Химически модифицированные коньюгаты прогенипоэтина
Формула / Реферат
1. Конъюгат прогенипоэтина, характеризующийся по крайней мере одной молекулой водорастворимого полимера, ковалентно присоединенной по крайней мере к одному аминокислотному остатку биологически активного полипептида прогенипоэтина.
2. Конъюгат прогенипоэтина по п.1, где указанный полимер представляет собой молекулу полиэтиленоксида.
3. Конъюгат прогенипоэтина по п.2, где указанная молекула полиэтиленоксида представляет собой молекулу полиэтиленгликоля.
4. Конъюгат прогенипоэтина по п.3, где полиэтиленгликоль присоединен к аминокислотному остатку, имеющему свободную амино-, карбоксильную или сульфгидрильную группу(-ы).
5. Конъюгат прогенипоэтина по п.4, где указанный полиэтиленгликоль конъюгирован посредством активированного полиэтиленгликоля.
6. Конъюгат прогенипоэтина по п.5, где указанный активированный полиэтиленгликоль выбран из группы, состоящей из паранитрофенила, сукцинимидила, карбонилимидазола, азлактонов, циклических имидтиокетонов, изоцианатов, изотиоцианатов, альдегидов, первичных аминов, гидразина, ацилгидразидов, карбазатов, семикарбаматов, тиокарбазатов, тиолов, малеимидов, сульфонов и фенилглиоксалей.
7. Конъюгат прогенипоэтина по п.6, где указанный активированный полиэтиленгликоль выбран из группы, состоящей из сукцинимидила, карбонилимидазола, альдегидов, ацилгидразидов, карбазатов, семикарбаматов и малеимидов.
8. Конъюгат прогенипоэтина по п.7, где указанный полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой примерно от 0,5 до 100 кДа.
9. Конъюгат прогенипоэтина по п.8, где указанный полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой примерно от 3,4 до 40 кДа.
10. Конъюгат прогенипоэтина по п.4, где указанный полиэтиленгликоль является разветвленным полимером.
11. Конъюгат прогенипоэтина по п.10, где разветвленный полимер полиэтиленгликоля характеризуется молекулярной массой примерно от 10 до 40 кДа.
12. Конъюгат прогенипоэтина по п.4, где указанный полиэтиленгликоль является бифункциональным полимером.
13. Конъюгат прогенипоэтина по пп.1-11 или 12, где указанный полипептид прогенипоэтин характеризуется формулой
R1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2 или R2-R1,
где R1 представляет собой полипептид, включающий модифицированную аминокислотную последовательность лиганда flt-3 формулы
где N-конец присоединен к C-концу непосредственно или через линкер (L2), способный соединять N-конец с C-концом и имеющий новые C- или N-концы у аминокислот
где R2 представляет собой фактор, выбранный из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора, цитокина, лимфокина, интерлейкина и кроветворного фактора роста;
где L1 представляет собой линкер, способный связывать R1 с R2;
и указанному белку прогенипоэтину может непосредственно предшествовать (метионин-1), (аланин-1) или (метионин-2, аланин-1).
14. Композиция, включающая белок прогенипоэтин по пп.1-11 или 12, и по крайней мере один фармацевтически приемлемый носитель.
15. Способ лечения пациента, имеющего нарушение кроветворения, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата прогенипоэтина по пп.1-11 или 12.
16. Способ по п.15, где указанное нарушение кроветворения представляет собой нейтропению, лейкопению, тромбоцитопению или анемию.
17. Способ по п.16, где указанное нарушение кроветворения представляет собой результат химиотерапии, радиационной терапии или применения лекарственных средств, подавляющих костный мозг.
18. Способ лечения пациента, восстанавливающегося и/или страдающего от трансплантации костного мозга, ожога, ранения, паразитарной, бактериальной или вирусной инфекции, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата прогенипоэтина по пп.1-11 или 12.
19. Способ мобилизации кроветворных предшественников и стволовых клеток в периферическую кровь, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата прогенипоэтина по пп.1-11 или 12.
20. Способ продукции дендритных клеток, включающий стадии
a) отделения кроветворных клеток-предшественников или клеток CD34+ от других клеток и
b) культивирования указанных кроветворных клеток-предшественников или клеток CD34+ в ростовой среде, содержащей кроветворный белок по пп.1-11 или 12.
21. Способ по п.20, дополнительно включающий стадию
c) воздействия на указанные культивируемые кроветворные клетки-предшественники или клетки CD34+ антигена.
22. Способ по п.20, где указанная ростовая среда дополнительно содержит один или несколько факторов, выбранных из группы, состоящей из GM-CSF, IL-4, TNF-a, фактора стволовых клеток (SCF), лиганда flt-3, IL-3, варианта IL-3, белка слияния - варианта IL-3 и многофункционального агониста рецепторов.
23. Способ по п.21, где указанная ростовая среда дополнительно содержит один или несколько факторов, выбранных из группы, состоящей из GM-CSF, IL-4, TNF-a, фактора стволовых клеток (SCF), лиганда flt-3, IL-3, варианта IL-3, белка слияния - варианта IL-3 и многофункционального агониста рецепторов.
24. Способ лечения человека, имеющего опухоль, инфекцию или аутоиммунное заболевание, включающий стадию введения указанному человеку кроветворного белка по пп.1-11 или 12.
25. Способ по п.24, дополнительно включающий введение одного или нескольких факторов, выбранных из группы, состоящей из GM-CSF, IL-4, TNF-a, фактора стволовых клеток (SCF), лиганда flt-3, IL-3, варианта IL-3, белка слияния - варианта IL-3 и многофункционального агониста рецепторов.
26. Способ конъюгирования полиэтиленгликоля с нуклеофилом, где конъюгацию проводят в присутствии неорганического растворителя.
Текст
006368 Область изобретения Настоящее изобретение относится к химической модификации прогенипоэтинов (ProGP), семейству рекомбинантных белков, которые являются многофункциональными агонистами лиганда flt3 и рецептора другого кроветворного фактора роста, включая в качестве неограничивающего примера G-CSF, посредством которой могут изменяться химические и/или физиологические свойства ProGP. Модифицированные ПЭГ ProGP могут обладать сниженной скоростью клиренса, увеличенной стабильностью, сниженной антигенностью или комбинацией данных свойств. Семейство белков ProGP определяется как семейство многофункциональных белков, в состав которого входит агонист рецептора flt3 и агонист рецептора второго кроветворного фактора роста или колониестимулирующего фактора, описанные вWO98/17810, который полностью включен сюда. Настоящее изобретение также относится к способам модификации ProGP. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям,включающим модифицированный ProGP. Дальнейшим осуществлением является применение модифицированного ProGP для лечения нарушений кроветворения. Предпосылки изобретения Прогенипоэтин может использоваться при лечении общих нарушений кроветворения, включая те,что возникают от химиотерапии или от радиационной терапии (Mac Vittie, Т. J.; et al., Exp. Hematol.(1999), 27 (10), 1557-1568). ProGP может также использоваться при трансплантации костного мозга, заживлении ран, лечении ожогов и лечении паразитарной, бактериальной или вирусной инфекции. Было сделано общее наблюдение, что физиологически активные белки, вводимые в организм, могут проявлять свою фармакологическую активность только в течение краткого периода вследствие высокой скорости их клиренса из организма. Более того, относительная гидрофобность данных белков может ограничивать их стабильность. В целях снижения скорости клиренса, улучшения стабильности или отмены антигенности терапевтических белков были предложены некоторые способы, в которых белки химически модифицируют водорастворимыми полимерами. Химические модификации данного типа могут эффективно блокировать протеолитический фермент от физического контакта с самим остовом белка, предотвращая таким образом деградацию. Химическое присоединение может эффективно снижать почечный клиренс. Дополнительные преимущества при определенных условиях включают в себя увеличение стабильности и времени циркуляции терапевтического белка, повышение растворимости и снижение иммуногенности. Обзорной статьей, описывающей модификацию и слияние белков, является Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (May 1992) (опубликовано Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK) . Полиалкиленоксид, особенно полиэтиленгликоль (ПЭГ), представляет собой одну из таких химических молекул, которые применяли для получения терапевтических белковых продуктов (таким образом,ПЭГилирование означает присоединение по крайней мере одной молекулы ПЭГ). Присоединение полиэтиленгликоля, как было показано, защищает против протеолиза, Sada, et al, J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139 (1991), и доступны способы присоединения нескольких молекул полиэтиленгликоля. См. патент США 4179337, Davis et al., "Неиммуногенные полипептиды", выданный 18 декабря 1979 г.; и патент США 4002531, Royer, "Модификация ферментов полиэтиленгликолем и полученный таким образом продукт", выданный 11 января 1977 г. Для обзора см. Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (J.S.Holcerberg and J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981. Использованы другие водорастворимые полимеры, такие как сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли(-1,3-диоксолан), поли(-1,3,6-триоксан), сополимер этилена/малеинового ангидрида, и полиаминокислоты (гомополимеры или произвольные сополимеры). Описано несколько примеров модифицированных ПЭГ терапевтических белков. ADAGEN, модифицированный ПЭГ препарат аденозиндеаминазы, разрешен для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицитного заболевания. ONCASPAR, модифицированная ПЭГ L-аспарагиназа, разрешена для лечения пациентов с гиперчувствительным ALL (острым лимфолейнозом). Модифицированная ПЭГ супероксиддисмутаза находится в клинических испытаниях для лечения травмы головы. Модифицированный ПЭГ -интерферон (патент США 5738846, 5382657) тестируют в клинических испытаниях III фазы для лечения гепатита посредством ПЭГ-Интрона (пэгитрон альфа-2b), разрешенного для лечения хронического гепатита С, тогда как еще одна молекула, PEGASYS, пока ожидает разрешения регулирующего органа; сообщается, что модифицированная ПЭГ глюкоцереброзидаза и модифицированный ПЭГ гемоглобин находятся на доклиническом тестировании. Еще одним примером является модифицированный ПЭГ IL-6; ЕР 0442724, озаглавленный "Модифицированный hIL-6", в котором описаны молекулы полиэтиленгликоля, добавленные к IL-6. Другим конкретным терапевтическим белком, который химически модифицирован, является гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF). G-CSF индуцирует быструю пролиферацию и высвобождение нейтрофильных гранулоцитов в кровяное русло и таким образом обеспечивает терапевтический эффект борьбы с инфекцией. В публикации Европейского патента ЕР 0401384, опубликованного 12 декабря 1990 г., озаглавленного "Химически модифицированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор", описаны материалы и методы для получения G-CSF, к которому присоединены моле-1 006368 кулы полиэтиленгликоля. Модифицированный G-CSF и его аналоги также описаны в ЕР 0473268, опубликованном 4 марта 1992 г., озаглавленном "Длительное высвобождение фармацевтических композиций,включающих полипептид, ковалентно конъюгированный с водорастворимым полимером", устанавливающем применение различных G-CSF и его производных, ковалентно конъюгированных с водорастворимым полимером в виде частиц, таким как полиэтиленгликоль. О модифицированном полипептиде,обладающем активностью человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, сообщается в ЕР 0335423, опубликованном 4 октября 1989 г. Патент США 58247 84 относится к способам Nконцевой модификации белков, включая композиции химически модифицированного с N-конца G-CSF. В патенте США 5824778 описан химически модифицированный G-CSF. В заявке на выдачу патента Японии Hei2 (1990)-30555 описан химически модифицированный человеческий IL-3, обладающий сниженной антигенностью. Семейство белков ProGP описано в WO 98/17810. Для полиэтиленгликоля было использовано много средств присоединения молекул полиэтиленгликоля к белку. В основном молекулы полиэтиленгликоля присоединяют к белку посредством реакционноспособной группы на белке. Для такого присоединения подходят аминогруппы, такие как те, что на остатках лизина и на Nконцах. Например, Royer (патент США 4002531, выше) заявляет, что восстановительное алкилирование применялось для присоединения молекул полиэтиленгликоля к ферменту. В ЕР 0539167, опубликованном 28 апреля 1993 г., Wright, "Имидаты ПЭГ и их белковые производные", заявлено, что пептидные и органические соединения со свободной(-ыми) аминогруппой(-ами) модифицируют имидатными производными ПЭГ или родственных водорастворимых органических полимеров. Chamow et al., BioconjugateChem. 