Способ увеличения содержания общих или растворимых углеводов или сахаристости эндогенных углеводов путем каталитического превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар

008669 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение в общем плане касается способов увеличения выхода веществ, продуцируемых организмом. В частности, настоящее изобретение касается способов увеличения общего содержания или содержания растворимых углеводов, или сахаристости, или увеличения содержания эндогенных углеводов в ткани растения с помощью продукции фермента, метаболизирующего сахар, который катализирует превращение эндогенного сахара (сахара, обычно производимого растением) в чужеродный сахар (сахар, который обычно не производится растением на данной стадии развития). Изобретение также касается растений или частей растений, которые продуцируют фермент, метаболизирующий сахар с образованием чужеродного сахара, что приводит к увеличению общего содержания сбраживаемых углеводов, и сбраживаемых углеводов и других образующихся из них продуктов. Полная библиография цитированных в настоящем описании публикаций приведена в конце описания изобретения. Уровень техники Растения являются основным источником возобновляемой биоэнергии, биоматериалов и промышленного сырья для промышленной биотрансформации. Выход и концентрация желательных сахаров в растениях являются ключевыми факторами, определяющими техническую и экономическую целесообразность последующих технологических процессов. Однако метаболические процессы в растениях,обеспечивающие биосинтез сахаров, демонстрируют значительную внутреннюю забуференность и избыточность. Следствием этого является тот факт, что изменение ключевого гена, обеспечивающего метаболизм сахара в растении, обычно не приводит к значительному полезному изменению выхода нужного сахара (Moore, 1995; Nguyen-Quoc and Foyer, 2001; Fernie et al., 2002). Например, Botha et al. (2001) показали, что уменьшение на 70% активности ключевого фермента, обеспечивающего распад сахарозы (кислая инвертаза), не приводит к заметному изменению выхода или чистоты сахарозы в трансгенном сахарном тростнике. Сахарозоизомеразы являются ферментами, продуцируемыми многими организмами, включая различные микроорганизмы, способные превращать дисахарид сахарозу в такие ее изомеры, как изомальтулоза (палатиноза) или трегалулоза. Сахарозоизомеразы различаются по своим свойствам, включая набор дисахаридных продуктов реакции, соотношение моносахаридов, таких как глюкоза и фруктоза, среди продуктов реакции, кинетические свойства ферментов, оптимальные условия для протекания реакции и чувствительность фермента к отклонению от оптимальных условий (Veronese and Perlot, 1999). Сахароза является главным промежуточным продуктом в потоке углерода от продуцирующих (фотосинтезирующих) тканей к потребляющим (растущие и запасающие) тканям в растении, кроме того, она является первичным запасным продуктом в определенных растениях, таких как сахарный тростник или сахарная свекла. В ряде работ указывается, что экспрессия введенных в растения генов сахарозоизомераз может приводить к превращению сахарозы в е изомеры, такие как изомальтулоза, и отмечается, что такое превращение может быть выгодно для промышленного производства такого изомера. Основной акцент в таких работах делается на максимально большое или полное превращение сахарозы в ее изомер желательный продукт для промышленного использования (Birch and Wu, 2002; Brnke et al., 2002b), или предшественник для дальнейшего превращения in planta в подходящие для промышленного использования материалы (Kunz et al., 2002). Также обсуждается вопрос, что такое превращение может быть летальным для клеток растения, если значительная часть углерода и запасов энергии будет переведена в недоступную растению форму, что может использоваться для уничтожения определенных клеток, например, при экспериментальном получении мужской стерильности (Brnke and Sonnewald, 2001). Действительно, в ряде работ сообщается, что трансгенная экспрессия сахарозоизомераз опасна для развития и продуктивности растений, вызывая тяжелые нарушения роста, снижение содержания крахмала и снижение содержания растворимых углеводов (Brnke et al., 2002a, b). В растениях табака были обнаружены тяжелые и повреждающие эффекты на развитие растения при конститутивной экспрессии под контролем промотора CaMV35S гена сахарозоизомеразы, слитого с сигнальным пептидом ингибитора II протеиназы картофеля для направления сахарозоизомеразы во внеклеточное пространство (апоплазму). Были обнаружены низкие уровни изомальтулозы (от 0,3 до 0,6 мМ на 1 м поверхности ткани листьев), что примерно эквивалентно 20-44% от нормальных уровней углеводов в крахмале листьев или в 10-45 раз превосходящие нормальные промежуточные уровни сахарозы в этой фотосинтезирующей ткани. О влиянии на уровень запасных углеводов в потребляющих тканях ничего не сообщалось. При этом сильно нарушался рост листьев и других органов, и растения теряли способность к размножению (Brnke et al., 2002 а). В растениях картофеля экспрессия подобной секретируемой в апоплазму сахарозоизомеразы под специфичным для клубней промотором пататина В 33 не приводит к появлению неблагоприятных последствий для роста и развития растений. Выход изомальтулозы также был низким (10-15 мкмоль на 1 г сырого веса ткани клубня, что эквивалентно примерно 4-5% от нормального уровня запасных углеводов в крахмале клубня), и немного ниже обычных уровней сахарозы в этой запасающей крахмал ткани. Более того, поскольку это сопровождалось снижением содержания сахарозы, гексоз и крахмала, общий выход-1 008669 растворимых углеводов (за исключением крахмала) и общее содержание сбраживаемых углеводов(включая крахмал) в модифицированных линиях растений были снижены (Brnke et al., 2002b). Для преодоления этих проблем в настоящем изобретении предлагается новый подход, основанный на комбинации (i) фермента сахарозоизомеразы, главным образом высокоэффективной сахарозоизомеразы, такой как UQ68J; (ii) использования видов растений, таких как сахарный тростник, которые накапливают сахарозу в качестве запасного углевода; и (iii) адресной доставки введенной сахарозоизомеразы в запасающие сахарозу компартменты растения, например, в крупные вакуоли запасающей сахарозу паренхимы зрелых стеблей в случае сахарного тростника. Поскольку изомальтулоза не метаболизируется в растениях, настоящее изобретение предполагает, что в отличие от сахарозы она в зрелых запасных тканях не будет вовлекаться в футильные циклы деградации и синтеза, которые могут снижать эффективность хранения углеводов и их полезный выход. Таким образом, предлагаемый подход настоящего изобретения направлен на достижение более высоких выходов растворимых углеводов и сбраживаемых углеводов в модифицированных растениях, в отличие от более низкого их выхода, как сообщалось в предыдущих работах. В соответствии с высказанной гипотезой было обнаружено, что в соке сахарного тростника концентрация изомальтулозы может достигать величин более 500 мМ при экспрессии сахарозоизомеразы (например, высокоэффективной сахарозоизомеразы UQ68J), адресно направленной в запасающие сахарозу вакуоли паренхимы зрелых стеблей. Это превышает общее содержание запасных углеводов в немодифицированном сахарном тростнике и может достигаться без соизмеримого снижения содержания эндогенных сахаров, что приводит к значительно более высокому общему содержанию растворимых сахаров в модифицированных линиях растений. Растения имеют высоко адаптированные сенсоры и транспортеры для сахарозы, однако обычно предполагается, что эти сенсоры и транспортеры сахарозы не способны отвечать аналогичным: образом на такие е изомеры, как изомальтулоза (Loreti et al., 2000; Sinha et al., 2002). В полную противоположность сахарозе, растения не способны метаболизировать некоторые е изомеры, такие как изомальтулоза,как источник углерода и энергии (Sinha et al., 2002). Тем не менее, изомеры могут вызывать изменения в наборе экспрессируемых клеткой генов и модифицировать активности некоторых ферментов, участвующих в метаболизме сахарозы или в каскадах трансдукции сигналов в растениях (Fernie et al., 2001; Sinhaet al., 2002). Поскольку экзогенная доставка изомальтулозы в срезы ткани клубней картофеля изменяла метаболизм других экзогенно доставляемых сахаров, Fernie et al., (2001) предположили, что доставка изомальтулозы в клубни картофеля представляет собой новый путь для повышения уровня синтеза крахмала. Однако экзогенная доставка подобных изомальтулозе веществ в такие органы растения, как клубни картофеля, не годится для практического использования в промышленных целях. Пока не было сообщений,что такой подход был испытан или применен для повышения выхода крахмала. В работах Brnke et al.,(2002b) трансгенные растения картофеля, экспрессирующие ген апоплазматической сахарозоизомеразы под специфичным для клубня промотором, накапливали изомальтулозу в количествах, достигающих нормального содержания сахарозы в клубнях, но демонстрировали сниженный выход крахмала и общих растворимых сахаров. Основываясь на предположении о различной способности растений чувствовать сахарозу и родственные вещества, такие как изомальтулоза, в настоящем изобретении был предложен другой подход для достижения повышенных выходов эндогенных сахаров в растениях с помощью подходящей экспрессии введенной сахарозоизомеразы. Этот подход отличается по своим целям от ранее сформулированных стратегий (вывести растения для получения изомальтулозы или производных изомальтулозы) и способен преодолеть их недостатки (растения с пониженными выходами эндогенных углеводов). Поскольку сигнальные и контролирующие механизмы, задействованные в метаболизме растений, пока полностью не известны, в настоящем изобретении была проведена значительная экспериментальная работа для определения границ условий, позволяющих получить желательный промышленный эффект (растения с повышенным выходом эндогенных углеводов). В связи с этим было обнаружено, что общее содержание растворимых сахаров в соке на уровне 700-900 мМ в сахарозном эквиваленте может быть достигнуто в линиях сахарного тростника, сконструированных для осуществления экспрессии на низком уровне сахарозоизомеразы, направленной в цитозольный компартмент, или присутствующей в обоих (цитозоль и апоплазма) компартментах. Этот подход позволяет примерно удвоить общее содержание запасных углеводов, обычно получаемое из немодифицированного сахарного тростника, и сопровождается незначительным изменением состава получаемых сахаров. Данный подход не ограничивается только геном сахарозоизомеразы, продуктом превращения изомальтулозой или растением сахарного тростника, которые были взяты в качестве примера. В более широком смысле он охватывает экспрессию в организме определенного введенного гена, что приводит к частичному превращению эндогенного вещества-субстрата,который в норме ощущается организмом, в вещество-продукт, которое не воспринимается организмом эквивалентным образом, что изменяет метаболические потоки и, как следствие, приводит к более высоким выходам желаемых эндогенных соединений.-2 008669 Раскрытие изобретения Настоящее изобретение основывается отчасти на открытии того факта, что при определенном способе экспрессии гена в растении, приводящей к превращению части эндогенного сахара в сахар, который обычно не продуцируется в растении на данной стадии развития, изменяется передача сигнала между продуцирующими и запасающими сахара частями растения, и это приводит к увеличению общего содержания растворимых углеводов, в том числе и сахаров, в растении. Это открытие было сведено на практике в форме методов для модификации общего содержания углеводов или сахаристости запасающих тканей растений, генетически модифицированных растений, запасающие ткани которых имеют более высокое содержание общих или растворимых углеводов или более высокую сахаристость, чем ткани немодифицированных растений, и продуктов, получаемых из таких генетически модифицированных растений. В соответствии с этим одним из аспектов настоящего изобретения являются способы, обеспечивающие изменение общего содержания растворимых сахаров или сахаристости запасающих тканей растения. Эти способы, как правило, включают в себя продукцию в клетках растения метаболизирующих сахара ферментов, которые катализируют превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар, который обычно не продуцируется в растении на данной стадии развития. В результате определенного уровня продукции метаболизирующего сахар фермента или определенного уровня его функциональной активности общее содержание углеводов или сахаристость запасающей ткани увеличивается по сравнению с соответствующей запасающей тканью растения, которое не продуцирует этот фермент. В некоторых воплощениях изобретения, метаболизирующий сахар фермент продуцируется в клетках растения с помощью экспрессии полинуклеотида, кодирующего данный фермент. В этих воплощениях растение представляет собой трансгенное растение, выбираемое из множества трансгенных растений на том основании, что оно содержит в своем нуклеоме кодирующий фермент полинуклеотид, функционально связанный с регуляторным элементом транскрипции. Такое трансгенное растение выбирается на основании того, что оно продуцирует метаболизирующий сахар фермент на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание или содержание растворимых углеводов или сахаристость запасающей ткани выбранного трансгенного растения является увеличенным по сравнению с этими параметрами соответствующей запасающей ткани контрольного растения. Соответственно, в клетках таких растений полинуклеотид функционально связан с регулирующим транскрипцию элементом, функциональным в растительных клетках. В некоторых воплощениях полинуклеотид, кодирующий фермент,экспрессируется конститутивно, и контролирующий его транскрипцию элемент является, таким образом,конститутивным промотором. В других воплощениях полинуклеотид, кодирующий фермент, экспрессируется селективно, что включает координацию экспрессии во времени, тканеспецифичную экспрессию и внутриклеточную локализацию фермента. В этих последних воплощениях элемент, контролирующий транскрипцию, выбирается из тканеспецифичного промотора, из промотора, регулируемого в процессе развития, или из индуцибельного промотора. В некоторых воплощениях общее содержание углеводов или сахаристость запасающей ткани увеличивается в результате продукции в клетках растения фермента, метаболизирующего сахар, на таком уровне или с такой функциональной активностью, которая приводит к частичному превращению, что составляет обычно менее чем примерно 20%, но, как правило, менее чем примерно 15%, и чаще менее чем примерно 10% превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар. Соответственно, частичное превращение осуществляется в тканях, претерпевающих деление клеток и/или рост клеток, обеспечивающие рост растения. В этих воплощениях фермент, метаболизирующий сахар, имеет подходящий уровень активности в цитоплазме клеток растения, или его активность может быть распределена между цитоплазмой и субклеточными компартментами, участвующими в запасании и/или транспорте сахаров. Соответственно, в этих воплощениях чужеродный сахар накапливается без соизмеримого снижения содержания эндогенных сахаров или углеводов. В других воплощениях общее содержание углеводов или сахаристость запасающей ткани увеличивается путем адресования фермента, метаболизирующего сахар, в определенный компартмент клетки растения, который участвует в запасании сахаров. В этих воплощениях фермент, метаболизирующий сахар, присутствует в соответствующем внутриклеточном компартменте в таком количестве или с такой функциональной активностью, которая приводит к превращению значительного количества, которое обычно составляет по меньшей мере примерно 20%, но, как правило, по меньшей мере около 40%, и более часто по меньшей мере примерно 60% превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар. Соответственно, такое значительное превращение осуществляется в тканях, которые по существу прекратили деление клеток или рост клеток и которые используются для запасания углеводов. Желательно, чтобы значительное превращение сахара не происходило в тканях, претерпевающих деление клеток и/или рост клеток, обеспечивающие рост растения. Подходящим внутриклеточным компартментом является компартмент, отвечающий за запасание сахаров, обычно вакуоль или вакуоль и апоплазматическое пространство. Соответственно, в этих воплощениях чужеродный сахар накапливается без соизмеримого уменьшения содержания эндогенных сахаров или углеводов. Как правило, к клеткам растений, которые функционируют в качестве запасников углерода, отно-3 008669 сятся клетки нефотосинтезирующих тканей или органов и запасающих тканей или органов, например корней, клубней, стеблей, плодов или семян, а также нефотосинтезирующие клетки продуцирующих органов, например листьев. В соответствии с этим, в качестве растений для генноинженерных манипуляций используются растения, экономическая ценность тканей которых определяется содержанием в них сахаров. К таким растениям относятся виды, используемые для получения овощей и фруктов в коммерческих целях, а также виды, которые выращиваются для экстракции из них сахарозы и других сахаров, в частности сахарный тростник и сахарная свекла. Пригодный эндогенный сахар и чужеродные сахара выбираются из моносахаридов, олигосахаридов и производных сахаров, включая сахароспирты, сахарные кислоты, аминосахара и другие варианты, такие как дезоксисахара, метилированные сахара и тому подобное. В одном из воплощений эндогенным сахаром является сахароза, а чужеродный сахар выбирается из изомальтулозы и трегалулозы. В этом воплощении ферментом, метаболизирующим сахар, обычно является сахарозоизомераза. В одном из своих родственных аспектов настоящее изобретение обеспечивает способы получения растения с такой запасающей тканью, которая имеет увеличенное содержание эндогенных углеводов по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения. Эти способы обычно включают в себя отбор трансгенного растения с желательным содержанием эндогенных углеводов из большого количества трансгенных растений, в нуклеом которых введен полинуклеотид, функционально связанный с регулирующим транскрипцию элементом, кодирующий метаболизирующий сахар фермент, который катализирует превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар. Трансгенное растение выбирается на основании того, что оно продуцирует фермент, метаболизирующий сахар, на таком уровне или с такой функциональной активностью, что содержание эндогенных углеводов в запасающей ткани или органе трансгенного растения увеличено по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения. В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает клетку трансгенного растения, имеющую повышенное общее содержание углеводов или повышенное содержание эндогенных углеводов по сравнению с клетками контрольного растения, как здесь определено. Нуклеом клетки трансгенного растения включает в себя контролирующий транскрипцию элемент, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим фермент, метаболизирующий сахар. Фермент, метаболизирующий сахар, катализирует превращение эндогенного сахара растительной клетки в чужеродный сахар. Преимущественно, фермент, метаболизирующий сахар, продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание углеводов или содержание эндогенных углеводов в клетках трансгенного растения увеличивается по сравнению с клетками контрольного растения. В еще одном из своих аспектов настоящее изобретение обеспечивает трансгенное растение, имеющее запасающую ткань с увеличенным общим содержанием углеводов или с увеличенной сахаристостью, или с увеличенным содержанием эндогенных углеводов по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения, как здесь определено. Трансгенное растение включает в себя клетки, которые имеют в своем нуклеоме полинуклеотид, кодирующий метаболизирующий сахар фермент, который катализирует превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар. Для осуществления экспрессии полинуклеотид функционально связан с регулирующим транскрипцию элементом,который функционален в клетках растения. В одном из воплощений фермент, метаболизирующий сахар,продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание углеводов или сахаристость, или содержание эндогенных углеводов в запасающей ткани трансгенного растения увеличено по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения. В еще одном из своих аспектов настоящее изобретение обеспечивает запасающую ткань трансгенного растения, в которой увеличено общее содержание углеводов или сахаристость, или содержание эндогенных углеводов по сравнению с запасающей тканью контрольного растения, как здесь определено. Запасающая ткань трансгенного растения включает в себя клетки, в нуклеом которых включен полинуклеотид, кодирующий метаболизирующий сахар фермент, который катализирует превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар. Для осуществления экспрессии полинуклеотид функционально соединен с регулирующим транскрипцию элементом, который является функциональным, по меньшей мере, в некоторых клетках растения. В одном из воплощений фермент, метаболизирующий сахар, продуцируется в производящей и/или запасающей тканях растения на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание углеводов или сахаристость, или содержание эндогенных углеводов в запасающей ткани трансгенного растения увеличено по сравнению с запасающей тканью контрольного растения. Соответственно, запасающая ткань выбирается из плодов, семян, стеблей, клубней или корней. Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает общие углеводы или эндогенные углеводы,выделяемые из растения или запасающей ткани, как в широком смысле описано выше. В одном из воплощений углеводы выбираются из простых сахаров, включая сахарозу, глюкозу и фруктозу. В следующем своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения продукта с помощью ферментации, который обычно включает в себя ферментирование углеводов, являющихся субстратами для ферментации и которые получают из растения или запасающей ткани растения, как в об-4 008669 щих чертах описано выше. Продукт ферментации, получаемый таким способом, как правило, включает в себя один или более компонентов, таких как этанол, уксусная кислота, молочная кислота, углекислый газ или другие продукты, получающиеся в результате ферментации субстратов, включающих в себя углеводы, выделенные из растения или запасающей ткани, как в общих чертах описано выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы для продуцирования в растении чужеродного сахара, который эндогенно не продуцируется растением на данной стадии развития как эндогенный сахар. Эти способы обычно включают в себя адресную доставку в субклеточный компартмент, используемый для запасания сахаров в клетках растения, метаболизирующего сахар фермента,который катализирует превращение эндогенного сахара в чужеродный сахар. В некоторых воплощениях субклеточный компартмент выбирается из вакуоли или апоплазматического пространства. Фермент, метаболизирующий сахар, преимущественно доставляется в субклеточный компартмент на таком уровне или с такой функциональной активностью, которые приводят к значительному увеличению общего содержания сахара, обычно по меньшей мере примерно на 10%, но предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, и более предпочтительно по меньшей мере примерно на 100% выше содержания эндогенного сахара в соответствующем немодифицированном растении. Соответственно, чужеродный сахар накапливается без соизмеримого уменьшения содержания эндогенных сахаров или углеводов. В еще одном из своих аспектов настоящее изобретение обеспечивает клетку трансгенного растения,которая включает в себя чужеродный сахар, как здесь описано. Нуклеом клеток трансгенного растения включает в себя регуляторный элемент транскрипции, функционально связанный с полинуклеотидом,который кодирует метаболизирующий сахар фермент, катализирующий превращение эндогенного сахара клеток растения в чужеродный сахар. Фермент, метаболизирующий сахар, включает в себя сигнальную последовательность, которая обеспечивает адресную доставку фермента в субклеточный компартмент,используемый в клетке растения для запасания сахаров. В другом своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает трансгенное растение, имеющее запасающую ткань, которая накапливает чужеродный сахар, как здесь определено. Трансгенное растение включает в себя клетки, в нуклеоме которых содержится полинуклеотид, кодирующий метаболизирующий сахар фермент, катализирующий превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар; этот полинуклеотид функционально связан с транскрипционным регуляторным элементом, который функционален в клетках растения, причем фермент, метаболизирующий сахар, включает сигнальную последовательность, адресно доставляющую фермент в субклеточный компартмент, используемый для запасания сахаров в клетках растения. В другом своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает запасающую ткань трансгенного растения, которая накапливает чужеродный сахар, как здесь определено. Запасающая ткань трансгенного растения включает в себя клетки, в нуклеоме которых содержится полинуклеотид, кодирующий метаболизирующий сахар фермент, катализирующий превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар; этот полинуклеотид функционально связан с транскрипционным результатом элементом, который функционален, по меньшей мере, в некоторых клетках растения, причем фермент, метаболизирующий сахар, имеет в своем составе сигнальную последовательность, которая адресно доставляет фермент в субклеточный компартмент, используемый для запасания сахаров в клетках запасающей ткани. Соответственно, запасающая ткань выбирается из плодов, семян, стеблей, клубней или корней. Демонстрация того, что экспрессия в организме введенного гена, приводящая к частичному превращению эндогенного вещества-субстрата, которое в норме чувствуется организмом, в веществопродукт, которое не воспринимается организмом эквивалентным образом, может изменять метаболические потоки и приводить к накоплению более высоких количеств желательных эндогенных веществ,явилась в высшей степени новым и неожиданным фактом и имеет широкую промышленную применимость за рамками гена сахарозоизомеразы, продукта превращения изомальтулозы, эндогенных углеводных соединений или растений сахарного тростника, обеспечиваемых данным изобретением в виде подробно описанных примеров. В соответствии с этим, настоящее изобретение включает в себя в широком смысле экспрессию в организме введенного гена, приводящую к частичному превращению эндогенного вещества-субстрата, которое в норме ощущается организмом, в вещество-продукт, которое не воспринимается организмом эквивалентным образом, в результате чего изменяются метаболические потоки и накапливаются более высокие количества желаемых эндогенных веществ. В настоящем изобретении также описан новый промотор, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:10, который обеспечивает специфическую экспрессию генов в стеблях растений (например, однодольных, особенно травянистых однодольных, таких как сахарный тростник). Этот промотор обеспечивает удобную систему экспрессии, которая не была получена при использовании тестированных ранее промоторов, и который структурно отличается от этих промоторов по ряду параметров,включая отсутствие участка, описываемого последовательностью SEQ ID NO:20. Соответственно, настоящее изобретение в другом своем аспекте обеспечивает изолированную молекулу ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, которая соответствует или комплементарна последовательности,представленной в SEQ ID NO:10, или ее биологически активной части, или ее варианту, имеющему последовательность, идентичную по меньшей мере на 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% последовательности, пред-5 008669 ставленной в SEQ ID NO:10. Желательно, чтобы варианты не имели в своем составе последовательности,представленной в SEQ ID NO:20, и гибридизовались с последовательностью, представленной в SEQ IDNO:10, по меньшей мере, в условиях средней строгости. Как правило, в настоящем изобретении используемый промотор сливают с кодирующей последовательностью для получения химерной конструкции с целью экспрессии кодируемой последовательности в интересующем растении. Конструкцию затем можно ввести в клетку растения-хозяина, или в растение,или в часть растения с помощью любого подходящего метода. Таким образом, другим аспектом настоящего изобретения является химерная ДНК-конструкция, включающая в себя молекулу ДНК как в общем плане описано выше, функционально связанную с чужеродной или эндогенной последовательностью нуклеиновой кислоты, которая должна быть транскрибирована. В некоторых воплощениях изобретения,химерная ДНК- конструкция также включает в себя 3'-нетранслируемую последовательность, которая функционально связана с чужеродной или эндогенной последовательностью ДНК и которая выполняет в клетках растения функцию терминации транскрипции и/или обеспечивает присоединение полиаденилированной нуклеотидной последовательности к 3'-концу транскрибируемой последовательности РНК. Чужеродная или эндогенная последовательность ДНК является чужеродной или эндогенной по отношению к растительной клетке, в которую она введена или будет введена. В некоторых воплощениях изобретения чужеродная или эндогенная последовательность ДНК кодирует структурный или регуляторный белок, или вместо этого транскрипт, способный модулировать экспрессию соответствующего гена-мишени. В некоторых воплощениях изобретения транскрипт включает в себя антисмысловую РНК,или рибозим, или другой транскрибируемый участок, предназначенный для понижающей регуляции экспрессии соответствующего гена-мишени. Например, другой транскрибируемый участок может включать в себя смысловой транскрипт, предназначенный для смысловой супрессии (ко-супресии) соответствующего гена-мишени. В другом своем воплощении настоящее изобретение предусматривает способ получения трансформированных растительных клеток, включающий введение в способные к регенерации клетки растения химерной ДНК-конструкции, как в общем плане описано выше, с целью получения трансформированных растительных клеток и идентификацию или отбор трансформированных растительных клеток. В близком к этому аспекте настоящее изобретение обеспечивает трансформированную растительную клетку, содержащую химерную ДНК-конструкцию, как в общем плане описано выше. В еще одном своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ отбора стабильных генетических трансформантов из трансформированных растительных клеток, включающий введение в способные к регенерации растительные клетки химерной ДНК -конструкции, в общем плане описано выше,с целью получения трансформированных растительных клеток и идентификацию или отбор линии трансформированных растительных клеток из этих трансформированных растительных клеток. Способные к регенерации клетки могут быть способными к регенерации клетками двудольного растения, но обычно это клетки однодольного растения, например такие, как способные к регенерации клетки травянистого однодольного растения. В некоторых воплощениях изобретения экспрессия химерной ДНКконструкции в трансформированных клетках изменяет фенотипические характеристики трансформированных клеток. В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения дифференцированного трансгенного растения, включающий в себя введение химерной ДНК-конструкции, как в общем плане описано выше, в способные к регенерации растительные клетки с целью получения способных к регенерации трансформированных клеток, идентификацию или отбор популяции трансформированных клеток,и регенерацию дифференцированного трансгенного растения из этой популяции клеток. В некоторых воплощениях изобретения экспрессия химерной ДНК-конструкции обеспечивает дифференцировку трансгенного растения, легко отличимого от соответствующего нетрансгенного растения. В близком к этому аспекте настоящее изобретение обеспечивает получение дифференцированного трансгенного растения, содержащего клетки, содержащие химерную ДНК-конструкцию, как в общем плане описано выше. Химерная ДНК-конструкция передается в процессе полного цикла дифференцировки трансгенного растения его потомству так, что она экспрессируется в растениях-потомках. Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает семена, другие части растения, ткани и растения-потомки, происходящие из дифференцированного трансгенного растения. Краткое описание фигур На фиг. 1 графически представлены результаты капиллярного электрофореза растворимых сахаров из тканей листа ( 3), стебля (междоузлие 12) и молодого корня контрольного растения Q117 и растений из трансгенных линий pUbi68J1.2, pUbil4S2.36 и pUbiErw2.1. Взятые в качестве образцов растения были 6-месячного возраста и имели 12-13 узлов. Трансгенные линии представляли собой первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса. Пики: 1 - сахароза, 2 - изомальтулоза, 3 - фруктоза и 4 - глюкоза. На фиг. 2 в виде диаграмм представлена эффективность превращения сахаров различными генами сахарозоизомеразы в E.coli (А) и в стеблях трансгенных растений сахарного тростника (Б). Эффективность превращения сахаров определяется как соотношение изомальтулоза/(сахароза + изомальтулоза) х-6 008669 100. Результаты на панели (А) представляют собой средние значения и стандартные ошибки для трех повторов культур. Результаты на панели (Б) представляют собой максимальные эффективности превращения в стеблях из 11 линий pUbiErw, 11 линий pUbil4S и 9 линий pUbi68J. Взятые в качестве образцов растения сахарного тростника были 6-месячного возраста и имели от 12 до 15 узлов, первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса. На фиг. 3 представлены фотографии 6-месячных типичных растений трех фенотипических классов линий сахарного тростника, трансформированных pUbi68J. Слева: нормальное (pUbi68J2.36). В центре: растение со слабой главной жилкой (pUbi68J1.2). Справа: низкорослое (pUbi68J2.22). Растения представляют собой первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса. На фиг. 4 представлены фотографии Нозерн-блот анализа суммарной РНК из листьев и стеблей сахарного тростника. Взятые в качестве образцов растения были 6-месячного возраста и имели от 12 до 15 узлов, первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса. На верхней панели представлены результаты гибридизации с зондами кДНК сахарозоизомеразы UQ68J, размер молекул около 1700 п.о. На нижней панели показан результат разделения суммарной РНК и окрашивание бромистым этидием больших и малых субъединиц рРНК. Дорожка 1 - pUbi68J2.22, междоузлия 3-4. Дорожка 2 - pUbi68J2.22, номера листьев 1-2. Дорожка 3 - pUbi68J2.36, междоузлия 3-4. Дорожка 4 - pUbi68J2.36, номера листьев 12. Дорожка 5 - pUbi68J1.2, междоузлия 3-4. Дорожка 6 - pUbi68J1.2, номера листьев 1-2. Дорожка 7 - контрольное растение Q117, междоузлия 3-4. Дорожка 8 - контрольное растение Q117, номера листьев 1-2. На фиг. 5 представлены диаграммы, демонстрирующие высокую эффективность превращения сахарозы в изомальтулозу в стебле, листьях и корнях растений трансгенной линии pUbi68J2.22. Взятые в качестве образцов растения были 6-месячного возраста и имели 12 узлов, первое вегетативное поколение,выращенное из каллюса. На фиг. 6 представлены диаграммы, демонстрирующие накопление сахарозы в трансгенныхpUbi68J2.36 и контрольных Q117 растениях сахарного тростника. Взятые в качестве образцов растения были 6-месячного возраста и имели 15 узлов, первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса. На фиг. 7 представлены диаграммы, демонстрирующие накопление изомальтулозы в тканях стебля и листьев растений трансгенной линии pUbi68J2.36. Взятые в качестве образцов растения были 6 месячного возраста и имели 15 узлов, первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса. На фиг. 8 представлены диаграммы, демонстрирующие общую концентрацию растворимых сахаров(в глюкозных эквивалентах) в трансгенных pUbi68J2.36 и контрольных Q117 растениях сахарного тростника. Взятые в качестве образцов растения были 6-месячного возраста и имели 15 узлов, первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса. На фиг. 9 представлены диаграммы, демонстрирующие скорости фотосинтетической фиксации CO2 в листьях растений трансгенной линии pUbi68J2.36 и контрольных Q117 растений сахарного тростника. Растения были 4-месячного возраста и были морфологически неразличимы. Растения трансгенной линииpUbi68J2.36 представляли собой третье вегетативное поколение (из стеблевых черенков) после регенерации. Результаты представляют собой средние значения и стандартные ошибки для трех повторов растений. На фиг. 10 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрацию хлорофилла в листьях растений трансгенной линии pUbi68J2.36 и контрольных растений Q117 сахарного тростника. Растения были 4-месячного возраста и были морфологически неразличимы. Растения трансгенной линии pUbi68J2.36 представляли собой третье вегетативное поколение (из стеблевых черенков) после регенерации. Результаты представляют собой средние значения и стандартные ошибки для трех повторов растений. На фиг. 11 представлены диаграммы, демонстрирующие соотношение хлорофиллов а/b в листьях растений трансгенной линии pUbi68J2.36 и контрольных растений Q 117 сахарного тростника. Растения были 4-месячного возраста и были морфологически неразличимы. Растения трансгенной линииpUbi68J2.36 представляли собой третье вегетативное поколение (из стеблевых черенков) после регенерации. Результаты представляют собой средние значения и стандартные ошибки для трех повторов растений. На фиг. 12 представлены графики, демонстрирующие скорости фотосинтетического транспорта электронов, измеренные по флуоресценции хлорофилла при различных интенсивностях света, в листьях растений трансгенной линии pUbi68J2.36 и контрольных растений Q117 сахарного тростника. Растения были 4-месячного возраста и были морфологически неразличимы. Растения трансгенной линииpUbi68J2.36 представляли собой третье вегетативное поколение (из стеблевых черенков) после регенерации. Результаты представляют собой средние значения и стандартные ошибки для трех повторов растений. На фиг. 13 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации изомальтулозы в корнях растений разных трансгенных линий, в которых экспрессируемая сахарозоизомераза направлялась в вакуоли, и контрольных растений Q117. Корни получали из двухглазковых секций сахарного тростника,которые заворачивали в мокрую ткань и выдерживали при 28 С в течение 7 дней. На фиг. 14 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации изомальтулозы в листьях растений трансгенной линии pU3ZERsN68J3.2 (в которых экспрессируемая сахарозоизомераза направля-7 008669 лась в вакуоли). Растения были 8-месячного возраста, имели 21 междоузлие и были морфологически неотличимы от контрольных растений линии Q117. Трансгенное растение представляло собой второе вегетативное поколение (из стеблевых черенков) после регенерации. На фиг. 15 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации изомальтулозы в стеблях растений трансгенной линии pU3ZERsN68J3.2His (в которых экспрессируемую сахарозоизомеразу адресовали в вакуоли). Растения были 8-месячного возраста, имели 35 междоузлий и были морфологически неотличимы от контрольных растений линии Q117. Трансгенное растение представляло собой второе вегетативное поколение (корневые отпрыски тростника из исходного горшка) после регенерации каллюса. На фиг. 16 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации изомальтулозы во фракциях внеклеточной и внутриклеточной жидкости из тканей стебля растений трансгенных линийpU3ZERsN68J3.2His (а), pU3ZERsN68J1.17 (b), pU3ZERc68JC3.1His (с) и pU3ZERsN68JC3.7His (d). Растения a, b, d были 8-месячного возраста, а растение с было 12-месячного возраста. Число междоузлий в растениях а, b, с и d составляло 35, 20, 43 и 30, соответственно. Трансгенное растение b представляло собой второе вегетативное поколение, выращенное из стеблевых черенков; трансгенные растения а, с и d представляли собой второе вегетативное поколение в виде корневых отпрысков тростника из исходных горшков. Растения всех трансгенных линий были морфологически неотличимы от контрольных растений линии Q117. На фиг. 17 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации изомальтулозы, других сахаров (сумма глюкозы, фруктозы и сахарозы в сахарозных эквивалентах, т.