Вирус, вызывающий заболевание дыхательных путей у восприимчивых млекопитающих

006879 Данное изобретение относится к области вирусологии. В последние десятилетия определены несколько этиологических возбудителей болезней млекопитающих, в особенности заболеваний дыхательных путей (RTI), в особенности у людей 7. Классическими этиологическими возбудителями RTI у млекопитающих являются респираторно-синцитиальные вирусы,принадлежащие к роду Pneumovirus, обнаруженные у людей (hRSV) и жвачных, таких как крупный рогатый скот или овцы (bRSV и/или oRSV) . У RSV человека для определения 2 антигенных подгрупп hRSV используют отличия в обратном анализе перекрестной нейтрализации, иммунологическом анализе реактивности белков G и нуклеотидных последовательностях гена G. В пределах подгрупп идентичность аминокислотных последовательностей составляет 94% (подгруппа А) и 98% (подгруппа В), тогда как обнаруженный уровень идентичности аминокислотных последовательностей между подгруппами составляет всего 53%. Дополнительное разнообразие в подгруппах наблюдали, основываясь на применении моноклональных антител, анализах RT-PCR и анализах защиты от РНКазы. Вирусы обеих подгрупп распространены во всем мире и могут встречаться во время одного сезона. Инфицирование может происходить при наличии предсуществующего иммунитета, а изменения антигенов не являются строго необходимыми для возникновения повторного инфицирования. См., например, Sullender, W.M., RespiratorySyncytial Virus Genetic and Antigenic Diversity. Clinical Microbiology Reviews, 2000. 13(1): p. 1-15; Collins,P.L., McIntosh, K. and Chanock, R.M., Respiratory syncytial virus. Fields virology, ed. B. N. Knipe, Howley,P.M. 1996, Philadelphia: lippencott-raven. 1313-1351; Johnson, P.R., et al., The G glycoprotein of human respiratory syncytial viruses of subgroups A and B: extensive sequence divergence between antigenically related proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 1987. 84(16): p. 5625-9; Collins, P.L., The molecular Biology of Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) of the Genus Pneumovirus, in The Paramyxoviruses, D.W. Kingsbury, Editor. 1991, Plenum Press: New York. p. 103-153. Другим классическим Pneumovirus является вирус пневмонии мышей (PVM), вообще обнаруженный только у лабораторных мышей. Однако, часть заболеваний, наблюдающихся у млекопитающих, все еще нельзя приписать известным патогенным микроорганизмам. Изобретение относится к изолированному РНК-содержащему вирусу с однонитевой антисмысловой РНК, существенно характерному для млекопитающих (MPV), принадлежащему к подсемейству Pneumovirinae семейства Paramyxoviridae и определяемому как филогенетически соответствующий родуMetapneumovirus. Указанный вирус определяют как филогенетически соответствующий роду Metapneumovirus посредством определения нуклеотидной последовательности указанного вируса и проверки ее,например, посредством филогенетических анализов, где строят деревья максимального правдоподобия с применением 100 условий инициализации и 3 перестановок, и нахождения ее более тесно филогенетически соответствующей вирусному изоляту, депонированному в CNCM, Paris как I-2614, чем соответствующей вирусному изоляту пневмовируса птиц (APV), также известному как вирус ринотрахеита индеек(TRTV), этиологическому возбудителю ринотрахеита птиц. Для указанного филогенетического анализа наиболее полезно получить нуклеотидную последовательность не-MPV, в качестве внешней группы для сравнения, наиболее подходящий изолят для внешней группы можно получить из серотипа С пневмовируса птиц (C-APV), как, например, продемонстрировано здесь на фиг. 5. Хотя филогенетические анализы предоставляют удобный способ определения такого вируса, какMPV, здесь представлены несколько других, возможно более прямых, хотя в чем-то более ясных способов идентификации указанного вируса или вирусных белков или нуклеиновых кислот указанного вируса. Практически MPV можно идентифицировать посредством установления процентов гомологии вируса,белков или нуклеиновых кислот при сравнении с изолятами, вирусными белками или нуклеиновыми кислотами, идентифицированными здесь по последовательности или вкладу. Широко известно, что вид вирусов, особенно вид РНК-вирусов, часто составляет квазивид, где кластер указанных вирусов обнаруживает гетерогенность среди его представителей. Таким образом, ожидают, что каждый изолят может обладать несколько отличным процентом родства с одним из различных изолятов, как представлено здесь. При желании сравнить с депонированным вирусом I-2614, изобретение представляет изолированный РНК-содержащий вирус с однонитевой антисмысловой РНК, существенно характерный для млекопитающих (MPV), принадлежащий к подсемейству Pneumovirinae семейства Paramyxoviridae и определяемый как филогенетически соответствующий роду Metapneumovirus посредством определения аминокислотной последовательности указанного вируса и определения того, что указанная аминокислотная последовательность обладает существенно большей степенью гомологии аминокислот с вирусным изолятом, депонированным в CNCM, Paris как I-2614, чем представленные здесь для белка L, белка М, белкаN, белка Р или белка F, при сравнении с APV-C или подобным; изолированный РНК-содержащий вирус с однонитевой антисмысловой РНК, существенно характерный для млекопитающих (MPV), принадлежащий к подсемейству Pneumovirinae семейства Paramyxoviridae, представляют как идентифицируемый в качестве филогенетически соответствующего роду Metapneumovirus посредством определения нуклеотидной последовательности указанного вируса и определения того, что указанная нуклеотидная последовательность обладает существенно большей степенью идентичности нуклеиновой кислоты с вирусным изолятом, депонированным в CNCM, Paris как I-2614, чем определенные здесь нуклеиновые кислоты,-1 006879 кодирующие белок L, белок М, белок N, белок Р или белок F, как здесь определено ниже, в сравнении сAPV-C. Опять же, как правило, когда изоляты, или вирусные белки или нуклеиновые кислоты изолятов, которые необходимо идентифицировать, обладают процентами гомологии, которые попадают в пределы и границы процентов гомологии, идентифицированных здесь для обеих обособленных групп, беря как соответствующие изоляты для сравнения изоляты 00-1 или 99-1, можно рассматривать MPV как принадлежащий к одной из двух идентифицированных здесь серологических групп MPV. Однако когда проценты гомологии ниже или когда необходимо в большей степени отличить вирусные изоляты, например, отAPV-C, лучше обратиться к идентифицированному здесь филогенетическому анализу. Опять же нужно иметь в виду, что при выборе других изолятов для определения процентов гомологии, указанные проценты могут немного изменяться. Вместе с данным MPV, изобретение относится к диагностическим средствам и способам диагностики, и терапевтическим средствам и способам терапии для применения в диагностике и/или лечении заболевания, в частности респираторного заболевания, в особенности млекопитающих, более конкретно,людей. Однако из-за генетического родства, хотя и отдаленного, существенно характерного для MPV млекопитающих с существенно характерным для APV птиц, в частности с APV-C, изобретение также относится к средствам и способам, применимым для диагностики и лечения болезни птиц. В вирусологии наиболее рекомендуемым является проведение диагностики и/или лечения конкретной вирусной инфекции реагентами, наиболее специфичными для указанного конкретного вируса, вызывающего указанную инфекцию. В данном случае это означает, что предпочтительно проводить указанные диагностику и/или лечение инфекции MPV реагентами, наиболее специфичными для MPV. Однако это ни в коем случае не исключает возможность применения менее специфичного, но в достаточной степени перекрестно реагирующего агента, т.к. он, например, легче доступен и в достаточной мере решает поставленную задачу. Именно это здесь, например, представлено для проведения вирусологической и/или серологической диагностики инфекций MPV у млекопитающих реагентами, полученными из APV, в частности реагентами, полученными из APV-C; здесь в подробном описании, например, показано, что достаточно надежный серологический диагноз инфицирования MPV у млекопитающих можно выполнять с применением ELISA, конкретно предназначенного для обнаружения антител APV у птиц. Особенно применимым для данной цели тестом является тест ELISA, предназначенный для определения антител APV (например, в сыворотке или яичном желтке), коммерчески доступная версия которого известна как APV-AbSweden. Обратная ситуация также может иметь место: именно это здесь представлено, например, для проведения вирусологической и/или серологической диагностики инфекций APV у млекопитающих реагентами, полученными из MPV; здесь, в подробном описании, например, показано, что достаточно надежный серологический диагноз инфекций APV у птиц можно выполнять с применением ELISA, предназначенного для обнаружения антител MPV. Принимая во внимание, что антигены и антитела обладают связью типа ключ-замок, обнаружение различных антигенов можно выполнять посредством выбора подходящего антитела, обладающего существенной перекрестной реактивностью. Конечно, для уверенности в такой перекрестной реактивности, лучше всего выбирать реагенты (такие как антигены или антитела), руководствуясь гомологиями аминокислот, существующими у различных (глико)протеинов различных вирусов, из-за чего реагенты, связывающие большинство гомологичных белков, будут наиболее применимы в тестах, зависящих от указанной перекрестной реактивности. Для детекции нуклеиновой кислоты даже проще, вместо подбора праймеров или зондов, основанных на гетерологичных нуклеотидных последовательностях различных вирусов, что, таким образом, позволяет выявить отличия между вирусами Metapneumovirus, характерными для млекопитающих и птиц,подбирать или выбирать праймеры или зонды, основанные на тех участках нуклеотидных последовательностей, специфичных для вируса, в которых показана высокая степень гомологии. В общем, для нуклеотидных последовательностей, гомология 90% или выше гарантирует достаточную перекрестную реактивность, чтобы быть уверенным в диагностических тестах, применяющих жесткие условия гибридизации. Изобретение, например, относится к способу для вирусологической диагностики инфекции MPV животных, конкретно млекопитающих, еще конкретнее человека, включающему определение в образцах от указанных животных присутствия вирусного изолята или его компонентов посредством реакции указанного образца с MPV-специфичной нуклеиновой кислотой или с антителом по изобретению, и к способу серологической диагностики инфекции MPV млекопитающих, включающему определение в образцах от указанных животных присутствия антитела, специфически направленного против MPV или его компонента, посредством реакции указанного образца со специфичной для MPV белковой молекулой или ее фрагментом или антигеном по изобретению. Также изобретение относится к диагностическому набору для диагностики инфекции MPV, включающему MPV, специфичную для MPV нуклеиновую кислоту, белковую молекулу или ее фрагмент, антиген и/или антитело по изобретению, и, предпочтительно, средство для детекции указанного MPV, специфичной для MPV нуклеиновой кислоты, белковой молекулы или ее фрагмента, антигена и/или антитела, указанное средство, например, включает легко воз-2 006879 будимую группу, такую как флуорофор или систему ферментной детекции, применяющуюся в данной области (примеры подходящего диагностического набора включают IF, ELISA, анализ нейтрализации,анализ RT-PCR). Для определения того, можно ли пока еще неидентифицированный вирусный компонент или его синтетический аналог, такой как нуклеиновая кислота, белковая молекула или их фрагмент,идентифицировать как специфичные для MPV, достаточно проанализировать указанную нуклеотидную или аминокислотную последовательность, предпочтительно по меньшей мере из 10, более предпочтительно по меньшей мере из 25, более предпочтительно из 40 нуклеотидов или аминокислот (соответственно), путем сравнения гомологии последовательности с известными последовательностями MPV или с известными последовательностями не-MPV (предпочтительно использовать последовательности APV-C) с применением, например, филогенетического анализа, как представлено здесь. Компонент или его синтетический аналог можно идентифицировать в зависимости от степени родства с указанными последовательностями MPV или не-MPV. Изобретение также относится к способу для вирусологической диагностики инфекции MPV у млекопитающего, включающий определение присутствия вирусного изолята или его компонента в образце от указанного млекопитающего посредством взаимодействия указанного образца с перекрестно реагирующей нуклеиновой кислотой, полученной из APV (предпочтительно серотип С), или с перекрестно реагирующим антителом, реактивным в отношении указанного APV, и к способу серологической диагностики инфекции MPV у млекопитающего, включающему определение в образце от указанного млекопитающего присутствия перекрестно реагирующего антитела, также направленного против APV или его компонента, посредством взаимодействия указанного образца с белковой молекулой, или ее фрагментом или антигеном, полученным из APV. Более того, изобретение относится к применению диагностического набора, изначально предназначенного для детекции APV или антител к APV, для диагностики инфекцииMPV, конкретно для детекции указанной инфекции MPV у людей. Изобретение также относится к способу для вирусологической диагностики инфекции APV у птицы, включающему определение присутствия вирусного изолята или его компонента в образце от указанной птицы посредством взаимодействия указанного образца с перекрестно реагирующей нуклеиновой кислотой, полученной из MPV или с перекрестно реагирующим антителом, реактивным в отношении указанного MPV, и способу серологической диагностики инфекции APV у птицы, включающему определение в образце от указанной птицы присутствия перекрестно реагирующего антитела, также направленного против MPV или его компонента, посредством взаимодействия указанного образца с белковой молекулой, или ее фрагментом, или антигеном, полученным из MPV. Более того, изобретение относится к применению диагностического набора, изначально предназначенного для детекции MPV или антител кMPV, для диагностики инфекции APV, конкретно для детекции указанной инфекции APV у домашней птицы, такой как курица, утка или индейка. Как указано, при лечении подобное применение можно проводить из-за обнаруженной перекрестной реактивности, в частности, когда обстоятельства делают применение более гомологичного подхода менее простым. Например, препаратами вакцин, полученных из изолятов APV (предпочтительно серотип С), можно проводить неотложные вакцинации, такие как экстренные вакцинации против инфекций MPV,когда более гомологичная вакцина против MPV недоступна и, наоборот, можно рассмотреть вакцинации против инфекций APV препаратами вакцин, полученных из MPV. Также способы обратной генетики делают возможным создание химерных вирусных конструкций APV-MPV, пригодных как вакцина, достаточно отличающаяся от полевых изолятов каждого из соответствующих штаммов, подлежащая аттенуации до требуемого уровня. Подобные способы обратной генетики также сделают возможным получение химерных парамиксовирусных-метапневмовирусных конструкций, таких как RSV-MPV или PI3MPV, для применения в препаратах вакцин. Такие конструкции особенно применимы в качестве сочетанной вакцины для борьбы с заболеваниями дыхательных путей. Таким образом, изобретение относится к новому этиологическому возбудителю, изолированному РНК-содержащему вирусу с однонитевой антисмысловой РНК, существенно характерному для млекопитающих (также обозначаемый здесь как MPV), принадлежащему к подсемейству Pneumovirinae семейства Paramyxoviridae, но не идентифицируемому как классический пневмовирус, и принадлежащему к родуMetapneumovirus, и специфичным для MPV компонентам или их синтетическим аналогам. До настоящего времени не найдены вирусы млекопитающих, подобные метапневмовирусам, например, метапневмовирусы, выделяемые из млекопитающих, по существу, выступающих в качестве природных хозяев для указанного вируса, или вызывающие заболевание указанных млекопитающих. Метапневмовирусы, в общем, рассматриваемые как, по существу, ограниченные домашней птицей в качестве природного хозяина или как этиологический возбудитель их заболеваний, также известны как пневмовирусы птиц. В последнее время описан изолят APV уток (FR 2801607), дополнительно демонстрирующий, что инфекции APV существенно ограничены птицами в качестве природных хозяев. Изобретение относится к изолированному пневмовирусу млекопитающих (также называемому здесь MPV), с порядком генов и аминокислотной последовательностью, отличающимися от порядка генов рода Pneumovirus и близкородственному с родом Metapneumovirus подсемейства Pneumovirinae семейства Paramyxoviridae, а, принимая во внимание их филогенетическое родство, возможно принадле-3 006879 жащему к нему. Хотя до сих пор метапневмовирусы изолировали только из птиц, в настоящее время показано, что родственные, хотя и отличные по своей природе, вирусы можно идентифицировать в других видах животных, таких как млекопитающие. Авторы настоящего изобретения демонстрируют повторное выделение MPV у людей, несмотря на то, что таких сообщений для APV не существует. Более того, в отличие от APV, MPV, по существу, или совсем не реплицируется у кур и индеек, или реплицируется плохо, тогда как легко это делает у макаков-крабоедов. Сообщений о репликации APV у млекопитающих не обнаружено. Кроме того, тогда как специфичные антисыворотки, активированные против MPV, нейтрализуют MPV, антисыворотки, активированные против APV А, В или С, не нейтрализуют MPV в той же самой степени, и данное отсутствие полной перекрестной реактивности представляет другое доказательство того, что MPV является особым метапневмовирусом. Более того, там, где APV и MPV обладают одинаковым порядком генов, белки G и белки SH MPV существенно отличаются от таковых, известных для APV, по причине того, что для них не показано значимой гомологии последовательности ни на уровне аминокислот, ни на уровне нуклеиновой кислоты. Диагностические анализы для различения изолятовAPV и MPV, или антител, направленных против данных различных вирусов, можно разработать, преимущественно взяв за основу один или оба данных белка (примерами являются IF, ELISA, анализ нейтрализации, анализ RT-PCR). Однако для различения APV и MPV можно также применять информацию о последовательности и/или антигенах, полученную из более родственных белков MPV N, Р, М, F и L, и анализы гомологии последовательности соответствующих белков APV. Например, филогенетические анализы информации о последовательности, полученной для MPV, выявили, что MPV и APV являются двумя различными вирусами. В частности, филогенетическое дерево демонстрирует, что APV и MPV являются двумя различными вирусными родами. Авторы настоящего изобретения также показали, чтоMPV циркулирует в популяции людей по меньшей мере 50 лет, поэтому межвидовой перенос, вероятно,произошел по меньшей мере 50 лет назад и не является повседневным явлением. Возможно из-за того,что СРЕ у MPV фактически неразличим от СРЕ, вызванного hRSV или hPIV-1 в tMK или других клеточных культурах, MPV до сих пор удавалось уходить незамеченным. tMK (третичные клетки почки обезьяны, т.