Уменьшение частоты спонтанных мутаций в клетках
Формула / Реферат
1. Способ уменьшения частоты спонтанных мутаций в клетке или организме путем введения в указанную клетку или организм по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК.
2. Способ получения клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций путем введения по меньшей мере в одну клетку организма по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК, и регенерации организма из указанной клетки, если данный организм является многоклеточным организмом.
3. Способ по п.1 или 2, в котором клетка является прокариотической клеткой.
4. Способ по п.3, в котором прокариотическая клетка является клеткой архебактерии или эубактерии.
5. Способ по п.4, в котором клетка эубактерии является клеткой грамположительной или грамотрицательной бактерии.
6. Способ по п.1 или 2, в котором клетка является эукариотической клеткой.
7. Способ по п.6, в котором эукариотическая клетка является грибной клеткой, животной клеткой или растительной клеткой.
8. Способ по любому из пп.1, 2 или 5-7, в котором организм является грибом, животным или растением.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором объединенное действие по меньшей мере двух мутаций приводит к усилению способности по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации.
10. Способ по п.9, в котором усилена способность системы репарации ошибочно спаренных оснований, системы пострепликативной репарации и/или системы SOS-репарации исправлять спонтанно возникающие мутации.
11. Способ по любому из пп.1-10, в котором по меньшей мере две мутации выбраны из мутации, приводящей к повышению экспрессии белка MutL или гомологичного ему белка, мутации, приводящей к повышению экспрессии белка MutS или гомологичного ему белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный ей белок, и аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного ей белка.
12. Способ по п.11, в котором повышение экспрессии MutL, MutS или гомологичного им белка достигается путем введения в клетку вектора, содержащего ген mutL, ген, кодирующий гомологичный белок MutL, ген mutS или ген, кодирующий гомологичный белок MutS, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих сверхэкспрессию MutL, MutS или гомологичного им белка.
13. Способ по п.12, в котором вектор является многокопийной плазмидой.
14. Способ по п.11 или 12, в котором регуляторная единица является индуцибельным или конститутивным промотором.
15. Способ по п.11, в котором повышение экспрессии MutL, MutS или гомологичного им белка достигается путем введения в хромосому (хромосомы) клетки-хозяина одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена mut под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц и/или путем введения одной или нескольких мутаций в указанные регуляторные единицы, контролирующие экспрессию нативного белка Mut, так, чтобы продуцирование соответствующего белка Mut увеличивалось по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа.
16. Способ по п.11, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV, представляет собой dinB10.
17. Способ по п.11, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III, представляет собой dnaE911.
18. Способ по любому из пп.1-17, в котором объединенное действие dinB10 и dnaE911 уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой или организмом дикого типа по меньшей мере в 10 раз.
19. Способ по любому из пп.1-18, в котором объединенное действие dinB10, dnaE911 и сверхэкспрессированного белка mutL уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой или организмом дикого типа по меньшей мере в 50 раз.
20. Способ по любому из пп.1-19, в котором объединенное действие по меньшей мере двух мутаций повышает жизнеспособность клетки.
21. Клетка с уменьшенной частотой спонтанных мутаций и/или повышенной жизнеспособностью, полученная способом по любому из пп.1-20, которая содержит по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК.
22. Клетка по п.21, которая является бактериальной, грибной, растительной или животной клеткой.
23. Организм с уменьшенной частотой спонтанных мутаций, полученный способом по любому из пп.1-20, где клетки этого организма содержат по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК.
24. Штамм E.coli MG1655dinB10, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17016).
25. Штамм E.coli MG1655dinB10 mutL::tet, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17017).
26. Штамм E.coli MG1655 dnaE zae::cm, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17018).
27. Штамм E.coli MG1655 dnaE zae::cm mutL::tet, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17019).
28. Штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zae::cm (DSM 17015).
29. Штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zae::cm mutL::tet (DSM 17014).
30. Штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zae::cm, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17020).
31. Штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zae::cm mutL::tet, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17021).
32. Способ создания экспрессирующей системы для белка, аминокислотная последовательность которого стабилизирована в отношении спонтанно возникающих мутаций, который включает в себя
a) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в геном клетки-хозяина, содержащей по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка; или
b) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка, и перенос указанного вектора в клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации; и
c) культивирование и/или поддержание клетки-хозяина в соответствующей среде.
33. Способ продуцирования белка, аминокислотная последовательность которого стабилизирована в отношении спонтанно возникающих мутаций, который включает в себя
a) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в геном клетки-хозяина, содержащей по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка; или
b) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка, и перенос указанного вектора в клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации;
c) культивирование клетки-хозяина в соответствующей среде в условиях, обеспечивающих экспрессию данного белка; и
d) выделение экспрессированного белка.
34. Способ по п.33, в котором белок выделяют из среды.
35. Способ по п.33, в котором белок экстрагируют из клетки-хозяина.
36. Способ по любому из пп.32-35, в котором белок является терапевтически пригодным белком, в частности, цитокином или фактором роста.
37. Способ по любому из пп.32-36, в котором вектор являетёя плазмидой, бактериофагом или космидой.
38. Способ по любому из пп.32-37, в котором регуляторная единица является промотором, сайтом связывания рибосомы, энхансером, сайленсером и/или 3'-концевым терминатором транскрипции.
39. Способ по любому из пп.32-38, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, функционально связана с лидерной последовательностью, направляющей перенос экспрессированного белка в клеточную органеллу, клеточный компартмент, внеклеточное пространство или среду.
40. Способ получения продукта ферментации путем культивирования в среде клетки, продуцирующей продукт ферментации, и/или по меньшей мере одного фермента, участвующего в образовании продукта ферментации, в котором геном клетки стабилизирован в отношении спонтанно возникающих изменений последовательности по меньшей мере двумя мутациями, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации.
41. Способ по п.40, в котором продукт ферментации является нуклеиновой кислотой, нуклеозидом, нуклеотидом, аминокислотой, белком, кислотой, углеводом, витамином, антибиотиком или алкалоидом.
42. Способ по любому из пп.32-41, в котором усилена способность системы репарации ошибочно спаренных оснований, функции исправления ошибок и/или системы SOS-репарации исправлять спонтанно возникающие мутации.
43. Способ по любому из пп.32-42, в котором по меньшей мере две мутации выбраны из мутации, приводящей к повышению экспрессии белка MutL или гомологичного белка, мутации, приводящей к повышению экспрессии белка MutS или гомологичного белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный ей белок, или аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного ей белка.
44. Способ по п.43, в котором повышение экспрессии MutL, MutS или гомологичного им белка происходит благодаря присутствию в клетке вектора, который содержит ген mutL, ген, кодирующий гомологичный белок MutL, ген mutS или ген, кодирующий гомологичный белок MutS, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих сверхэкспрессию MutL, MutS или гомологичного им белка.
45. Способ по п.43, в котором повышение экспрессии MutL, MutS или гомологичного им белка достигается путем введения в хромосому (хромосомы) клетки-хозяина одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена mut под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц и/или введения одной или нескольких мутаций в указанные регуляторные единицы, контролирующие экспрессию нативного белка Mut так, чтобы продуцирование соответствующего белка Mut увеличивалось по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа.
46. Способ по п.43, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV, представляет собой dinB10.
47. Способ по п.43, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III, представляет собой dnaE911.
48. Способ по любому из пп.32-47, в котором объединенное действие dinB10 и dnaE911 уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой дикого типа по меньшей мере в 10 раз.
49. Способ по любому из пп.32-48, в котором объединенное действие dinB10, dnaE911 и сверхэкспрессированного белка mutL уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой дикого типа по меньшей мере в 50 раз.
50. Способ по любому из пп.32-49, в котором объединенное действие по меньшей мере двух мутаций повышает жизнеспособность клетки.
51. Способ по любому из пп.32-50, в котором клетка является прокариотической или эукариотической клеткой.
52. Способ по п.51, в котором клетка является клеткой грамположительной или грамотрицательной бактерии.
53. Способ по п.51, в котором клетка является грибной клеткой, животной клеткой или растительной клеткой.
54. Способ по любому из пп.32-53, в котором клетка является клеткой по любому из пп.21, 22 или 24-31 или полученной способом по любому из пп.1-20.
55. Способ по любому из пп.32-54, в котором клетку культивируют в жидкой среде.
56. Способ по п.55, в котором клетку культивируют в непрерывной культуре или периодической культуре.
57. Способ по любому из пп.32-56, в котором клетка является иммобилизованной.
58. Способ по любому из пп.32-54, в котором клетку культивируют на твердой или полутвердой среде.
59. Способ по любому из пп.40-58, в котором продукт ферментации выделяют из клетки.
60. Способ по любому из пп.40-58, в котором продукт ферментации выделяют из среды.
61. Белок, полученный способом по любому из пп.32-60.
62. Продукт ферментации, полученный способом по любому из пп.40-60.
Текст
009058 Настоящее изобретение относится к способам уменьшения частоты спонтанных мутаций в клетках или организмах, к способам получения таких клеток и организмов, к клеткам и/или организмам с уменьшенной частотой спонтанных мутаций, к способам создания экспрессирующих систем для белков, к способам продуцирования белков и продуктов ферментации с использованием клеток с уменьшенной частотой спонтанных мутаций. Мутация является отличительным признаком живых систем и создает материал для естественной селекции. Такие организмы как бактерии постоянно подвергаются спонтанным мутациям. Частота мутаций изменяется в широких пределах в зависимости от организма, например от величины определенного гена и чувствительности гена к инактивации парой оснований в положениях замещения. В Escherichiacoli число мутаций в геноме на одну репликацию генома равно g = 0,0025, и частота мутаций в паре оснований на одну репликацию соответствует b = 5,410-10 при величине генома, составляющей 4,6106 пар оснований. Частота мутаций даже в одном хорошо определенном пути, таком как G-CА-Т, может изменяться более 2000 раз на разных сайтах в одном гене, главным образом под мало изученным влиянием последовательности локальной ДНК и структуры ДНК. Как типы мутаций, так и вызывающие их процессы являются весьма разнобразными и исследованы лишь частично. Мутации имеют также важное значение в многоклеточных организмах. Однако здесь необходимо различать два разных типа изменений генетического материала, а именно мутации в гаметах, то есть гаметические мутации, и изменения в клетках организма, то есть соматические мутации. Если гаметические мутации передаются по наследству, то соматические мутации таким свойством не обладают. Однако соматические мутации могут иметь важное значение, так как они способствуют развитию рака. При обнаружении гаметических мутаций, в частности, у человека, и измерении частоты мутаций у человека возникают трудности, связанные с проблемой диплоидии. Большинство прямых мутаций являются рецессивными, и поэтому не могут быть обнаружены, если в зиготе не образуются две копии мутантного аллеля. Реверсии обычно происходят гораздо реже, так как существует намного больше способов мутации гена по сравнению с реверсией существующей мутации. В результате выполнения исследований in vivo с использованием клеток человека in vitro установлено, что общая частота мутаций у человека аналогична частоте мутаций, измеренной в разных прокариотических и эукариотических микроорганизмах. Мутации, такие как наследуемые изменения генетического материала, могут представлять собой обширные мутации, в частности, на уровне хромосомы, или точковые мутации, которые не могут рассматриваться как цитологические аномалии. Точковые мутации включают в себя замены пар оснований,такие как транзиции, трансверсии и мутации со сдвигом рамки. Последствия мутаций, связанных с заменой оснований, в областях, кодирующих белок гена, зависят от типа замены и ее места. Такие замены пар оснований могут быть молчащими, то есть не вызывающими появления нового аминокислотного остатка в белковой последовательности. Однако они могут также вызывать замену аминокислот. Такие миссенсмутации могут иметь очень серьезные последствия, как, например, в случае серповидно-клеточной анемии, незначительные последствия или могут вообще не иметь последствий. И наконец, замены оснований в области, кодирующей белок, могут вызывать мутацию аминокислотного кодона с превращением в терминирующий кодон или наоборот. Мутация первого типа, вызывающая образование преждевременно укороченного белка, определяется как нонсенс-мутация. Мутации, связанные с заменой оснований, могут также возникать в последовательностях, участвующих в регуляции экспрессии гена, например в промоторах, 5'-концевых регуляторных областях генов или в интронах, и могут влиять на их транскрипцию,трансляцию или сплайсинг. Многие -талассемии являются результатом неструктурных мутаций данного типа, которые влияют на уровень экспрессии генов гемоглобинов. Мутации со сдвигом рамки возникают в результате инсерции или делеции одного или нескольких (но не более трех) нуклеотидов в кодирующей области гена. Подобная мутация вызывает изменение рамки считывания. Мутация такого типа изменяет все аминокислоты в нижней области и с высокой степенью вероятности создает нефункциональный продукт, так как такой белок может существенно отличаться от нормального белка. Спонтанные мутации могут возникать в результате естественных процессов в клетке, и их следует отличать от индуцированных мутаций, то есть от мутаций, возникающих в результате взаимодействия ДНК с внешним агентом или мутагеном. Важным источником спонтанных мутаций являются ошибки в репликации ДНК, например, возникающие вследствие неправильного действия ДНК-полимеразы. Частота, с которой ДНК-полимеразы вызывают ошибки, влияет на частоту спонтанных мутаций, при этом было установлено, что разные ДНК-полимеразы обладают разной степенью точности. Одним важным фактором, влияющим на точность ДНК-полимеразы, является наличие исправляющей ошибки 3'-5'-концевой экзонуклеазы, которая удаляет неправильно спаренные основания, вставленные полимеразой. Функцией 3'-5'-концевой экзонуклеазы является предотвращение неправильного введения оснований во время репликации ДНК и мутаций. Другим важным источником спонтанных