е. G/2 + F/2 + S) и общее содержание сахаров (в сахарозных эквивалентах) в тканях стеблей растений контрольной линии Q117 (а) и растений трансгенных линий pU3ZERsN68J3.2 1 (b), pU3ZERsN68J3.2 2 (с) и pU3ZERsN68J3.2His (d). Все растения были 8-месячного возраста и имели 21, 27, 22 и 35 междоузлий, соответственно. Контрольные растения Q117 выращивали из стеблевых черенков. Трансгенные растения b и с представляли собой второе вегетативное поколение, выращенное из стеблевых черенков. Трансгенное растение d представляло собой второе вегетативное поколение в виде корневых отпрысков тростника из исходного горшка. Растения всех трансгенных линий были морфологически неотличимы от контрольных растений линии(сумма глюкозы, фруктозы и изомальтулозы в сахарозных эквивалентах) и общее содержание сахаров (в сахарозном эквиваленте) в тканях стеблей растений контрольной линии Q117 (а) и трансгенных линийpU3ZER.sN68J1.17 1 (b), pU3ZERsN6SJ1.17 2 (с) и pU3ZERsN68J1.2 (d). Все растения были 8 месячного возраста и имели 21, 20, 30 и 31 междоузлие, соответственно. Контрольное растение Q117 выращивали из стеблевых черенков. Трансгенное растение b представляло собой второе вегетативное поколение, выращенное из стеблевых черенков. Трансгенные растения с и d представляли собой второе вегетативное поколение в виде корневых отпрысков тростника из исходных горшков. Растения всех трансгенных линий были морфологически неотличимы от контрольных растений линии Q117. На фиг. 19 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации сахарозы, других сахаров(сумма глюкозы, фруктозы и изомальтулозы в сахарозных эквивалентах) и общее содержание сахаров (в сахарозном эквиваленте) в тканях стеблей растений контрольной линии Q117 (а) и трансгенных линийpU3ZERc68JC1.3His (b), pU3ZERc68JC3.7His (с) и pU3ZERc68JC3.8His (d). Все растения были 8 месячного возраста и имели 28, 32, 38 и 30 междоузлий, соответственно. Контрольные растения Q117 и трансгенные растения b, с и d представляли собой второе вегетативное поколение в виде корневых отпрысков тростника из исходных горшков. Растения всех трансгенных линий были морфологически неотличимы от контрольных растений линии Q117. На фиг. 20 представлены диаграммы, демонстрирующие уровни активности GUS в тканях стеблей растений трансгенной линии с промотором 67 А (p67A-GUS6.7) и трансгенной линии с промотором 67 В(p67B-GUS3.1). Растения обеих линий были 6-месячного возраста, имели по 14 междоузлий и были выращены из стеблевых черенков. На фиг. 21 графически представлены структуры иллюстративных векторов для прямого переноса гена, использованных для создания растений сахарного тростника с фенотипом высокого общего содержания сахаров. Осуществление изобретения 1. Определение терминов Если не определено иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, которое вкладывает в них любой средний специалист в области, к которой относится изобретение. Хотя любые методы или материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы при осуществлении или при проверке настоящего изобретения, здесь описаны предпочтительные методы и материалы. Ниже определены основные термины, используемые в настоящем изобретении. Неопределенные артикли а или an используются здесь для обозначения одного или более чем одного (то есть по меньшей мере одного) грамматического объекта, к которому относится артикль. Например, термин элемент с неопределенным артиклем an обозначает один или более чем один элемент. Термин около используется в изобретении в отношении величины, уровня, значения, объема,длины, положения, размера или количества, которые варьируют в пределах максимум 30%, предпочтительно 20% и более предпочтительно 10% от указанных величины, уровня, значения, объема, длины,положения, размера или количества. Термин чужеродный используется в изобретении для обозначения вещества, продуцируемого модифицированным растением, которое обычно не продуцируется соответствующим немодифицирован- 10008669 ным растением на той же стадии развития. Термин биологически активный участок в применении к последовательности промотора обозначает тот участок, который обеспечивает по меньшей мере около 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,24, 26, 28 или 30% активности промотора с данной последовательностью. Также необходимо понимать,что фраза биологически активный участок обозначает часть указанной последовательности ДНК, которая инициирует транскрипцию РНК или которая, будучи соединенной с определенным геном и введенной в клетку растения, вызывает экспрессию гена на уровне, который выше уровня экспрессии в отсутствие такой части последовательности ДНК. Включенные в объем настоящего изобретения биологически активные участки имеют длину по меньшей мере около 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800 или даже 900 нуклеотидов. Используемые здесь термины цис-действующая последовательность, цис-действующий элемент или цис-регуляторный участок, или регуляторный участок, или близкие по смыслу термины обозначают в данном изобретении любую последовательность нуклеотидов, которая при встраивании в подходящее положение по отношению к экспрессируемой генетической последовательности способна регулировать, по меньшей мере, частично, экспрессию этой генетической последовательности. Специалисты в данной области знания должны понимать, что цис-регуляторный участок может быть способен к активации, сайленсингу, энхансингу, подавлению или изменению любым другим образом уровня экспрессии, и/или специфичности по отношению к определенному типу клеток, и/или специфичности к определенной стадии развития последовательности гена на транскрипционном или пост-транскрипционном уровне. В определенных воплощениях данного изобретения цис-действующая последовательность представляет собой активаторную последовательность, которая усиливает или стимулирует экспрессию экспрессируемой генетической последовательности. Во всем описании изобретения, если в контексте специально не оговорено иначе, термины включают, включает и включающая должны пониматься как включение указанной стадии или элемента,или группы стадий или элементов, но не как исключение любой другой стадии или элемента, или любой другой группы стадий или элементов. Термин соответствует чему-либо или соответствующий чему-либо означает в изобретении полинуклеотид, который (а) имеет нуклеотидную последовательность, по существу, в значительной степени идентичную или комплементарную всей указанной полинуклеотидной последовательности или е части, или (б) кодирует аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности пептида или белка. Эта фраза также включает в свой объем пептид или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая, по существу, идентична аминокислотной последовательности указанного пептида или белка. Термин эндогенный используется в изобретении для обозначения вещества, которое в норме продуцируется немодифицированным растением, находящимся на той же стадии развития, что и исследуемое растение. Термины чужеродный полинуклеотид, или экзогенный полинуклеотид, или гетерологический полинуклеотид и тому подобные обозначают любую нуклеиновую кислоту (то есть генетическую последовательность), которая введена в геном растения с помощью экспериментальных манипуляций и может включать в себя последовательности генов, обнаруженные в таком растении, при том условии, что введенный ген содержит определенные модификации (например, точечную мутацию, присутствие селектируемого маркерного гена, присутствие сайта lохР и т.д.) по сравнению с имеющимся природным геном. Термин ген в данном изобретении обозначает любой из или все дискретные кодирующие участки клеточного генома, а также связанные с ними некодирующие и регуляторные области. Термин ген также используется для обозначения открытой рамки считывания, кодирующей специфические полипептиды, интроны и связанные с ними 5'- и 3'-некодирующие нуклеотидные последовательности, участвующие в регуляции экспрессии. В этой связи термин ген может также включать в себя регуляторные сигналы, такие как промоторы, энхансеры, сигналы терминации и/или полиаденилирования, которые в норме связаны с данным геном, или гетерологические регуляторные сигналы. Последовательности ДНК могут представлять собой кДНК или геномные ДНК или их фрагменты. Ген может быть введен в подходящий вектор для внехромосомного поддержания или для интеграции в геном клетки-хозяина. Используемые в изобретении термины гибридизация в условиях малой строгости, средней строгости, высокой строгости или очень высокой строгости описывают условия проведения гибридизации и отмывки. Методика проведения реакций гибридизации может быть найдена в Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, N.Y. (1989), 6.3.1.-6.3.6. В этом источнике описаны методы с использованием водных или неводных растворов, любой из которых может быть использован. Указываемые в изобретении специфические условия гибридизации означают следующее: 1) гибридизация в условиях малой строгости проводится в 6xрастворе хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при температуре около 45 С, с последующими двумя промывками в 0,2xSSC, 0,1% SDS при температуре по меньшей мере 50 С (температура промывки может быть увеличена до 55 С для условий малой строгости); 2) гибридизация в усло- 11008669 виях средней строгости проводится в 6xSSC при температуре около 45 С, с последующей одной или более промывками в 0,2xSSC, 0,1% SDS при температуре 60 С; 3) гибридизация в условиях высокой строгости проводится в 6xSSC при температуре около 45 С, с последующей одной или более промывками в 0,2xSSC, 0,1% SDS при температуре 65 С; и 4) гибридизация в условиях очень высокой строгости проводится в 0,5 М фосфате натрия и 7% SDS при температуре 65 С, с последующей одной или более промывками в 0,2xSSC, 1% SDS при температуре 65 С. Термин интрон обозначает участок ДНК или РНК, который обычно удаляется из первичного РНК-транскрипта в результате сплайсинга и отсутствует в зрелой молекуле мРНК. Используемое в изобретении понятие иммуно-интерактивный включает ссылку на любое взаимодействие, реакцию или другую форму ассоциации между молекулами, в частности, когда одна из этих молекул является компонентом или имитирует компонент иммунной системы. Термин изолированный обозначает материал, который в значительной мере или полностью освобожден от компонентов, которые обычно связаны с ним в его нативном состоянии. Например, используемый в изобретении термин изолированный полинуклеотид обозначает полинуклеотид, который очищен от последовательностей, которые фланкируют его в нормальном нативном состоянии, то есть освобожден от участков ДНК, в норме прилегающих к полинуклеотиду с двух сторон. Термин маркерный ген обозначает ген, который придает отличный фенотип клеткам, экспрессирующим это маркерный ген, что позволяет отличить такие трансформированные клетки от клеток, которые не имеют этого маркера. Селектируемый маркерный ген придает клеткам определенные признаки,позволяющие проводить отбор на основе устойчивости к определенному селективному агенту (например, гербициду, антибиотику, радиации, нагреванию или другим воздействиям, повреждающим нетрасформированные клетки). Маркерный ген для скрининга (или репортерный ген) придает клеткам свойства, которые можно идентифицировать при наблюдении или тестировании, то есть посредством скрининга (например, активность Р-глюкуронидазы, люциферазы или другого фермента, который отсутствует в нетрансформированных клетках). Термин нуклеом обозначает все имеющиеся в клетке нуклеиновые кислоты и включает геном,внехромосомные молекулы нуклеиновых кислот и все молекулы РНК, такие как мРНК, гетерогенная ядерная РНК (гяРНК), малая ядерная РНК (мяРНК), малая ядрышковая РНК (мнРНК), малая цитоплазматическая РНК (мцРНК), рибосомальная РНК (рРНК), РНК трансляционного контроля (ткРНК), транспортная РНК (тРНК), эРНК, комплементарная матричной РНК интерферирующая РНК (микРНК) или интерферирующая РНК (иРНК), РНК хлоропластов или пластид (хпРНК) и митохондриальная РНК(мтРНК). Термин функционально связанный или функционально сопряженный и тому подобное обозначает связь полинуклеотидных элементов в функциональном отношении. Последовательность нуклеиновой кислоты является функционально связанной, когда она вводится в функциональные взаимоотношения с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер является функционально сопряженным с кодирующей последовательностью, если он изменяет транскрипцию этой кодирующей последовательности. Термин функционально связанный означает, что такие последовательности нуклеиновой кислоты обычно расположены рядом и, где необходимо объединить два участка, кодирующие белок, расположены рядом и в одной рамке считывания. Кодирующая последовательность функционально связана с другой кодирующей последовательностью, когда РНК-полимераза будет транскрибировать обе кодирующие последовательности в единую молекулу мРНК, которая затем будет транслироваться в единую полипептидную цепь, включающую аминокислоты, кодируемые двумя последовательностями. Кодирующие последовательности не обязательно должны быть расположены рядом друг с другом, если экспрессируемые последовательности в конечном счете процессируются с получением нужного белка. Функциональное сопряжение промотора с транскрибируемым полинуклеотидом означает, что этот транскрибируемый полинуклеотид (например, кодирующий белок полинуклеотид или другой транскрипт) находится под контролем данного промотора, который регулирует транскрипцию, а иногда и трансляцию этого полинуклеотида. В конструкции, состоящей из комбинации гетерологический промотор/структурный ген, обычно является предпочтительным поместить промотор или его вариант на определенном расстоянии от участка начала транскрипции транскрибируемого полинуклеотида. Это расстояние примерно соответствует расстоянию между промотором и контролируемым им геном в нативном состоянии, то есть в том гене, из которого данный промотор был получен. Как известно специалистам в данной области, определенные отклонения в этом расстоянии могут иметь место без потери функции. Подобно этому, предпочтительное расположение регуляторного элемента последовательности (например, оператора, энхансера и т.д.) по отношению к транскрибируемому полинуклеотиду,который должен находиться под его контролем, определяется расположением этого элемента в нативном состоянии, то есть в том гене, из которого он был получен. Термины растение и дифференцированное растение используются в изобретении для обозначения целого растения или части растения, состоящей из дифференцированных клеток разного типа, тканей и/или систем органов. Проростки и семена также подпадают под обозначение данными терминами. Включаемые в объем изобретения растения могут быть любыми растениями, подходящими для приме- 12008669 нения способов трансформации, включая покрытосеменные, голосеменные, однодольные и двудольные. Термин растительная клетка используется в изобретении для обозначения протопластов или других клеток, полученных из растений, клеток, продуцирующих гаметы, и клеток, которые регенерируют в целое растение. Термин растительные клетки обозначает клетки в растениях, а также протопласты или другие клетки в культуре. Под термином растительная ткань понимается дифференцированная или недифференцированная ткань, полученная из корней, побегов, плодов, клубней, пыльцы, семян, опухолевой ткани, такой как верхушечные галлы, или различные формы агрегированных клеток: растений в культуре, такие как зародыши или каллюсы. Термины полинуклеотидный вариант и вариант и подобные термины обозначают полинуклеотиды, имеющие последовательность, существенно идентичную последовательности данного полинуклеотида или полинуклеотидов, которые гибридизуются с данной последовательностью в строгих условиях, которые определены здесь далее. Эти термины также включают полинуклеотиды, получаемые из исследуемого нуклеотида путем вставки, делеции или замены по меньшей мере одного нуклеотида. В соответствии с этим термины полинуклеотидный вариант и вариант включают полинуклеотиды, в которых один или более нуклеотидов было добавлено, или удалено, или заменено на другие нуклеотиды. В этой связи специалистам в данной области хорошо известно, что в исследуемом полинуклеотиде могут быть сделаны определенные изменения, включая мутации, вставки, делеции и замены, причем измененный полинуклеотид сохранит биологическую функцию или активность исходного полинуклеотида. Соответственно, данные термины включают полинуклеотиды, которые инициируют транскрипцию РНК,или такие, которые при слиянии с определенным геном и при введении в растительную клетку вызывают экспрессию гена на более высоком уровне, чем это возможно в отсутствие таких полинуклеотидов. Термины полинуклеотидный вариант и вариант также включают встречающиеся в природе аллельные варианты. Термины полинуклеотид или нуклеиновая кислота используются в изобретении для обозначения мРНК, РНК, кРНК, кДНК или ДНК. Термин обычно используется для обозначения олигонуклеотида,имеющего длину не менее чем 30 нуклеотидов. Взаимозаменяемые термины полипептид, пептид и белок используются в изобретении для обозначения полимера, состоящего из остатков аминокислот, его вариантов и синтетических аналогов. Таким образом, эти термины применимы к полимерам аминокислот, в которых один или более аминокислотных остатков являются синтетической аминокислотой, в обычных условиях не встречающейся,например химическим аналогом соответствующей природной аминокислоты, а также к природным аминокислотным полимерам. Термин промотор употребляется в изобретении в своем широком смысле и обозначает участок ДНК, обычно расположенный против направления транскрипции относительно кодирующего мРНК участка (перед 5'-концом), который контролирует инициацию и уровень транскрипции. Термин промотор должен рассматриваться здесь в своем самом широком смысле, включающем транскрипционные регуляторные последовательности классического геномного гена, в частности последовательности ТАТА-бокс и ССААТ-бокс, а также дополнительные регуляторные элементы (то есть, расположенные перед кодирующим участком активаторные последовательности, энхансеры и сайленсеры), которые изменяют экспрессию гена в ответ на стимулы, связанные со стадией развития и/или с изменением в окружающей среде, или тканеспецифичным, или зависимым от типа клеток способом. Обычно, но не обязательно,промотор располагается перед структурным геном (перед 5'-концом), экспрессию которого он регулирует. Более того, регуляторные элементы, включая промотор, обычно располагаются в пределах 2 т.