Способ исследования панкреатического сока и способ определения изменения состава панкреатического сока

1 Изобретение относится к способам исследования сущности панкреатита, и в частности панкреонекроза, и может быть использовано для диагностики, в том числе на ранних стадиях, и назначения курса лечения при всех формах панкреатита, в том числе панкреонекроза. Острый панкреатит является тяжелой патологией брюшной полости и относится к одной из важнейших проблем экстренной хирургии. Тяжелая эндогенная интоксикация, панкреатогенный шок, циркуляторные расстройства определяют клинический симтомокомплекс и являются основной причиной смерти больных при данной патологии. Известна систематизация,при которой рассматривают отечную, гегеморрагическую, некротическую и гнойную формы острого панкреатита как отдельные фазы его развития [М.М. Богер. Панкреатиты. Издательство Наука. Сибирское отделение. Новосибирск. 1984 г. стр.35]. Несмотря на достигнутые успехи в диагностике и лечении острого панкреатита, в настоящее время все же нельзя с уверенностью прогнозировать исход лечения больного. Кроме того, к сожалению, до сих пор велико число диагностических ошибок при панкреатите, что затрудняет проведение адекватной комплексной терапии на ранних стадиях заболевания и, соответственно, неблагоприятно отражается на результатах лечения этой тяжелой патологии и не позволяет существенно снизить уровень смертности. Во многом это связано с неполным представлением о патогенезе острого панкреатита. Несмотря на то, что возможность самопереваривания поджелудочной железы установлена уже более трех веков назад, нет полной ясности в отношении сущности острого панкреатита. Известно, что патогенез острого панкреатита является сложным и неоднородным процессом, в котором сочетаются различные патогенетические звенья. Исходной является дисхилия, возникающая под влиянием действия различных токсических факторов на секреторные клетки экзокринной части железы или вследствие нарушения механизмов регуляции экзокринной деятельности железы. Результатом дисхилии является затруднение оттока панкреатического сока, что приводит к возникновению интерстициального отека. Известно, что острый панкреатит обычно протекает с образованием интерстициального отека, который первоначально является асептическим, а воспалительные элементы, выявляемые при остром панкреатите, присоединяются позже, в результате застойного отека железы[М.М. Богер. Панкреатиты. Издательство Наука. Сибирское отделение. Новосибирск. 1984 г. стр.35]. Известны также различные механизмы,приводящие к отеку, т.е. нарушению функций поджелудочной железы в результате дисхилии 2 ка. Сибирское отделение. Новосибирск. 1984 г. стр.52]. Среди этиологических факторов острого панкреатита известны свыше 37 факторов [М.М. Богер. Панкреатиты. Издательство Наука. Сибирское отделение. Новосибирск. 1984 г. стр.35-36]. Существует ряд теорий патогенеза острого панкреатита, среди которых все большее обоснование и распространение в последние десятилетия получает ферментная теория [В.Г. Владимиров, В.И. Сергиенко. Острый панкреатит,Экспериментально-клинические исследования. Москва, Медицина, 1986 г. стр.6]. Известно, что различные исследователи чаще высказываются в пользу активизации ферментов непосредственно в поджелудочной железе под влиянием пока еще не ясных причин[М.М. Богер. Панкреатиты. Издательство Наука. Сибирское отделение. Новосибирск. 1984 г. стр.46], а также известна роль ферментов в патогенезе панкреатита. Известно, что поджелудочная железа секретирует все ферменты, необходимые для расщепления пищевых веществ. При этом большинство исследователей выделяют четыре основные группы панкреатических ферментовIII. Карбогидразы, гликозидазы. IV Нуклеазы). Практически все протеолитические ферменты секретируются в неактивной форме. Активация состоит в разрыве одной из пептидных связей и отщеплении пептида. При этом происходит перестройка пространственной структуры оставшейся части макромолекулы, сопровождающаяся сближением аминокислотных остатков активного центра и активацией фермента. Этот процесс часто носит аутокаталитический характер (он происходит за счет продукта реакции)[В.Г. Владимиров, В.