е. клетки МК на третьем пассаже в клеточной культуре) предпочтительно применяют ввиду их малой стоимости в сравнении с первичными или вторичными культурами. СРЕ, также как и для классических Paramyxoviridae, характеризуется образованием синцития, после чего клетки демонстрировали быстрое внутреннее разрушение с последующим их отделением от монослоя. Обычно (но не всегда) СРЕ обнаруживали в клетках после трех пассажей вируса из оригинального материала с 10 по 14 сутки после инокуляции, немного позднее, чем СРЕ, вызванный другими вирусами, такими как hRSV или hPIV-1. Традиционно, как разрушительные возбудители заболевания, парамиксовирусы каждый год служат причиной множества летальных исходов у животных и людей во всем мире. Paramyxoviridae формируют семейство в порядке Mononegavirales (РНК-содержащие вирусы с однонитевой антисмысловой РНК),состоящее из подсемейств Paramyxovirinae и Pneumovirinae. Последнее подсемейство в настоящее время таксономически подразделяют на рода Pneumovirus и Metapneumovirus1. Респираторно-синцитиальный вирус человека (hRSV), типовой вид рода Pneumovirus, является единственной наиболее важной причиной инфекций нижних дыхательных путей в младенчестве или раннем детстве в мире 2. Другие представители рода Pneumovirus включают бычий и овечий респираторно-синцитиальные вирусы и вирус пневмонии мышей (PVM). Пневмовирус птиц (APV), также известный как вирус ринотрахеита индеек (TRTV), этиологический возбудитель ринотрахеита птиц, инфекции верхних дыхательных путей индеек 3, является единственным представителем недавно описанного рода Metapneumovirus, который, как указано выше, до сих пор не ассоциирован с инфекциями, или, самое главное, с заболеванием млекопитающих. Серологические подгруппы APV можно дифференцировать на основании нуклеотидных или аминокислотных последовательностей гликопротеина G и анализ нейтрализации с использованием моноклональных антител, которые также распознают гликопротеин G. В подгруппах А, В и D идентичность аминокислотной последовательности белков G в пределах подгрупп составляет от 98,5% до 99,7%, тогда как идентичность аминокислот между подгруппами наблюдали в пределах 31,2-38%. См., например, Collins, M.S.,Gough, R.E. and Alexander, D.J., Antigenic differentiation of avian pneumovirus isolates using polyclonal antisera and mouse monoclonal antibodies. Avian Pathology, 1993. 22: p. 469-479.; Cook, J.K.A., Jones, B.V., Ellis,M.M., Antigenic differentiation of strains of turkey rhinotracheitis virus using monoclonal antibodies. AvianBayon-Auboyer, M.H., et al., Comparison of F-, G- and N-based RT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitis virus. Arch Virol, 1999. 144 (6): p. 1091109; Juhasz, K. and A.J. Easton, Extensive sequence variation in the attachment (G) protein gene of avian pneumovirus: evidence for two distinct subgroups. J Gen Virol, 1994. 75 (Pt 11): p. 2873-80. Дополнительный серотип APV представлен в WO0020600, в котором описан изолят APV Colorado и сравнен с известными штаммами APV или TRT посредством тестов нейтрализации сыворотки in vitro.-4 006879 Сначала изолят Colorado тестировали по отношению к моноспецифичным поликлональным антисывороткам для распознавания изолятов TRT. Моноспецифичные поликлональные антисыворотки к любому из изолятов TRT не нейтрализовали изолят Colorado. Однако его нейтрализовала гипериммунная антисыворотка, активированная против штамма подгруппы А. Данная антисыворотка нейтрализовала гомологичный вирус при титре 1:400, а изолят Colorado - при титре 1:80. Далее, с применением указанного выше способа, изолят Colorado тестировали по отношению к моноклональным антителам к TRT. В каждом случае, титр обратной нейтрализации составил 10. Моноспецифичную антисыворотку, активированную против изолята Colorado, также тестировали по отношению к штаммам TRT обеих подгрупп. Антисыворотка к изоляту Colorado не нейтрализовала ни один из штаммов TRT. Штамм APV Colorado не защищал цыплят SPF от заражения штаммами вируса TRT любой из подгрупп А или В. Данный результат означает, что изолят Colorado может быть первым примером дальнейшего серотипирования пневмовируса птиц, что также предлагали Bayon-Auboyer et al. (J. Gen. Vir. 81:2723-2733 (2000. В предпочтительном осуществлении, изобретение относится к изолированному MPV, таксономически соответствующему метапневмовирусу (неизвестного в настоящее время млекопитающего), с порядком генов, отличающимся от последовательности генов у пневмовирусов подсемейства Pneumovirinae семейства Paramyxoviridae. Классификация двух родов первоначально основывается на совокупности их генов: у метапневмовирусов, как правило, отсутствуют неструктурные белки, такие как NS1 или NS2 (см. также Randhawa et al., J. Vir. 71:9849-9854 (1997 и порядок генов отличается от порядка генов у пневмовирусов (RSV: '3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5', APV:'3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')4,5,6. Посредством анализа ЕМ обнаружено, что представленный по настоящему изобретению MPV или таксономически соответствующие ему изоляты представляют собой частицы, подобные парамиксовирусам. По классификации MPV, филогенетически или таксономически соответствующие ему вирусные изоляты чувствительны к обработке хлороформом, оптимально культивируются в клетках tMK или функционально эквивалентных им клетках, и существенно зависят от трипсина в большинстве клеточных культур. Более того, типичный СРЕ или отсутствие гемагглютинирующей активности в отношении большинства традиционно использующихся красных клеток крови означает, что так, как представлено здесь, вирус, хотя и отдаленно, родственен с классическими пневмовирусами, такими как RSV. Хотя большинство парамиксовирусов обладает гемагглютинирующей активностью, у большинства пневмовирусов она отсутствует 13. MPV по изобретению также содержит вторую перекрывающую ORF (M2-2) во фрагменте нуклеиновой кислоты, кодирующем белок М 2, как, в общем, в большинстве других пневмовирусов, например, как показано у Ahmadian et al., J. Gen. Vir. 80:2011-2016 (1999). Для обнаружения дополнительных вирусных изолятов, представленных по настоящему изобретению, достаточно проверить образец, необязательно полученный от больного животного или человека, на предмет присутствия вируса подсемейства Pneumovirinae, и проверить полученный таким образом вирус на предмет присутствия генов, кодирующих (функциональные) NS1 или NS2, или, по существу, показать порядок генов, отличный от порядка генов пневмовирусов, таких как RSV, как уже обсуждалось выше. Более того, вирусные изоляты, филогенетически и, таким образом, таксономически соответствующиеMPV, можно обнаружить посредством экспериментов по перекрестной гибридизации с использованием нуклеиновой кислоты из изолята MPV, как представлено здесь, или в традиционных перекрестных серологических экспериментах с использованием моноклональных антител, специфически направленных против изолятов MPV, и/или антигенов, и/или иммуногенов, конкретно полученных из них. Вновь выделенные вирусы филогенетически и, таким образом, таксономически соответствуют MPV тогда, когда содержат порядок генов и/или аминокислотную последовательность, достаточно сходную с изолятом(и)-прототипом(ами) MPV авторов настоящего изобретения, или структурно ему(им) соответствует(ют) и когда показано близкое родство с родом Metapneumovirus подсемейства Pneumovirinae. Как можно заключить из сравнения представленных на фиг. 6 последовательностей с последовательностями других вирусов, в частности APV-C, наибольшая гомология аминокислотной последовательности MPV с любым из других известных в настоящее время вирусов этого же семейства (APV подтип С) и определение структурного соответствия на уровне отдельного белка представляет собой 87% для белка матрикса,88% для нуклеопротеина, 68% для фосфопротеина, 81% для белка слияния и 56-64% для частей белка полимеразы. Отдельные белки или целые вирусные изоляты с соответственно большей гомологией, чем упомянутые данные максимальные значения, рассматривают как филогенетически и, таким образом, таксономически соответствующие MPV и содержащие нуклеотидную последовательность, структурно соответствующую последовательности, показанной на фиг. 6. Таким образом, настоящее изобретение относится к вирусу, филогенетически соответствующему депонированному вирусу. Нужно заметить, что,подобно другим вирусам, между различными изолятами изолированного РНК-содержащего вируса с однонитевой антисмысловой РНК, существенно характерного для млекопитающих, как представлено здесь,обнаружена определенная степень изменчивости. На филогенетических деревьях авторы настоящего изобретения идентифицировали по меньшей мере 2 генетических кластера вирусных изолятов, основываясь на анализах сравнения последовательности частей генов L, М, N и F. Основываясь на отличиях в нуклеотидном и аминокислотном составе вирусных нуклеотидных и аминокислотных последовательно-5 006879 стей (вирусные последовательности) и по аналогии с другими пневмовирусами, такими как RSV, данные генотипы MPV представляют собой подтипы MPV. В пределах каждого из генетических кластеров изолятов MPV на уровне нуклеотидов обнаружили степень идентичности в размере 94-100% для L, 91-100% для М, 90-100% для N и 93-100% для F, а на уровне аминокислот обнаружили степень идентичности в размере 91-100% для L, 98-100% для М, 96-100% для N и 98-100% для F. Дополнительное сравнение можно найти на фиг. 18 по 28. Минимальная степень идентичности на уровне нуклеотидов для целой группы изолированного РНК-содержащего вируса с однонитевой антисмысловой РНК, существенно характерного для млекопитающих, как представлено здесь (изоляты MPV) установленная до настоящего времени, составила 81% для L и М, 83% для N и 82% для F. На уровне аминокислот данный процент составил 91 для L и N, 94 для М и 95 для F. Для вирусной последовательности изолята MPV или отдельного гена F у MPV, как представлено здесь, например, показана идентичность с соответствующей нуклеотидной или аминокислотной последовательностью гена слияния (F) уAPV-C менее чем 81% последовательности нуклеотидов или менее чем 82% аминокислотной последовательности, например, как представлено у Seal et al., Vir. Res. 66:139-147 (2000). Также, для вирусной последовательности изолята MPV или отдельного гена L у MPV, как представлено здесь, например, показана идентичность с соответствующей нуклеотидной или аминокислотной последовательностью гена полимеразы у APV-A менее чем 61% нуклеотидной последовательности или менее чем 63% аминокислотной последовательности, например, как представлено у Randhawa et al., J.Gen. Vir. 77:3047-3051 (1996). Несоответствие последовательности штаммов MPV во всем мире, по аналогии с другими вирусами,может быть несколько выше. Следовательно, два возможных генетических кластера идентифицируют посредством анализов неполных нуклеотидных последовательностей ORF для N, M, F и L 9 вирусных изолятов. В пределах кластера обнаружена идентичность нуклеотидов в размере 90-100%, а между кластерами идентичность составила 81-88%. Информация о последовательности, полученная на большом количестве изолятов, подтвердила существование двух генотипов. Вирусный изолят ned/00/01 как прототип кластера А и вирусный изолят ned/99/01 как прототип кластера В использовали в анализах перекрестной нейтрализации для проверки возможной связи генотипов с различными серотипами или подгруппами. Из данных фактов авторы настоящего изобретения заключили, что вирусные изоляты, существенно характерные для млекопитающих, для которых процент гомологии аминокислот с изолятом I-2614 является более высоким, чем 64 для L, 87 для М, 88 для N, 68 для Р, 81 для F, 84 для М 2-1 или 58 для М 22, можно классифицировать как изолированный РНК-содержащий вирус с однонитевой антисмысловой РНК, существенно характерный для млекопитающих, как представлено здесь. В частности, такие вирусные изоляты, которые, в общем, на уровне нуклеотидной последовательности обладают минимальной степенью идентичности с изолятом-прототипом MPV, как представлено здесь, в размере 81% для L и М,83% для N и/или 82% для F, являются представителями группы изолятов MPV, как представлено здесь. На уровне аминокислот, данный процент составляет 91 для L и N, 94 для М и/или 95 для F. Когда процент гомологии аминокислотной последовательности для данного вирусного изолята выше, чем 90 для L и N, 93 для М или 94 для F, вирусный изолят является похожим на группу изолятов MPV, изображенную на фиг. 5. Когда процент гомологии аминокислотной последовательности для данного вирусного изолята выше, чем 94 для L, 95 для N или 97 для М и F, вирусный изолят можно идентифицировать как принадлежащий к одному из кластеров генотипов, представленных на фиг. 5. Необходимо заметить, что данные проценты гомологии, с помощью которых определены генетические кластеры, похожи на степень гомологии, обнаруженную у генетических кластеров соответствующих генов RSV. Вкратце, изобретение относится к изолированному РНК-содержащему вирусу с однонитевой антисмысловой РНК, существенно характерному для млекопитающих (MPV), принадлежащему к подсемейству Pneumovirinae семейства Paramyxoviridae и определяемому как филогенетически соответствующий роду Metapneumovirus, посредством определения нуклеотидной последовательности подходящего фрагмента генома указанного вируса и проверки ее посредством анализов филогенетического дерева, где строят деревья максимального правдоподобия с применением 100 условий инициализации и 3 перестановок, и находя ее более тесно филогенетически соответствующей вирусному изоляту, депонированному в CNCM, Paris как I-2614, чем соответствующей вирусному изоляту пневмовируса птиц (APV), также известному как вирус ринотрахеита индеек (TRTV), этиологическому возбудителю ринотрахеита птиц. Подходящими для таких анализов филогенетического дерева фрагментами нуклеиновой кислоты генома, ведущими к различным анализам филогенетического дерева, как показано здесь на фиг. 4 или 5,являются, например, любой из фрагментов 1-10 RAP-PCR, как показано здесь в подробном описании. Анализы филогенетического дерева генов нуклеопротеина (N), фосфопротеина (Р), матриксного белка(М) и белка слияния (F) MPV выявили наибольшую степень гомологии последовательности с серотипом С APV, пневмовируса птиц, впервые обнаруженного у птиц в Соединенных Штатах. В предпочтительном осуществлении, изобретение относится к изолированному РНК-содержащему вирусу с однонитевой антисмысловой РНК, существенно характерному для млекопитающих (MPV), принадлежащему к подсемейству Pneumovirinae семейства Paramyxoviridae и определяемому как филогенетически соответствующий роду Metapneumovirus, посредством определения нуклеотидной последова-6 006879 тельности подходящего фрагмента генома указанного вируса и проверки ее посредством анализов филогенетического дерева, где строят деревья максимального правдоподобия с применением 100 условий инициализации и 3 перестановок, и находя ее более тесно филогенетически соответствующей вирусному изоляту, депонированному в CNCM, Paris как I-2614, чем соответствующей вирусному изоляту пневмовируса птиц (APV), также известному как вирус ринотрахеита индеек (TRTV), этиологическому возбудителю ринотрахеита птиц, где указанный подходящий фрагмент содержит открытую рамку считывания,кодирующую вирусный белок указанного вируса. Подходящая открытая рамка считывания (ORF) содержит ORF, кодирующую белок N. Когда обнаруженная общая идентичность аминокислот анализируемого белка N с белком N изолята I-2614 составляет, по меньшей мере, 91%, предпочтительно по меньшей мере 95%, анализируемый вирусный изолят включает предпочтительный изолят MPV по изобретению. Как показано, первый ген на геномной картеMPV кодирует белок из 394 аминокислот (аа) и обнаруживает большую гомологию с белком N других пневмовирусов. Длина ORF у N идентична длине ORF у N APV-C (табл. 5) и меньше, чем у других парамиксовирусов (Barr et al., 1991). Анализ аминокислотной последовательности выявил высочайшую гомологию с APV-C (88%) и только 7-11% с другими парамиксовирусами (табл. 6).Mononegavirales: А, В и С (фиг. 8). Хотя сходство наиболее высоко в пределах вирусного семейства, в различных семействах вирусов данные области являются высоко консервативными. Во всех трех областных MPV выявлена идентичность аминокислотной последовательности в размере 97% с APV-C, 89% - сAPV-B, 92% - с APV-A и 66-73% - с RSV и PVM. Область между аминокислотными остатками 160 и 340 оказывается высоко консервативной у метапневмовирусов и, несколько в меньшей степени, у Pneumovirinae (Miyahara et al., 1992; Li et al., 1996; Barr et al., 1991). Данная конкретная область, обнаруживающая 99% сходства с APV-C, находится в согласии с тем, что MPV является метапневмовирусом. Другая подходящая рамка считывания (ORF), пригодная для филогенетических анализов, содержитORF, кодирующую белок Р. Когда обнаруженная общая идентичность аминокислот анализируемого белка Р с белком Р изолята I-2614 составляет по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере,85%, анализируемый вирусный изолят включает предпочтительный изолят MPV по изобретению. ВтораяORF на геномной карте кодирует белок из 294 аминокислот, который обладает гомологией аминокислотной последовательности с белком Р APV-C в размере 68%, а с белком Р RSV - только 22-26% (табл. 6). Ген Р MPV содержит одну основную ORF и в данном отношении подобен Р многих других парамиксовирусов (Рассмотрено у Lamb and Kolakofsky, 1996; Sedlmeier et al., 1998). В отличие от APV А, В иLing (1995) предположил, что область высокого сходства всех пневмовирусов (аминокислотные остатки 185-241) играет роль или в процессе синтеза РНК, или в поддержании структурной целостности нуклеокапсидного комплекса. Данная область высокого сходства, также обнаруженная у MPV (фиг. 9),особенно когда в расчет берут консервативные замены, показывает 100% сходство с APV-C, 93% с APVA и В и примерно 81% с RSV. С-конец белка Р у MPV богат остатками глутамата, как описано для APVC (Ling et al., 1995). Другая подходящая рамка считывания (ORF), пригодная для филогенетических анализов, содержитORF, кодирующую белок М. Когда обнаруженная общая идентичность аминокислот анализируемого белка М с белком М изолята I-2614 составляет по меньшей мере 94%, предпочтительно, по меньшей мере, 97%, анализируемый вирусный изолят включает предпочтительный изолят MPV по изобретению. Третья ORF генома MPV кодирует белок из 254 аминокислот, и похожа на ORF для М других пневмовирусов. ORF для М у MPV обладает точно таким же размером, что и ORF для М других метапневмовирусов (табл. 5), и показывает высокую гомологию аминокислотной последовательности с матриксным белком APV (76-87%), меньшую гомологию с матриксным белком RSV и PVM (37-38%) и 10% или меньшую гомологию с матриксным белком других парамиксовирусов (таблица 6). Easton (1997) сравнил последовательности матриксных белков всех пневмовирусов и обнаружил консервативный гексапептид от остатка 14 до остатка 19, который также консервативен и в MPV (фигура 10). Для RSV, PVM и APV идентифицированы малые вторичные ORF в пределах главной ORF для М или перекрывающиеся с нею(52 аминокислоты и 51 аминокислота у bRSV, 75 аминокислот у RSV, 46 аминокислот у PVM и 51 аминокислота у APV) (Yu et al., 1992; Easton et al., 1997; Samal et al., 1991; Satake et al., 1984). Авторы настоящего изобретения отметили две малые ORF в ORF для М у MPV. Одну малую ORF из 54 аминокислотных остатков обнаружили в пределах главной ORF для М, начиная от 2281 нуклеотида, а другую малую ORF из 33 аминокислотных остатков, перекрывающуюся с главной ORF для М, обнаружили, начиная с нуклеотида 2893 (данные не показаны). Подобно вторичным ORF у RSV и APV, значимой гомологии данных вторичных ORF и ORF других пневмовирусов не обнаружено, а видимые сигналы инициации или терминации отсутствуют. Кроме того, доказательства синтеза белков, соответствующих данным вторичным ORF у APV и RSV, отсутствуют. Другая подходящая рамка считывания (ORF), пригодная для филогенетических анализов, содержитORF, кодирующую белок F. Когда обнаруженная общая идентичность аминокислот анализируемого белка F с белком F изолята I-2614 составляет по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере-7 006879 97%, анализируемый вирусный изолят включает предпочтительный изолят MPV по изобретению. ORF для F у MPV расположена в непосредственной близости от ORF для М, что характерно для представителей рода Metapneumovirus. Ген F у