п.н. от начала участка начала транскрипции гена. В соответствии с данным изобретением промоторы могут содержать дополнительные специфические регуляторные элементы, расположенные более отдаленно от начала участка, с целью дальнейшего усиления экспрессии в клетке и/или изменения времени включения или индуцибельности экспрессии структурного гена, с которым он функционально сопряжен. Термин конститутивный промотор обозначает промотор, который управляет экспрессией функционально связанной с ним транскрибируемой последовательности во многих или во всех тканях растения. Термин промотор, специфичный для запасающей ткани обозначает промотор, который обеспечивает экспрессию функционально связанной с ним транскрибируемой последовательности преимущественно в запасающей ткани растения (например, в тканях плода, ткани корня, ткани клубня, ткани семени,ткани стебля или запасающей ткани листа) по сравнению с экспрессией в других тканях растения, включая ассимилирующие ткани (например, листа). Термин рекомбинантный полинуклеотид используется в изобретении для обозначения полинуклеотида, полученного in vitro с помощью манипуляций с нуклеиновой кислотой и в природе обычно не встречающегося. Например, рекомбинантный полинуклеотид может представлять собой вектор экспрессии. Обычно такие векторы экспрессии включают в себя нуклеиновые кислоты, регулирующие транскрипцию и трансляцию, функционально сопряженные с нуклеотидной последовательностью. Термин рекомбинантный полипептид обозначает полипептид, полученный с помощью рекомби- 13008669 нантных методов, то есть при экспрессии рекомбинантного полинуклеотида. Термин регенерация используется в изобретении для обозначения растительного материала, вырастающего в целое, дифференцированное растение из растительной клетки, из группы растительных клеток, части растения (включая семена) или кусочка растения (например, из протопласта, каллюса или участка ткани). Термином репортерная молекула в данном изобретении обозначается молекула, которая по своей химической природе обеспечивает аналитически распознаваемый сигнал, позволяющий обнаружить комплекс, включающий антигенсвязывающую молекулу и ее антиген-мишень. Термин репортерная молекула также распространяется на процессы агглютинации клеток или ингибирования агглютинации,например на эритроциты, связанные с латексными бусинами, и тому подобное. Термин селективная экспрессия используется в изобретении для обозначения экспрессии почти исключительно в строго определенном органе растения, включая, но, не ограничиваясь, плоды, клубни,корни или семена. Данный термин может также применяться для обозначения экспрессии на определенной стадии развития органа, такой как ранний или поздний эмбриогенез или разные стадии зрелости стебля, или для обозначения экспрессии, которая индуцируется определенными условиями среды или определенными воздействиями. Таким образом, селективная экспрессия может противопоставляться конститутивной экспрессии, которая обозначает экспрессию во многих или во всех тканях растения в большинстве или во всех условиях, испытываемых растением. Селективная экспрессия может также приводить к компартментализации продуктов экспрессии гена в специфических тканях растения, органах растения или на определенных стадиях развития. Компартментализация в специфических участках клетки, таких как цитозоль, вакуоль, или апоплазматическое пространство, может достигаться путем включения в структуру генного продукта соответствующей сигнальной последовательности, обеспечивающей доставку продукта в требуемый компартмент клетки, или, в случае полуавтономных органелл (пластид и митохондрий), путем интеграции трансгена вместе с соответствующими регуляторными последовательностями непосредственно в геном органеллы. Термины, используемые для описания взаимного соответствия двух или более полинуклеотидов или полипептидов, включают термины ссылочная последовательность, окно сравнения, идентичность последовательности, процент идентичности последовательности и существенная идентичность. Ссылочная последовательность состоит по меньшей мере из 12, чаще из 15-18, или чаще всего по меньшей мере из 25 мономерных единиц, коими являются нуклеотиды или остатки аминокислот. Поскольку два полинуклеотида могут содержать в себе (1) последовательность (то есть только часть всей полинуклеотидной последовательности), которая сходна у двух данных полинуклеотидов, и (2) последовательность, которая различается у двух данных полинуклеотидов, сравнение последовательности двух(или более) полинуклеотидов обычно проводят, сравнивая последовательность двух полинуклеотидов в определенном окне сравнения, чтобы идентифицировать и сравнить локальные участки сходства последовательностей. Окно сравнения означает определенный сегмент, состоящий по меньшей мере из 50 соседних позиций, обычно от примерно 50 до примерно 100 позиций, более часто от примерно 100 до примерно 150 позиций, в пределах которого последовательность с тем же числом соседних позиций сравнивается со ссылочной последовательностью после оптимального выравнивания двух данных последовательностей. Для оптимального выравнивания двух последовательностей окно сравнения может включать около 20% или менее вставок или делеций (то есть брешей), по сравнению со ссылочной последовательностью (которая не включает вставок или делеций). Оптимальное выравнивание последовательностей в окне сравнения может производиться с использованием компьютерных алгоритмов (GAP,BESTFIT, FASTA и TFASTA из пакета Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) или с помощью проверки и наилучшего выравнивания(то есть приводящего к набольшей степени гомологии в пределах окна сравнения), проводимого любым из подходящих методов. Можно также сослаться на семейство программ BLAST и привести в качестве примера работу Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389. Детальное обсуждение анализа последовательностей можно найти в Разделе 19.3 работы Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology",John WileySons Inc, 1994-1998, Chapter 15. Взаимозаменяемые термины идентичность последовательностей или идентичность используются в изобретении для обозначения степени идентичности последовательностей при сравнении нуклеотидного состава или аминокислотного состава в пределах окна сравнения. Таким образом, процент идентичности последовательностей рассчитывается при сравнении двух оптимально выравненных последовательностей в окне сравнения путем подсчета числа позиций, в которых находятся идентичные азотистые основания (например, А, Т, С, G, I) или идентичные аминокислотные остатки (например, Ala,Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys и Met) в обоих последовательностях, подсчета числа таких полных совпадений, деления числа совпадающих позиций на общее число позиций в окне сравнения (то есть на размер окна) и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. В объеме настоящего изобретения идентичность последовательностей будет пониматься как процент совпадений, рассчитанный с помощью компьютерной программы DNASIS (Версия 2.5 для Windows; доступна от Hitachi Software engineering Co., Ltd.,- 14008669South San Francisco, California, USA) с использованием стандартных установок по умолчанию, описанных в инструкции к программе. Термины запасающая клетка и запасающая ткань обозначают клетки, ткани или органы, в которых во время сбора урожая накапливается органический углерод, который попадает в эти клетки с потоком веществ в форме, отличной от углекислого газа. В растениях к запасающим тканям относятся все нефотосинтезирующие ткани, а также фотосинтезирующие ткани, которые суммарно накапливают органический углерод, связываемый другими фотосинтезирующими клетками, или получают его из окружающей среды или из внешней среды путем, отличным от прямой фиксации углекислого газа. Термин строгость используется в изобретении для обозначения температурных условий, ионной силы и присутствия или отсутствия определенных органических растворителей во время гибридизации. Чем выше строгость условий, тем выше будет степень комплементарности между иммобилизованными нуклеотидными последовательностями и меченой полинуклеотидной последовательностью. Термином строгие условия обозначаются температурные условия и ионная сила, при которых будут гибридизоваться только нуклеотидные последовательности, имеющие высокое содержание комплементарных оснований. Требуемая строгость условий зависит от нуклеотидной последовательности и от различных компонентов, присутствующих в среде во время гибридизации. Обычно строгие условия подбираются таким образом, чтобы температура была примерно на 10-20 С ниже, чем температура точки плавления (Тп) для данной последовательности при определенной ионной силе и рН. Точкой Тп является температура (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с комплементарным зондом. Термин сахара, производные сахаров используется в изобретении в своем самом широком значении и включает: моносахариды (альдозы и кетозы), включающие в себя вещества с общей формулой(СН 2 О)n, где n = 3 или более; включая тетрозы (например, эритроза, треоза, эритрулоза), пентозы (например, рибоза, арабиноза, ксилоза, ликсоза, рибулоза, ксилулоза), гексозы (например, аллоза, альтроза,глюкоза, манноза, гулоза, идоза, галактоза, талоза, псикоза, фруктоза, сорбоза, тагатоза) и более длинные молекулы, такие как седогептулоза или манногептулоза; олигосахариды, образуемые при соединении вместе нескольких моносахаридных звеньев посредством гликозидных связей; включая дисахариды (например, мальтоза, лактоза, гентибиоза, мелибиоза, трегалоза, софороза, примовероза, рутиноза, сахароза,изомальтулоза, трегалулоза, тураноза, мальтулоза, левкроза) и более длинные олигомеры, такие как раффиноза, мелезитоза, бемесиоза или стахиоза; сахароспирты (например, эритрит, рибит, маннит, сорбит); сахарные кислоты (например, глюконовая кислота, глюкаровая кислота, глюкуроновая кислота); аминосахара (например, глюкозамин, галактозамин); и другие варианты, такие как дезоксисахара, метилированные сахара, сахарофосфаты и УДФ-сахара, некоторые из которых могут превращаться в сахара или другие производные сахаров, описанные выше, в результате метаболических превращений в растениях. Термин трансформация обозначает изменение генотипа организма, например бактерии или растения, с помощью ведения чужеродной или эндогенной нуклеиновой кислоты. Под трансформантом понимается организм, который был, таким образом, трансформирован. Используемый в изобретении термин трансгенный обозначает генетически модифицированное растение, эндогенный геном которого дополнен или модифицирован с помощью случайной или сайтнаправленной интеграции или путем стабильного поддержания в способной к репликации неинтегрированной форме введенного чужеродного или экзогенного гена или последовательности. Под трансгеном понимается ген или последовательность, которая введена в растение. Термин вектор обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулу ДНК, полученную, например, из плазмиды, бактериофага или вируса растения, в которую можно встроить или клонировать последовательность нуклеиновой кислоты. Вектор предпочтительно содержит один или более уникальных сайтов рестрикции и может быть способен к автономной репликации в определенных клетках-хозяевах, включая клетку-мишень или ткань-мишень, или их прародительские клетки или ткани,или может интегрироваться в геном определенного хозяина так, чтобы клонированная последовательность стала воспроизводимой. В соответствии с этим, вектор может представлять собой автономно реплицируемый вектор, то есть вектор, существующий в виде внехромосомной самостоятельной единицы,репликация которой не зависит от репликации хромосомы, например линейную или замкнутую кольцевую плазмиду, внехромосомный элемент, минихромосому или искусственную хромосому. Вектор может содержать любые элементы, обеспечивающие саморепликацию. Альтернативно этому, вектор может быть таким, который после введения в клетку интегрируется в геном клетки-реципиента и реплицируется вместе с хромосомой (или хромосомами), в которую он встроился. Векторная система может включать один вектор или плазмиду, два или более векторов или плазмид, которые вместе содержат суммарную ДНК, которая должна быть введена в геном клетки-хозяина, или транспозон. Выбор вектора обычно зависит от совместимости вектора и клетки, в которую этот вектор должен быть введен. Вектор также может включать в себя селективный маркер, такой как ген устойчивости к антибиотику, который может быть использован для отбора подходящих трансформантов. Примеры таких генов, обеспечивающих устойчивость к антибиотикам, хорошо известны специалистам в данной области.- 15008669 2. Способ изменения общего содержания углеводов или сахаристости в растительной ткани Настоящее изобретение основывается отчасти на открытии того факта, что экспрессия экзогенного или чужеродного фермента, метаболизирующего сахар, такого как сахарозоизомераза, в растении (например, в сахарном тростнике) приводящая к превращению части содержащейся в клетке сазарозы в изомальтулозу (чужеродный сахар, который в норме не производится растением), может приводить к существенному увеличению общего содержания углеводов в запасающих сахарозу тканях растения. Не желая быть ограниченным какой-либо одной частной теорией или механизмом действия, отметим, что специфические изменения метаболизма, вовлекающие превращение сахара, который в норме ощущается организмом, в новый сахар, который не воспринимается организмом эквивалентным образом, могут изменять метаболизм и приводить к накоплению более высоких концентраций углеводов. Авторы изобретения полагают, что такие специфические изменения на клеточном уровне могут изменять соотношение производство-запасание на уровне целого растения, приводя к накоплению большего количества углеводов в запасающих тканях вследствие комбинированного воздействия на синтез в производящих тканях,транспорт между производящими и запасающими тканями и превращение или хранение в запасающих тканях. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает новые способы для изменения общего содержания углеводов или сахаристости запасающей ткани растения. Способы, как правило, включают продуцирование в растении фермента, метаболизирующего сахар, который катализирует превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар, который в норме не продуцируется растением на данной стадии развития. Преимущественно, фермент, метаболизирующий сахар, продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, что содержание углеводов или сахаристость запасающей ткани увеличивается по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения,которое не продуцирует фермент. В некоторых воплощениях фермент, метаболизирующий сахар, продуцируется в растительных клетках посредством экспрессии полинуклеотида, который кодирует фермент. В этих воплощениях растение является трансгенным растением, которое выбирается из множества трансгенных растений, которые содержат в своем нуклеоме полинуклеотид, кодирующий фермент,функционально связанный с регуляторным элементом транскрипции. Трансгенное растение выбирается на основе того, что оно продуцирует фермент, метаболизирующий сахар, на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание углеводов или содержание растворимых углеводов, или сахаристость запасающей ткани трансгенного растения увеличиваются по сравнению с этими параметрами соответствующей запасающей ткани контрольного растения. В некоторых воплощениях общее содержание углеводов или сахаристость, или содержание эндогенных углеводов запасающей ткани увеличено в результате продукции в клетках растения фермента,метаболизирующего сахар, на таком уровне или с такой функциональной активностью, которая приводит к частичному превращению эндогенного сахара в чужеродный сахар. В этих воплощениях фермент, метаболизирующий сахар, имеет подходящий уровень активности в цитоплазме или же фермент распределен между цитоплазмой и другими клеточными компартментами, вовлеченными в запасание и/или транспорт сахара. Увеличение в содержании растворимых углеводов или сахаристости запасающей ткани обычно достигается в этих воплощениях за счет менее чем около 30, 20 или 15%, и предпочтительно менее чем около 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар. Предпочтительно в этих воплощениях чужеродный сахар накапливается без соизмеримого снижения содержания эндогенных сахаров или углеводов. В других воплощениях общее содержание углеводов или сахаристость, или содержание эндогенных углеводов запасающей ткани увеличено посредством адресования фермента, метаболизирующего сахар,в субклеточный компартмент, используемый для запасания сахара в растительной клетке (например, вакуоль или апоплазматическое пространство). В этих воплощениях фермент, метаболизирующий сахар,присутствует в соответствующем субклеточном компартменте в таком количестве или с такой функциональной активностью, которая приводит к превращению значительного количества, которое составляет,как правило, по меньшей мере около 20, 25 или 30%, но типично по меньшей мере около 40, 45, 50 или 55% и в большинстве случаев по меньшей мере около 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар. Желательно, чтобы значительное превращение сахара не происходило в тканях, в которых происходит деление клеток и/или рост клеток, обеспечивающие рост растения. Предпочтительно, в этих воплощениях чужеродный сахар накапливается без соизмеримого уменьшения содержания эндогенных сахаров или углеводов. Таким образом, изменение общего содержания углеводов или сахаристости, или содержания эндогенных углеводов в запасающей ткани достигается посредством изменения уровня превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар. Это превращение может быть осуществлено во всех тканях растения, например, при использовании конститутивного промотора для осуществления экспрессии последовательности, кодирующей фермент, метаболизирующий сахар. Альтернативно, оно может быть осуществлено в производящих тканях, в транспортирующих