мутаций являются структурные изменения оснований нуклеиновых кислот, именуемые таутомеризацией. Основания могут существовать в двух формах, с превращением из одной формы в другую, и наоборот. Например, гуанин может существовать в кето-форме и-1 009058 форме енола. Разные таутомерные формы оснований обладают разными свойствами спаривания. Если во время репликации ДНК остаток G находится в форме енола, ДНК-полимераза добавляет к нему остаток Т вместо нормального остатка С. Поэтому таутомеризация является причиной транзиций. Другим мутагенным процессом, происходящим в клетках, является спонтанное разрушение оснований. В клетках достаточно часто происходит дезаминирование цитозина, с образованием урацила. Дезаминирование может быть устранено в результате специального процесса репарации, который позволяет обнаружить урацил, обычно отсутствующий в ДНК; в противном случае произойдет спаривание U с А, которое может вызвать транзицию C:G в Т:А во время репликации ДНК. Третьим типом часто возникающего спонтанного повреждения ДНК является разрушение оснований свободными радикалами кислорода. Указанный процесс возникает в клетках в результате окислительного метаболизма, а также вызывается физическими агентами, такими как радиация. Важным продуктом окисления является 8-гидроксигуанин, который ошибочно спаривается с аденином, вызывая трансверсии G:C в Т:А. Еще одним типом спонтанного повреждения ДНК является алкилирование, добавление алкильных групп к основаниям или остову ДНК. Алкилирование происходит в результате взаимодействия с ДНК таких соединений как Sаденозилметионин. Алкилированные основания могут подвергаться спонтанному разрушению или ошибочному спариванию. Кроме того, спонтанные мутации со сдвигом рамки могут быть также вызваны механизмом, именуемым "смещенным ошибочным спариванием" между матричной цепью и вновь синтезированной цепью во время репликации ДНК. Спонтанные мутации возникают произвольно на любом сайте генома, при этом большинство спонтанных мутаций являются вредными для пораженного организма, и вероятность появления благоприятной мутации очень низка. Поэтому организмы создали механизмы самозащиты от слишком большой частоты мутаций. Такие защитные механизмы распознают и исправляют ошибочные спаривания, возникшие в ДНК в результате репликации или спонтанного дезаминирования ДНК, а также распознают и удаляют потенциально мутагенные изменения, происходящие в результате взаимодействия ДНК с экзогенными или эндогенными мутагенами. В частности, мутации являются крайне нежелательными в биотехнологических процессах, таких как процессы ферментации. Поскольку мутации могут возникать в любой части генома ферментирующей клетки, они могут влиять на образование или состав продукта ферментации. Например, если продуктом ферментации является белок, мутация последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, может вызывать образование варианта белка с измененной аминокислотной последовательностью. Даже если мутация возникает в незначительной части ферментирующих клеток, это может привести к получению конечного белка, загрязненного таким вариантом. Подобный результат может иметь серьезные непредсказуемые последствия в тех случаях, когда белок предназначен для лечения человека, например, при изменении антигенных свойств белка. Возникновение мутаций в популяции ферментирующих клеток может также повлиять на скорость образования продукта, если, например, такая мутация поражает регуляторный путь в верхней области, в частности, фермент, участвующий в образовании продукта ферментации, или регуляторную единицу, контролирующую экспрессию требуемого продукта ферментации. Кроме того, даже если мутации являются редкими и поражают лишь незначительную часть популяции ферментирующих клеток, такие мутации могут быстро распространяться в такой популяции, если они сообщают пораженным клеткам избирательное преимущество по сравнению с немутировавшими клетками. В частности, в непрерывных культурах с постоянным удалением клеток для поддержания устойчивого состояния при длительном культивировании может происходить постепенное сокращение числа немутировавших клеток по сравнению с мутировавшими клетками. Другой причиной, по которой мутации, в частности, в процессе ферментации, являются весьма нежелательными, является феномен так называемой мутации в стационарной фазе, который именуется также адаптивной мутацией. Когда популяции микроорганизмов подвергают нелетальному отбору во время стационарной фазы ферментации, очень часто возникают мутации, ослабляющие давление отбора(Cairns et al., Genetics, 128 (1991), 695-701). Даже если первоначально кажется, что возникают только полезные мутации, в настоящее время установлено, что отобранные мутации сопровождаются неотобранными мутациями, то есть данный процесс не направлен на полезные гены (Foster, J. Bacteriol., 179 (1997),1550-1554). Большинство исследований в области адаптивных мутаций было выполнено с использованием штамма Escherichia coli, который не может утилизировать лактозу (Lac-) , но легко приобретает такую способность (Lac+), когда лактоза является единственным источником углерода. Процесс возникновения адаптивной мутации не аналогичен процессу, вызывающему мутации Lac+ во время нормального роста. В отличие от мутаций, обусловленных ростом, почти все адаптивные мутации Lac+ зависят от функций рекомбинации, таких как гомологичная функция рекомбинации системы репарации двунитевого разрыва(DSB) RecBCD E.coli (Cairns et al., Genetics, 128 (1991), 695-701; Foster, Annu. Rev. Microbiol., 47 (1993),467-504; Harris et al., Science, 264 (1994), 258-260). Поэтому техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, состоит в создании средств и способов продуцирования клеткой или организмом продукта ферментации, такого как белок,-2 009058 которые защищают и/или стабилизируют клетку или организм от спонтанных мутаций, в частности, во время стационарной фазы процесса ферментации, благодаря чему в течение длительного времени сохраняется постоянная скорость образования и состав продукта ферментации, такого как белок. Настоящее изобретение позволяет решить вышеуказанную техническую проблему благодаря созданию способа уменьшения частоты спонтанных мутаций в клетке или организме путем введения в указанную клетку или организм по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК. Настоящее изобретение позволяет также решить вышеуказанную техническую проблему благодаря созданию способа получения клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций путем введения по меньшей мере в одну клетку организма по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК, если такой организм является многоклеточным организмом. В соответствии с настоящим изобретением, способность механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанные мутации значительно усиливается при введении в клетку по меньшей мере двух разных мутаций, которые воздействуют на разные системы репарации. Усиление способности механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанные мутации, достигаемое в результате введения по меньшей мере двух разных мутаций согласно настоящему изобретению, уменьшает частоту устойчиво наследуемой мутации в клетке и, следовательно, общую частоту мутаций. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, было обнаружено, что в результате изменения определенных механизмов репарации клеточной ДНК, в частности, путем введения специфических мутаций, усиливающих способность указанных систем репарации ДНК более эффективно исправлять спонтанные мутации, можно значительно уменьшить частоту спонтанных мутаций в клетках дикого типа. Например, в соответствии с настоящим изобретением, было обнаружено, что сверхэкспрессия белка MutS во время фазы роста значительно уменьшает мутабильность клетки-хозяина. Однако подобный вывод противоречит результатам, ранее полученным в данной области. В патенте США 6656736 указано, что сверхэкспрессия диких или мутантных белков MMR в дрожжах или других организмах вызывает нарушение системы репарации ошибочно спаренных оснований, в результате чего дрожжевые клетки с такой нарушенной системой репарации ошибочно спаренных оснований становятся гипермутабильными. Кроме того, бактериальный штамм, несущий делецию dinB10 и аллель-антимутатор dnaE911, характеризуется 10-кратным уменьшением мутабильности по сравнению с соответствующим штаммом дикого типа. Дополнительная сверхэкспрессия белка MutL, имеющего непосредственное отношение к системе репарации ошибочно спаренных оснований, снижает мутабильность в 50 раз. Можно показать,что в другой системе реверсия специфических мутаций со сдвигом рамки может быть уменьшена даже в 1000 раз. Подобным образом можно значительно уменьшить не только частоту мутаций, обусловленных ростом, но и частоту адаптивных мутаций, то есть частоту мутаций, обусловленных стационарной фазой. Весьма удивительным является то, что влияние нескольких мутаций на частоту спонтанных мутаций в клетке-хозяине носит синергичный, а не аддитивный характер. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что введение указанных мутаций не только усиливает способность механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанные мутации, но и значительно повышает жизнеспособность клетки. Например, было установлено, что сверхэкспрессия белка MutL в ферментирующем бактериальном штамме повышает жизнеспособность клетки примерно в 103 раз. Уменьшение частоты спонтанных мутаций в клетках и повышение жизнеспособности клеток согласно настоящему изобретению путем введения нескольких мутаций, усиливающих способность механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации, имеет, в частности,важное значение для клеток или штаммов, используемых для экспрессии и/или образования продуктов ферментации, таких как белки. При использовании таких клеток аминокислотная последовательность полученных белковых продуктов может оставаться неизменной на протяжении многих поколений продуцирующих клеток или организмов. Белковые препараты, полученные с использованием таких клеток,не загрязняются вариантами белка вследствие мутации и поэтому не создают проблем при применении в качестве лечебных средств и не вызывают нежелательных эффектов в организме реципиента. Использование клеток согласно настоящему изобретению с усиленными механизмами репарации клеточной ДНК является особенно полезным при продуцировании рекомбинантных белков. Однако использование клеток согласно настоящему изобретению с усиленными механизмами репарации клеточной ДНК не ограничено продуцированием белков ферментирующими клетками. Клетки согласно настоящему изобретению можно использовать для получения продуктов ферментации всех типов, таких как антибиотики, органические кислоты и т.д. Значительно уменьшенная частота спонтанных мутаций в таких клетках позволяет не только сохранять постоянный состав продукта в течение длительного времени, но и поддерживать высокие темпы образования продукта, так как благодаря уменьшению частоты мутаций в клетках-хозяевах стабильными и неизменными остаются факторы, контролирующие эффективную скорость образования продукта. В контексте настоящего изобретения термин "мутация, усиливающая механизм репарации клеточ-3 009058 ной ДНК", означает любое наследуемое изменение той части генома клетки, которая кодирует белки или ферменты, относящиеся по меньшей мере к одному специфическому механизму репарации ДНК, или любое наследуемое изменение той части генома, которая участвует в регуляции экспрессии компонентов механизма репарации клеточной ДНК, определяющих лучшее узнавание и исправление ошибок в геноме клетки или организма, произошедших в ДНК вследствие репликации, спонтанного дезаминирования ДНК или любых других естественных процессов, вызывающих спонтанные мутации. Поэтому "мутация,усиливающая механизм репарации клеточной ДНК", обеспечивает более эффективную и более точную коррекцию спонтанно возникающих ошибок в геноме данной клетки или организма. Поэтому "мутация, усиливающая механизм репарации клеточной ДНК", уменьшает частоту устойчиво наследуемых мутаций в популяции, то есть уменьшает частоту мутаций в такой популяции. В контексте настоящего изобретения термин "частота мутаций" определяется как отношение числа мутаций к общему числу особей в популяции. "Мутация, усиливающая механизм репарации клеточной ДНК", также уменьшает частоту мутаций, определяемую как вероятность мутации данного гена во время репликации и устойчивое наследование данной мутации гена. Кроме того, в контексте настоящего изобретения мутация, усиливающая механизм репарации клеток ДНК, вызывает также уменьшение мутагенеза, опосредуемого транспозоном. Поэтому благодаря наличию мутации, усиливающей механизм репарации клеточной ДНК, клетка или организм характеризуется очень низкой частотой спонтанных мутаций, которая, в частности, является значительно ниже аналогичного показателя соответствующей клетки или организма без мутации. Мутации, усиливающие механизм репарации клеточной ДНК, включают, не ограничиваясь ими, делеции структурных генов, кодирующих ферменты, участвующие в репарации клеточной ДНК, например, делецию структурного гена вызывающей ошибки ДНК-полимеразы; замены, делеции, инверсии и/или добавления оснований в структурном гене, кодирующем фермент, участвующий в репарации клеточной ДНК,которые, например, могут создавать антимутаторный фенотип или повышать точность ДНК-полимеразы,вызывать сверхэкспрессию белка, продуцирование которого сокращается во время определенной фазы роста, дифференцировки или размножения клетки или организма, уменьшать экспрессию белка, например, вызывающей ошибки ДНК-полимеразы и т.д. Из контекста настоящего изобретения следует, что каждая отдельная мутация, усиливающая механизм репарации клеточной ДНК, может также усиливать второй или третий механизм репарации клеточной ДНК. Кроме того, каждая отдельная мутация, усиливающая механизм репарации клеточной ДНК, может также повышать жизнеспособность клетки. В контексте настоящего изобретения термин "две мутации, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК" означает, что обе мутации влияют по меньшей мере на два разных механизма репарации ДНК, благодарячему указанные системы репарации ДНК приобретают способность более эффективно и/или более точно исправлять спонтанно возникающие мутации в геноме по сравнению с немутировавшими системами репарации ДНК. В контексте настоящего изобретения термин "механизм репарации клеточной ДНК" означает ферментативный механизм или систему, с помощью которых клетка или организм может распознавать и исправлять любую ошибку в геноме, возникающую в результате репликации ДНК и/или измененений и повреждений оснований. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанные механизмы репарации клеточной ДНК включают систему репарации ошибочно спаренных оснований, систему пострепликативной (рекомбинационной) репарации и систему SOS-репарации. Мутации, усиливающие репарацию ошибочно спаренных оснований, в частности, представляют собой такие мутации, которые позволяют устранить ситуацию, когда сокращается количество одного из белков, участвующих в репарации ошибочно спаренных оснований. На долю "системы репарации ошибочно спаренных оснований" (MMR) приходится 99% всех случаев репарации в клетках. Указанная система в наибольшей степени способствует точности репликации в Е. coli, где она также использует другие пути репарации ДНК, привлекая свои белки к репарации ДНК в процессе транскрипции и репарации очень коротких участков. MMR также усиливает генетическую устойчивость, подавляя рекомбинацию между случаями неточной гомологии, которая в противном случае может вызывать перестройку генома. Репарация ошибочно спаренных пар также стимулирует генетическую устойчивость, редактируя вырезание транспозонов. Гомологи белков MMR E.coli выполняют аналогичные функции в других бактериях, дрожжах, мышах и человеке (Modrich, Science, 266 (1994), 19591960; Radman et al., Phil. Trans. R. Soc. London, 347 (1995), 97-103). В E.coli в MMR участвуют генные продукты mutH, mutL, mutS и mutU. Система узнает вновь синтезированную цепь, а не исходную цепь благодаря метилированию. Генный продукт mutS узнает ошибочно спаренные основания ДНК и связывается с ними. Генный продукт mutL взаимодействует с MutS после связывания с ошибочно спаренными основаниями и, как считается, координирует MutS с MutH. Затем экзонуклеаза MutH разрывает неметилированную новую цепь ДНК. Хеликаза MutU проникает в ДНК на месте одноцепочечного разрыва и заменяет разорванную цепь. Мутации, усиливающие репарацию ошибочно спаренных пар, в частности,представляют собой такие мутации, которые позволяют устранить ситуацию, когда сокращается количество одного из белков, участвующий в репарации ошибочно спаренных оснований. Система пострепликативной репарации представляет собой систему, которая устраняет поврежде-4 009058 ния ДНК в следующем цикле репликации. В результате репликации поврежденной ДНК в дочерних цепях образуются разрывы. Отсутствующая генетическая информация заполняется соответствующими областями ДНК из родительской цепи путем рекомбинации. Репликация поврежденной ДНК, процесс, который именуется также синтезом с замещением разрывов, является основным источником точковых мутаций. В последнее время было достигнуто гораздо большее понимание указанного процесса благодаря идентификации участвующих в нем ДНК-полимераз (Friedberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (2000),5681-5683). Реакция SOS представляет собой совокупность клеточных реакций, индуцируемых клетками под воздействием разных генотоксических и метаболических стрессов, которые обычно препятствуют репликации ДНК. Действие системы SOS-репарации опосредовано белками LexA и RecA. Белок LexA действует в качестве репрессора примерно 30 разных генов, включая recА и 1 ехА. Сигнал SOS индуцирует одноцепочечная ДНК, с которой связывается RecA и активируется в виде копротеазы (RecA). RecA стимулирует протеолитическое саморасщепление репрессора lexA и некоторых репрессоров фага, осуществляя таким образом дерепрессию регулона SOS. Escherichia coli имеет по меньшей мере три SOSиндуцибельные полимеразы: полимераза II (Pol II), полимераза IV (Pol IV) и полимераза V (Pol V). В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере две мутации выбирают из мутации,повышающей экспрессию белка MutL или гомологичного белка, из мутации, повышающей экспрессию белка MutS или гомологичного белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный белок, и аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного белка. В контексте настоящего изобретения термин "аллель-антимутатор" означает аллель, который вызывает уменьшение частоты спонтанных мутаций в клетке или организме по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения повышение экспрессии MutL или гомологичного белка и экспрессии MutS или гомологичного белка достигается путем введения в клетку вектора, содержащего ген mutL или ген, кодирующий гомологичный белок MutL, и ген mutS или ген, кодирующий гомологичный белок MutS, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих сверхэкспрессию соответствующего белка Mut. Указанный вектор предпочтительно является многокопийной плазмидой. Регуляторная единица предпочтительно является индуцибельным или конститутивным промотором. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения повышение экспрессии MutL или гомологичного белка и экспрессии MutS или гомологичного белка достигается путем изменения указанных регуляторных единиц, направляющих экпрессию нативного белка Mut клетки-хозяина или организма-хозяина на продуцирование клеткой больших количеств нативного белка Mut по сравнению с обычно продуцируемыми количествами. Из вышеизложенного следует, что регуляторные единицы, направляющие транскрипцию локализованной в хромосоме нативной нуклеотидной последовательности,кодирующей соответствующий белок Mut, в комплементарную последовательность РНК, и/или трансляцию полученной кодирующей последовательности РНК в полипептидную цепь белка Mut, мутируют или заменяются другими приемлемыми гомологичными или гетерологичными регуляторными единицами с достижением более высокого продуцирования нативного белка Mut по сравнению с имеющим место в соответствующей клетке или организме дикого типа. В другом варианте осуществления изобретения сверхэкспрессия соответствующего белка Mut достигается путем введения одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена mut под функциональным контролем соответствующих регуляторных единиц в хромосому (хромосомы) клеткихозяина, при этом дополнительный ген(ы) mut может быть нативным или гетерологичным геном, выделенным из другого вида. В предпочтительном варианте осуществления изобретения аллель-антимутатор гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный белок, представляет собой dinB10, который фактически является делецией гена dinB. dinB-кодированная ДНК-полимераза IV (Pol IV) относится к недавно идентифицированному Y-семейству или семейству нуклеотидилтрансфераз UmuC/DinB вызывающих ошибки ДНКполимераз. Указанное семейство представлено подсемействами UmuC, DinB, Rad30 и Rev1 (Gerlach etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999), 11922-11927). Установлено, что dinB-кодированная ДНКполимераза IV E.coli участвует в спонтанном мутагенезе и в процессе репликации поврежденной ДНК,который известен как синтез с замещением разрывов (TLS) и является основным источником точковых мутаций. Подобно ДНК-полимеразе V полимераза IV также индуцируется как часть реакции SOS на повреждение ДНК. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения использован аллель-антимутатор гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III, который предпочтительно является dnaE911. На долю холофермента ДНК-полимеразы III (Pol III HE) приходится более 90% синтеза клеточной ДНК, и указанный фермент необходим также для пострепликативного исправления ошибочно спаренных оснований. Установлено, что холофермент полимераза III эффективно осуществляет синтез ДНК с замещением разрывов после неосновных сайтов. Ген dnaE E.coli кодирует -субъединицу холофермента ДНК-5 009058 полимеразы III, которая сообщает активность полимеразе. Поэтому -субъединица является одним из главных определителей точности. В публикации Fijalkowska and Schaaper, J. Bact., 177 (1995), 5979-5986,описаны несколько аллелей-антимутаторов dnaE, которые подавляют повышенную мутабильность штамма с дефектным геном mutL, подвергнутым репарации ошибочно спаренных оснований. В соответствии с настоящим изобретением объединенное действие мутаций dinB10 и dnaE911 уменьшает частоту спонтанных мутаций в клетке по сравнению с клеткой или организмом дикого типа по меньшей мере в 10 раз. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения объединенное действие dinB10, dnaE911 и сверхэкспрессированного белка MutL уменьшает частоту спонтанных мутаций в клетке по сравнению с клеткой или организмом дикого типа по меньшей мере в 50 раз. По меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает механизмы репарации клеточной ДНК и/или повышает жизнеспособность клетки, могут быть введены в клетку любым известным методом, в частности, путем мутагенеза данной клетки с целью мутации гена, который, как известно, относится к одной из систем репарации клеточной ДНК, или путем введения уже известных мутаций или аллелей в указанную клетку. Существует целый ряд разных методов мутагенеза, которые включают, не ограничиваясь ими, неспецифический мутагенез, сайт-направленный мутагенез, мутагенез олигонуклеотидного кластера или точковый мутагенез при помощи вызывающей ошибку PCR. Неспецифический мутагенез, например,вызывает образование большого числа произвольно распределенных мутаций с заменой нуклеотидов во фрагментах клонированной ДНК в результате обработки химическими веществами, такими как азотистая кислота, гидразин и т.д. Была создана вызывающая ошибку PCR для введения произвольных точковых мутаций в клонированные гены. Модификации, которые уменьшают точность реакции PCR, включают увеличение концентрации MgCl2, добавление MgCl2 или изменение относительных концентраций четырех dNTP. Указанные традиционные методы мутагенеза сфокусированы на изменении отдельных генов,обладающих дискретными и селектируемыми фенотипами. Сущность данных методов заключается в клонировании гена, выполнении анализа, позволяющего контролировать ген и/или его функцию, мутировании выбранных положений в гене и отборе вариантов гена для изменения функции данного гена. Вариант, обладающий измененными функциями, затем может быть введен и экспрессирован в клетке желаемого типа. Для получения требуемых функций гена могут быть выполнены повторные циклы методов мутагенеза. Другим методом изменения функции гена является рекомбинация с использованием одной из многочисленных хорошо известных систем. В соответствии с целями настоящего изобретения можно использовать уже существующие аллели или мутации. Такие существующие аллели или мутации могут быть введены в клетку любыми известными методами. По меньшей мере две мутации согласно настоящему изобретению можно ввести в клетку любыми известными приемлемыми методами, которые включают, не ограничиваясь ими, трансформацию, конъюгацию, трансдукцию, сексдукцию, инфицирование и/или электропорацию. В контексте настоящего изобретения термин "трансформация" означает поглощение клеткой, например, микробной клеткой, выделенной предпочтительно очищенной молекулы нуклеиновой кислоты из окружающей среды. Термин "конъюгация" означает опосредуемый плазмидой перенос бактериальной плазмиды из одной бактериальной клетки в другую бактериальную клетку в результате межклеточного контактирования. Механизм переноса обычно кодируется плазмидами или конъюгирующими транспозонами. Примерами таких плазмид являются конъюгирующие или хелперные плазмиды. Конъюгация является одним из основных путей генетического обмена между разными филогенетическими группами прокариотических клеток и между прокариотами и эукариотами. Термин "трансдукция" означает перенос молекулы нуклеиновой кислоты из одной бактериальной клетки в другую бактериальную клетку бактериофагом, который включает высвобождение бактериофага из одной клетки и последующее инфицирование другой клетки. Существуют два типа трансдукции. Специализированная трансдукция может происходить во время лизогенного жизненного цикла умеренного бактериофага, в результате чего генетический материал бактерий может заменить часть генома бактериофага. Указанный фрагмент бактериальной ДНК, реплицирующийся в виде части генома фага, может быть перенесен фагом в другую клеткуреципиент. В случае генерализованной трансдукции весь геном литического фага может быть заменен бактериальной ДНК. Термин "электропорация" означает способ, в соответствии с которым клетки смешивают с молекулами нуклеиновой кислоты и затем в течение короткого времени подвергают воздействию импульсов высокого электрического напряжения. Мембрана клетки-хозяина становится проницаемой, позволяя чужеродным нуклеиновым кислотам проникать в указанную клетку-хозяина. Клетка, используемая в способе уменьшения частоты спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению и в способе создания клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению, может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой. Термины "эукариотическая клетка" и "эукариотическая клетка-хозяин" означают любые клетки, которые имеют мембраносвязанное ядро, органеллы и генетический материал, локализованный в хромасомах, где ДНК объединена с гистонами. Цитоскелет является другим отличительным признаком, присущим эукариотам, который представляет собой сеть белковых нитей, состоящих в основном из актина и тубулина, которые присоединены к клеточной мембране и пересекают периферию клетки. "Эукариоты"-6 009058 включают таксономические царства одноклеточных организмов, грибов, растений и животных. Эукариоты могут представлять собой одноклеточные организмы, такие как протисты, например парамеции и амебы, или многоклеточные организмы, такие как разнообразные грибы, животные и растения. Предпочтительный вариант осуществления способов уменьшения частоты спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению относится к использованию животных клеток, растительных клеток или грибных клеток. Термины "прокариотическая клетка" и "прокариотическая клетка-хозяин" означают любую клетку,в которой геном свободно локализован в цитоплазме в виде кольцевой структуры, то есть клетку, в которой геном не окружен ядерной мембраной. Прокариотическая клетка далее отличается тем, что она необязательно нуждается в кислороде и ее рибосомы меньше, чем у эукариотических клеток. Прокариотические клетки включают архебактерии и эубактерии. В зависимости от состава оболочки клетки эубактерии можно разделить на грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии и цианобактерии. В предпочтительном варианте осуществления способа уменьшения частоты спонтанных мутаций или создания соответствующих организмов согласно настоящему изобретению используемой прокариотической клеткой является клетка архебактерии или эубактерии, причем особенно предпочтительными прокариотическими клетками являются грамотрицательные бактерии, грамположительные бактерии или цианобактерии. Настоящее изобретение относится также к клетке с уменьшенной частотой спонтанных мутаций и/или с повышенной жизнеспособностью, которую получают способом уменьшения частоты спонтанных мутаций в клетке или организме согласно настоящему изобретению или способом создания клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению, при этом указанная клетка содержит по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает по меньшей мере два механизма репарации клеточной ДНК. В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетка является бактериальной клеткой, например грамотрицательной бактерией, такой какE.coli, или грамположительной бактерией, такой как Bacillus subtilis, грибной клеткой, растительной клеткой или животной клеткой, такой как клетка насекомого или клетка млекопитающего. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения бактерия относится к штаммам, включающим E.coli MG1655dinB10, содержащий плазмиду pmutL, E.coli MG1655dinB10 mutLtet,содержащий плазмиду pmutL, E.coli MG1655 dnaE zaecm, содержащий плазмиду pmutL, E.coli MG1655MG1655dinB10 dnaE zaecm mutLtet, E.coli MG1655dinB10 dnaE zaecm, содержащий плазмиду pmutL,или E.coli MG1655dinB10 dnaE zaecm mutLtet, содержащий плазмиду pmutL. Настоящее изобретение относится также к использованию клеток согласно настоящему изобретению с уменьшенной частотой спонтанных мутаций и/или повышенной жизнеспособностью для создания организмов с уменьшенной скоростью спонтанных мутаций, к использованию клеток согласно настоящему изобретению в качестве клеток-хозяев для экспрессии белка, к использованию клеток согласно настоящему изобретению в качестве ферментирующих организмов для продуцирования продуктов ферментации, к использованию клеток согласно настоящему изобретению в качестве модельной системы для изучения влияния лекарственных средств-кандидатов, к использованию клеток согласно настоящему изобретению в качестве модельной системы для изучения заболеваний, поражающих человека, животных или растения, и к использованию клеток согласно настоящему изобретению для создания, в частности, для селекции или культивирования трансгенных организмов. Специалисту в данной области должно быть известно много способов создания многоклеточного организма, в частности, растения или животного, из одиночных клеток. Многоклеточные организмы,созданные из клеток согласно настоящему изобретению, также должны характеризоваться уменьшенной частотой спонтанных мутаций. Настоящее изобретение относится также к организму с уменьшенной частотой спонтанных мутаций, полученному способом уменьшения частоты спонтанных мутаций в клетке или организме согласно настоящему изобретению или способом создания клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению, причем клетки такого организма содержат по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает по меньшей мере два механизма репарации клеточной ДНК и/или повышает жизнеспособность клеток. В предпочтительном варианте осуществления изобретения многоклеточным организмом является гриб, такой как Saccharomyces cerevisiae или Aspergillus nidulans, растение, в частности, растение сельскохозяйственного назначения, такое как кукуруза (Zea mays), или животное, в частности, млекопитающее, например, млекопитающее, которое может быть использовано в качестве модельной системы для изучения данного заболевания или действия лекарственных средств-кандидатов при терапевтическом лечении