луночные планшеты, были обработаны экстракционным буфером (250 мМ сахарозы, 20 мМ HEPES, 10 мМ КС 1, 1,5 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1 мМ пефаблока; рН 7,5), содержащим 20 мгк/мл дигитонина, в течение 12-15 минут на льду. Для измерения общей активности клеточного фермента цистеинкатепсина клетки были обработаны вышеуказанным экстракционным буфером, содержащим 200 мгк/мл дигитонина, в течение 12-15 минут на льду. Для анализа 3/7-подобной активности субсливающиеся клетки были обработаны буфером для экстракции каспазы (0,5% Тритон Х-100, 25 мМHEPES, 5 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 1 мМ пефаблока, рН 7,5) в течение 20 мин на льду. Активность, подобная активности каспазы 3/7 и активности цистеинкатепсина, была оценена добавлением одного объема 20 мкМ Ac-DEVD-AFC (Biomol) в буфер реакции с каспазой (100 мМ HEPES, 20% глицерина, 0,5 мМProducts) в буфер реакции с катепсином (50 мМ натрия ацетата, 4 мМ EDTA, 8 мМ DTT, 1 мМ пефаблока, рН 6,0), соответственно. Vmax выделения AFC (возбуждение 400 нм, излучение 489 нм) был анализи-5 011170 рован более 20 мин при 30 С, применяя флуорометр Spectramax Gemini (Molecular Devices, Саннивейл,Калифорния). Испытание лизосомальной стабильности, клеточная культура Клетки были подвергнуты воздействию лизосомотропного слабого основания и метахроматического флуорохрома акридинового оранжевого (АО, Molecular Probes), который аккумулируется в кислых камерах. Высоко концентрированный АО в кислых лизосомах показывает красную флуоресценцию, но после перелокализации зеленую флуоресценцию в цитоплазме. Чтобы контролировать лизосомальную целостность, субсливающиеся обработанные лекарственным средством клетки были подвергнуты воздействию 0,1-0,5 мкг/мл АО в течение 3 ч при 37 С. Клетки были оценены, либо применяя инвертированный микроскоп Olympus IX-70, или отделены от субстрата и проанализированы проточной цитометрией, применяя FACSort (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния) с аргоновым ионным лазером с выходной длиной волны 488 нм, и проанализированы, применяя программное обеспечение CELLQuest. Испытание лизосомальной стабильности in vitro Клетки MCF-7, высеянные на 14 см чашки, были нагружены Fe-декстраном в течение 9 ч, с последующей 16-часовой очисткой в питательной среде. Впоследствии клетки были промыты в PBS и отделены от субстрата. Клеточная дробь была ресуспендирована в буфере SCA (20 мМ Hepes KOH, 10 мМ KCl,1,5 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 250 мМ сахарозы, рН 7,5) и уравновешена на льду в течение 20 мин. Клеточная дробь была гомогенизирована 15-200 ударами Тефлонового пестика. После центрифугирования в течение 5 мин при 750 g супернатант был изолирован и был повторен этап центрифугирования. Остающийся супернатант был перенесен на столбец, находящийся в магнитном поле. Лизосомальная фракция была промыта дважды и элюирована из столбца. Высвобождение лизосомальных катепсинов впоследствии было измерено в 25 мкл растворе лизосом в черном антагонисте 96-луночных планшетах, как описано для измерений активности катепсина. После 1,5 ч реакции при 37 С, Vmax выделенияAFC был анализирован более 20 мин при 30 С, применяя флуорометр Spectramax Gemini (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). Иммуноблот-анализ и иммунофлуоресценция Применяемые первичные антитела включали мышиные моноклональные антитела против катепсина В (Oncogene Research Products, Бостон, MA), катепсина L (Transduction Laboratories, Лексингтон, KY),цитохрома с (BD Pharmingen) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДГ, Biogenesis, Пул, Великобритания), Hsp70 (2H9; любезно предоставленного Борисом Моргулисом, Санкт-Петербург, Россия) и кроличьего поликлонального катепсина D (DAKO corporation, Калифорния), и AIF (apoptosis