5: 133-140 (1994) сообщают о модификации иммуноадгезина CD4 монометоксиполиэтиленгликольальдегидом путем восстановительного алкилирования. Авторы сообщают, что 50% CD4-Ig модифицировалось MePEG в условиях, позволяющих осуществлять контроль за степенью модификации ПЭГ(там же на стр.137). Авторы также сообщают, что связывающая способность модифицированного CD4-Igin vitro (пo отношению к белку др 120) снижалась со скоростью, коррелировавшей со степенью модификации MePEG (там же). Патент США 4904584, Shaw, выданный 27 февраля 1990 г., относится к модификации некоторого числа остатков лизина в белках для присоединения молекул полиэтиленгликоля через реакционноспособные аминогруппы. Многие способы присоединения полимера к белку включают применение группы, действующей в качестве связывающей группы. Однако, такие группы могут быть антигенными. Доступен способ с использованием тресил-хлорида, не задействующий связывающей группы, но данный способ, возможно,трудно применять для получения терапевтических продуктов, поскольку использование тресил-хлорида может приводить к продукции токсичных побочных продуктов. См. Francis et al., In: Stability of proteinSystems, Application In Cell Biology and Biotechnology, Fisher et al., eds. Plenum Press, New York, N.Y.,1989 pp. 211-213. См. также, Rose et al., Bioconjugate Chemistry 2: 154-159 (1991), где сообщается о селективном присоединении линкерной группы карбогидразида к С-концевой карбоксильной группе белкового субстрата(инсулина). Настоящее изобретение относится к химически модифицированным молекулам ProGP, характеризующимся сниженной скоростью клиренса, повышенной стабильностью, сниженной антигенностью или комбинацией данных свойств. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к химически модифицированным ProGP, которые характеризуются улучшением, по крайней мере, одного химического или физиологического свойства, выбранного из сниженной скорости клиренса, повышенной стабильности, сниженной антигенности в качестве неограничивающих примеров. Таким образом, как это описано ниже более подробно, настоящее изобретение характеризуется некоторым количеством аспектов, относящихся к химической модификации ProGP, а также к специфическим модификациям с использованием различных групп на основе полиэтиленгликоля. Настоящее изобретение также относится к способам продукции химически модифицированныхProGP. Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим химически модифицированные ProGP. Модифицированный ProGP по настоящему изобретению может использоваться при лечении нейтропении, тромбоцитопении, мобилизации кроветворных предшественников и стволовых клеток в периферическую кровь, подавления костного мозга и дефицитов кроветворения и иммунодефицитов, в качестве неограничивающих примеров.-2 006368 Краткое описание рисунков Фиг. 1 представляет собой репродукцию профиля элюции при ионообменной хроматографии реакционной смеси ПЭГ-ALD с молекулярной массой 30000 и ProGP-4. Фиг. 2 а представляет собой профиль SEC-HPLC рекомбинантного ProGP-4. Фиг. 2b представляет собой профиль SEC-HPLC реакционной смеси ПЭГ-ALD с молекулярной массой 30000 и ProGP-4. Фиг. 2 с представляет собой профиль SEC-HPLC очищенного на ионообменнике модифицированного с N-конца одной молекулой ПЭГ-ALD с молекулярной массой 30000 ProGP-4. Фиг. 3 представляет собой SDS-PAGE (ПЭГ-ALD массой 30000) - ProGP-4. Дорожка 1. Белковые стандарты молекулярной массы; Дорожка 2. Пустая; Дорожка 3. ProGP-4; Дорожка 4. (ПЭГ-ALD с молекулярной массой 30000) - ProGP-4. Фиг. 4 представляет собой профиль SDS-SEC-HPLC очищенного на ионообменнике модифицированного с N-конца одной молекулой ПЭГ-ALD с молекулярной массой 30000 ProGP-4. На фиг. 5 показан профиль обращенно-фазовой HPLC модифицированного с N-конца одной молекулой ПЭГ-ALD с молекулярной массой 30000 ProGP-4. На фиг. 6 показан спектр MALDI-TOF очищенного на обращенной фазе модифицированного одной молекулой ПЭГ-ALD с молекулярной массой 30000 мономера ProGP-4. На фиг. 7 показан профиль SEC-HPLC расщепленного трипсином модифицированного одной молекулой ПЭГ-ALD с молекулярной массой 30000 ProGP-4. На фиг. 8 проиллюстрировано сравнение кривых реакции для агониста рецептора flt3, агониста рецептора G-CSF, совместного добавления агониста рецептора flt3 и агониста рецептора G-CSF, не модифицированного ПЭГ ProGP-4 и модифицированного одной молекулой ПЭГ-ALD с молекулярной массой 30000 ProGP-4 в анализе колониеобразующих единиц гранулоцитов/макрофагов (CFU-GM), в котором измеряют деление и дифференцировку происходящих из костного мозга человека СD34+-клеток. На фиг. 9 проиллюстрировано сравнение кривых концентрации в мышиной плазме для ProGP-4 и модифицированного одной молекулой ПЭГ-ALD с молекулярной массой 30000 ProGP-4. На фиг. 10 сравнивается биологическая активность in vivo немодифицированного ПЭГ ProGP-4,вводимого мышам ежесуточно, по отношению к модифицированному с N-конца одной молекулой ПЭГALD с молекулярной массой 30000 ProGP-4, вводимому раз в трое суток, путем отображения общих количеств лейкоцитов (WBC) и дендритных клеток (DC) в периферической крови и селезенке, определенных через 24 ч после введения дозы. На фиг. 11 сравнивается кинетика ответа DC in vivo для немодифицированного ПЭГ ProGP-4, вводимого мышам ежесуточно, по отношению к модифицированному с N-конца одной молекулой ПЭГ-ALD с молекулярной массой 30000 ProGP-4, вводимому раз в трое суток, путем отображения общих количеств лейкоцитов (WBC) и дендритных клеток (DC) в периферической крови и селезенке, определенных через 24, 4 8 и 72 ч после введения дозы. На фиг. 12 показана аминокислотная последовательность ProGP-4. Подробное описание изобретения Прогенипоэтины (ProGP) представляют собой семейство рекомбинантных белков, которые являются многофункциональными агонистами лиганда ftl3 и другого кроветворного фактора роста. Их рекомбинантная продукция и способы применения подробно описаны в WO 98/17810. Белки прогенипоэтины характеризуются формулойR1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2 или R2-R1,где R1 представляет собой полипептид, включающий аминокислотную последовательность модифицированного лиганда ft1-3 формулы-3 006368 где N-конец соединен с С-концом непосредственно или через линкер (L2), способный соединять Nконец с С-концом и имеющий новые С- или N-концы у аминокислот где R2 представляет собой фактор, выбранный из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора, цитокина, лимфокина, интерлейкина и кроветворного фактора роста; где L1 представляет собой линкер, способный связывать R1 с R2. Последовательности белка прогенипоэтина может непосредственно предшествовать (метионин-1),(аланин-1) или (метионин-2, аланин-1). В предпочтительном осуществлении белки прогенипоэтины характеризуются формулойR1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2 или R2-R1,где R1 представляет собой полипептид, включающий аминокислотную последовательность модифицированного лиганда ft1-3 формулы где N-конец соединен с С-концом непосредственно или через линкер (L2), способный соединять Nконец с С-концом и имеющий новые С- или N-концы у аминокислот где R2 представляет собой полипептид, включающий аминокислотную последовательность модифицированного G-CSF человека формулыXaa в положении 170 представляет собой His, Arg или Ser; где аминокислоты 1-11 с N-конца и/или аминокислоты 1-5 с С-конца необязательно удалены из указанной аминокислотной последовательности модифицированного G-CSF человека; и где N-конец соединен с С-концом непосредственно или через линкер (L2) , способный соединять Nконец с С-концом и имеющий новые С- или N-концы у аминокислот где L1 представляет собой линкер, способный связывать R1 с R2. Еще в одном осуществлении последовательности прогенипоэтина может непосредственно предшествовать (метионин-1), (аланин-1) или (метионин-2, аланин-1). В предпочтительном осуществлении R1 выбран изc-mpl (ТРО) , M-CSF, эритропоэтин (ЕРО), IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, вариант IL-3, IL-5, IL 6, IL-7, IL-8, IL-9,IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, LIF, лиганд flt3/flk2, человеческий гормон роста, фактор роста В-клеток,фактор дифференцировки В-клеток, фактор дифференцировки эозинофилов и фактор стволовых клеток(SCF). В предпочтительном осуществлении белок прогенипоэтин выбран из-7 006368 Более предпочтительно, чтобы белок прогенипоэтин представлял собой SEQ ID NO:165. В предпочтительном осуществлении R2 выбран из группы, состоящей из G-CSF, G-CSF Ser17, GCSF Ala17 и лиганда c-mpl (ТРО). В предпочтительном осуществлении R2 представляет собой вариант IL-3 с SEQ ID 261. В предпочтительном осуществлении R2 представляет собой вариант IL-3 с SEQ ID NO:256, SEQ ID NO:257, SEQ IDNO:258 или SEQ ID NO:259. В предпочтительном осуществлении линкер (L2) выбран из группы, состоящей из-8 006368 Любой очищенный и выделенный ProGP, который продуцируется клетками-хозяевами, такими как Е. coli и животные клетки, трансформированными или трансфицированными путем использования рекомбинантных генетических методов, может использоваться по настоящему изобретению. Среди них особенно предпочтительным является ProGP, который продуцируется трансформированной Е. coli. Такой ProGP может быть получен в больших количествах с высокой чистотой и гомогенностью. Например,указанный выше ProGP может быть получен способом, раскрытым в WO 98/17810. Термин "по существу имеет следующую аминокислотную последовательность" означает, что указанная выше аминокислотная последовательность может включать одну или несколько аминокислотных изменений (делецию, добавление, вставку или замену), пока данные изменения не вызовут каких-либо неблагоприятных функциональных отличий по сравнению с ProGP. Более предпочтительным является применение ProGP, по существу характеризующегося аминокислотной последовательностью, в которую включен, по крайней мере,один лизин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота или неспаренный остаток цистеина. По настоящему изобретению полиэтиленгликоль ковалентно связывают через аминокислотные остатки ProGP. Данным аминокислотным остатком может являться любой реакционноспособный(-ые) остаток(-ки), содержащий(-ие), например, свободную амино-, карбокси- или сульфгидрильную (тиольную) группу, к которой может привязываться концевая реакционноспособная группа активированного полиэтиленгликоля. Аминокислотные остатки, имеющие свободные аминогруппы, могут включать остатки лизина и/или N-концевой аминокислотный остаток, те, что имеют свободную карбоксильную группу,могут включать аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту и/или С-концевые аминокислотные остатки, и имеющие сульфгидрил(тиол) включают такие остатки, как цистеин. В другом осуществлении для взаимодействия с N-концевыми остатками серина используют оксиновые химические способы (LemieuxBertozzi Tib Tech 16: 506-513, 1998). Полиэтиленгликоль, применяемый по настоящему изобретению, не ограничивается какой-либо конкретной формой или интервалом молекулярной массы. Обычно используют молекулярную массу от 500 до 60000 и предпочтительно от 1000 до 40000. Полиэтиленгликоль может также представлять собой разветвленный ПЭГ, описанный в патенте США 5932462, патенте США 5342940, патенте США 5643575,патенте США 5919455, патенте США 6113906 и патенте США 5183660. Полиалкиленоксиды, особенно полиэтиленгликоли, связывают с ProGP через концевую реакционноспособную группу, которая может оставлять или не оставлять линкерную группу(спейсер) между ПЭГ и белком. Для образования конъюгатов с ProGP по настоящему изобретению полимеры, такие как полиалкиленоксиды, преобразуют в "активированные" формы. Реакционноспособная группа представляет собой, например, концевую реакционноспособную группу, которая опосредует связь между химическими группами белка, такими как амино-, карбоксильные или тиольные группы, и полиэтиленгликолем. Обычно одну или обе концевые полимерные гидроксильные группы (т.