MPV кодирует белок из 539 аминокислот, который на два аминокислотных остатка больше, чем F у APV-C (табл. 5). Анализ аминокислотной последовательности показал 81% гомологии с APV-C, 67% с APV-A и В, 33-39% с белками F пневмовирусов и только 10-18% с другими парамиксовирусами (табл. 6). Одним из консервативных признаков у белков F парамиксовирусов,который также наблюдали у MPV, является расположение цистеиновых остатков (Morrison, 1988; Yu etal., 1991). Метапневмовирусы обладают 12 остатками цистеина в F1 (7 являются консервативными у всех парамиксовирусов) и двумя в F2 (1 является консервативным у всех парамиксовирусов). Из 3 возможных участков N-связанного гликозилирования, представленных в ORF для F у MPV, ни один не является общим с RSV и два (позиции 66 и 389) являются общими с APV. Третий, уникальный, участок возможногоN-связанного гликозилирования для MPV расположен в позиции 206 (фиг. 11). Несмотря на низкую гомологию последовательности с другими парамиксовирусами, белок F MPV обнаруживает типичные характеристики белка слияния, согласующиеся с характеристиками, описанными для белков F других представителей семейства Paramyxoviridae (Morrison, 1988). Белки F представителей Paramyxoviridae синтезируются в виде неактивных предшественников (FO), расщепляемых посредством протеаз клеткихозяина, образующих N-концевые субъединицы F2 и большие С-концевые субъединицы F1. Предполагаемый участок расщепления (Collins et al., 1996) консервативен у всех представителей семейства Paramyxoviridae. Участок расщепления у MPV содержит остатки RQSR. Оба аргининовых (R) остатка являются общими с APV и RSV, но глутаминовый (Q) и сериновый (S) остатки являются общими с другими парамиксовирусами, такими как вирус парагриппа человека типа I, вирус Сендай и морбилливирусы(данные не показаны). Полагают, что N-концевая гидрофобная область F1 функционирует как мембранный домен слияния и показывает высокое сходство последовательности у парамиксовирусов и морбилливирусов и, в меньшей степени, у пневмовирусов (Morrison, 1988). Данные 26 остатков (позиции 137163, фиг. 11) консервативны у MPV и APV-C, что согласуется с тем, что данная область является высоко консервативной у метапневмовирусов (Naylor et al., 1998; Seal et al., 2000). Как видно для субъединиц F2 у APV и других парамиксовирусов, MPV обнаруживает делецию 22 аминокислотных остатков в сравнении с RSV (позиции 107-128, фигура 11). Более того, для RSV и APV обнаружено, что сигнальный пептид и якорный домен являются консервативными в пределах подтипов и высоко вариабельны между подтипами (Plows et al., 1995; Naylor et al., 1998) . Сигнальный пептид MPV(аминокислоты 10-35, фигура 11) на N-конце F2 демонстрирует некоторое сходство с последовательностью APV-C (18 из 2 6 аминокислотных остатков являются сходными) и меньшую консервативность с другими видами APV или RSV. Гораздо большую вариабельность наблюдают в мембранном якорном домене на карбоксильном конце F1, хотя некоторая гомология с APV-C еще видна. Другая подходящая открытая рамка считывания (ORF), пригодная для филогенетических анализов,содержит ORF, кодирующую белок М 2. Когда обнаруженная общая идентичность аминокислот анализируемого белка М 2 с белком М 2 изолята I-2614 составляет, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, анализируемый вирусный изолят включает предпочтительный изолят MPV по изобретению. Ген М 2 уникален для Pneumovirinae, а для всех пневмовирусов наблюдали две перекрывающиеся ORF. Первая главная ORF соответствует белку М 2-1, который усиливает процессивность вирусной полимеразы (Collins et al., 1995; Collins, 1996) и прохождение ею межгенных областей (Hardy etal., 1998; Fearns et al., 1999). Ген М 2-1 у MPV, расположенный рядом с геном F, кодирует белок из 187 аминокислот (табл. 5), и обнаруживает наивысшую (84%) гомологию с М 2-1 у APV-C (табл. 6). Сравнение всех пневмовирусных белков М 2-1 выявило наибольшую консервативность N-концевых частей белка (Collins et al., 1990; Zamora et al., 1992; Ahmadian et al., 1999), что согласуется с наблюдением, чтоMPV обнаруживает 100% сходство с APV-C первых 80 аминокислотных остатков белка (фиг. 12 А). Белок М 2-1 у MPV содержит 3 цистеиновых остатка, расположенных в пределах первых 30 аминокислотных остатков, что является консервативным у всех пневмовирусов. Такая концентрация цистеиновых остатков часто обнаруживается у связывающих цинк белков (Ahmadian et al., 1991; Cuesta et al., 2000). Вторичные ORF (M2-2), перекрывающиеся с М 2-1 ORF пневмовирусов, являются консервативными по расположению, но не по последовательности, и, как считается, вовлечены в контроль переключения между репликацией вирусной РНК и транскрипцией (Collins et al., 1985; Elango et al., 1985; Baybutt et al.,1987; Collins et al. , 1990; Ling et al., 1992; Zamora et al. , 1992; Alansari et al., 1994; Ahmadian et al., 1999;Bermingham et al., 1999). У MPV ORF для М 2-2 начинается с 512 нуклеотида ORF для М 2-1 (фиг. 7), что является точно такой же стартовой позицией, как у APV-C. Длины ORF для М 2-2 являются одинаковыми для APV-C и MPV и составляют 71 аминокислотный остаток (табл. 5). Сравнение последовательностиORF для М 2-2 (фиг. 12 В) выявило 56% гомологию аминокислотных последовательностей у MPV и APVC и только 26-27% гомологию аминокислотных последовательностей у MPV и APV-A и В (табл. 6). Другая подходящая открытая рамка считывания (ORF), пригодная для филогенетических анализов,содержит ORF, кодирующую белок L. Когда обнаруженная общая идентичность аминокислот анализируемого белка L с белком L изолята I-2614 составляет по меньшей мере 91%, предпочтительно по меньшей мере 95%, анализируемый вирусный изолят включает предпочтительный изолят MPV по изобрете-8 006879 нию. Аналогично другим вирусам с "минус"-цепью, последняя ORF генома MPV является компонентом РНК-зависимой РНК полимеразы комплексов репликации и транскрипции. Ген L у MPV кодирует белок из 2005 аминокислот, который на 1 остаток больше, чем данный белок у APV-A (табл. 5). Белок L у MPV проявляет гомологию по последовательности в размере 64% с APV-A, 42-44% - с RSV и приблизительно 13% с другими парамиксовирусами (табл. 6). Poch et al. (1989; 1990) идентифицировали шесть консервативных доменов в белках L несегментированных РНК-вирусов с "минус"-цепью, из которых домен III включает четыре мотива ядра полимеразы, которые, как считается, являются основными для функционирования полимеразы. Данные мотивы (А, В, С и D) являются в высокой степени консервативным в белкеL у MPV: по мотивам А, В и С: MPV обладает 100% сходством со всеми пневмовирусами, а по мотиву DMPV обладает 100% сходством с APV и 92% - с RSV. Для целого домена III (аминокислоты 625-847 в(Stec, 1991). Подобно APV, ORF для L у MPV содержит мотив, в котором размещение промежуточных остатков сдвинуто на один: K(X)22GEGAGN(X)19K. Более предпочтительная подходящая открытая рамка считывания (ORF), пригодная для филогенетических анализов, содержит ORF, кодирующую белок SH. Когда обнаруженная общая идентичность аминокислот анализируемого белка SH с белком SH изолята I-2614 составляет по меньшей мере 30%,предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, анализируемый вирусный изолят включает предпочтительный изолят MPV по изобретению. Данный ген, располагающийся рядом с М 2 у MPV, кодирует белок из 183 аминокислот (фиг. 7). Анализ нуклеотидной последовательности и выведенной из нее аминокислотной последовательности не выявил заметной гомологии с другими генами или продуктами генов РНК-содержащих вирусов. ORF для SH у MPV является длиннейшей ORF для SH, известной до настоящего времени (табл. 5). Состав аминокислотных остатков ORF для SH относительно схож с составом аминокислотных остатков APV, RSV и PVM с высоким процентом треонина и серина (22%, 18%, 19%, 20,0%, 21% и 28% содержания серина/треонина у MPV, APV, RSV A,RSV В, bRSV and PVM, соответственно). ORF для SH у MPV содержит 10 цистеиновых остатков, тогда как SH у APV содержит 16 цистеиновых остатков. Все пневмовирусы обладают схожими количествами участков возможного N-связанного гликозилирования (у MPV - 2, у APV - 1, у RSV - 2, у bRSV - 3, уPVM - 4). Профили гидрофобности белков SH у MPV, APV и RSV обнаружили одинаковые структурные особенности (фиг. 13 В). ORF для SH у APV и у MPV обладают гидрофильным N-концом (аминокислоты 130), центральным гидрофобным доменом (аминокислоты 30-53), который может служить в качестве возможного трансмембранного домена, вторым гидрофобным доменом вокруг 160 остатка и гидрофильным С-концом. Напротив, в SH у RSV обнаружено отсутствие С-концевой половины ORF у APV и MPV. У всех пневмовирусов гидрофобные домены белков SH фланкируются основными аминокислотами, которые также обнаружены в ORF для SH у MPV (аминокислоты 29 и 54). Другая более предпочтительная подходящая открытая рамка считывания (ORF), пригодная для филогенетических анализов, содержит ORF, кодирующую белок G. Когда обнаруженная общая идентичность аминокислот анализируемого белка G с белком G изолята I-2614 составляет, по меньшей мере,30%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, анализируемый вирусный изолят включает предпочтительный изолят MPV по изобретению. ORF для G у MPV расположена рядом с геном SH и кодирует белок из 236 аминокислот. Обнаруженная вторичная малаяORF, расположенная непосредственно вслед за данной ORF, потенциально кодирует 68 аминокислотных остатков (позиции 6973-7179), но у нее отсутствует стартовый кодон. Третья большая ORF, в другой рамке считывания, из 194 аминокислотных остатков (фрагмент 4, фиг. 7), перекрывается с обеими из данныхORF, но также не обладает стартовым кодоном (нуклеотиды 6416-7000). Данная большая ORF, следующая за четвертой ORF в той же самой рамке считывания (нуклеотиды 7001-7198), возможно кодирует 65 аминокислотных остатков, но снова не обладает стартовым кодоном. Наконец, в третьей рамке считывания (нуклеотиды 6444-6737, фиг. 1) обнаружена потенциальная ORF из 97 аминокислотных остатков (но не обладающая стартовым кодоном). В отличие от первой ORF, другие ORF не имеют видимых последовательностей начала или конца гена (см. ниже). Хотя 236 аминокислотных остатков ORF для G, вероятно, представляют, по меньшей мере, часть белка прикрепления MPV, нельзя исключить, что дополнительные кодирующие последовательности экспрессируются в виде отдельных белков или как часть белка прикрепления вследствие некоторого события, изменяющего РНК. Следует заметить, что у APV и RSV не идентифицировали вторичных ORF после первичной ORF для G, но и APV и RSV обладают вторичными ORF в пределах главной ORF для G. Однако доказательство экспрессии этих ORF отсутствует, и не существует гомологии расчетной аминокислотной последовательности у различных вирусов (Ling et al., 1992). Во вторичных ORF для G уMPV не обнаружили особенностей других белков G, а чтобы выяснить экспрессируются ли дополнительные ORF, нужно провести дополнительные исследования. Анализ BLAST со всеми четырьмя ORF не выявил заметной гомологии с другими известными вирусными генами или продуктами генов на уровнях-9 006879 нуклеотидов или аминокислотной последовательности. Это согласуется с низкими гомологиями последовательности, найденными для других белков G, таких как hRSV А и В (53%) (Johnson et al., 1987) иAPV А и В (38%) (Juhasz et al., 1994). Тогда как большинство ORF у MPV имеют сходство с ORF у APV как по длине, так и по последовательности, ORF для G у MPV значительно меньше, чем ORF для G у APV (табл. 5). Аминокислотная последовательность обнаруживает содержание серина и треонина в размере 34%,что даже выше, чем 32% у RSV и 24% у APV. ORF для G также содержит 8,5% пролиновых остатков, что выше, чем 8% у RSV и 7% у APV. Необычное изобилие пролиновых остатков в белках G у APV, RSV иMPV также наблюдали у гликопротеинов слизистого происхождения, где они являлись главной детерминантой третичной структуры белков (Collins et al., 1983; Wertz et al., 1985; Jentoft, 1990). Количество потенциальных участков N-связанного гликозилирования в G у MPV является сходным с другими пневмовирусами: у MPV их 5, тогда как у hRSV их 7, у bRSV - 5 и у APV - от 3 до 5. Предсказанный профиль гидрофобности G у MPV выявил особенности, сходные с другими пневмовирусами. N-концы содержат гидрофильную область, за которой следует короткая гидрофобная зона(аминокислоты 33-53) и преимущественно гидрофильный карбоксильный конец (фиг. 14 В). Такая общая организация согласуется с организацией заякоренных трансмембранных белков II типа и хорошо соответствует данным областям белков G у APV и RSV. ORF для G у MPV содержит только 1 цистеиновый остаток, в отличие от RSV и APV (5 и 20 соответственно). По классическому серологическому анализу, например, как известно из Francki, R.I.В., Fauquet,СМ., Knudson, D.L., and Brown, F., Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the internationalCommittee on Taxonomy of Viruses. Arch Virol, 1991. Supplement 2: p. 140-144, изолят MPV также идентифицируют как принадлежащий к серотипу, как представлено здесь, определенному на основании своих иммунологических отличий, что устанавливали посредством количественной нейтрализации с антисыворотками животных (полученными, например, от хорьков или морских свинок, как представлено в подробном описании). Такой серотип или перекрестно не реагировал с другими, или показывал соотношение титра гомологичного к гетерологичному 16 в обоих направлениях. Если нейтрализация выявляет некоторую степень перекрестной реакции двух вирусов в одном из двух или в обоих направлениях (соотношение титра гомологичного к гетерологичному восемь или 16), отличия серотипов принимают при наличии существенных биофизических/биохимических отличий ДНК. Если нейтрализация выявляет отчетливую перекрестную реакцию двух вирусов в одном из двух или в обоих направлениях (соотношение титра гомологичного к гетерологичному меньше, чем восемь), полагают, что изучаемые серотипы изолятов идентичны. Как указано выше, здесь представлен подходящий изолят-прототип, такой как изолят I-2614,также известный здесь как изолят MPV 00-1. Дальнейшую классификацию вируса в качестве изолированного РНК-содержащего вируса с однонитевой антисмысловой РНК, существенно характерного для млекопитающих, как представлено здесь,можно проводить на основании гомологии белков G и/или SH. В тех случаях, когда общая идентичность аминокислотной последовательности ORF для N, P, M, F, M2 и L у APV (выделенного у птиц) и у MPV(выделенного у людей) составляла от 64 до 88 процентов, а также обнаружена гомология нуклеотидных последовательностей некодирующих областей геномов APV и MPV, по существу не обнаружили видимой гомологии аминокислотной последовательности двух ORF изолята человека (MPV) и любой из ORF других парамиксовирусов. Содержание аминокислот, профили гидрофобности и расположение данныхORF в вирусном геноме показали, что они представляют аналоги белков G и SH. Гомология последовательности у APV и MPV, сходная организация их геномов (3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5'), а также филогенетический анализ представляют дополнительное доказательство для предложенной классификации MPV как первого метапневмовируса млекопитающих. Таким образом, например, новые изоляты MPV идентифицировали как таковые посредством выделения вируса из tMK или других клеток и характеристики посредством RT-PCR и/или анализа последовательности, с последующими анализами филогенетического дерева, а также посредством серологических способов, таких как анализы вирусной нейтрализации, непрямые иммунофлуоресцентные анализы, прямые иммунофлуоресцентные анализы, анализы FAC или другие иммунологические способы. Предпочтительно эти способы нацелены на аналоги белков SH и/илиG. Например, изобретение представляет здесь способ для идентификации дополнительных изолятовMPV, как представлено здесь, причем способ включает инокуляцию по существу не инфицированнымMPV или не несущим конкретный патогенный микроорганизм морским свинкам или хорькам (в подробном описании животное инокулируют интраназально, но также допустимы и другие пути инокуляции,такие, как внутримышечная или подкожная инокуляция, а также использование другого экспериментального животного) изолята-прототипа I-2614 или родственных изолятов. Сыворотки отбирают у животного на нулевые сутки, через две и три недели после инокуляции. У животного проходила специфичная сероконверсия, что измеряли посредством анализа нейтрализации вируса (VN) и непрямым IFA против соответствующего изолята I-2614, а сыворотки животного с сероконверсией применяли для иммунологического выявления указанных дополнительных изолятов.- 10006879 Как пример, изобретение относится к характеристике нового представителя семейства Paramyxoviridae, метапневмовируса человека или метапневмовирусподобного вируса (так как его окончательная таксономия ожидает дискуссии в Комитете по таксономии вирусов, здесь MPV описан, например, как таксономически соответствующий APV) (MPV), способный вызывать тяжелое заболевание дыхательных путей у людей. Клинические признаки заболевания, вызываемого MPV, такие как кашель,миалгия, рвота, лихорадка, бронхиолит или пневмония, возможный конъюнктивит или их комбинации,по существу сходны с клиническими признаками, вызываемыми hRSV. Как видно у инфицированныхhRSV детей, очень маленькие дети могут нуждаться в госпитализации. Как пример, здесь представленMPV, депонированный 19 января 2001 года как I-2614 в CNCM, Institute Pasteur, Paris или вирусный изолят, филогенетически соответствующий ему. Кроме того, изобретение относится к вирусу, содержащему нуклеиновую кислоту или функциональному фрагменту, филогенетически соответствующему последовательности нуклеиновой кислоты, показанной на фиг. 6 а, 6b, 6 с, или структурно соответствующему ей. Конкретно, изобретение относится к вирусу, характеризующемуся тем, что после его проверки посредством филогенетических анализов, при которых строят деревья максимального правдоподобия с применением 100 условий инициализации и 3 перестановок, его признали более близко филогенетически соответствующим вирусному изоляту, депонированному в CNCM, Paris как I-2614, чем соответствующим вирусному изоляту пневмовируса птиц (APV), также известному как вирус ринотрахеита индеек (TRTV),этиологическому возбудителю ринотрахеита птиц. Особенно применимым является использование вирусного изолята APV-C, представляющего собой наиболее близкородственный, хотя и существенно не характерный для млекопитающих вирус в качестве внешней группы для указанных анализов филогенетического дерева. Авторы настоящего изобретения представляют новый вирус человека, который следует называть метапневмовирусом человека или метапневмовирусподобным вирусом (MPV), основываясь на нескольких наблюдениях. Анализ ЕМ выявил парамиксовирусподобные частицы. Согласно классификации,MPV чувствителен к обработке хлороформом. MPV оптимально культивировать в клетках tMK, и он зависит от трипсина. Клинические симптомы, вызываемые посредством MPV, а также типичный СРЕ и отсутствие гемагглютинирующей активности означают, что данный вирус является близкородственным с hRSV. Хотя большинство парамиксовирусов обладают гемагглютинирующей активностью, большинство пневмовирусов ею не обладают 18. Как пример, изобретение относится к ранее не идентифицированному парамиксовирусу из образцов назофарингеального аспирата, забранного у 28 детей, страдающих тяжелым RTI. Клинические симптомы у данных детей являлись очень сходными с симптомами, вызываемыми hRSV. Двадцать семь пациентов являлись детьми в возрасте до пяти лет, а половина из них в возрасте от 1 до 12 месяцев. Другой пациент находился в возрасте 18 лет. Все субъекты страдали заболеванием верхних дыхательных путей, с симптомами, колеблющимися от кашля, миалгии, рвоты и лихорадки до бронхиолита и тяжелой пневмонии. Большинство данных пациентов подвергали госпитализации от одной до двух недель. Вирусные изоляты от этих пациентов при негативной контрастной