тканях или в запасающих тканях при использовании регулируемого тканеспецифичного или специфичного для определенной стадии развития промотора. В некоторых воплощениях уровень превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар изменя- 16008669 ется вследствие увеличения или снижения уровня экспрессии последовательности, кодирующей фермент, метаболизирующий сахар. Например, этого можно достигнуть на уровне транскрипции при использовании промоторов различной силы или индуцибельных промоторов, которые способны контролировать уровень транскриптов экспрессируемой кодирующей последовательности. Альтернативно, уровень экспрессии последовательности, кодирующей фермент, можно модулировать посредством изменения числа копий конструкции, включающей в себя кодирующую последовательность, на клетку и изменения элемента регуляции транскрипции, который функционально связан с ней и который является функциональным в клетке. Альтернативно, может быть отобрано множество трансформантов и подвергнуто скринингу на подходящий уровень и/или специфичность трансгенной экспрессии, возникающей под влиянием эндогенных последовательностей, расположенных вблизи сайта интеграции трансгена. Подходящим уровнем и образцом экспрессии трансгена является такой, который приводит в результате к существенному увеличению содержания растворимых углеводов или сахаристости тканей, предназначенных для использования. Это может быть определено простым тестированием трансформантов примерно на той стадии развития, на которой растение предназначено для сбора урожая, например, применяя способ, описанный в примере 9. В некоторых воплощениях уровень экспрессии кодирующей последовательности выбирается таким образом, чтобы он был по меньшей мере на примерно 10, 20, 30, 40, 50,60, 70, 80 или 90%, или даже по меньшей мере на примерно 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000% выше, или по меньшей мере на примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 92, 94, 96, 97, 98 или 99%, или даже по меньшей мере на примерно 99,5, 99,9, 99,95, 99,99, 99,995 или 99,999% ниже, чем уровень экспрессии в контрольном растении. В другом воплощении уровень экспрессии кодирующей последовательности может быть изменен на посттранскрипционном уровне при использовании последовательностей, расположенных в транскрибируемом гене (цис-РНК последовательности) или при использовании независимо транскрибируемых последовательностей (транс-РНК последовательности), которые влияют на процессинг или стабильность мРНК, кодирующей фермент, метаболизирующий сахар. Например, цис-РНК последовательности могут изменять вторичную структуру нетранслируемой лидерной последовательности или включать стартовые кодоны, не попадающие в рамку считывания, или неоптимальный контекст стартового кодона, или редкий кодон для контроля скорости трансляции; они могут включать также последовательности с некоторым подобием сайтов сплайсинга интрона или сигналов полиаденилирования, что приводит к ошибкам в процессинге РНК или уменьшает стабильность мРНК. Примеры транс-РНК последовательностей включают совместно экспрессируемые антисмысловые молекулы или рибозимы, которые препятствуют экспрессии или ингибируют ее. Альтернативно, молекулы РНК, включающие примерно 21-23 нуклеотида,которые запускают расщепление специфической мРНК, которой они соответствуют, как описано, например Tuschl et al. in U.S. Patent Application No. 20020086356, могут быть использованы для запуска механизма РНК-интерференции (РНКи) для модуляции экспрессии кодирующей фермент последовательности. В другом воплощении уровень превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар изменяется при использовании ферментов, метаболизирующих сахар, с разной функциональной активностью. Такое изменение может являться следствием различий в специфических активностях или стабильности ферментов в клеточных компартментах, в которых завершается превращение сахара. В некоторых воплощениях активность фермента, метаболизирующего сахар, который используется для превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар по меньшей мере примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90%, или даже по меньшей мере примерно на 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000% выше, или по меньшей мере примерно на 10, 20, 30 40, 50, 60, 70, 80, 90, 92, 94, 96, 97, 98 или 99%, или даже по меньшей мере примерно на 99,5, 99,9, 99,95, 99,99, 99,995 или 99,999% ниже, чем контрольного фермента. Ферменты, метаболизирующие сахар с различными активностями, могут быть получены из природных источников, либо с использованием синтетических или рекомбинантных методов, например, путем модификации каталитического сайта или какого-либо другого сайта (например, субстратсвязывающего сайта, кофакторсвязывающего сайта), соответствующего либо исходного фермента. Как правило, модификация достигается посредством замены, добавления, либо делении по меньшей мере одной аминокислоты в последовательности родительского фермента с использованием, например, подходящих или специально разработанных методов мутагенеза либо комбинаторной химии, которые хорошо известны специалистам в данной области. Различные метаболизирующие сахара ферменты могут включать в себя консервативные аминокислотные замены. Консервативные аминокислотные замены - это такие замены, при которых аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим похожую боковую цепь. Исследователями в данной области были охарактеризованы семейства аминокислотных остатков, имеющих похожие боковые цепи. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми группами (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми радикалами (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми группами(например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковы- 17008669 ми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, аминокислотный остаток в родительском ферменте подходящим образом заменен другим аминокислотным остатком, относящимся к семейству с похожими боковыми цепями. Альтернативно, в другом воплощении настоящего изобретения мутации могут быть внесены случайно по всей длине, либо в определенный участок полинуклеотида, кодирующего соответствующий фермент, с использованием, например, насыщающего мутагенеза, и полученные в результате мутанты могут быть протестированны на ферментативную активность с целью идентификации мутантов, имеющих активность, отличную от активности родительского фермента. Интересующие ферменты могут быть протестированы для сравнения активности, например, с использованием способа, изложенного в примере 2, модифицированного посредством инкубации неочищенных либо очищенных препаратов фермента до и/или во время эксперимента в условиях, сходных с условиями во внутриклеточным компартменте растительной клетки, где должны происходить превращения сахаров; это используется в качестве дополнительного теста на стабильность и специфическую активность фермента в данных условиях. В другом воплощении настоящего изобретения уровень и локализация превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар модулируется с использованием метаболизирующего сахар фермента, направляемого в различные функциональные внутриклеточные компартменты. В иллюстративных примерах активность направлена в цитозоль, как в компартмент первичного метаболизма. Это может быть достигнуто посредством экспрессии ядерного гена, приводящего к синтезу внутри цитозоля формы фермента, не имеющей сигнальной последовательности, необходимой для транспорта в другие компартменты клетки. В других иллюстративных примерах активность направлена в запасающий компартмент, такой как вакуоль, либо в запасающий и транспортный компартмент, такой как внеклеточное пространство(апоплазма), посредством включения в последовательность фермента сигнала, необходимого для транспорта фермента из цитозоля в нужный клеточный компартмент. Определенные сигнальные последовательности могут привести к распределению ферментативной активности между двумя и более клеточными компартментами (Small et al., 1998). Так, например, сигнал NTPP, описанный в примере 4 (SEQ IDNO:7), с высокой эффективностью направляет белки в вакуоль сахарного тростника, в то время как сигнал СТРР, описанный в примере 5 (SEQ ID NO:8 плюс SEQ ID NO:9), может привести к распределению белка в клетках сахарного тростника между цитозолем и секреторным путем (включающим вакуоль, систему внутренних мембран, и апоплазму) (Gnanasambandam and Birch 2004). Другие факторы могут влиять на изменение содержания растворимых углеводов либо сахаристость запасающих тканей, включая содержание доступного субстрата (то есть эндогенного сахара). Количество субстрата, доступного метаболизирующему сахар ферменту может зависеть от видов растений, которые использовались как объекты для модификаций (включая внутривидовые мутанты), типа ткани, в которой происходит экспрессия, внутриклеточной локализации экспрессии и от стадии развития конкретного растения. Стабильность введенного белка может также зависеть от количества субстрата. Тем не менее считается, что любая оптимизация, которая окажется в данном случае необходимой, может быть легко достигнута с применением рутинных методов, включая методы, описанные выше. Эндогенные сахара, продуцируемые различными растениями, могут различаться и, таким образом,эндогенный сахар одного растения может являться чужеродным для другого растения. Следовательно,необходимо определить, какие сахара эндогенно продуцируются выбранным растением, чтобы таким образом установить, какие сахара являются чужеродными для растения и какой тип метаболизирующего сахар фермента(ов) может быть полезным для продуцирования чужеродного сахара в данном растении. Типы сахаров, эндогенно продуцируемых растениями, могут быть определены с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области. Данные методы включают разделение сахаров либо производных сахаров посредством электрофореза либо хроматографических методов (включая бумажную хроматографию, тонкослойную хроматографию, газовую хроматографию, газожидкостную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию). Разделенные компоненты, как правило, идентифицируют путем сравнения профиля разделения со стандартами известных образцов либо при помощи аналитических техник, таких как масс-спектрометрия и спектроскопия ядерного магнитного резонанса. Например, отсылка может быть сделана к примеру 9, Robinson 1980, The OrganicConstituents of Higher Plants, Cordus Press, North Amherst, USA; Adams et al. 1999, Anal. Biochem. 266: 7784; Veronese and Perlot 1999, Enz. Microbial Tech. 24: 263-269; Hendrix and Salvucci 2001, J. Insect Physiol. 47: 423-432; Thompson et al. 2001, Carbohydrate Res. 331: 149-161; и к ссылкам, цитируемым в них. Знание того, какие эндогенные сахара продуцирует растение, позволяет установить соответствующий метаболизирующий сахар фермент, который превращает один эндогенный сахар или более в чужеродный сахар, либо производное сахара. Например, метаболизирующий сахар фермент может катализировать реакцию, выбранную из реакций окисления, реакций восстановления, дегидрогеназных реакций,реакций гидрогенирования, изомеризации, реакций присоединения, включающих, но не ограничивающихся ими, ацетилирование, карбоксилирование, глюкуронидирование, присоединение глицина, метилирование (О-, N-, или S-метилирование), фосфорилирование и присоединение сульфата, или реакций гидролиза. Примеры ферментов, которые могут катализировать желаемые превращения, включают изомеразы, эпимеразы, мутазы, киназы, альдолазы, трансферазы, транскетолазы, фосфатазы, синтазы, кар- 18008669 боксилазы, дегидрогеназы и гидролазы. Эндогенные и чужеродные сахара подходящим образом выбираются из моносахаридов, олигосахаридов, сахароспиртов, сахарных кислот, аминосахаров и других вариантов, таких как дезоксисахара, метилированные сахара, и тому подобные. Примеры моносахаридов включают вещества с формулой(СН 2 О)n, где n = 3 или более, но обычно менее чем 10; включая вещества, содержащие тетрозы (например, эритроза, треоза, эритрулоза), пентозы (например, рибоза, арабиноза, ксилоза, ликсоза, рибулоза,ксилулоза), гексозы (например, аллоза, альтроза, глюкоза, манноза, гулоза, идоза, галактоза, талоза, псикоза, фруктоза, сорбоза, тагатоза), и более длинные молекулы, такие как седогептулоза или манногептулоза. Олигосахариды, которые образуются посредством соединения с образованием гликозидных связей вместе двух или большего числа моносахаридных звеньев, могут быть выбраны из дисахаридов (например, мальтоза, лактоза, гентиобиоза, мелибиоза, трегалоза, сефароза, примовероза, рутиноза, сахароза,изомальтулоза, трегалулоза, тураноза, мальтулоза, леукроза) и более длинных олигемеров, таких как раффиноза, мелезитоза, бемизиоза или стахиоза. Примеры сахароспиртов включают в себя, но не ограничиваются эритритом, рибитом, маннитом, сорбитом. Не ограничивающие примеры сахарных кислот включают глюконовую кислоту, глюкаровую кислоту, глюкуроновую кислоту. Не ограничивающие примеры аминосахаров включают в себя глюкозамин, галактозамин. Эндогенные или чужеродные сахара также могут быть выбраны из других вариантов, таких как дезоксисахара и метилсахара, некоторые из которых могут быть превращены в описанные выше производные сахаров в процессе функционирования метаболизма растения. В определенных воплощениях настоящего изобретения чужеродный сахар представляет собой изомер эндогенного сахара. В одном из примеров настоящего воплощения эндогенным сахаром является сахароза и метаболизирующим сахар ферментом является сахарозоизомераза, которая посредством изомеризации превращает сахарозу в чужеродный сахар, выбираемый из изомальтулозы и трегалулозы. В соответствии с настоящим изобретением, частичное превращение эндогенного сахара в чужеродный сахар при помощи фермента, метаболизирующего сахар, увеличивает в растении общее содержание углеводов или сахаристость растения или собираемой как урожай части растения, по сравнению с соответствующей тканью контрольного растения, которое не продуцирует фермент. Типичные углеводы включают, но не ограничиваются, простыми сахарами, такими как глюкоза, фруктоза и сахароза, так же как и определенные растворимые полимеры, и другие растворимые компоненты клетки. В одном воплощении способ позволяет получить запасающую ткань, имеющую повышенное содержание углерода в виде растворимых углеводов - то есть увеличенную долю растворимых углеводов на единицу веса запасающей ткани по сравнению с измеренной в контрольных растительных клетках. Углеводы могут быть измерены с использованием стандартных протоколов, хорошо известных специалистам в данной области. 3. Способ увеличения содержания желаемых метаболитов в организмах Принципы и способы, детально разработанные в данном изобретении, для увеличения содержания углеводов в растениях могут быть использованы для увеличения содержания углеводов в других организмах, в которых преобладают разные запасные углеводы, такие как трегалоза в грибах и гликоген у животных. Эти приемы и способы могут также быть использованы для увеличения содержания в организме других классов желательных метаболитов, таких как липиды, аминокислоты и пептиды, или вторичные метаболиты. Специалистам в данной области будет понятно, что вариации методов увеличения содержания углеводов в растениях, изложенных в деталях в данном изобретении в качестве примеров,могут сделать возможным увеличение содержания в организме желаемых метаболитов других классов. Соответственно, настоящее изобретение охватывает в широком смысле плане экспрессию в организме введенных генов, приводящую к частичному превращению эндогенного вещества-субстрата, которое в норме ощущается организмом, в вещество-продукт, которое не воспринимается организмом эквивалентным образом, что в результате изменяет метаболические потоки и приводит к аккумуляции в больших количествах желаемых эндогенных веществ. 4. Конструкции нуклеиновых кислот В некоторых воплощениях метаболизирующий сахар фермент продуцируется в клетках растения посредством экспрессии чужеродного или экзогенного полинуклеотида, который кодирует фермент. Как правило, чужеродный или экзогенный полинуклеотид является функционально связанным с регуляторным элементом транскрипции в конструкции нуклеиновой кислоты. Регуляторный элемент транскрипции обязательно включает промотор и необязательно цис-действующую последовательность, каждый из которых компонентов является функциональным в клетках растения. Преимущественно конструкция включает один или оба из следующих элементов: 3'-нетранслируемая область и маркерный ген. 4.1 Элементы контроля транскрипции Последовательности промоторов, описываемых в настоящем изобретении, могут быть нативными для трансформированного растения-хозяина или могут происходить из альтернативного источника, когда этот промотор является функциональным в растении-хозяине. Другие источники промоторов включают гены Т-ДНК Agrobacterium, это промоторы для биосинтеза нопалина, октапина, маннопина или других опиновых промоторов, промоторы из растений, такой как промотор убиквентина; тканеспеци- 19008669 фичные промоторы (см., например, U.S. Pat. No. 5459252 на имя Conkling et al.; WO 91/13992 на имя Advanced Technologies); а также промоторы из вирусов (включая специфичные для вируса-хозяина) или частично или полностью синтетические промоторы. Многочисленные промоторы, которые являются функциональными в одно- и двудольных растениях хорошо известны специалистам в данной областиGarfinkel et al., 1983, Cell 27: 143-153; Barker et al., 1983, Plant Mol. Biol. 2: 235-350); включая различные промоторы, изолированные из растений (такие как промотор Ubi из гена ubi-1 кукурузы, Christensen andQuail, 1996) (см., например, U.S. Pat. No. 4,962,028) и вирусов (такие как промотор вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S). Последовательности промоторов могут включать цис-действующие последовательности, которые регулируют транскрипцию, где регуляция вовлекает, например, химическую или физическую репрессию или индукцию (например, регуляция основана на метаболитах, свете или других физико-химических факторах; см., например, WO 93/06710, где обнаружен чувствительный к нематоде промотор), или регуляция основана на клеточной дифференциации (например, связанная с листьями, корнями, семенами или тому подобным в растениях; см., например, U.S. Pat. No. 5459252, где обнаружен специфичный для корня промотор). Следовательно, участок промотора или регуляторная порция такого участка могут быть получены из соответствующего гена, который регулируется таким образом. Например, ген 1,5 рибулозобифосфат карбоксилазы является светоиндуцируемым и может быть использован для инициации транскрипции. Известны другие гены, которые индуцируются стрессом, температурой, повреждением, патогенными воздействиями и др. Другие цис-действующие последовательности, которые могут быть использованы, включают энхансеры транскрипции и/или трансляции. Эти энхансерные области хорошо известны специалистам в данной области и могут включать инициирующий кодон АТГ и примыкающие последовательности. Инициирующий кодон должен попадать в рамку считывания кодирующей последовательности, соответствующей чужеродному или экзогенному полинуклеотиду, для обеспечения трансляции полноразмерной последовательности. Сигналы, контролирующие