е. альфа- и омега-концевые гидроксильные группы) преобразуют в реакционноспособные функциональные группы, что позволяет осуществляться ковалентной конъюгации. Данный процесс часто обозначают как "активация", и полиэтиленгликолевый продукт, содержащий реакционноспособную группу, здесь и далее обозначают как "активированный полиэтиленгликоль". Полимеры, содержащие как -, и -связывающие группы, также обозначают как "бис-активированные полиалкиленоксиды" и обозначают как "бифункциональные". Полимеры, содержащие одну и ту же реакционноспособную группу на - и -концевых гидроксилах, иногда обозначают как "гомобифункциональные" или "гомобис-активированные". Полимеры, содержащие различные реакционноспособные группы на - и -концевых гидроксилах, иногда обозначают как "гетеробифункциональные" или "гетеробис-активированные". Полимеры, содержащие единственную реакционноспособную группу, обозначают как "моноактивированные" полиалкиленоксиды или "монофункциональные". Другие по существу неантигенные полимеры сходным образом "активируют" или "функционализируют". Активированные полимеры, таким образом, подходят для опосредования связи между химическими группами на белке, такими как -амино-, карбоксильные и тиольные группы, и полиэтиленгликолем. Бис-активированные полимеры могут таким образом реагировать с двумя молекулами белка или с одной молекулой белка и реакционноспособной небольшой молекулой в другом осуществлении для эффективного образования белковых полимеров или конъюгатов белок-небольшая молекула посредством поперечных связей. Функциональные группы, способные взаимодействовать с N-концевыми -аминогруппами или -аминогруппами лизинов, находящихся на ProGP, включают карбонаты, такие как пнитрофенил или сукцинимидил; карбонилимидазол; азлактоны; циклические имидтиокетоны; изоцианаты или изотиоцианаты и альдегиды. Функциональные группы, способные взаимодействовать с группами карбоновой кислоты, реакционноспособными карбонильными группами и окисленными углеводородными группами на ProGP, включают первичные амины; и гидразиновые, и гидразидовые функциональные группы, такие как ацилгидразиды, карбазаты, семикарбаматы, тиокарбазаты, и т.д. Меркаптогруппы, если они доступны на ProGP, также могут использоваться в качестве участков присоединения для подходящих активированных полимеров с реакционноспособными группами, такими как тиолы; малеимиды,сульфоны и фенилглиоксали; см., например, патент США 5093531, описание которого включено сюда-9 006368 в качестве ссылки. Другие нуклеофилы, способные взаимодействовать с электрофильным центром,включают в качестве неограничивающих примеров гидроксил, амино, карбоксил, тиол, активный метилен и тому подобное. В одном из предпочтительных осуществлений изобретения связь, основанная на вторичном амине,или амидная связь образуется с использованием N-концевых аминогрупп ProGP или -аминогрупп лизина и активированного ПЭГ. В другом предпочтительном аспекте изобретения связь, основанная на вторичном амине, образуется между N-концевой первичной аминогруппой ProGP и ПЭГ-(простой или разветвленной цепью) альдегидом путем восстановления подходящим восстанавливающим агентом, таким как NaCNBH3, NаВН 3, пиридинборан и т.д., как описано в Chamow et al., Bioconjugate Ghent. 5: 133-140(1994) и патенте США 5824784. В другом предпочтительном осуществлении изобретения полимеры, активированные образующими амид линкерами, такими как сукцинимидиловые сложные эфиры, циклические имидтиокетоны или тому подобное, используют для воздействия на связывание ProGP с полимером; см., например, патент США 5349001; патент США 5405877; и Greenwald, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17: 101-161,2000, которые включены сюда в качестве ссылки. Один из предпочтительных активированных полиэтиленгликолей, который может быть связан со свободными аминогруппами ProGP, включает N-гидроксисукцинилимидполиэтиленгликоль с простой или разветвленной цепью и может быть получен путем активации сложных эфиров янтарной кислоты и полиэтиленгликоля N-гидроксисукцинилимидом. Другие предпочтительные осуществления изобретения относятся к применению других активированных полимеров для образования ковалентных связей полимера с ProGP через -амино- или другие группы. Например, изоцианатные или изотиоцианатные формы терминально активированных полимеров могут использоваться для образования связей с аминогруппами лизина, основанных на мочевине или тиомочевине. В другом предпочтительном аспекте изобретения с аминогруппами белка образуются карбаматные(уретановые) связи, как описано в патентах США 5122614, 5324844 и 5612640, которые включены сюда в качестве ссылки. Примеры включают полимеры, активированные N-сукцинимидилкарбонатом,паранитрофенилкарбонатом и карбонилимидазолом. В другом предпочтительном осуществлении данного изобретения бензотриазолкарбонатное производное ПЭГ связано с аминогруппами на ProGP. Другой аспект изобретения относится к пролекарственному средству или форме ProGP с замедленным высвобождением, состоящим из водорастворимого полимера, такого как полиэтиленгликоль, присоединенного к молекуле ProGP посредством функционального линкера, который, предположительно,может разрушаться путем ферментативного или рН-направленного гидролиза с высвобождением свободного ProGP или другого производного ProGP. Пролекарственное средство также может представлять собой "двойное пролекарственное средство" (Bundgaard in Advanced Drug Delivery Reviews 3:39-65,1989), задействующее применение каскадной латентности. В таких системах в реакцию гидролиза входят начальная лимитирующая скорость (медленная) ферментативная или рН-направленная стадия и вторая стадия, включающая в себя быстрый неферментативный гидролиз, который происходит только после прохождения первой стадии. Такой способный к высвобождению полимер предоставляет белковые конъюгаты, которые являются нестойкими и могут функционировать в качестве депо, которое длительное время высвобождает ProGP. Такие функциональные линкеры описаны в патенте США 5614549; патенте США 5840900; патенте США 5880131; патенте США 5965119; патенте США 6011042; патенте США 6180095 Bl; Greenwald R.B. et al., J. Med. Chem. 42; 3657-3667, 1999; Lee, S. et al., BioconjugateR.B. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:101-161, 2000. Еще одно осуществление настоящего изобретения представляет собой способ конъюгирования ПЭГ с нуклеофилом, где конъюгирование проводят в присутствии неорганического растворителя. "Нуклеофил" определяется как белки, включающие в качестве неограничивающих примеров антитела и кроветворные факторы роста, пептиды, ферменты, химические вещества, применяемые в медицине, или органические группы. Предпочтительно неорганический растворитель представляет собой ацетонитрил, метанол или этанол. Более предпочтительно неорганический растворитель представляет собой ацетонитрил. Предпочтительно концентрация неорганики составляет примерно от 1 до 25%, более предпочтительно примерно от 3 до 13% и более предпочтительно примерно 8%. Реакции конъюгации, обозначенные как модификации посредством ПЭГ, исторически проводили в растворе с молярным избытком полимера и безотносительно того, где полимер будет присоединяться к белку. Такие общие способы, однако, обычно оказываются неадекватными при конъюгировании биологически активных белков с неантигенными полимерами в плане сохранения достаточной биологической активности. Одним из путей поддержания биологической активности ProGP является существенное предотвращение в процессе присоединения полимера конъюгации с теми реакционноспособными группамиProGP, которые ассоциированы с участком(-ами) связывания с рецептором. Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление способа конъюгирования полиэтиленгликоля с ProGP, поддерживающего высокие уровни сохраненной активности. Химические модификации посредством ковалентной связи могут проводиться при любых подходящих условиях, в основном адаптированных к конъюгации биологически активного вещества с активированным полиэтиленгликолем. Реакция конъюгации проводится в относительно мягких условиях для предотвращения инактивации ProGP. Мягкие условия включают поддержание рН реакционного раствора в интервале от 3 до 10 и температур реакции в интервале примерно от 0 до 37 С. В случаях, где реакционноспособные аминокислотные остатки в ProGP содержат свободные аминогруппы, указанные выше модификации предпочтительно проводят в подходящих буферах (рН от 3 до 10), неограничивающими примерами которых являются фосфатный, цитратный, ацетатный, сукцинатный или HEPES, в течение 148 ч при 4-37 С. При взаимодействии N-концевых аминогрупп с такими реагентами, как ПЭГ-альдегиды,предпочтительно поддерживается рН 4-7. Активированный полиэтиленгликоль может использоваться в молярном соотношении в 0,05-100 раз, предпочтительно 0,05-0,5 раз, относительно числа свободных аминогрупп ProGP. С другой стороны, когда реакционноспособные аминокислотные остатки в ProGP содержат свободные карбоксильные группы, указанную выше модификацию предпочтительно проводят при рН примерно от 3,5 до 5,5, например, модификацию полиоксиэтилендиамином проводят в присутствии карбодиимида (рН 4-5) в течение 1-24 ч при 4-37 С. Активированный полиэтиленгликоль может использоваться в молярном соотношении в 0,05-300 раз относительно числа свободных карбоксильных групп ProGP. В особых осуществлениях верхний предел количества полимера, включенного в состав реакционных смесей для конъюгации, составляет примерно от 1:1 до содержания, при котором возможно взаимодействие активированного полимера и ProGP без образования существенного количества молекул с большой молекулярной массой, т.е. большего, чем примерно 20%, количества конъюгатов, содержащих более приблизительно одной цепи полимера на молекулу ProGP. Например, в данном аспекте изобретения предполагается, что отношения выше, чем примерно 6:1, могут использоваться для образования значительных количеств требуемых конъюгатов, которые впоследствии можно изолировать от любых молекул с большой молекулярной массой. В другом аспекте данного изобретения бифункционально активированные производные ПЭГ могут использоваться для получения полимерных молекул ProGP-ПЭГ, в которых множественные молекулыProGP поперечно связаны через ПЭГ. Хотя описанные здесь условия реакции могут приводить к тому,что значительные количества ProGP будут немодифицированы, немодифицированный ProGP может легко возвращен в следующие реакционные смеси для дополнительных реакций конъюгации. Способы по настоящему изобретению неожиданно приводят к получению очень малого, т.