lab, DanishCancer Research). Для иммуноблот-анализа белки были разделены 6-12% SDS-PAGE и перенесены на нитроцеллюлозную мембрану. После инкубации первичных антител в течение 1 ч в реальном масштабе времени или при 4 С в течение ночи блот был культивирован со вторичными козьими антимышиными или антикроличьими антителами IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена, в течение 1 ч в реальном масштабе времени. Последующее обнаружение белка было выполнено, применяя ECL или ECL plus(Amersham Biosciences, Бакингемшир, Англия). Чтобы визуализировать катепсины, AIF и cyt С, клетки были фиксированы и была усилена их проницаемость в -20 С метаноле в течение 10 мин при 25 С. После преблокирования 5% козьей сывороткой(в 1% BSA, 0,3% Тритона Х-100 в PBS) в течение 20 мин, клетки были культивированы с первичными антителами (в 0,25% BSA, 0,1% Тритоне Х-100 в PBS), как указано, в течение 1,5 ч. После 1 ч инкубации со вторичными антителами Alexa Fluor-488 или -546-конъюгированными антимышиными IgG или антикроличьими IgG (Molecular Probes) клетки были промыты три раза в 0,05% Твине 20 в PBS и прикреплены, применяя Набор ProLong Antifade (Molecular Probes). Был проведен софокусный анализ, применяя микроскоп Zeiss Axiovert 100M с программным обеспечением LSM 510. Эксперименты in vivo Клетки WEHI-R4 (5106) были имплантированы подкожно на спине иммунокомпетентных самок мышей BALB/c. Лечение сирамезином началось за два дня до имплантации опухоли. Мыши были разделены на группы (5-9/группа), и вводилось перорально 200 мкл 1) носителя (0,5% метилцеллюлозы 15 в 0,9% растворе NaCl), 2) 100 мг/кг/день сирамезина в суспензии (в 0,5% метилцеллюлозы 15 в 0,9% растворе NaCl) 7 дней в неделю. Для комбинационных исследований in vivo вводилось 50 мг/кг сирамезина 7 дней/неделя в комбинации с отдельной дозой этопозида (внутрибрюшинно) до 30 мг/кг (вводимого в день первый). Объемы опухолей были оценены применением штангенциркуля. Эффект лекарственных средств на опухолевый рост контролировался более 14-21 дня перед умерщвлением мышей. Результаты Дозозависимым образом сирамезин эффективно индуцирует программируемую клеточную гибель в культивируемых опухолевых клеточных линиях различного происхождения, включая клеточные линии,происходящие от опухолей предстательной железы, молочной железы и шейки матки. Чувствительность клеток к сирамезину увеличена после онкогенного преобразования ras или src, показывающего, что сирамезин обладает желаемой эффективностью противоопухолевого лекарственного средства, чтобы индуцировать его селективное воздействие на раковые клетки при только ограниченных эффектах на нор-6 011170 мальные клетки. Кроме того, сирамезин, когда тестировался на фоне сигма-лигандов в упомянутой ссылке, таких как галоперидол и пентазоцин, в клетках WEHI-S и MSF7, был значимо более мощным индуктором апоптоза, чем галоперидол и пентазоцин. Форма гибели, индуцированная сирамезином, является каспазо-независимой на основании морфологических изменений ядер во время процесса гибели, отсутствия защиты фармакологическими ингибиторами каспазы и отсутствия эффектора активации каспазы. Вместо этого, высвобождение лизосомальных катепсинов в цитозоль кажется вовлеченным в выполнение процесса гибели. Это обнаружение основано на иммуногистохимических окрашиваниях лизосомальных катепсинов В и L, так же как высвобождение катепсинов in vitro из очищенных лизосом. Также применение фармакологических ингибиторов катепсинов может уменьшить гибель, индуцированную сирамезином. Опухолевые клетки, которые были защищены от большинства других противоопухолевых лекарственных средств эктопической экспрессией Bcl-2, были эффективно убиты сирамезином. Тогда как некоторые химиотерапевтические средства активируют р 53-зависимый путь гибели, сирамезин не активирует