Фармацевтическая композиция с иммунодепрессивным и противоопухолевым действием, способ ее получения

(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЛИМОНОВА АНАСТАСИЯ ВИКТОРОВНА (RU) Изобретение относится к области медицины, конкретно, к созданию новой фармацевтической композиции и способу ее получения. Фармацевтическая композиция, обладающая иммунодепрессивным и противоопухолевым действием, содержит эффективное количество трис-(2 гидроксиэтил) аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты и вспомогательные вещества (крахмал картофельный, лактозу, магний стеариновокислый и метилцеллюлозу). Способ получения фармацевтической композиции включает смешение трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты с лактозой, крахмалом картофельным и увлажнение полученной смеси раствором связующего (2% раствор метилцеллюлозы), влажное гранулирование, сушку и сухое гранулирование. Композиция выполнена в виде капсул для применения внутрь, малотоксична, имеет высокую биодоступность. 014434 Изобретение относится к области медицины, конкретно к созданию фармацевтической композиции,обладающей иммунодепрессивным и противоопухолевым действием, содержащей в качестве активного вещества синтетическое химическое соединение - трис-(2-гидроксиэтил)аммониевую соль (1 бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты ( далее - А). Известно, что А, являясь биологически активным веществом с иммунодепрессивными и противоопухолевыми свойствами, может быть использовано в медицине и фармакологии для создания лекарственных препаратов [1, 2]. Фармацевтические композиции и готовые лекарственные формы, полученные на основе использования А, в литературе не описаны. Известен синтетический иммунодепрессант азатиоприн, используемый в современной медицинской практике в виде таблеток по 0,05 г [3, 4]. Данный препарат вызывает у пациентов нежелательные побочные реакции - тошноту, рвоту, потерю аппетита, аллергические состояния, токсический гепатит и др. Он противопоказан при выраженном угнетении гемопоэза, лейкопении, тяжелых заболеваниях печени, беременности. Задачей настоящего изобретения является расширения номенклатуры синтетических лекарственных препаратов, обладающих иммунодепрессивным и противоопухолевым действием, а также отличающихся хорошей переносимостью и минимумом побочных эффектов, предложена новая фармацевтическая композиция. Задачей изобретения является создание фармацевтической композиции, обладающей иммунодепрессивной и противоопухолевой активностью, имеющей оптимальную биодоступность и эффективность, содержащей в качестве действующего вещества трис-(2-гидроксиэтил)аммониевую соль (1 бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты, а также разработка способа ее получения. Решение поставленной задачи достигается тем, что предлагаемая фармацевтическая композиция содержит в качестве действующего вещества трис-(2-гидроксиэтил)аммониевую соль (1-бензилиндолил 3-тио)уксусной кислоты и опытно подобранные вспомогательные вещества (разрешенные к применению в фармацевтической промышленности). Фармацевтическая композиция (готовая лекарственная форма) представляет собой тврдую желатиновую капсулу, в которой содержится действующее вещество А в терапевтически эффективной дозе 0,1 г, а также вспомогательные вещества: крахмал картофельный - 0,05 г, лактоза - 0,0963 г, магний стеариновокислый - 0,0025 г и метилцеллюлоза - 0,0012 г (всего 0,250 г). Фармацевтическая композиция и готовые лекарственные формы, полученные на основе использования А ранее в литературе не описаны. Заявленные соотношения компонентов обеспечивают необходимые технологические свойства гранулированной массы для заполнения капсул и фармакопейное качество готовой лекарственной формы. Предложен также способ получения композиции, включающий смешение трис-(2 гидроксиэтил)аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты с лактозой и крахмалом картофельным, увлажнение полученной смеси раствором связующего вещества (водный раствор метилцеллюлозы), влажное гранулирование, сушку и сухое гранулирование. В связи с тем, что субстанция действующего вещества не обладает технологическими свойствами,необходимыми для получения гранулированной массы (отсутствие сыпучести, большой насыпной вес,электростатичность), состав массы получали методом влажной грануляции. Использование метода прямого смешивания А со вспомогательными веществами положительных результатов не дат, так как у полученной массы отсутствует сыпучесть, и она имеет большой насыпной вес, что препятствует наполнению капсул необходимым количеством активного вещества. Использование указанных вспомогательных веществ и их экспериментально подобранные соотношения позволили получить массу с хорошей сыпучестью для заполнения капсул. Капсулы обладают необходимой распадаемостью, оптимальным высвобождением действующего вещества, стабильны при хранении. Пример 1. Способ получения фармацевтической композиции (состав, мас.