данного заболевания. Настоящее изобретение относится также к использованию организмов согласно настоящему изобретению в качестве хозяина для экспрессии и/или продуцирования белков, имеющим экономическое,медицинское или сельскохозяйственное значение, к использованию организмов согласно настоящему изобретению для селекции или культивирования трансгенных организмов, к использованию организмов согласно настоящему изобретению в качестве модельных систем для изучения заболеваний и к исполь-7 009058 зованию организмов согласно настоящему изобретению в качестве модельной системы для изучения действия лекарственных средств-кандидатов. Техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, может быть решена с помощью способа создания экспрессирующей системы для белка, содержащего аминокислотную последовательность, стабилизированную в отношении спонтанно возникающих мутаций, который включает:a) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в геном клеткихозяина, содержащей по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка; илиb) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка, и перенос указанного вектора в клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации; иc) культивирование и/или поддержание клетки-хозяина в соответствующей среде. Способ создания экспрессирующей системы для белка согласно настоящему изобретению относится, в частности, к созданию клетки-хозяина, в которой может происходить экспрессия белка и которая характеризуется очень низкой частотой спонтанных мутаций, в частности, более низкой, чем в других известных клетках-хозяевах. Поэтому экспрессирующая система, созданная способом согласно настоящему изобретению, значительно уменьшает вероятность того, что нуклеотидная последовательность,кодирующая данный белок и, следовательно, аминокислотную последовательность указанного белка,будет изменена мутациями. Экспрессирующая система, созданная способом согласно настоящему изобретению на основе клетки-хозяина согласно настоящему изобретению с низкой частотой спонтанных мутаций и повышенной жизнеспособностью, может быть использована для экспрессии и генерации белков, целостность которых будет сохранена в течение длительного времени. Экспрессирующая система согласно настоящему изобретению может быть особенно пригодна для продуцирования белков, предназначенных для использования в лечебных целях, в которых любые изменения аминокислотной последовательности, например, вызывающие изменение биологической активности или антигенных свойств белка, могут оказывать вредное влияние на терапевтическую пользу белка. Поэтому способ создания экспрессирующей системы согласно настоящему изобретению пригоден для устранения даже минимальных загрязнений получаемого белкового препарата мутировавшими, аберрантными белками. Экспрессирующая система, получаемая способом согласно настоящему изобретению на основе клетки-хозяина согласно настоящему изобретению с низкой частотой спонтанных мутаций, может быть использована для долговременного сохранения нуклеотидных последовательностей, кодирующих определенный белок, без необходимости регулярной проверки секвенированием наличия или отсутствия изменений в нуклеотидной последовательности. В контексте настоящего изобретения термин "экспрессирующая система" означает, в частности,клеточную систему, которая обеспечивает эффективную экспрессию белка, то есть продуцирование больших количеств данного белка в клетке. Термин "экспрессирующая система" относится, в частности,к клеточной среде, которая делает возможной транскрипцию нуклеотидной последовательности, кодирующей требуемый белок, в комплементарную последовательность РНК, сплайсинг данной последовательности РНК для удаления некодирующих фрагментов последовательности и трансляцию полученных таким образом кодирующих фрагментов последовательности РНК в полипептидную цепь белка. Термин"экспрессирующая система" относится также к клеточной среде, которая позволяет выполнять стадии посттрансляционного процессинга, такие как гликозилирование белка или удаление существующей лидерной последовательности из белка. Поэтому "создание экспрессирующей системы" означает, что нуклеотидная последовательность, кодирующая требуемый белок, должна быть функционально связана с соответствующими регуляторными единицами, контролирующими и направляющими экспрессию кодированного генного продукта в данной клеточной среде, и что должна быть получена соответствующая клетка-хозяин, в которой используемые регуляторные единицы функционируют с достижением оптимальной экспрессии белка. В соответствии с настоящим изобретением уменьшение частоты спонтанных мутаций и повышение жизнеспособности клетки-хозяина в системе для экспрессии белка достигается в результате использования по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации в любой нуклеиновой кислоте, присутствующей в клетке-хозяине. В частности, по меньшей мере две указанные мутации усиливают способность системы репарации ошибочно спаренных оснований, функции исправления ошибок и/или системы SOS-репарации исправлять спонтанно возникающие мутации. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанные мутации выбирают из мутации, повышающей экспрессию белка MutL или гомологичного белка, мутации, повышающей экспрессию белка MutS или гомологичного белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологич-8 009058 ный белок, и аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного белка. В одном варианте осуществления изобретения повышение экспрессии MutL или гомологичного белка и повышение экспрессии MutS или гомологичного белка можно быть достигнуто путем введения в клетку-хозяина вектора, содержащего ген mutL или ген, кодирующий гомологичный белок, и ген mutS или ген, кодирующий гомологичный белок, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, в результате чего происходит сверхэкспрессия соответствующего белка Mut по сравнению с соответствующей клеткой-хозяином дикого типа. Вектор, используемый для сверхэкспрессии белка MutL или MutS, предпочтительно является многокопийной плазмидой, содержащей соответствующий ген mut под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц. В предпочтительном варианте осуществления изобретения регуляторная единица, контролирующая сверхэкспрессию соответствующего гена mut, может быть индуцибельным или конститутивным промотором. В другом варианте осуществления изобретения повышение экспрессии MutL или гомологичного белка и повышение экспрессии MutS или гомологичного белка соответственно может быть достигнуто путем введения одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена mut в хромосому(хромосомы) клетки или введения одной или нескольких мутаций в регуляторные единицы, направляющие транскрипцию нативного, локализованного в хромосоме гена mut, благодаря чему указанная клетка продуцирует большее количество соответствующего белка Mut по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа. В предпочтительном варианте осуществления изобретения аллелем-антимутатором гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV, является dinB10. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения аллелем-антимутатором гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III, являетсяdnaE911. В соответствии с настоящим изобретением созданная экспрессирующая система может быть использована для экспрессии любого белка. В контексте настоящего изобретения термин "белок" означает молекулу, содержащую по меньшей мере две аминокислоты, соединенные амидной связью. Поэтому в соответствии с настоящим изобретением термин "белок" означает также пептид, например олигопептид,полипептид или часть природного белка, такую как домен. Аминокислотная последовательность экспрессируемого белка может соответствовать аминокислотной последовательности природного белка, то есть может представлять собой последовательность дикого типа. Белок, предназначенный для экспрессии экспрессирующей системой, может содержать аминокислотную последовательность, которая изменена по сравнению с аминокислотной последовательностью белка дикого типа, например, имеет другой аминокислотный состав и/или другую длину цепи. По сравнению с белком дикого типа экспрессируемый белок может иметь другие аминокислотные остатки в одном или нескольких положениях. По сравнению с белком дикого типа экспрессируемый белок может иметь усеченную или удлиненную цепь. Кроме того, экспрессируемый белок может обладать характеристиками, отличающимися от характеристик соответствующего белка дикого типа. Вышеуказанные отличающиеся признаки могут включать, не ограничиваясь ими, измененную теплостойкость, другую субстратную специфичность, другую активность, измененные или новые каталитические сайты и т.д. Экспрессируемый белок может также быть слитым белком, содержащим два или более отдельных полипептидов и, кроме того, содержащим один или несколько доменов второго полипептида. Такие изменения или мутации белка могут быть получены в результате выполнения соответствующих манипуляций в отношении нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, известных в данной области, до введения кодирующей белок нуклеотидной последовательности в геном клетки-хозяина с уменьшенной частотой спонтанных мутаций или в вектор, который затем вводят в клетку-хозяина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения экспрессируемый белок является рекомбинантным белком, то есть белком, измененным методами генетической инженерии и/или методами рекомбинантных ДНК. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения экспрессируемый белок может быть ферментом, который может быть использован для промышленного производства природных и неприродных соединений. Ферменты или соединения, продуцированные с помощью ферментов, могут быть использованы для производства лекарственных средств, косметических средств, продуктов питания и т.д. Экспрессируемый белок может также представлять собой вещество, применяемое для лечения человека и животных. Важными классами приемлемых в медицинском отношении белков являются, например, цитокины и факторы роста. В соответствии со способом согласно настоящему изобретению последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, вводят в геном или вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц. Регуляторные единицы, которые контролируют и направляют экспрессию гена и генного продукта, включают, не ограничиваясь ими, промоторы, сайты связывания рибосомы,энхансеры, сайленсеры, сайты полиаденилирования и/или 3'-концевые терминаторы транскрипции. Регуляторные единицы могут также включать лидерные или сигнальные последовательности, направляющие экспрессированный белок в соответствующий компартмент клетки-хозяина или из клетки. Использование таких регуляторных единиц зависит от типа клетки-хозяина. Хорошо известны регуляторные едини-9 009058 цы, которые могут быть использованы в определенной прокариотической или эукариотической клеткехозяине (см., например, Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Handbook, second edition (1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA). В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, клонируют в векторе. В качестве вектора предпочтительно используют плазмиды,бактериофаги, вирусы или космиды. Специалистам в данной области должно быть известно большое число приемлемых векторов для эукариотических или прокариотических клеток-хозяев, которые могут быть использованы для введения кодирующей белок нуклеотидной последовательности в данную клетку-хозяина. Кроме того, специалисту в данной области должны быть известны многочисленные методы клонирования кодирующей белок нуклеотидной последовательности, в соответствии с которыми указанную последовательность функционально связывают с регуляторными единицами, и введения нуклеотидных последовательностей в клетку-хозяина (см., например, Sambrook et al., 1989). Другим объектом настоящего изобретения является способ продуцирования белка, содержащего аминокислотную последовательность, стабилизированную в отношении спонтанно возникающих мутаций, который включает:a) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в геном клеткихозяина, содержащей по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка; илиb) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка, и перенос указанного вектора в клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации;c) культивирование клетки-хозяина в соответствующей среде в условиях, обеспечивающих экспрессию данного белка; иd) выделение экспрессированного белка. В зависимости от функционального связывания последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, с лидерной или сигнальной последовательностью, экспрессированный белок переносится в определенную клеточную органеллу, в определенный клеточный компартмент, во внеклеточное пространство или в среду, в которой культивируются клетки. Поэтому указанный белок может накапливаться в клетке или секретироваться из клетки. В предпочтительном варианте осуществления способа продуцирования белка согласно настоящему изобретению указанный белок выделяют из среды. В другом предпочтительном варианте осуществления способа продуцирования белка согласно настоящему изобретению белок экстрагируют из клетки-хозяина, например, из определенной клеточной органеллы. Кроме того, специалисту в данной области должны быть известны многочисленные методы выделения белка из клетки, клеточной органеллы или среды. В соответствии с настоящим изобретением любая эукариотическая или прокариотическая клетка может быть использована в качестве клетки-хозяина для экспрессии или генерации белка. Особенно предпочтительные примеры включают грибные клетки, животные клетки, растительные клетки, архебактерии, цианобактерии, грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии. Настоящее изобретение относится также к белку, получаемому способом согласно настоящему изобретению. Другим объектом настоящего изобретения является способ получения продукта ферментации путем культивирования клетки, продуцирующей продукт ферментации, и/или по меньшей мере одного фермента, участвующего в образовании продукта ферментации в среде, при этом геном клетки стабилизирован в отношении спонтанно возникающих изменений последовательности по меньшей мере двумя мутациями, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации. Таким образом, способ согласно настоящему изобретению относится к использованию клетки для ферментативных целей, то есть для продуцирования продукта ферментации, при этом геном клетки стабилизирован в отношении спонтанно возникающих изменений последовательности и поэтому характеризуется очень низкой частотой спонтанных мутаций. Кроме того, используемая клетка обладает повышенной жизнеспособностью. Благодаря использованию клеток с уменьшенной частотой спонтанных мутаций способ согласно настоящему изобретению гарантирует гораздо меньшую вероятность того, что нуклеотидная последовательность, кодирующая данный белок, и следовательно аминокислотная последовательность данного белка будут изменены мутациями. Поскольку указанные клетки характеризуются повышенной жизнеспособностью, использование таких клеток гарантирует отсутствие осложнений во время процесса ферментации и высокопродуктивное получение продукта ферментации. В контексте настоящего изобретения термин "ферментация" означает любой способ получения оп- 10009058 ределенного продукта вследствие анаэробного или аэробного метаболизма микробов, грибных клеток,растительных клеток или животных клеток или при помощи ферментов, полученных из таких клеток,которые могут быть выделены, очищены и/или иммобилизованы. В определение термина "ферментация" входят все ферментативно-химические изменения органического субстрата, вызываемые действием одного или нескольких ферментов микробных, растительных, грибных и/или животных клеток. Требуемый продукт ферментации может быть продуцирован в самой клетке благодаря экспрессии белка или в результате метаболизма клетки, при этом продукт ферментации может накапливаться в клетке или может быть перенесен из клетки в среду, либо клетка продуцирует один или несколько ферментов, которые в процессе секреции из клетки катализируют конверсию субстрата в среде в требуемый продукт ферментации. В том случае, когда продуктом ферментации является нуклеиновая кислота или белок, кодированный нуклеиновой кислотой, способ согласно настоящему изобретению позволяет избежать даже минимальных загрязнений продукта ферментации мутациями и, таким образом, в течение длительного времени сохранить целостность продукта ферментации. Когда продукт ферментации образуется под действием одного или нескольких ферментов, продуцируемых клеткой, способ согласно настоящему изобретению позволяет сохранить целостность соответствующих ферментов и, таким образом, сохранить специфичность и эффективность метаболических процессов, вызывающих образование продукта ферментации. Способ получения продукта ферментации согласно настоящему изобретению может быть также пригоден для сохранения целостности полигенных кластеров и/или генных продуктов, кодированных таким полигенным кластером, участвующим в данном процессе, и, таким образом, для сохранения специфичности и эффективности процесса, в котором участвуют генные продукты, кодированные таким полигенным кластером. Примеры такого полигенного кластера включают, не ограничиваясь ими, поликетидсинтазный кластер (PKS). Метаболиты поликетидов образуют большую группу природных продуктов, образуемых бактериями, такими как актиномицеты и миксобактерии, и грибами с разными структурами и биологическими активностями. Комплексные поликетиды продуцируются многофункциональными PKS при помощи механизма, аналогичного синтезу длинноцепочечной жирной кислоты у животных. Исследование PKS эритромицина в Saccharopolyspora erythraea позволило выявить модульную организмацию. Синтез комплексного поликетида происходит в соответствии с механизмом реакций, в котором каждый модуль в PKS образует цепочку из трех-шести ферментативных доменов, катализирующих реакции почти в линейном порядке. В соответствии с настоящим изобретением уменьшение частоты спонтанных мутаций и повышение жизнеспособности клетки, используемой для ферментации, достигается благодаря использованию по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации в любой нуклеиновой кислоте, присутствующей в клетке. В частности, по меньшей мере две указанные мутации усиливают способность системы репарации ошибочно спаренных оснований, функции исправления ошибок и/или системы SOS-репарации исправлять спонтанно возникающие мутации в клетке. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанные мутации выбирают из мутации, повышающей экспрессию белка MutL или гомологичного белка, мутации, повышающей экспрессию белка MutS или гомологичного белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный белок, и аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного белка. В одном варианте осуществления изобретения повышение экспрессии MutL или гомологичного белка и повышение экспрессии MutS или гомологичного белка может быть достигнуто путем введения в клетку, используемую для ферментации, вектора, содержащего ген mutL или ген, кодирующий гомологичный белок, и ген mutS или ген, кодирующий гомологичный белок, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих сверэкспрессию соответствующего белкаmut по сравнению с соответствующей клеткой-хозяином дикого типа. Вектор, используемый для сверхэкспрессии белка MutL или MutS, предпочтительно является многокопийной плазмидой, которая содержит соответствующий ген mut, находящийся под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц. В предпочтительном варианте осуществления изобретения регуляторная единица,контролирующая сверхэкспрессию соответствующего гена mut, может быть индуцибельным или конститутивным промотором. В другом варианте осуществления изобретения повышение экспрессии MutL или гомологичного белка и повышение экспрессии MutS или гомологичного белка может быть достигнуто путем введения одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена mut в хромосому (хромосомы) клетки либо одной или нескольких мутаций в регуляторные единицы, направляющие транскрипцию нативного, локализованного в хромосоме гена mut, благодаря чему клетка продуцирует большее количество соответствующего белка Mut по сравнению с клеткой дикого типа. В предпочтительном варианте осуществления изобретения аллелем-антимутатором гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV, является dinB10. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения аллелем-антимутатором гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III, являетсяdnaE911. В соответствии с настоящим изобретением присутствие dinB10 и dnaE911 в клетке, используемой для ферментации, уменьшает частоту спонтанных мутаций в данной клетке по сравнению с клеткой дикого типа по меньшей мере в 10 раз. Присутствие dinB10 и dnaE911 в клетке, которая, кроме того, сверхэкспрессирует белок mutL, уменьшает частоту спонтанных мутаций в данной клетке по сравнению с клеткой дикого типа по меньшей мере в 50 раз. Продукты ферментации, полученные способом согласно настоящему изобретению, могут быть первичными или вторичными метаболитами клетки. Первичными метаболитами являются вещества, синтезируемые живой клеткой и необходимые клетке для образования клеточных структур и поддержания обменных процессов. В отличие от первичных метаболитов вторичными метаболитами являются соединения, в частности, низкомолекулярные соединения, синтезированные клеткой, которые не обязательно требуются для выполнения функций клетки. Как правило, вторичные метаболиты могут сообщать клетке или организму селективное преимущество в определенной среде. Продукты ферментации, полученные способом согласно настоящему изобретению, могут быть продуктами ферментации в классическом смысле, то есть получаемыми в результате ферментативного расщепления углеводов кислородом, осуществляемого исключительно микробами, такими как продукты спиртового брожения, молочнокислого брожения, пропионовокислого брожения и т.д. Примеры продуктов ферментации включают, не ограничиваясь ими, нуклеиновые кислоты, нуклеозиды, нуклеотиды, белки, аминокислоты, органические кислоты, спирты, углеводы, витамины, антибиотики и алкалоиды. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения продуктами ферментации являются нуклеиновые кислоты, в частности, пригодные для терапевтического применения, например, нуклеиновые кислоты, предназначенные для использования в качестве вакцины. В контексте настоящего изобретения термин "нуклеиновые кислоты" означает молекулы, которые содержат по меньшей мере два нуклеотида, связанных фосфодиэфирной связью. Поэтому термин "нуклеиновая кислота" означает также олигонуклеотид. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК. Нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения продуктами ферментации являются белки, в частности, ферменты или белки, пригодные для терапевтического применения, или их части,такие как домены. Предпочтительные примеры ферментов включают, не ограничиваясь ими, протеазы,амилазы, пектиназы и глюкозоизомеразы. Предпочтительные примеры белков, пригодных для терапевтического применения, включают, не ограничиваясь ими, цитокины, такие как интерфероны, интерлейкины, фаторы роста, факторы свертывания крови, антитела и т.д. Предпочтительные примеры органических кислот включают, не ограничиваясь ими, лимонную кислоту, молочную кислоту или уксусную кислоту. Предпочтительные примеры спиртов включают, не ограничиваясь ими, этанол, пропанол и бутанол. Предпочтительные примеры углеводов включают, не ограничиваясь ими, сахара, такие как сахароза, мальтоза или палатиноза, или сахарные спирты, такие как ксилит или мальтит. Предпочтительные примеры витаминов включают, не ограничиваясь ими, витамин В 12 или рибофлавин. Предпочтительные примеры антибиотиков включают, не ограничиваясь ими, пенициллин, цефалоспорин, стрептомицин, поликетидный антибиотик, такой как эритромицин, и т.д. Продукт ферментации может быть выделен из ферментирующих клеток или из среды, используемой для культивирования. Поэтому настоящее изобретение относится также к продукту ферментации, получаемому способом согласно настоящему изобретению, предназначенному для получения продукта ферментации. В способе получения продукта ферментации согласно настоящему изобретению могут быть использованы как эукариотические, так и прокариотические клетки. В предпочтительном варианте осуществления способа получения продукта ферментации согласно настоящему изобретению использумой эукариотической клеткой является грибная клетка, животная клетка или растительная клетка. Прокариотической клеткой, используемой при осуществлении способа получения продукта ферментации согласно настоящему изобретению, является цианобактерия, архебактерия, грамположительная бактерия или грамотрицательная бактерия. При осуществлении способа ферментации согласно настоящему изобретению можно использовать любую клетку, которая предпочтительно обладаетзначительно меньшей частотой спонтанных мутаций по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа. В частности, предпочтительными являются клетки или организмы, у которых частота спонтанных мутаций была уменьшена способом уменьшения частоты спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению или которые были получены способом создания клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления способа согласно настоящему изобретению клетку культивируют в приемлемой жидкой среде. Специалисту в данной области должны быть известны многие жидкие среды, в которых можно культивировать клетки, например прокариотические или эукариоти- 12009058 ческие клетки, для получения продукта ферментации. В соответствии с настоящим изобретением клетку можно культивировать в непрерывной или периодической культуре. Периодической культурой является культура, которая образуется в жидкой среде, засеянной клетками, причем во время культивирования среду не подвергают постоянной замене и в нее необязательно вводят только газ, такой как кислород. Периодическая культура может быть культурой с подпиткой для устранения катаболической репрессии при образовании продукта. Поэтому в случае культуры с подпиткой потребление субстрата, такого как сахар, должно компенсироваться введением дополнительных количеств указанного субстрата. Непрерывной культурой является культура, которую инокулируют клетками только один раз, после чего в зависимости от увеличения массы клеток или накопления продукта потребляемую культуральную среду постоянно заменяют свежей средой, при этом из культуры одновременно удаляют продукт ферментации вместе с потребленной средой и необязательно с клетками. Непрерывные культуры можно культивировать в бродильных чанах. В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки могут находиться в культуре в иммобилизованной форме. В другом варианте осуществления способа согласно настоящему изобретению клетку культивируют на твердой или полутвердой среде. Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к организму, в частности, к прокариотическому организму, наиболее предпочтительно штамму Escherichia coli, который выбирают из группы, включающей штамм E.coli MG1655dinB10, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17016); штамм E.coli MG1655dinB10 mutLtet, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17017); штамм E.coli MG1655 dnaE zaecm, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17018) ; штамм E.coli MG1655 dnaE zaecm mutLtet, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17019); штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zaecm (DSM 17015); штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zaecm mutLtet (DSM 17014); штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zaecm, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17020); и штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zaecm mutLtet, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17021). Вышеуказанные микроорганизмы депонированы на основании Будапештского соглашения в DSMZ(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkilturen GmbH in Braunschweig, Germany) 3-го января 2005 г. под вышеуказанными номерами DSM. Настоящее изобретение иллюстрировано нижеследующим списком последовательностей, фигурами и примерами. На фиг. 1 изображена физическая структура плазмиды pmutL, которая по существу аналогична плазмиде pmutS. На фиг. 2 графически представлены значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к рифампицину в штаммах дикого типа, dinB10, dnaE911, dinB10 dnaE911, mutL-, mutL- dinB10,mutL- dnaE911 и mutL- dinB10 dnaE911. Как показано на данной фигуре, мутабильность сильно подавлена экспрессией MutL. Данные представлены в виде значений SMF. Плазмида pmutL является производным mutL+ плазмиды pTrcHis2/lacZ. Во всех генетических манипуляциях был использован штамм дикого типа MG1655 (wt). На фигуре показаны родственные генотипы. В колонках изображены по три столбца,относящихся к одному генотипу, из которых: а) первый столбец означает бактериальный штамм, b) второй столбец означает соответствующий бактериальный штамм, несущий плазмиду pTrcHis2/lacZ, и с) третий столбец означает соответствующий бактериальный штамм, несущий плазмиду pmutL. На фиг. 3 графически представлены значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к рифампицину в штаммах дикого типа, dinB10, dnaE911, dinB10 dnaE911, mutS-, nutS- dinB10,mutS- dnaE911 и mutS- dinB10 dnaE911. На данной фигуре показано подавление мутабильности в фенотипе mutS- под действием мутаций dinB10, dnaE911 и dinB10 dnaE911. Данные представлены в виде значений SMF. На фигуре показаны родственные генотипы. На фиг. 4 изображена физическая структура плазмиды pdapAIF (А) и плазмиды pSU40dapA (В). На фиг. 5 показана стратегия создания плазмиды pSU40nutL. На фиг. 6 графически изображена реверсия точковых мутаций dapA в штаммах Тор 10 (дикого типа;dapAkn pdapA15 pSU40 (dapA-), MG1655 dinB10 dapAkn pdapA15 pSU40mutL (dapA-). На данной фигуре показано подавление мутабильности в результате экспрессии MutL. Приведены значения мутаций,сообщающих устойчивость к DAP, деленные на общее число жизнеспособных клеток. Плазмида pmutL является производным mutL+ плазмиды pTrcHis2/lacZ или pSU40. Во всех генетических манипуляциях был использован штамм дикого типа MG1655 (wt). На фигуре показаны родственные генотипы. На фигуре изображена одна колонка, включающая три столбца для контрольных образцов, и три колонки,включающие по два столбца для исследуемых штаммов. В колонке, состоящей из двух столбцов, а) первый столбец означает бактериальный штамм, несущий исходный вектор, и b) второй столбец означает бактериальный штамм, несущий производную плазмиду mutL+. Все использованные бактериальные штаммы экспрессируют в хромосоме MutL дикого типа.- 13009058 На фиг. 7 показаны производные плазмиды рХХ 7.A) Клонирование хлорамфеникольного кластера в плазмиде рХХ 7, в результате чего была получена плазмида рХХ 7cm. Девять полученных клонов анализировали путем расщепления рестрикционными ферментами EcoRI и NcoI (ожидаемые фрагменты: 1677 п.о. и 3292 п.о.). Все испытанные клоны характеризовались правильным паттерном миграции.B) Клонирование молчащего гена tetA в плазмиде рХХ 7, в результате чего была получена плазмидаpXX7tet. Двадцать четыре полученных клона анализировали путем расщепления рестрикционным ферментом EcoRIO (ожидаемые фрагменты: 4141 п.о. и 3113 п.