р 53. Это показывает, что путь гибели значимо отличается от того, что индуцирован ДНКповреждающими средствами (такими как этопозид), результат, который подтверждает данные, показывает широкий диапазон показаний для лечения злокачественной опухоли для сирамезина, с тех пор р 53 зависимый путь гибели часто ставится под угрозу в злокачественной опухоли. Это также основано на вышеупомянутом наблюдении, что сирамезин-индуцированная гибель опухолевых клеток не ингибированна Bcl-2. Важно, что сирамезин был хорошо устойчив in vivo и показал антионкогенный эффект в изогенной опухолевой ксенотрансплантатной модели на BALB/c мышах. В дополнение, комбинационный эффект сирамезина и этопозида наблюдался in vivo в сравнении с группами, подвергавшимися лечению отдельно сирамезином и этопозидом соответственно. Кроме того, сирамезин действует синергическим образом вместе с этопозидом, доксорубицином, стауроспорином, винкристином и тамоксифеном в индукции клеточной гибели в WEHI-S клетках. Эти результаты показывают, что сирамезин является новым противоопухолевым лекарственным средством, которое особенно эффективно в сравнении с другими сигмалигандами ссылки и которое может быть применено отдельно или в комбинации с обычными химиотерапевтическими средствами для лечения злокачественных опухолей. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления фармацевтической композиции для использования в лечении злокачественной опухоли. 2. Применение сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для увеличения и/или обеспечения усиленного эффекта химиотерапевтического средства в лечении злокачественной опухоли. 3. Применение сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления фармацевтической композиции для использования в комбинации с химиотерапевтическим средством в лечении злокачественной опухоли. 4. Применение сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления фармацевтической композиции для использования в лечении злокачественной опухоли, где фармацевтическая композиция дополнительно включает другое химиотерапевтическое средство. 5. Применение по любому из пп.1-4, где злокачественная опухоль выбрана из рака легкого, рака предстательной железы, рака молочной железы, глиомы, нейробластом, меланомы, лейкоза, опухоли костного мозга или рака кожи. 6. Применение по любому из пп.2-4, где химиотерапевтическое соединение выбрано из этопозида,доксорубицина, стауроспорина, винкристина и тамоксифена или их фармацевтически приемлемых солей. 7. Применение по любому из пп.1-6, где указанное лечение рака комбинировано с лучевой терапией. 8. Применение по любому из пп.1-7, где сирамезин используется как соль-фумарат или гидрохлорид. 9. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение пациенту эффективного количества сирамезина или его фармацевтически приемлемой соли. 10. Способ по п.9, где злокачественная опухоль выбрана из рака легкого, рака предстательной железы, рака молочной железы, глиомы, нейробластом, меланомы, лейкоза, опухоли костного мозга или рака кожи.
МПК / Метки
МПК: A61K 31/70, A61K 31/704, A61K 31/135, A61P 35/00, A61K 31/553, A61K 45/06, A61K 31/475, A61K 31/454
Метки: применение, злокачественных, лечении, опухолей, сирамезина
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/8-11170-primenenie-siramezina-v-lechenii-zlokachestvennyh-opuholejj.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Применение сирамезина в лечении злокачественных опухолей</a>
Предыдущий патент: Система подкожной доставки, способ ее получения и ее применение для лечения холинергических дефицитных расстройств
Следующий патент: Катализатор для получения сложных эфиров,способ получения сложного эфира и способ получения сложного полиэфира с участием такого катализатора
Случайный патент: Жилет защитный от ионизирующих излучений