трансляцию, и инициирующие кодоны могут иметь различное происхождение, они могут быть как природными, так и синтетическими. Участки, обеспечивающие инициацию трансляции, могут происходить из источника участка инициации транскрипции или из чужеродного или экзогенного полинуклеотида. Последовательность также может происходить из того же источника, что и промотор, выбранный для осуществления транскрипции, и может быть специфически модифицирована с целью увеличения эффективности трансляции мРНК. Примеры энхансеров транскрипции включают, но ими не ограничиваются, элементы из промотораCaMV 35S и генов октопинсинтазы как, например, описано в работе Last et al. (U.S. Patent No. 5290924,которая включена в данное описание посредством отсылки). Предполагается, что использование энхансерного элемента, такого как ocs элемент, и в особенности многочисленных копий элемента, будет увеличивать уровень транскрипции с прилежащих промоторов, когда это касается трансформированных растений. Альтернативно, omega последовательность, происходящая из гена белка оболочки вируса табачной мозаики (Gallie et al., 1987) может быть использована для увеличения эффективности трансляции мРНК, транскрибируемой с полинуклеотида в соответствии с изобретением. В некоторых воплощениях регуляторный элемент транскрипции представляет собой конститутивный промотор. Среди известных последовательностей, применяемых с целью обеспечения конститутивной экспрессии генов, есть регуляторные участки, связанные с генами Agrobacterium, такими как, например, гены, кодирующие нопалинсинтазу (Nos), маннопинсинтазу (Mas) или октопинсинтазу (Ocs), также как и участки, кодирующие экспрессию вирусных генов, таких как участки 35S и 19S вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Термин конститутивный, который здесь используется, не обязательно указывает на то, что ген является экспрессируемым на одном и том же уровне во всех типах клеток, но что ген экспрессируется в широком диапазоне типов клеток, хотя часто обнаруживаются некоторые вариации в эффективности экспрессии. В других воплощениях регуляторный элемент транскрипции является тканеспецифичным промотором. Например, при обеспечении экспрессии метаболизирующих сахара ферментов по разным причинам может быть желательным ограничить экспрессии этих ферментов растительными клетками, которые функционируют как запасники углерода. С этой целью можно идентифицировать подходящие участки инициации транскрипции, которые обеспечат экспрессию предпочтительно в специфических типах тканей, таких как корни, клубни, семена или плоды. Эти последовательности могут быть идентифицированы, например, из библиотек кДНК, при использовании различных способов отбора, или могут быть выведены из последовательностей, описанных в литературе. Известно много тканеспецифичных промоторных участков, таких как промотор малой субъединицы Rubisco, который предпочтительно экспрессируется в ткани листа, промотор пататина, который преимущественно экспрессируется в клубнях картофеля. Другие области инициации транскрипции, которые предпочтительно обеспечивают транскрипцию в определенных тканях или при определенных условиях роста, включают такие области из напина, АСР семян или листьев, зеина, и тому подобных. Также известны промоторы, специфичные для плодов, одним из таких промоторов является промотор Е 8, опи- 20008669 санный в работах Deikman et al., (1988., EMBO J. 2: 3315-3320) и DellaPenna et al. (1989, Plant Cell 1: 5363). В одном воплощении этого типа конструкция Е 8 (специфичный для плодов промотор)сахарозоизомераза будет экспрессировать сахарозоизомеразу специфичным для плодов образом, где уровни сахарозы, продуцируемой в плодах, могут быть увеличены. Альтернативно, могут быть использованы промоторы, которые избирательно экспрессируют кодирующие последовательности в запасающих сахарозу тканях (таких как зрелые стебли сахарного тростника и клубни сахарной свеклы). Например, промоторы, специфичные для зрелых стеблей сахарного тростника, описаны в секции 6 данного изобретения и в международной публикации WO 01/18211. Альтернативно, промотор является индуцибельным промотором, который способен контролировать экспрессию полинуклеотида, кодирующего фермент, на соответствующей стадии развития растения. В этом последнем из названных воплощений элементом регуляции транскрипции является, соответственно, связанный с развитием организма регулируемый промотор, координирующий время экспрессии. Осуществляя регулирование во времени экспрессии сахар-метаболизирующих ферментов, полезно принимать во внимание изменение концентрации сахара, которое имеет место в процессе развития растения. Значение сахара внутри ткани может также изменяться во времени и в этой связи в процессе развития концентрации сахарозы в запасающей ткани могут изменяться. Например, концентрация сахарозы в определенных плодах, таких как сладкие дыни, изменяется в процессе созревания плодов. Сахара-гексозы накапливаются на ранних стадиях развития, за этим следует накопление высоких уровней сахарозы на более поздних стадиях (Schaffer et al., 1987, Phytochemistry 26: 1883-1887). В развивающемся эндосперме кукурузы концентрация сахарозы увеличивается с 8 по 12 день после опыления и затем падает более чем в десять раз до 28 дней после опыления (Tsai et al., 1970, Plant Phys. 46: 299-306). Кроме того, концентрация сахарозы в семенах сои значительно изменяется в процессе развития, так, например, содержание раффинозных сахаридов разительно увеличивается спустя 53 дня после цветения (Amuti, 1977, Phytochemistry 16: 529-532). В семенах гороха содержание сахарозы драматически падает в процессе развития(Holl and Vose, Can. 1980, J. Plant Sci. 60: 1109-1114). Эти примеры иллюстрируют желательность выбора промотора для регулируемой во времени специфической экспрессии гена фермента для получения нужного результата с учетом изменяющихся пулов сахарозы. 4.2 3'-Нетранслируемая область Конструкция нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может включать 3'-нетранслируемую последовательность. 3'-Нетранслируемая последовательность является той порцией гена, включающей сегмент ДНК, которая содержит сигнал полиаденилирования и любые другие регуляторные сигналы,способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования характеризуется тем, что он обеспечивает присоединение тяжа полиадениловой кислоты к 3'-концу предшественника мРНК. Сигналы полиаденилирования обычно узнаются по наличию гомологии с канонической формой 5'-ААТААА-3', хотя нередко встречаются вариации. 3'-Нетранслируемая регуляторная последовательность ДНК обычно включает от примерно 50 до 1000 пар нуклеотидов и может содержать растительные последовательности, терминирующие транскрипцию и трансляцию, в дополнение к сигналу полиаденилирования и любым другим регуляторным сигналам, способным воздействовать на процессинг мРНК или экспрессию гена. Примеры пригодных 3'нетранслируемых последовательностей включают 3'-транскрибируемые нетранслируемые области, содержащие сигнал полиаденилирования из гена нопалинсинтазы (nos) Agrobacterium tumefaciens (Bevan etal., 1983, Nucl. Acid Res., 11: 369) и терминатор для Т 7 транскрипта из гена октопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens. Альтернативно, пригодные 3'-нетранслируемые последовательности могут происходить из растительных генов, как например, 3'-конец генов ингибитора протеазы I или II из картофеля или томата, генов запасного белка сои и гена гороха Е 9, кодирующего малую субъединицу рибулозо-1,5 бисфосфаткарбоксилазы (ssRUBISCO), хотя также могут быть использованы другие 3'-элементы, известные специалистам в данной области. Альтернативно, 3'-нетранслируемые регуляторные последовательности могут быть получены de novo, как, например, описано в работе An (1987, Methods in Enzymology,153: 292), которая включена в данное описание путем отсылки. 4.3 Дополнительные последовательности Так как последовательность ДНК, встроенная между сайтом инициации транскрипции и сайтом старта кодирующей последовательности, то есть нетранслируемая лидерная последовательность, может влиять на экспрессию гена, можно также использовать особую лидерную последовательность. Подходящими лидерными последовательностями являются такие, которые включают последовательности, способные управлять оптимальной экспрессией чужеродной или эндогенной последовательности ДНК. Например, такие лидерные последовательности включают предпочтительную консенсусную последовательность, которая может увеличивать или поддерживать стабильность мРНК и предотвращать несоответствующую инициацию трансляции, как, например, описано в работе Joshi (1987, Nucl. Acid Res., 15: 6643). Однако другие лидерные последовательности, например лидерная последовательность RTBV,имеют высокоупорядоченную вторичную структуру, которая, как ожидается, понижает стабильность мРНК и/или снижает уровень трансляции мРНК. Таким образом, лидерные последовательности (i) которые не имеют высокоупорядоченной вторичной структуры, (ii) которые имеют высокоупорядоченную- 21008669 вторичную структуру и вторичная структура не понижает стабильность мРНК и/или не уменьшает эффективность трансляции, или (iii) которые происходят из генов, которые эффективно экспрессируются в растениях, будут более предпочтительными. Регуляторные элементы, такие как интрон сахарозосинтазы, могут быть также использованы как,например, описано в работе Vasil et al. (1989, Plant Physiol, 91: 5175), интрон Adh I, как, например, описано в работе Callis et al. (1987, Genes Develop., II), или элемент omega TMV как, например, описано в работе Gallie et. al. (1989, The Plant Cell, 1: 301), где это желательно. Специалистам в данной области известны другие такие регуляторные элементы, пригодные при осуществлении данного изобретения. Дополнительно, для адресования фермента, кодируемого чужеродным или экзогенным полинуклеотидом, во внутриклеточный компартмент внутри растительных клеток или во внеклеточную среду могут быть применены адресующие последовательности. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая последовательность транзитного или сигнального пептида может быть функционально слита с последовательностью, которая кодирует выбранный фермент данного изобретения таким образом, что после трансляции транзитный или сигнальный пептид может транспортировать фермент в определенный внутриклеточный или внеклеточный компартмент, а затем может быть факультативно посттрансляционно удален. Транзитные или сигнальные пептиды действуют, облегчая транспорт белков через внутриклеточные мембраны, например эндоплазматического ретикулума, вакуолей, везикул, пластид, митохондриальные мембраны и мембраны плазмалеммы. Например, адресующая последовательность может направлять желаемый белок в определенную органеллу, такую как вакуоль или пластида(например, хлоропласт), предпочтительнее, чем в цитозоль. Таким образом, конструкция нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может дополнительно включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей транзитный пептид пластид, функционально связанный с промоторной областью и чужеродным или экзогенным полинуклеотидом. Например, можно сослаться на работы Heijne et al.(1989, Eur. J. Biochem., 180: 535) и Keegstra et al. (1989, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 40:471). В некоторых воплощениях сахароза (то есть эндогенный сахар), хранящаяся в клетках запасающей ткани, превращается в изомальтулозу и/или трегалулозу (то есть чужеродный сахар) в результате введения гена бактерий с промотором, специфичным для запасающей ткани, и регуляторной последовательностью, обеспечивающей цитозольную локализацию сахарозоизомеразы. В этих воплощениях авторы изобретения выбирают цитозоль для экспрессии гена сахарозоизомеразы, поскольку он является ключевым компартментом клетки, вовлеченным в многочисленные процессы промежуточного метаболизма и в поток множества метаболитов. В других воплощениях они выбирают вакуоль как место локализации сахарозоизомеразной активности, поскольку она является первичным запасающим компартментом для сахаров в таких растениях, как сахарный тростник. В еще других воплощениях авторы выбирают распределение активности сахарозоизомеразы между компартментами для достижения максимального эффекта в общей аккумуляции сахаров. В других воплощениях продукт экспрессии гена может быть направлен в другие клеточные компартменты, такие как вакуоли, лизосомы, пероксисомы, пластиды, митохондрии,эндоплазматический ретикулум, ядра или внеклеточное пространство, как подходит для представляющих интерес исследователей метаболических путей. Конструкция нуклеиновой кислоты данного изобретения может быть введена в вектор, такой как плазмида. Плазмидные вектора, например, сконструированные на основе таких векторов, как pUC, pSK,pGEM, pSP или pBS, включают дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты, которые обеспечивают облегчение селекции, амплификации и трансформации экспрессионной кассеты в прокариотические и эукариотические клетки. Дополнительные последовательности нуклеиновых кислот включают ориджины репликации для обеспечения автономной репликации вектора, гены селектируемых маркеров, предпочтительно кодирующие гены, обеспечивающие устойчивость к антибиотику или гербициду, уникальные множественные сайты для клонирования, что обеспечивает множество сайтов для встраивания последовательностей нуклеиновых кислот или генов, закодированных в конструкции нуклеиновой кислоты, и последовательности, которые увеличивают эффективность трансформации прокариотических и эукариотических (особенно растительных) клеток. Вектор предпочтительно содержит один или более элементов, обеспечивающих либо интеграцию вектора в геном клетки-хозяина, либо автономную репликацию вектора в клетке, независимо от клеточного генома. Вектор может интегрироваться в геном клетки-хозяина после его введения в клеткухозяина. Интеграция вектора может зависеть от имеющейся в нем чужеродной или экзогенной полинуклеотидной последовательности или от любых других элементов вектора, которые обеспечивают его стабильную интеграцию в геном за счет гомологичной рекомбинации. Альтернативно этому, вектор может содержать дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты, обеспечивающие направленную гомологичную рекомбинацию вектора в геном клетки-хозяина. Дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты обеспечивают интеграцию вектора в геном клетки-хозяина в строго определенное место в хромосоме. Чтобы увеличить вероятность встраивания в геном клетки-хозяина в строго определенное место, интеграционные элементы должны предпочтительно содержать достаточное количество нуклеиновых кислот, такое как от 100 до 1500 пар оснований, предпочтительно от 400 до 1500 пар оснований, и наиболее предпочтительно от 800 до 1500 пар оснований, которые имеют высокую степень го- 22008669 мологии с соответствующей последовательностью-мишенью для увеличения вероятности гомологичной рекомбинации. В качестве интеграционных элементов могут выступать любые последовательности, которые гомологичны последовательности-мишени в геноме клетки-хозяина. Более того, интеграционными элементами могут быть как некодирующие, так и кодирующие последовательности нуклеиновой кислоты. Для целей клонирования и субклонирования вектор может также включать в себя ориджин репликации, что обеспечивает вектору возможность автономно реплицироваться в клетке-хозяине, такой как бактериальная клетка. Примерами бактериальных ориджинов репликации являются ориджины репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177 и pACYC184, обеспечивающие репликацию в Е. coli, и pUB110,pE194, рТА 1060 и pAM31, обеспечивающие репликацию в Bacillus. Ориджин репликации может также содержать определенную мутацию, которая делает ее функционирование в клетках Bacillus температурно-чувствительным (см., например, Ehrlich, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1433),4.4 Маркерные гены Для облегчения идентификации трансформантов, в конструкцию нуклеиновой кислоты включается желаемый селектируемый или пригодный для скрининга маркерный ген, или в дополнение к этому чужеродный или экзогенный полинуклеотид. Конкретный выбор маркера принципиально не важен, если он является функциональным (то есть, селектируемым) в интересующих растительных клетках. Маркерный ген и чужеродный или экзогенный полинуклеотид не обязательно должны быть слиты, поскольку совместная трансформация неслитыми генами также эффективна при трансформации растений, как, например,это описано в U.S. Pat. No. 4399216. Определяемые терминами селектируемые или пригодные для скрининга маркерные гены - это гены, кодирующие секретируемый маркер, секреция которого может детектироваться для идентификации или отбора трансформированных клеток. Примеры включают маркеры, которые кодируют секретируемый антиген, идентифицируемый по взаимодействию с соответствующими антителами, или секретируемые ферменты, детектируемые по их каталитической активности. Секретируемые белки включают,но ими не ограничиваются, белки, которые встраиваются в клеточную стенку или захватываются клеточной стенкой (например, белки, имеющие лидерную последовательность, такую как обнаруженная в экспрессируемой единице белка экстензина или PR-S табака); небольшие способные к диффузии белки, которые можно детектировать, например, с помощью ELISA, и небольшие активные ферменты, активность которых определяется во внеклеточном растворе (например, -амилаза, -лактамаза, фосфинотрицинацетилтрансфераза). 4.4.1 Селектируемые маркеры Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются гены dal из Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis, или маркеры, которые обеспечивают устойчивость к антибиотикам, таким как ампициллин, канамицин, эритромицин, хлорамфеникол или тетрациклин. Типичными селектируемыми маркерами для отбора растительных траснформантов являются, но ими не ограничиваются, ген hyg, который обеспечивает устойчивость к гигромицину В, ген неомицинфосфотрансферазы (nео), придающий устойчивость к канамицину, паромомицину, G418 и подобным соединениям, описанным, например, в работеPotrykus et al. (1985, Mol. Gen. Genet. 199: 183); ген глутатион-S-трансферазы из печени крысы, придающий устойчивость к обладающим гербицидной активностью производным глутатиона, как, например,описано в ЕР-A 256 223; ген глутаминсинтетазы, обеспечивающий при суперэкспрессии устойчивость к ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как фосфинотрицин, как, например, описано в WO87/05327, ген ацетилтрансферазы из Streptomyces viridochromogenes, придающий устойчивость к селективному агенту фосфинотрицину, как, например, описано в ЕР-А 275957, ген, кодирующий 5-енолшикимат-3 фосфатсинтазу (EPSPS), придающий устойчивость к N-фосфонометилглицину, как, например, описано в работе Hinchee et al. (1988, Biotech, 6: 915), ген bar, придающий устойчивость к биалафосу, как, например, описано в WO91/02071; ген нитрилазы, например ген bхn из Klebsiella ozaenae, который придает устойчивость к бромоксинилу (Stalker et al., 1988, Science, 242: 419); ген дигидрофолатредуктазы(DHFR), придающий устойчивость к метотрексату (Thillet et al., 1988, J. Biol. Chem., 263: 12500); мутантный ген ацетолактатсинтазы (ALS), который придает устойчивость к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим ингибирующим ALS соединениям (ЕР-А-154204); мутантный ген антранилатсинтазы, который придает устойчивость к 5-метилтриптофану; или ген далапондегалогеназы, который придает устойчивость к гербициду. 