электронной микроскопии обладали морфологией парамиксовирусов, но не реагировали со специфичными антисыворотками против известных парамиксовирусов человека и животных. Как определили посредством непрямых иммунофлуоресцентных анализов (IFA) с сыворотками, активированными против двух из изолятов, все они оказались близкородственными друг другу. Анализы последовательности девяти из данных изолятов выявили,что вирус до некоторой степени родственен APV. Основываясь на вирусологических данных, гомологии последовательности, а также геномной организации, авторы настоящего изобретения предполагают, что вирус является представителем рода Metapneumovirus. Серологические исследования показали, что данный вирус является относительно обычным патогенным микроорганизмом, так как доминирование серотипа в Голландии у людей в возрасте около пяти лет приближается к 100%. Более того, обнаружено, что доминирование серотипа в сыворотках, собранных у людей в 1958 году, является в равной степени высоким, указывая на то, что данный вирус циркулировал в популяции людей более чем 40 лет. Идентификация данного предполагаемого нового представителя рода Metapneumovirus теперь также обеспечивает развитие средств и способов для диагностических анализов, или тестовых наборов и вакцин, или композиций сывороток, или антител для вирусных инфекций дыхательных путей, и способы для проверки или скрининга противовирусных агентов, пригодных для лечения инфекций MPV. До этой степени изобретение среди прочего относится к изолированной или рекомбинантной нуклеиновой кислоте, или ее функциональному фрагменту, специфичному для вируса, полученным из вируса по изобретению. В частности, изобретение относится к праймерам и/или зондам, пригодным для определения нуклеиновой кислоты MPV. Кроме того, изобретение относится к вектору, включающему нуклеиновую кислоту по изобретению. Прежде всего, представлены векторы, такие как плазмидные векторы, содержащие геном MPV (или его часть), вирусные векторы, содержащие геном MPV (или его часть), (например, но без ограничения, другие парамиксовирусы, вирус коровьей оспы, ретровирусы,бакуловирусы) или MPV, содержащий геном другого вируса (или его часть) или других патогенных микроорганизмов. Кроме того, описан ряд способов обратной генетики для получения рекомбинантных вирусов с "минус"-цепью, основываясь на двух критических параметрах. Во-первых, получение таких ви- 11006879 русов зависит от репликации неполной или полноразмерной копии антисмысловой вирусной геномной РНК (вРНК) или ее комплементарной копии (кРНК). Данную вРНК или кРНК можно выделить из вызывающего инфекцию вируса, получить путем транскрипции in vitro или из клеток путем трансфекции нуклеиновых кислот. Во-вторых, получение рекомбинантного вируса с "минус"-цепью зависит от функционального полимеразного комплекса. Обычно, полимеразный комплекс пневмовирусов состоит из белковN, P, L и возможно М 2, но не обязательно ограничивается ими. Полимеразные комплексы или их компоненты можно получить из вирусных частиц, выделенных из клеток, экспрессирующих один или несколько компонентов, или получить посредством трансфекции специфичных экспрессирующих векторов. Инфекционные копии MPV можно получить, когда вышеуказанный полимеразный комплекс реплицирует вышеуказанные вРНК, кРНК или векторы, экспрессирующие данные РНК 16,17,18,19,20,21,22. Для получения минирепликонов или системы обратной генетики для получения полноразмерной копии, содержащей большую часть генома MPV или весь геном достаточно применить 3'-концевые и/или 5'концевые последовательности нуклеиновой кислоты, например, полученные из APV или самого MPV(Randhawa et al., 1997). Также изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор по изобретению. Плазмидные или вирусные векторы, включающие компоненты полимеразы MPV (предположительно N, P, L и М 2, но не обязательно ограничивающиеся ими), получают из прокариотических клеток для экспрессии компонентов в подходящих клеточных типах (бактерии, клетки насекомых, эукариотические клетки). Для экспрессии вирусных нуклеиновых кислот in vitro и in vivo в прокариотических клетках должны быть получены плазмидные или вирусные векторы, содержащие полноразмерные или неполные копии генома MPV. Поздние векторы могут содержать другие вирусные последовательности для получения химерных вирусов или химерных вирусных белков, могут не содержать части вирусного генома для получения дефектного по репликации вируса и могут содержать мутации, делеции или инсерции для получения аттенуированных вирусов. Инфекционные копии MPV (являющиеся диким типом, аттенуированными, дефективными по репликации или химерными) можно получить посредством коэкспрессии компонентов полимеразы по установленным в данной области способам, описанным выше. Кроме того, можно использовать эукариотические клетки, временно или стабильно экспрессирующие один или несколько полноразмерных или неполных белков MPV. Такие клетки можно получить путем трансфекции (белки или векторы из нуклеиновой кислоты), инфекции (вирусные векторы) или трансдукции (вирусные векторы), и они могут являться пригодными для комплементации указанных вирусов дикого типа, аттенуированных, дефективных по репликации или химерных вирусов. В частности, химерный вирус можно применять для получения рекомбинантных вакцин, защищающих от двух или более вирусов 23,24,26. Например, можно предусмотреть, чтобы вирусный векторMPV, экспрессирующий один или более белков RSV или вектор RSV, экспрессирующий один или более белков MPV, защищали вакцинированных таким вектором субъектов от обеих вирусных инфекций. Подобный подход можно предусмотреть для PI3 или других парамиксовирусов. Аттенуированные и дефектные по репликации вирусы можно применять для целей вакцинации живыми вакцинами, как предлагают для других вирусов 25,26. В предпочтительном осуществлении, изобретение относится к белковой молекуле или белку, специфичному для метапневмовируса, или их функциональным фрагментам, кодируемым нуклеиновой кислотой по изобретению. Пригодные белковые молекулы, например, получают из любых генных или геномных фрагментов, получаемых из вируса по изобретению. Такие молекулы или их антигенные фрагменты, как представлено здесь, например, пригодны для диагностических способов или наборов и в фармацевтических композициях, таких как субъединичные вакцины. Особенно применимыми являются белки F, SH и/или G или их антигенные фрагменты для включения как антиген или субъединичный иммуноген, но также можно применять целый инактивированный вирус. Особенно применимыми также являются такие белковые субстанции, которые кодируются фрагментами рекомбинантных нуклеиновых кислот, определенных для филогенетических анализов, конечно предпочтительными являются те из них,которые лежат в предпочтительных пределах и границах ORF, пригодных для филогенетических анализов, в частности для выявления специфичных к MPV антител, или in vivo (например, антител для целей защиты или для обеспечения диагностики) или in vitro (например, для способа фагового дисплея или другого способа, применимого для получения синтетических антител). Также здесь представляют антитела, являющиеся природными поликлональными или моноклональными или синтетическими антителами (например, связывающая молекула, полученная из (фаговой) библиотеки), специфически взаимодействующими с антигеном, содержащим белковую молекулу по изобретению или ее функциональный фрагмент, специфичный для MPV. Такие антитела пригодны в способе для идентификации вирусного изолята как содержащего MPV, посредством взаимодействия указанного вирусного изолята или его компонента с антителом, как представлено здесь. Например, данной цели можно достигнуть посредством использования очищенного или неочищенного MPV или его частей (белков, пептидов), применяя ELISA, RIA, FACS или сходные форматы анализов определения антигена (Current Protocols in Immunology). Альтернативно, для идентификации вирусных антигенов можно использо- 12006879 вать инфицированные клетки или клеточные культуры, применяя классические иммунофлуоресцентный или иммуногистохимический способы. Другим способом для идентификации вирусного изолята как содержащего MPV, является взаимодействие указанного вирусного изолята или его компонента со специфичной для вируса нуклеиновой кислотой по изобретению, в частности, когда указанный вирус млекопитающих содержит вирус человека. Таким образом, изобретение относится к вирусному изоляту, идентифицируемому способом по изобретению как вирус млекопитающих, таксономически соответствующий РНК-содержащему вирусу с однонитевой антисмысловой РНК, идентифицируемому как возможно принадлежащий к роду Metapneumovirus подсемейства Pneumovirinae семейства Paramyxoviridae. Способ пригоден для способа вирусологической диагностики инфекции MPV млекопитающих, например, указанный способ включает определение присутствия вирусного изолята или его компонента в образце от указанного млекопитающего посредством взаимодействия указанного образца с нуклеиновой кислотой или антителом по изобретению. Далее, в подробном описании, приведены примеры, такие как использование PCR (или других способов амплификации или гибридизации, общеизвестных в данной области) или использование иммунофлуоресцентной детекции (или других иммунологических способов,известных в данной области). Также изобретение относится к способу для серологической диагностики инфекции MPV млекопитающих, например, указанный способ включает определение присутствия антитела, специфически направленного против MPV, или его компонента в образце от указанного млекопитающего посредством взаимодействия указанного образца с белковой молекулой или ее фрагментом или антигеном по изобретению. Представленные здесь способы и средства особенно применимы в диагностических наборах для диагностики инфекции MPV, проводимой посредством вирусологической или серологической диагностики. Например, такие наборы или анализы могут включать вирус, нуклеиновую кислоту, белковую молекулу или ее фрагмент, антиген и/или антитело по изобретению. Применения вируса, нуклеиновой кислоты, белковой молекулы или ее фрагмента, антигена и/или антитела по изобретению относятся также к получению фармацевтической композиции, например, к лечению или предотвращению инфекции MPV и/или к лечению или предотвращению заболеваний дыхательных путей, в частности у людей. Аттенуации вируса можно достигнуть посредством установленных способов, разработанных для данной цели,включая применение родственных вирусов других видов, серийных пассажей в лабораторных животных и/или тканевые/клеточные культуры, сайт-направленного мутагенеза молекулярных клонов и обмена генов или генных фрагментов между родственными вирусами, но не ограничиваясь этим. Фармацевтические композиции, включающие вирус, нуклеиновую кислоту, белковую молекулу или ее фрагмент, антиген и/или антитело по изобретению, например, можно применять в способе лечения или предотвращения инфекций MPV и/или респираторных заболеваний, включающем представление субъекту фармацевтической композиции по изобретению. Именно это наиболее полезно, когда указанный субъект является человеком, особенно когда указанный человек находится в возрасте меньше 5 лет,так как такие младенцы и очень маленькие дети с наибольшей вероятностью подвергаются инфицированию MPV человека, как представлено здесь. Обычно, в острой фазе пациенты должны страдать от симптомов заболевания верхних дыхательных путей, предрасполагающих к другим респираторным и прочим заболеваниям. Также могут возникать заболевания нижних дыхательных путей, предрасполагающие к дополнительным и прочим серьезным состояниям. Также изобретение относится к способу получения противовирусного средства, пригодного для лечения заболевания дыхательных путей, включающему создание клеточной культуры или экспериментального животного, включающих вирус по изобретению, обработку указанной культуры или животного кандидатом на противовирусное средство и определение эффекта указанного средства на указанный вирус или инфицирование им указанной культуры или животного. Пример такого противовирусного средства включает антитело, нейтрализующее MPV, или его функциональный компонент, как представлено здесь, но также получены противовирусные средства другой природы. Также изобретение относится к применению противовирусного средства по изобретению для получения фармацевтической композиции,в частности, для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания дыхательных путей,особенно при инфекции MPV, а также относится к фармацевтической композиции, включающей антивирусное средство по изобретению, применимое в способе лечения или предотвращения инфекции MPV или респираторного заболевания, указанный способ включает представление субъекту такой фармацевтической композиции. Далее изобретение раскрывают в подробном описании без его ограничений. Пояснения к рисункам Фиг. 1 А содержит табл. 1: процент гомологии, обнаруженной у аминокислотных последовательностей изолята 00-1 и других представителей Pneumovirinae. Проценты (х 100) даны для последовательностей аминокислот N, P, M, F и двух фрагментов RAP-PCR из L (8 и 9/10). Номера доступа, применяемые для анализов, описываются в разделе "Материалы и методы".- 13006879 Фиг. 1 В содержит табл. 2: доминирование серотипа MPV у людей, распределенных по возрастным группам, с использованием иммунофлуоресцентного анализа и анализа нейтрализации вируса. Фиг. 2: схематическое представление генома APV с расположением и размером фрагментов, полученных посредством RAP-PCR и RT-PCR из вирусного изолята 00-1. Фрагменты с 1 по 10 получали с применением RAP-PCR. Фрагмент А получали с праймером, подобранным во фрагментах 1 и 2, полученных посредством RAP-PCR, и праймером, подобранным на основе выравнивания лидерной и концевой последовательностей у APV и RSV6. Фрагмент В получали с применением праймеров, подобранных во фрагментах 1 и 2, полученных посредством RAP-PCR и во фрагменте 3, полученном посредствомRAP-PCR. Фрагмент С получали с применением праймеров, подобранных во фрагменте 3, полученном посредством RAP-PCR и во фрагментах 4, 5, 6 и 7, полученных посредством RAP-PCR. Для всех филогенетических деревьев (фиг. 3-5) последовательности ДНК выравнивали с применением программного пакета Clustal W, и деревья максимального правдоподобия получали с применением программного пакета DNA-ML программы Phylip 3.5, использующей 100 условий инициализации и 3 перестановки 15. Ранее опубликованные последовательности, применяемые для получения филогенетических деревьев, доступны в Genbank под номерами доступа: для всех ORF: hRSV: NC001781; bRSV:NC001989; для ORF для F: PVM, D11128; APV-A, D00850; APV-B, Y14292; APV-C, AF187152; для ORF для N: PVM, D10331; APV-A, U39295; APV-B, U39296; APV-C, AF176590; для ORF для М: PMV,U66893; APV-A, Х 58639; APV-B, U37586; APV-C, AF262571; для ORF для Р: PVM, 09649; APV-A,U22110, APV-C, AF176591. Филогенетические анализы для девяти различных вирусных изолятов MPV проводили со штаммом APV С в качестве внешней группы. Аббревиатуры, применяемые на фигурах: hRSV: человеческий RSV; bRSV: бычий RSV; PVM: вирус пневмонии мышей; APV-A, В и С: птичий пневмовирус типов А, В и С. Фиг. 3: сравнение ORF для N, Р, М и F у представителей подсемейства Pneumovirinae и вирусного изолята 00-1. Выравнивание выявило аминокислотные последовательности полных белков N, Р, М и F и неполных белков L вирусного изолята 00-1. Показаны аминокислоты, отличающиеся у изолята 00-1 и других вирусов, идентичные аминокислоты изображали точками, разрывы изображали в виде штрихов. Числа соответствуют позициям аминокислот в белке. Номера доступа, используемые в анализах, описаны в разделе "Материалы и методы". APV-A, В или С: Птичий пневмовирус типа А, В или С, b- илиAPV-B в GenBank недоступны. Для выравнивания L являлись доступными только последовательностиbRSV, hRSV и APV-A. Фиг. 4: филогенетические анализы ORF для N, Р, М и F представителей рода Pneumovirinae и вирусного изолята 00-1. Филогенетический анализ проводили на вирусных последовательностях следующих генов: F (панель А), N (панель В), М (панель С) и Р (панель D). Филогенетические деревья базировались на анализах максимального правдоподобия, использующих 100 условий инициализации и 3 перестановки. Для каждого дерева показана шкала, представляющая количество нуклеотидных замен. Фиг. 5: филогенетическая родство частей ORF для F (панель А), N (панель В), М (панель С) и L (панель D) девяти первичных изолятов MPV с APV-C, являющимся ближайшим генетическим родственником. Филогенетические деревья базировались на анализах максимального правдоподобия. Для каждого дерева показана шкала, представляющая количество нуклеотидных замен. Номера доступа для APV-C: панель A: D00850; панель В: U39295; панель С: Х 58639; и панель D: U65312. Фиг. 6 А: информация о нуклеотидной и аминокислотной последовательности 3'-конца генома изолята 00-1 MPV. ORF приведены. N: ORF нуклеопротеина; Р: ORF фосфопротеина; М: ORF матриксного белка; F: ORF белка слияния; GE: конец гена; GS: начало гена. Фиг. 6 В и С: информация о нуклеотидной и аминокислотной последовательности из полученных фрагментов гена полимеразы (L) изолятов 00-1 MPV. Позиционирование фрагментов L основывается на гомологии белков с APV-C (номер доступа U65312). Транслируемый фрагмент 8 (фиг. 6 В) располагается,начиная с 8 аминокислоты по 243, а консенсусные фрагменты 9 и 10 (фиг. 6 С) располагались в ORF дляL у APV-C, начиная с 1358 аминокислоты по 1464. Фиг. 7: геномная карта изолята 00-1 MPV. Позиции нуклеотидов стартового и терминирующего кодонов показаны под каждой ORF. Двойные линии, которые пересекают ORF для L, показывают более краткое представление гена L. Три рамки считывания ниже карты обозначают основную ORF для G(нуклеотиды 6262-6972) и перекрывающиеся возможные вторичные ORF. Фиг. 8: выравнивание предсказанной аминокислотной последовательности нуклеопротеина MPV с аминокислотными последовательностями нуклеопротеина других пневмовирусов. Консервативные области, идентифицированные Barr (1991), обводили рамками и помечали А, В и С. Консервативная область пневмовирусов (Li, 1996) затенена серым. Разрывы изображали в виде штрихов, точки указывают положения идентичных аминокислотных остатков, в сравнении с MPV. Фиг. 9: сравнение аминокислотной последовательности фосфопротеина MPV с аминокислотными последовательностями фосфопротеина других пневмовирусов. Область высокого сходства (Ling, 1995)- 14006879 обведена рамкой, а область, богатая глутаматом, затенена серым. Разрывы изображали в виде штрихов,точки указывают положения идентичных аминокислотных остатков, в сравнении с MPV. Фиг. 10: сравнение выведенной аминокислотной последовательности матриксного белка MPV с аминокислотными последовательностями матриксного белка других пневмовирусов. Консервативная гексапептидная последовательность (Easton, 1997) затенена серым. Разрывы изображали в виде штрихов,точки указывают положения идентичных аминокислотных остатков, в сравнении с MPV. Фиг. 11: выравнивание предсказанной аминокислотной последовательности белка слияния MPV с аминокислотными последовательностями белка слияния других пневмовирусов. Консервативные цистеиновые остатки обведены рамкой, участки N-связанного гликозилирования подчеркнуты, участок расщепления F0 подчеркнут двойной линией, белок слияния, сигнальный белок и мембранный якорный домен показаны серой штриховкой. Разрывы изображали в виде штрихов, точки указывают положения идентичных аминокислот, в сравнении с MPV. Фиг. 12: сравнение аминокислотной последовательности ORF для М 2 у MPV с аминокислотными последовательностями ORF для М 2 других пневмовирусов. Выравнивание ORF для М 2-1 показано на панели А, с консервативными N-концами (Collins, 1990; Zamora, 1999) затененными серым. Три консервативных цистеиновых остатка напечатаны жирной гарнитурой шрифта и отмечены посредством . Выравнивание ORF для М 2-2 показано на панели В. Разрывы изображали в