Способ прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергодерматозов при воздействии хрома, никеля и кобальта

СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАННЕГО РАЗВИТИЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ АЛЛЕРГОДЕРМАТОЗОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ХРОМА,НИКЕЛЯ И КОБАЛЬТА Измеров Николай Федотович, Кузьмина Людмила Павловна, Измерова Наталья Ивановна, Коляскина Мария Михайловна,Чистова Илона Ярославовна, Петинати Яна Александровна, Цидильковская Эльвира Семеновна, Лазарашвили Нана Анзориевна, Кузьмина Людмила Сергеевна,Мартышов Сергей Александрович,Девиченская Валентина Александровна,Коляскина Елена Викторовна (RU) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергодерматозов при воздействии хрома, никеля и кобальта. Задачей настоящего изобретения является прогнозирование риска развития профессиональных аллергодерматозов в течение 3-х лет от начала непрерывной работы с хромом, никелем и кобальтом - факторами сенсибилизирующего действия в процессе предварительных или периодических медицинских осмотров большого количества работающих или поступающих на работу во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени. Указанная задача достигается тем,что в способе прогнозирования раннего развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии хрома,никеля и кобальта, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности, дополнительно проводят амплификацию последовательности в промоторной области гена IL-10 в полиморфном положении - 1082,определяют нуклеотидную последовательность и на основании этого определяют полиморфный вариант гена IL-10, при обнаружении гомозиготного варианта гена IL-10 G-1082A - АА соответственно прогнозируют ранние сроки развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии хрома, никеля и кобальта в течение первых 3-х лет от начала профессионального непрерывного контакта с ними, а при наличии гетерозиготного варианта генаIL-10 G-1082A - GA или гомозиготного варианта гена IL-10 G-1082A-GG прогнозируют возможность развития профессиональных аллергических дерматозов через 3 и более лет работы в контакте c хромом, никелем и кобальтом. Предложенный способ позволяет прогнозировать раннее развитие профессиональных аллергических дерматозов в течение 3-х лет от начала профессионального непрерывного контакта с хромом, никелем и кобальтом - факторами сенсибилизирующего действия в процессе предварительных или периодических медицинских осмотров большого количества работающих или поступающих на работу во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени. Предлагаемый способ может быть использован в клинических, биохимических, молекулярногенетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНЫ ТРУДА" РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК (ФБГУ "НИИ МТ" РАМН) (RU) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергодерматозов при воздействии хрома, никеля и кобальта. Известен способ прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии факторов сенсибилизирующего действия, в том числе хрома, никеля и кобальта, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфного варианта A4889G цитохрома Р-450 1 А 1 (Способ прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов. Патент РФ 2467330,кл G 01 N 33/50, 2011). Однако, известный способ прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов имеет низкую специфичность в отношении хрома, никеля и кобальта - факторов сенсибилизирующего действия, т.к. цитохром Р-450 1 А 1 принимает участие, главным образом, в активации до канцерогенных, мутагенных и токсических эффектов самых разнообразных ксенобиотиков. Используя известный способ, прогнозируют риск развития профессиональных аллергодерматозов у работника при непрерывной работе в условиях воздействия на организм хрома, никеля и кобальта - факторов сенсибилизирующего действия 4-5 лет от начала работы, что не позволяет прогнозировать риск более раннего развития (при непрерывной работе до 3-х лет от начала работы) профессиональных аллергических дерматозов. Задачей настоящего изобретения является прогнозирование риска развития профессиональных аллергодерматозов в течение 3-х лет от начала непрерывной работы с хромом, никелем и кобальтом - факторами сенсибилизирующего действия в процессе предварительных или периодических медицинских осмотров большого количества работающих или поступающих на работу во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени. Техническим результатом изобретения является возможность индивидуального прогноза риска развития профессиональных аллергодерматозов до 3-х лет от начала непрерывной работы с хромом, никелем и кобальтом - факторами сенсибилизирующего действия, что позволит своевременно выявлять лиц,предрасположенных к развитию профессиональных аллергодерматозов для предупреждения развития профессиональной патологии путем рационального трудоустройства вне контакта с хромом, никелем и кобальтом - факторами сенсибилизирующего действия, проведения своевременной коррекции и повышения адаптационных способностей организма различными неспецифическими способами. Указанная задача достигается тем, что в известном способе прогнозирования раннего развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии хрома, никеля и кобальта, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности, дополнительно проводят амплификацию последовательности в промоторной области гена IL-10 в полиморфном положении 1082, определяют нуклеотидную последовательность и на основании этого определяют полиморфный вариант гена IL-10, при обнаружении гомозиготного варианта гена IL-10 G-1082A - АА соответственно прогнозируют ранние сроки развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии хрома, никеля и кобальта в течение первых 3-х лет от начала профессионального непрерывного контакта с ними, а при наличии гетерозиготного варианта гена IL-10 G-1082A - GA или гомозиготного варианта гена IL-10 G-1082A - GG прогнозируют возможность развития профессиональных аллергических дерматозов через 3 и более лет работы в контакте с хромом, никелем и кобальтом. Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники,т.е. соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень". Предлагаемый способ может быть применен в клинических, биохимических, молекулярногенетических лабораториях, укомплектованных широко используемым оборудованием и препаратами,выпускаемыми отечественной или зарубежной промышленностью. Следовательно, заявленный способ является доступным и практически применимым. Предлагаемый способ основан на исследовании комплекса диагностических тестов, при этом наличие или отсутствие полиморфного варианта АА, GA или GG гена IL-10 G-1082 А играет основную роль при прогнозировании раннего начала и течения профессиональных аллергических дерматозов при воздействии хрома, никеля и кобальта - факторов сенсибилизирующего действия. Гомозиготный вариант гена IL-10 G-1082A - АА определяет гиперсекрецию интерлейкина-10, который является основополагающим в патогенетических механизмах профессиональных аллергических дерматозов, так как подавляет продукцию провоспалительных цитокинов и стимулирует секрецию иммуноглобулинов, особенно иммуноглобулина Е, В-лимфоцитами. Обнаружение вышеуказанного варианта гена IL-10 G-1082A - АА свидетельствует о риске раннего развития профессиональных аллергических дерматозов в течение первых 3-х лет от начала непрерывного профессионального контакта с хромом,никелем и кобальтом -факторами сенсибилизирующего действия. При наличии гетерозиготного варианта гена IL-10 G-1082A - GA или гомозиготного варианта гена IL-10 G-1082A - GG прогнозируют развитие профессиональных аллергических дерматозов через 3 и более лет непрерывной работы в контакте с хро-1 024837 мом, никелем и кобальтом - факторами сенсибилизирующего действия. Предлагаемый способ пояснен на чертеже. На чертеже представлена электрофореграмма продуктов амплификации гена IL-10 (G-1082 А) в 3%ном агарозном геле, где К- - отрицательный контрольный образец, К+ -положительный контрольный образец, 1 - гомозигота GG (норма), 2 - гомозигота GG (норма), 3 - гетерозигота GA, 4 - гетерозигота GA,5 - гомозигота АА (патология). Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. У пациентов осуществляют забор венозной крови. Кровь исследуют в соответствии с предлагаемым способом. Из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК-сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту. Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовят серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляют 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления генотипирования IL-10 с помощью наборов фирмы "Литех", Россия. При этом используют реагенты, например, производства фирмы "Литех", Россия: разбавитель, реакционная смесь (норма - N, патология Р), Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл. Реакцию амплификации проводят по следующей программе. При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (фирма BIO RAD, США), когда температура достигнет 94 С - режим Pause, ставят пробирки в ячейки термоциклера и выдерживают их при температуре 93 С - 1 мин. Далее выдерживают пробирки 35 циклов: при 93 С - 10 с, при 64 С - 10 с, при 72 С 20 с, а в конце при 72 С - 1 мин, затем 10 Storage. После проведения амплификации осуществляют анализ продуктов реакции в 3%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете (фиг. 1). Интерпретация результата + - гомозигота по Аллели 1,- гетерозигота,-+ - гомозигота по Аллели 2. При обнаружении гомозиготного варианта гена IL-10 G-1082A - АА соответственно прогнозируют ранние сроки развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии хрома, никеля и кобальта - факторов сенсибилизирующего действия в течение первых 3-х лет от начала профессионального непрерывного контакта с хромом, никелем и кобальтом - факторами сенсибилизирующего действия, при наличии гетерозиготного варианта гена IL-10 G-1082A - GA или гомозиготного варианта генаIL-10 G-1082A - G прогнозируют возможность развития профессиональных аллергических дерматозов через 3 и более лет непрерывной работы в контакте хромом, никелем и кобальтом - факторами сенсибилизирующего действия. Пример 1. Больной Р., 45 лет. При поступлении на работу в контакте с цементом, содержащим в своем составе хром, никель и кобальт, предлагаемого способа кровь больного Р. исследовали следующим образом. Из 100 мкл цельной крови выделили суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту. Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления генотипирования IL-10 с помощью наборов фирмы "Литех", Россия. При этом использовали реагенты производства фирмы "Литех", Россия: разбавитель, реакционная смесь (норма - N, патология - Р),Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл. Реакцию амплификации провели по следующей программе. При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (фирма BIO RAD, США), когда температура достигнет 94 С - режим Pause, ставят пробирки в ячейки термоциклера и выдерживают их при температуре 93 С - 1 мин. Далее выдерживают пробирки 35 циклов: при 93 С - 10 с, при 64 С - 10 с, при 72 С 20 с, а в конце при 72 С - 1 мин, затем 10 Storage. После проведения амплификации осуществили анализ продуктов реакции в 3%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете. При анализе результатов был выявлен гомозиготный вариант АА, имеющий замену гуанин на аденина в положении 1082 - варианта генотипа, соответствующего сниженной активности интерлейкина 10. По данным биохимических исследований: нормальное содержание воспалительного белка - эозинофильного катионного протеина и антител, ответственных за аллергическую реакцию - иммуноглобулина Е в сыворотке крови. При прохождении обязательного периодического медицинского осмотра через 2 года после начала работы с хромом, никелем и кобальтом - факторами сенсибилизирующего действия,входящими в состав цемента, у больного Р. были выявлены клинико-функциональные признаки аллергодерматоза. По данным биохимических исследований: повышенное содержание воспалительного белка - эозинофильного катионного протеина и антител, ответственных за аллергическую реакцию - иммуноглобулина Е в сыворотке крови. Больной Р. направлен в центр Профпатологии для экспертизы связи заболевания с профессией. По результатам экспертизы был установлен диагноз - профессиональная экзема верхних конечностей через 2 года после начала непрерывной работы с хромом, никелем и кобальтом - факторами сенсибилизирующего действия, входящими в состав цемента. Вывод: у больного Р. был выявлен гомозиготный вариант АА гена IL-10 (G-1082 А), т.е. синтез интерлейкина-10 понижен, что привело к нарушению соотношения воспалительных и противовоспалительных реакций с преобладанием воспалительных, следствием чего явилось раннее развитие профессиональной экземы верхних конечностей через 2 года непрерывной работы с хромом, никелем и кобальтом факторами сенсибилизирующего действия, входящими в состав цемента. Пример 2. Больная П., 51 год. При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента было выявлено,что больная П. работала оператором на заводе по производству бетона, подвергаясь воздействию соединений никеля, хрома и кобальта, входящими в состав цемента. Через год после начала работы по результатам обследования был поставлен диагноз профессиональная экзема верхних конечностей. По данным биохимических исследований: значительное повышение содержания воспалительного белка - эозинофильного катионного протеина и антител, ответственных за аллергическую реакцию - иммуноглобулина Е в сыворотке крови. Согласно предлагаемого способа кровь исследовали следующим образом. Из 100 мкл цельной крови выделили суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту. Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления генотипирования IL-10 с помощью наборов фирмы "Литех", Россия. Объем полимерной цепной реакции - 25 мкл, при этом использовали реагенты производства фирмы"Литех", Россия: разбавитель, реакционная смесь (норма - N, патология - Р), Taq-полимераза. Реакцию амплификации провели по следующей программе. При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (фирма BIO RAD, США), когда температура достигнет 94 С - режим Pause, ставят пробирки в ячейки термоциклера и выдерживают их при температуре 93 С - 1 мин. Далее выдерживают пробирки 35 циклов: при 93 С - 10 с, при 64 С - 10 с, при 72 С 20 с, а в конце при 72 С - 1 мин, затем 10 Storage. После проведения амплификации осуществили анализ продуктов реакции в 3%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете. При анализе результатов был выявлен гомозиготный вариант АА, имеющий замену гуанин на аденина в положении 1082 - варианта генотипа, соответствующего сниженной активности интерлейкина 10. Вывод: у больной Ф. был выявлен гомозиготный вариант АА гена IL-10 G-1082 А, т.е. синтез интерлейкина-10 понижен, это приводит к более выраженной воспалительной реакции, которая повышает риск раннего развития в первый год работы, следствием этого явилось развитие профессиональной экземы в первый же год непрерывной работы при воздействии соединений никеля, хрома и кобальта, входящих в состав цемента. Пример 3. Больная Г., 50 лет. При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента было выявлено,что больная Г. работала отжигальщицей на металлообрабатывающем заводе, подвергаясь воздействию хрома. Через 9 лет после начала работы по результатам обследования был поставлен диагноз профессиональная экзема верхних конечностей. По данным биохимических исследований: повышение содержания воспалительного белка - эозинофильного катионного протеина и антител, ответственных за аллергическую реакцию - иммуноглобулина Е в сыворотке крови. Согласно предлагаемого способа кровь больной Г. исследовали следующим образом. Из 100 мкл цельной крови выделили суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту. Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавили 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления генотипирования IL-10 с помощью наборов фирмы "Литех", Россия. Объем амплификационной смеси - 25 мкл, при этом используют реагенты производства фирмы"Литех", Россия: разбавитель, реакционная смесь (норма - N, патология - Р), Taq-полимераза. Реакцию амплификации провели по следующей программе. При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (фирма BIO RAD, США), когда температура достигнет 94 С - режим Pause, ставят пробирки в ячейки термоциклера и выдерживают их при температуре 93 С - 1 мин. Далее выдерживают пробирки 35 циклов: при 93 С - 10 с, при 64 С - 10 с, при 72 С 20 с, а в конце при 72 С - 1 мин, затем 10 Storage. После проведения амплификации осуществили анализ продуктов реакции в 3%-ном полиакрила-3 024837 мидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете. При анализе результатов был выявлен гетерозиготный вариант GA, имеющий замену гуанин на аденина в положении 1082 - варианта генотипа, соответствующего незначительно сниженной активности интерлейкина 10. Вывод: у больной Б. был выявлен гетерозиготный вариант GA, т.е. синтез интерлейкина-10 незначительно снижен, это приводит к воспалительной реакции, которая повышает риск развития через 3 и более лет работы, следствием этого явилось развитие профессиональной экземы через 9 лет работы в контакте с хромом - веществом сенсибилизирующего действия. Пример 4. Больной Б., 60 лет. При анализе анамнеза и проф. маршрута пациента было выявлено, что больной Б. работал модельщиком в АМО "ЗИЛ", в течение 26 лет имел контакт с солями хрома, шпатлевкой, клеем ПВА, отвердителем. Через 26 после начала работы по результатам обследования в НИИ медицины труда был поставлен диагноз - профессиональная экзема верхних конечностей. По данным биохимических исследований: незначительное повышение содержания воспалительного белка - эозинофильного катионного протеина и нормальное содержание антител, ответственных за аллергическую реакцию иммуноглобулина Е в сыворотке крови. Согласно предлагаемого способа кровь больного Б. исследовали следующим образом. Из 100 мкл цельной крови выделили суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В"(ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту. Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавили 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления генотипирования IL-10 с помощью наборов фирмы "Литех", Россия. Объем амплификационной смеси - 25 мкл, при этом используют реагенты производства фирмы"Литех", Россия: разбавитель, реакционная смесь (норма - N, патология - Р), Taq-полимераза. Реакцию амплификации проводили по следующей программе. При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (фирма BIO RAD, США), когда температура достигнет 94 С - режим Pause, ставят пробирки в ячейки термоциклера и выдерживают их при температуре 93 С - 1 мин. Далее выдерживают пробирки 35 циклов: при 93 С - 10 с, при 64 С - 10 с, при 72 С 20 с, а в конце при 72 С - 1 мин, затем 10 Storage. После проведения амплификации осуществили анализ продуктов реакции в 3%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете. При анализе результатов был выявлен гомозиготный вариант GG, не имеющий замену гуанин на аденина в положении 1082 - варианта генотипа, соответствующего нормальной активности интерлейкина 10. Вывод: у больного Б. было выявлено отсутствие гомо- и гетерозиготы ИЛ 10 G1082A, т.е. интерлейкин-10 синтезируется в нормальном количестве. Противовоспалительная функция интерлейкина-10 сохранена, однако длительное воздействие солей хрома - веществ сенсибилизирующего действия способствует ослаблению иммунного статуса, следствием чего явилось позднее развитие профессиональной экземы верхних конечностей - спустя лишь 26 лет после начала работы с вредным производственным фактором сенсибилизирующего действия - солями хрома. Таким образом, предложенная совокупность приемов позволяет прогнозировать раннее развитие профессиональных аллергических дерматозов в течение 3-х лет от начала профессионального непрерывного контакта с хромом, никелем и кобальтом - факторами сенсибилизирующего действия в процессе предварительных или периодических медицинских осмотров большого количества работающих или поступающих на работу во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени. Предлагаемый способ может быть использован в клинических, биохимических, молекулярногенетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергодерматозов при воздействии хрома, никеля и кобальта, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что дополнительно проводят амплификацию последовательности в промоторной области гена IL-10 в полиморфном положении - 1082, определяют нуклеотидную последовательность и на основании этого определяют полиморфный вариант гена IL-10, при обнаружении гомозиготного варианта гена IL-10 G-1082A - АА соответственно прогнозируют ранние сроки развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии хрома, никеля и кобальта в те-4 024837 чение первых 3-х лет от начала профессионального контакта с ними, а при наличии гетерозиготного варианта гена IL-10 G-1082A - GA или гомозиготного варианта гена IL-10 G-1082A - GG прогнозируют возможность развития профессиональных аллергических дерматозов через 3 и более лет непрерывной работы в контакте с хромом, никелем и кобальтом.