Сильнодействующие иммуностимуляторы из микроводорослей
Номер патента: 6318
Опубликовано: 27.10.2005
Авторы: Элсохли Хала Ниази, Росс Самир, Элсохли Махмуд, Пу Нирмал, Паско Дэвид Стэнли
Формула / Реферат
1. Иммуностимулирующие препараты, выделяемые из микроводорослей, содержащих полисахариды, экстрагируемые растворителем в виде воды или в виде смеси воды и хотя бы одного низшего алкилового спирта, в котором алкиловая часть состоит из 1-4 атомов углерода и в которой активные полисахариды имеют явную молекулярную массу приблизительно более 2 миллионов Да.
2. Иммуностимулирующий препарат по п.1, отличающийся тем, что иммуностимулирующая активность проявляется в виде активации моноцитов/макрофагов.
3. Иммуностимулирующий препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae.
4. Иммуностимулирующий препарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae.
5. Иммуностимулирующий препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa.
6. Иммуностимулирующий препарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa.
7. Иммуностимулирующий препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis.
8. Иммуностимулирующий препарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis.
9. Иммуностимулирующий препарат по п.3, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из маннозы, глюкозы, рамнозы, галактозы, фукозы, метилированных сахаров и N-ацетилированных аминосахаров.
10. Иммуностимулирующий препарат по п.4, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из маннозы, глюкозы, рамнозы, галактозы, фукозы, метилированных сахаров и N-ацетилированных аминосахаров.
11. Иммуностимулирующий препарат по п.5, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из арабинозы, галактозы, рамнозы, глюкозы и метилированных сахаров.
12. Иммуностимулирующий препарат по п.6, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из арабинозы, галактозы, рамнозы, глюкозы и метилированных сахаров.
13. Иммуностимулирующий препарат по п.7, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из рамнозы, глюкуроновой кислоты, фукозы, галактозы и метилированных сахаров.
14. Иммуностимулирующий препарат по п.8, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из рамнозы, глюкуроновой кислоты, фукозы, галактозы и метилированных сахаров.
15. Фармацевтическая композиция, состоящая из иммуностимулирующих препаратов по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемого носителя или наполнителя.
16. Пищевая добавка, состоящая из иммуностимулирующих препаратов по любому из пп.1-14 и носителя или наполнителя, приемлемого для пищевой добавки.
17. Способ усиления иммунной функции индивидуума, нуждающегося в таком лечении, состоящий во введении упомянутому индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции по п.15.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что индивидуум страдает вирусной, бактериальной или грибковой инфекцией.
19. Способ по п.17, отличающийся тем, что индивидуум страдает раком.
20. Способ по п.17, отличающийся тем, что индивидуум страдает иммунодефицитом.
21. Способ по п.17, отличающийся тем, что индивидуумом является человек.
22. Способ по п.17, отличающийся тем, что индивидуумом является животное.
23. Способ усиления иммунной функции индивидуума, нуждающегося в таком лечении, состоящий во введении упомянутому индивидууму эффективного количества пищевой добавки по п.16.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что индивидуум страдает вирусной, бактериальной или грибковой инфекцией.
25. Способ по п.23, отличающийся тем, что индивидуум страдает раком.
26. Способ по п.23, отличающийся тем, что индивидуум страдает иммунодефицитом.
27. Способ по п.23, отличающийся тем, что индивидуумом является человек.
28. Способ по п.23, отличающийся тем, что индивидуумом является животное.
29. Процесс получения препарата из пищевых микроводорослей, обогащенных иммуностимулирующими полисахаридами, включающий следующие этапы:
a) получение экстракта экстрагированием из микроводорослей с помощью растворителя в виде воды или смеси воды и хотя бы одного низшего алкилового спирта, в котором алкиловая часть состоит из 1-4 атомов углерода при температуре от 4 до 100шC;
b) возможное концентрирование экстракта до небольшого объема, что желательно при большом объеме препарата;
c) осаждение полисахаридного препарата из экстракта средствами осаждения;
d) сепарация осажденного полисахаридного препарата средствами сепарации;
e) промывка выпавшей фазы по этапу (d) спиртом 95%.
30. Процесс по п.29, отличающийся тем, что в качестве спирта при экстрагировании используется этанол.
31. Процесс по п.29, отличающийся тем, что в качестве спирта при экстрагировании используется метанол.
32. Процесс по п.29, отличающийся тем, что в качестве спирта при экстрагировании используется пропанол.
33. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что предпочтительная концентрация спирта на этапе a) составляет 20-80%.
34. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что предпочтительная температура экстрагирования составляет от 40 до 80шC.
35. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae.
36. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa.
37. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis.
38. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) выпариванием растворителя, желательно при пониженном давлении.
39. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) лиофилизацией.
40. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) путем диализа.
41. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе c) полисахаридный препарат осаждается путем введения этанола до получения конечной концентрации этанола приблизительно 80%.
42. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе c) полисахаридный препарат осаждается путем охлаждения экстракта.
43. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе c) полисахаридный препарат осаждается путем добавления соли.
44. Процесс по п.43, отличающийся тем, что в качестве соли применяется сульфат аммония.
45. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем фильтрации.
46. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем центрифугирования.
47. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе e) осажденный полисахаридный препарат промывается раствором этанола концентрацией 95%.
48. Процесс по любому из пп.29-32, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления ультрафильтрацией практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 100000 Да.
49. Процесс по любому из пп.29-32, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления с помощью размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 2 миллионов Да.
50. Способ лечения индивидуума иммуностимулирующим полисахаридным препаратом с целью стимулирования у индивидууьр моноцитной/макрофаговой активности путем введения индивидууму эффективного количества полисахаридного препарата, полученного экстрагированием из пищевых микроводорослей в сочетании с приемлемым носителем.
51. Способ по п.50, отличающийся тем, что иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для усиления заживления ран.
52. Способ по п.50, отличающийся тем, что иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для лечения рака.
53. Способ по п.50, отличающийся тем, что иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для лечения иммунодефицита.
54. Способ по п.50, отличающийся тем, что иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для лечения вирусной, бактериальной или грибковой инфекции.
55. Способ по п.50, отличающийся тем, что индивидуумом является человек.
56. Способ по п.50, отличающийся тем, что индивидуумом является животное.
57. Способ по п.50, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae.
58. Способ по п.50, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa.
59. Способ по п.50, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis.
60. Процесс по п.33, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae.
61. Процесс по п.33, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa.
62. Процесс по п.33, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis.
63. Процесс по п.33, отличающийся тем, что предпочтительная температура экстрагирования составляет от 40 до 80шC.
64. Процесс по п.33, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) выпариванием растворителя, желательно при пониженном давлении.
65. Процесс по п.33, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) лиофилизацией.
66. Процесс по п.33, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) путем диализа.
67. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе c) полисахаридный препарат осаждается путем введения этанола до получения конечной концентрации этанола приблизительно 80%.
68. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе c) полисахаридный препарат осаждается путем добавления соли.
69. Процесс по п.68, отличающийся тем, что в качестве соли применяется сульфат аммония.
70. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе c) полисахаридный препарат осаждается путем охлаждения экстракта.
71. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем фильтрации.
72. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем центрифугирования.
73. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе e) осажденный полисахаридный препарат промывается раствором этанола концентрацией 95%.
74. Процесс по п.33, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 100000 Да ультрафильтрацией.
75. Процесс по п.33, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 2 миллионов Да с помощью размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии.
76. Процесс по п.34, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae.
77. Процесс по п.34, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa.
78. Процесс по п.34, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis.
79. Процесс по п.34, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) выпариванием растворителя, желательно при пониженном давлении.
80. Процесс по п.34, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) лиофилизацией.
81. Процесс по п.34, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) путем диализа.
82. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе c) полисахаридный препарат осаждается путем введения этанола до получения конечной концентрации этанола приблизительно 80%.
83. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе c) полисахаридный препарат осаждается путем добавления соли.
84. Процесс по п.83, отличающийся тем, что в качестве соли применяется сульфат аммония.
85. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе c) полисахаридный препарат осаждается путем охлаждения экстракта.
86. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем фильтрации.
87. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем центрифугирования.
88. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе e) осажденный полисахаридный препарат промывается раствором этанола концентрацией 95%.
89. Процесс по п.34, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 100000 Да ультрафильтрацией.
90. Процесс по п.34, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 2 миллионов Да с помощью размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии.