о.). Один из испытанных клонов характеризовался правильным паттерном миграции. На фиг. 8 показаны значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к рифампицину для штаммов JM83 рХХ 7, JM83 рХХ 7 рTrc и JM83 рХХ 7 pmutL. Плазмида pmutL является производным mutL+ плазмиды рTrc. Значения SMF представлены в виде устойчивости к рифампицину в зависимости от общего числа жизнеспособных клеток. Штамм дикого типа JM83 экспрессирует в хромосомеMutL дикого типа. На фиг. 9 показаны значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к фосфомицину для штаммов JM83 рХХ 7, JM83 рХХ 7 рTrc и JM83 рХХ 7 pmutL. Плазмида pmutL является производным nutL+ плазмиды рTrc. Значения SMF представлены в виде устойчивости к фосфомицину в зависимости от общего числа жизнеспособных клеток. Штамм дикого типа JM83 экспрессирует в хромосомеMutL дикого типа. На фиг. 10 показано число колоний cmR, образовавшихся в зависимости от частоты спонтанных мутаций в гене-репортере устойчивости к хромамфениколу, для штаммов JM83 pXX7cm, JM83 рХХ 7cm рTrc и JM83 pXX7cm pmutL. Плазмида рХХ 7 ст является производным сm+ плазмиды рХХ 7. ПлазмидаpmutL является производным mutL+ плазмиды рTrc. На данной фигуре представлены значения мутаций,вызывающих чувствительность к хлорамфениколу, деленные на общее число жизнеспособных клеток. Контрольные штаммы JM83pXX7, JM8 3pXX7 pTrc и JM83pXX7 pmutL характеризуются ожидаемой чувствительностью к хлорамфениколу (при отсутствии гена устойчивости к хлорамфениколу). На фиг. 11 показано число колоний tetR, образовавшихся в зависимости от частоты спонтанных мутаций в молчащем гене-репортере tetA, для штаммов JM83 pXX7tet, JM83 pXX7tet pTrc и JM83 pXX7tetpmutL. Плазмида pXX7tet является производным плазмиды рХХ 7, несущей молчащий ген tetA. ПлазмидаpmutL является производным metL+ плазмиды pTrc. На данной фигуре представлены значения мутаций,вызывающих устойчивость к тетрациклину, деленные на общее число жизнеспособных клеток. Контрольные штаммы JM83pXX7, JM83pXX7 pTrc и JM83pXX7 pmutL характеризуются ожидаемой чувствительностью к тетрациклину (при отсутствии гена устойчивости к тетрациклину). Для двух штаммовJM83 рХХ 7 и JM83 pXX7tet значения мутабильности были равны 0,43 или 0,39 (1,1). Экспрессия MutL уменьшает значение мутабильности до 0,25 (1,72). На фиг. 12 показана мутабильность модифицированного штамма-продуцента JM83 рХХ 7cm в "условиях ферментации". На данной фигуре показана частота спонтанных мутаций в отношении устойчивости к хлорамфениколу в клетках при подавлении G-CSF (А) или экспрессии G-CSF (В). Во всех испытаниях белокpXX7pTrc pmutL характеризуются ожидаемой чувствительностью к хлорамфениколу в случае (А) и (В). На фиг. 13 показана мутабильность модифицированного штамма-продуцента JM83 pXX7tet в "условиях ферментации". На данной фигуре показана частота спонтанных мутаций в отношении устойчивости к тетрациклину в клетках при подавлении G-CSF (А) или экспрессии G-CSF (В). Во всех испытанных случаях белок MutL был экспрессирован в хромосоме.SEQ ID NO:1 и 2 представляют собой последовательности затравок NutLNcolhin и MutLXholher,используемых для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего белок MutL.SEQ ID NO:3 и 4 представляют собой последовательности затравок MutSBamHIhin и MutSXholher,используемых для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего белок MutS. Последовательности SEQ ID NO:5 - SEQ ID NO:10 представляют собой последовательности затравок dapABamHIIF, dapABamH1+1, dapABamH1+2, dapAXhol, dapAEcoRIhin и dapAHindIIIher, используемых для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего белок DapA.SEQ ID NO:11 и 12 представляют собой последовательности затравок cmBbvCIhin и cmAhdIger, используемых для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего ген устойчивости к хлорамфениколу. Пример I. Определение частоты спонтанных мутаций (SMF) в отношении устойчивости к рифампицину в разных штаммах E.coli Клетки бактерий Escherichia coli обычно чувствительны к антибиотику рифампицину, то есть они не могут расти на средах, содержащих данный антибиотик. Однако в геноме E.coli обычно наблюдается низкая частота мутаций, сообщающих устойчивость к рифампицину. Таким образом, при культивировании большого числа клеток (108) на среде, содержащей рифампицин, образуется лишь несколько колоний, в то время как большинство клеток будет уничтожено антибиотиком. Образование колоний возможно потому, что в геноме клеток возникают спонтанные мутации, сообщающие устойчивость к ри- 14009058 фампицину. Указанные мутации в свою очередь наследуются потомством исходного мутанта. Важно отметить, что такая мутация является благоприятной только в среде, где присутствует рифампицин, и,вероятно, не сообщает преимуществ образовавшемуся варианту в большинстве других условий. Рифампицин является антибиотиком, который применяется главным образом для лечения туберкулеза, лепры и иногда других заболеваний. Устойчивость возникает вследствие изменений проницаемости мембраны или мутаций в гене rpoB, кодирующем мРНК-полимеразу. Оба вышеуказанных механизма запускаются мутацией в хромосоме. Однако в хромосоме E.coli существует несколько генов-мишеней, которые могут сообщать бактериям устойчивость к рифампицину. Для вычисления частоты спонтанных мутаций (SMF) определяли частоту спонтанных мутаций, сообщающих устойчивость к рифампицину, и полученное значение делили на общее число жизнеспособных клеток в культуре. А) Сверхэкспрессия MutL в штамме E.coli, вызывающая образование сильного фенотипа генамутатора (делеция в хромосоме mutL и/или dnaQ), и культивирование клеток на антибиотике рифампицине. Описание эксперимента 1. Создание плазмиды сверхэкспрессии MutL и MutSa) Клонирование mutL в pTrcHis2/lacZ Указанная плазмида была создана для достижения высокой и "контролируемой" экспрессии MutL вE.coli. Геномную ДНК, полученную из штамма E.coli MG1655, использовали для амплификации фрагмента ДНК длиной 1848 п.о., кодирующего белок MutL, при помощи затравок 1 (SEQ ID NO:1) и 2 (SEQ IDNO:2) (см. также табл. 1). Указанный фрагмент, полученный при помощи PCR, расщепляли и клонировали в плазмиде pTrcHis2/lacZ в виде фрагмента Ncol-XhoI с образованием плазмиды pmutL. Физическая структура плазмиды pmutL показана на фиг. 1. Полимеразную реакцию синтеза цепи (PCR) выполняли в нижеследующих условиях (температура в С/время в минутах): (98/10), (96/0,75; 55/0,50; 72/2,5)35 (72/10); соотношение (Taq/Pfu) (5/1). Были выделены шесть полученных клонов, которые анализировали путем расщепления рестрикционным ферментом EcoRV (ожидаемые фрагменты: 871 п.о. и 5373 п.о.). Все шесть клонов характеризовались правильным паттерном миграции.b) Клонирование mutS в pTrcHis2/lacZ Указанная плазмида была создана для достижения высокой и "контролируемой" экспрессии MutS вE.coli. Геномную ДНК, полученную из штамма E.coli MG1655, использовали для амплификации фрагмента ДНК длиной 2562 п.о., кодирующего белок MutS, при помощи затравок 3 (SEQ ID NO:3) и 4 (SEQ IDNO:4) (см. также табл. 1). Указанный фрагмент, полученный при помощи PCR, расщепляли и клонировали в плазмиде pTrcHis2/lacZ в виде фрагмента BamHI-XhoI с образованием плазмиды pmutS. ПлазмидаpmutS по существу имеет такую же физическую структуру, что и плазмида pmutL, показанная на фиг. 1. Полимеразную реакцию синтеза цепи (PCR) выполняли в нижеследующих условиях (температура в С/время в минутах): (98/10), (96/0,75; 55/0,58; 72/3)35 (72/10); геркулаза. Были выделены шесть полученных клонов, которые анализировали путем расщепления рестрикционным ферментом EcoRV (ожидаемые фрагменты: 1186 п.о. и 5775 п.о.). Все шесть клонов характеризовались правильным паттерном миграции. Таблица 1. Перечень затравок, используемых для амплификации фрагментов ДНК, кодирующих соответственно белок MutL и MutS- 15009058 2. Анализ методом вестерн-блоттинга а) Обнаружение MutL 20 мкл ночной культуры ES568 (mutL13; Mut-) pmutL инокулировали в 10 мл среды LB, содержащей 0,4% глюкозы и ампициллин (100 мкг/мл), до достижения оптической плотности (OD), равной примерно 0,5. Для удаления глюкозы клетки центрифугировали и растворяли в 5 мл среды LB, содержащей требуемые антибиотики. Добавление IPTG в конечной концентрации 1 мМ индуцировало экспрессию белка из Plac плазмиды pmutL. Культуры инкубировали в течение 16 ч при 37 С, центрифугировали и готовили к выполнению анализа методом SDS-PAGE. Анализ методом вестерн-блоттинга выполняли, используя АР-конъюгированные антитела против His-tac (данные не показаны).b) Обнаружение MutS Клетки штамма Top10 дикого типа трансформировали созданной плазмидой pmutS и очищали полученные трансформанты. 20 мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды LB,содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и 0,4% глюкозы, до достижения оптической плотности (OD), равной примерно 0,5. Для удаления глюкозы клетки центрифугировали и растворяли в 5 мл среды LB, содержащей требуемые антибиотики. Добавление IPTG в конечной концентрации 1 мМ индуцировало экспрессию белка из Plac плазмиды pmutS. Культуры инкубировали в течение 16 ч при 37 С, центрифугировали и готовили к выполнению анализа методом SDS-PAGE. Анализ методом вестерн-блоттинга выполняли, используя АР-конъюгированные антитела против His-tac (данные не показаны). 3. Исследования роста Бактериальные штаммы ES568 (mutL13; Mut-), MG1655dnaQkn (Mut-) и штамм MG1655 (Mut+) дикого типа трансформировали плазмидой pmutL или исходной плазмидой pTrcHis2/lacZ. Полученные единичные колонии очищали на агаровых пластинках со средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и затем инокулировали в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 37 С. 20 мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 5 мл среды LB, содержащей 0,4% глюкозы и требуемый антибиотик (100 мкг/мл ампициллина; 50 мкг/мл канамицина), до достижения оптической плотности (OD), равной примерно 0,5. Для удаления глюкозы клетки центрифугировали и растворяли в 5 мл среды LB, содержащей соответствующие антибиотики. Добавление IPTG в конечной концентрации 1 мМ индуцировало экспрессию белка из Plac плазмиды pmutL. Культуры инкубировали в течение ночи при 37 С, затем клетки центрифугировали и объем среды уменьшали до 1/10 (об./об.). И наконец, культуры разводили и культивировали на агаровых пластинках, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, или 100 мкг/мл ампициллина и 100 мкг/мл рифампицина, и инкубировали в течение трех дней при 30 С. Экспрессию MutL подтверждали, выполняя анализ методом вестерн-блоттинга. Краткий обзор и заключение: было установлено, что сверхэкспрессия MutL (фенотип mutL+) уменьшает частоту спонтанных мутаций примерно в 20 раз. Аналогичный эффект наблюдался для клетокmutL- или dnaQ-, которые характеризуются высокой частотой мутаций (данные не показаны). В) Сверхэкспрессия MutL в штаммах E.coli, несущих разные комбинации делеции dinB и/или аллеля-антимутатора dnaE911. 1. Создание штамма а) Из штамма E.coli ES1484 (mutL218Tn10) получали лизат P1vir для инфицирования клеток штаммов E.coli MG1655 и MG1655dinB10. Получение P1vir Аликвоту ночной культуры штамма E.coli ES1484 (mutL218tet) инокулировали в среде LB, содержащей СаСl2 (5 мМ), при 37 С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли P1vir (штамм MG1655 дикого типа). Инфицированную культуру инкубировали в течение примерно 4 ч при 37 С до обнаружения лизиса клеток. Затем добавляли СНСl3, лизат центрифугировали, супернатант переносили в новую пробирку, содержащую СНСl3, и хранили при 4 С. Р 1-опосредованная трансдукция Аликвоты ночных культур из штаммов-хозяев MG1655 и MG1655 dinB10 инокулировали в средеLB при 37 С до достижения фазы экспоненциального роста. Клетки центрифугировали, вторично суспендировали в MgSO4 (СЕ = 10 мМ), содержащем СаСl2 (СЕ = 5 мМ), добавляли полученный лизат P1vir и смеси клеток инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Добавляли цитрат натрия (для прекращения инфицирования фагом) и SOC в качестве источника питательных веществ. После инкубации в течение 1 ч при 37 С аликвоты клеток культивировали на агаровых пластинках, содержащих тетрациклин (12,5 мкг/мл). Полученные единичные колонии очищали, тестировали и хранили выделенные штаммы.b) Из штамма NR10171 dnaE (dnaE911 zaecm) получали лизаты P1vir, ипользуемые для инфицирования бактериальных клеток из штаммов E.coli MG1655, MG1655dinB10, MG1655mutLtet иMG1655dinB10 mutLtet. Полученные единичные колонии очищали, тестировали и хранили выделенные штаммы.- 16009058 2. Исследования роста Бактериальные штаммы MG1655, MG1655dinB10, MG1655dnaE911 zaecm, MG1655dinB10MG1655dinB10 dnaE911 zaecm mutLtet трансформировали плазмидами pTrcHis2A или pmutL. Полученные единичные колонии очищали и инокулировали в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина,в течение ночи при 30 С. 20 мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 5 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, при 30 С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли IPTG в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии MutL из Plac. Культуры выдерживали в течение 1 ч при 30 С, затем температуру повышали до 37 С и клетки инкубировали в течение ночи при 37 С. Клетки центрифугировали и объем среды уменьшали до 1/10 (об./об.). И наконец, культуры разводили и культивировали на агаровых пластинках, содержащих 100 мкг/мл ампициллина или 100 мкг/мл ампициллина и 100 мкг/мл рифампицина, и инкубировали в течение трех дней при 30 С. Значения частоты спонтанных мутаций (SMF) в отношении устойчивости к рифампицину, представленные в табл. 2 и на фиг. 2, свидетельствуют о подавлении мутабильности вследствие экспрессии Мутабильность (значения SMF) уменьшается под действием антимутаторов, таких как dinB10 (делеция) или dnaE911 (аллель), соответственно в 4 и 3 раза. Кроме того, в указанных штаммах наблюдалось дополнительное уменьшение мутабильности в результате экспрессии MutL (в 2-7 раз). Бактериальный штамм, несущий оба антимутатора, dinB10 и dnaE911, характеризуется 10-кратным уменьшением мутабильности по сравнению со штаммом MG1655 дикого типа. Дополнительная экспрессия MutL, повидимому, не изменяет мутабильность. Делеция гена mutL в хромосоме увеличивает мутабильность штамма-хозяина примерно в 103 раз. Мутабильность уменьшается под действием антимутаторов dinB10 (в 5 раз), dnaE911 (в 3 раза), dinB10 иmutLtet в 50 раз; для MG1655dinB10 mutLtet в 22 раза; для MG1655 dnaE911 zaecm; mutLtet в 20 раз и для MG1655dinB10 dnaE911 zaecm mutLtet в 11 раз). Краткий обзор и заключение: антимутаторы dinB10 и dnaE911 уменьшают частоту спонтанных мутаций в 3-4 раза. Экспрессия MutL в указанных штаммах далее уменьшает частоту спонтанных мутаций в 2-7 раз. С) Мутабильность в штамме mutS-, несущем разные комбинации делеции dinB и/или антимутатораdnaE911 Для подтверждения приведенных выше результатов исследовали эффект антимутатора dinB10 (делеция полимеразы IV) и/или dnaE911 (аллель в кодирующей последовательности для -субъединицы полимеразы III) в фенотипе mutS-. 1. Создание штаммов Из штамма E.coli ES1481 (mutL215Tn10) получали лизат P1vir, используемый для инфицирования бактериальных клеток из штаммов E.coli MG1655, MG1655dinB10, MG1655dnaE911 zaecm иMG1655dinB10 dnaE911 zaecm. Полученные единичные колонии очищали, тестировали и хранили выделенные штаммы. 2. Исследования роста 10 мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды LB, содержащей 12,5 мкг/мл тетрациклина, при 30 С. Во время фазы экспоненциального роста (после выращивания в течение 8 ч) температуру повышали до 37 С и клетки инкубировали в течение ночи при 37 С. Клетки центрифугировали и объем среды уменьшали до 1/10 (об./об.). И наконец, культуры разводили, культивировали на агаровых пластинках с рифампицином (100 мкг/мл) или без рифампицина и инкубировали в течение пяти дней при 30 С. Значения частоты спонтанных мутаций (SMF) в отношении устойчивости к рифампицину, представленные в табл. 3 и на фиг. 3, свидетельствуют о подавлении мутабильности в фенотипе mutS-. Таблица 3. Значения SMF в колониях, устойчивых к рифампицинуdnaE911, (примерно в 1,5 раза) по сравнению со штаммом дикого типа. Кроме того, бактериальный штамм, несущий антимутаторы dinB10 и dnaE911, характеризуется 4,5-кратным уменьшением мутабильности по сравнению со штаммом MG1655 дикого типа. Делеция гена mutS в хромосоме значительно увеличивает мутабильность в штамме-хозяине. Мутабильность уменьшается под действием антимутаторов dinB10 (в 12,5 раза), dnaE911 (в 10 раз), dinB10 иdnaE911 (в 60 раз). Заключение и краткий обзор: антимутаторное действие, вызываемое dinB10 или dnaE911, частично дополняет фенотип Mut-, получаемый в результате делеции mutS в хромосоме. Пример II. Реверсия мутаций dapA Для исследования реверсии точковых мутаций и мутаций со сдвигом рамки в определенном генемишени использовали систему, обладающую ауксотрофным фенотипом в E.coli (штамм dapA-). Ген dapA кодирует дигидродипиколинат-синтазу, которая катализирует конденсацию L-аспартат-семиальдегида и пуривата в дигидропиколиновую кислоту при помощи пинг-понгового механизма, в соответствии с которым пируват связывается с ферментом, образуя шиффово основание с остатком лизина. Бактериальные клетки с мутацией в гене dapA, вызывающей образование нефункционального генного продукта, не могут расти на среде, которая не содержит DL-диаминопимелиновую кислоту (DAP). Белок MutL экспрессируется в фенотипе dapA- (dapA15 (точковая мутация имеет фенотип DapA-) или dapAkn) в присутствии плазмид, кодирующих dapAIF (открытая рамка считывания (ORF) дикого типа), dapA+1 (мутация со сдвигом рамки), dapA+2 или dapA15 (точковая мутация). Ревертанты обнаружены на планшетах без DL-диаминопимелиновой кислоты. Описание эксперимента 1. Создание плазмид а) Клонирование dapA Клонирование dapA (dapA15), dapA+1 (dapA15+1), dapA+2 (dapA15+2) в pTrcHis2/lacZ Геномную ДНК, полученную из штамма E.coli MG1655 (дикого типа) или АТ 997 (dapA15), использовали для амплификации фрагмента ДНК длиной 732 п.