е. составляющего менее чем примерно 30% и более предпочтительно менее чем примерно 10% молекул с большой молекулярной массой и молекул, содержащих более одной цепи полимера на ProGP. Данные условия реакции резко отличаются от тех, что обычно используют для реакций конъюгации с полимерами, где активированный полимер присутствует в молярном избытке в несколько раз по отношению к целевой молекуле. В других аспектах изобретения полимер присутствует в количествах примерно от 0,1 до 50 эквивалентов на эквивалент ProGP. В других аспектах изобретения полимер присутствует в количествах примерно от 1 до 10 эквивалентов на эквивалент ProGP. Реакции конъюгации по настоящему изобретению вначале предоставляют реакционную смесь или смесь молекул, содержащую конъюгаты моно- и ди-ПЭГ-ProGP, непрореагировавший ProGP, непрореагировавший полимер и обычно менее приблизительно 20% молекул с большой молекулярной массой. Молекулы с большой молекулярной массой включают конъюгаты, содержащие более одной полимерной цепи и/или полимеризованные молекулы ПЭГ-ProGP. После удаления непрореагировавших молекул и молекул с большой молекулярной массой получают композиции, содержащие главным образом конъюгаты моно- и ди-полимер-ProGP. Благодаря тому факту, что данные конъюгаты большей частью содержат единственную цепь полимера, они по существу гомогенны. Данные модифицированные ProGP обладают по крайней мере примерно 5% от биологической активности in vitro, ассоциированной с природным или немодифицированным ProGP, что измеряют с использованием стандартных анализов клеточной пролиферации, таких как анализы AML, TF1 и анализ колониеобразующих единиц (патент США 6030812, который включен сюда в качестве ссылки). В предпочтительных аспектах изобретения модифицированные ProGP обладают примерно 25% от биологической активности in vitro, более предпочтительно, модифицированные ProGP обладают примерно 50% от биологической активности in vitro, более предпочтительно модифицированные ProGP обладают примерно 75% от биологической активности invitro и наиболее предпочтительно модифицированные ProGP обладают эквивалентной или повышенной биологической активностью in vitro. Способы по настоящему изобретению предпочтительно охватывают довольно ограниченные отношения полимера к ProGP. Таким образом, было обнаружено, что конъюгаты ProGP преимущественно ограничены видами молекул, содержащими только одну цепь полимера. Более того, присоединение полимера к реакционноспособным группам ProGP происходит существенно чаще, чем при использовании- 11006368 сильного молярного избытка полимерного линкера. Немодифицированный ProGP, присутствующий в реакционной смеси, после гашения реакции конъюгации может восстанавливаться для использования в последующих реакциях с использованием ионообменной хроматографии или гель-фильтрации, или сходных способов разделения. Модифицированный полиэтиленгликолем ProGP, то есть химически модифицированный белок по настоящему изобретению, может быть очищен из реакционной смеси общепринятыми способами, которые используются для очистки белков, такими как диализ, высаливание, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, гель-хроматография и электрофорез. Ионообменная хроматография является особенно эффективной для удаления непрореагировавших полиэтиленгликоля и ProGP. В дальнейшем осуществлении изобретения молекулы моно- и диполимер-ProGP выделяют из реакционной смеси для удаления молекул с большой молекулярной массой и немодифицированного ProGP. Разделение осуществляют путем помещения смешанных молекул в буферный раствор, содержащий примерно 0,5-10 мг/мл конъюгатов ProGP-полимер. Подходящие растворы характеризуются рН примерно от 4 до 10. Растворы предпочтительно содержат одну или несколько буферных солей, выбранных из КСl, NaCl, K2HPO4,KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, CH3CO2H и NaOH. В зависимости от реакционного буфера раствор конъюгатов ProGP-полимер вначале может подвергаться замене буфера/ультрафильтрации для удаления любого непрореагировавшего полимера. Например, раствор конъюгата ПЭГ-ProGP может подвергаться ультрафильтрации через мембрану, отделяющую низкомолекулярные соединения (от 10000 до 30000 Да) для удаления большей части нежелательных веществ, таких как непрореагировавший полимер, поверхностно-активные вещества, если они присутствуют, и тому подобное. Разделение конъюгатов в смеси, содержащей требуемые виды молекул, предпочтительно проводят с использованием среды для ионообменной хроматографии. Такие среды способны селективно связывать конъюгаты ПЭГ-ProGP по различию в зарядах, которые могут варьировать до некоторой степени предсказуемым образом. Например, поверхностный заряд ProGP определяется числом доступных заряженных групп на поверхности белка. Данные заряженные группы обычно служат точкой предполагаемого присоединения конъюгатов полиалкиленоксида. Поэтому конъюгаты ProGP будут характеризоваться зарядом, отличным от других видов молекул, что обеспечит селективное выделение. Сильно полярные анионно- и катионнообменные смолы, такие как смолы на основе четвертичного амина или сульфопропила, соответственно, используют для способа по настоящему изобретению. Катионообменные смолы являются особенно предпочтительными. Неограничивающий список катионообменных смол, в том числе коммерчески доступных, подходящих для применения по настоящему изобретению, включает SP-hitrap, SP Sepharose HP и SP Sepharose fast flow. Другие подходящие катионообменные смолы, например S- и СМ-смолы, также могут использоваться. Неограничивающий список анионообменных смол, в том числе коммерчески доступных, подходящих для применения по настоящему изобретению, включает Q-hitrap, Q Sepharose HP, и Q Sepharose fast flow. Другие подходящие анионообменные смолы, например DEAE-смолы, также могут использоваться. Например, катионообменная смола предпочтительно упакована в колонку и уравновешена общепринятыми способами. Используют буфер, характеризующийся теми же значениями рН и осмоляльности, что и раствор конъюгированного с ProGP полимера. Буфер для элюции предпочтительно содержит одну или несколько солей, выбранных из KСl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3,NaBO4 и (NH4)2 СО 3. Содержащий конъюгат раствор затем адсорбируется на колонку, причем непрореагировавший полимер и некоторые молекулы с высокой молекулярной массой не задерживаются. По окончании загрузки на колонку воздействуют градиентным потоком буфера для элюции с повышением концентраций соли с целью элюции требуемой фракции конъюгированного с полиалкиленоксидомProGP. Элюированные объединенные фракции предпочтительно ограничивают с целью унификации полимерных конъюгатов после стадии катионообменного разделения. Любые неконъюгированные молекулы ProGP затем могут быть смыты с колонки общепринятыми способами. Если требуется, модифицированные одной или многими молекулами ПЭГ виды ProGP могут далее разделяться один от другого путем дополнительной ионообменной хроматографии или гель-фильтрации. Также могут использоваться способы, задействующие множественные стадии изократической элюции с повышением концентрации. Множественные стадии изократической элюции с повышением концентрации будут приводить к последовательной элюции конъюгатов ди-РrоGР-полимер и затем конъюгатов MOHO-ProGP-полимер. Температурный интервал для элюции составляет примерно от 4 до 25 С. Предпочтительно элюцию проводят при температуре примерно от 6 до 22 С. Например, элюции фракции ПЭГ-ProGP детектируют путем поглощения УФ при 280 нм. Сбор фракций может осуществляться путем простых профилей элюции с течением времени. В способах конъюгирования полимера полиэтиленгликоля с группой ProGP может использоваться поверхностно-активное вещество. Подходящие поверхностно-активные вещества включают средства ионного типа, такие как додецилсульфат натрия (SDS). Также могут использоваться другие ионные поверхностно-активные вещества, такие как додецилсульфат лития, соединения четвертичного аммония,таурохолевая кислота, каприловая кислота, декансульфоновая кислота, и т.д. Также могут использовать- 12006368 ся неионные поверхностно-активные вещества. Например, могут использоваться такие вещества, как полиоксиэтиленсорбитаны (Tween), полиоксиэтиленовые простые эфиры (Triton). См. также Neugebauer,A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp. Единственным ограничением, связанным с поверхностно-активными веществами, используемыми по способам изобретения, является то, что их применяют в условиях и в концентрациях, которые не вызывают существенной. необратимой денатурации ProGP и не ингибируют конъюгацию полимера полностью. Данные поверхностно-активные вещества присутствуют в реакционных смесях в количествах примерно от 0,01-0,5% предпочтительно от 0,05-0,5% и наиболее предпочтительно примерно от 0,075-0,25%. Также рассматриваются смеси поверхностно-активных веществ. Полагают, что поверхностно-активные вещества предоставляют временную, обратимую систему защиты в процессе конъюгации полимера. Было показано, что поверхностно-активные вещества эффективны в плане селективного препятствия конъюгации полимера и при этом позволяют осуществляться основанной на лизинах и N-конце конъюгации. Настоящий модифицированный полиэтиленгликолем ProGP имеет более продолжительный фармакологический эффект, что, вероятно, может объясняться его пролонгированным периодом полужизни invivo. ПЭГ-ProGP по настоящему изобретению предназначен для применения при получении больших количеств дендритных клеток из предшественников, причем данные клетки используются в качестве адъювантов при иммунизации. Дендритные клетки играют важную роль в иммунной системе. Они являются специализированными антиген-презентирующими клетками, наиболее эффективными в активации покоящихся Т-клеток, и являются главными антиген-презентирующими клетками для активации не подвергнутых какому-либо воздействию Т-клеток in vivo и, таким образом, для инициации первичных иммунных ответов. Они эффективно поглощают, процессируют и презентируют растворимые опухолеспецифические антигены (Аг). Дендритные клетки обладают уникальной способностью кластеризовать не подвергнутые какому-либо воздействию Т-клетки и отвечать на первый контакт с Аг быстрой позитивной регуляцией экспрессии главного комплекса гистосовместимости (МНС) и костимуляторных молекул, продукцией цитокинов и миграцией в лимфатические органы. Поскольку дендритные клетки играют центральную роль при сенсибилизации хозяина против неоантигена для СD4-зависимого иммунного ответа, они могут также играть ключевую роль в развитии и регуляции противоопухолевого иммунитета. Дендритные клетки происходят из костномозгового CD34+ -предшественника, общего для гранулоцитов и макрофагов, и у человека было установлено существование отдельной колониеобразующей единицы дендритных клеток (CFU-DC), которая дает начало чистым колониям дендритных клеток. Кроме того, описана (CD14+)-промежуточная клетка, существующая после CPU, с потенциалом по дифференцировке по пути дендритной клетки или макрофага в разных условиях по цитокинам. Данный бипотенциальный предшественник присутствует в костном мозге, пуповинной крови и периферической крови. Дендритные клетки могут быть выделены на основе специфических маркеров клеточной поверхности, таких как CD1a+, CD3-, CD4-, CD20-, CD40+, CD80+, и CD83+, с целью представления о созревании культивированных дендритных клеток. Основанные на дендритных клетках стратегии предоставляют способ усиления иммунного ответа против опухолей и инфекционных агентов. СПИД является еще одним заболеванием, при котором могут использоваться основанные на дендритных клетках способы лечения, поскольку дендритные клетки могут играть главную роль в обеспечении репликации ВИЧ-1. Для иммунотерапии требуется получение от пациентов со злокачественными опухолями дендритных клеток, воздействие на них опухолевого Аг invitro, выделенного из хирургически удаленных опухолевых масс, и обратная инъекция данных клеток пациентам с опухолями. В качестве источника опухолевого антигена достаточно относительно грубых мембранных препаратов опухолевых клеток, что исключает необходимость в молекулярной идентификации опухолевого антигена. Опухолевый антиген также может представлять собой синтетические пептиды, углеводы или последовательности нуклеиновой кислоты. Кроме того, сопутствующее введение цитокинов, таких как ПЭГ-ProGP по настоящему изобретению, может далее способствовать индукции противоопухолевого иммунитета. Предполагается, что данная иммунотерапия может иметь место в варианте in vivo, когда ПЭГ-ProGP по настоящему изобретению отдельно или с другими кроветворными факторами роста вводят пациенту с опухолью с целью увеличения числа дендритных клеток, и на дендритных клетках презентируется эндогенный опухолевый антиген. Также предсказывается, что иммунотерапия in vivo может осуществляться с использованием экзогенного антигена. Также полагают, что иммунотерапевтическое лечение может включать в себя мобилизацию предшественников дендритных клеток или зрелых дендритных клеток путем введения пациенту ПЭГ-ProGP по настоящему изобретению отдельно или с другими кроветворными факторами роста, отбора у пациента предшественников дендритных клеток или зрелых дендритных клеток, воздействия на дендритные клетки антигеном и возвращения данных дендритных клеток пациенту. Более того, ранее отобранные дендритные клетки могут культивироваться ех vivo с ПЭГ-ProGP по настоящему изобретению отдельно или с другими кроветворными факторами роста для увеличения числа дендритных клеток перед воздействием антигена. Основанные на дендритных клетках стратегии также предоставляют собой способ снижения иммунного отве- 13006368 та при аутоиммунных заболеваниях. Исследования дендритных клеток сильно затруднены за счет сложностей получения данных клеток в достаточных количествах и в достаточно чистом виде. В варианте размножения клеток ex vivo гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и фактор-некроза опухолей(TNF-) действуют совместно при образовании дендритных клеток ex vivo из кроветворных предшественников (клеток CD34+), извлеченных из костного мозга, пуповинной крови или периферической крови, а лиганд flk-2/flt-3 и