Текст
006318 В настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США с регистрационным номером 60/217,001, поданной 10.07.2001, которая приводится в данном случае в качестве ссылки. Область техники изобретения Настоящее изобретение относится к способу извлечения иммуностимулирующих полисахаридных препаратов из пищевых микроводорослей. Оно также относится к идентификации иммуностимулирующих водорастворимых полисахаридных препаратов сложной структуры, выделенных из пищевых микроводорослей, содержащих активные полисахариды со средней молекулярной массой выше 2 млн дальтонов. Оно также относится к способам лечения и/или профилактики различных болезненных состояний с использованием препаратов по настоящему изобретению. Предпосылки создания изобретения За последние три десятилетия иммунотерапия стала важным методом лечения болезней и состояний человека, в котором используются схемы модулирования иммунного ответа. Это, в частности, важно при патологических состояниях, когда иммунная система оказывается скомпрометированной. Исследования, проведенные на модельных заболеваниях и с использованием клинических испытаний, продемонстрировали, что механизмы иммунной защиты организма полезны при лечении и профилактике, направленных на микробные инфекции, иммунодефицита, рак и автоиммунные расстройства (1-5). Иммуноусиливающие протоколы также могут использоваться для стимулирования заживления ран. В процессе заживления ран основная роль макрофагов заключается в модулировании деления клеток и образовании новых тканей. Они также выполняют функции фагоцитов, средств санации рановой полости и вызывают факторы роста, которые влияют на этап развития кровеносных сосудов при заживлении ран (6). С точки зрения истории, первыми иммуностимуляторами были бактериальные продукты (лизаты и общие фракции), аттенуированные микробы или подавленные теплом бактерии, в их число входили такие средства, как бациллы Кальметта-Гуерина (Calmette-Guerin), Corynebacterium parvum, и липополисахарид (1, 2). Хотя положительное воздействие этих средств было ограничено токсичностью и побочными эффектами, многие из них получили лицензию Департамента сельского хозяйства США на иммуномодуляцию в ветеринарной медицине (3). Другие вещества были получены из различных источников и включали вещества природного происхождения, вещества, полученные с помощью химического синтеза, или вещества, синтезированные с использованием рекомбинантных технологий. Большая часть иммуностимуляторов природного происхождения - это высокомолекулярные полисахариды, гликопротеины или сложные пептиды (1). Например, три грибковых полисахарида, полученные из Schizophyllum commune(шизофиллан), Lentinus edodes (лентинан) и Coriolus versicolor (крестин), в настоящее время разрешены к клиническому применению в Японии в качестве модификаторов биологической реакции (4). Другой полисахарид - ацеманнан (выделен из Aloe vera) получил лицензию Департамента сельского хозяйства США на лечение фибросаркомы у собак и кошек (7). К ним относятся несколько низкомолекулярных иммуностимуляторов, полученных из природных продуктов, типа гликосфинголипида KRN-7000. В настоящее время проходят клинические исследования с применением KRN-7000 в качестве иммуностимулятора для лечения солидных опухолей (8). Было также получено несколько иммуностимуляторов синтетического происхождения, в число которых входят такие соединения как изопринозин и мурамилпептиды (2). Недавно на основе рекомбинантных технологий, которые были одобрены федеральным Департаментом сельского хозяйства, были получены иммуностимуляторы эндогенного происхождения. К ним относятся колониестимулирующие факторы, интерфероны и рекомбинантные белки (5). Однако эти соединения часто имеют короткий полупериод жизни и поэтому трудно определить оптимальную дозу и соответствующие сочетания. Хотя настоящие иммуностимуляторы представляются перспективными, все еще существует необходимость в разработке сильнодействующих средств, и в увеличении арсенала наличных лекарств для иммунотерапии. Одним источником химически разнообразных соединений, которые можно использовать для открытия лекарственных иммуностимуляторов, являются натуральные продукты. На протяжении столетий натуральные продукты использовались в качестве терапевтически полезных средств, многие из которых и сегодня применяются в медицине. Интерес к природным продуктам, как к средству получения лекарства, основан на их, не имеющем себе равных, разнообразии молекул и на богатом спектре биологической активности (9). С давних времен микроводоросли применялись в качестве источника питательных веществ. Исторические факты говорят о том, что микроводоросли типа Spirulina platensis использовались племенами в окрестностях озера Чад в Африке и ацтеками, жившими приблизительно около озера Текскоко в Мексике (10). В течение нескольких последних десятилетий возрос интерес к коммерческому производству пищевых микроводорослей для употребления их человеком и в качестве корма для скота. Среди различных микроводорослей, которые были исследованы на их коммерческий потенциал, наибольший интерес с точки зрения производства и применения имеют три основных типа, к которым относятся виды Spirulina, виды Chlorella, и Aphanizomenon flos-aquae (AFA). Как в сомнительных отчетах, так и в последних исследованиях по применению пищевых микроводорослей отмечается их усиленная иммунная функция как у животных, так и у человека. При введенииChlorella pyrenoidosa через рот наблюдалось усиление природной активности киллерных клеток (11) иmonocytogenes. Пищевая Spirulina platensis увеличивает активность макрофагов фагоцита у цыплят (13), aSpirulina fusifirmis проявляет хемопревентивные эффекты у человека (14). Было отмечено, что при употреблении человеком Aphanizomenon flos-aquae в пищу наблюдаются изменения в потоке обмена иммунными клетками и усиливается иммунный надзор (15). Активные элементы всех этих эффектов окончательно установлены не были. Из исследованных микроводорослей были выделены различные соединения. Была обнаружено, что ряд полисахаридов и гликопротеинов, выделенных из видов Spirulina и Chlorella обладают противоопухолевой, противовирусной и иммуностимулирующей активностью. В отличие от них, из микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae не было выделено подобных элементов, демонстрирующих какую-либо биологическую активность. Было обнаружено, что ряд полисахаридов, выделенных из видов Chlorella, обладает биологической активностью. В патенте США 4533548 из микроводорослей Chlorella pyrenoidosa был выделен кислый полисахарид, который проявлял противоопухолевую и противовирусную активность (16). Гликозильный состав этого полисахарида был по большей части рамнозой с небольшим количеством галактозы, арабинозы, глюкозы и глюкуроновой кислоты. Другой полисахарид, выделенный из морской Chlorella minutissima в соответствии с патентом США 4831020, обладает эффектом подавления роста опухоли. Однако в нем не приведена его молекулярная масса или гликозильный состав (17). В патенте США 4786496 показано, что липидная фракция (гликолипидная часть) морского видаChlorella проявляет противоопухолевые свойства (18). Из вида Chlorella было выделено также несколько гликопротеинов. Например, в патенте США 4822612 описан гликопротеин массой 45000 Да, который обладает противораковым эффектом (19). В научной литературе также описываются и другие гликопротеины (20-23) и глицерогликолипиды (24), которые обладают иммунопотенциирующими и противоопухолевыми свойствами. Ни одно из этих соединений не является полисахаридом. Из вида Spirulina было выделено несколько различных типов полисахаридов, которые проявляли биологическую активность. Например, спирулан кальция сульфатированного полисахарида подавляет инвазию опухоли и метастазы (25). Спирулан кальция (молекулярная масса 74000 Да) состоит из рамнозы (52,3%), 3-O-метилрамнозы (32,5%), 2,3-ди-О-метилрамнозы (4,4%), 3-O-метилксилозы (4,8%), уроновых кислот (16,5%) и сульфата (26). В патенте США 5585365 показано, что противовирусный полисахарид молекулярной массой от 250000 до 3000000 Да был выделен из вида Spirulina с экстрагированием теплой водой (27). Этот полисахарид состоит из рамнозы, глюкозы, фруктозы, рибозы, галактозы, ксилозы, маннозы, глюкуроновой кислоты и галактуроновой кислоты. Недавно из вида Spirulina был выделен ряд других низкомолекулярных полисахаридов массой от 12600 до 60000 Да (28-30). Одним способом определения иммуностимулирующей активности является использование биологической пробы с макрофагами. Моноциты/макрофаги обнаружены практически во всех тканях тела, где они крайне необходимы при координировании иммунных реакций и многочисленных биологических процессов (31). Они играют большую роль в фагоцитозе, иммунном надзоре, заживлении ран, подавлении микробов и опухолевых клеток и в презентировании антигенов Т-лимфоцитам (32). При раке макрофаги обуславливают функции опухолевой цитотоксичности посредством выработки цитокинов и других иммунных факторов (33). Для того чтобы макрофаги играли ведущую роль в адаптивном и нативном иммунитете они должны эффективно реагировать на агентов окружающей среды и активироваться первыми (34). Активация макрофагов опосредована факторами провоспалительной транскрипции типа ядерного фактора каппа В (NF-каппа В). Затем такие факторы транскрипции контролируют и модулируют активацию/подавление любого массива генов, который стимулирует разнообразие иммунных реакций. У нестимулированных макрофагов, NF-каппа В существует в виде неактивных гетеродимеров, изолированных ингибирующими каппа В (И-каппа В) белками внутри цитозоли. Агенты, вызывающие диссоциацию и деградацию И-каппа В белков, обеспечивают перенос NF-каппа В димеров в ядра, где они могут активировать транскрипцию нижних генов (35). Гены-мишени, регулируемые NF-каппа В, включают провоспалительные цитокины, хемокины, воспалительные ферменты, адгезионные молекулы и рецепторы (36). В настоящем изобретении для регулирования экстракции, выделения, определения характеристик и разработок иммуностимулирующих полисахаридных препаратов из пищевых микроводорослей используется основанная на факторе транскрипции проба на NF-каппа В в моноцитах человека. Полисахариды по настоящему изобретению растворимы как в воде, так и в водном растворе этанола в отличие от почти всех остальных доступных в настоящее время полисахаридов. Из микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae (AFA), Chlorella pyrenoidosa и Spirulina platensis были выделены новые водорастворимые полисахаридные препараты, обладающие макрофагальной иммуностимулирующей активностью и содержащие активные полисахариды со среднемолекулярной массой 2 млн Да. Вклад активности данных полисахаридных препаратов в активацию моноцитов не менее чем в-2 006318 тысячу раз больше вклада полисахаридных препаратов, используемых в настоящее время в медицине для иммунотерапии раковых пациентов. В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения иммуностимулирующие препараты выделяются из микроводорослей, содержащих полисахариды, экстрагируемые растворителем в виде воды или в виде смеси воды и хотя бы одного низшего алкилового спирта, в котором алкиловая часть состоит из 1-4 атомов углерода, и в которой активные полисахариды имеют среднюю молекулярную массу приблизительно 2 млн Да. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения иммуностимулирующая активность иммуностимулирующего препарата проявляется в виде активации моноцитов/макрофагов. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения иммуностимулирующий препарат экстрагируется из микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения иммуностимулирующий препарат экстрагируется из микроводоросли Chlorella pyrenoidosa. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения иммуностимулирующий препарат экстрагируется из микроводоросли Spirulina platensis. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения компоненты гликозила активных полисахаридов иммуностимулирующего препарата в значительной степени состоят из маннозы, глюкозы, рамнозы, галактозы, фукозы, метилированных сахаров и Nацетилированных аминосахаров. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения компоненты гликозила активных полисахаридов иммуностимулирующего препарата в значительной степени состоят из арабинозы, галактозы, рамнозы, глюкозы и метилированных сахаров. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения компоненты гликозила активных полисахаридов иммуностимулирующего препарата в значительной степени состоят из рамнозы, глюкуроновой кислоты, фукозы, галактозы и метилированных сахаров. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения фармацевтические составы включают любой из предыдущих иммуностимулирующих препаратов и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения пищевая добавка включает любой из предыдущих иммуностимулирующих препаратов и приемлемый носитель или наполнитель для пищевой добавки. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения способ усиления иммунной функции у индивидуума, нуждающегося в таком лечении, состоит во введении упомянутому индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции или пищевой добавки. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения такой индивидуум страдает вирусной, бактериальной или грибковой инфекцией. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения такой индивидуум страдает раком. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения такой индивидуум страдает иммунодефицитом. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения таким индивидуумом является человек. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения таким индивидуумом является животное. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения технология получения препарата из пищевых микроводорослей, обогащенных иммуностимулирующими полисахаридами, включает такие этапы, как (а) получение экстракта в процессе обработки микроводорослей экстрагированием растворителем в виде воды или смеси воды и хотя бы одного низшего алкилового спирта, у которого алкиловая часть состоит из 1-4 атомов углерода, с объемной концентрацией спирта в смеси от 0 до 100% при температуре экстрагирования от 4 до 100 С; (b) возможное концентрирование экстракта до небольшого объема; (с) осаждение полисахаридного препарата из экстракта средствами осаждения; (d) сепарация осажденного полисахаридного препарата средствами сепарации; (е) промывка выпавшей фазы по этапу (d) спиртом концентрацией 95%. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения в качестве спирта, применяемого в процессе экстрагирования с получением препарата из пищевых микроводорослей, обогащенных иммуностимулирующими полисахаридами, используется этанол. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения в качестве спирта, применяемого в процессе экстрагирования с получением преперата из пищевых микроводорослей, обогащенных иммуностимулирующими полисахаридами, используется метанол. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения в качестве спирта, применяемого в процессе экстрагирования с получением препарата из пищевых микроводорослей, обогащенных иммуностимулирующими полисахаридами, используется изопропанол или пропанол. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения желательно, чтобы концентрация спирта на этапе(а) составляла от 20 до 80%. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения желательно, чтобы температура экстрагирования составляла от 40 до 80 С. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения данная технология применяется для получения препарата, обогащенного иммуностимулирующими полисахаридами, из микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения данная технология применяется для получения препарата, обогащенного иммуностимулирующими полисахаридами, из микроводорослей Chlorella pyrenoidosa. В соответствии с другим предпочтительным-3 006318 вариантом настоящего изобретения данная технология применяется для получения препарата, обогащенного иммуностимулирующими полисахаридами, из микроводорослей Spirulina platensis. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения этап концентрирования (b) выполняется(при необходимости) путем лиофилизации. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения этап концентрирования (b) выполняется (при необходимости) путем диализа. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения этап осаждения полисахаридного препарата (с) выполняется путем введения этанола до получения конечной концентрации этанола приблизительно 80%. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения этап осаждения полисахаридного препарата (с) выполняется путем охлаждения экстракта. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения этап осаждения полисахаридного препарата (с) выполняется путем добавления соли. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения осажденный полисахаридный препарат проходит сепарацию на этапе (d) путем фильтрации. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения осажденный полисахаридный препарат проходит сепарацию на этапе (d) путем центрифугирования. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения осажденный полисахаридный препарат промывается на этапе (е) этанолом концентрацией 95%. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения технология также включает очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде, и удаления практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 100000 Да путем ультрафильтрации. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения процесс также включает очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и удаления практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 2 млн Да с помощью размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения способ лечения индивидуума иммуностимулирующим полисахаридным препаратом для стимуляции у индивидуума моноцитной/макрофаговой активности включает введение индивидууму эффективного количества полисахаридного препарата, экстрагированного из пищевых микроводорослей, в сочетании с приемлемым носителем. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для стимулирования заживления ран. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для лечения рака. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для лечения иммунодефицита. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для лечения вирусной, бактериальной или грибковой инфекции. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения таким индивидуумом является человек. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения таким индивидуумом является животное. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения способ лечения индивидуума иммуностимулирующим полисахаридным препаратом для стимуляции у индивидуума моноцитной/макрофаговой активности включает введение индивидууму эффективного количества полисахаридного препарата, экстрагированного из микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae в сочетании с приемлемым носителем. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения способ лечения индивидуума иммуностимулирующим полисахаридным препаратом для стимуляции у индивидуума моноцитной/макрофаговой активности включает введение индивидууму эффективного количества полисахаридного препарата, экстрагированного из микроводорослей Chlorella pyrenoidosa в сочетании с приемлемым носителем. В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения способ лечения индивидуума иммуностимулирующим полисахаридным препаратом для стимуляции у индивидуума моноцитной/макрофаговой активности включает введение индивидууму эффективного количества полисахаридного препарата, экстрагированного из микроводорослей Spirulina platensis, в сочетании с приемлемым носителем. Краткое описание фигур Фиг. 1 - хроматограмма полисахаридного препарата NP16847 (пример 1), полученная высокоэффективной жидкостной хроматографией; введение 75 мкл при концентрации 500 мкг/мл; фиг. 2 - хроматограмма полисахаридного препарата NP16848 (пример 1), полученная высокоэффективной жидкостной хроматографией; введение 200 мкл при концентрации 125 мкг/мл; фиг. 3 - хроматограмма полисахаридного препарата NP16846 (пример 1), полученная высокоэффективной жидкостной хроматографией; введение 200 мкл при концентрации 35 мкг/мл; фиг. 4 - полисахаридные препараты из микроводорослей NP16847, NP16848 и NP16846 усиливают мРНК продуцирование провоспалительного цитокина. Результаты RT-PCR для IL-1 мРНК, TNFмРНК и GAPDH мРНК в клетках ТНР-1 за 2 ч: контроль, бактериальный LPS при концентрации 10 мкг/мл, (1) полисахаридный препарат NP16847 при концентрации 0,5 мкг/мл, (2) полисахаридный препарат NP16846 при концентрации 0,5 мкг/мл, и (3) полисахаридный препарат NP16848 при концентрации 0,5 мкг/мл;-4 006318 фиг. 5 - технологическая схема с изображением протокола экстрагирования теплой водой при 40 С с последующим осаждением раствором этанола концентрацией 70% для удаления материала, содержащего фикоцианин (пример 4); фиг. 6 - технологическая схема с изображением протокола экстрагирования теплой водой при 40 С с последующим осаждением сульфатом аммония для удаления материала, содержащего фикоцианин(пример 5); фиг. 7 - технологическая схема с изображением протокола экстрагирования теплой водой при 70 С(пример 6); фиг. 8 - технологическая схема с изображением протокола экстрагирования раствором этанола концентрацией 70% при 40 С (пример 7); фиг. 9 - технологическая схема с изображением протокола экстрагирования раствором этанола концентрацией 70% при 40 С с последующим прямым осаждением этанолом (пример 8); фиг. 10 - технологическая схема с изображением протокола экстрагирования раствором этанола концентрацией 70% при 40 С с последующим прямым осаждением раствором этанола концентрацией 80% (пример 9); фиг. 11 - анализ методом высокоэффективной жидкостной размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии препаратов NP16847 до и после ультрафильтрации с использованием оптимальных условий экстрагирования раствором этанола концентрацией 50% при 60 С (пример 24). Подробное описание изобретения Для очистки иммуностимулирующих полисахаридов и оптимизации их экстракции использовалась биопроба, основанная на факторе транскрипции, для активации NF-каппа В в моноцитах/фагоцитах человека ТНР-1. С помощью этой пробы измерялась иммуностимулирующая активность, на что указывает повышенная экспрессия репортера люциферазы, стимулированного NF-каппа В. Моноциты человека ТНР-1 (Коллекция культур американского типа, Роквилл, США) выращивались в среде RPMI 1640 с добавлением фетальной бычьей сыворотки (10% об./об.) и амикацина (60 мг/л) при 37 С, в атмосфере 5% СO2 и 95% воздуха. Активно растущие клетки были трансфицированы диэтиламиноэтилдекстраном (10 мкг/1106 клеток) и плазмидом репортера pBIIXLUC (10 мкг/1106 клеток). Этот плазмид (подарок д-ра Рикардо Далла-Фавера) содержал две копии звена NF-каппа В из HIV/IgK (37). Затем трансфецированные клетки были ресуспендированы в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки,и высевались в микротитрационные планшеты с 96 лунками с плотностью 2105 клеток на лунку. Спустя 24 ч микроводоросли извлекались, фракционировались и к трансфецированным клеткам добавлялись полисахаридные препараты. Клетки собирались и через 4 ч после добавления образцов измерялась активность люциферазы. Клетки собирались с использованием пластин с фильтром Пакарда и лизировались с использованием 30 мкл смеси люциферазы (1:1, люцифераза Люклит (LucLit): 1(физиологический раствор с фосфатным буфером), 1 мМ Са и Mg). Набор генных проб репортера люциферазы Люклита был приобретен в компании Пакард (Доунерс Гров, шт. Иллинойс, США). В однофотонном режиме с использованием сцинтилляционного счетчика микротитрационных пластин Пакарда измерялось светоиспускание. Активация фиксировалась как процент максимальной активации NF-каппа В, вызываемой концентрацией 10 мкг/мл LPS (бактерии Е. Coli., серотип 026: В 6, компания Сигма Кемикл, Сант Луис, США), что было использовано в качестве контрольного эксперимента с положительным результатом. Анализ состава гликозила и гликозильной связи выполнялся в Университете шт. Джорджия в Центре комплексных углеводородных исследований. Состав гликозила определялся с применением GCмасс-спектрометрического анализа TMS-метилгликозидов. Для идентификации O-метилированных сахаров, обнаруженных во время TMS-метилгликозидной процедуры, также определялся состав гликозила с использованием алдитолацетатной процедуры (38). Анализ гликозильной связи выполнялся с использованием методики Хакомори (39), в сочетании с восстановлением карбоксильной группы для обнаружения связей уроновой кислоты (40). Пример 1. Начальное выделение высокомолекулярного полисахаридного препарата из микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae (NP 16847), которая проявляет сильные свойства активации моноцита. Общий экстракт из микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae (партия 01 10FA из компании Сел Тек, Кламат Фолс, шт. Орегон, США) бьш подготовлен путем трехкратного экстрагирования лиофилизированного материала (125 г) (по 4 ч каждый раз) раствором этанола концентрацией 70% при 40 С. Значение ЕС 50 общего экстракта составляло 10 мкг/мл. Водные экстракты этанола выпаривались до сухого состояния и затем проходили разделение растворителем