4.4.2 Маркеры, пригодные для скрининга Предпочтительные маркеры, пригодные для скрининга, включают, но ими не ограничиваются, генuidA, кодирующий фермент Р-глюкуронидазу (GUS), для которого известны многочисленные хромогенные субстраты; ген -галактозидазы, кодирующий фермент, для которого известны хромогенные субстраты; ген экворина (Prasher et al., 1985, Biochem. Biophys. Res. Comm., 126: 1259), который может использоваться для детекции кальций-чувствительной биолюминесценции; ген зеленого флуоресцентного белка (Niedz et al., 1995 Plant Cell Reports, 14: 403); ген люциферазы (luc) (Ow et al., 1986, Science, 234: 856), который позволяет проводить биолюминесцентную детекцию; ген -лактамазы (Sutcliffe, 1978,- 23008669Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737), кодирующий фермент, для которого известны многочисленные хромогенные субстраты (например, PADAC, хромогенный цефалоспорин); ген R-локуса, кодирующий продукт, который регулирует образование антоциановых пигментов (красная окраска) в тканях растений(Dellaporta el al., 1988, in Chromosome Structure and Function, pp. 263-282); ген а-амилазы (Ikuta et al.,1990, Biotech, 8:241); ген тирозиназы (Katz et al., 1983, J. Gen. Microbiol, 129:2703), который кодирует фермент, способный окислять тирозин до допа и допахинона, который в свою очередь конденсируется с образованием легко детектируемого вещества меланина; или ген xylE (Zukowsky et al., 1983, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 80: 1101), который кодирует катехиндиоксигеназу, способную превращать хромогенные катехины. 5. Введение конструкции нуклеиновой кислоты в клетки растений Для введения молекул нуклеиновой кислоты в растительную клетку-хозяина доступны многочисленные методы. Существует много методов трансформации растительных клеток, хорошо известных специалистам в данной области, и постоянно предлагаются новые методы. Практический выбор способа трансформации будет определяться его эффективностью при трансформации конкретных видов растений, а также опытом и предпочтениями того специалиста, который будет использовать настоящее изобретение в соответствии с определенной выбранной методологией. Опытному специалисту должно быть очевидно, что конкретный выбор способа трансформации для введения конструкции нуклеиновой кислоты в клетки растения не является принципиальным или ограничивающим данное изобретение; он должен обеспечивать приемлемый уровень переноса нуклеиновой кислоты. Практические рекомендации для применения систем для трансформации с целью усовершенствования растений изложены в Birch (1997,Аnnu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 48: 297-326). В принципе, как двудольные, так и однодольные растения, подходящие для трансформации, могут быть модифицированы с помощью введения конструкции нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением в клетку-реципиент и выращивания нового растения, которое несет в себе и экспрессирует полинуклеотид в соответствии с данным изобретением. Введение и экспрессию чужеродных или экзогенных полинуклеотидов в двудольных (широколиственных) растениях, таких как табак, картофель или люцерна можно произвести, как было показано, с использованием Т-ДНК индуцирующей опухоли (Ti) плазмиды из Agrobacterium tumefaciens (см., например, Umbeck, U.S. Patent No. 5004863, и международную заявку PCT/US93/02480). Конструкция из данного изобретения может быть введена в клетку растения с использованием A. tumefaciens, содержащей Ti плазмиду. При использовании культуры A. tumefaciens в качестве средства для трансформации, наиболее выгодным является использование неонкогенного штамма Agrobacterium в качестве переносчика вектора, чтобы была возможной нормальная неонкогенная дифференцировка трансформируемых тканей. Предпочтительно, чтобы Agrobacterium содержала бинарную систему плазмиды Ti. Такая бинарная система включает в себя (1) первую Ti плазмиду, имеющую участок вирулентности,необходимый для интродукции транспортной ДНК (Т-ДНК) в растения, и (2) химерную плазмиду. Химерная плазмида содержит в себе по меньшей мере один пограничный участок Т-ДНК плазмиды Ti дикого типа, фланкирующий нуклеиновую кислоту, которая должна быть перенесена. Было показано, что системы бинарных Ti плазмид являются эффективными для трансформации растительных клеток, как,например, описано в работах De Framond (1983, Biotechnology, 1:262) и Hoekema et al. (1983, Nature,303:179). Такие бинарные системы являются предпочтительными inter alia, поскольку они не требуют интеграции в Ti плазмиду Agrobacterium. Методы с использованием Agrobacterium включают, но ими не ограничиваются:(б) трансформацию растительных клеток или тканей Agrobacterium; или(в) трансформацию семян, верхушечных точек или меристем Agrobacterium. Рис и кукуруза, относящиеся к однодольным, как было показано, также восприимчивы к трансформации Agrobacterium. Однако многие другие культурные однодольные растения, включая овес, сорго,просо и рожь, пока не удалось успешно трансформировать с использованием Agrobacterium. Тем не менее Ti плазмида может в будущем использоваться в качестве вектора для работы с этими однодольными растениями. Кроме того, используя Ti плазмиду в качестве модельной системы, возможно удастся искусственно создать вектор для трансформации этих растений. Плазмида Ti может также быть интродуцирована в однодольные растения искусственными методами, такими как микроинъекция или слияние протопластов однодольного растения и сферопластов бактерии, содержащей Т-участок, который затем может быть интегрирован в ядерную ДНК растения. Кроме того, перенос гена может быть осуществлен с помощью in situ трансформацииAgrobacterium, как описано Bechtold et al. (1993, C.R. Acad. Sci. Paris, 316: 1194). Этот подход основывается на вакуумной инфильтрации суспензии клеток Agrobacterium. Альтернативно этому, химерная конструкция может быть введена с использованием в качестве векторов индуцирующих корни (Ri) плазмид Agrobacterium. Вирус мозаики цветной капусты (CaMV) может также использоваться в качестве вектора для интродукции экзогенных нуклеиновых кислот в клетки растений (U.S. Pat. No. 4407956). ДНК геномаCaMV включается в родительскую бактериальную плазмиду, при этом создается рекомбинантная молекула ДНК, которая может размножаться в бактерии. После клонирования рекомбинантная плазмида снова может быть клонирована и в дальнейшем модифицирована путем введения в нее желаемой последовательности нуклеиновой кислоты. Модифицированная вирусная часть рекомбинантной плазмиды затем вырезается из родительской бактериальной плазмиды и используется для введения в растительные клетки или в растения. Конструкция нуклеиновой кислоты может также вводиться в растительные клетки способом электропорации, как, например, описано Fromm et al. (1985, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A, 82: 5824) и Shimamoto et al. (1989, Nature 338: 274-276). При использовании этой техники растительные протопласты подвергают электропорации в присутствии векторов или нуклеиновых кислот, содержащих необходимые последовательности нуклеиновых кислот. Электрические импульсы с высокой напряженностью поля делают мембраны обратимо проницаемыми, обеспечивая проникновение нуклеиновых кислот. Подвергнутые электропорации протопласты растений восстанавливают клеточную стенку, делятся и формируют каллюс. Другим методом введения конструкции нуклеиновой кислоты в клетку растения является высокоскоростное баллистическое обстреливание мелкими частицами (известное также как бомбардировка частицами или бомбардировка микроснарядами) с предназначенными для введения нуклеиновыми кислотами, которые введены внутрь матрицы или закреплены на поверхности таких микробусинок или частиц,как, например, описано Klein et al. (1987, Nature 327: 70). Хотя обычно требуется введение в клетку только одной последовательности нуклеиновой кислоты, данный метод, в частности, предусматривает множественное введение. Альтернативно этому, конструкция нуклеиновой кислоты может быть введена в растительную клетку контактным способом с использованием механических или химических методов. Например, нуклеиновая кислота может быть механически перенесена непосредственно в растительную клетку посредством микроинъекции с использованием микропипетки. Альтернативно этому, нуклеиновая кислота может быть внесена в растительную клетку с использованием полиэтиленгликоля, который образует с генетическим материалом преципитирующий комплекс, захватываемый клеткой. В настоящее время известно много разных методов для трансформации однодольных растений. Чаще всего такими методами трансформации однодольных являются бомбардировка микрочастицами эксплантов или суспензии клеток, перенос генов с использованием Agrobacterium и прямое поглощение ДНК или электропорация, как, например, описано Shimamoto et al. (1989, supra). Трансгенные растения кукурузы были получены посредством введения bar гена Streptomyces hygroscopicus в зародышевые клетки кукурузы, культивируемые в суспензии, с помощью бомбардировки микрочастицами (GordonKamm, 1990, Plant Cell, 2: 603-618). О введении генетического материала в алейроновые протопласты других однодольных злаков, таких как пшеница и ячмень, сообщалось в литературе (Lee, 1989, Plant Mol.Biol. 13: 21-30). Растения пшеницы регенерировали из эмбриогенных суспензионных культур посредством отбора достигших определенного возраста компактных и имеющих почковидную форму эмбриогенных каллюсных тканей для установления эмбриогенных суспензионных культур (Vasil, 1990,Bio/Technol. 8: 429-434). Комбинация с системами трансформации для этих зерновых делает возможным применение данного изобретения для однодольных растений. Эти методы также могут использоваться для трансформации и регенерации двудольных растений. Трансгенные растения сахарного тростника были регенерированы из эмбриогенного каллюса, как, например, описано Bower et al. (1996, MolecularBreeding 2: 239-249). Альтернативно этому, можно использовать комбинацию разных подходов для усиления эффективности процесса трансформации, например бомбардировку микрочастицами, покрытыми Agrobacterium(EP-A-486234), или бомбардировку микроснарядами для нанесения ран с последующим совместным культивированием с Agrobacteriun (EP-A-486233). Предпочтительными растениями для настоящего изобретения являются виды, выращиваемые или собираемые для получения ценных веществ, включая растворимые углеводы, которые используются,например, как продукты питания, корма, для ферментативной переработки или в качестве промышленного сырья и для других целей. Примеры таких видов включают содержащие сахар культуры, такие как сахарный тростник, сахарная свекла, сладкое сорго и цикорий; плоды, такие как виноград, цитрусовые,семечковые плоды, косточковые плоды и орехи; овощи, выращиваемые для использования листьев,стеблей, корней, клубней, плодов, стручков или семян; а также кормовые травы. 6. Промоторные последовательности настоящего изобретения Настоящее изобретение также обеспечивает промоторную последовательность для стебельспецифичной экспрессии химерных и гетерологичных генов в растениях, главным образом в однодольных растениях, и более предпочтительно в травянистых однодольных растениях, которая включает последовательность, представленную в SEQ ID NO:10. Эта промоторная последовательность также называется в изобретении промотором Р 67 В. Настоящее изобретение также включает в себя биологически активные части последовательности SEQ ID NO:10 и варианты полинуклеотидной последовательности. Специалисты в данной области должны понимать, что биологически активная часть или фрагмент про- 25008669 моторной последовательности, слитые с определенным геном и введенные в клетку растения, обеспечивают экспрессию гена на уровне, который выше уровня экспрессии в отсутствие такого фрагмента. Согласно настоящему изобретению в промотор могут быть включены один или более биологически активных участков, например один или более мотивов могут быть соединены в минимальный промотор. Такие мотивы могут придавать промотору Р 67 В такие функции промотора, как способность к увеличенной эффективности в стеблях однодольных растений и особенно травянистых однодольных растений,иллюстративные примеры которых включают сахарный тростник, рис, пшеницу, сорго, ячмень, рожь,кукурузу и тому подобное. Активность промотора может быть определена методами, хорошо известными специалистам. Например, уровень активности промотора поддается количественной оценке по определению количества мРНК, синтезируемой при транскрипции с данного промотора или по количеству белкового продукта,образуемого при трансляции мРНК, синтезируемой при транскрипции с данного промотора. Количество специфической мРНК, присутствующей в системе экспрессии, может быть определено, например, с использованием специфических олигонуклеотидов, способных гибридизоваться с данной мРНК, которые помечены, или могут использоваться для специфической реакции амплификации, такой как ПЦР. Использование репортерного гена облегчает определение активности промотора в результате продукции определенного белка. Методы измерения активности промотора, которыми набор возможных методов не ограничивается, раскрыты в работах Medberry et al. (1992, Plant Cell 4: 185; 1993, The Plant J. 3: 619),Sambrook et al. (1989, supra) и McPherson et al. (U.S. Patent No. 5164316). Настоящее изобретение также включает варианты промотора, которые, по существу, комплементарны ссылочному промотору настоящего изобретения. В целом, эти варианты промотора будут включать участки, которые демонстрируют по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательности со ссылочной полинуклеотидной последовательностью идентичного размера (в пределах окна сравнения) или при сравнении выровненных последовательностей, когда выравнивание производится с помощью компьютерных программ для определения степени гомологии, известных специалистам в данной области. Подходящие варианты могут выбираться с использованием стандартных методов. Например, полинуклеотиды, соответствующие SEQ ID NO:10, могут быть подвергнуты случайному мутагенезу (например, транспозонному мутагенезу), олигонуклеотид-опосредованному(или сайт-направленному) мутагенезу, ПЦР-мутагенезу и кассетному мутагенезу предварительно подготовленного варианта или безвариантной версии изолированного природного промотора настоящего изобретения с применением стандартных процедур, известных специалистам в данной области. Альтернативно этому, варианты промоторной последовательности могут быть получены в соответствии со следующим способом:(а) получение экстракта нуклеиновой кислоты из подходящего организма, который предпочтительно относится к однодольным, и предпочтительно к травянистым однодольным, таким как сахарный тростник;(б) конструирование праймеров, фланкирующих по меньшей мере часть последовательности ссылочного промотора настоящего изобретения; и(в) с использованием праймеров для амплификации, посредством метода амплификации нуклеиновой кислоты получение по меньшей мере одного продукта амплификации из экстракта нуклеиновой кислоты, где продукт амплификации соответствует варианту промотора настоящего изобретения. Подходящими методами для амплификации нуклеиновой кислоты являются хорошо известные специалистам методы, которые включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР), как, например, описано в Ausubel et al. (supra); амплификацию с вытеснением цепи (strand displacement amplification (SDA,как, например, описано в U.S. Patent No 5422252; репликацию по типу катящегося кольца (rolling circlereplication (RCR, как, например, описано в Liu et al, (1996, J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594 и International application WO 92/01813) и Lizardi et al. (International Application WO 97/19193); амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (nucleic acid sequence-based amplification (NASBA,как, например, описано Sooknanan et al. (1994, Biotechniques 17: 1077-1080); и амплификацию с репликазой Q- (Q- replicase amplification), как, например, описано Tyagi et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5395-5400). 7. Использование промотора настоящего изобретения Последовательность изолированного промотора настоящего изобретения может использоваться, inter alia, для обеспечения экспрессии чужеродной или эндогенной последовательности ДНК. Чужеродная или эндогенная последовательность ДНК может включать участок, транскрибируемый в молекулу РНК,которая модулирует экспрессию соответствующего гена-мишени. Такая модуляция экспрессии может достигаться, например, с использованием антисмысловой технологии, рибозимной технологии и косуппрессии или зависимого от гомологии сайлесинга гена, что хорошо известно специалистам в данной области. В соответствии с этим, транскрипт может включать в себя антисмысловую молекулу РНК, или рибозим, или другой транскрипт (такой как инвертированные повторы и дцРНК, как, например, сказано ниже) с целью понижающей регуляции экспрессии соответствующего гена-мишени. Таким образом, в некоторых воплощениях транскриптом является антисмысловая молекула РНК,- 26008669 которая непосредственно блокирует трансляцию мРНК, транскрибируемой с гена-мишени, за счет связывания с этой мРНК и предотвращения трансляции белка. Там, где это применимо, антисмысловые РНК должны иметь в длину по меньшей мере около 10-20 нуклеотидов или более, и быть по меньшей мере на 75% комплементарными их генам-мишеням или транскриптам генов, так чтобы предотвращать экспрессию гомологичных последовательностей-мишеней. В других воплощениях транскрипт представляет собой рибозим, функция которого заключается в ингибировании трансляции мРНК гена-мишени. Рибозимы - это обладающие энзиматической активностью молекулы РНК, способные катализировать специфическое расщепление мРНК. Механизм действия рибозимов включает последовательность-специфичную гибридизацию молекулы рибозима с комплементарной РНК-мишенью с последующим эндонуклеолитическим расщеплением. В объем настоящего изобретения входят сконструированные молекулы рибозимов, содержащие мотивы, имеющие форму молотка, которые специфически и эффективно катализируют эндонуклеолитическое расщепление последовательностей РНК генов-мишеней. Участки специфического расщепления рибозимами в потенциальной молекуле-мишени РНК могут быть заранее найдены с помощью сканирования молекулы-мишени для поиска сайтов расщепления рибозимами, которые включают последовательности GUA, GUU и GUC. В случае идентификации такого сайта могут быть сконструированы короткие последовательности РНК размером от 15 до 20 рибонуклеотидов, соответствующие участку гена-мишени, содержащему такой сайт расщепления, для предсказания особенностей их структуры, например вторичной структуры, которые могут сделать олигонуклеотидную последовательность неподходящей. В случае использования подходящие рибозимы могут быть подобраны из группы, состоящей из имеющих форму молотка рибозимов,имеющих форму топора рибозимов, саттелитных рибозимов тритона, рибозимов из Tetrahymena и РНКазы Р, и далее сконструированы с помощью известных специалистам в данной