%: соединение А - 40; крахмал картофельный - 20; лактоза - 38,5; магний стеариновокислый - 1,0; метилцеллюлоза - 0,5). В смеситель загружают 50,0 г крахмала картофельного, 96,25 г лактозы и 100 г трис-(2 гидроксиэтил)аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты; массу перемешивают до однородного состояния. Затем в смеситель загружают предварительно приготовленный 2% водный раствор метилцеллюлозы в количестве 62,5 мл, перемешивают, подвергают влажному гранулированию на грануляторе и передают на сушку до остаточной влажности (10,5%). Сухое гранулирование проводят вручную на металлическом сите, затем гранулят опудривают магнием стеариновокислым - 2,5 г. Получают 247 г гранулированной массы (выход 98,5%), которой заполняют тврдые желатиновые капсулы. Распадаемость: не более 20 мин. Растворение: не менее 80% за 30 мин. Пример 2. Изучение общетоксических свойств фармацевтической композиции Для изучения острой токсичности использовались нелинейные крысы обоего пола.-1 014434 Содержимое капсул растворяли в дистиллированной воде и вводили животным внутрижелудочно с помощью зонда в дозах 500, 1000, 2000, 3000 и 5000 мг/кг. В каждой группе было по 6 крыс. За животными наблюдали в течение двух недель. Изучали гибель крыс (LD50) и клиническую картину отравления. Установлено, что по показаниям острой токсичности композиция, содержащая А и вспомогательные вещества, относится к малотоксичным препаратам. Для изучения хронической токсичности использовались кролики обоего пола, которым в течение 6 месяцев внутрижелудочно вводились капсулы, содержащие А и вспомогательные вещества (суточные дозы композиции составляли 40 и 80 мг/кг, что превышает предполагаемую терапевтическую дозу для человека в несколько раз). В каждой группе было по 10 животных. Установлено, что композиция (готовая лекарственная форма) не оказывает токсического влияния на организм экспериментальных животных: не изменялось поведение, внешний вид, масса тела, ректальная температура. Отдельно наблюдаемые колебания биохимических показателей не были связаны с токсическим действием композиции и находились в пределах физиологической нормы. Не выявлено существенных изменений гематологических показателей, свидетельствующих о нарушениях в лейкоэритроцитарном составе крови. При патоморфологическом изучении тканей внутренних органов не установлено патологических изменений, связанных с токсическим действием препарата. Внутрижелудочное шестимесячное введение кроликам капсул (содержащих композицию) не оказывает местного раздражающего действия на область желудочно-кишечного тракта. Пример 3. Определение биодоступности композиции. В опытах на кроликах определяли биодоступность композиции, содержащей А и вспомогательные вещества. Для определения абсолютной биодоступности кроликам внутрь вводили по одной капсуле композиции. Определено содержание действующего вещества в плазме крови животных (метод ВЭЖХ), рассчитаны фармакокинетические параметры, характеризующие скорость и степень всасывания действующего вещества, его элиминацию, определена абсолютная биодоступность составов капсул. Показано, что после назначения внутрь композиции действующее вещество А хорошо высвобождается из капсул, быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта. Действующее вещество А длительно находится в крови (24 ч) и медленно выводится из сосудистого русла. Абсолютная биодоступность для композиции составляет 0,71. Пример 4. Изучение специфической фармакологической (иммунодепрессивной и противоопухолевой) активности композиции. Методы исследования Животные. В работе использовали здоровых половозрелых животных - мышей линии СВА, DBA/2, C57BL/6,мышей гибридов (C57BL/6xDBA/2)F1 (B6D2F1) обоего пола, 8-10 недельного возраста, массой тела 1820 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышает 10%. Контрольные и опытные животные одного возраста получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период экспериментов контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях - стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром). Опыты проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных (Страсбург, 1986) и одобренными комитетом по биомедицинской этике НИИ клинической иммунологии СО РАМН (г. Новосибирск). Исследование фармацевтической композиции проводили в несколько серий опытов, соответственно каждая серия опытов имела свой контроль. Определение количества IgM антителообразующих клеток in vivo Фармацевтическую композицию (содержимое капсул, растворенное в культуральной среде RPMI 1640) вводили мышам внутрижелудочно в дозе 25 мг/кг (что соответствует дозе 10 мг/кг чистой субстанции А) в объеме 0,5 мл ежедневно один раз в сутки в день иммунизации и в последующие 3 дня (индуктивная/продуктивная фазы формирования гуморального иммунного ответа). Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединений (культуральная среда RPMI 1640). Животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 10 /мышь однократно. КоличествоIgM AOK в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа (5-е сутки после иммунизации) по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом [5]. Результаты выражали в абсолютном количестве IgM AOK в селезенке. В каждой исследуемой группе было по 10 животных. Модель люпус-подобного иммунокомплексного гломерулонефрита у мышей осуществлялась путм переноса самкам B6D2F1 лимфоидных клеток родительской линии DBA/2 [6]. Вводили клетки лимфатических узлов, тимуса и селезнки в соотношении 1:3:6 (соответственно по 5106 клеток лимфатических узлов, 15106 клеток тимуса, 30106 клеток селезнки), выделенных ex temporo, в стерильной средеRPMI-1640. Каждая мышь-реципиент получала по 50106 клеток путм внутривенной инъекции в хво-2 014434 стовую вену в объме 0,5 мл среды двукратно с интервалом в пять дней. Для контроля использовались интактные животные того же генотипа, пола, возраста, что и в опыте. При этом у мышей-реципиентов к 3-му месяцу развивается люпус-подобное поражение почек аутоиммунного генеза. Поражение почек тестировали по уровню белка в моче. Содержание белка в моче определяли калориметрически с красителем Kumsai brillant blue (Loba Feinchemie) с помощью Titertec Multiskan, длина волны 570 nm. Реактив готовили следующим образом: 10 мг Кумасси растворяли в 5 мл С 2 Н 5 ОН. После полного растворения красителя добавляли 11,2 мл 70% H3PO4. Общий объм доводили до 100 мл, фильтровали. К 5 мкл мочи, разведнной в 5 раз в ЗФР, добавляли 150 мкл красителя Кумасси. Калибровочную кривую строили по BSA (100-1000 мкг/мл). Модель острой РТПХ (реакция трансплантат против хозяина) осуществляли путм внутривенного переноса самкам B6D2F1 100106 клеток селезенки родительской линии C57BL/6 (С 57 В 1/6B6D2F1). Выраженность острой РТПХ оценивали по количеству живых мышей через 21 день и через 28 дней после индукции реакции. Для определения противоопухолевых свойств композиции использовалась модель метастазирования клеток гепатомы Г 27 в легкие у мышей. Результаты исследования 1. Изучение иммунодепрессивных свойств композиции в модели первичного гуморального иммунного ответа. Изучали влияние действующего вещества А и фармацевтической композиции на индуктивную/продуктивную фазы первичного гуморального иммунного ответа: содержимое капсул в дозе 25 мг/кг ( и вещество А в дозе 10 мг/кг) вводили мышам одновременно с антигеном и далее в течение 3-х суток ежедневно. Проведено несколько серий опытов. Результаты представлены в табл. 1. Таблица 1. Влияние А и композиции на первичный гуморальный иммунный ответ у мышей B6D2F1 Таким образом, полученные результаты говорят о том, что композиция отличается выраженным достоверным иммунодепрессивным (подавляющим) эффектом в отношении формирования гуморального иммунного ответа, сравнимым с чистой субстанцией (при одинаковой дозе содержания действующего вещества). 2. Изучение иммунодепрессивных свойств композиции в модели острой РТПХ. Мышам-реципиентам B6D2F1 в день переноса клеток селезенки от родителя С 57 В 1/6 вводили внутрижелудочно композицию в дозе 25 мг/кг (в дозе 10 мг/кг действующего вещества) и далее ежедневно в течение 12 суток. Учет количества живых мышей проводили на 21 и 28 день от момента индукции РТПХ. Данные представлены в табл. 2. Таблица 2. Влияние композиции на развитие острой РТПХ Как видно из представленных в табл. 2 данных, композиция существенно подавляет развитие острой РТПХ и повышает выживаемость животных более чем в 2 раза. 3. Изучение иммунодепрессивных свойств композиции в модели аутоиммунного заболевания. Мышам с иммунокомплексным гломерулонефритом ежедневно вводили внутрижелудочно композицию в дозе 25 мг/кг (в дозе 10 мг/кг действующего вещества), курс составил 13 введений. Контрольным мышам в таком же режиме вводили азатиоприн (в дозе 10 мг/кг действующего вещества). Определяли уровень белка в моче до введения препаратов, через 7 дней от начала введения и по окончании курса. Данные представлены в табл. 3 и 4.