Антивирусное средство на основе гемолимфы насекомых подкласса pterigota

010578 Настоящее изобретение относится к фармакологически активным средствам природного происхождения и может быть использовано для получения антивирусных лекарственных средств и лечения вирусных инфекций. Известны фармацевтические препараты, содержащие комплекс экстрактивных средств животных или растительных тканей и применяемые для лечения вирусных инфекций путем стимуляции иммунной системы и прямого воздействия на вирионы или зараженные вирусом клетки. Известен процесс получения из CD4-позитивных T-лимфоцитов и клеток костного мозга белков,подавляющих развитие вируса иммунодефицита человека (патент US 5480782). Известно наружное средство, содержащее экстракт растения Ginkgo biloba и обладающее антивирусной и антибактериальной активностью (патент DE 4334600 А 1). Патент WO 81/03124 описывает полипептидную фракцию, выделенную из моллюска Mytilus edulis и активную в отношении различных вирусов, бактерий и простейших. Известны антивирусные препараты растительного происхождения, механизм действия которых основан на инактивации свободных вирусных частиц, блокировании их транспорта через клеточную мембрану или подавлении репликации вируса в клетке-хозяине (Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. М.: изд-во Медицина, 1998). Известна многокомпонентная композиция, выделенная из тканей насекомого Calliphora vicinaRobineau-Desvoidy (Diptera, Calliphoridae) и обладающая антивирусной активностью (патентUS 6337093). Из состава данной композиции выделен пептид аллоферон с антивирусной и противоопухолевой активностью (патент RU 2172322). Антивирусная активность указанной композиции и ее действующего вещества аллоферона обусловлена иммуномодулирующими свойствами: способностью индуцировать синтез интерферона и усиливать цитотоксическую активность естественных киллеров(Chernysh et al. Antiviral and antitumor peptides from insects //PNAS, 2002, 99, p. 12628-12632). В то же время ни указанная композиция, ни аллоферон не оказывают прямого защитного действия на клетки,подвергнутые вирусной инфекции. Указанная композиция и ее действующее вещество аллоферон являются единственными антивирусными препаратами из насекомых, известными в настоящее время. По этому признаку они являются наиболее близкими аналогами настоящего изобретения. Перечисленные выше и аналогичные им фармацевтические препараты природного происхождения увеличивают арсенал антивирусных лекарственных средств. Однако известные препараты не покрывают существующую потребность, в связи с чем вирусные инфекции остаются одной из наиболее опасных и трудноизлечимых групп заболеваний человека и животных. В задачу настоящего изобретения входит расширение арсенала антивирусных лекарственных средств. Сущность изобретения В процессе создания настоящего изобретения установлено, что гемолимфа различных насекомых содержит экстрактивные вещества, введение которых в культуру клеток млекопитающих увеличивает устойчивость последних к вирусной инфекции. Дальнейшие систематические исследования крылатых насекомых (подкласс Pterigota класса Insecta) позволили выявить наличие аналогичной антивирусной активности в отдельных таксономических группировках ранга видов, родов, семейств и отрядов. В результате была разработана методология поиска антивирусных лекарственных средств, содержащихся в тканях насекомых, и определены на ее основе виды и группы более высокого ранга, наиболее перспективные в качестве источника антивирусных веществ. Таким образом, предметом настоящего изобретения является новая группа антивирусных средств - антивирусные препараты прямого действия, получаемые путем экстракции тканей насекомых, в частности представителей отрядов Odonata (стрекозы), Mantoptera(богомолы), Hemiptera (полужесткокрылые), Coleoptera (жуки), Diptera (двукрылые), Mecoptera (скорпионницы) или Lepidoptera (бабочки). Под препаратами прямого действия в данном случае понимаются индивидуальные вещества или их смеси, увеличивающие устойчивость клеток организма к вирусной инфекции путем разрушения вируса, блокирования его репликации или иным способом, который может осуществляться без участия иммунной системы. Отличительной особенностью и родовым признаком таких препаратов служит повышение устойчивости клеток-мишеней к вирусной атаке вне организма (invitro), например, при введении препарата в культуральную среду с клетками. Антонимами препаратов прямого действия в контексте настоящего изобретения являются иммуномодуляторы, фармакологическая активность которых основана на стимуляции антивирусного