виде штрихов, точки указывают положения идентичных аминокислот, в сравнении с MPV. Фиг. 13: анализы аминокислотной последовательности ORF для SH у MPV. (A). Аминокислотная последовательность ORF для SH у MPV, с сериновыми и треониновыми остатками, затененными серым,цистеиновые остатки выделены жирной гарнитурой шрифта, а гидрофобные области подчеркнуты двойной линией. Потенциальные участки N-связанного гликозилирования подчеркнуты одной линией. Числа обозначают положение основных аминокислот, фланкирующих гидрофобный домен. (В) Выравнивание графиков гидрофобности белков SH у MPV, APV-A и hRSV-B. Применяли способ Kyte и Doolittle (1982) с окном из 17 аминокислот. Стрелка обозначает сильно гидрофобный домен. Позиции в ORF указаны на оси X. Фиг. 14: анализы аминокислотной последовательности ORF для G у MPV. (А) Аминокислотная последовательность ORF для G у MPV, с сериновыми, треониновыми и пролиновыми остатками, затененными серым, цистеиновые остатки выделены жирной гарнитурой шрифта, а гидрофобные области подчеркнуты двойной линией. Потенциальные участки W-связанного гликозилирования подчеркнуты одной линией. (В) Выравнивание графиков гидрофобных белков G у MPV, APV-A и hRSV-B. Применяли способ Kyte и Doolittle (1982) с окном из 17 аминокислот. Стрелка обозначает сильно гидрофобную область,а позиции в ORF указаны на оси X. Фиг. 15: сравнение аминокислотных последовательностей консервативного домена гена полимеразы MPV и других парамиксовирусов. Домен III, показанный с четырьмя консервативными мотивами полимеразы (А, В, С, D) в домене III (Poch 1998, 1999), обведен рамкой. Разрывы изображали в виде штрихов, точки указывают положения идентичных аминокислотных остатков, в сравнении с MPV. hPIV3: вирус парагриппа человека типа 3; SV: вирус Сендай; hPIV-2: вирус парагриппа человека типа 2; NDV: вирус болезни Ньюкасла; MV: вирус кори; nipah: вирус Nipah. Фиг. 16: филогенетические анализы ORF для М 2-1 и L у MPV и выбранных парамиксовирусов.ORF для М 2-1 выравнивали с ORF для М 2-1 других представителей рода Pneumovirinae (A), a ORF для L выравнивали с ORF для L представителей рода Pneumovirinae и другими выбранными парамиксовирусами как описано в пояснениях к фиг. 15 (В). Филогенетические деревья получали посредством анализов максимального правдоподобия, использующими 100 условий инициализации и 3 перестановки. Для каждого дерева показана шкала, представляющая количество нуклеотидных замен. Числа в деревьях представляют значения условий инициализации, основанные на консенсусных деревьях. Фиг. 17: некодирующие последовательности изолята 00-1 hMPV. (А) Некодирующие последовательности между ORF и концами генома показаны в положительной цепи. Слева направо: показаны терминирующие кодоны указанных ORF, с последующими некодирующими последовательностями, сигналами старта гена и стартовые кодоны последующих указанных ORF. Числа указывают первую позицию стартового и терминирующего кодонов на карте hMPV. Последовательности, продемонстрировавшие сходство с опубликованными сигналами конца гена, подчеркнуты, а последовательности, продемонстрировавшие сходство с UAAAAAU/A/C, обозначены линией над последовательностью. (В) Нуклеотидные последовательности концов генома hMPV. Концы генома hMPV выравнивали друг с другом и с концами генома APV. Подчеркнутые области изображают последовательности праймеров, применяемых в анализах RT-PCR, основанные на 3'- и 5'-концевых последовательностях APV и RSV (Randhawa et al., 1997;Mink et al., 1991). Нуклеотиды, выделенные жирным курсивом, являются частью сигнала начала гена N гена. Le: лидерный, Tr: концевой. Фиг. 18: сравнение двух изолятов-протопипов hMPV с APV-A и APV-C; матрица подобия ДНК для нуклеиновых кислот, кодирующих различные вирусные белки. Фиг. 19: сравнение двух изолятов-протопипов hMPV с APV-A и APV-C; матрица подобия белка для различных вирусных белков.- 15006879 Фиг. 20: выравнивание аминокислот нуклеопротеина двух изолятов-прототипов hMPV. Фиг. 21: выравнивание аминокислот фосфопротеина двух изолятов-прототипов hMPV. Фиг 22: выравнивание аминокислот матриксного белка двух изолятов-прототипов hMPV. Фиг. 23: выравнивание аминокислот белка слияния двух изолятов-прототипов hMPV. Фиг. 24: выравнивание аминокислот белка М 2-1 двух изолятов-прототипов hMPV. Фиг. 25: выравнивание аминокислот белка М 2-2 двух изолятов-прототипов hMPV. Фиг. 26: выравнивание аминокислот короткого гидрофобного белка двух изолятов-прототиповhMPV. Фиг. 27: выравнивание аминокислот гликопротеина прикрепления двух изолятов-прототиповhMPV. Фиг. 28: выравнивание аминокислот белка N-конца полимеразы двух изолятов-прототипов hMPV. Фиг. 29: результаты RT-PCR анализа мазков из гортани и носа 12 морских свинок, инокулированных ned/00/01 и/или ned/99/01. Фиг. 30 А: ответ посредством IgG против ned/00/01 и ned/99/01 у морских свинок, инфицированныхned/99/01 и повторно инфицированных или ned/00/01 (GP 8 и 9), или ned/99/01 (GP 10, 11, 12). Фиг. 31: специфичность ELISA с ned/00/01 и ned/99/01 к сывороткам, взятым от морских свинок,инфицированных или ned/00/01, или ned/99/01. Фиг. 32: средний ответ IgG против ned/00/01 и ned/99/01 посредством ELISA 3 гомологично (001/00-1), 2 гомологично (99-1/99-1), 2 гетерологично (99-1/00-1) и 2 гетерологично (00-1/99-1) инфицированных морских свинок. Фиг. 33: средний процент ингибирования APV у инфицированных hMPV морских свинок. Фиг. 34: титры нейтрализации вируса у морских свинок, инфицированных ned/00/01 и ned/99/01,против ned/00/01, ned/99/01 и APV-C. Фиг. 35: Результаты анализов RT-PCR мазков из гортани макаков-крабоедов, (дважды) инокулированных ned/00/01. Фиг. 36 А (две верхние панели): Ответ IgA, IgM и IgG против ned/00/01 у 2 макаков-крабоедов, повторно инфицированных ned/00/01. Фиг. 36 В (нижние панели) Ответ IgG против APV у 2 макаков-крабоедов, инфицированныхned/00/01. Фиг. 37: сравнение применения ELISA с hMPV и ELISA ингибирования APV для определения антител IgG в сыворотках человека. Подробное описание Выделение и характеристика вируса С 1980 по 2000 г. авторы настоящего изобретения обнаружили 28 неидентифицированных вирусных изолятов у пациентов с тяжелым респираторным заболеванием. Данные 28 неидентифицированных вирусных изолятов медленно росли в клетках tMK, плохо - в клетках VERO и А 549, и не размножались или размножались плохо в клетках MDCK или эмбриональных фибробластах цыплят. Большинство данных вирусных изолятов индуцировали СРЕ после трех пассажей в клетках tMK, между десятыми и четырнадцатыми сутками. СРЕ в клетках tMK или других клеточных культурах являлся практически неотличимым от СРЕ, вызванного hRSV или hPIV и характеризовался образованием синцития, после чего клетки демонстрировали быстрое внутреннее разрушение с последующим их отделением от монослоя. Обычно (иногда позднее) СРЕ в клетках проявлялся после трех пассажей вируса из оригинального материала с 10 по 14 сутки после инокуляции, немного позднее, чем СРЕ, вызванный другими вирусами, такими как hRSV или hPIV. Авторы настоящего изобретения использовали супернатанты инфицированных клеток tMK для анализа ЕМ, который выявил присутствие вирусных частиц, подобных парамиксовирусам, в диапазоне от 150 до 600 нанометров с резкими проекциями оболочек в диапазоне от 13 до 17 нанометров. В соответствии с биохимическими свойствами оболочечных вирусов, таких как Paramyxoviridae стандартная обработка хлороформом или простым эфиром 8 приводила к уменьшению инфекционности для клетокtMK до 104 TCID50. Для супернатантов инфицированной вирусом культуры клеток tMK не показана гемагглютинирующая активность с эритроцитами индейки, цыплят или морских свинок. Во время культивирования на тестируемых клетках, репликация вируса казалась зависящей от трипсина. Данные комбинированные вирусологические факты представили возможность таксономически классифицировать вновь идентифицированный вирус как представитель семейства Paramyxoviridae. Авторы настоящего изобретения выделили РНК из клеток tMK, инфицированных 15 неидентифицированными вирусными изолятами, для анализов для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (RT-PCR), применяющих наборы праймеров, специфичные для Pneumovirinae9, hPIV 1-4, вируса Сендай, вируса обезьян типа 5, вируса болезни Ньюкасла, вирусов hRSV, кори, Nipah, Hendra, Tupaia иMapuera. Анализы RT-PCR проводили в мягких условиях для того, чтобы обнаружить возможные родственные вирусы, а РНК, изолированную из гомологичных вирусных маточных растворов, применяли как- 16006879 контроль. Несмотря на то, что доступные контроли проявляли положительную реакцию с соответствующими вирусоспецифичными праймерами, вновь идентифицированные вирусные изоляты не реагировали с любым набором праймеров, что означало, что данный вирус не является близкородственным для тестируемых вирусов. Авторы настоящего изобретения использовали супернатанты двух инфицированных вирусом клеточных культур tMK для интраназальной инокуляции морским свинкам и хорькам. Сыворотки этих животных собирали на нулевые сутки, через две и три недели после инокуляции. У животных не обнаружили клинических симптомов, но у всех проходила сероконверсия, что измеряли анализами нейтрализации вируса (VN) и непрямым IFA против гомологичных вирусов. В непрямом IFA сыворотки не реагировали ни с одним из известных парамиксовирусов, описанных выше, и с PVM. Далее, применяя сыворотки морских свинок и хорьков перед и после инфицирования, авторы настоящего изобретения скринировали пока не идентифицированные вирусные изоляты, из которых 28 являлись безусловно положительными при применении непрямого IFA с сыворотками после инфицирования, что означало, что данные изоляты серологически близкородственны или идентичны.RAP PCR Для получения информации о последовательности неизвестных вирусных изолятов авторы настоящего изобретения применили стратегию амплификации PCR со случайными праймерами, известной какRAP-PCR10. С этой целью, клетки tMK инфицировали одним из вирусных изолятов (изолят 00-1), а такжеhPIV-1, который служил контролем. После того, как в обеих культурах обнаружили сходные уровни СРЕ, вирус в супернатантах культур очистили на непрерывных градиентах 20-60% сахарозы. Фракции градиента посредством ЕМ проверяли на предмет наличия вирусоподобных частиц, и из фракции, где обнаружили нуклеокапсиды, содержащей примерно 50% сахарозы, выделили РНК. Эквивалентные количества РНК, изолированной из обеих вирусных фракций, использовали в RAP-PCR, после которой образцы, один рядом с другим, разделяли в 3% агарозном геле NuSieve. Потом из геля очистили двадцать различимых полос, специфичных для неидентифицированного вируса, клонировали в плазмиде pCR2.1(Invitrogen) и определили последовательность с применением специфичных для вектора праймеров. Когда авторы настоящего изобретения использовали данные последовательности для поиска гомологии с последовательностями в базе данных Genbank, применяя программное обеспечение BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), 10 из 20 фрагментов обнаружили сходство с последовательностямиAPV/TRTV. Данные 10 фрагментов расположены в генах, кодирующих нуклеопротеин (N; фрагменты 1 и 2),матриксный белок (М; фрагмент 3), белок слияния (F; фрагменты 4, 5, 6, 7) и белок полимеразы (L; фрагменты 8, 9, 10) (фиг. 2). Далее авторы настоящего изобретения подобрали праймеры PCR для завершения определения информации о последовательности на 3'-конце вирусного генома, на основе фрагментов RAP PCR авторов настоящего изобретения, а также на опубликованных лидерных и концевых последовательностях для Pneumovirinae6. Амплифицировали три фрагмента: фрагмент А охватывал крайний 3'-концевой отрезок открытой рамки считывания (ORF) для N, фрагмент В охватывал ORF для фосфопротеина (Р), а фрагмент С перекрывал промежуток между ORF для М и F (фиг. 2). Анализы последовательности данных трех фрагментов выявили отсутствие ORF для NS1 и NS2 на крайнем 3'-концевом отрезке вирусного генома и расположение ORF для F непосредственно рядом с ORF для М. Данная организация генома имеет сходство с организацией генома метапневмовируса APV, что также согласуется с гомологией последовательности. Суммарно, транслированные последовательности ORF для N, Р, М и F продемонстрировали в среднем 30-33% гомологии с представителями рода Pneumovirus и 66-68% с представителями рода Metapneumovirus. Для ORF для SH и G не обнаружили видимой гомологии с обоими из родов. Обнаруженные для N гомологии аминокислот составляют примерно 40% с hRSV и 88% с APV-C, его наиболее близкими генетическими родственниками, что, например, можно вывести посредством сравнения аминокислотной последовательности фиг. 3 с аминокислотной последовательностью соответствующих белков N у других вирусов. Аминокислотная последовательность Р обладает гомологией с hRSV в размере примерно 25% и с APV-C - примерно 66-68%, М с hRSV - примерно 36-39% и с APV-C примерно 87-89%, F с hRSV примерно 40% и с APV-C примерно 81%, М 2-1 с пневмовирусами - примерно 34-36% и с APV-C примерно 84-86%, М 2-2 с пневмовирусами - примерно 15-17% и с APV-C примерно 56%, а фрагменты, полученные для L с пневмовирусами, обладают в среднем 44% и с APV-C 64%. Филогенез Хотя поиски BLAST с применением нуклеотидных последовательностей, полученных из неидентифицированных вирусных изолятов, выявили гомологии главным образом с представителями Pneumovirinae, на основе гомологии белковых последовательностей также выявлено некоторое сходство с другими парамиксовирусами (данные не показаны). Как показатель родства между вновь идентифицированными вирусным изолятом и представителями Pneumovirinae, на основе ORF для N, Р, М и F данных вирусов построены филогенетические деревья. На всех четырех филогенетических деревьях вновь идентифицированный вирусный изолят являлся наиболее близкородственным с APV (фиг. 4). Из четырех описанных 11 серотипов APV, серотип APV С, метапневмовирус, первоначально обнаруженный у птиц в США,- 17006879 обнаружил наиболее близкое соответствие с вновь идентифицированным вирусом. Однако необходимо отметить, что для серотипа APV D доступна только часть информации о последовательности. Для установления родства различных вновь идентифицированных авторами настоящего изобретения вирусных изолятов, авторы настоящего изобретения построили филогенетические деревья, основываясь на информации о последовательности, полученной из 8-9 изолятов (8 для F, 9 для N, М и L). С этой целью авторы настоящего изобретения применяли RT-PCR с праймерами, подобранными для амплификации коротких фрагментов ORF для N, M, F и L, для которых впоследствии прямым способом определили последовательность. Девять вирусных изолятов, которые ранее определили как родственные посредством серологических способов (см. выше), также определили как родственные генетически. Практически, все девять изолятов оказались более близкородственными друг другу, чем APV. Хотя использованная для данных филогенетических деревьев информация о последовательности являлась ограниченной, оказывается, что девять изолятов можно разделить на две группы, где изоляты 94-1, 99-1 и 99-2 объединяются в одну группу, а другие шесть изолятов (94-2; 93-1; 93-2; 93-3; 93-4; 00-1) - в другую (фиг. 5). Доминирование серотипа Для изучения доминирования серотипа вируса в популяции людей авторы настоящего изобретения тестировали сыворотки людей различных возрастных категорий посредством непрямого IFA, применяя клетки tMK, инфицированные одним из неидентифицированных вирусных изолятов. Данный анализ выявил, что у 25% детей между шестью и двенадцатью месяцами присутствовали антитела к вирусу, а к возрасту 5 лет почти 100% детей оказались серопозитивными. В итоге, 56 образцов сыворотки, проверенных посредством непрямого IFA, тестировали посредством анализа VN. Для 51 (91%) образца результаты анализа VN (титр 8) совпадают с полученными непрямым IFA результатами (титр 32). Четыре образца, которые ранее посредством непрямого IFA определили как позитивные, оказались негативными при тесте VN (титр 8) , тогда как одна сыворотка, отрицательно реагировавшая при IFA (титр 32), при тесте VN оказалась положительной (титр 16) (табл. 2).IFA, проведенный с 72 сыворотками, собранными у людей в 1958 году (возраст в диапазоне 8-99 лет)12,27, выявил 100% доминирования генотипа, указывая на то, что вирус циркулировал в популяции людей более чем 40 лет. Кроме того, ряд данных сывороток применяли в анализе VN для подтверждения данных IFA (табл. 2). Генетические анализы генов N, М, Р и F выявили, что MPV обладает более высокой гомологией последовательности с ранее предложенным родом Metapneumovirinae (в среднем 63%), чем при сравнении с родом Pneumovirinae (в среднем 30%), таким образом, демонстрируя геномную организацию, подобную APV/TRTV и схожую с ним. В отличие от геномной организации вирусов RSV ('3-NS1-NS2-N-P-MSH-G-F-M2-L-5'), у метапневмовирусов отсутствуют гены NS1 и NS2, а также отличается расположение генов между М и L ('3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5'). Отсутствие ORF между генами М и F в вирусных изолятах авторов настоящего изобретения, отсутствие NS1 и NS2, расположенных вблизи N, и обнаруженная высокая степень гомологии аминокислотной последовательности с APV являются основаниями предложить классификацию MPV, выделенного у людей как первого представителя рода Metapneumovirus млекопитающих, в частности человеческого происхождения. Филогенетические анализы выявили, что девять изолятов MPV, для которых получена информация о последовательности, являются близкородственными. Хотя информация о последовательности являлась ограниченной, практически они являлись более близкородственными друг другу, чем любому из метапневмовирусов птиц. Из четырех описанных серотипов APV, основываясь на генах N, Р, М и F, серотип С являлся наиболее близкородственным к MPV. Однако нужно заметить, что в Genbank для гена F серотипа D доступной являлась только часть последовательности, а для серотипа В доступными являлись только последовательности генов М, N и F. Изоляты MPV авторов настоящего изобретения формировали два кластера на филогенетических деревьях. И для hRSV и для APV описаны различные генетические и серологические подтипы. Представляют ли два генетических кластера изолятов MPV также функционально отличающиеся серологические подгруппы, остается в настоящее время неизвестным. Серологические наблюдения авторов настоящего изобретения показали, что MPV является обычным патогенным микроорганизмом человека. Повторная изоляция данного вируса из клинических образцов детей с тяжелой RTI показывает, что клиническое и экономическое влияние MPV может являться высоким. Новые диагностические способы, основывающиеся на обнаружении вируса и серологии, позволят более подробный анализ сферы действия и клинического и экономического влияния данного вирусного патогенного микроорганизма. Незначительная разница результатов у IFA и VN (5 образцов) может представлять собой следствие того, что IFA детектирует только сывороточные IgG-антитела, тогда как анализ VN детектирует оба класса и подкласса антител, или разница может быть следствием разницы чувствительности между данными двумя анализами. Для IFA применяли крайнее значение 16, тогда как для VN - 8. С другой стороны, разница между анализами IFA и VN может также означать возможную разницу между различными серотипами данного вновь идентифицированного вируса. Так как кажется, что MPV более близкородственен к APV, авторы настоящего изобретения предполагают, что вирус человека мог возникнуть от птиц. Анализ образца сыворотки, взятой у людей в 1958 году, выявил, что MPV являлся- 18006879 широко распространенным в популяции людей более 40 лет, указывая на то, что предполагаемый случай зооноза должен был произойти задолго до 1958 года. Материалы и методы Коллекция образцов В течение последних десятилетий лаборатория авторов настоящего изобретения собирала назофарингеальные аспираты детей, страдающих RTI, которые стандартным образом проверяли на предмет