на воду и хлороформ (1:1). Активность определялась исключительно в водном слое, который также отделялся от n-бутанола (вода:n-бутанол = 63:37). Более активный водный слой (ЕС 50 = 0,5 мкг/мл) подвергался осаждению спиртом (вода:метанол:этанол = 1:2:3) при -80 С в течение 24 ч. Значение ЕС 50 осажденного материала, который называют препаратом предультрафильтрата, составляло 0,2 мкг/мл, сухой остаток Aphanizomenon flosaquae составлял 3% массы. Затем этот материал пропускался через ультрафильтрационное устройство с мембраной из полиэфирсульфона, отсекающей соединения молекулярной массой 100000 Да (Сентрикон-5 006318 Плюс-20 из компании Миллипор, Бедфорд, шт. Массачусетс, США). Отфильтрованный остаток промывался несколько раз 3% (мас./об.) раствором KСl для удаления примесей, приставших (вероятно в результате ионного взаимодействия) к материалам с большой молекулярной массой. Значение ЕС 50 отфильтрованного остатка, который называется постультрафильтрационным материалом, составляло 0,1 мкг/мл, или 0,6%. По результатам оценки с использованием колориметрический пробы (41) с фенолсерной кислотой при 450-490 нм содержание углеводородов в постультрафильтрационном препарате NP16847 составляло от 90 до 100%. По результатам этой оценки было дано заключение о том, что данный материала является полисахаридным препаратом. В результате элементного анализа, выполненного компанией Лаборатории Галбрайт, (Кноксвил, шт. Теннеси, США), было выявлено, что этот материал содержит следующие элементы: 49,1% углерода, 40,8% кислорода, 7,62% водорода, 2,46% азота и следы серы. В табл. 1 представлены результаты анализа гликозильного состава и связей постультрафильтрата. NP16847 преимущественно состоит из маннозы, глюкозы, 4-метилманнозы, рамнозы и остатков метилированного сахара вместе с другими простыми сахарами и ацетилированными аминосахарами. Это первый отчет о каком-либо полисахариде, выделенном из микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae, проявляющем какой-то тип биологической активности. Постультрафильтрат NP 16847 анализировался с использованием размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии. Установка состояла из системного контроллера Model 600E, инжектора UK6, системы доставки растворителя Model 600, дифференциального рефрактометра Model 401 и интегратораHewlett-Packard Model 3396 А. Анализ выполнялся при температуре 30 С и расходе воды 1 мл/мин, при этом вода отвечала требованиям по качеству высокоэффективной жидкостной хроматографии, с использованием колонны Shodex Ohpak KB-805 размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии, длиной 300 мм, внутренним диаметром 8 мм. Эта колонна способна сепарировать молекулы до расчетной молекулярной массы 4 млн Да. Анализ постультрафильтрата NP 16847 показал один максимум при элюировании в пустом объеме (фиг. 1) и время удержания, соответствующее среднемолекулярной массе приблизительно 2 млн Да по стандартам декстрана. Эта методика выделения, описанная в примере 1, применительно к очистке полисахаридов Aphanizomenon flos-aquae является новшеством, так как при начальной экстракции используется раствор этанола концентрацией 70 %, в отличие от ранее применявшихся методик, в которых использовалась горячая вода. Для определения того, можно ли применять эту методику в качестве общего способа экстракции иммуностимулирующих полисахаридов из других пищевых микроводорослей, методика, описанная в примере 1, была применена к двум другим микроводорослям, которые обычно употребляются в качестве пищевых добавок, а именно Chlorella pyrenoidosa и Spirulina platensis. Пример 2. Начальное выделение высокомолекулярного полисахаридного препарата из микроводоросли Chlorella pyrenoidosa (NP 16848), которая проявляет сильные свойства активации моноцита. Общий экстракт из микроводорослей Chlorella pyrenoidosa (партияVP0978 из компании Сан Хлорелла, Торрансе, шт. Калифорния, США) был подготовлен путем трехкратного экстрагирования лиофилизированного материала (35 г) (по 4 ч каждый раз) раствором этанола концентрацией 70% при 40 С. Значение EC50 общего экстракта составляло 25 мкг/мл. Водные экстракты этанола выпаривались до сухого состояния и затем проходили разделение растворителем на воду и хлороформ (1:1). Активность определялась исключительно в водном слое, который также отделялся от n-бутанола (вода:n-бутанол = 63:37). Более активный водный слой подвергался осаждению спиртом (вода:метанол:этанол = 1:2:3) при-80 С в течение 24 ч. Затем осажденный материал пропускался через ультрафильтрационное устройство с мембраной из полиэфирсульфона, отсекающей соединения молекулярной массой 100000 Да (Сентрикон Плюс-20 из компании Миллипор, Бедфорд, шт. Массачусетс, США). Отфильтрованный остаток промывался несколько раз 3% (мас./об.) раствором KСl для удаления примесей, приставших (вероятно в результате ионного взаимодействия) к материалам с большой молекулярной массой. Значение ЕС 50 отфильтрованного остатка, который называется постультрафильтрационным материалом, составляло 0,3 мкг/мл или 0,2%. По результатам оценки с использованием колориметрический пробы (41) с фенолсерной кислотой при 450-490 нм содержание углеводородов в постультрафильтрационном препарате NP16848 составляло от 90 до 100%. По результатам этой оценки было дано заключение о том, что данный материала является полисахаридным препаратом. В табл. 2 представлены результаты анализа гликозильного состава и связей постультрафильтрата. Препарат NP16848 преимущественно состоит из арабинозы, галактозы, рамнозы и остатков метилированного сахара вместе с другими простыми сахарами и ацетилированными аминосахарами. Хотя другие иммуностимулирующие полисахариды и водорастворимые препараты из видаChlorella и были представлены в литературе, тем не менее, препарат NP 16848 является новым соединением. Анализ постультрафильтрата NP 16848 с использованием высокоэффективной жидкостной размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии, описанной в примере 1, показал один максимум при элюировании в пустом объеме (фиг. 2) и время удержания, соответствующее среднемолекулярной массе приблизительно 2 млн Да по стандартам декстрана.-6 006318 Пример 3. Начальное выделение высокомолекулярного полисахаридного препарата из микроводоросли Spirulina platensis (NP16846), которая проявляет сильные свойства активации моноцита. Общий экстракт из микроводорослей Spirulina (партияВ 16933 из компании Триарко Индастриз,Уайне, шт. Нью Джерси, США) был подготовлен путем трехкратного экстрагирования лиофилизированного материала (35 г) (по 4 ч каждый раз) раствором этанола концентрацией 70% при 40 С. Значение ЕС 50 общего экстракта составляло 50 мкг/мл. Водные экстракты этанола выпаривались до сухого состояния и затем проходили разделение растворителем на воду и хлороформ (1:1). Активность определялась исключительно в водном слое, который также отделялся от n-бутанола (вода:n-бутанол = 63:37). Более активный водный слой подвергался осаждению спиртом (вода:метанол:этанол = 1:2:3) при -80 С в течение 24 ч. Затем осажденный материал пропускался через ультрафильтрационное устройство с мембраной из полиэфирсульфона, отсекающей соединения молекулярной массой 100000 Да (Сентрикон Плюс-20 из компании Миллипор, Бедфорд, шт. Массачусетс, США). Отфильтрованный остаток промывался несколько раз 3% (мас./об.) раствором KСl для удаления примесей, приставших (вероятно в результате ионного взаимодействия) к материалам с большой молекулярной массой. Значение ЕС 50 отфильтрованного остатка, который называется постультрафильтрационным материалом, составляло 0,3 мкг/мл или 0,1%. По результатам оценки с использованием колориметрический пробы (41) с фенолсерной кислотой при 450-490 нм содержание углеводородов в постультрафильтрационном препарате Spirulina составляло от 90 до 100%. По результатам этой оценки было дано заключение о том, что данный материала является полисахаридным препаратом. В табл. 3 представлены результаты анализа гликозильного состава и связей постультрафильтрата. Препарат NP16846 преимущественно состоит из рамнозы, глюкуроновой кислоты,фукозы, галактозы и остатков метилированного сахара вместе с другими простыми сахарами и ацетилированными аминосахарами. Другие полисахариды с подобными гликозильными соединениями из видаSpirulina были представлены в литературе, но они значительно меньше по размерам, чем препарат NP 16846. Анализ постультрафильтрата NP 16846 с использованием высокоэффективной жидкостной размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии, описанной в примере 1, показал один максимум при элюировании в пустом объеме (фиг. 3) и время удержания, соответствующее среднемолекулярной массе приблизительно 2 млн Да по стандартам декстрана. Активация моноцитов/макрофагов Для подтверждения активации ТНР-1 моноцитов/макрофагов полисахаридными препаратами микроводорослей измерялись уровни провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF- матричной РНК (мРНК). В качестве контрольных измерений для определения специфичности изменений уровней IL-1 и TNFматричной РНК также исследовались уровни GAPDH матричной РНК. Так как GAPDH является геном хозяина, то следует ожидать, что уровни матричной РНК останутся постоянными, если только изменения не будут внесены искусственно. Праймеры RT-PCR для IL-1, TNF- и GAPDH были приобретены в компании "Интегрейтед ДНА текнолоджиз" (Коралвилл, шт. Айдахо, США). В работе Су и др. (42) описаны последовательности этих праймеров. Прямая последовательность IL-1 (5'-ATG-GCA-GAA-GTA-CCT-AAG-CTC-GC-3'); обратная последовательность IL-1 (5'-ACA-CAA-ATT-GCA-TGG-TGA-AGT-CAG-TT-3'); прямая последовательность TNF- (5'-GAG-TGA-CAA-GCC-TGT-AGC-CCA-TGT-TGT-AGC-3'); обратная последовательностьGAPDH (5'-TGA-AGG-TCG-GAG-TCA-ACG-GAT-TTG-GT-3'); обратная последовательность GAPDH (5'CAT-GTG-GGC-CAT-GAG-GTC-САС-САС-3'). Активно растущие клетки ТНР-1 (3 млс, 1106 клеток/мл) инкубировались в течение 2 ч в присутствии испытуемого материала. С использованием набора ТРИ Реагент (Молекулярный исследовательский центр, Цинциннати, шт. Огайо, США) выделялась общая РНК, клетки которой лизировались с использованием сочетания фенола и гуанидинтиоцианата. После добавления бромохлоропропана РНК отделялась в водную фазу и затем осаждалась изопропанолом. Масса общей РНК, полученной этим способом, составляла приблизительно 30 мкг. Электрофорез выделенной РНК с использованием 0,8% геля агарозы не показал наличие примесной ДНК. Реакции RT-PCR осуществлялись при использовании реагентов компании Промега (Мэдисон, шт. Висконсин, США). В каждой реакции использовались следующие компоненты (общим объемом 30 мкл): 6 мкл AMV/Tfl 5x буфер реакции, смесь 0,6 мкл дезоксинуклеозидтрифосфата (10 мМ), 1,2 мкл MgSO4(25 мМ), 0,6 мкл обратной транскриптазы AMV (5 ед./мкл), 0,6 мкл полимеразы Tf1 ДНК (5 ед./мкл), 1,2 мкл каждого праймера (15 пмоль/мкл), и 2 нг общей РНК (IL-1, TNF-) или 5 нг общей РНК (GAPDH). В протоколе RT-PCR использован автоматический датчик тепловых циклов компании Техне Юнит Проген. Первый цикл продолжался 45 мин при 48 С, за которым следовали 2-минутные циклы при 94 С. Амплификация достигалась спустя 35 циклов: денатуризация при 94 С в течение 45 мин; отжиг при 68 С в течение 7 мин и распрямление при 68 С в течение 2 мин. На заключительном цикле образцы выдерживались при 68 С в течение 7 мин. Электрофорез продуктов RT-PCR (IL-1, TNF- и GAPDH мРНК) вы-7 006318 полнялся с использованием 12 мкл реактивной смеси 5% полиакриламидных гелей с бромистым этидием, используемым в качестве окрашивающего вещества. Обработка клеток ТНР-1 либо LPS, либо полисахаридными препаратами водорослей привела к резкому увеличению численности как IL-1 (810 пар нуклеотидов), так и TNF- (444 пары нуклеотидов) в сравнении с контрольными опытами. Для всех образцов (фиг. 4) уровни глицералгидефосфатдегидрогеназы генов хозяина матричной РНК (GAPDH, 1000 пар нуклеотидов) оставались теми же самыми. Наблюдаемая активация NF-каппа В с помощью препаратов NP16847, NP16848 и NP16846 была вызвана наличием в препарате примесного эндотоксина. Это было подтверждено результатами следующих двух экспериментов, которые проводились для выяснения этой возможности. В первом эксперименте добавлялся полимиксин В (10 мкг/мл, компания Сигма Кемикл, Сант Луис, шт. Монтана, США) в сочетании с каждым полисахаридным препаратом (0,1-1 мкг/мл) для выяснения будет ли прекращена активация NF-каппа В. Полимиксин В является поликатионным антибиотиком, который, как известно, блокирует многие из биологических эффектов, вызванных LPS, путем связывания с частью молекулы, образованной липидом А. Все три микроводорослевых полисахаридных препарата были нечувствительны к добавкам полимиксина В (данные не показаны). Добавление полимиксина В к LPS (10 мкг/мл) подавляет активацию NF-каппа В на 75%. Во втором эксперименте, проводившимся для проверки возможности стимулируемых эндотоксином эффектов, с помощью анализа гликозильного состава велся поиск наличия-гидроксимиристата. Не было выявлено обнаруживаемых уровней -гидроксимиристата в образцах препаратов NP16848 и NP16846. Таким образом, маловероятно, что наблюдаемая активация макрофагов с помощью препаратов NP16848 и NP16846, была вызвана эндотоксинами. Однако в двух других образцах препаратов NP16847 были обнаружены небольшие количества гидроксимиристата (0,6% общей площади максимума). Для того чтобы определить какое количество эндотоксинподобного материала присутствовало, было проанализировано шесть образцов микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae с использованием пробы лизата амебоцита Limulus (анализ выполнялся компанией БиоУиттакер, Уолкерсвиль, шт. Мэриленд, США). Количество обнаруженного с использованием этой пробы позитивного материала лизата амебоцита Limulus составило 0,002% массы сухого вещества микроводорослей. Для сравнения - доля препарата NP16847 примерно в 300 раз больше (0,6%). Это означает, что при концентрации, требуемой для получения полумаксимальной активации NF-каппа В с помощью препарата NP16847 (100 нг/мл), общее количество потенциального позитивного материала лизата амебоцита Limulus должна составлять 300 пг/мл. Такую концентрацию эндотоксина не определить с использованием системы макрофаговой пробы. Поэтому возможную примесь эндотоксина нельзя считать причиной имитационного влияния препарата NP16847 на активацию макрофагов. В примерах 1-3 показано, что полисахаридные препараты с сильной иммуностимулирующей активностью извлекаются из пищевых микроводорослей с применением раствора этанола концентрацией 70% при 40 С. Этапы выделения этих полисахаридных препаратов проходили по сложному протоколу и при использовании органических растворителей. Традиционно полисахариды извлекаются из природных источников с применением теплой воды ввиду их хорошей растворимости в воде. Поэтому можно было ожидать, что эта методика выделения в теплой воде принесет более высокий процент выхода этих полисахаридов в сравнении с начальным экстрагированием раствором этанола концентрацией 70%. Кроме того, так как менее вероятно, что водный экстракт содержит неполярный материал, то нет необходимости использовать разделение с помощью органического растворителя, если этот способ уже успешно опробован. Однако в отличие от предсказанного результата с помощью экстрагирования водой (примеры 4-6) были получены препараты значительно менее активные, чем с помощью методики, в которой используется начальное экстрагирование водным раствором этанола (пример 1), к тому же возникли дополнительные проблемы. Как измерения при анализе с использованием высокоэффективной жидкостной размерноэксклюзивной колоночной хроматографии, так и при исследовании иммуностимулирующей активности(активации макрофагов) выполнялись в соответствии с приведенными ранее примерами. В качестве микроводорослей в каждом примере использовались лиофилизированные микроводоросли Aphanizomenonflos-aquae (партия 041900 Merc), полученные из компании Кламат Элджи Продактс, Кламат Фоллс,шт. Орегона, США. Ультрафильтрация (при необходимости) выполнялась с использованием устройства с мембраной из полиэфирсульфона, отсекающей соединения молекулярной массой 100000 Да (Сентрикон Плюс-20 из компании Миллипор, Бедфорд, шт. Массачусетс, США). В каждом эксперименте отфильтрованный остаток промывался несколько раз 3% (мас./об.) раствором KСl для удаления примесей,приставших (вероятно в результате ионного взаимодействия) к материалам с большой молекулярной массой. Пример 4. Экстрагирование водой, нагретой до 40 С, и удаление фикоцианина с помощью осаждения спиртом. Экстрагирование микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae водой, нагретой до 40 С, было проблематичным из-за того, что этот общий экстракт содержал большое количество фикоцианина (синий белковый пигмент). Попытки удалить фикоцианин с помощью ультрафильтрации оказались безуспеш-8 006318 ными, так как этот материал задерживался вместе с полисахаридным препаратом NP16847 в фильтре,отсекающем соединения молекулярной массой 100000 Да. Для полного осаждения фикоцианина с помощью спирта требовался раствор этанола концентрацией 70% или выше (данные не показаны). Для оценки этого способа 10 г лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae экстрагировались трижды водой (62,5 мл каждый раз) при 40 С, каждый раз в течение 4-8 ч. Общий водный экстракт лиофилизировался и повторно растворялся в 40 мл воды. Добавлялся этанол (92 млс) комнатной температуры до получения конечной концентрации этанола, равной 70%. Осаждаемые материалы (содержащие фикоцианин) удалялись и супернатант пропускался через ультрафильтрационное устройство. На каждом этапе процедуры выделения материал оценивался на активацию макрофагов (фиг. 5). Очевидно, что большая часть иммуностимулирующей активности терялась в выпавшей фазе (также содержащей фикоцианин) во время осаждения раствором этанола концентрацией 70%. Доля постультрафильтрата (массой больше 100000 Да), полученного этим способом, составляла 1,0%. Хотя эта доля больше 0,6% постультрафильтрата, полученного при экстрагировании раствором этанола концентрацией 70% по примеру 1,этот материал содержит другие вещества помимо препарата NP16847, так как его значение ЕС 50 составляет 1000 нг/мл. Для сравнения - значение ЕС 50 материала из примера 1 составляет 10 нг/мл. Пример 5. Экстрагирование водой, нагретой до 40 С, и удаление фикоцианина сульфатом аммония. В способах выделения фикоцианина (43, 44) обычно используется осаждение сульфата аммония(насыщенность 40-65%). Этот протокол был исследован с целью оценки возможности выборочного удаления фикоцианина из общего экстракта при осаждении сульфата аммония. Лиофилизированные микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae (10 г) подвергались трехкратному экстрагированию водой (62,5 мл каждый раз) при 40 С в течение 4-8 ч. Общий водный экстракт лиофилизировался и повторно растворялся в 40 мл воды, содержащей 48 г сульфата аммония (насыщенность 50%). Осаждаемые материалы (содержащие фикоцианин) удалялись и супернатант пропускался через ультрафильтрационное устройство. Доля постультрафильтрата, полученного этим способом, составляла 1,32%, но в ней, вероятно, содержалось мало препарата NP16847, так как его удельная активность была весьма низкой (значение ЕС 50 составляло более 1000 нг/мл). На фиг. 6 показана иммуностимулирующая активность материала на каждом этапе процедуры выделения. Так же как и в предыдущем подходе, при добавлении сульфата аммония большая часть препарата NP16847 осаждалась вместе с фикоцианином. Очевидно, что попытки отделить фикоцианин от препарата NP16847 в общем водном экстракте оказались безуспешными. Кроме того, повторное применение процесса экстрагирования водным раствором этанола при высоких температурах (например, 50% раствора этанола при 60 С) к остатку (к остатку водного эктрагирования при 40 С) привело к выделению значительного количества препарата NP16847(см. пример 43). Таким образом, при экстрагировании водой, нагретой до 40 С, препарат NP16847 полностью извлечь не удается. Пример 6. Экстрагирование горячей водой, нагретой до 70 С. Экстрагирование водой, нагретой до более высоких температур, например до 70 С, должно бы вызвать денатурирование и осаждение фикоцианина, его отделение от препарата NP16847 и других полярных молекул раствора. Для оценки этого подхода 20 г лиофилизированной микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae трижды экстрагировались водой (125 мл каждый раз) при 70 С в течение 4-8 ч. Казалось,что этот общий экстракт не содержал никакого фикоцианина, о чем говорило отсутствие синего цвета. Общий водный экстракт лиофилизировался и повторно растворялся в 80 мл воды. Препарат NP16847 осаждался спиртом (вода:метанол:этанол = 1:2:3) при -20 С в течение 24 ч. Осаждаемый материал пропускался через ультрафильтрационное устройство. На фиг. 7 показана иммуностимулирующая активность материала на каждом этапе процедуры выделения. Значение ЕС 50 для активации макрофагов постфильтрата (200 нг/мл) было немного больше, чем у постфильтрата, полученного в примере 1 (100 нг/мл). Выход постультрафильтрата по этому способу составил 1,74%, что значительно выше 0,6% препаратаNP16847, полученного при применении экстрагирования раствором этанола концентрацией 70% по примеру 1. Поэтому при экстрагировании водой, нагретой до 70 С, извлекается почти в 3 раза больше препарата NP16847, на что указывает сравнение значений ЕС 50 постфильтрационных материалов. Выделение препарата NP16847 экстрагированием горячей водой (70 С) имеет несколько преимуществ по сравнению с выделением по примеру 1. Не применяются органические растворители, для получения конечного материала нужно выполнить только несколько этапов, и экстрагируется примерно в три раза больше препарата NP16847. Однако имеется и несколько недостатков. Во-первых, общий водный экстракт должен быть лиофилизирован с целью концентрирования во избежание применения чрезвычайно больших объемов спирта при осаждении. Во-вторых, предультрафильтрат содержит значительное количество неактивного материала (о чем говорит малое значение ЕС 50, которое составляет приблизительно 500 нг/л, и хроматограмма высокоэффективной жидкостной хроматографии на фиг. 7), что приводит к очень медленной очистке ультрафитрационным устройством. Было оценено несколько дополнительных способов, полученных на основе модификаций методики экстрагирования раствором этанола концентрацией 70%, описанной в примере 1. В следующих примерах описаны методики выделения, в которых не требуется использовать органические растворители, и в которых для выделения экстракта необходимо выполнить ограниченное число этапов. Была разработана-9 006318 простая, экономичная и эффективная технология, в которой решены все проблемы, связанные с экстрагированием горячей водой. Пример 7. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 70%, нагретого до 40 С, с отделением хлороформа. При экстрагировании препарата NP16847 по примеру 1, применение второго этапа, в котором происходило разделение n-бутанола и воды растворителем, приводило к существенным потерям иммуностимулирующей активности в слое бутанола. Поэтому протокол примера 1 был модифицирован с целью удаления этапа отделения n-бутанола с помощью растворителя. Этот новый способ идентичен методике,рассмотренной в примере 1, за исключением того, что здесь происходит только одно разделение растворителем хлороформа и воды (1:1). На фиг. 8 показана схема выделения и иммуностимулирующая активность на каждом этапе технологии выделения. Значение ЕС 50 для постультрафильтрационного материала, полученного по этому способу (200 нг/мл), было немного выше значения, для материала, полученного по технологии, описанной в примере 1 (100 нг/мл). Доля постультрафильтрата NP16847, полученного по этой методике, составляла 1,97%. Поэтому удаление этапа отделения бутанола растворителем из методики экстрагирования раствором этанола концентрацией 70% (пример 1) привело к увеличению выхода постультрафильтрата NP16847 более чем в три раза. Однако большим недостатком этой методики является использование хлороформа на этапе разделения органическим растворителем. Пример 8. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 70%, нагретого до 40 С, и прямое осаждение спиртом. Для оценки подхода, в котором отсутствует как отделение бутанола, так и хлороформа, 10 г лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae экстрагировалось дважды раствором этанола концентрацией 70% (125 мл каждый раз) при 40 С. Первое экстрагирование выполнялось в течение 3 ч, а второе в течение 12 ч. Общий экстракт раствора этанола концентрацией 70% выдерживался в течение нескольких часов при -20 С, и осаждаемый материал удалялся центрифугированием. Выпавшая фаза промывалась холодным раствором этанола концентрацией 95% (для удаления остатков неполярного материала), повторно растворялась в воде и затем пропускалась через ультрафильтрационное устройство. На фиг. 9 показана иммуностимулирующая активность материала на каждом этапе технологии выделения. Значение EC50 для постультрафильтрационного материала, полученного по этому способу (200 нг/мл), было немного выше значения для материала, полученного по технологии,описанной в примере 1 (100 нг/мл). Доля постультрафильтрата NP16847, полученного по этой методике,составляла 1,2%. Хотя выход этого продукта в 2 раза больше того, который был получен с применением методики экстрагирования, описанной в примере 1, тем не менее, это примерно на 30% меньше выхода при извлечении продукта по протоколу, описанному в примере 7. Такой низкий выход объясняется, вероятно, неполным осаждением в растворе этанола концентрацией 70%. Пример 9. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 70%, нагретого до 40 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Предыдущий способ был немного изменен с целью увеличения выхода препарата NP16847. Общий экстракт после экстрагирования раствором этанола концентрацией 70% доводился до концентрации этанола 80% путем добавления 100% этанола и выдерживался при -20 С в течение нескольких часов. Осаждаемый материал обрабатывался так же, как описано выше. На фиг. 10 показана схема выделения и иммуностимулирующая активность материала на каждом этапе технологии выделения. В результате применения этого модифицированного способа выход предультрафильтрата NP16847 составил 5,7%, а значение ЕС 50 в пробе активации моноцита было равно 200 нг/мл. Доля постультрафильтрата составляла 1,8%. Значение ЕС 50 для постультрафильтрационного материала (200 нг/мл) была немного выше доли материала, полученного по методике, описанной в примере 1 (100 нг/мл), но равна доле постультрафильтрата, полученного по методике, описанной в примерах 6 и 7. Применение методики прямого осаждения полисахаридного препарата NP16847 из общего экстракта раствора этанола концентрацией 70% (пример 9) обеспечило достижение начальных целей. В этой методике не используется никакой органический растворитель (или метанол), отсутствует этап лиофилизации/выпаривания растворителя, и для получения сравнительно чистого препарата NP16847 oнa включает только несколько этапов. Наполовину чистый препарат NP16847 (70% которого содержит молекулы массой менее 100000 Да) можно получить при исключении этапа ультрафильтрационной очистки (на фиг. 10 обозначены как хроматограммы высокоэффективной жидкостной хроматографии для пред- и постультрафильтрата). Этого предультрафильтрационного препарата NP16847 достаточно для экстракта пищевой добавки (ботанической). Для выделения этого материала просто требуется прямое осаждение спиртом из экстракта раствора этанола концентрацией 70%. В следующих пунктах объясняется, почему эта методика выделения (пример 9) лучше остальных. 1. Экстрагирование водой при 40 С. а. Большое содержание фикоцианина, который не может быть отделен от препарата NP16847 ультрафильтрацией или осаждением этанолом или сульфатом аммония.b. Удельная активность препарата NP16847, полученного после ультрафильтрации, была низкой, и значение ЕС 50 составляло приблизительно 1000 нг/мл в сравнении со значением 200 нг/мл (пример 9).- 10006318 с. Остаток водного эктрагирования содержал значительные количества препарата NP16847, который нельзя было извлечь при этой температуре с помощью экстрагирования водой (см. пример 43). 2. Экстрагирование водой при 70 С. а. При экстрагировании водой, нагретой до этой температуры, предультрафильтрат содержит большие количества неактивного полярного материала. Это нежелательно по двум причинам. Во-первых,разработка препарата на основе предультрафильтрата будет включать два уровня препарата NP16847. Во-вторых, ультрафильтрация является очень медленным процессом для получения постультрафильтрационного препарата NP16847.b. Хотя в этой методике не используются токсичные органические растворители, для нее требуется этап лиофилизации общего экстракта. 3. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 70% после разделения органическим растворителем. а. Очевидно, что основным недостатком этого этапа является применение органического растворителя (т.е. хлороформа) с целью удаления неполярного материала. На основе примеров, описанных выше, можно сделать вывод о том, что оптимальная общая методика (пример 9) включает два начальных экстрагирования лиофилизированных икроводорослей Aphanizomenon flos-aquae раствором этанола концентрацией 70% при 40 С. Содержание этанола в общем экстракте доводится до 80%, и экстракт охлаждается до -20 С. С целью удаления остатков липофильного материала выпавшая фаза собирается и промывается холодным раствором этанола концентрацией 95%. Высокомолекулярный материал (массой больше 100000 Да), содержащий приблизительно 30% предультрафильтрационного полисахаридного материала, можно выделять с использованием ультрафильтрации. Ниже приводится сравнение препарата NP16847, полученного в примере 9, и препарата NP16847,приготовленного экстрагированием раствором этанола концентрацией 70% при 40 С (пример 1). Эти данные показывают, что экстрагирование препарата из микроводорослей Aphanizomenon flosaquae с применением методики, описанной в примере 9, приводит к двукратному увеличению предультрафильтрата и трехкратному увеличению постультрафильтрата NP16847. Однако значение ЕС 50 предультрафильтрационного препарата, полученного по этой методике, немного выше значения препарата,полученного в примере 1, что указывает на то, что некоторое увеличение выхода продукта происходит благодаря неактивному материалу. Поэтому условия примера 1 были выбраны в качестве начальной точки для дальнейшей оптимизации с целью повышения удельной активности препарата NP16847, с учетом следующих преимуществ, получаемых при применении нового способа: 1. Оптимальный выход и хорошая удельная активность как предультрафильтрационного, так и постультрафильтрационного полисахаридных препаратов NP16847. 2. Отсутствие токсичных органических растворителей. 3. Отсутствие ротарного испарителя или лиофилизации больших объемов воды или растворителя. В примерах 10-38 представлен детальный анализ изменений как температуры экстрагирования, так и концентрации этанола с целью оптимизации условий, применяемых в примере 9. Пример 10. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 70%, нагретого до 50 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 70% при 50 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,2 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 6,5% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4).- 11006318 Пример 11. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 70%, нагретого до 60 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 70% при 60 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,2 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 7,1% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 12. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 70%, нагретого до 70 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 70% при 70 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,4 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 7,1% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением EC50, равным 75 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Удаление низкомолекулярного материала (массой меньше 100000 Да) приводило к выходу 2,7% постультрафильтрационного препарата NP16847 и к получению значения ЕС 50, равного 35 нг/мл. Пример 13. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 70%, нагретого до 80 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 70% при 80 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,2 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 7,6% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 50 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 14. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 70%, нагретого до 23 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 70% при 23 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,5 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрацией 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 4,5% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50 больше 250 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 15. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 60%, нагретого до 23 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 60% при 23 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл растворав течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,3 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 7,0% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50 больше 250 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4).- 12006318 Пример 16. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 60%, нагретого до 40 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 60% при 40 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,2 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 8,4% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 200 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 17. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 60%, нагретого до 50 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 60% при 50 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,0 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 9,4% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 18. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 60%, нагретого до 60 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 60% при 60 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,4 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 9,5% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Удаление низкомолекулярного материала (массой меньше 100000 Да) приводило к выходу 3,5% постультрафильтрационного препарата NP16847 и к получению значения ЕС 50, равного 75 нг/мл. Пример 19. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 60%, нагретого до 70 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 60% при 70 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,0 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 10,0% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 50 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 20. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 60%, нагретого до 80 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 60% при 80 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,2 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 11,2% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 25 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4).- 13006318 Пример 21. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 50%, нагретого до 23 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 50% при 23 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,3 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 9,1% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 200 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 22. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 50%, нагретого до 40 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 50% при 40 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,3 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 8,9% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 23. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 50%, нагретого до 50 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 50% при 50 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,1 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 9,4% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 75 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 24. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 50%, нагретого до 60 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 50% при 40 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,4 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 10,8% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 25 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Удаление низкомолекулярного материала (массой меньше 100000 Да) приводило к выходу 4,5% постультрафильтрационного препарата NP16847 и к получению значения ЕС 50, равного 20 нг/мл. Пример 25. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 50%, нагретого до 70 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 50% при 70 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл растворав течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,4 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 10,2% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 25 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Удаление низкомолекулярного материала (массой меньше 100000 Да) приводило к- 14006318 выходу 5,6% постультрафильтрационного препарата NP16847 и к получению значения ЕС 50, равного 20 нг/мл. Пример 26. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 50%, нагретого до 80 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 50% при 80 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,2 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 11,7% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением EC50, равным 25 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 27. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 40%, нагретого до 23 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 40% при 23 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,3 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 11,4% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50 больше 250 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 28. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 40%, нагретого до 40 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 40% при 40 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,4 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 10,7% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением EC50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 29. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 40%, нагретого до 50 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 40% при 50 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,0 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 10,3% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 30. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 40%, нагретого до 60 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 40% при 60 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,4 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 10,8% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 50 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Удаление низкомолекулярного материала (массой меньше 100000 Да) приводило к- 15006318 выходу 3,3% постультрафильтрационного препарата NP16847 и к получению значения ЕС 50, равного 25 нг/мл. Пример 31. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 40%, нагретого до 70 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 40% при 70 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,4 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 11,1% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 50 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 32. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 40%, нагретого до 80 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 40% при 80 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,3 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 12,6% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 50 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Удаление низкомолекулярного материала (массой меньше 100000 Да) приводило к выходу 6,2% постультрафильтрационного препарата NP16847 и к получению значения ЕС 50, равного 30 нг/мл. Пример 33. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 30%, нагретого до 23 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 30% при 23 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,2 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 13,7% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 200 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 34. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 30%, нагретого до 40 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 30% при 40 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,3 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 13,8% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением EC50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 35. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 30%, нагретого до 50 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 30% при 50 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,1 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов, выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 10,9%- 16006318 предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением EC50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 36. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 30%, нагретого до 60 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 30% при 60 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,2 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 10,5% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 37. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 30%, нагретого до 70 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 30% при 70 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,1 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 11,0% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 75 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). Пример 38. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 30%, нагретого до 80 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором этанола концентрацией 30% при 80 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 3 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 12 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,0 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 11,9% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 75 нг/мл в пробе активации моноцитов (табл. 4). В табл. 4 приводится влияние как температуры, так и концентрации этанола во время начального экстрагирования на конечные точки, описанные выше. Конечными точками, применявшимися для оценки эффективности каждого состояния экстрагирования, помимо значения ЕС 50 предультрафильтрата,были извлекаемые доли предультрафильтрата. Предультрафильтрационный материал выбирался для этих анализов из-за его возможного использования в качестве либо пищевой добавки, либо фармацевтического препарата. При исключении этапа ультрафильтрации происходит значительное упрощение процедуры выделения. При соблюдении условий, рассмотренных в примере 9 (раствор этанола концентрацией 70%, 40 С),выход ультрафильтрата NP16847 со значением ЕС 50, равным 200 нг/мл, достигает 5,7%. При увеличении температуры экстрагирования выше 40 С и в присутствии раствора этанола концентрацией 70% увеличивается выход полисахаридного препарата NP16847 на этапе начальной экстракции и его удельная активность. Однако снижение температуры экстрагирования раствором этанола концентрацией 70% с 40 до 23 С или использование любой другой концентрации этанола не приводит к снижению значения ЕС 50. При этой температуре (23 С) и при более низких концентрациях этанола выход конечного продукта увеличивался. Частично повышение выхода конечного продукта можно объяснить увеличением эффективности экстрагирования фикоцианина, что подтверждается окрашиванием материала в синий цвет. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 70% при более высоких температурах немного увеличивает извлечение и существенно повышает удельную активность (например, при 70% растворе этанола и 80 С). Экстрагирование раствором этанола концентрацией 50% при любой температуре выше 40 С приводит к увеличению значений ЕС 50, если сравнивать с другими концентрациями этанола. При концентрациях этанола ниже 50% удельная активность обычно уменьшается при любых температурных условиях. Концентрации этанола выше 50% обладают обратным влиянием на выход конечного продукта: выход конечного продукта падал при более высоких концентрациях этанола, но немного увеличивался при меньших концентрациях (при температурах 50 С и ниже). Более низкие значения выхода конечного про- 17006318 дукта, связанные со снижением удельной активности при концентрациях этанола выше 50%, дают основание полагать, что при этих условиях экстрагируется меньшее количество препарата NP16847. При концентрациях этанола ниже 50% более высокие значения выхода конечного продукта, связанные с пониженной удельной активностью, дают основание полагать, что вместе с препаратом NP16847 экстрагируется большее количество неактивного материала. При температурах ниже 60 С и концентрациях этанола 30 и 40%, часть этого неактивного материала скорее всего из-за более эффективного экстрагирования фикоцианина выпадает в осадок, что снова подтверждается увеличением синей окраски выпавшей фазы. В области табл. 4 от 60 до 80 С при концентрации этанола 50% представлены условия как для оптимального извлечения, так и для оптимальной удельной активности. Желательно, чтобы область температур находилась в диапазоне от 60 до 70 С (примеры 24 и 25), так как дальнейший анализ как предультрафильтрационного, так и постультрафильтрациогго материала, полученного экстракцией раствором этанола концентрацией от 40 до 60% при 80 С, показал наличие большого количества водонерастворимого материалы. Соблюдение этих оптимальных условий обеспечивает выход постультрафильтрата на уровне 4,5-5,6% (в 7,5-9,3 раз больше, чем при ранее соблюдавшихся условиях экстрагирования раствором этанола концентрацией 70% при 40 С - пример 1) и значение ЕС 50 приблизительно 20 нг/мл (в 5 раз меньше, чем при экстрагировании раствором этанола концентрацией 70% при 40 С). Пример 39. Более короткое время экстрагирования. Данные, представленные в табл. 4, были собраны по материалу, экстрагировавшемуся дважды, в первый раз в течение 3 ч и второй раз в течение 12 ч при каждых условиях. Для оптимизации крупномасштабного процесса экстрагирования препарата NP16847, были проведены испытания с более короткими временами экстрагирования, равными 1 ч, и было обнаружено, что получаются те же результаты,как по выходу конечного продукта, так и по удельной активности. Пример 40. Экстрагирование горячей водой при 95 С в течение 30 мин. В предшествующих методиках по выделению иммуностимулирующих полисахаридов из других типов микроводорослей (17, 27) обычно использовалось одноразовое экстрагирование горячей водой при 95 С в течение 30 мин. Для оценки этого способа 1 г лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался однократному экстрагированию с применением 20 мл воды при 95 С в течение 30 мин. Концентрация этанола в водном экстракте доводилась до 80% и экстракт выдерживался при-20 С в течение нескольких часов. Выход собранной выпавшей фазы составил 12,1%, но в ней содержалось меньше NP16847, так как значение ЕС 50 этого материала составляло приблизительно 500 нг/мл. Ультрафильтрация приводила к выходу конечного продукта 5,1% и не показала изменений удельной активности. Очевидно, что эти условия не подходят для экстрагирования препарата NP16847 из микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae. Пример 41. Экстрагирование водой при 4 С с последующим повторным экстрагированием раствором этанола концентрацией 50% при 60 С. Возможно, примесный полярный материал можно выборочно удалять путем начального экстрагирования водой без существенных потерь препарата NP16847. Для оценки этого подхода была испытана двухэтапная методика экстрагирования. После первого этапа, включающего начальное экстрагирование водой при 4 С, выполнялся второй этап повторного экстрагирования при оптимальных условиях (раствор этанола концентрацией 50% при 60 С). Хотя удельная активность препарата NP16847 при применении этого способа была сравнима с удельной активностью препарата, получаемой при оптимальных условиях, выход конечного продукта был примерно на 70% меньше как для предультрафильтрата, так и для постультрафильтрата. Пример 42. Экстрагирование водой при 23 С с последующим повторным экстрагированием раствором этанола концентрацией 50% при 60 С. Методика, применявшаяся в примере 41, была немного изменена путем увеличения температуры экстрагирования с 4 до 23 С. Таким образом, на первом этапе выполнялось начальное экстрагрирование водой при температуре 23 С, а на втором этапе выполнялось повторное экстрагирование при оптимальных условиях (раствор этанола концентрацией 50% при 60 С). Результаты были такими же, как и в примере 41 (т.е. удельная активность была сравнима с удельной активностью, получаемой при оптимальных условиях, выход конечного продукта был примерно на 70% меньше как для предультрафильтрата, так и для постультрафильтрата). Пример 43. Экстрагирование водой при 40 С с последующим повторным экстрагированием раствором этанола концентрацией 50% при 60 С. Методика, применявшаяся в примере 41, была немного изменена путем увеличения температуры экстрагирования с 4 до 40 С. Таким образом, на первом этапе выполнялось начальное экстрагрирование водой при температуре 40 С, а на втором этапе выполнялось повторное экстрагирование при оптимальных условиях (раствор этанола концентрацией 50% при 60 С). Результаты были такими же, как и в примере 41 (т.е. удельная активность была сравнима с удельной активностью, получаемой при оптимальных условиях, выход готового продукта был примерно на 70% меньше как для предультрафильтрата, так и для постультрафильтрата).