И. Сергиенко. Острый панкреатит. Экспериментально-клинические исследования. Москва, Медицина, 1986 г. стр.4546]. Под воздействием факторов различной природы, как то: различные заболевания органов пищеварения, алкоголизм, эндогенные и экзогенные интоксикации, а также другие, в том числе пока еще неизвестные, причины возникают сначала дистрофические, а затем атрофические изменения дуоденальной слизистой. Дистрофия и атрофия дуоденальной слизистой в результате нарушения трофики и снижения регенеративной способности слизистой сопровождается уменьшением числа S-клеток,вырабатывающих секретин, и в меньшей степени I-клеток, продуцирующих холецистокининпанкреозимин. В результате дефицита эндогенного секретина уменьшается секреция жидкой части панкреатического сока, что приводит к сгущению панкреатического сока и повышению концентрации в нем белка. По мере повышения в панкреатическом соке концентрации белка 3 увеличивается его вязкость и снижается скорость оттока панкреатического сока. Замедление оттока панкреатического сока в сочетании с повышением его вязкости и концентрации белка приводит к преципитации последнего с образованием белковых пробок, которые частично или полностью вызывают закупорку различных отделов панкреатических протоков. Одним из актуальных вопросов, обсуждаемых до настоящего времени, остается связь экструзии и синтеза секреторного продукта. Некоторые исследователи считают, что увеличение синтеза ферментов связано с увеличением их секреции. Другие полагают, что в поджелудочной железе эти процессы протекают независимо. При этом приводятся многочисленные доказательства, подтверждающие правильность обеих точек зрения. Сделать окончательное заключение по этому вопросу сложно, поскольку одни исследования проведены in vitro, другие - in vivo и на различных животных [В.Г. Владимиров,В.И. Сергиенко. Острый панкреатит. Экспериментально-клинические исследования. Москва,Медицина, 1986 г. стр.55]. Вкратце современное представление о патогенезе острого панкреатита можно обобщенно выразить в виде последовательности этапов: дефицит секретина; дисхилия с преобладанием недостаточности гидрокинетической деятельности железы, сгущение панкреатического сока с повышением его вязкости, преципитация белка панкреатического сока, закупорка протоков; затруднение оттока панкреатического сока; парапедез панкреатического сока с отеком железы; нарушение клеточного метаболизма с гипоксией и общим ацидозом; разрыхление клеточной мембраны под влиянием липазы; расщепление внутриклеточного и внеклеточного жира до жирных кислот с возникновением местного ацидоза; активация трипсиногена лизосомальными фермантами в условиях рН 7,4; самопереваривание [М.М. Богер. Панкреатиты. Издательство Наука. Сибирское отделение. Новосибирск. 1984 г. стр.53-54]. При этом с точки зрения своевременной диагностики и назначения курса лечения при всех формах панкреатита наиболее важными являются начальные этапы, включающие дисхилию, сгущение панкреатического сока с повышением его вязкости и преципитацию белка панкреатического сока. Для оценки и сравнения функционального состояния поджелудочной железы проводят биохимические и биофизические исследования крови, ткани поджелудочной железы, а также панкреатического сока. Специалистами предложено уже более 80 различных тестов, используя которые можно определить развитие патологии в поджелудочной железе. Большинство из этих тестов основаны на оценке концентрации содержания раз 004420 4 личных ферментов в крови и/или панкреатическом соке. Одним из основных перспективных направлений исследования патогенеза острого панкреатита является исследование именно панкреатического сока, которое до настоящего времени остается актуальным и достаточно сложным процессом в связи со сложностью и неоднородностью состава панкреатического сока и подверженностью к изменению его свойств под действием ряда факторов. В известных методах исследования функции поджелудочной железы, как правило, проводят оценку концентрации основных панкреатических ферментов и бикарбанатов [М.