лиганд c-kit (фактор стволовых клеток [SCF]) действуют синергически с усилением индуцированного GM-CSF и TNF- образования дендритных клеток (Siena, S. et al. ExperimentalHematology 23:1463-1471, 1995). Также предоставлен способ размножения ex vivo предшественников дендритных клеток или зрелых дендритных клеток с использованием ПЭГ-ProGP по настоящему изобретению с целью обеспечения достаточных количеств дендритных клеток для иммунотерапии. Более того, имеется наблюдение, что модифицированный полиэтиленгликолем ProGP по настоящему изобретению может ускорять восстановление от нейтропении. Модифицированный полиэтиленгликолем ProGP по настоящему изобретению может иметь по существу ту же биологическую активность,что и интактный ProGP, и, соответственно, может использоваться для тех же применений. Модифицированный полиэтиленгликолем ProGP характеризуется активностью по увеличению числа нейтрофилов и поэтому он может использоваться при лечении общих нарушений кроветворения, включая те, что возникают вследствие химиотерапии или радиационной терапии. Он также может использоваться при лечении инфекции и при трансплантации костного мозга. Модифицированный ProGP по настоящему изобретению может использоваться при лечении заболеваний, характеризующихся сниженными уровнями клеток миелоидного, эритроидного, лимфоидного или мегакариоцитарного ряда системы кроветворения или их комбинации. Кроме того, они могут использоваться для активации зрелых миелоидных и/или лимфоидных клеток. В состав состояний, чувствительных к лечению полипептидами по настоящему изобретению, входит лейкопения, снижение числа циркулирующих лейкоцитов (белых клеток) в периферической крови. Лейкопения может индуцироваться путем воздействия некоторых вирусов или излучения. Она часто является побочным эффектом различных форм лечения злокачественных опухолей, например, воздействия химиотерапевтических лекарственных средств, излучения, инфекции или кровотечения. Терапевтическое лечение лейкопении данными модифицированными ProGP по настоящему изобретению может предотвращать нежелательные побочные эффекты, вызванные лечением доступных в настоящее время лекарственных средств. Модифицированный ProGP по настоящему изобретению может использоваться для лечения или профилактики нейтропении и, например, для лечения таких состояний, как апластическая анемия, циклическая нейтропения, идиопатическая нейтропения, синдром Чедиака-Хигаши, системная красная волчанка (СКВ), лейкоз, синдром миелодисплазии и миелофиброз. Модифицированный ProGP по настоящему изобретению может использоваться для лечения или профилактики тромбоцитопении. В настоящее время единственными способами терапии тромбоцитопении являются трансфузии тромбоцитов, которые дороги и связаны со значительным риском инфекции(ВИЧ, ВГВ) и аллоиммунизации, и IL-11 (Neumega), применение которого разрешено при некоторых тромбоцитопениях. Модифицированный ProGP может ослабить или уменьшить необходимость в трасфузиях тромбоцитов. Тяжелая тромбоцитопения может являться результатом генетических дефектов, таких как анемия Фанкони, синдромы Уискотта-Олдрича или Мэя-Хегглина. Приобретенная тромбоцитопения может являться результатом действия ауто- или аллоантител, как при иммунной тромбоцитопенической пурпуре, системной красной волчанке, гемолитической анемии или несовместимости плода и матери. Кроме того, к тромбоцитопении могут приводить спленомгалия, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, тромбозная тромбоцитопеническая пурпура, инфекция или протезирование сердечных клапанов. Тяжелая тромбоцитопения также может являться результатом химиотерапии и/или радиационной терапии злокачественных опухолей. Тромбоцитопения может также являться результатом проникновения в костный мозг карциномы, лимфомы, лейкоза или фиброза. Модифицированный ProGP по настоящему изобретению может использоваться для мобилизации кроветворных предшественников и стволовых клеток в периферическую кровь. Показано, что происходящие из периферической крови предшественники являются эффективными при восстановлении пациентов в течение аутологичной трансплантации костного мозга. Показано, что кроветворные факторы роста, включая G-CSF и GM-CSF, увеличивают количество циркулирующих предшественников и стволовых клеток в периферической крови. Это упрощает процедуру сбора периферических стволовых клеток и сильно снижает стоимость процедуры за счет снижения числа требуемых ферезов. Модифицированный ProGP может использоваться при мобилизации стволовых клеток и дальнейшего увеличения эффективности трансплантации периферических стволовых клеток. Другое предполагаемое клиническое применение факторов роста состоит в активации кроветворных предшественников и стволовых клеток in vitro в целях генной терапии. Для включения интересующего гена в геном кроветворного предшественника или стволовой клетки необходимо стимулировать клеточное деление и репликацию ДНК. Кроветворные стволовые клетки входят в клеточный цикл с- 14006368 очень низкой частотой, и это означает, что факторы роста могут использоваться для обеспечения трансдукции гена и усиления таким образом клинических перспектив генной терапии. Многие лекарственные средства могут вызывать супрессию костного мозга или дефициты кроветворения. Примерами таких лекарственных средств являются AZT, DDI, алкилирующие агенты и антиметаболиты, применяемые при химиотерапии, антибиотики, такие как хлорамфеникол, пенициллин, ганцикловир, дауномицин, и сульфаниламидные средства, фенотиазоны, транквилизаторы, такие как мепробамат, анальгетики, такие как аминопирин и дипирон, противосудорожные средства, такие как фенитоин или карбамазепин, антитироидные средства, такие как пропилтиоурацил и метимазол, и диуретики. Модифицированный ProGP по настоящему изобретению может использоваться для профилактики или лечения супрессии костного мозга или дефицитов кроветворения, которые часто происходят у пациентов,которых лечат данными лекарственными средствами. Дефициты кроветворения также могут происходить из-за вирусных, микробных или паразитарных инфекций и в результате лечения заболевания почек или почечной недостаточности, например диализа. Модифицированный ProGP по настоящему изобретению может использоваться для лечения такого дефицита кроветворения. Лечение дефицита кроветворения может включать введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей модифицированный ProGP. Модифицированный ProGP по настоящему изобретению также может использоваться для активации и амплификации клеток - кроветворных предшественников путем обработки данных клеток in vitro модифицированным ProGP пo настоящему изобретению перед инъекцией клеток пациенту. Посредством лечения модифицированным ProGP по настоящему изобретению также можно благоприятно воздействовать на различные иммунодефициты, например, относящиеся к Т и/или В-лимфоцитам, или иммунные нарушения, например ревматоидный артрит. Иммунодефициты могут быть результатом вирусных инфекций, например HTLV-I, HTLV-II, HTLV-III, тяжелого воздействия радиации,противораковой терапии, или результатом другого медицинского воздействия. МодифицированныйProGP по настоящему изобретению также может использоваться, отдельно или в комбинации с другими факторами кроветворения, при лечении других дефицитов кровяных клеток, включая тромбоцитопению(дефицит тромбоцитов) или анемию. Другие применения данных новых полипептидов заключаются в лечении пациентов, восстанавливающихся после трансплантации костного мозга in vivo и ex vivo, и в разработке моноклональных или поликлональных антител, получаемых стандартными способами, для диагностического или терапевтического применения. Модифицированный полиэтиленгликолем ProGP по настоящему изобретению может составляться с получением фармацевтических средств, содержащих также фармацевтически приемлемый разбавитель,средство для получения изотонического раствора, средство для поддержания условий рН и тому подобное, с целью введения их пациенту. Указанные выше фармацевтические средства могут вводиться подкожно, внутримышечно, внутривенно или перорально, в зависимости от цели лечения. Доза также может основываться на типе и состоянии нарушения пациента, подлежащего лечению, причем в норме она может составлять от 0,1 до 50 мг для инъекции и от 0,1 мг до 5 г для перорального введения для взрослого человека. Присоединенные полимерные вещества также предпочтительно являются водорастворимыми при комнатной температуре. Неограничивающий список таких полимеров включает гомополимеры полиалкиленоксидов, такие как полиэтиленгликоль или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и блоксополимеры, при том что водорастворимость блоксополимеров сохраняется. В качестве альтернативы основанным на ПЭГ полимерам могут использоваться эффективно неантигенные материалы, такие как декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, основанные на углеводородах полимеры, и тому подобное. Активация - и -концевых групп данных полимерных веществ, конечно, может осуществляться способами, сходными с теми, что применяются для преобразования полиалкиленоксидов, и, таким образом, будет понятна обычным специалистам в данной области. Обычным специалистам в данной области будет ясно, что указанный выше список является сугубо иллюстративным и что охватываются все полимерные материалы с описанными здесь свойствами. Для целей настоящего изобретения "эффективно неантигенные" означает все материалы, которые в данной области рассматривают как нетоксичные и не вызывающие существенного иммунного ответа у млекопитающих. Определения Далее следует список сокращений и соответствующие им значения, которые применяются здесь взаимозаменяемо: г - грамм(-ы); мг - миллиграмм(-ы); мл - миллилитр(-ы); КТ - комнатная температура;- 15006368 ПЭГ - полиэтиленгликоль. Полное содержание всех публикаций, патентов и патентных заявок, цитируемых в данном описании, включено сюда в качестве ссылки, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были бы конкретно и индивидуально обозначены, как включенные в качестве ссылки. Хотя указанное выше изобретение было описано в некоторых подробностях путем иллюстрации и приведения примеров с целью облегчения восприятия, специалист в данной области в свете изложения данного изобретения легко поймет, что могут быть сделаны изменения и модификации без уклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Последующие примеры предоставляются лишь с иллюстративными целями и не предназначены для ограничения объема изобретения, который описан выше в широком смысле. В последующих примерах полипептид ProGP представляет собой ProGP-4, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 12. Очевидно, что другие представители семейства ProGP можно также модифицировать ПЭГ сходным образом, как это описано в последующих примерах. Примеры Пример 1. ProGP-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 30000. ПЭГ-альдегид с молекулярной массой 5000, 20000 и 30000. В данном примере демонстрируется способ получения по существу гомогенных препаратов модифицированного одной молекулой ПЭГ с N-конца ProGP путем восстановительного алкилирования. Реагент метокси-линейный ПЭГ-пропиональдегид с молекулярной массой, примерно равной 30000,(Shearwater Polymers Inc.) избирательно связывали посредством восстановительного аминирования с Nконцом ProGP, пользуясь преимуществом различия относительного значения рКа первичного амина наN-конце по сравнению со значениями рКа первичных аминов в -положении аминогруппы остатков лизина. Белок ProGP, растворенный до 1-5 мг/мл в 10 мМ сукцинате натрия, рН 5,0, или в 10 мМ сукцинате натрия (J. Т. Baker, Phillipsburg, Нью-Джерси), 8%-ном ацетонитриле (Burdick and Jackson, Muskegon,Мичиган), рН 5,0, подвергали взаимодействию с метокси-ПЭГ-пропиональдегидом, M-PEG-ALD,(Shearwater Polymers Inc., Huntsville, Алабама) путем добавления твердого M-PEG-ALD с получением относительного молярного соотношения ПЭГ:ProGP (димер), равного 2-12:1. Реакции катализировали путем добавления матричного раствора 1 М NaCNBH4 (Sigma Chemical, Сент-Луис, Миссури), разведенного в Н 2 О до конечной концентрации, равной 10 мМ. Реакции проводили в темноте при 4 С в течение 18-24 ч. Реакции останавливали добавлением 1 МTris-основания (Sigma Chemical, Сент-Луис, Миссури) до конечной концентрации Tris, равной 50 мМ, и конечного рН, равного 8,5. Пример 