-3 014434 Таблица 3. Влияние композиции на уровень белка в моче у мышей с гломерулонефритом- среднее значение Таблица 4. Влияние азатиоприна на уровень белка в моче у мышей с гломерулонефритом- среднее значение Как видно из данных табл. 3 и 4, композиция оказывает иммунодепрессивный эффект у мышей с иммунокомплексным гломерулонефритом сравнимый с известным лекарственным препаратом азатиоприном. 4. Изучение противоопухолевых свойств композиции Мышам линии СВА внутривенно вводили клетки гепатомы Г 27 в дозе 10010 /мл. Учет метастазов в легких проводили на 15 день после перевивки опухоли. Композицию вводили в различных дозах внутрижелудочно (14 введений по одному разу в день). Результаты представлены в табл. 5.-4 014434 Таблица 5. Влияние композиции на процесс метастазирования клеток гепатомы Г 27 в легкие у мышей СВАMts- среднее число метастазов в легких Как видно из данных табл. 5, композиция эффективно (достоверно) ингибирует процесс метастазирования клеток опухоли (гепатомы Г 27) в легкие у мышей. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что разработана новая фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующего вещества эффективное количество трис-(2 гидроксиэтил)аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты. Композиция малотоксична и имеет достаточно высокую абсолютную биодоступность (0,71). Композиция может быть выполнена в виде капсул. Капсулы обладают необходимой распадаемостью и высвобождением действующего вещества, стабильны при хранении. Срок хранения 2 года. Разработан также способ получения композиции, который может быть реализован в промышленности. В опытах на мышах изучены иммунодепрессивные и противоопухолевые свойства композиции. Показано, что она проявляет выраженный иммунодепрессивный эффект у мышей в модели формирования гуморального иммунного ответа, в модели иммунокомплексного гломерулонефрита, а также в модели острой РТПХ. Композиция оказывает противоопухолевое действие, достоверно подавляя процесс метастазирования клеток гепатомы Г 27 в легкие у мышей. Известные в настоящее время лекарственные препараты, обладающие подобными свойствами, применяются в медицинской практике для лечения аутоиммунных и опухолевых заболеваний, а также для предотвращения отторжения трансплантированных органов и тканей [3]. Список литературы 1. Пат. 2228178 РФ А 61 К 31/405, А 61 Р 37/06, заявл. 23.12.2002, опубл. 10.05.2004. 2. Пат. 2240793 РФ А 61 К 31/404, А 61 Р 35/00, заявл. 09.12. 2003, опубл. 27.11.2004. 3. Машковский М.Д. //Лекарственные средства, 14-е издание, 2001, том. 2, стр. 197. 4. Cecil Texbook of Medicine, 18th edition, 1988, p. 584 and p. 1095. 5. Cunningham A.J., Szenberg A.// Immunology, 1968, vol. 14(4), P.599-600. 6. Kimura M., Gleichmann E.//Clin. Immunol. And Immunopathol., 1987,vol.43, No.l.-P.97-109. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фармацевтическая композиция, обладающая иммунодепрессивными и противоопухолевыми свойствами, характеризующаяся тем, что она выполнена в виде капсулы и содержит в качестве действующего вещества трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты и вспомогательные вещества в количестве мас.%: действующего вещества - 40 и вспомогательных веществ- 60, при этом в качестве вспомогательных веществ она включает в мас.%: крахмал картофельный - 20,лактозу - 38,5, магний стеариновокислый - 1 и метилцеллюлозу - 0,5. 2. Способ получения фармацевтической композиции по п.1, характеризующийся тем, что действующее вещество трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли (1-бензилиндолил-3-тио)уксусной кислоты смешивают с лактозой и картофельным крахмалом, далее полученную смесь увлажняют раствором связующего (2% раствор метилцеллюлозы), затем последовательно осуществляют влажное гранулирование,сушку и сухое гранулирование, гранулят опудривают магнием стеариновокислым. Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2