области методов на основании конкретной последовательности гена-мишени (например, см. U.S. Pat.5741679). Пригодность предполагаемых мишеней может быть также проверена по их доступности для гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами при проведении экспериментов, предусматривающих защиту от рибонуклеаз. В других воплощениях транскриптом является молекула РНК, которая обеспечивает интерференцию РНК (РНКи) гена-мишени или транскрипта гена. РНКи обозначает взаимодействие с продуктом или разрушение продукта гена-мишени за счет введения одноцепочечной, или обычно двухцепочечной РНК(дцРНК), которая гомологична транскрипту гена-мишени. Таким образом, в некоторых воплощениях дцРНК per se и особенно дцРНК-производящие конструкции, соответствующие по меньшей мере части гена-мишени, могут использоваться для уменьшения уровня и/или функциональной активности его продукта. Опосредованное РНКи ингибирование экспрессии гена может быть достигнуто с использованием любого метода, известного специалистам, например, путем трансфекции конструкцией нуклеиновой кислоты, кодирующей структуру РНК стебель-петля или шпилька, в геном клетки-хозяина, или путем экспрессии конструкции трансфицированной нуклеиновой кислоты, гомологичной гену-мишени, между конвергентными промоторами, или за счет дупликации голова к голове или хвост к хвосту позади единственного промотора. Любая подобная конструкция может быть использована, если она обеспечивает получение одиночной РНК, способной замыкаться сама на себя и формировать дцРНК, или если она обеспечивает получение двух отдельных транскриптов РНК, которые отжигаются и образуют дцРНК,гомологичную гену-мишени. Из литературы известно, что для РНКи не требуется абсолютной гомологии, нижний порог гомологии составляет около 85% для дцРНК длиной около 200 пар оснований (Plasterk and Ketting, 2000, CurrentOpinion in Genetics and Dev. 10: 562-67). Таким образом, в зависимости от длины дцРНК, РНКикодирующие нуклеиновые кислоты могут варьировать по своему уровню гомологии с транскриптом гена-мишени, то есть дцРНК длиной от 100 до 200 пар оснований должна иметь по меньшей мере около 85% гомологии с геном-мишенью, а более длинные дцРНК, то есть длиной от 300 до 400 пар оснований должны иметь по меньшей мере около 75% гомологии с геном-мишенью. РНК-кодирующие конструкции, которые экспрессируют одиночный РНК-транскрипт, предназначенный для отжига с отдельно экспрессируемой РНК, или одиночные конструкции, экспрессирующие отдельные транскрипты с конвергентных промоторов, предпочтительно имеют в длину по меньшей мере около 100 нуклеотидов. РНКкодирующие конструкции, которые экспрессируют одиночную РНК, сконструированную для формирования дцРНК за счет внутреннего фолдинга, предпочтительно имеют в длину по меньшей мере около 200 нуклеотидов. Промотором, используемым для экспрессии конструкции, формирующей дцРНК, может быть промотор любого типа, если образующаяся дцРНК является специфичной по отношению к продукту гена,предназначенному для разрушения, в данной линии клеток. Альтернативно этому, промотор может быть специфичен к определенной линии клеток, если он экспрессируется в этой линии на определенной стадии развития. Может оказаться выгодным, если наблюдается некоторое перекрывание в гомологии с геном, который экспрессируется в линии клеток, не являющихся мишенью. Промотор также может индуцироваться посредством контролируемых внешних факторов, или за счет эндогенных вызываемых внешней средой факторов.- 27008669 В другом воплощении изобретения для обеспечения РНКи могут использоваться молекулы РНК длиной от примерно 21 до примерно 23 нуклеотидов, которые обеспечивают расщепление специфической мРНК, которой они соответствуют, как, например, описано Tuschl et al. в U.S. Patent Application No. 20020086356. Такие 21-23-нуклеотидные молекулы РНК могут содержать 3'-гидроксильную группу, могут быть одноцепочечными или двухцепочечными (как две 21-23-нуклеотидные РНК), причем молекулы дцРНК могут иметь тупые концы или содержать выступающие концы (например, 5', 3'). В других своих воплощениях чужеродная или эндогенная последовательность ДНК кодирует: детектируемый или измеряемый продукт, например р-глюкуронидазу или люциферазу; селектируемый продукт, например неомицинфосфотрансферазу (nptII), обеспечивающую устойчивость к аминогликозидным антибиотикам, таким как Geneticin или паромомицин; продукт, обеспечивающий устойчивость к гербицидам, например устойчивость к глифосату или устойчивость к глюфосинату; продукт, изменяющий биосинтез или модификацию крахмала, например крахмал-ветвящий фермент, крахмалсинтазу,АДФ-глюкозопирофосфорилазу; продукт, участвующий в биосинтезе жирных кислот, например десатуразу или гидроксилазу; продукт, придающий устойчивость к насекомым, например кристаллический белковый токсин из Bacillus thuringiensis; продукт, обеспечивающий устойчивость к вирусам, например белок оболочки вируса; продукт, обеспечивающий устойчивость к грибам, например хитиназу, -1,3 глюканазу или фитоалексины; продукт, изменяющий метаболизм сахарозы, например инвертазу или сахарозосинтазу; ген, кодирующий ценные фармацевтические вещества, например антибиотики, вторичные метаболиты, фармацевтические пептиды или вакцины. Последовательность чужеродной или эндогенной ДНК включает, но не ограничивается, ДНК из генов растений и генов нерастительных организмов, таких как бактерии, дрожжи, животные или вирусы. Более того, в объем настоящего изобретения включается выделение последовательности чужеродной или эндогенной ДНК из данного генотипа растения, последующее введение размноженных копий этой последовательности в тот же самый генотип, например, для усиления производства продукта определенного гена. Вводимая ДНК может содержать модифицированные гены, части генов, химерные гены, включая гены из того же или другого растительного генотипа. К показательным агрономическим свойствам, кодируемым чужеродной или эндогенной последовательностью ДНК, относятся, но ими не ограничиваются, свойства, желательные для производителей растительной продукции, такие как устойчивость к недостатку воды, устойчивость или невосприимчивость к вредителям, устойчивость или невосприимчивость к гербицидам, устойчивость или невосприимчивость к болезням (например, устойчивость к вирусным или грибным патогенам), невосприимчивость к стрессу(повышенная устойчивость к засолению) и повышенное содержание полезных веществ или повышенная урожайность; свойства, желательные для потребителей сельскохозяйственной продукции, получаемой из растений, такие как повышенное содержание питательных веществ в продуктах питания человека или кормах животных, или преимущества в производстве пищевых продуктов, такие как улучшенная перерабатываемость. При таком применении трансгенные растения, содержащие промотор данного изобретения, как правило, выращиваются для использования их семян, плодов или других частей растений, включая стебли, оболочки, вегетативные части и тому подобное в качестве продуктов питания человека или кормов животных, включая их использование для силосования кормов для животных или в декоративных целях. Часто химические компоненты зерновых культур экстрагируются для использования в качестве продуктов питания или для промышленного использования, поэтому могут быть созданы трансгенные растения, имеющие повышенное или измененное содержание таких компонентов. Изолированная последовательность промотора данного изобретения может также найти применение в коммерческом производстве белков или других веществ, если интересующее вещество экстрагируется или очищается из частей растения, семян и тому подобное. Такие белки и другие вещества включают, но ими не ограничиваются, иммуногенные молекулы для использования в качестве вакцин, цитокины и гормоны. Можно также культивировать клетки или ткани из растений, выращивая их in vitro, или проводить ферментацию для получения нужных веществ. Трансгенные растения, содержащие изолированную последовательность промотора из настоящего изобретения, могут также использоваться для целей промышленного разведения, или могут скрещиваться с сельскохозяйственными растениями близких видов. Улучшенные свойства, закодированные в чужеродной или эндогенной последовательности ДНК, могут быть перенесены, например, из клеток одних видов растений в клетки друтих видов растений, например, путем слияния протопластов. Трансгенные растения, содержащие изолированную последовательность промотора из настоящего изобретения, могут также использоваться в различных целях в исследовательской работе или в разведении, включая создание новых мутантных растений посредством инсерционного мутагенеза, чтобы выявить желательные мутантные формы, которые в будущем могут быть получены путем традиционного мутагенеза и отбора. Примером такого использования может быть введение рекомбинантной последовательности ДНК, кодирующей мобильный элемент, который может использоваться для создания генетических вариаций, или введения уникальной идентификационной последовательности-подписи, или других маркерных последовательностей, которые могут использоваться для идентификации являющихся- 28008669 собственностью линий или разновидностей. 8. Получение и характеристика дифференцированных трансгенных растений 8.1 Регенерация Способы, используемые для регенерации трансформированных клеток в дифференцированные растения, не являются принципиальными для данного изобретения, поэтому может использоваться любой из способов, подходящих для растения-мишени. Обычно после процесса трансформации клетки растения регенерируют для получения целого растения. Регенерация растения из протопластов варьирует от вида к виду растения, но обычно вначале получают суспензию протопластов. Для некоторых видов можно вслед за этим индуцировать образование зародыша из суспензии протопластов, вплоть до стадии созревания и прорастания, как у настоящего зародыша. Культуральная среда обычно содержит различные аминокислоты и гормоны, необходимые для роста и регенерации. Примеры используемых гормонов включают ауксины и цитокинины. Иногда предпочтительным является введение в среду глутаминовой кислоты и пролина, особенно для таких видов,как кукуруза и люцерна. Эффективность регенерации будет зависеть от состава среды, генотипа, и от предыстории культуры. Если контролировать эти составляющие, регенерация является воспроизводимой. Регенерация также осуществляется из каллюса эксплантов, органов или частей растения. Трансформацию можно проводить в контексте регенерации органа или части растения, как, например, описано в Methods in Enzymology, Vol. 118 и Klee et al. (1987, Annual Review of Plant Physiology, 38: 467); данные работы включаются в изобретение путем отсылки. При использовании метода трансформациирегенерации листового диска, предложенного Horsch et al. (1985, Science, 227: 1229, включается в изобретение путем отсылки), диски культивируются на селективной среде, после чего в течение примерно 24 недель появляются ростки. Развивающиеся ростки вырезаются из каллюсов и помещаются на подходящую селективную среду, стимулирующую образование корней. Укорененные растеньица после появления корней как можно быстрее переносятся в почву. По мере необходимости растения пересаживают до достижения ими зрелости. У вегетативно размножающихся культур взрослые трансгенные растения размножают с помощью черенкования или с использованием техники культуры ткани для получения множества идентичных растений. После этого производят отбор желаемых трансформантов, получают новые разновидности и вегетативно размножают их для коммерческого использования. У культур, размножающихся семенами, взрослые трансгенные растения могут подвергать самоопылению для получения инбредных гомозиготных растений. Инбредное растение дает семена, содержащие новый интродуцированный ген или гены. Из этих семян выращивают растения, которые будут обладать определенным фенотипом, например рано зацветать. Части, получаемые из регенерированных растений, такие как цветы, семена, листья, ветки, плоды и тому подобное, входят в состав настоящего изобретения, при условии, что они включают клетки, которые трансформированы описанным способом. Потомство, варианты и мутанты регенерированных растений также включаются в объем изобретения, при условии, что эти части также включают в себя введенные последовательности нуклеиновой кислоты. Необходимо учитывать, что в литературе постоянно появляется множество описаний новых методов для регенерации все новых видов растений. Поэтому любой специалист в данной области может подобрать в литературе подходящий для его конкретных целей метод, не тратя времени на чрезмерное экспериментирование. Характеристика Для того чтобы подтвердить присутствие в регенерированном растении чужеродного или экзогенного полинуклеотида, может быть использовано много разных методов. Такие методы включают, например, молекулярно-биологические анализы, хорошо известные специалистам, такие как Саузерн- и нозерн-блоттинг и ПЦР; методы для определения активности ферментов, метаболизирующих сахара; а также иммунологические методы, позволяющие определить наличие или количество экспрессированного фермента. После того, как наличие интересующего фермента в растении подтверждено, растение выращивается. Необходимо вырастить два и более поколений, чтобы с уверенностью подтвердить, что определенная фенотипическая характеристика растения является устойчивой и передается по наследству. Для идентификации желаемых фенотипических характеристик, трансгенные растения, которые содержат и экспрессируют данный фермент, метаболизирующий сахар, сравниваются с контрольными растениями. Соответственно, трансгенные растения отбираются с помощью измерения активности фермента в выбранных запасающих тканях, например в тканях клубней, плодов и/или корней. Активность фермента, метаболизирующего сахар, может периодически измеряться на разных стадиях роста и старения и сравниваться с таковой в контрольных растениях. Растения или части растений, имеющие повышенный или пониженный уровень активности фермента по сравнению с контролем, обираются на одной или нескольких стадиях развития. Активность может сравниваться по одному или нескольким параметрам,включая тип фермента, тип контрольного элемента транскрипции, тип инициации трансляции, тип участка терминации, число копий трансгена, инсерцию и расположение трансгена. При определении фенотипических характеристик, связанных с ферментативной активностью,- 29008669 трансгенные и контрольные растения желательно выращивать в камере для выращивания, теплице, камере без крыши и/или в полевых условиях. Идентификация определенной фенотипической характеристики и сравнение с контролем основывается на рутинном статистическом анализе и подсчете. Статистические различия между линиями растений могут определяться путем сравнения в линиях растений активности фермента, метаболизирующего сахар, в каждой ткани, экспрессирующей фермент. Экспрессия и активность сравниваются с параметрами роста, развития и урожайности, которые включают морфологию частей растения, цвет, число, размеры, сухой и сырой вес, созревание, соотношение биомасс надземной и подземной частей, время наступления, скорости и длительность разных стадий роста и старения, включая вегетативный рост, плодоношение, цветение, содержание растворимых углеводов, включая сахарозу, глюкозу, фруктозу, уровни крахмала и уровни других эндогенных сахаров, а также уровни чужеродных сахаров. Для идентификации трансгенных растений, имеющих другие характеристики, растения могут тестироваться на их фотосинтетическую и метаболическую активность, а также на синтез конечных продуктов. Например, материал, выделенный из таких клеток и частей трансгенного растения,как клубни, плоды или корни, анализируется на содержание таких конечных продуктов, как крахмал,сахароза, глюкоза, фруктоза, сахароспирты, а также другие эндогенные и чужеродные сахара с помощью стандартных методик. Сахаристость, основанная на содержании сахаров, в частности фруктозы и сахарозы, также может быть измерена. У некоторых растений для получения фенотипического эффекта может потребоваться изменение условий роста. Например, кислород, углекислый газ и свет могут контролироваться и измеряться в специальной открытой газовой камере, и распределение углерода может измеряться с помощью использования меченого С 14 углекислого газа или других субстратов метаболизма. Включение углерода также может измеряться в экстрактах из плодов, листьях и/или корней с помощью хроматографии или по методу Брикса с помощью сахарного рефрактометра. Эти характеристики можно сравнивать для разных линий в разных условиях роста, меняя в камере параметры газообмена, количество и качество света, температуру, субстрат или влажность. 9. Получение продуктов ферментации Растворимые углеводы, подуцируемые трансгенными растениями из настоящего изобретения, будут включать сбраживаемые углеводы, которые затем могут использоваться в качестве промышленного сырья для ферментации с целью производства спирта и спирт-содержащих напитков, и других продуктов ферментации, таких как продукты питания, пищевые добавки, ферменты и материалы для промышленности. Методы ферментации с использованием растительных углеводов в качестве промышленного сырья, предназначенные для получения различных конечных продуктов сбраживания, хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Vogel et al. 1996, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook: Principles, Process Design, and Equipment, Noyes Publications, Park Ridge, N.J., USA и цитированные там ссылки). В одном из воплощений изобретения растворимые углеводы могут экстрагироваться путем выжимания из растения или посредством диффузии из тканей растения в воду или другой подходящий растворитель. Получаемый сок или экстракт, содержащий растворимые углеводы, может прямо использоваться как субстрат для ферментации или биопревращения в периодическом непрерывном процессе или процессе с использованием иммобилизованных клеток. Альтернативно этому, часть растворимых углеводов может извлекаться для других целей, а неизвлеченные компоненты могут использоваться как промышленное сырье для ферментации, как это имеет место в случае патоки после извлечения большей части сахарозы путем кристаллизации. Для лучшего понимания данного изобретения и его быстрого внедрения в практику, его некоторые предпочтительные воплощения будут описаны ниже в виде примеров, которыми изобретение не ограничивается. Примеры Пример 1. Экспрессия трех генов сахарозоизомеразы (SI) в E.coli Последовательности генов сахарозоизомеразы UQErw (Erwinia rhapontici), UQ14S и UQ68J описаны в работе Бирч и By (Birch and Wu (2002. Для субклонирования трех генов сахарозоизомеразы (SI) в вектор для экспрессии рЕТ 24b (Novagen) были сконструированы три пары праймеров. При использовании полимеразной цепной реакции были удалены некодирующие области и лидерные последовательности и был введен искусственный стартовый кодон. Каждый прямой праймер 1) включает в себя стартовый кодон, 2) создает подобный существующему в растениях контекст для начала трансляции, 3) включает сайт рестрикции ВаmHI для облегчения клонирования и совпадения открытой рамки считывания гена. Каждый обратный праймер включает сайт рестрикции КрnI и стоп-кодон. Последовательности праймеров представлены ниже в табл. 1.