присутствия вирусов. Все назофарингеальные аспираты тестировали посредством прямых иммунофлуоресцентных анализов (DIF), применяя флуоресцентно меченные антитела против вирусов гриппа типов А и В, hRSV и вируса парагриппа человека (hPIV) типов 1-3. Назофарингеальные аспираты также обрабатывали для выделения вируса, применяя быстрые способы снятия оболочки 14 на различных линиях клеток, включая клетки VERO, третичные клетки почки макака-крабоеда (tMK), клетки эпителия легкого человека (HEL) и клетки почки собаки Madin-Darby (MDCK). Образцы, в которых обнаружили цитопатический эффект (СРЕ) после двух-трех пассажей и которые оказались негативными в DIF, тестировали посредством непрямого иммунофлуоресцентного анализа (IFA), применяя антитела, специфичные против вируса гриппа типов А, В и С, hRSV типов А и В, вируса кори, вируса свинки, вируса парагриппа человека (hPIV) типов 1-4, вируса Сендай, обезьяньего вируса типа 5 и вируса болезни Ньюкасла. Хотя во многих случаях этиологический агент не смогли идентифицировать, некоторые образцы оказались негативными для всех тестируемых вирусов. Прямой иммунофлуоресцентный анализ (DIF) Назофарингеальные аспираты пациентов, страдающих RTI, использовали для DIF и выделения вируса, как описано 14'15. Образцы хранили при -70 С. Коротко, назофарингеальные аспираты разводили 5 мл Dulbecco MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) и одну минуту тщательно перемешивали на устройстве типа "вортекс". Таким образом, суспензию центрифугировали десять минут при 840 х g. Осадок распределяли на предметном стекле для многих образцов (Nutacon, Leimuiden, The Netherlands), a супернатант использовали для выделения вируса. После сушки, клетки 1 мин фиксировали в ацетоне при комнатной температуре. После отмывки предметные стекла инкубировали 15 мин при 37 С с коммерчески доступными антисыворотками, специфичными к вирусам, таким как грипп А и В, hRSV и hPIV 1-3(Dako, Glostrup, Denmark), меченными FITC. После трех отмывок в PBS и одной в проточной воде, предметные стекла помещали в раствор глицерин/PBS (Citifluor, UKC, Canterbury, UK) и покрывали. Предметные стекла анализировали с применением флуоресцентного микроскопа Axioscop (Carl Zeiss B.V,Weesp, the Netherlands). Выделение вируса Для выделения вируса клетки tMK (RIVM, Bilthoven, The Netherlands) культивировали в 24 луночных планшетах, содержащих предметные стекла (Costar, Cambridge, UK) , в описанной ниже среде,дополненной до 10% фетальной бычьей сывороткой (BioWhittaker, Vervier, Belgium). Перед инокуляцией планшеты отмывали в PBS и заполняли Eagle's MEM с солью Hanks (ICN, Costa mesa, CA) , половину литра которой дополнили до 0,26 г НаНСО 3, 0,25 М HEPES (Biowhittaker), 2 мМ L-глутамина(Biowhittaker), 100 единиц пенициллина, 100 мкг стрептомицина (Biowhittaker), 0,5 г молочного альбумина (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands), 1,0 г D-глюкозы (Merck, Amsterdam, The Netherlands),5,0 г пептона (Oxoid, Haarlem, The Netherlands) и 0,02% трипсина (Life Technologies, Bethesda, MD) . Планшеты инокулировали супернатантом образцов назофарингеального аспирата в размере 0,2 мл на каждую лунку по три лунки на образец, с последующим центрифугированием один час при 840 х g. После инокуляции планшеты инкубировали максимум 14 суток при 37 С, меняя среду один раз в неделю и ежедневно контролируя культуры на предмет наличия СРЕ. После 14 суток клетки соскабливали из второго пассажа и инкубировали 14 суток. Данный шаг повторили для третьего пассажа. Предметные стекла использовали для демонстрации наличия вируса посредством непрямого IFA, как описано ниже. Иммунизация животных Для вновь обнаруженных вирусов получили специфичные антисыворотки хорьков и морских свинок посредством экспериментального интраназального инфицирования двух хорьков и двух морских свинок, не инфицированных специфичным патогенным микроорганизмом и содержавшихся в отдельных герметичных стерильных камерах с перчатками. Две-три недели спустя у всех животных забрали кровь посредством сердечной пункции, и их сыворотки использовали в качестве сывороток сравнения. Сыворотки тестировали на предмет наличия всех ранее описанных вирусов посредством непрямого IFA, как описано ниже. Выявление антигена посредством непрямого IFA Авторы настоящего изобретения провели непрямой IFA на предметных стеклах, содержащих инфицированные клетки tMK. После отмывки в PBS предметные стекла инкубировали 30 мин при 37 С с сыворотками, специфичными к вирусу. В DIF авторы настоящего изобретения использовали моноклональные антитела против гриппа А, В и С, hPIV типов с 1 по 3 и hRSV, как описано выше. Для hPIV типа 4, вируса свинки, вируса кори, вируса Сендай, обезьяньего вируса типа 5, вируса болезни Ньюкасла использовали поликлональные антитела (RIVM) и сыворотки сравнения хорьков и морских свинок. После трех отмывок в PBS и одной в проточной воде, предметные стекла окрашивали вторичными антителами,- 19006879 направленными против сывороток, применявшихся в первой инкубации. Вторичные антитела для поликлональных антисывороток представляли собой антитела козы против антител хорька (KPL, Guilford,UK, разведенные в 40 раз), антитела мыши против антител кролика (Dako, Glostrup, Denmark, разведенные в 20 раз), антитела кролика против антител цыплят (KPL, разведенные в 20 раз) и антитела мыши против антител морских свинок (Dako, разведенные в 20 раз). Предметные стекла обрабатывали, как описано для DIF. Выявление антигена у людей посредством непрямого IFA Для выявления антител, специфичных к вирусу, инфицированные клетки tMK фиксировали охлажденным ацетоном на покровных стеклах, отмывали в PBS и окрашивали образцами сыворотки в разведении от 1 до 16. Далее, образцы окрашивали 80-кратно разведенными в PBS меченными FITC антителами кролика против антител человека (Dako). Предметные стекла обрабатывали, как описано выше. Культура вируса MPV Субконфлуэнтный монослой клеток tMK в среде, как описано выше, инокулировали супернатантами образцов с зарегистрированным после второго или третьего пассажа в 24-луночных планшетах СРЕ. Культуры ежедневно контролировали на предмет наличия СРЕ, а среду меняли один раз в неделю. Поскольку у каждого изолята СРЕ различается, все культуры с 12 по 14 сутки проверяли непрямым IFA с антителами хорька против новых вирусных изолятов. Позитивные культуры три раза подвергали замораживанию-оттаиванию, после чего очищали супернатанты посредством низкоскоростного центрифугирования, разделяли и хранили замороженными при -70 С. Дозы вируса в единицах 50% инфицирования тканевых культур (TCID50) в супернатантах культур определяли, как описано 16. Анализ нейтрализации вируса Анализы VN проводили серийными двукратными разведениями сывороток человека и животных,начиная с восьмикратного разведения. Разведенные сыворотки инкубировали один час со 100 TCID50 вируса перед инокуляцией клеток tMK, растущих в 96-луночных планшетах, после чего планшеты центрифугировали при 840 х g. Среду меняли на третьи и шестые сутки, a IFA с антителами хорька противMPV проводили через 8 суток после инокуляции. Титр VN определяли как наибольшее разведение образца сыворотки, приводящее к негативному результату в IFA и ингибирующее СРЕ в клеточных культурах. Характеристика вируса Анализы гемагглютинации и тесты чувствительности к хлороформу проводили, как описано ранее 8,14. Для анализов посредством ЕМ, вирус концентрировали из супернатантов инфицированных клеточных культур в микроцентрифуге при 4 С при 17000 х g, после чего осадок ресуспендировали в PBS и проверяли посредством негативной контрастной ЕМ. Для RAP-PCR вирус концентрировали из инфицированных клеток tMK посредством ультрацентрифугирования на подушке 60% сахарозы (2 часа при 150000 х g, 4 С) . Потом интерфазу 60% сахарозы развели PBS и наслоили сверху на 20-60% непрерывный градиент сахарозы, который центрифугировали 16 ч при 275000 х g при 4 С. Фракции градиента сахарозы проверяли на предмет наличия вирусоподобных частиц посредством ЕМ и электрофореза в полиакриламидном геле с окрашиванием серебром. Примерно 50% фракций сахарозы, в которых обнаружили наличие нуклеокапсидов, использовали для выделения РНК и RAP-PCR. Выделение РНК РНК выделяли из супернатантов инфицированных клеточных культур или фракций сахарозного градиента, применяя набор High Pure RNA Isolation kit (Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands) по инструкциям производителя.RT-PCR Вирусоспецифичные последовательности олигонуклеотидов для RT-PCR известных парамиксовирусов описаны в приложении 1. Одношаговый RT-PCR проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержавшей 50 мМ Tris-HCl рН 8,5, 50 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2, 2 мМ дитиотреитол, 200 мкМ каждого dNTP,10 единиц рекомбинантной RNAsin (Promega, Leiden, the Netherlands) , 10 единиц AMV RT (Promega,Leiden, The Netherlands) , 5 единиц Amplitaq Gold DNA polymerase (PE Biosystems, Nieuwerkerk aan deIjssel, The Netherlands) и 5 мкл РНК. Условия цикла представляли собой однократную инкубацию 45 мин при 42 С и 7 мин при 95 С, повторенные 40 раз 1 мин при 95 С, 2 мин при 42 С и 3 мин при 72 С и однократную инкубацию 10 мин при 72 С.RAP-PCR, по существу, проводили, как описано ранее 10. Последовательности олигонуклеотидов описаны в приложении 2. Для реакции RT 2 мкл РНК использовали в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 10 нг/мкл олигонуклеотида, 10 мМ дитиотреитол, 500 мкм каждого dNTP, 25 мМ Tris-HCl рН 8,3,75 мМ KСl и 3 мМ МgСl2. Реакционную смесь инкубировали 5 мин при 70 С и 5 мин при 37 С, после чего добавили 200 единиц Superscript RT enzyme (LifeTechnologies). Инкубация при 37 С продолжалась 55 мин, а реакцию останавливали посредством 5 мин инкубации при 72 С. Смесь RT растворяли для получения 50 мкл реакционной смеси для PCR, содержащей 8 нг/мкл олигонуклеотида, 300 мкм каждогоdNTP, 15 мМ Tris-HCl рН 8,3, 65 мМ KСl, 3 мМ MgCl2 и 5 единиц ДНК-полимеразы Taq (PE Biosystems). Условия цикла представляли собой однократную инкубацию 5 мин при 94 С, 5 мин при 40 С и 1 мин- 20006879 при 72 С, с последующими, повторенными 40 раз 1 мин при 94 С, 2 мин при 56 С и 1 мин при 72 С и однократную инкубацию 5 мин при 72 С. После RAP-PCR 15 мкл продукта RT-PCR один рядом с другим разделили в 3% агарозном геле NuSieve (FMC BioProducts, Heerhugowaard, The Netherlands). Различимые фрагменты, специфичные для MPV, очищали из геля посредством набора Qiaquick Gel Extraction(Qiagen, Leusden, The Netherlands) и клонировали в векторе pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, The Netherlands) по инструкциям производителя. Анализ последовательности Для продуктов RAP-PCR, клонированных в векторе pCR2.1 (Invitrogen), определили последовательность со специфичными для М 13 олигонуклеотидами. Фрагменты ДНК, полученные посредствомRT-PCR, очищали из агарозного геля посредством набора Qiaquick Gel Extraction (Qiagen, Leusden, TheNetherlands) и определяли последовательность прямым способом с теми же олигонуклеотидами, что и для PCR. Анализы последовательности проводили с применением набора Dyenamic ET terminator sequencing (Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, The Netherlands) и автоматического ДНК-секвенатораABI 373 (PE Biosystem). Все способы проводили по инструкциям производителя. Получение фрагментов генома MPV посредством RT-PCR Для получения фрагментов PCR, перекрывающих промежутки А, В и С между фрагментами RAPPCR (фиг. 2), авторы настоящего изобретения применяли анализ RT-PCR РНК, выделенной из вирусного изолята 00-1, как описано ранее. Применяли следующие праймеры: Для фрагмента A: TR1 (5'-AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3'), подобранный к лидерному концу, и N1 (5'-CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3'), подобранный к 3'-концу фрагментов RAP-PCR,полученных из N. Для фрагмента В: N2 (5'-CATGCAAGCTTATGGGGC-3'), подобранный к 5'-концу фрагментов RAPPCR, полученных из N, и M1 (5'-CAGAGTGGTTATTGTCAGGGT-3'), подобранный к 3'-концу фрагментов RAP-PCR, полученных из М. Для фрагмента С: М 2 (5'-GTAGAACTAGGAGCATATG-3'), подобранный к 5'-концу фрагментовRAP-PCR, полученных из М, и F1 (5'-TCCCCAATGTAGATACTGCTTC-3'), подобранный к 3'-концу фрагментов RAP-PCR, полученных из F. Фрагменты очищали из геля, клонировали и определяли последовательность, как описано ранее.RT-PCR для диагностики MPV Для амплификации и определения последовательности частей ORF для N, M, F и L девяти из изолятов MPV авторы настоящего изобретения использовали праймеры N3 (5'-GCACTCAAGAGAL6 (5'-CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3') и L7 (5'-CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3'), амплифицируя фрагмент, состоящий из 173 нуклеотидов, соответственно. RT-PCR, очистка из геля и прямое определение последовательности проводили, как описано выше. Кроме того, использовали зонды: Зонд, используемый для М: 5'-TGCTTGTACTTCCCAAAG-3' Зонд, используемый для N: 5'-TATTTGAACAAAAAGTGT-3' Зонд, используемый для L: 5'-TGGTGTGGGATATTAACAG-3' Филогенетические анализы Для всех филогенетических деревьев, последовательности ДНК выравнивали с применением программного пакета ClustalW, a деревья максимального правдоподобия получали с применением программного пакета DNA-ML программного обеспечения Phylip 3.5 с применением 100 условий инициализации и 3 перестановок 15. Для получения филогенетических деревьев использовали ранее опубликованные последовательности, доступные в Genbank с номерами доступа: все ORF: hRSV: NC001781; bRSV:PVM, D10331; APV-A, U39295; APV-B, U39296; APV-C, AF176590; ORF для M: PMV, U66893; APV-A,X58639; APV-B, U37586; APV-C, AF262571; ORF для P: PVM, 09649; APV-A, U22110, APV-C, AF176591. Филогенетические анализы для девяти вирусных изолятов MPV проводили со штаммом APV-C в качестве внешней группы. Аббревиатуры, применяемые на фигурах: hRSV: человеческий RSV; bRSV: бычий RSV; PVM: вирус пневмонии мышей; APV-A, -В и -С: пневмовирус птиц, типы А, В и С. Примеры способов идентификации MPV Коллекция образцов В целях обнаружения вирусных изолятов необходимо изучать назофарингеальные аспираты, глоточные и назальные мазки, бронхоальвеолярные смывы предпочтительно млекопитающих, таких как человек, плотоядные (собаки, кошки, куньи, тюлени и т.п.), лошади, жвачные (крупный рогатый скот,овцы, козы и т.п.), свиньи, кролики, птицы (домашняя птица, страусы). У птиц также можно изучать мазки из клоаки и помет. Для иммунологических анализов, таких как ELISA и анализ нейтрализации вируса,необходимо собирать сыворотки.- 21006879 Собранные вирусные образцы разводили 5 мл среды Dulbecco MEM (BioWhittaker, Walkersville,MD) одну минуту тщательно перемешивали на устройстве типа "вортекс". Таким образом, суспензию центрифугировали десять минут при 840 х g. Осадок распределяли на покровном стекле для многих образцов (Nutacon, Leimuiden, The Netherlands), а супернатант использовали для выделения вируса. Выделение вируса Для выделения вируса, клетки tMK (RIVM, Bilthoven, The Netherlands) культивировали в 24 луночных планшетах, содержащих предметные стекла (Costar, Cambridge, UK) , в описанной ниже среде,дополненной до 10% фетальной бычьей сыворотки (BioWhittaker, Vervier, Belgium). Перед инокуляцией планшеты отмывали в PBS и заполняли Eagle's MEM с солью Hanks (ICN, Costa mesa, CA) дополненной до 0,52 г/л NaHCO3, 0,025M HEPES (Biowhittaker), 2 мМ L-глутамина (Biowhittaker), 200 единиц/л пенициллина, 200 мкг/л стрептомицина (Biowhittaker), 1,0 г/л молочного альбумина (Sigma-Aldrich,Zwijndrecht, The Netherlands), 2,0 г/л D-глюкозы (Merck, Amsterdam, The Netherlands), 10,0 г/л пептона(Oxoid, Haarlem, The Netherlands) и 0,02% трипсина (Life Technologies, Bethesda, MD). Планшеты инокулировали супернатантом образцов назофарингеального аспирата в размере 0,2 мл на каждую лунку по три лунки на образец, с последующим центрифугированием один час при 840 х g. После инокуляции планшеты инкубировали максимум 14 суток при 37 С, меняя среду один раз в неделю и ежедневно контролируя культуры на предмет наличия СРЕ. После 14 суток клетки соскабливали из второго пассажа и инкубировали 14 суток. Данный шаг повторили для третьего пассажа. Предметные стекла использовали для демонстрации наличия вируса посредством непрямого IFA, как описано ниже. СРЕ обычно наблюдали после третьего пассажа, с 8 по 14 сутки в зависимости от изолята. В tMK или других клеточных культурах СРЕ практически не отличался от СРЕ, вызванного hRSV или hPIV. Однако, hRSV индуцирует СРЕ, начиная примерно с 4 суток. СРЕ характеризовался образованием синцития, после чего клетки демонстрировали быстрое внутреннее разрушение с последующим их отделением от монослоя. Для некоторых изолятов наблюдение СРЕ представляло затруднение и, для подтверждения присутствия вируса в данных культурах, применяли IFA. Культура вируса MPV Субконфлуэнтный монослой клеток tMK в среде, как описано выше, инокулировали супернатантами образцов с зарегистрированным после второго или третьего пассажа в 24-луночных планшетах СРЕ. Культуры ежедневно контролировали на предмет наличия СРЕ, а среду меняли один раз в неделю. Поскольку СРЕ отличается у каждого изолята, все культуры с 12 по 14 сутки проверяли непрямым IFA с антителами хорька против новых вирусных изолятов. Позитивные культуры три раза подвергали замораживанию-оттаиванию, после чего очищали супернатанты посредством низкоскоростного центрифугирования, разделяли и хранили замороженными при -70 С. Дозы вируса 50% инфицирования тканевых культур (TCID50) в супернатантах культур определяли, как описано 16. Характеристика вируса Анализы гемагглютинации и тесты чувствительности к хлороформу проводили, следуя хорошо отработанным и описанным способам, применяемым в данной области 14. Для анализов посредством ЕМ,вирус концентрировали из супернатантов инфицированных клеточных культур в микроцентрифуге при 4 С при 17000 х g, после чего осадок ресуспендировали в PBS и проверяли посредством негативной контрастной ЕМ. Выявление антигена посредством непрямого IFA Собранные образцы обрабатывали, как описано, а осадок образцов распределяли на предметном стекле для многих образцов. После сушки, клетки 1 мин фиксировали в ацетоне при комнатной температуре. Альтернативно, вирус культивировали на клетках tMK в 24-луночных направляющих, содержащих предметные стекла. Данные предметные стекла отмывали в PBS и 1 мин фиксировали в ацетоне при комнатной температуре. После отмывки в PBS предметные стекла инкубировали 30 мин при 37 С с поликлональными антителами, разведенными в PBS от 1:50 до 1:100. Для получения поликлональных антител авторы настоящего изобретения использовали иммунизированных хорьков и морских свинок, но данные антитела можно активировать у других млекопитающих, а рабочее разведение поликлональных антител может варьировать для каждой иммунизации. После трех отмывок в PBS и одной в проточной воде, предметные стекла инкубировали 30 мин при 37 С с козьими антителами против антител хорька меченными FITC (KPL,Guilford, UK, разведенные в 40 раз). После трех отмывок в PBS и одной в проточной воде предметные стекла помещали в раствор глицерин/PBS (Citifluor, UKC, Canterbury, UK) и покрывали. Предметные стекла анализировали с применением флуоресцентного микроскопа Axioscop (Carl Zeiss B.V, Weesp, theNetherlands). Выявление антител у людей, млекопитающих, жвачных или других животных посредством непрямого IFA Для выявления специфичных для вируса антител, инфицированные клетки tMK с MPV фиксировали с ацетоном на покровных стеклах (как описано выше), отмывали в PBS и инкубировали 30 мин при 37 С с образцами сывороток в разведении от 1 до 16. После двух отмывок в PBS и одной в проточной- 22006879 воде, предметные стекла инкубировали 30 мин при 37 С с меченными FITC вторичными антителами к виду (Dako). Предметные стекла обрабатывали, как описано выше. Антитела можно метить флуоресцентным красителем непосредственно, что приведет к прямому иммунофлуоресцентному