о., кодирующего белок DapA, с помощью затравок 5 (SEQ ID NO:5), 6 (SEQ ID NO:6), 7 (SEQ ID NO:7) и 8 (SEQ ID NO:8) (см. табл. 4). Указанные фрагменты, полученные при помощи PCR, расщепляли и клонировали в плазмиде pTrcHis2/lacZ в виде фрагмента BamHI-XhoI, в результате чего были получены плазмиды pdapAIF, pdapA+1 и pdapA+2. Физическая структура плазмиды pdapAIF показана на фиг. 4 А. Полимеразную реакцию синтеза цепи (PCR) выполняли в нижеследующих условиях (температура в С/время в минутах): (98/10), (96/0,75; 55/0,50; 72/2)35 (72/10); геркулаза. Восемь клонов, полученных в каждом случае, анализировали путем расщепления рестрикционным ферментом BstEII (ожидаемые фрагменты: 1314 п.о. и 3964 п.о.). В общей сложности двадцать три из двадцати четырех испытанных клонов характеризовались правильным паттерном миграции. Клонирование dapA15 в pSU19 и pSU40 Геномную ДНК, полученную из штамма E.coli AT997, использовали для амплификации фрагмента ДНК длиной 732 п.о., кодирующего белок DapA, с помощью затравок 9 (SEQ ID NO:9) и 10 (SEQ IDNO:10) (см. табл. 4). Указанный фрагмент, полученный при помощи PCR, расщепляли и клонировали в плазмидах pSU19 и pSU40 в виде фрагмента HindIII-EcoRI, в результате чего были получены плазмидыpSU19dapA15 и pSU40dapA15. Физическая структура плазмиды pSU40dapA показана на фиг. 4 В. Полимеразную реакцию синтеза цепи (PCR) выполняли в нижеследующих условиях (температура в С/время в минутах): (98/10) (96/0,75; 55/0,50; 72/2)35 (72/10); соотношение (Taq/Pfu) (5/1). Десять полученных клонов выделяли и анализировали путем расщепления рестрикционным ферментом NheI (ожидаемые фрагменты: 1122 п.о. и 2557 п.о. для pSU40) или ApoI (ожидаемые фрагменты: 478 п.о. и 3192 п.о.). Все клоны характеризовались правильным паттерном миграции. 2) Клонирование mutLa) Субклонирование mutL в pSU40 Плазмиду pmutL расщепляли SpHI-XmnI и методом гель-электрофореза выделяли фрагмент длиной 3629 п.о. Плазмиду pSU40 расщепляли SphI-HincII и методом гель-электрофореза выделяли фрагмент длиной 2680 п.о. Два очищенных фрагмента лигировали по "липким" концам, получая при этом плазмиду pSU40mutL. Стратегия создания плазмиды pSU40mutL показана на фиг. 5. Шесть полученных клонов анализировали путем расщепления рестрикционными ферментами NcoI(ожидаемые фрагменты: 1828 п.о. и 4481 п.о.). Три из шести испытанных клонов характеризовались правильным паттерном миграции.b) Плазмида pmutLspec: замена гена blа геном spec Замена гена устойчивости к ампициллину геном устойчивости к спектомицину в плазмиде pmutL ДНК, полученную из плазмиды рIС 156, расщепляли FspI-XmnI и методом гель-электрофореза выделяли фрагмент длиной 1304 п.о.; ДНК, полученную из плазмиды pmutL, расщепляли ScaI-XmnI и ме- 19009058 тодом гель-электрофореза выделяли фрагмент длиной 5443 п.о. Два очищенных фрагмента лигировали по "тупым" концам, получая при этом плазмиду mutLspec. Двенадцать полученных клонов анализировали путем расщепления рестрикционным ферментомEcoRI (ожидаемые фрагменты: 1291 п.о. и 5456 п.о.). Два из двенадцати испытанных клонов характеризовались правильной величиной. Таблица 4. Перечень затравок, используемых для амплификации фрагментов ДНК, кодирующих белок DapA 2. Анализ методом вестерн-блоттинга а) Обнаружение DарА/DарА 15 Штамм dapAkn трансформировали плазмидами pdapAIF, pdapA+1, pdapA+2, pdapA15IF,pdapA15+1 и pdapA15+2 и очищали полученные трансформанты. 20 мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды LB, содержащей 0,4% глюкозы, DL-диаминопимелиновую кислоту (100 мкг/мл), ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (50 мкг/мл), до достижения оптической плотности (OD), равной примерно 0,5. Для удаления глюкозы одну часть клеток центрифугировали и растворяли в 5 мл среды LB, содержащей требуемые антибиотики. Добавление IPTG в конечной концентрации 1 мМ индуцировало экспрессию белка из Plac разных производных pTrcHis2/lacZ. Культуры инкубировали в течение 16 ч при 37 С, центрифугировали и готовили к выполнению анализа методом SDS-PAGE. Анализ методом вестерн-блоттинга выполняли, используя АРконъюгированные антитела против His-tac (данные не показаны).b) Обнаружение MutL Штамм Top10 дикого типа трансформировали плазмидой pmutLspec и очищали полученные трансформанты. 20 мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды LB, содержащей спектиномицин (75 мкг/мл), до достижения оптической плотности (OD), равной примерно 0,5. Культуру делили на 5 мл аликвоты и один раз добавляли IPTG в конечной концентрации 1 мМ для индукции экспрессии MutL из промотора Plac. Культуры инкубировали в течение 4 ч при 37 С, центрифугировали и готовили к выполнению анализа методом SDS-PAGE. Для подтверждения экспрессии MutL выполняли анализ методом вестерн-блоттинга, используя АР-конъюгированные антитела против His-tac (данные не показаны). 3. Создание штаммов Из штамма E.coli dapAkn были получены лизаты P1vir, используемые для инфицирования бактериальных клеток из штаммов E.coli MG1655, MG1655dinB10, MG1655dnaE911zaecm, MG1655dinB10dnaE911 zaecm, MG1655mutLtet, MG1655dinB10 mutLtet, MG1655dnaE911 zaecm mutLtet,MG1655dinB10 dnaE911zaecm mutLtet. Полученные единичные колонии очищали, тестировали и хранили выделенные штаммы. 4. Исследования ростаa) Реверсия точковых мутаций Бактериальные штаммы АТ 997 (dapA15) и MG1655dinB10 dapAkn трансформировали плазмидамиpTrcHis2/lacZ и pSU19dapA15 или плазмидами pmutL и pSU19dapA15. Полученные единичные колонии очищали и инокулировали в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, 30 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл DAP, в течение ночи при 37 С.b) Реверсия мутаций со сдвигом рамки Бактериальный штамм АТ 997 (dapA15; DapA-) трансформировали плазмидами pSU40 и pdapAIF,плазмидами pSU40mutL и pdapAIF, плазмидами pSU40 и pdapA+1, плазмидами pSU40mutL и pdapA+1,- 20009058 плазмидами pSU40 и pdapA+2 или плазмидами pSU40mutL и pdapA+2. Полученные единичные колонии очищали и инокулировали в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл DAP, в течение ночи при 37 С. 20 мкл ночных культур бактериальных клеток инокулировали в 10 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл DAP, при 30 С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли IPTG в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии MutL из промотора Plac. Культуры инкубировали в течение одного часа при 30 С, затем температуру повышали до 37 С и культуры выдерживали в течение ночи при 37 С. И наконец, культуры центрифугировали и удаляли 9 мл среды, остальные клетки разводили и культивировали на агаровых пластинках, содержащих 100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола или 100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл DAP, и инкубировали в течение пяти дней при 30 С. Значения реверсии мутаций dapA в штамме дикого типа и в штаммах, сверхэкспрессирующихkn (DapA-) имеют ожидаемые значения dap-/dap+: примерно 1 для штамма дикого типа (наличие роста при отсутствии DL-диаминопимелиновой кислоты) и 0 для штаммов dapA- (отсутствие роста при отсутствии DL-диаминопимелиновой кислоты). Два штамма АТ 997 (dapA15) pdapAIF pTrc (4) и АТ 997 (dapA15) pdapAIF pmutL (5) характеризуются ожидаемым фенотипом дикого типа при наличии функционального гена dapA в плазмиде pdapAIF. Мутации со сдвигом рамки (6,8) или точковые мутации плазмиды, кодированной dapA, в штаммехозяине dapA- (10) должны подавлять рост клеток при отсутствии DAP, в то время как реверсия введенных мутаций индуцирует рост при отсутствии DAP (7,11). Краткий обзор и заключение: в обоих случаях (мутация со сдвигом рамки и точковая мутация) более высокая реверсия мутации наблюдалась при отсутствии MutL. Значение dap-/dap+ для мутации со сдвигом рамки уменьшается в 1000 раз и для точковой мутации в 10 раз, из чего следует, что экспрессияMutL подавляет реверсию мутаций и, следовательно, противодействует закреплению спонтанных мутаций в хромосоме. Пример III. Экспрессия MutL в "условиях ферментации" Мутабильность штамма-продуцента JM83 рХХ 7, несущего вектор экспрессии G-CSF, контролируемый триптофаном, анализировали путем А) вычисления частоты спонтанных мутаций, культивируя клетки на рифампицилине, В) вычисления частоты спонтанных мутаций, культивируя клетки на фосфомицине, и С) введения генов-репортеров в плазмиду-продуцент рХХ 7 (кодирующую G-CSF). При выполнении анализа В) рифампицилин заменяли фосфомицином, так как в экспериментальных- 21009058 условиях устойчивость к фосфомицину возникает в E.coli гораздо быстрее. Фосфомицин является ингибитором клеточной оболочки, применяемым главным образом для лечения неосложненных инфекционных заболеваний нижнего отдела мочевых путей. Описание эксперимента 1. Клонирование а) Клонирование хлорамфеникольного кластера в плазмиде рХХ 7 ДНК, полученную из плазмиды pSU19, использовали для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего ген устойчивости к хлорамфениколу, с помощью затравок 11 (SEQ ID NO:11) и 12 (SEQ IDNO:12) (табл. 6). Указанные фрагменты, полученные при помощи PCR, расщепляли и клонировали в плазмидах рХХ 7 в виде фрагмента BbvcI-AhdI, в результате чего были получены плазмиды рХХ 7cm. Стратегия создания плазмиды рХХ 7cm показана на фиг. 7 А. Для упрощения отбора клонировали только область -10 последовательности "Шина Дальгарно". Полимеразную реакцию синтеза цепи (PCR) выполняли в нижеследующих условиях (температура в С/время в минутах): (98/10) (96/0,75; 55/0,50; 72/1)35 (72/10); геркулаза. Таблица 6. Затравки, используемые для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего ген устойчивости к хлорамфениколуb) Клонирование молчащего гена tetA в плазмиде рХХ 7 Обойму селекции плазмиды pGBG1 выделяли и клонировали в плазмиде рХХ 7 в виде фрагментаMslI-SmaI, получая при этом плазмиду pXX7tet (лигирование по "тупым" концам). Стратегия создания плазмиды pXX7tet показана на фиг. 7 В. Плазмиду pGBG1 выделяли и исследовали мобильные элементы и другие спонтанные мутации в разных грамотрицательных бактериях (Schneider et al., Plasmid 44, 201-207 (2000. Обойма селекции,содержащая ген-мишень для мутагенеза, состоит из молчащего гена tetA, контролируемого промоторомPR бактериофага , который подавляется репрессоромCI. Спонтанные мутации (точковые мутации,делеции и инсерции), которые инактивируют CI или удалают сайт связывания CI, подавляют PR и, таким образом, запускают экспрессию tetA. Ген-мишень для мутагенеза имеет цепь длиной около 1 т.п.о. В данном случае экспрессия MutL должна уменьшить частоту мутаций и следовательно снизить устойчивость к тетрациклину в указанном штамме-хозяине. 2. Исследования роста А) Определение частоты спонтанных мутаций (SMF) в E.coli при культивировании клеток на рифампицилине Бактериальный штамм JM83 рХХ 7 трансформировали плазмидой pTrcHis2/lacZ (контрольная плазмида) и pmutL. Полученные единичные колонии очищали и клетки инокулировали в среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 30 С. 3 мл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 100 мл среды RMG, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, при 30 С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли IPTG в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии MutL из промотора Plac плазмиды pmutL, после чего добавляли триптофан в конечной концентрации 100 мкг/мл для индукции экспрессии G-CSF из плазмиды рХХ 7. Через один час после индукции температуру инокуляции повышали с 30 до 37 С и выдерживали клетки в течение ночи при 37 С. Клетки центрифугировали и объем среды уменьшали до 10 мл. И наконец, культуры разводили и культивировали на А) пластинках с LBA, В) пластинках с RMG и С) пластинках с М 9, содержащих:b) 100 мкг/мл ампициллина и при необходимости 50 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл рифампицина; и инкубировали в течение трех дней при 30 С. Значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к рифампицину для штаммовJM83 рХХ 7, JМ 83 рХХ 7 рTrc и JM83 рХХ 7 pmutL приведены на фиг. 8. Штамм-продуцент JM83 рХХ 7 имеет значение SMF, равное примерно 0,45. Указанное значение SMF сохраняется при дополнительном введении "пустого" вектора рTrc в штамм-продуцент. Но дальнейшее введение pmutL в штамм JM83 рХХ 7 вызывает уменьшение значения SMF при сверхэкспрессии MutL примерно в 2 раза.- 22009058 В) Определение частоты спонтанных мутаций (SMF) в E.coli при культивировании клеток на фосфомицине Бактериальный штамм JM83 рХХ 7 трансформировали плазмидой pTrcHis2A и pmutL. Полученные единичные колонии очищали и для каждого штамма (JM83 рХХ 7, JM83 рTrcА и JM83 рХХ 7 pmutL) 20 независимых однозначно определяемых клеток инокулировали в среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 30 С. 10 мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды RMG, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, при 30 С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли IPTG в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии MutL из Plac плазмиды pmutL и затем добавляли триптофан в конечной концентрации 100 мкг/мл для индукции экспрессии G-CSF из Ptrp плазмиды рХХ 7. Через один час после индукции температуру инокуляции повышали с 30 до 37 С и выдерживали клетки в течение ночи при 37 С. Клетки центрифугировали и объем среды уменьшали до 1 мл. И наконец, культуры разводили и культивировали на агаровых пластинках со средой LB, содержащей: а) 100 мкг/мл ампициллина и при необходимости 50 мкг/мл канамицина;b) 100 мкг/мл ампициллина и при необходимости 50 мкг/мл канамицина и 30 мкг/мл фосфомицина; и инкубировали в течение трех дней при 30 С. Значения частоты спонтанных мутаций в отношении устойчивости к фосфомицину для штаммовJM83 рХХ 7, JM83 pXX7 рTrc и JM83 рХХ 7 pmutL приведены на фиг. 9. Штамм-продуцент JM83 рХХ 7 имеет значение SMF, равное примерно 4,9. Указанное значение SMF сохраняется при дополнительном введении "пустого" вектора рTrc в штамм-продуцент. Но дальнейшее введение pmutL в штамм JM83 рХХ 7 вызывает уменьшение значения SMF при сверхэкспрессии MutL примерно в 3 раза. Краткий обзор и заключение: Сверхэкспрессия MutL уменьшает мутабильность в штаммепродуценте G-CSF примерно в 3 раза и повышает жизнеспособность клеток в 103 раз. С) Определение частоты спонтанных мутаций в штамме E.coli JM83pXX7 путем введения геноврепортеровb) Экпрессия и подавление G-CSF Поскольку активность G-CSF контролировать нельзя, в плазмиду рХХ 7 были введены генырепортеры. Мутагенез анализировали в двух разных системах. В первой системе был использован ген устойчивости к хлорамфениколу, контролируемый слабым промотором. Спонтанные мутации, такие как точковые мутации, делеции и инсерции, которые дезактивируют экспрессию гена cm, уменьшают устойчивость к хлорамфениколу. Отсутствие MutL должно быть выражено в виде уменьшения отношения числа спонтанных мутаций, сообщающих устойчивость к хлорамфениколу, к общему числу жизнеспособных клеток в культуре. Во второй системе использовали кластер, содержащий молчащий ген tetA, контролируемый промотором PR бактериофага , и репрессорcl, препятствующий экспрессии tetA. Спонтанные мутации, такие как точковые мутации, делеции и инсерции, которые инактивируют cl или удаляют сайт связывания cl, вызывают дерепрессию PR и, таким образом, запускают экспрессию tetA. ЭкспрессияMutL должна быть выражена в виде уменьшения отношения числа спонтанных мутаций, сообщающих устойчивость к тетрациклину, к общему числу жизнеспособных клеток в культуре. а) Экспрессия G-CSF Бактериальный штамм JM83 трансформировали плазмидами pXX7cm, pXX7cm pTrcHis2/lacZ,pXX7cm pmutL, pXX7tet, pXX7tet pTrcHis2/lacZ и pXX7tet pmutL. Полученные единичные колонии очищали и клетки инокулировали в среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 30 С. 10 мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды RMG, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, при 30 С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли IPTG в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии MutL из Plac плазмиды pmutL, и добавляли триптофан в конечной концентрации 100 мкг/мл для индукции экспрессииG-CSF из промотора Ptrp плазмиды рХХ 7. Через один час после индукции температуру инокуляции повышали с 30 до 37 С и выдерживали клетки в течение ночи при 37 С. Клетки центрифугировали и объем среды уменьшали до 1 мл. И наконец, культуры разводили и культивировали на агаровых пластинках со средой LB, содержащей разные антибиотики (указанные в табл. 7), и инкубировали в течение четырех дней при 30 С. Значения частоты спонтанных мутаций в гене-репортере устойчивости к хлорамфениколу для штаммов JM83 pXX7cm, JM83 pXX7cm pTrc и JM83 pXXcm pmutL показаны на фиг. 10. Для двух штаммов JM83 рХХ 7cm и JM83 рХХ 7 рTrc значения мутабильности были равны 0,28 или 0,35 (1,25). Экспрессия MutL уменьшает значение мутабильности до 0,49 (А 1,75). Из вышеизложенного следует, что экспрессия MutL подавляет конверсию устойчивости к хлорамфениколу в чувствительность к хлорамфениколу и, таким образом, противодействует закреплению спонтанной мутации в хромосоме. Значения частоты спонтанных мутаций в молчащем гене-репортере tetA для штаммов JM83pXX7tet, JM83 pXX7tet pTrc и JM83 pXX7tet pmutL показаны на фиг. 11. Для двух штаммов JM83pXX7tet и JM83 pXX7tet pTrc значения мутабильности были равны 0,43 или 0,39 (1,1). Экспрессия MutL уменьшает значение мутабильности до 0,25 (1,72). Из вышеизложенного следует, что экспрессия MutL подавляет конверсию чувствительности к тетрациклину в устойчивость к тетрациклину и, таким образом, противодействует закреплению спонтанных мутаций в хромосоме.b) Экспрессия и подавление G-CSF Бактериальный штамм дикого типа JM83 трансформировали плазмидами pXX7cm, pXX7cmpTrcHis2/lacZ, pXX7cm pmutL, pXX7tet и pXX7tet pTrcHis2/lacZ и pXX7tet pmutL. Полученные единичные колонии очищали и клетки инокулировали в среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 30 С. 10 мкл ночных культур указанных бактерий инокулировали в 10 мл среды RGM, содержащей 50 мкг/мл канамицина и при необходимости 100 мкг/мл ампициллина, при 30 С. Во время фазы экспоненциального роста добавляли IPTG в конечной концентрации 1 мМ для усиления экспрессии MutL из промотора Ptrс плазмиды prautL. Культуры делили пополам и добавляли триптофан в конечной концентрации 100 мкг/мл для индукции экспрессии G-CSF из промотора Ptrp плазмиды рХХ 7. Через один час после индукции температуру инокуляции повышали с 30 до 37 С и выдерживали клетки в течение ночи при 37 С. Клетки центрифугировали и объем среды уменьшали до 1 мл. И наконец, культуры разводили и культивировали на агаровых пластинках со средом LB, содержащей разные антибиотики (см. табл. 7), и инкубировали в течение ночи при 37 С. Мутабильность модифицированного штамма-продуцента JM83 рХХcm в условиях ферментации показана на фиг. 12. При отсуствии G-CSF измеренная частота устойчивости к хлорамфениколу изменялась в пределах от 50 до 55 для штаммов JM83 рХХ 7cm, JM83 рХХ 7cm рTrc и JM83 pXX7cm pmutL. Индукция G-CSG уменьшает указанные значения для штаммов JM83 pXX7tet и JM83 pXX7tet рTrc в 3 раза. Но для штамма JM83 рХХ 7 pmutL устойчивость к хлорамфениколу сохраняется при экспрессии G-CSF. Экспрессия MutL подавляет конверсию устойчивости к хлорамфениколу в чувствительность к хлорамфениколу. MutL противодействует закреплению спонтанных мутаций в хромосоме. На фиг. 13 показано значительное увеличение мутабильности в модифицированном штаммепродуценте JM83 рХХ 7 в условиях ферментации. Но для штамма JM8 3 рХХ 7 pmutL, экспрессирующего кодированный плазмидой белок MutL, устойчивость к тетрациклину остается постоянной при экспрессии G-CSF. Экспрессия MutL подавляет конверсию устойчивости к тетрациклину в чувствительность к тетрациклину и противодействует закреплению спонтанных мутаций в хромосоме. Заключение и краткий обзор: полученные результаты показывают, что сверхэкспрессия MutL уменьшает мутабильность в штамме, ферментирующем G-CSF, во время продуцирования G-CSF примерно в 3 раза. Кроме того, установлено, что сверхэкспрессия MutL повышает жизнеспособность клеток в 103 раз. Индукция G-CSF повышает частоту спонтанных мутаций в испытанных штаммах-продуцентах примерно в 2-3 раза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ уменьшения частоты спонтанных мутаций в клетке или организме путем введения в указанную клетку или организм по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК. 2. Способ получения клетки или организма с уменьшенной частотой спонтанных мутаций путем введения по меньшей мере в одну клетку организма по меньшей мере двух мутаций, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК, и реге- 25009058 нерации организма из указанной клетки, если данный организм является многоклеточным организмом. 3. Способ по п.1 или 2, в котором клетка является прокариотической клеткой. 4. Способ по п.3, в котором прокариотическая клетка является клеткой архебактерии или эубактерии. 5. Способ по п.4, в котором клетка эубактерии является клеткой грамположительной или грамотрицательной бактерии. 6. Способ по п.1 или 2, в котором клетка является эукариотической клеткой. 7. Способ по п.6, в котором эукариотическая клетка является грибной клеткой, животной клеткой или растительной клеткой. 8. Способ по любому из пп.1, 2 или 5-7, в котором организм является грибом, животным или растением. 9. Способ по любому из пп.1-8, в котором объединенное действие по меньшей мере двух мутаций приводит к усилению способности по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации. 10. Способ по п.9, в котором усилена способность системы репарации ошибочно спаренных оснований, системы пострепликативной репарации и/или системы SOS-репарации исправлять спонтанно возникающие мутации. 11. Способ по любому из пп.1-10, в котором по меньшей мере две мутации выбраны из мутации,приводящей к повышению экспрессии белка MutL или гомологичного ему белка, мутации, приводящей к повышению экспрессии белка MutS или гомологичного ему белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный ей белок, и аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного ей белка. 12. Способ по п.11, в котором повышение экспрессии MutL, MutS или гомологичного им белка достигается путем введения в клетку вектора, содержащего ген mutL, ген, кодирующий гомологичный белокMutL, ген mutS или ген, кодирующий гомологичный белок MutS, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих сверхэкспрессию MutL, MutS или гомологичного им белка. 13. Способ по п.12, в котором вектор является многокопийной плазмидой. 14. Способ по п.11 или 12, в котором регуляторная единица является индуцибельным или конститутивным промотором. 15. Способ по п.11, в котором повышение экспрессии MutL, MutS или гомологичного им белка достигается путем введения в хромосому (хромосомы) клетки-хозяина одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена mut под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц и/или путем введения одной или нескольких мутаций в указанные регуляторные единицы, контролирующие экспрессию нативного белка Mut, так, чтобы продуцирование соответствующего белка Mut увеличивалось по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа. 16. Способ по п.11, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV, представляет собой dinB10. 17. Способ по п.11, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего субъединицу ДНКполимеразы III, представляет собой dnaE911. 18. Способ по любому из пп.1-17, в котором объединенное действие dinB10 и dnaE911 уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой или организмом дикого типа по меньшей мере в 10 раз. 19. Способ по любому из пп.1-18, в котором объединенное действие dinB10, dnaE911 и сверхэкспрессированного белка mutL уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой или организмом дикого типа по меньшей мере в 50 раз. 20. Способ по любому из пп.1-19, в котором объединенное действие по меньшей мере двух мутаций повышает жизнеспособность клетки. 21. Клетка с уменьшенной частотой спонтанных мутаций и/или повышенной жизнеспособностью,полученная способом по любому из пп.1-20, которая содержит по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК. 22. Клетка по п.21, которая является бактериальной, грибной, растительной или животной клеткой. 23. Организм с уменьшенной частотой спонтанных мутаций, полученный способом по любому из пп.1-20, где клетки этого организма содержат по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых вызывает усиление по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК. 24. Штамм E.coli MG1655dinB10, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17016). 25. Штамм E.coli MG1655dinB10 mutLtet, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17017). 26. Штамм E.coli MG1655 dnaE zaecm, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17018). 27. Штамм E.coli MG1655 dnaE zaecm mutLtet, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17019). 28. Штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zaecm (DSM 17015). 29. Штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zaecm mutLtet (DSM 17014).- 26009058 30. Штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zaecm, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17020). 31. Штамм E.coli MG1655dinB10 dnaE zaecm mutLtet, содержащий плазмиду pmutL (DSM 17021). 32. Способ создания экспрессирующей системы для белка, аминокислотная последовательность которого стабилизирована в отношении спонтанно возникающих мутаций, который включает в себяa) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в геном клеткихозяина, содержащей по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка; илиb) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка, и перенос указанного вектора в клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации; иc) культивирование и/или поддержание клетки-хозяина в соответствующей среде. 33. Способ продуцирования белка, аминокислотная последовательность которого стабилизирована в отношении спонтанно возникающих мутаций, который включает в себяa) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в геном клеткихозяина, содержащей по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка; илиb) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, в вектор под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих индуцибельную или конститутивную экспрессию белка, и перенос указанного вектора в клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере две мутации, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации;c) культивирование клетки-хозяина в соответствующей среде в условиях, обеспечивающих экспрессию данного белка; иd) выделение экспрессированного белка. 34. Способ по п.33, в котором белок выделяют из среды. 35. Способ по п.33, в котором белок экстрагируют из клетки-хозяина. 36. Способ по любому из пп.32-35, в котором белок является терапевтически пригодным белком, в частности, цитокином или фактором роста. 37. Способ по любому из пп.32-36, в котором вектор является плазмидой, бактериофагом или космидой. 38. Способ по любому из пп.32-37, в котором регуляторная единица является промотором, сайтом связывания рибосомы, энхансером, сайленсером и/или 3'-концевым терминатором транскрипции. 39. Способ по любому из пп.32-38, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, функционально связана с лидерной последовательностью, направляющей перенос экспрессированного белка в клеточную органеллу, клеточный компартмент, внеклеточное пространство или среду. 40. Способ получения продукта ферментации путем культивирования в среде клетки, продуцирующей продукт ферментации, и/или по меньшей мере одного фермента, участвующего в образовании продукта ферментации, в котором геном клетки стабилизирован в отношении спонтанно возникающих изменений последовательности по меньшей мере двумя мутациями, объединенное действие которых усиливает способность по меньшей мере двух механизмов репарации клеточной ДНК исправлять спонтанно возникающие мутации. 41. Способ по п.40, в котором продукт ферментации является нуклеиновой кислотой, нуклеозидом,нуклеотидом, аминокислотой, белком, кислотой, углеводом, витамином, антибиотиком или алкалоидом. 42. Способ по любому из пп.32-41, в котором усилена способность системы репарации ошибочно спаренных оснований, функции исправления ошибок и/или системы SOS-репарации исправлять спонтанно возникающие мутации. 43. Способ по любому из пп.32-42, в котором по меньшей мере две мутации выбраны из мутации,приводящей к повышению экспрессии белка MutL или гомологичного белка, мутации, приводящей к повышению экспрессии белка MutS или гомологичного белка, аллеля-антимутатора гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV или гомологичный ей белок, или аллеля-антимутатора гена, кодирующего субъединицу ДНК-полимеразы III или гомологичного ей белка. 44. Способ по п.43, в котором повышение экспрессии MutL, MutS или гомологичного им белка происходит благодаря присутствию в клетке вектора, который содержит ген mutL, ген, кодирующий гомологичный белок MutL, ген mutS или ген, кодирующий гомологичный белок MutS, под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц, обеспечивающих сверхэкспрессию MutL,MutS или гомологичного им белка.- 27009058 45. Способ по п.43, в котором повышение экспрессии MutL, MutS или гомологичного им белка достигается путем введения в хромосому (хромосомы) клетки-хозяина одной или нескольких дополнительных копий соответствующего гена mut под функциональным контролем одной или нескольких регуляторных единиц и/или введения одной или нескольких мутаций в указанные регуляторные единицы, контролирующие экспрессию нативного белка Mut так, чтобы продуцирование соответствующего белка Mut увеличивалось по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа. 46. Способ по п.43, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего ДНК-полимеразу IV, представляет собой dinB10. 47. Способ по п.43, в котором аллель-антимутатор гена, кодирующего субъединицу ДНКполимеразы III, представляет собой dnaE911. 48. Способ по любому из пп.32-47, в котором объединенное действие dinB10 и dnaE911 уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой дикого типа по меньшей мере в 10 раз. 49. Способ по любому из пп.32-48, в котором объединенное действие dinB10, dnaE911 и сверхэкспрессированного белка mutL уменьшает частоту спонтанных мутаций по сравнению с клеткой дикого типа по меньшей мере в 50 раз. 50. Способ по любому из пп.32-49, в котором объединенное действие по меньшей мере двух мутаций повышает жизнеспособность клетки. 51. Способ по любому из пп.32-50, в котором клетка является прокариотической или эукариотической клеткой. 52. Способ по п.51, в котором клетка является клеткой грамположительной или грамотрицательной бактерии. 53. Способ по п.51, в котором клетка является грибной клеткой, животной клеткой или растительной клеткой. 54. Способ по любому из пп.32-53, в котором клетка является клеткой по любому из пп.21, 22 или 24-31 или полученной способом по любому из пп.1-20. 55. Способ по любому из пп.32-54, в котором клетку культивируют в жидкой среде. 56. Способ по п.55, в котором клетку культивируют в непрерывной культуре или периодической культуре. 57. Способ по любому из пп.32-56, в котором клетка является иммобилизованной. 58. Способ по любому из пп.32-54, в котором клетку культивируют на твердой или полутвердой среде. 59. Способ по любому из пп.40-58, в котором продукт ферментации выделяют из клетки. 60. Способ по любому из пп.40-58, в котором продукт ферментации выделяют из среды. 61. Белок, полученный способом по любому из пп.32-60. 62. Продукт ферментации, полученный способом по любому из пп.40-60.
МПК / Метки
МПК: C12N 1/20, C12N 15/09, C12Q 1/02, C12N 15/63
Метки: клетках, уменьшение, мутаций, спонтанных, частоты
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-9058-umenshenie-chastoty-spontannyh-mutacijj-v-kletkah.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Уменьшение частоты спонтанных мутаций в клетках</a>
Предыдущий патент: Способ получения (s)- или (r)-4-галоген-3-гидроксибутиратов
Следующий патент: Замещенные производные азабициклогексана в качестве антагонистов мускаринового рецептора
Случайный патент: Фармацевтические пероральные композиции с пролонгированным высвобождением, включающие производные 2-оксо-1-пирролидина