М. Богер, Панкреатиты. Издательство Наука, Сибирское отделение, Новосибирск, 1984 г., стр. 53-54]. Однако такая оценка не всегда дает возможность с высокой долей вероятности судить о развитии панкреатита, в том числе острого, поскольку концентрация ферментов в панкреатическом соке (также как и в крови) может изменяться под влиянием различных факторов, не имеющих отношения к развитию острого панкреатита. Из имеющегося многообразия тестов автору сложно выделить какой-либо один, который может быть принят за наиболее близкий к заявляемому способу исследования панкреатического сока, а также к способу определения изменения состава панкреатического сока. Однако автор отмечает, что практически при любом исследовании панкреатического сока определяют факторы, воздействующие на изменение панкреатического сока, а также его состав и свойства. Из вышесказанного следует, что вопрос своевременной и достоверной диагностики острого панкреатита является чрезвычайно важным и все еще не решенным, и вопрос этот может быть решен как путем изучения патогенеза острого панкреатита, так и путем биохимического и биофизического исследования панкреатического сока и его изменения в процессе развития болезни. Таким образом, задачей изобретения является повышение точности определения нарушений экзокринной деятельности поджелудочной железы на основании определения изменения состава панкреатического сока, а также точного определения состава и свойств панкреатического сока. Поставленная задача решается тем, что в способе исследования панкреатического сока,при котором определяют факторы, воздействующие на изменение панкреатического сока и его состава и свойств, дополнительно определяют наличие частиц со строго упорядоченной структурой. В одном из вариантов реализации заявляемого способа в качестве частиц со строго упорядоченной структурой определяют комбинацию фрагментов мембран клеток, проферментов 5 и ферментов поджелудочной железы, которые формируют новый класс частиц. Определяемые частицы со строго упорядоченной структурой предпочтительно имеют везикулярную форму. Поставленная задача решается также тем,что в способе определения изменения состава панкреатического сока, включающем исследование панкреатического сока, об изменении судят по появлению в панкреатическом соке частиц со строго упорядоченной структурой. Результаты исследований, а также новые функциональные возможности измерительной аппаратуры приводят к формированию иных взглядов на природу и функции как самой поджелудочной железы, так и ее секрета. Так результаты многолетней практической работы автора, в основном, подтверждают все описанное выше. Однако в ходе исследований автор неожиданно обнаружил, что в результате сгущения панкреатического сока с повышением его вязкости и повышением концентрации белка в панкреатическом соке вначале не происходит преципитация белка, как это принято считать в настоящее время. В действительности, на начальных стадиях острого панкреатита в панкреатическом соке обнаруживаются упорядоченные структуры частиц, которые с физической точки зрения могут быть охарактеризованы как везикулы, а по своей физико-химической природе представляют собой структурную комбинацию фрагментов мембран клеток, проферментов и ферментов поджелудочной железы(протеолипосомы). Отличие обнаруженных структур частиц от структур, полученных в результате преципитации белка, со всей очевидностью подтверждается результатами осуществления заявляемых способов как на основании результатов биохимического исследования панкреатического сока, так и визуально на основании полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа фотографических материалов. Следует отметить, что аналогичные исследования прежде не проводились. Ниже изобретение поясняется на примере одной из возможных реализаций заявляемых способов со ссылкой (для иллюстрации) на фигуры, на которых представлены: фиг. 1 - фотография очага некроза диаметром 21 мм в области перехода тела в хвост поджелудочной железы и жидкость в сальниковой сумке; фиг. 2 - этап дренирования под УЗИконтролем; фиг. 3 - фотография дренирования специальным инструментом Устройство дренирования полостных образований; фиг. 4, 5 - фотографии (СЭМ) упорядоченных структур частиц панкреатического сока с различным увеличением. 