анализу. FITC можно заменить любым флуоресцентным красителем. Иммунизация животных Для вновь обнаруженных вирусов получили специфичную антисыворотку хорьков и морских свинок посредством экспериментального интраназального инфицирования двух хорьков и двух морских свинок, не инфицированных специфичным патогенным микроорганизмом и содержавшихся в отдельных герметичных стерильных камерах с перчатками. Две-три недели спустя у всех животных забрали кровь посредством сердечной пункции и их сыворотки использовали в качестве сывороток сравнения. Сыворотки тестировали на предмет наличия всех ранее описанных вирусов посредством непрямого IFA как описано ниже. Другие виды животных также подходят для получения препаратов специфичных антител,а также можно применять другие антигенные препараты. Анализ нейтрализации вируса Анализы VN проводили серийными двукратными разведениями сывороток человека и животных,начиная с восьмикратного разведения. Перед инокуляцией клеток tMK, растущих в 96-луночных планшетах, разведенные сыворотки инкубировали один час со 100 TCID50 вируса, после чего планшеты центрифугировали при 840 х g. Применяли ту же среду, как и описанная выше. Среду меняли на третьи и шестые сутки, a IFA проводили через 8 суток после (см. выше). Титр VN определяли как наибольшее разведение образца сыворотки, приводящее к негативному результату в IFA и ингибирующее СРЕ в клеточных культурах. Выделение РНК РНК выделяли из супернатантов инфицированных клеточных культур или фракций сахарозного градиента, применяя набор High Pure RNA Isolation, по инструкциям производителя (Roche Diagnostics,Almere, The Netherlands). РНК можно выделять другими способами, общеизвестными в данной областиRNAsin (Promega, Leiden, the Netherlands), 10 единиц AMV RT (Promega, Leiden, the Netherlands) , 5 единиц Amplitaq Gold DNA polymerase (PE Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel, The Netherlands) и 5 мкл РНК. Условия цикла представляли собой однократную инкубацию 45 мин при 42 С и 7 мин при 95 С,повторенные 40 раз 1 мин при 95 С, 2 мин при 42 С и 3 мин при 72 С и однократную инкубацию 10 мин при 72 С. Для диагностической PCR применяли следующие праймеры: Для нуклеопротеина: N3(5'-GCACTCAAGAGATACCCTAG-3') и N4(5'-AGACTTTCTGCTTTGCTGCCTG-3'), амплифицируя фрагмент, состоящий из 151 нуклеотида. Для матриксного белка: М 3 (5'CCCTGACAATAACCACTCTG-3') и М 4 (5'-GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC3'), амплифицируя фрагмент, состоящий из 252 нуклеотидов. Для белка полимеразы: L6 (5'-CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3') и L7 (5'-CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3'), амплифицируя фрагмент, состоящий из 173 нуклеотидов. На основе последовательностей MPV можно подобрать другие праймеры, а также, для конкретных целей,можно использовать другие буферы и условия анализа. Анализ последовательности Анализы последовательности проводили с применением набора Dyenamic ET terminator sequencing(PE Biosystem). Все способы проводили по инструкциям производителя. У фрагментов после PCR прямым способом определили последовательность с теми же олигонуклеотидами, что и для PCR или фрагменты очищали из геля посредством набора Qiaquick Gel Extraction (Qiagen, Leusden, The Netherlands),клонировали в векторе pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, The Netherlands) по инструкциям производителя, а потом определяли последовательность со специфичными для М 13 олигонуклеотидами. Применяемые для анализа 3'-конца генома (отсутствие NS1/NS2) олигонуклеотиды Основываясь на опубликованных Randhawa (1997) концевой и лидерной последовательностях hRSV и APV, подобрали праймер TR1 (5'-AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3') , а, основываясь на полученных для белка N последовательностях, подобрали праймер N1 (5'-CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC3'). Анализ RT-PCR и определение последовательности проводили, как описано выше. Результатом RT-PCR являлся продукт длиной примерно 500 пар оснований, являвшийся слишком маленьким, чтобы содержать информацию для двух ORF, а трансляция данных последовательностей не выявила ORF. Выявление антител у людей, млекопитающих, жвачных и других животных посредством ELISA У Paramyxoviridae белок N является наиболее представленным белком, и иммунный ответ на этот белок при инфицировании развивается рано. По этим причинам, для разработки анализа ELISA для выявления антитела к MPV предпочтительно применяют рекомбинантный источник белков N. Антигены,- 23006879 подходящие для выявления антитела, включают любые белки MPV, связывающиеся с любыми специфичными к MPV антителами пациента, подвергавшегося воздействию вируса MPV или инфицированного им. Предпочтительные антигены по изобретению включают антигены, которые преимущественно порождают иммунный ответ у пациентов, подвергавшихся воздействию MPV, и которые, поэтому, наиболее легко узнают антитела пациента. Особенно предпочтительные антигены включают белки N, F и G изMPV. Антигены, применяемые в иммунологических способах, могут являться нативными или модифицированными. Для изменения аминокислотной последовательности антигена MPV, с целью получения модифицированного варианта антигена, который можно использовать в иммунологических способах,можно применять общеизвестные способы молекулярной биологии. Способы клонирования генов, перемещения генов в экспрессирующие вектора и из них и экспрессии белка, кодируемого геном в гетерологичном хозяине, общеизвестны, и данные способы можно применять для предоставления экспрессирующих векторов, клеток-хозяев и клонированных для экспрессии генов, кодирующих антигены у хозяина для получения рекомбинантных антигенов для использования в диагностических анализах. См., например, Molecular cloning, A laboratory manual and Current Protocols inMolecular Biology. Для получения антигенов MPV можно применять множество экспрессирующих систем. Например,для получения белков в E.coli, В.subtilis, дрожжах, клетках насекомых и млекопитающих описано множество подходящих экспрессирующих векторов, любой из которых можно применять для получения антигена MPV, подходящего для выявления антител против MPV у подвергшихся воздействию пациентов. Бакуловирусная экспрессирующая система обладает преимуществом, предоставляя необходимую обработку белков, и поэтому предпочтительна. Система использует промотор полиэдрина для непосредственной экспрессии антигенов MPV (Matsuura et al., 1987, J.Gen.Virol.68: 1233-1250). Антигены, получаемые посредством рекомбинантных бакуловирусов, можно применять во множестве иммунологических анализов для выявления антител против MPV у пациента. Доказано, что рекомбинантные антигены можно использовать вместо настоящих вирусов практически в любом иммунологическом анализе для выявления антител, специфичных к вирусу. Анализы включают прямой и непрямой анализы, сэндвич-анализы, анализы в твердой фазе, такие, наряду с другими, как анализы с применением планшетов или бус и анализы в жидкой фазе. Подходящие анализы включают анализы, в которых применяют первичные и вторичные антитела, и анализы, в которых применяют связывающие реагенты, такие как белок А. Более того, множество способов выявления, которые можно применять по изобретению,включают способы, использующие колориметрию, флуоресценцию, фосфоресценцию, хемилюминесценцию, люминесценцию и радиоактивность. Пример 1. Непрямой EIA с IgG против MPV с применением белка N. Применяя белок N (получаемый посредством бакуловируса у клеток Sf9 насекомых) как антиген,можно провести непрямой EIA с IgG. Для получения антигена клетки Sf9 инфицировали рекомбинантным бакуловирусом и собирали на 3-7 сутки после инфицирования. Клеточную суспензию дважды отмывали в PBS, рН 7,2, доводя плотность клеток до 5,0 х 105 клеток/мл, и три раза подвергали замораживанию-оттаиванию. Большие обломки клеток осаждали посредством низкоскоростного центрифугирования(15 мин при 500 х g), а супернатанты собирали и до применения хранили при -70 С. Неинфицированные клетки обрабатывали сходным образом для отрицательного контроля антигена. Для покрытия планшетов для микротитрования использовали 100 мкл лизата, обработанного замораживанием-оттаиванием, в разведениях в диапазоне от 1:50 до 1:1000. Неинфицированные клеточные лизаты вносили в спаренные лунки, где они служили отрицательным контролем. После ночной инкубации, планшеты дважды отмывали в PBS/0,05% Tween. Тестовые сыворотки разводили в соотношениях от 1:50 до 1:200 в буфере для ELISA (PBS, дополненный до содержания 2% нормальной козьей сыворотки,0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% коровьего молока), с последующей инкубацией лунок 1 час при 37 С. Планшеты дважды отмывали в PBS/0,05% Tween. В лунки добавляли козьи IgG против антител человека (или против антител других видов), меченные пероксидазой хрена и разведенные в соотношении от 1:3000 до 1:5000 в буфере для ELISA, и инкубировали 1 час при 37 С. Планшеты дважды отмывали вPBS/0,05% Tween и один раз в проточной воде, инкубировали с субстратом фермента ТМВ, 3,3',5,5'тетраметилбензидином, например, полученным из Sigma, 15 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию 100 мкл 2 М фосфорной кислоты. Чтение результата посредством колориметрического измерения проводили при 450 нм с применением автоматического устройства для анализа планшетов для микротитрования. Пример 2. EIA захвата IgM против MPV с применением рекомбинантного нуклеопротеина.EIA захвата IgM против MPV с применением рекомбинантного нуклеопротеина или любого другого рекомбинантного белка в качестве антигена можно проводить посредством модификации ранее описанных Erdman et al. (1990) J. Clin. Microb. 29: 1466-1471 анализов. В лунки планшета для микротитрования, в 0,1 М карбонатный буфер с рН 9,6, добавляли аффинноочищенное захватывающее антитело против IgM человека (или против антител других видов), например- 24006879 полученное из Dako в концентрации 250 нг на лунку. После ночной инкубации при комнатной температуре планшеты дважды отмывали в PBS/0,05% Tween. 100 мкл тестовой сыворотки, разведенной в соотношениях от 1:200 до 1:1000 в буфере для ELISA, вносили в лунки из расчета три лунки на образец и инкубировали 1 ч при 37 С. Затем планшеты дважды отмывали в PBS/0,05% Tween. Лизат клеток Sf21 (инфицированный рекомбинантным вирусом), обработанный замораживаниемоттаиванием и разведенный в диапазоне от 1:100 до 1:500 в буфере для ELISA, внесли в лунки и инкубировали 2 ч при 37 С. Неинфицированный лизат клеток служил отрицательным контролем, и его вносили в спаренную лунку. Затем планшеты трижды отмывали в PBS/0,05% Tween и инкубировали со 100 мкл поликлональных антител против MPV в оптимальном разведении в буфере для ELISA 1 ч при 37 С. После двух отмывок в PBS/0,05% Tween планшеты инкубировали с вторичными антителами (такими как антитела кролика против антител хорька), меченными пероксидазой хрена 20 мин при 37 С. Затем планшеты пять раз отмывали в PBS/0,05% Tween, инкубировали с субстратом фермента ТМВ, 3,3',5,5'-тетраметилбензидином, например, полученным из Sigma, 15 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию 100 мкл 2 М фосфорной кислоты. Чтение результата посредством колориметрического измерения проводили при 450 нм с применением автоматического устройства для анализа планшетов для микротитрования. Чувствительность EIA захвата IgM против MPV с применением рекомбинантного нуклеопротеина(или другого рекомбинантного белка) и целого вируса MPV определяли путем сравнения пар сывороток пациентов с клинической инфекцией MPV в острой фазе и фазе выздоровления. Специфичность EIA захвата рекомбинантного нуклеопротеина определяли посредством тестирования образцов сыворотки здоровых субъектов и субъектов с другими видами парамиксовирусной инфекции. Возможности EIA для использования белка слияния и гликопротеина, получаемых экспрессией бакуловирусов Гликопротеины G и F являются двумя трансмембранными оболочечными гликопротеинами вириона MPV и представляют собой главные антигены для нейтрализации и защитные антигены. Экспрессия данных гликопротеинов в системе вирусного вектора, такой как бакуловирусная система, предоставляет источник рекомбинантных антигенов для применения в анализах выявления антител, специфичных кMPV. Более того, их применение в комбинации с нуклеопротеином, например, дополнительно усиливает чувствительность ферментного иммунологического анализа при выявлении антител против MPV. Как альтернативные описанным здесь способам можно применять множество других иммунологических анализов (Current Protocols in Immunology). Для того чтобы обнаружить вирусные изоляты, можно также изучать назофарингеальные аспираты,глоточные и назальные мазки, бронхоальвеолярные смывы и глоточные мазки предпочтительно людей,плотоядных (собак, кошек, тюленей и т.п.), лошадей, жвачных (крупного рогатого скота, овец, коз и т.п.),свиней, кроликов, птиц (домашней птицы, страусов), но не ограничиваясь ими. У птиц также можно изучать мазки из клоаки и помет. Для всех примеров для обнаружения вируса можно применять серологические способы (выявление антитела или антигена и т.п.), способы для выделения вируса и способы для выявления нуклеиновой кислоты. Моноклональные антитела можно получать посредством иммунизации мышей (или других животных) очищенным MPV или его частями (белки, пептиды) с последующим применением хорошо разработанной гибридомной технологии (Current Protocols in Immunology). Альтернативно, для данной цели можно применять технологию фагового дисплея (Current Protocols inImmunology). Подобным образом поликлональные антитела можно получать от инфицированных людей или животных, или от иммунизированных людей или животных (Current Protocols in Immunology). Выявление присутствия или отсутствия белков NS1 и NS2 можно проводить, применяя вестернблоттинг, IFA, способы иммунопреципитации с использованием множества препаратов антител. Выявление присутствия или отсутствия в вирусных изолятах генов белков NS1 и/или NS2 или их гомологов можно проводить, применяя PCR с наборами праймеров подобранных на основании известных геновNS1 и NS2, а также множеством способов гибридизации нуклеиновой кислоты. Для определения возможного присутствия генов NS1 и NS2 на 3'-конце вирусного генома можно проводить PCR с праймерами, специфичными к 3'-концу генома. В данном случае авторы настоящего изобретения использовали праймер, специфичный к 3'-нетранслируемой области вирусного генома и праймер к ORF для N. Для той же цели можно подобрать другие праймеры. Отсутствие генов NS1/NS2 выявляют посредством определения длины и/или определения последовательности продукта PCR. С целью сделать возможной положительную идентификацию присутствия генов NS1 или NS2 можно использовать праймеры, специфичные к генам NS1 и/или NS2, в комбинации с праймерами, специфичными к другим частям 3'-конца вирусного генома (таким как нетранслируемая область или ORF для N, М или F). Кроме того, для той же цели можно применять множество способов, таких как молекулярное клонирование и гибридизация нуклеиновой кислоты. Пример 3. Различные серотипы/подгруппы MPV. Посредством анализов нуклеотидных последовательностей ORF для N, M, F и L 9 вирусных изолятов выявлены два потенциальных генных кластера. Идентичность нуклеотидов в пределах кластера наблюдали в размере 90-100%, а между подгруппами идентичность наблюдали в пределах 81-88%. Инфор- 25006879 мация о последовательности, полученная из большого количества вирусных изолятов, подтвердила существование двух генотипов. Вирусный изолят ned/00/01 как прототип для кластера А и вирусный изолят ned/99/01 как прототип для кластера В использовали для анализов перекрестной нейтрализации для проверки возможной связи генотипов с различными серотипами или подгруппами. Результаты Применяя анализы RT-PCR с праймерами, расположенными в области гена полимеразы, из образцов назофарингеальных аспиратов авторы настоящего изобретения идентифицировали 30 дополнительных вирусных изолятов. Информация о последовательности частей генов матриксного белка и полимеразы данных новых изолятов, вместе с информацией о последовательности частей генов матриксного белка и полимеразы предыдущих 9 изолятов использовали для конструирования филогенетических деревьев(фиг. 16). Анализы данных деревьев подтвердили наличие двух генетических кластеров, с вирусным изолятом ned/00/01 как прототип для кластера А и вирусным изолятом ned/99/01 как прототип для кластера В. Идентичность нуклеотидной последовательности в пределах групп составляла более чем 92%, тогда как между кластерами идентичность составляла 81-85%. Вирусные изоляты ned/00/01 и ned/99/01 использовали для инокуляции хорькам с целью активации вирусоспецифичных антисывороток. Данные антисыворотки использовали в анализах нейтрализации вируса с обоими вирусами. Таблица 3. Титры нейтрализации вируса Для изолята 00-1 титр отличается в 32 (64/2) раза. Для изолята 99-1 титр отличается в 16 (64/4) раз. Кроме того, по 6 морских свинок инокулировали одним из вирусов (ned/00/01 и ned/99/01). АнализыRT-PCR образцов назофарингеальных аспиратов выявили репликацию вируса со 2 до 10 суток после инфицирования. На 70 сутки после инфицирования у морских свинок провоцировали иммунный ответ как на гомологичный, так и гетерологичный вирус, и для всех четырех случаев отмечена репликация вируса. Таблица 4 Заметка: морских свинок 2 и 9 не подвергали вторичному инфицированию. Анализы нейтрализации вируса с антисыворотками после первой провокации иммунного ответа выявили существенно схожие результаты, как и в анализах VN, проводившихся у хорьков (отличие в титре в VN 16 раз). Результаты, представленные в данном примере, подтверждают существование двух генотипов, соответствующих двум серотипам MPV, и демонстрируют возможность повторного инфицирования гетерологичным и гомологичным вирусами. Пример 4. Дополнительное определение последовательности. Данный пример описывает дополнительный анализ последовательностей открытых рамок считывания (ORF) и межгенных последовательностей у MPV, а также неполных последовательностей концов генома.- 26006879 Анализы последовательностей генов нуклеопротеина (N) , фосфопротеина (Р) , матриксного белка(М) и белка слияния (F) MPV выявляют высочайшую степень гомологии с серотипом С APV, пневмовирусом птиц, первично обнаруженным в Соединенных Штатах. Данные анализы также выявили отсутствие неструктурных белков NS1 и NS2 на 3'-конце вирусного генома и расположение белка слияния непосредственно рядом с матриксным белком. Здесь авторы настоящего изобретения предлагают последовательности генов белка 22 К (М 2), малого гидрофобного белка (SH), белка прикрепления (G) и белка полимеразы (L), последовательность межгенных областей и концевую последовательность. В комбинации с последовательностями, описанными ранее, последовательности, предлагаемые здесь, завершают последовательность генома MPV, за исключением крайних 12-15 нуклеотидов концов генома и определяют геномную организацию MPV. Попарное сравнение последовательностей генома MPV с последовательностями геномов подтипов А, В и С APV, подтипов А и В RSV, PVM и других парамиксовирусов представляет веское доказательство систематизации MPV в род Metapneumovirus. Результаты Стратегия определения последовательности Изолят MPV 00-1 (van den Hoogen et al., 2001) размножали в третичных клетках почки обезьяны(tMK), а РНК выделяли из супернатанта на 3 неделе после инокуляции и использовали как матрицу для анализов RT-PCR. Праймеры подобрали на основании информации о частичной последовательности,доступной для MPV 00-1 (van den Hoogen et al., 2001), а также лидерной и концевой последовательностейAPV и RSV (Randhawa et al., 1997; Mink et al., 1991). Исходно, посредством амплификации RT-PCR, получили фрагменты между ранее полученными продуктами, в диапазоне длин от 500 п.н. до 4 т.п.н. и точно определили последовательность. Геномную последовательность впоследствии подтвердили посредством получения серии перекрывающихся фрагментов RT-PCR в диапазоне от 500 до 800 п.