2. ProGP-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 20000. Реагент метокси-ПЭГ-пропиональдегид, где ПЭГ представляет собой ПЭГ с линейной цепью и молекулярной массой 20000, (Shearwater Polymers Inc.) присоединяли к N-концу ProGP с использованием процедуры, описанной для примера 1. Пример 3. ProGP-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 50000. Реагент метокси-ПЭГ-пропиональдегид, где ПЭГ представляет собой ПЭГ с линейной цепью и молекулярной массой 50000, (Fluka) присоединяли к N-концу ProGP с использованием процедуры, описанной для примера 1. Пример 4. ProGP-ПЭГ с разветвленной цепью, имеющий молекулярную массу 40000. ПЭГ 2-АLD, молекулярная масса 40000 Реагент (ПЭГ 2-АLD) метокси-ПЭГ-пропиональдегид, где ПЭГ представляет собой ПЭГ с разветвленной цепью и молекулярной массой 40000, (ПЭГ 2-АLD) (Shearwater Polymers Inc.) присоединяли к Nконцу ProGP с использованием процедуры, описанной для примера 1. Пример 5. ProGP-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 20000.SPA-ПЭГ 5 с молекулярной массой 20000 В данном примере демонстрируется способ получения по существу гомогенных препаратов модифицированного одной молекулой ПЭГ прогенипоэтина (ProGP) с использованием активных сложных эфиров N-гидроксисукцинимидила (NHS). Маточный раствор белка ProGP растворяли до 1-5 мг/мл в 10 мМ сукцинате натрия, рН 5,0, титровали до рН 7,2 путем добавления 0,25 М буфера HEPES. Затем раствор подвергали взаимодействию с метокси-ПЭГ-сукцинимидилпропионатом (SPA-ПЭГ) путем добавления твердого SPA-ПЭГ с получением относительного молярного отношения ПЭГ:прогенипоэтин, равного 6,5:1. Реакции проводили при 4 С в течение 1 ч. Реакции останавливали путем снижения рН до 4,0 посредством 0,1 Н уксусной кислоты или путем добавления 5 х молярного избытка Tris-HCl. Подобным образом в отношении ПЭГ молекулярной массой 20000 может использоваться CM-HBA-NHS 5. Двойные эфиры мПЭГ мПЭГ-CM-HBA-NHS Пример 6. ProGP (биотин-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 3400). Биотин-ПЭГ-NHS с молекулярной массой 3400 Реагент с молекулярной массой 3400 биотин-ПЭГ-СО 2-NНS (Shearwater Polymers Inc.) присоединяли к ProGP с использованием процедуры, описанной для примера 5. Пример 7. ProGP-ПЭГ с разветвленной цепью, имеющий молекулярную массу 10000.ProGP с использованием процедуры, описанной для примера 5. Пример 8. ProGP-ПЭГ с разветвленной цепью, имеющий молекулярную массу 20000. Разветвленный ПЭГ 2-SРА с молекулярной массой 20000 (Shearwater Polymers Inc.) присоединяли кProGP с использованием процедуры, описанной для примера 5. Пример 9. ProGP-ПЭГ с разветвленной цепью, имеющий молекулярную массу 40000. Разветвленный ПЭГ 2-SРА с молекулярной массой 40000 (Shearwater Polymers Inc.) присоединяли кProGP с использованием процедуры, описанной для примера 5. Пример 10. ProGP-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 20000. ВТС-ПЭГ с молекулярной массой 20000 ВТС-ПЭГ с молекулярной массой 20000 (Shearwater Polymers Inc.) присоединяли к ProGP с исполь- 17006368 зованием процедуры, описанной для примера 4. В данном примере демонстрируется способ получения по существу гомогенных препаратов модифицированного ПЭГ прогенипоэтина (ProGP) с использованием производных бензотриазола карбоната и ПЭГ. Пример 11. ProGP-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 5000.ProGP с использованием процедуры, описанной для примера 5. В данном примере демонстрируется способ получения по существу гомогенных препаратов модифицированного ПЭГ прогенипоэтина(ProGP) с использованием гидролизуемой связи. Пример 12. ProGP-ПЭГ с линейной цепью, имеющий молекулярную массу 20000. ПЭГ-гидразид с молекулярной массой 20000 В данном примере демонстрируется способ получения по существу гомогенных препаратов модифицированного ПЭГ прогенипоэтина (ProGP) с использованием метокси-ПЭГ-гидразида, HZ-ПЭГ, с молекулярной массой 20000 (Shearwater Polymers Inc.). Маточный раствор белка ProGP растворяли до концентрации 1-5 мг/мл в 10 мМ сукцинате натрия, рН 5,0. Данный раствор затем подвергали взаимодействию с HZ-ПЭГ путем добавления твердого вещества с получением относительного молярного отношения ПЭГ : прогенипоэтин, составляющего 6,5-26:1. Реакции катализировали карбодиимидом (EDC, ЕОАС) в конечной концентрации 2 мМ. Реакции проводили при 4 С в течение 2 ч. Реакции останавливали путем снижения рН до 4 0,1 н уксусной кислотой. Примеры 13. Виды молекул, модифицированные несколькими молекулами ПЭГ. По примерам 1-4 также получали модифицированные ProGP, содержащие две присоединенные молекулы ПЭГ или более (модифицированные несколькими молекулами ПЭГ), и отделяли их от видов молекул, модифицированных одной молекулой ПЭГ, с использованием анионообменной хроматографии. Модифицированные ProGP, содержащие две присоединенные молекулы ПЭГ или более (модифицированные несколькими молекулами ПЭГ), также отделяли от видов молекул, модифицированных одной молекулой ПЭГ, с использованием катионообменной хроматографии. Модифицированные ProGP, содержащие две присоединенные молекулы ПЭГ или более (модифицированные несколькими молекулами ПЭГ), также могут быть получены по примерам 5-13 и могут быть очищены способом, сходным с таковым для примеров 1-4. Пример 14. Очистка модифицированного ПЭГ ProGP. Модифицированные ПЭГ молекулы ProGP очищали от реакционной смеси до 95% (SEC-анализ) с использованием единственной стадии ионообменной хроматографии. Анионообменная хроматография. Модифицированные одной молекулой ПЭГ-альдегида массой 30 кДа, 20 кДа и 5 кДа молекулыProGP очищали от реакционной смеси до 95% (SEC-анализ) с использованием единственной стадии анионообменной хроматографии. Модифицированный ПЭГ ProGP очищали от немодифицированногоProGP и модифицированных несколькими ПЭГ молекул ProGP с использованием анионообменной хроматографии (фигура 1). Типичную реакционную смесь ProGP-ПЭГ-альдегида массой 30 кДа (50-350 мг белка), описанную выше, очищали на высокоэффективной колонке с Q-Sepharose (XK 26/20, объем слоя 70 мл, Amershara Pharmacia Biotech, Piscataway, Нью-Джерси), уравновешенной 50 мМ Tris, pH 8,5 (буфер А). Реакционную смесь разбавляли 550 мМ Tris с 8% ацетонитрилом, рН 8,5, и загружали на колонку со скоростью потока, равной 10 мл/мин. Колонку промывали 5 объемами колонки буфера А, а затем 5 объемами колонки буфера А, содержащего 30 мМ NaCl. Впоследствии различные молекулы ProGP элюировали из колонки 20 объемами колонки буфера А и линейным градиентом NaCl, представляющим собой 30-130 мМ. Измеряли поглощение элюируемого раствора при 280 нм (A280) и собирали фракции объемом 12 мл. Фракции объединяли по степени модификации ПЭГ, например, моно-, ди-, три- и т.д.(как оценивается в примере 15). рН объединенной фракции снижали до 7,5 с использованием 1 М НСl и затем ее концентрировали до 1-5 мг/мл в концентраторе Omegacell с перемешиванием в ячейке и фильтром 10 кДа (Filtron Technology Corporation, Northborough, Массачусетс). Концентрацию белка в объединенной фракции определяли по А 280 с использованием коэффициента экстинкции 0,97%. Общий выход очищенного модифицированного одной молекулой ПЭГ-альдегида массой 30 кДа ProGP по данному способу составлял 25-30%. Катионообменная хроматография.- 18006368 Катионообменную хроматографию проводили на высокоэффективной колонке с SP Sepharose(Pharmacia XK 26/20, объем слоя 70 мл), уравновешенной 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (буфер С). Реакционную смесь разбавляли 10 буфером С и загружали на колонку со скоростью потока 5 мл/мин. Затем колонку промывали 5 объемами колонки буфера С, а затем 5 объемами колонки 12%-ного буфера D(10 мМ ацетат, рН 4,5, 1 М NaCl). Впоследствии молекулы ПЭГ-ProGP элюировали из колонки линейным градиентом от 12 до 27% буфера D в 20 объемах колонки. Измеряли поглощение элюируемого раствора при 280 нм (А 280) и собирали фракции объемом 10 мл. Фракции объединяли по степени модификации ПЭГ (моно-, ди-, три-, и т.д.), обменивали буфер на 10 мМ ацетат с рН 4,5 и концентрировали до 1-5 мг/мл в ячейке с перемешиванием, присоединенной к мембране Amicon YM10. Концентрацию белка в объединенной фракции определяли по А при 280 нм с использованием коэффициента экстинкции 0,71. Общий выход очищенного модифицированного одной молекулой ПЭГ ProGP по данному способу составлял от 10 до 50%. Пример 15. Биохимическая характеристика. Очищенные объединенные фракции модифицированного ПЭГ ProGP характеризовали посредствомSDS-PAGE (фиг. 3), гель-фильтрации неденатурирующих и денатурирующих условиях (фиг. 2, 4), RPHPLC (фиг. 5), трипсинового картирования (фиг. 7) и MALDI-TOF (6). Высокоэффективная жидкостная хроматография по принципу гель-фильтрации (SEC-HPLC).SEC-HPLC при неденатурирующих условиях. Реакционную смесь метокси-ПЭГ-пропиональдегида с молекулярной массой 30 кДа и ProGP подвергали анионообменной очистке и конечные очищенные продукты оценивали с использованием SECHPLC при неденатурирующих условиях (фигура 2 а, 2b). Аналитическую SEC-HPLC при неденатурирующих условиях проводили с использованием колонки Superdex 200 HR 10/30 (Amersham PharmaciaBiotech, Piscataway, Нью-Джерси) в 50 мМ Tris, pH 7,5, 150 мМ NaCl при скорости потока, равной 0,4 мл/мин. Модификация ПЭГ сильно повышает гидродинамический объем белка, что приводит к сдвигу к более короткому времени задержки. Два вида молекул, модифицированных ПЭГ, наблюдали в реакционной смеси ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 30 кДа и ProGP вместе с немодифицированным ProGP. Данные модифицированные ПЭГ и немодифицированные молекулы разделяли путем хроматографии наQ-Sepharose (фиг. 1), и впоследствии было показано, что полученный в результате очищенный модифицированный одной молекулой ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 30 кДа ProGP элюировался в виде единственного пика при SEC-HPLC в неденатурирующих условиях (чистота 95%, фиг. 2 с). Стадия хроматографии на Q-Sepharose эффективно удаляла свободный ПЭГ, немодифицированный ПЭГ димерProGP и модифицированные несколькими молекулами ПЭГ виды молекул от модифицированного одной молекулой ПЭГ ProGP.SEC с денатурацией SDS, при которой диссоциирует нековалентный димер ProGP, использовали для демонстрации того, что модифицированный одной молекулой ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 30 кДа ProGP модифицирован ПЭГ только на одной субъединице (мономере) димера ProGP (фиг. 4).SEC-HPLC при денатурирующих условиях проводили тем же способом, как описано для SEC-HPLC, при неденатурирующих условиях за исключением того, что в составе используемого буфера был 0,1% SDS. Элюцию белка отслеживали измерением поглощения при 220 нм. Очищенный модифицированный одной молекулой ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 30 кДа ProGP, который элюируется как единственный пик на SEC при неденатурирующих условиях, разделялся на модифицированную ПЭГ субъединицу и не модифицированную ПЭГ субъединицу (как идентифицировано ниже) в денатурирующих условиях.SDS-PAGE, при котором диссоциирует нековалентный димер ProGP, использовали для демонстрации чистоты и того, что ProGP-ПЭГ-альдегид массой 30 кДа модифицирован ПЭГ только по одной субъединице (мономеру) димера ProGP (фигура 3). SDS-PAGE проводили на 12%-ных Tris-глициновых гелях толщиной 1 мм (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и окрашивали с использованием набора для окрашивания гелей Novex Colloidal Coomassie G-250(Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Очищенный модифицированный одной молекулой ПЭГ-альдегида массой 30 кДа ProGP, который элюируется в виде единого пика при SEC в неденатурирующих условиях,разделяется на модифицированную ПЭГ субъединицу и немодифицированную ПЭГ субъединицу. Обращенно-фазовая HPLC (RP-HPLC).RP-HPLC проводили на колонке Phenomenex Jupiter C18 (4,6 х 250 мм, размер частиц 5 мкм) при температуре 50 С; образцы загружали на колонку, уравновешенную 40% ацетонитрилом, 0,1% TFA, при 1 мл/мин. Колонку промывали 3 мл 58%-ного ацетонитрила. Впоследствии белок элюировали градиентом от 58 до 63% ацетонитрила в течение 27 мин. Препаративную и аналитическую RP-HPLC проводили на колонке Jupiter C18, 4,6250 мм, размер частиц 5 мкм, (Phenomenex, Torrance, Калифорния) при температуре 50 С. Образцы загружали на колонку, уравновешенную 40% ацетонитрилом, 0,1% TFA, при 1 мл/мин. Колонку промывали 3 мл 58%-ного- 19006368 ацетонитрила. Впоследствии белок элюировали градиентом