6 Способ осуществляли следующим образом. Пациент Т. 47 лет, поступил в клинику через 12 ч от начала заболевания. На основании клинико-лабораторных и инструментальных методов исследований диагностирован острый некротизирующий панкреатит, оментобурсит. При УЗИ выявлено наличие очага некроза диаметром 21 мм в области перехода тела в хвост поджелудочной железы и жидкость в сальниковой сумке, фиг. 1. Через сутки, в связи с увеличением объема жидкости в сальниковой сумке и углублением тяжести состояния больного, под местной анестезией Sol. Novocaini 0,25% - 30,0 и УЗИ контролем (Aloka SSD-630) выполняли чрескожное дренирование. Этап дренирования под УЗИконтролем показан на фиг. 2. Дренирование выполняли известным специальным инструментом Устройство дренирования полостных образований (УДПО), см. фиг. 3 Дренаж был фиксирован к коже. По дренажу в течение 2 суток отделялось грязногеморрагическое содержимое общим объемом 1970 мл. После того, как полость сальниковой сумки спалась и по дренажу стал отделяться прозрачный чистый панкреатический сок дебитом 350-400 мл/сутки, проводили его забор. Этот чистый панкреатический сок больного острым некротизирующим панкреатитом перед исследованием наносили на предметный столик,подвергали сначала естественной сушке, а затем помещали в камеру вакуумного поста SputterCoater. В камере создавали вакуум до давления 6-810 атм. Сплошное токопроводящее покрытие 100 А создавали катодным распылением золота при напряжении 10 кВ, токе 30 мА и времени распыления 0,5-1,0 мин. Подготовленный образец помещали в камеру сканирующего электронного микроскопа(СЭМ) Cam Scan (Англия) и проводили съемку при ускоряющем напряжении 15 кэВ. Количественный стереологический анализ проб проводили на автоматическом анализаторе изображенияMini-Magiscan фирмы Joyce Loebl (Англия),по программе Genias-26, позволяющей проводить анализ практически любых структур, частиц, включений и фаз. Обсчет размера объектов проводился с фотографий, полученных при помощи СЭМ при увеличении в 1000 и 10000 раз(фиг. 4, 5). В панкреатическом соке больных острым некротизирующим панкреатитом были впервые обнаружены определенные частицы со строго упорядоченной структурой, аналогичные везикулам, ранее обнаруженным автором в желчи[Федорук А.М. Клиническое значение биотрансформации желчи в желчном пузыре, канд. диссертация, Минск, 1992, стр. 62 -121]. Диаметр обнаруженных частиц колеблется, при этом наиболее часто встречаются вези 7 кулы диаметром 200-450 нм. Частицы проявляют явную тенденцию к слипанию, слиянию и образованию везикулярных агрегатов. В результате аналогичных исследований панкреатического сока ряда других пациентов с подозрением на острый панкреатит было установлено, что изменения панкреатического сока у больных острым некротизирующим панкреатитом, вызванные нарушением экзокринной деятельности поджелудочной железы и именуемые дисхилией, характеризуются биотрансформацией с формированием нового класса везикулярных частиц, агрегатирование которых на данной стадии заболевания можно рассматривать как обратимый процесс при условии своевременного медикаментозного лечения. Полученные экспериментальные данные в корне меняют взгляды современной медицины на процессы, проистекающие на начальных стадиях развития острого панкреатита, а предложенные в изобретении способы позволяют диагностировать острый панкреатит с высокой степенью достоверности уже на начальных стадиях его развития, что при условии правильного выбора схемы лечения значительно снижает риск летального исхода в результате развития острого панкреатита и панкреонекроза. Таким образом, повышение точности определения состава панкреатического сока и,прежде всего, обнаружение в составе панкреатического сока нового неизвестного специалистам класса частиц типа везикул позволяет осу Фиг.1. Острый некротизирующий панкреатит,оментобурсит 8 ществлять схемы лечения путем воздействия на механизм их образования и взаимодействия,например их разделение с уменьшением в размерах и разблокировки протоковой системы поджелудочной железы и исключения повреждающего действия везикул на любые клеточные структуры (крови, тканей органов и т.п.). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ исследования панкреатического сока, при котором определяют факторы, воздействующие на изменение панкреатического сока,его состав и свойства, отличающийся тем, что дополнительно определяют наличие частиц со строго упорядоченной структурой. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве частиц со строго упорядоченной структурой определяют комбинацию фрагментов мембран клеток, проферментов и ферментов поджелудочной железы. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве частиц со строго упорядоченной структурой определяют везикулы. 4. Способ определения изменения состава панкреатического сока, включающий исследование панкреатического сока, отличающийся тем, что об изменении судят по появлению в панкреатическом соке частиц со строго упорядоченной структурой.