н., представляющих весь геном MPV. Для минимизации ошибок амплификации и определения последовательности у всех фрагментов PCR определяли точную последовательность обеих цепей. Нуклеотидную и аминокислотную последовательности применяли для поиска гомологии последовательности в базе данных Genbank с применением программного обеспечения BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Названия белкам приписывали открытым рамкам считывания (ORF), основываясь на гомологии с известными вирусными генами, а также на их положении в геноме. Основываясь на данной информации, создали геномную карту MPV (фиг. 7). Геном MPV состоит из 13378 нуклеотидов и его организация подобна геномной организации APV. Ниже авторы настоящего изобретения представляют сравнение ORF и некодирующих последовательностей MPV и ORF и некодирующих последовательностей других парамиксовирусов и обсуждают основные сходства и отличия. Ген нуклеопротеина (N) Как показано, первый ген на геномной карте MPV кодирует белок из 394 аминокислот и обладает большой гомологией с белком N других парамиксовирусов. Длина ORF для N идентична длине ORF дляN у APV-C (табл. 5) и меньше чем длина ORF для N других пневмовирусов (Barr et al., 1991). Анализ аминокислотной последовательности выявил высочайшую гомологию с APV-C (88%) и только 7-11% с другими парамиксовирусами (табл. 6).Barr et al. (1991) идентифицировали 3 области сходства между вирусами, принадлежащими к порядку Mononegavirales: А, В и С (фиг. 8). Хотя сходство наиболее высоко в пределах вирусного семейства, в различных семействах вирусов данные области являются высоко консервативными. Во всех трех областях MPV выявлена идентичность аминокислот в размере 97% с APV-C, 89% - с APV-B, 92% - сAPV-A и 66-73% - с RSV и PVM. Область между аминокислотными остатками 160 и 340 оказывается высоко консервативной у метапневмовирусов и, несколько в меньшей степени, у Pneumovirinae (Miyahara et al., 1992; Li et al., 1996; Barr et al., 1991). Данная конкретная область, обнаруживающая 100% сходства с APV-C, находится в согласии с тем, что MPV представляет собой метапневмовирус. Ген фосфопротеина (Р). Вторая ORF геномной карты кодирует белок из 294 аминокислот, проявляющий гомологию по последовательности в размере 68% аминокислот с белком Р APV-C и только 22-26% с белком Р RSV (табл. 6). Ген Р MPV содержит одну дополнительную ORF и в этом отношении подобен генам Р многих других парамиксовирусов (рассмотрено у Lamb and Kolakofsky, 1996; Sedlmeier et al., 1998). В противоположность APV-A и -В и PVM и подобно RSV и APV-C в ORF для Р у MPV отсутствуют остатки цистеина. Ling (1995) предположил, что область высокого подобия у всех пневмовирусов(аминокислоты 185-241) играет роль или в процессе синтеза РНК или поддержании структурной целостности нуклеокапсидного комплекса. Данная область высокого подобия также обнаружена у MPV (фиг. 9), конкретно, когда в расчет берут консервативные замены, демонстрируя 100% подобия с APV-C, 93% с APV-A и В и примерно 81% с RSV. С-конец белка Р MPV богат глутаминовыми остатками, как описано у вирусов APV (Ling et al., 1995). Ген матриксного белка (М) Третья ORF в геноме MPV кодирует белок из 254 аминокислот, соответствующий ORF других пневмовирусов. ORF для М у MPV обладает в точности таким же размером как ORF для М других пневмовирусов (табл. 5) и обладает значительной гомологией с матриксными белками APV (78-87%), мень- 27006879 шей гомологией с матриксными белками RSV и PVM (37-38%) и гомологией в размере 10% или менее с матриксными белками других пневмовирусов (таблица 6).Easton (1997) сравнил последовательности матриксных белков всех пневмовирусов и обнаружил консервативный гексапептид из остатков с 14 по 19, который также консервативен у MPV (фиг. 10). ДляRSV, PVM и APV идентифицированы малые вторичные ORF в пределах главной ORF для М или перекрывающиеся с ней (52 аминокислоты и 51 аминокислота у bRSV, 75 аминокислот у RSV, 46 аминокислот у PVM и 51 аминокислота у APV) (Yu et al., 1992; Easton et al., 1997; Samal et al., 1991; Satake et al.,1984). Авторы настоящего изобретения заметили две малых ORF в ORF для М у MPV. Одну малую ORF из 53 аминокислотных остатков обнаружили в пределах главной ORF для М (фрагмент 1, фиг. 7), начиная от нуклеотида 2281, а другую малую ORF из 33 аминокислотных остатков обнаружили перекрывающуюся с главной ORF для М, начиная с нуклеотида 2893 (фрагмент 2, фиг. 7). Подобно вторичным ORFRSV и APV значимой гомологии вторичных ORF с вторичными ORF других пневмовирусов не обнаружено, а также отсутствуют видимые сигналы начала и окончания транскрипции. Кроме того, доказательства синтеза белков, соответствующих данным вторичным ORF APV и RSV, отсутствуют. Ген белка слияния (F)ORF для F у MPV расположена рядом с ORF для М, что характерно для представителей родаMetapneumovirus. Ген F у MPV кодирует белок из 539 аминокислот, что на два аминокислотных остатка больше чем F у APV-C (табл. 5). Анализ аминокислотной последовательности выявил 81% гомологии сAPV-C, 67% с APV-A и В, 33-39% с белками F пневмовирусов и только 10-18% с другими парамиксовирусами (табл. 6). Одним из консервативных признаков у белков F парамиксовирусов, которую также наблюдали у MPV, является расположение цистеиновых остатков (Morrison, 1988; Yu et al., 1991). Метапневмовирусы обладают 12 остатками цистеина в F1 (7 являются консервативными у всех парамиксовирусов) и двумя в F2 (1 является консервативным у всех парамиксовирусов). Из 3 возможных участков Nсвязанного гликозилирования, представленных в ORF для F у MPV, ни один не является общим с RSV и два (позиции 74 и 389) являются общими с APV. Третий, уникальный, участок возможного W-связанного гликозилирования расположен в позиции 206 (фиг. 11). Несмотря на низкую гомологию последовательности с другими парамиксовирусами, белок F MPV обнаруживает типичные характеристики белка слияния, согласующиеся с характеристиками, описанными для белков F других представителей семейства Paramyxoviridae (Morrison, 1988). Белки F представителей Paramyxoviridae синтезируются в виде неактивных предшественников (F0), расщепляемых посредством протеаз клетки-хозяина, образующих N-концевые субъединицы F2 и большие С-концевые субъединицы F1. Предполагаемый участок расщепления (Collins et al., 1996) консервативен у всех представителей семейства Paramyxoviridae. Участок расщепления у MPV содержит остатки RQSR. Оба аргининовых (R) остатка являются общими с APV и RSV, но глутаминовый (Q) и сериновый (S) остатки являются общими с другими парамиксовирусами, такими как вирус парагриппа человека типа 1, вирус Сендай и морбилливирусы (данные не показаны). Полагают, что N-концевая гидрофобная область F1 функционирует как мембранный домен слияния и показывает высокое сходство последовательности у парамиксовирусов и морбилливирусов и, в меньшей степени, у пневмовирусов (Morrison, 1988). Данные 26 остатков (позиции 137-163, фиг. 11) консервативны у MPV и APV-C, что является в согласии с тем, что данная область является высоко консервативной у метапневмовирусов (Naylor et al., 1998; Seal et al., 2000). Как видно для субъединиц F2 у APV и других парамиксовирусов, MPV обнаруживает делецию 22 аминокислотных остатков в сравнении с RSV (позиции 107-128, фиг. 11). Более того, для RSV и APV,обнаружено, что сигнальный пептид и якорный домен являются консервативными в пределах подтипов и высоко вариабельны между подтипами (Plows et al., 1995; Naylor et al., 1998). Сигнальный пептид MPV(аминокислоты 10-35, фиг. 11) на N-конце F2 демонстрирует некоторое сходство с последовательностью с APV-C (18 из 26 аминокислотных остатков являются сходными) и меньшую консервативность с другими видами APV или RSV. Гораздо большую вариабельность наблюдают в мембранном якорном домене на карбоксильном конце F1, хотя некоторая гомология с APV-C еще видна. Белок 22 К (М 2) Ген М 2 уникален для Pneumovirinae и для всех пневмовирусов наблюдали две перекрывающиесяORF. Первая главная ORF соответствует белку М 2-1, который усиливает процессивность вирусной полимеразы (Collins et al., 1995; Collins, 1996) и прохождение ею межгенных областей (Hardy et al., 1998;Fearns et al., 1999). Ген М 2-1 у MPV, расположенный рядом с геном F, кодирует белок из 187 аминокислот (табл. 5) и обнаруживает наивысшую (84%) гомологию с М 2-1 у APV-C (табл. 6). Сравнение всех пневмовирусных белков М 2-1 выявило наибольшую консервативность N-концевых частей белка (Collinset al., 1990; Zamora et al., 1992; Ahmadian et al., 1999), что находится в согласии с наблюдением, что MPV обнаруживает 100% сходство с APV-C первых 80 аминокислотных остатков белка (фиг. 12 А). Белок М 21 у MPV содержит 3 цистеиновых остатка, расположенных в пределах первых 30 аминокислотных остатков, что является консервативным у всех пневмовирусов. Такая концентрация цистеиновых остатков часто обнаруживается у связывающих цинк белков (Ahmadian et al., 1991; Cuesta et al., 2000).- 28006879 Вторичные ORF (M2-2), перекрывающиеся с М 2-1 ORF пневмовирусов, являются консервативными по расположению, но не по последовательности, и, как считается, вовлечены в контроль переключения между репликацией вирусной РНК и транскрипцией (Collins et al., 1985; Elango et al., 1985; Baybutt et al.,1987; Collins et al., 1990; Ling et al., 1992; Zamora et al., 1992; Alansari et al., 1994; Ahmadian et al., 1999;Bermingham et al., 1999). У MPV ORF для М 2-2 начинается с 512 нуклеотида ORF для М 2-1 (фиг. 7), что является точно такой же стартовой позицией, как у APV-C. Длины ORF для М 2-2 являются одинаковыми для APV-C и MPV и составляют 71 аминокислотный остаток (табл. 5). Сравнение последовательностиORF для М 2-2 (фиг. 12 В) выявило 64% гомологию аминокислотных последовательностей у MPV и APVC и только 44-48% гомологию аминокислотных последовательностей у MPV и APV-A и В (табл. 6).ORF малого гидрофобного белка (SH) Ген, располагающийся рядом с М 2 у hMPV, возможно кодирует белок SH из 183 аминокислот (фиг. 1 и 7). Видимой идентичности последовательности у данной ORF с другими вирусными генами или продуктами генов РНК не обнаружено. Это не является неожиданным, так как сходство последовательностей у белков SH пневмовирусов, как правило, невелико. Предполагаемая ORF для SH у hMPV является длиннейшей ORF для SH, известной до настоящего времени (табл. 1). Аминокислотный состав ORF дляSH относительно схож с аминокислотным составом APV, RSV и PVM с высоким процентом содержания остатков треонина и серина (22%, 18%, 19%, 20,0%, 21% и 28% у hMPV, APV, RSV A, RSV В, bRSV andPVM, соответственно). ORF для SH у MPV содержит 10 цистеиновых остатков, тогда как SH у APV содержит 16 цистеиновых остатков. ORF для SH у MPV обладает двумя участками возможного Nсвязанного гликозилирования (аминокислоты 76 и 121), тогда как APV - одним, RSV - двумя или тремя иPVM - четырьмя. Профили гидрофобности предполагаемого белка SH у hMPV, и SH у APV и RSV выявили одинаковые структурные особенности (фиг. 7 В). ORF для SH у APV и у hMPV обладают гидрофильным Nконцом, центральным гидрофобным доменом, который может служить в качестве возможного трансмембранного домена (аминокислоты 30-53 для hMPV), вторым гидрофобным доменом (аминокислоты 155170) и гидрофильным С-концом. Напротив, в SH у RSV обнаружено отсутствие С-концевой части ORF из APV и MPV. У всех пневмовирусов гидрофобные домены белков SH фланкируются основными аминокислотными остатками, которые также обнаружены в ORF для SH у hMPV (аминокислоты 29 и 54).ORF для G у hMPV расположена рядом с геном SH и кодирует белок из 236 аминокислот (нуклеотиды 6262-6972, фиг. 1). Обнаруженная вторичная малая ORF, расположенная непосредственно вслед за данной ORF, потенциально кодирует 68 аминокислотных остатков (нуклеотиды 6973-7179), но у нее отсутствует стартовый кодон. Третья возможная ORF во второй рамке считывания из 194 аминокислотных остатков перекрывается с обеими из данных ORF, но также не обладает стартовым кодоном (нуклеотиды 6416-7000). Данная ORF, следующая за возможной четвертой ORF в той же рамке считывания, состоящая из 65 аминокислотных остатков (нуклеотиды 7001-7198), снова не обладает стартовым кодоном. Наконец, в третьей рамке считывания (нуклеотиды 6444-6737, фиг. 1) обнаружена потенциальная ORF из 97 аминокислотных остатков (но не обладающая стартовым кодоном). В отличие от первой ORF, другиеORF не имеют видимых последовательностей начала или конца гена (см. ниже). Хотя 236 аминокислотных остатков ORF для G, вероятно, представляют по меньшей мере часть белка прикрепления hMPV,нельзя исключить, что дополнительные кодирующие последовательности экспрессируются в виде отдельных белков или как часть белка прикрепления вследствие некоторого события, изменяющего РНК. Следует заметить, что у APV и RSV не идентифицировали вторичных ORF после первичной ORF для G,но и APV и RSV обладают вторичными ORF в пределах главной ORF для G. Однако доказательство экспрессии этих ORF отсутствует, а также не существует гомологии расчетной аминокислотной последовательности у различных вирусов (Ling et al., 1992). Во вторичных ORF для G у hMPV не обнаружили особенностей других белков G, а чтобы выяснить, экспрессируются ли дополнительные ORF, нужно провести дополнительные исследования. Анализ BLAST со всеми ORF не выявил заметной гомологии с другими известными вирусными генами или продуктами генов на уровнях нуклеотидов или аминокислотной последовательности. Это согласуется с низкими процентами гомологии последовательности, найденными для других белков G, таких как hRSV А и В (53%) (Johnson et al., 1987) и APV А и В (38%) (Juhasz and Easton, 1994). Тогда как большинство ORF у hMPV имеют сходство с ORF у APV как по длине, так и по последовательности, возможная ORF для G из 236 аминокислотных остатков значительно меньше, чем ORF дляG у APV (табл. 1). Аминокислотная последовательность обнаруживает содержание серина и треонина в размере 34%, что даже выше, чем 32% у RSV и 24% у APV. Возможная ORF для G также содержит 8,5% пролиновых остатков, что выше, чем 8% у RSV и 7% у APV. Необычное изобилие пролиновых остатков в белках G у APV, RSV и MPV также наблюдали у гликопротеинов слизистого происхождения, где они являлись главной детерминантой третичной структуры белков (Collins and Wertz, 1983; Wertz et al., 1985;Jentoft, 1990). ORF для G у hMPV содержит пять потенциальных участков N-связанного гликозилирования, тогда как у hRSV их 7, у bRSV - 5 и у APV - от 3 до 5.- 29006879 Предсказанный профиль гидрофобности G у MPV выявил особенности, сходные с другими пневмовирусами. N-концы содержат гидрофильную область, за которой следует короткая гидрофобная зона(аминокислоты 33-53 для hMPV) и преимущественно гидрофильный карбоксильный конец (фиг. 14 В). Такая общая организация согласуется с организацией заякоренных трансмембранных белков II типа и хорошо соответствует данным областям белков G у APV и RSV. Возможная ORF для G у hMPV содержит только 1 цистеиновый остаток, в отличие от RSV и APV (5 и 20 соответственно). Известно, что только две из четырех вторичных ORF в гене G содержат один дополнительный цистеиновый остаток и что данные четыре возможных ORF содержат 12-20% сериновых и треониновых и 6-11% пролиновых остатков. Ген полимеразы (L) Аналогично другим вирусам с "минус"-цепью, последняя ORF генома MPV является компонентом РНК-зависимой РНК полимеразы комплексов репликации и транскрипции. Ген L у MPV кодирует белок из 2005 аминокислот, который на 1 остаток длиннее, чем данный белок у APV-A (табл. 5). Белок L уMPV проявляет гомологию по последовательности в размере 64% с APV-A, 42-44% -с RSV и приблизительно 13% с другими парамиксовирусами (табл. 6). Poch et al. (1989; 1990) идентифицировали шесть консервативных доменов в белках L несегментированных РНК-вирусов с "минус"-цепью, из которых домен III включает четыре мотива ядра полимеразы, которые, как считается, являются основными для функционирования полимеразы. Данные мотивы (А, В, С и D) являются в высокой степени консервативными в белке L у MPV: по мотивам А, В и С MPV обладает 100% сходством со всеми пневмовирусами, а по мотиву D MPV обладает 100% сходством с APV и 92% - с вирусами RSV. Для целого домена III (аминокислоты 627-903 в ORF для L) MPV обладает гомологией с APV в размере 77%, с RSV - 61-62% и с другими парамиксовирусами - 23-27% (фиг. 15). В дополнение к мотивам полимеразы, белки L пневмовирусов содержат последовательность, соответствующую консенсусному АТФ-связывающему мотивуK(Х)21GEGAGN(X)20K (Stec, 1991). ORF для L у MPV содержит подобно APV мотив, в котором размещение промежуточных остатков сдвинуто на один: K(X)22GEGAGN(X)19K. Филогенетические анализы Как показатель родства MPV с представителями Pneumovirinae, ранее, основываясь на ORF для N,Р, М и F, сконструировали филогенетические деревья, которые выявили близкое родство MPV с APV-C. Ввиду низкой гомологии генов G и SH у MPV с другими пневмовирусами построить достоверные филогенетические деревьев для данных генов не представлялось возможным. Кроме того, различная организация генома у представителей родов Pneumovirus и Metapneumovirus сделала невозможной создание филогенетических деревьев на основе последовательности целого генома. Поэтому, в дополнение к ранее опубликованным, авторы настоящего изобретения построили филогенетические деревья только для генов М 2 и L. Оба эти дерева подтвердили близкое родство APV и MPV в пределах подсемейства Pneumovirinae (фиг. 16). Некодирующие последовательности MPV Генные контакты генома парамиксовирусов содержат короткие и высококонсервативные последовательности нуклеотидов на начале и конце каждого гена (сигналы начала и конца гена), возможно играющие роль в инициации и терминации транскрипции (Curran et al., 1999). Сравнение межгенных последовательностей всех генов MPV выявило консенсусную последовательность сигнала старта гена дляN, P, M, F, M2 и G: GGGACAAGU (фигура 17 а), которая идентична для консенсусного сигнала старта гена у метапневмовирусов (Ling et al., 1992; Yu et al., 1992; Li et al., 1996; Bayon-Auboyer et al., 2000). Обнаружено, что сигналы старта гена для генов SH и L у MPV немного отличаются от консенсусного (SH:GGGAUAAAU, L: GAGACAAAU). Обнаружено, что сигнал старта гена для L у APV также отличается от консенсусного: AGGACCAAT (APV-A) (Randhawa et al., 1996) и GGGACCAGT (APV-D) (BayonAuboyer et al., 2000). В противоположность схожим последовательностям старта гена у MPV и APV, в межгенных последовательностях MPV не удалось обнаружить консенсусную последовательность конца гена у APV,UAGUUAAUU (Randhawa et al., 1996). Повторяющейся последовательностью, которую нашли во многих генах, исключая межгенные области G-L, и которая, возможно, могла бы действовать в качестве сигнала конца гена, являлась U ААААА U/A/C. Однако так как авторы настоящего изобретения определяли последовательность вирусной РНК раньше, чем последовательность мРНК, определенные сигналы конца гена определить не удалось и, таким образом, необходимы дальнейшие исследования. Межгенные области пневмовирусов изменяются по размеру и последовательности (Curran et al., 1999; Blumberg et al., 1991;Collins et al., 1983). Межгенные области у MPV не обнаруживают гомологии с межгенными областямиAPV и RSV и их размер находится в диапазоне от 10 до 228 нуклеотидов (фиг. 17 В). Межгенная область между ORF для М и F у MPV содержит часть вторичной ORF, которая начинается в первичной ORF для М (см. выше). Межгенная область между SH и G содержит 192 нуклеотида, и, основываясь на присутствии многочисленных терминирующих кодонов во всех трех рамках считывания, не обнаруживает возможности кодирования. Межгенная область между G и L содержит 241 нуклеотид и может включать дополнительные ORF (см. выше). Интересно, что старт ORF для L расположен в данных вторичных ORF. Поскольку ген L у APV не начинается в предшествующей ORF для G, ORF для L у RSV также начинает- 30