от 58 до 63% ацетонитрила в течение 27 мин. Элюируемый растворитель тестировали, измеряя поглощение при 214 нм. Очищенный PEG-ProGP, который элюируется в виде единственного пика при SEC в неденатурирующих условиях, разделяется (фиг. 5) на модифицированную ПЭГ субъединицу и немодифицированную ПЭГ субъединицу (как определено выше) при денатурирующих условиях. Для подтверждения идентичности каждого вида молекулы пики от элюции RP-HPLC (фиг. 5) собирали для экспериментов с использованием MALDI-TOF MS и Nконцевого секвенирования.N-концевое секвенирование и пептидное картирование. Химию автоматической деградации по Эдману использовали для определения NH2-концевой белковой последовательности (SOP 400.324). Для деградации использовали секвенатор Applied BiosystemsApplied Biosystems Model 140C, соединенного с РТН-С 18-колонкой Elmer/Brownlee с внутренним диаметром 2,1 мм. Результатом N-концевого секвенирования пика RP-HPLC (фиг. 5), соответствующего правильной массе ПЭГ-ProGP, являлись два сигнала. Основной сигнал (выход примерно 75%) характеризовался ожидаемой для ПЭГ-ProGP последовательностью, за исключением отсутствия N-концевой аминокислоты. Данный результат является ожидаемым для белка, модифицированного ПЭГ с N-конца. Остаток первого цикла был невыявляемым вследствие присоединенной группы ПЭГ. Более слабый сигнал(выход примерно 25%) характеризовался правильной N-концевой аминокислотной последовательностью. Имея ввиду то, что пик, собранный после RP-HPLC, является на 100% модифицированным ПЭГ, эти данные указывают на то, что 75% модификации ПЭГ осуществляется по N-концу, при том, что остаток,очевидно, характеризуется связыванием по одному из нескольких возможных остатков лизина. Расщепление трипсином. Модифицированный ПЭГ ProGP расщепляли в концентрации 1 мг/мл трипсином (Promega) в PBS модификации Дульбекко (Pierce), 10 мМ Tris, pH 7,5 (Sigma). Трипсин использовали в отношении 50:1 перерастворенным в 40% ACN (BJ), 0,1% TFA (Pierce). После расщепления в течение ночи при 37 С добавляли вторую аликвоту трипсина, и раствор снова расщепляли в течение ночи при 37 С. Расщепление останавливали 5% 1,0 н. НСl (Fisher), и, если необходимо, продукт расщепления хранили при 4 С до применения. 175 мкл наносили на колонку TosoHaas 3000PW, уравновешенную 35% ACN, 0,1% TFA,при 0,5 мл/мин, и элюировали в течение 50 мин (фиг. 7). Фракции собирали вручную от 0 до 25 мин. Фракцию, содержащую модифицированные ПЭГ фрагменты, подвергали секвенированию по Эдману. Данные результаты указывали на то, что примерно 77% конъюгации с ПЭГ происходило по альфааминогруппе N-концевого аланина, при том, что оставшиеся 23% распределялись как 14% на К 284, 5% на К 201 и 4% на К 252. Времяпролетная масс-спектрометрия по принципу опосредованной матрицей лазерной десорбцииионизации (MALDI-TOF MS). Очищенные при помощи RP-HPLC модифицированные ПЭГ, немодифицированные ПЭГ мономерыProGP концентрировали и примерно 1 мкл концентрата наносили на мишень для MALDI с 3,5 диметокси-4-гидроксикоричной кислотой в качестве матрицы. Спектры получали с использованием Perseptive Biosystems Voyager MALDI-TOF (Perseptive Biosystems) путем детекции положительно заряженных ионов в линейном режиме. Сто двадцать три сканирования было собрано и усреднено. Массы вычисляли с использованием BSA в качестве стандарта. Путем MALDI-TOF MS подтверждали правильные массы каждой субъединицы, как модифицированного одной молекулой ПЭГ массой 30000 Да мономераProGP-4 (ПЭГ-ProGP) (фиг. 6) и немодифицированного ПЭГ мономера ProGP-4 (данные не показаны). Элюирумый ранее пик характеризовался молекулярной массой 71000 Да, соответствующей ПЭГ массой 32000 Да плюс ProGP-4 массой 39000 Да. Элюируемый позднее пик характеризовался молекулярной массой, правильной для ProGP-4 (39000 Да). Пример 16. Анализ пролиферации клеток BaF3/G-CSFR. Мышиные клеточные линии BaF3, трансфицированные генами, кодирующими рецептор G-CSF человека (mBaF3/hG-CSFR), использовали для оценки активности агониста hG-CSF. Клетки mBaF3/hGCSFR высевали при 2,5104 клеток/лунку в 96-луночные планшеты для микротитрования, содержащие серийное разведение ProGP и модифицированного ПЭГ ProGP. Через Т = 56 ч клетки подвергали воздействию [метил-3 Н]-тимидином при 0,5 мКи на лунку в течение 18 ч. Содержимое планшетов собирали на стекловолоконные фильтровальные матрасы и измеряли включенную радиоактивность путем сцинтилляционной спектроскопии. Среда анализа для клеточных линий состояла из IMDM, дополненной бычьим сывороточным альбумином (BSA) (Boehringer Mannheim, Индианаполис, Индиана), 500 мкг/мл, человеческим трансферрином (Sigma, St. Louis, Монтана), 100 мкг/мл, липидной составляющей, включавшей в себя 2,5 мл фосфатидилхолина/мл BSA, и 50 мМ 2-меркаптоэтанолом. Активность ПЭГ ProGP в качестве агониста рецептора G-CSF усиливалась по сравнению с ProGP-4 (таблица 1). Значение ЕС 50 для ПЭГProGP (0,005 нМ) было примерно в 4 раза ниже (р 0,05), чем то, что было определено для ProGP-4(0,021 нМ). Пример 17. Анализ клеточной пролиферации Baf3/Flt3.- 20006368 Химерную молекулу рецептора Flt3/G-CSF конструировали с использованием внеклеточного и трансмембранного доменов человеческого Flt3, лидерной последовательности человеческого IL-3 и цитоплазматического домена рецептора человеческого G-CSF. Полученную в результате конструкцию использовали для трансфекции линии лимфоидных клеток мыши Baf/3. По описанному протоколу продуцировали стабильные клоны Baf/3, которые пролиферировали в ответ на человеческий FL, но не на другие протестированные человеческие цитокины. Данную клональную линию использовали для анализа присущей ProGP и модифицированному ПЭГ ProGP активности агониста Flt3. Клетки высевали при 2,5104 клеток/лунку в 96-луночные планшеты для микротитрования, содержащие серийные разведения каждого фактора роста в бессывороточной IMDM, дополненной человеческим трансферрином (100 мкг/мл), липидной составляющей, включавшей в себя 2,5 мл фосфатидилхолина/мл бычьего сывороточного альбумина (500 мкг/мл), и 50 мкМ 2-меркаптоэтанолом. Через 56 ч клетки подвергали воздействию[метил-3 Н]-тимидином при 0,5 мкКи на лунку в течение 14-18 ч, собирали и измеряли включенную радиоактивность путем сцинтилляционной спектроскопии. Модифицированные ПЭГ формы ProGP сохраняли биологическую активность ProGP-4 (табл. 1). Таблица 1. Сравнение индуцируемой ProGP-4 и модифицированного ПЭГ-ALD массой 30 кДа Пример 18. Клоногенные анализы КОЕ-ГМ. Размножение кроветворных предшественников демонстрировали с использованием происходящих из костного мозга человека клеток CD34 + в анализе колониеобразующих единиц гранулоцитов/макрофагов (КОЕ-ГМ), в котором клоногенные предшественники делятся и дифференцируются в полужидкой среде в ответ на действие факторов роста. Свежие образцы костномозговой (КМ) жидкости получали при сотрудничестве с St. Louis University Medical School. Фракции мононуклеарных клеток получали после центрифугирования в градиенте плотности с использованием Ficoll-Hypaque. Затем клетки CD34+ (стволовые и предшественники) выделяли путем позитивного отбора с использованием набора реагентов для стволовых клеток Isolex 50 (Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Иллинойс). По данной процедуре получали обогащенный клеточный продукт, в котором 90% клеток экспрессировали антиген клеточной поверхности CD34+. Данные клетки CD34+ высевали на чашки для тканевой культуры размером 35 мм (10000 клеток/чашку) в MethoCult H4230 (StemCell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия), содержащей 0,9% метилцеллюлозы в среде Дульбекко, модифицированной по Iscove (IMDM) ,30% FBS, 1% BSA, 1 мМ 2-меркаптоэтанола и 2 мМ L-глутамина. Культуры инкубировали с факторами роста в течение 10-12 суток при 37 С в увлажненном воздухе,содержащем 5% СО 2. Концентрации соответствующих агонистов рецептора в экспериментах с совместным добавлением являются эквимолярными на указанном уровне концентрации. Кроветворные колонии(50 клеток) подсчитывали с использованием обратного микроскопа. Индуцированная ПЭГ-ProGP дифференцировка и размножение кроветворных клеток-предшественников в колониеобразующие единицы гранулоцитарных/макрофагальных клеток (КОЕ-ГМ) была равной ответу, вызванному ProGP-4 или одновременным введением человеческого flt3-лиганда и hG-CSF (фиг. 8). Пример 19. Введение факторов роста для исследования фармакокинетики (РК). Самок мышей C57BL/6 (возраст 8-12 недель, Charles River, Raleigh, Северная Каролина) держали в виварии Pharmacia. ProGP и модифицированный ПЭГ ProGP разводили в PBS (Life Technologies, GrandIsland, Нью-Йорк) и вводили мышам в дозе 100 мкг/инъекцию. Мышам вводили единственную подкожную дозу (SC).- 21006368 Концентрации белков ProGP и модифицированного ПЭГ ProGP в плазме мышей определяли с использованием "сэндвич"-метода ELISA. 96-луночные планшеты для микротитрования покрывали 150 мл/лунку аффинно очищенного поликлонального антитела козы против Flt3-лиганда, разведенного до 1 мкг/мл в 100 мМ NaHCO3, рН 8,2. Планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре в увлаженной камере и блокировали в течение одного часа при 37 С фосфатно-солевым буфером, содержащим 3% BSA и 0,05% полиоксиэтиленсорбитана монолаурата (Tween 20), рН 7,4. Планшеты промывали четыре раза 150 мМ раствором NaCl, содержащим 0,05% Tween 20 (буфер для промывки). Образцы плазмы РК разводили в буфере для анализа (PBS, 0,1% BSA, 0,01% Tween 20), рН 7,4, и титровали 1:2 в матрице для анализа, состоящей из объединенной мышиной плазмы. Плазменные концентрации матрицы и образцов уравнивали по процентному содержанию. Планшеты инкубировали в течение 2,5 ч при 37 С в увлажненной камере, затем промывали 4 раза буфером для промывки. Аффинно очищенное поликлональное антитело козы против агониста человеческого рецептора G-CSF, конъюгированное с пероксидазой хрена, разводили 1:10000 (0,25-0,05 мкг/мл) в буфере для анализа и в каждую лунку добавляли 150 мкл. Планшеты инкубировали в течение 1,5 ч при 37 С в увлажненной камере. Лунки опустошали и каждую лунку снова промывали четыре раза буфером для промывки. Каждую лунку затем загружали 150 мкл раствора субстрата пероксидазы ТМВ. Планшеты инкубировали при комнатной температуре примерно в течение 10 мин и считывали при тестируемой длине волны 650 нм в многоканальном спектрофотометре для планшетов микротитрования (Molecular Devices Corporation). Концентрации иммунореактивного ProGP в неисследованных образцах РК рассчитывали из стандартной кривой для ProGP-4 или ПЭГ-ProGP с использованием программы подгонки кривой по четырем параметрам Molecular Devices. Анализ данных по фармакокинетике. Параметры РК, приведенные в табл. 2, определяли посредством неразделенного анализа с использованием WinNonlin (версия 3.0, Pharsight, Chapel Hill, Северная Каролина). Данные по концентрации в плазме (n=3) усредняли и проводили один анализ РК на среднем значении. Очевидный окончательный период полужизни (t1/2) выбирали вручную во время неразделенного анализа путем визуального обследования логарифмически-линейного графика зависимости концентрации в плазме от времени. Сравнение фармакокинетики ProGP-4 и ПЭГ-ProGP показано на фиг. 9 и табл. 2. Эти данные показывают, что единичная доза ПЭГ-ProGP, равная 100 мкг, введенная мыши подкожно, характеризуется продленным временем пребывания в плазме по сравнению с таковым для ProGP-4. Через 48 ч концентрация ПЭГ-ProGP в плазме была примерно в 70 раз выше, чем для ProGP-4. Детектируемый уровень ПЭГ-ProGP наблюдали через 96 ч после дозировки, в то время как ProGP-4 не детектировали через 72 ч. Такие значения РК, как конечный период полужизни (t1/2), клиренс (С 1), время достижения максимальной концентрации (Тmах) и максимальная концентрация (Cmax), для ПЭГ-ProGP и ProGP-4 существенно не отличались. Таким образом, модификация ПЭГ продлевает время, в течение которого белок циркулирует в крови мыши. Таблица 2. Сравнение фармакокинетики ProGP-4 и ПЭГ-РrоGР-4 (пример 1) у мышей. Введение факторов роста для исследования фармакодинамики (PD). Самок мышей C57BL/6 (возраст 8-12 недель, Charles River, Raleigh, Северная Каролина) содержали в виварии Pharmacia. ProGP-4 и ПЭГ-ProGP разводили в PBS (Life Technologies, Grand Island, Нью-Йорк) и вводили мышам в дозах, варьирующих от 100 до 500 мкг/инъекцию. Мышам делали подкожные (SC) инъекции следующим образом: ProGP-4 вводили ежесуточно на 0-6 сутки или на 