иммунного ответа организма. Понятно,что некоторые метаболиты насекомых могут сочетать свойства антивирусного препарата прямого и иммуномодулирующего механизма действия. Последнее обстоятельство не должно препятствовать их включению в заявляемую группу лекарственных средств, если терапевтическая эффективность этих веществ полностью или частично обусловлена механизмом прямого антивирусного действия. Понятно также, что антивирусные вещества, первоначально выделенные из тканей указанных насекомых, могут быть воспроизведены путем химического или биологического синтеза и использованы в таком или модифицированном виде в качестве лекарственных средств. Модификации базовой структуры могут преследовать цели увеличения стабильности, биодоступности, антивирусной активности, сниже-1 010578 ния токсичности или иных побочных эффектов препарата. Полученные индивидуальные вещества и их смеси могут использоваться в составе фармацевтических композиций, а также в комбинации с другими антивирусными средствами. Указанную совокупность антивирусных веществ прямого действия, выделяемых из тканей различных насекомых, предлагается обозначать термином энтовироны ("энто-" от греческого "энтомон" - насекомое и "вирон" от латинского "вирус"). С целью изучения распределения энтовиронов в пределах класса насекомых были исследованы по единой методике препараты гемолимфы 31 вида насекомых: отряд Mantoptera: Iris polystictica; отряд Hemiptera: Aphrophora salicina; отряд Coleoptera: Pseudophonus rufipes, Acanthocinuss aedilis, Nicrophorus vespillo; отряд Hymenoptera: Vespa crabro, Diprionpini, Athalia colibri; отряд Diptera: Delia brassicae, Calliphora uralensis, Musca domestica, Epysyrphus balteatus, Stratiomyssingularior, Gasterophilus veterinus, Lunatipula sublunata Отряд Mecoptera: Panorpa communis; отряд Lepidoptera: Mamestra persicaria, Diachrysia chrysitis, Operophtera brumata, Cossus cossus, Dendrolimus sibiricus, Lasiocampa trifoli, Axyliaputris, Notodonta dromedarius, Sphinx ligustri, Ephestia kuhniella,Tortrix viridana; отряд Odonata: Aeschna cyanea, Aeschna grandis, Libellula quadrimaculata, Somatochlora metallica. Присутствие энтовиронов установлено в образцах 26 видов, относящихся ко всем исследованным отрядам насекомых (см. таблицу). Лишь 5 образцов дали негативный результат. Исследованные отряды,как показано на фигуре, относятся к двум главным ветвям эволюции подкласса Pterigota (крылатые насекомые): Palaeoptera (древнекрылые) и Neoptera (новокрылые). На этом основании энтовироны можно считать характерной особенностью подкласса Pterigota в целом. Этот вывод подтверждается тем обстоятельством, что энтовироны обнаружены во всех подразделениях группы Neoptera, включающих Polyneoptera, Paraneoptera и Oligoneoptera, а также во всех подразделениях наиболее многочисленной группыOligoneoptera, а именно Neuropteroidea, Hymenopteroidea и Mecopteroidea. Представители подкласса Apterigota в исследовании не участвовали в связи с техническими трудностями получения образцов гемолимфы. Поэтому формула настоящего изобретения ограничена представителями подкласса Pterigota. Хотя энтовироны широко распространены среди насекомых, активность их существенно различается у представителей различных группировок. Наибольшей активностью отличаются энтовироны представителей отряда Odonata (стрекозы), в частности стрекоз семейства Aeschnidae, таких как Aeschnagrandis и Aeschna суапеа, а также семейства Libellulidae, в частности Libellula quadrimaculata и Somatochlora metallica. Другая группа с повышенной активностью энтовиронов относится к отрядуpersicaria семейства, а также семейству Geometridae на примере Operophtera brumata. Кроме того, высокий уровень активности энтовиронов характерен для некоторых представителей отрядов Coleoptera(Pseudophonus rufipes, Carabidae) и Diptera (Stratiomys singularior, Stratiomyidae). Представители перечисленных выше видов, семейств и отрядов особенно полезны в качестве источника получения энтовиронов. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Пример 1. Выделение энтовиронов из гемолимфы насекомых. Исходный биологический материал для постановки опытов (личинок насекомых определенного вида и стадии развития) получали из природных популяций, определяли видовую принадлежность и содержали в лабораторных условиях при комнатной температуре и естественной влажности. Имунную систему личинок активировали путем прокола кутикулы иглой, смоченной суспензией убитых нагреванием(1 мин на кипящей водяной бане) клеток бактерий Escherichia coli и Micrococcus luteus (109/мл клеток каждого вида). Иммунизированных таким образом личинок инкубировали в течение суток при комнатной температуре. По истечение этого срока поверхность личинок стерилизовали 70%-ным этанолом,промывали личинок в стерильной дистиллированной воде и подсушивали на фильтровальной бумаге. Гемолимфу личинок собирали через разрез кутикулы в охлажденные на льду пробирки с добавлением апротинина и фенилтиомочевины для подавления протеолитической и фенолоксидазной активности гемолимфы, немедленно замораживали в жидком азоте и хранили до использования при -20 С. Размороженную гемолимфу центрифугировали 10 мин при 4000 G, супернатант подкисляли трифторуксусной кислотой до конечной концентрации кислоты 0,05% (v/v) и наносили на колонкуSep-Pak с сорбентом C18 (фирма Waters) из расчета 3 мл гемолимфы на 1 г сорбента. Гидрофильные компоненты гемолимфы удаляли, промывая колонку 0,05 %-ной трифторуксусной кислотой. Затем сорбированные на колонке гидрофобные компоненты элюировали 50%-ным ацетонитрилом в 0,05 %-ной трифторуксусной кислоте. Полученную в результате элюции ацетонитрилом смесь гидрофобных компонентов лиофилизировали и использовали для определения антивирусной активности. Пример 2. Антивирусная активность энтовиронов, выделенных из гемолимфы насекомых. Антивирусную активность определяли в системе in vitro, обычно используемой для определения антивирусной активности интерферонов (Chernysh et al. Antiviral and antitumor peptides from insects//PNAS, 2002, 99, p. 12628-12632). Культуру клеток человека L 41 выращивали в лунках 96-луночных планшетов до образования монослоя клеток на дне лунки. Затем в лунку вносили тестируе-2 010578 мый препарат и одновременно вирус везикулярного стоматита (VSV, штамм Индиана) в дозе 100 ЦПД 50(цитопатическая доза, вызывающая гибель 50% клеток монослоя). В контрольные лунки вносили эквивалентное количество растворителя. Зараженную вирусом культуру инкубировали 18 часов при 37 С, затем клетки окрашивали 0.1% раствором красителя "кристаллический фиолетовый". Долю погибших клеток определяли путем последующей экстракции красителя и определения его оптической плотности при 590 нм. Критерием активности энтовиронов служило увеличение доли выживших клеток монослоя по сравнению с контролем. Результат признавался положительным при уровне достоверности различий между опытом и контролем Р 0.01 по критерию Стьюдента. Результаты изучения антивирусной активности препаратов гемолимфы 31 вида насекомых представлены в таблице. Образцы, давшие положительную реакцию в тесте на антивирусную активность,Всего таких образцов обнаружено 26 или 84% всего массива данных. отмечены знаком Как видно из фигуры, содержащие энтовироны образцы относятся к 8 отрядам, представляющим всем подразделения крылатых насекомых (Pterigota): Palaeoptera и Neoptera, Polyneoptera, Paraneoptera иOligoneoptera, Neuropteroidea, Hymenopteroidea и Mecopteroidea. На этом основании энтовироны следует считать характерным компонентом гемолимфы класса насекомых в целом. Среди исследованных образцов выделяются высоким уровнем активности энтовиронов четыре кластера, относящихся к определенным отрядам и семействам. Прежде всего, это образцы, полученные из гемолимфы стрекоз (отряд Odonata), представленных семействами Aeschnidae и Libellulidae на примере Aeschna grandis и Libellulaquadrimaculata, соответственно. Второй кластер относится к отряду жуки (Coleoptera), представленному семейством Carabidae на примере Pseudophonus rufipes. Третий кластер образуют препараты гемолимфы бабочек (Lepidoptera), представленные семейством Noctuidae на примере совок Diachrysia chrysitis и Mamestra persicaria, а также семейством Geometridae на примере пяденицы Operophtera brumata. Наконец,четвертый кластер относится к отряду двукрылых (Diptera), представленному семейством Stratiomyidae на примере Stratiomys singularior. Перечисленные виды, семейства и отряды являются особенно полезными в качестве источника получения энтовиронов.-3 010578 Антивирусная активность энтовиронов, выделенных из гемолимфы насекомых ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Антивирусное средство на основе гемолимфы насекомых подкласса Pterigota, отличающееся тем,что оно получено путем активации иммунной системы насекомых проколом кутикулы иглой, смоченной суспензией убитых нагреванием клеток бактерий, например Escherichia coli или Micrococcus luteus, сбора гемолимфы и дальнейшей обработки полученной гемолимфы центрифугированием, хроматографией супернатанта путем элюирования сорбированных на колонке гидрофобных компонентов с получением элюата, содержащего смесь гидрофобных компонентов, обладающих антивирусной активностью. 2. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что хроматографию супернатанта проводят на колонке с сорбентом C18 путем элюирования сорбированных на колонке гидрофобных компонентов 50% ацетонитрилом. 3. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Odonata. 4. Антивирусное средство по п.2, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Odonata используют виды семейства Aeschnidae. 5. Антивирусное средство по п.3, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Aeschnidae используют стрекоз рода Aeschna. 6. Антивирусное средство по п.2, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Odonata используют виды семейства Libellulidae. 7. Антивирусное средство по п.5, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Libellulidae-4 010578 используют стрекоз рода Libellula. 8. Антивирусное средство по п.5, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Libellulidae используют стрекоз рода Somatochlora. 9. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Mantoptera. 10. Антивирусное средство по п.8, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Mantoptera используют богомолов рода Iris. 11. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Hemiptera. 12. Антивирусное средство по п.10, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Hemiptera используют пенниц рода Aphrophora. 13. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Mecoptera. 14. Антивирусное средство по п.12, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Mecoptera используют скорпионниц рода Panorpa. 15. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Hymenoptera. 16. Антивирусное средство по п.14, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Hymenoptera используют пилильщиков рода Athalia. 17. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Coleoptera. 18. Антивирусное средство по п.16, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Coleoptera используют виды семейства Carabidae. 19. Антивирусное средство по п.17, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Carabidae используют жужелиц рода Pseudophonus. 20. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Diptera. 21. Антивирусное средство по п.19, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Diptera используют виды семейства Stratiomyidae. 22. Антивирусное средство по п.20, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Stratiomyidae используют львинок рода Stratiomys. 23. Антивирусное средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве насекомых подкласса Pterigota используют виды отряда Lepidoptera. 24. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Noctuidae. 25. Антивирусное средство по п.23, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Noctuidae используют совок рода Mamestra. 26. Антивирусное средство по п.23, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Noctuidae используют совок рода Diachrisia. 27. Антивирусное средство по п.23, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Noctuidae используют совок рода Axylia. 28. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Geometridae. 29. Антивирусное средство по п.27, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Geometridae используют пядениц рода Operophtera. 30. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Lasiocampidae. 31. Антивирусное средство по п.29, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Lasiocampidae используют шелкопрядов рода Dendrolimus. 32. Антивирусное средство по п.29, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Lasiocampidae используют шелкопрядов рода Lasiocampa. 33. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Notodontidae. 34. Антивирусное средство по п.32, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Notodontidae используют хохлаток рода Notodonta. 35. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Sphingidae. 36. Антивирусное средство по п.34, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Sphingidae используют бражников рода Sphinx. 37. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Pyralydae. 38. Антивирусное средство по п.36, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Pyralidae-5 010578 используют огневок рода Ephestia. 39. Антивирусное средство по п.22, отличающееся тем, что в качестве видов отряда Lepidoptera используют виды семейства Tortricidae. 40. Антивирусное средство по п.38, отличающееся тем, что в качестве видов семейства Tortricidae используют листоверток рода Tortrix. Распределение образцов с активностью энтовиронов (отмечены знаком