0-9 сутки (0,1 мг/инъекцию); ПЭГ-ProGP вводили на 0, 3 и 6 сутки или на 0, 3, 6 и 9 сутки (0,3 мг/инъекцию); ПЭГProGP вводили на 0 сутки или на 0 и 5 сутки (0,5 мг/инъекцию). Контроль в виде носителя вводили ежесуточно на 0-9 сутки с использованием PBS (0,1 мл/инъекцию). Переработка периферической крови и селезенки. Периферическую кровь собирали от анестезированных посредством СО 2 мышей в покрытые гепарином пробирки путем пункции сердца. Селезенки собирали от подвергнутых эвтаназии животных непосредственно после сбора крови. Подсчет общего числа лейкоцитов (WBC) проводили на цельной крови с- 22006368 использованием устройства для подсчета клеток (Coulter ZM, Miami Lakes, Флорида). Эритроциты лизировали с использованием 0,15 М гипотонического раствора хлорида аммония (Stem Cell Technology,Ванкувер, Британская Колумбия). Клетки собирали центрифугированием (300g в течение 10 мин) и промывали холодной IMDM (Life Technologies, Grand Island, Нью-Йорк), содержащей 2% FBS (IMDMFBS, Bioproducts for Science, Индианаполис, Индиана). Селезенки собирали и перерабатывали в холодной IMDM-FBS, гомогенизировали до клеточной суспензии и фильтровали через нейлоновое сито с отверстием 70 мкм. Эритроциты лизировали с использованием гипотонического раствора хлорида аммония, клетки селезенки промывали холодной IMDM-FBS и фильтровали через сито с отверстием 70 мкм. Клетки селезенки ресуспендировали в 25 мл буфера IMDM, содержащего 2% BSA, и подсчитывали с целью определения числа спленоцитов в селезенке. Реагенты для проточной цитометрии. Моноклональные антитела, конъюгированные с флуорохромом или биотином, приобретали отPharmingen (San Diego, Калифорния). CD16/CD32 (антитело к Fc-рецептору II/III, блок Fc), конъюгированные с FITC антитела против CDllc/HL3 и конъюгированные с РЕ антитела против МНС класса II (IAb//AF6-120.1) использовали в концентрации 1-5 мкг/мл. Подходящие по изотипу контроли использовали для разных комбинаций антител. Реакции общих лейкоцитов (WBC) и дендритных клеток (DC) в селезенке были сходными для ПЭГProGP, вводимого каждые третьи сутки, по сравнению с ProGP-4, вводимым ежесуточно (фиг.10). Относительная реакция DC в периферической крови на 10 сутки была выше для ПЭГ-ProGP, вводимого каждые третьи сутки, по сравнению с ProGP-4, вводимым ежесуточно. Кинетики мобилизации DC (фиг. 11) были сходными для ProGP-4 и ПЭГ-РrоGР-4 (пример 1) в селезенке; тогда как в периферической крови кинетики модификации DC были модифицированы для ПЭГ-ProGP-4 (пример 1), вводимого каждые третьи сутки, по сравнению с ProGP-4, вводимым ежесуточно. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Конъюгат прогенипоэтина, характеризующийся по крайней мере одной молекулой водорастворимого полимера, ковалентно присоединенной по крайней мере к одному аминокислотному остатку биологически активного полипептида прогенипоэтина. 2. Конъюгат прогенипоэтина по п.1, где указанный полимер представляет собой молекулу полиэтиленоксида. 3. Конъюгат прогенипоэтина по п.2, где указанная молекула полиэтиленоксида представляет собой молекулу полиэтиленгликоля. 4. Конъюгат прогенипоэтина по п.3, где полиэтиленгликоль присоединен к аминокислотному остатку, имеющему свободную амино-, карбоксильную или сульфгидрильную группу(-ы). 5. Конъюгат прогенипоэтина по п.4, где указанный полиэтиленгликоль конъюгирован посредством активированного полиэтиленгликоля. 6. Конъюгат прогенипоэтина по п.5, где указанный активированный полиэтиленгликоль выбран из группы, состоящей из паранитрофенила, сукцинимидила, карбонилимидазола, азлактонов, циклических имидтиокетонов, изоцианатов, изотиоцианатов, альдегидов, первичных аминов, гидразина, ацилгидразидов, карбазатов, семикарбаматов, тиокарбазатов, тиолов, малеимидов, сульфонов и фенилглиоксалей. 7. Конъюгат прогенипоэтина по п.6, где указанный активированный полиэтиленгликоль выбран из группы, состоящей из сукцинимидила, карбонилимидазола, альдегидов, ацилгидразидов, карбазатов,семикарбаматов и малеимидов. 8. Конъюгат прогенипоэтина по п.7, где указанный полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой примерно от 0,5 до 100 кДа. 9. Конъюгат прогенипоэтина по п.8, где указанный полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой примерно от 3,4 до 40 кДа. 10. Конъюгат прогенипоэтина по п.4, где указанный полиэтиленгликоль является разветвленным полимером. 11. Конъюгат прогенипоэтина по п.10, где разветвленный полимер полиэтиленгликоля характеризуется молекулярной массой примерно от 10 до 40 кДа. 12. Конъюгат прогенипоэтина по п.4, где указанный полиэтиленгликоль является бифункциональным полимером. 13. Конъюгат прогенипоэтина по пп.1-11 или 12, где указанный полипептид прогенипоэтин характеризуется формулойR1-L1-R2, R2-L1-R1, R1-R2 или R2-R1,где R1 представляет собой полипептид, включающий модифицированную аминокислотную последовательность лиганда flt-3 формулы где N-конец присоединен к С-концу непосредственно или через линкер (L2), способный соединять Nконец с С-концом и имеющий новые С- или N-концы у аминокислот где R2 представляет собой фактор, выбранный из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора, цитокина, лимфокина, интерлейкина и кроветворного фактора роста; где L1 представляет собой линкер, способный связывать R1 с R2; и указанному белку прогенипоэтину может непосредственно предшествовать (метионин-1),(аланин-1) или (метионин-2, аланин-1). 14. Композиция, включающая белок прогенипоэтин по пп.1-11 или 12, и по крайней мере один фармацевтически приемлемый носитель. 15. Способ лечения пациента, имеющего нарушение кроветворения, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата прогенипоэтина по пп.1-11 или 12. 16. Способ по п.15, где указанное нарушение кроветворения представляет собой нейтропению, лейкопению, тромбоцитопению или анемию. 17. Способ по п.16, где указанное нарушение кроветворения представляет собой результат химиотерапии, радиационной терапии или применения лекарственных средств, подавляющих костный мозг. 18. Способ лечения пациента, восстанавливающегося и/или страдающего от трансплантации костного мозга, ожога, ранения, паразитарной, бактериальной или вирусной инфекции, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата прогенипоэтина по пп.1-11 или 12. 19. Способ мобилизации кроветворных предшественников и стволовых клеток в периферическую кровь, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата прогенипоэтина по пп.1-11 или 12. 20. Способ продукции дендритных клеток, включающий стадииa) отделения кроветворных клеток-предшественников или клеток CD34+ от других клеток иb) культивирования указанных кроветворных клеток-предшественников или клеток CD34+ в ростовой среде, содержащей кроветворный белок по пп.1-11 или 12. 21. Способ по п.20, дополнительно включающий стадию с) воздействия на указанные культивируемые кроветворные клетки-предшественники или клеткиCD34+ антигена. 22. Способ по п.20, где указанная ростовая среда дополнительно содержит один или несколько факторов, выбранных из группы, состоящей из GM-CSF, IL-4, TNF-, фактора стволовых клеток (SCF), лиганда flt-3, IL-3, варианта IL-3, белка слияния - варианта IL-3 и многофункционального агониста рецепторов. 23. Способ по п.21, где указанная ростовая среда дополнительно содержит один или несколько фак- 24006368 торов, выбранных из группы, состоящей из GM-CSF, IL-4, TNF-, фактора стволовых клеток (SCF), лиганда flt-3, IL-3, варианта IL-3, белка слияния - варианта IL-3 и многофункционального агониста рецепторов. 24. Способ лечения человека, имеющего опухоль, инфекцию или аутоиммунное заболевание, включающий стадию введения указанному человеку кроветворного белка по пп.1-11 или 12. 25. Способ по п.24, дополнительно включающий введение одного или нескольких факторов, выбранных из группы, состоящей из GM-CSF, IL-4, TNF-, фактора стволовых клеток (SCF), лиганда flt-3,IL-3, варианта IL-3, белка слияния - варианта IL-3 и многофункционального агониста рецепторов. 26. Способ конъюгирования полиэтиленгликоля с нуклеофилом, где конъюгацию проводят в присутствии неорганического растворителя.
МПК / Метки
МПК: A61K 38/00
Метки: модифицированные, конъюгаты, химически, прогенипоэтина
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-6368-himicheski-modificirovannye-konyugaty-progenipoetina.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Химически модифицированные коньюгаты прогенипоэтина</a>
Химически пассивированное изделие из магния или его сплавов
Номер патента: 4143
Опубликовано: 26.02.2004
Авторы: Курце Петер, Колер Марко, Крюгер Ульрике, Банерье Дора
МПК: C23C 22/68
Метки: изделие, пассивированное, магния, сплавов, химически
Формула / Реферат:
1. Изделие из магния или его сплавов, поверхность которого полностью или частично покрыта конверсионным покрытием, отличающееся тем, что конверсионное покрытие содержит MgO, Mn2O3 и MnO2, а также по меньшей мере один оксид металла, выбранного из группы, включающей ванадий, молибден и вольфрам. 2. Изделие по п.1, отличающееся тем, что конверсионное покрытие получено пассивированием изделия в водном пассивирующем электролите, при этом такой...
Способ производства химически высокоактивной извести в печи
Номер патента: 2327
Опубликовано: 25.04.2002
Автор: Лейвли Ллойд Л.
МПК: B01D 53/50, C01B 13/14, C01B 13/18...
Метки: способ, химически, извести, высокоактивной, печи, производства
Формула / Реферат:
1. Способ производства химически высокоактивной извести в печи для производства в процессах десульфуризации дымового газа, в котором печь представляет такой тип, в которой дымовой газ, включающий диоксид серы, получают от сгорания содержащих серу топлив, причем упомянутый способ включает впрыскивание тонко измельченных частиц известняка в упомянутую печь, в местоположении, в котором температура проходящего через него дымового газа превышает...
Химически индуцированное усиление проницаемости подземного угольного отложения
Номер патента: 849
Опубликовано: 26.06.2000
Авторы: Бросс Стивен В., Риз Уолтер К.
МПК: E21B 43/22
Метки: угольного, подземного, усиление, химически, проницаемости, отложения, индуцированное
Формула / Реферат:
1. Способ извлечения метана из подземного угольного отложения, в котором пробурена, как минимум, одна скважина, включающий: a) нагнетание газообразного окислителя в угольное отложение; b) выдерживание, как минимум, части газообразного окислителя в угольном отложении в течение определенного времени для интенсификации образования трещин в угольном отложении и c) отбор метана из угольного отложения с повышенной скоростью. 2. Способ по п.1, где...
Химически индуцируемое стимулирование подземных углеродистых отложений газообразными окислителями
Номер патента: 926
Опубликовано: 26.06.2000
Авторы: Риз Уолтер К., Бросс Стивен В.
МПК: E21B 43/16, E21F 7/00
Метки: химически, окислителями, индуцируемое, стимулирование, подземных, газообразными, углеродистых, отложений
Формула / Реферат:
1. Способ повышения скорости извлечения метана из подземного углеродистого отложения, в котором пробурена, как минимум, одна скважина, причем указанный способ включает: a) нагнетание газообразного окислителя в упомянутое углеродистое отложение; b) выдерживание, по крайней мере, части газообразного окислителя в упомянутом углеродистом отложении в течение определенного периода времени для стимулирования образования трещин в упомянутом...
Химически индуцируемое усиление образования трещин в подземных каменноугольных отложениях
Номер патента: 1524
Опубликовано: 23.04.2001
Авторы: Бросс Стивен В., Риз Уолтер К.
МПК: E21B 43/26, E21F 7/00
Метки: трещин, подземных, образования, химически, индуцируемое, каменноугольных, усиление, отложениях
Формула / Реферат:
1. Способ повышения скорости извлечения метана из подземного угольного отложения, в котором пробурена, как минимум, одна скважина, посредством нагнетания водного раствора окислителя в упомянутое отложение, выдерживания водного раствора окислителя в упомянутом отложении в течение определенного времени для интенсификации образования трещин в упомянутом угольном отложении и отбора метана из упомянутого угольного отложения с повышенной скоростью,...
Предыдущий патент: Связанные с шизофренией ген и белок потенциал-зависимого воротного ионного канала
Следующий патент: Синтетический способ получения соединения эктеинасцидина
Случайный патент: Промышленный способ производства ароматического карбоната