- 18006318 Пример 44. Экстрагирование раствором этанола концентрацией 70% при 40 С с последующим повторным экстрагированием раствором этанола концентрацией 50% при 60 С. Возможно, примесный полярный материал можно выборочно удалять путем начального экстрагирования водой без существенных потерь препарата NP16847. Для оценки этого подхода была испытана двухэтапная методика экстрагирования. После первого этапа, включающего начальное экстрагирование раствором этанола концентрацией 70% при 40 С, выполнялся второй этап повторного экстрагирования при оптимальных условиях (раствор этанола концентрацией 50% при 60 С). Хотя применение данной методики дало немного лучшее значение ЕС 50 (10 нг/мл), по сравнению с теми значениями, которые были получены в примерах 24 и 25 для постультрафильтрата NP16847, выход готового продукта составил только 1,0%. Выход предультрафильтрата составил 2,2% при значении ЕС 50, равном 20 нг/мл. Одно из свойств очищенного препарата NP16847 состояло в том, что он, по-видимому, прикреплялся к кончику полипропиленовой пипетки. Во избежание преувеличенных значений ЕС 50, в результате переноса материала во время последовательного разбавления, кончики пипеток менялись перед каждым разбавлением. Хроматографический анализ препарата NP16847 до и после ультрафильтрации показан на фиг. 5-11. Элюирование препарата NP16847, выделявшегося с применением методики, рассмотренной в примере 1,происходило обычно в виде широкого одиночного максимума (фиг. 1). Однако при применении измененной методики (примеры 4-9), элюирование препарата NP16847 происходило по широкой области,включающей, как очевидно, три максимума (см. фиг. 5-10). Однако при разделении растворителем этих постультрафильтрационных препаратов NP16847 на воду и хлороформ (1:1) эта трехпиковая характеристика может заменяться широким одиночным максимум. На фиг. 9 и 10 показана форма максимума очищенного полисахарида NP16847 после его отделения от хлороформа. В слепом опыте также имеет место большой максимум далеко справа от каждой хроматограммы и поэтому вызван хлороформом. Существует несколько возможных объяснений трансформации сложного максимума в одиночный максимум. Возможно, что следовое количество неполярного или жирного материала, связанного с препаратомNP16847, который отвечает за внутримолекулярную связь полисахаридов NP16847. Эти более крупные комплексы могут вызывать появление многочисленных максимумов. Удаление неполярного материала хлороформом разрушает эти связи и вызывает появление одиночного хроматографического максимума. Возможная связь жирного или неполярного материала с препаратом NP16847 может объяснить экстрагируемость этого полисахаридного материала водным раствором этанола высоких концентраций. По причине очень большой молекулярной массы этого материала трудно объяснить является ли препаратNP16847 одиночным полисахаридом или смесью родственных полисахаридов. Однако многочисленные максимумы не наблюдаются у предультрафильтрационных и постультрафильтрационных препаратовNP16847 при соблюдении оптимальных условий экстрагирования (раствор этанола концентрацией 50% при 60-70 С, см. фиг. 11). Это может быть вызвано либо более низкой концентрацией этанола, либо более высокими температурами экстрагирования, либо сочетанием этих двух факторов. С помощью GC-спектрометрического анализа TMS-метилгликозидов (табл. 5) оценивался углеводородный состав различных препаратов NP16847. Материал NP16847 из примера 1 (NP1) подвергался повторному анализу и было обнаружено, что профиль углеводородного состава идентичен тому, который был определен ранее. Так как в примерах 4-44 применялась другая партия микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae (приобретенная в другой компании) препарат NP16847 выделялся из этого нового материала по методике экстрагирования, описанной в примере 1 (NP2). Как у этого препарата NP16847 так и у NP1, был сравнимый гликозильный состав, что указывает на схожесть различных партий микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae. Однако препарат NP2 был в пять раз менее активен, чем NP1(табл. 5) ввиду частичной потери активных полисахаридов, переходящих в фазу n-бутанола во время разделения n-бутанола и воды. В общем, родственные углеводородные составы были обнаружены в предультрафильтрационном и постультрафильтрационном препаратах NP16847 (NP3-NP6), полученных с применением оптимальных условий экстрагирования (раствор этанола концентрацией 50% при 60 С и 70 С). Однако в предультрафильтрате NP16847 было значительно больше глюкозы и меньше единиц Nацетилированного сахара, чем в постультрафильтрационных препаратах. На основе схожести углеводородных составов различных препаратов NP16847 (NP1-NP7) можно сделать вывод о том, что основными гликозильными остатками, присутствующими в этом материале, являются манноза, рамноза, арабиноза и глюкоза. Для идентификации O-метилированных сахаров, обнаруженных во время TMSметилгликозидной процедуры, определялся также и гликозильный состав с использованием алдитолацетатного анализа. Остатки метилированного сахара, содержащиеся в этих препаратах, включали 2 метилрамнозу, 3-метилрамнозу, 4-метилрамнозу, 2-метилфукозу, 3-метиларабинозу и 3-метилманнозу. Интересно, что эти препараты NP16847 содержат 5,1-12,5% остатков метилированного углеводорода и большую долю деоксигескоз (т.е. рамнозу и фукозу). Обе эти характеристики могут объяснить необычную экстрагируемость полисахаридного материала NP16847 водным раствором этанола сравнительно больших концентраций.- 19006318 Так как значение ЕС 50 испытуемых образцов (NP1-NP7) отличается почти в 50 раз, можно увидеть некоторое различие их углеводородных составов. Очевидно, что чистоту или активность препаратовNP16847 нельзя определить по этим параметрам. Поэтому лучше определять свойства препаратов NP16847 по биологической активности, размеру и экстрагируемости водным раствором этанола. Может оказаться, что за способность препарата NP16847 активировать моноциты/макрофаги отвечает какой-нибудь уникальный структурный признак, а не специфический углеводородный состав. Возможно также, что углеводородный состав препаратов NP1-NP7 отражает полисахариды, экстрагируемые водным раствором этанола, и иммуностимулирующие полисахариды будут присутствовать в качестве структурного класса внутри этой группы. Такая интерпретация основана на эмпирических данных о том, что углеводородный профиль материала, полученного экстрагированием горячей водой (NP8 и NP9), сильно отличается от профиля препаратов NP16847, выделенных с помощью экстрагирования водным раствором этанола (NP1-NP7). Преобладающим гликозильным остатком как предультрафильтрационного, так и постультрафильтрационного материала, полученного из микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae экстрагированием горячей водой, была глюкоза (табл. 5). Другой отличительной характеристикой препаратов NP8 и NP9 является малое содержание рамнозы, по сравнению с материалом NP16847, выделенным экстрагированием водным раствором этанола. Пример 45. Экстрагирование раствором метанола концентрацией 60%, нагретого до 65 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором метанола концентрацией 60% при 65 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 1 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 1 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,5 млс). Концентрация метанола в супернатанте доводилась до 80% концентрации этанола путем добавления холодного 100% метанола. После выдержки при-20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором метанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 1,8% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 75 нг/мл в пробе активации моноцитов. Пример 46. Экстрагирование раствором изопропанола концентрацией 40%, нагретого до 65 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором изопропанола концентрацией 40% при 65 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 1 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 1 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,5 млс). Концентрация изопропанола в супернатанте доводилась до 80% концентрации этанола путем добавления холодного 100% изопропанола. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором изопропанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 12,0% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов. Пример 46. Экстрагирование раствором изопропанола концентрацией 40%, нагретого до 65 С, и прямое осаждение раствором спирта концентрацией 80%. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию раствором изопропанола концентрацией 40% при 65 С сначала с применением 7,5 мл раствора в течение 1 ч, а затем с применением 6,25 мл раствора в течение 1 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,5 млс). Путем добавления холодного 100% изопропанола концентрация изопропанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором изопропанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой методики экстрагирования извлекалось 12,0% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным 100 нг/мл в пробе активации моноцитов. Пример 47. Экстрагирование 100% этанолом методом горячего орошения и осаждение охлаждением до -20 С. Один грамм лиофилизированных микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae подвергался экстрагированию 100% этанолом методом горячего орошения сначала с применением 8,0 мл этанола в течение 1 ч, а затем с применением 6,50 мл этанола в течение 1 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,0 млс). Затем объединенный супернатант выдерживался при-20 С в течение нескольких часов и осаждаемый материал удалялся центрифугированием. Затем выпавшая фаза промывалась холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. В результате применения этой- 20006318 методики экстрагирования извлекалось 0,68% предультрафильтрационного препарата NP16847 со значением ЕС 50, равным приблизительно 750 нг/мл в пробе активации моноцитов. Пример 48. Экстрагирование иммуностимулирующего полисахаридного материала водным раствором спирта из других пищевых микроводорослей (Chlorella и Spirulina). Процесс получения препарата NP16847 из микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae начальной экстракцией водным раствором спирта при оптимальных условиях приводит к получению препарата,который в 20 раз более активен, чем материал, полученный экстрагированием горячей водой (значение ЕС 50 для активации моноцитов равно соответственно 25 нг/мл и 500 нг/мл). Ту же методику экстрагирования водным раствором спирта можно применить к другим пищевым водорослям для получения препаратов, обогащенных иммуностимулирующими полисахаридами. Например, в предыдущих патентах (16, 17, 27) отмечалось, что вид Chlorella и вид Spirulina содержат иммуностимулирующие полисахариды, которые экстрагируются холодной водой. Однако экстрагирование водным раствором спирта (вместо горячей воды) приводит к селективному обогащению полисахаридами, которые являются иммуностимуляторами, и поэтому приводит к получению препаратов из тех организмов, которые проявляют наивысшую биологическую активность, а также обеспечивают более высокую долю выхода активного материала (см. эксперименты, описанные ниже). В этих экспериментах применялись следующие пищевые микроводоросли: Chlorella pyrenoidosa(компания Сан Хлорелла, партияWS 1422) и Spirulina platensis (компания Нейчерс Уэй, партия 912091). Все полисахаридные препараты представляли предультрафильтрационный материал. Для приготовления экстрактов, полученных экстрагированием горячей водой, 1 г лиофилизированных микроводорослей экстрагировался один раз с применением 20 мл воды при 95 С в течение 30 мин. Содержание спирта в экстрактах горячей воды доводилось до 80% и экстракты выдерживались при -20 С в течение ночи. Выпавшая фаза, собранная из микроводоросли Chlorella, составляла 13,2%, а значение ЕС 50 было равно 1000 нг/мл. Выпавшая фаза, собранная из микроводоросли Spirulina, составляла 16,5%, а значение ЕС 50 было равно 10000 нг/мл для активации моноцитов/макрофагов. Экстракты водного раствора этанола готовились путем систематического изменения как температуры, так и концентрации растворителя (доля этанола в воде), применявшегося во время начального экстрагирования. Для определения оптимальных условий приготовления иммуностимулирующего полисахаридного материала использовались конечные точки доли конечного продукта и значение ЕС 50 активации макрофагов. Экстракты микроводорослей Chlorella и Spirulina готовились по следующей методике. Один грамм лиофилизированных микроводорослей экстрагировался при соответствующей температуре сначала с применением 7,5 мл водного раствора этанола в течение 2 ч, а затем с применением 6,25 мл водного раствора этанола в течение 2 ч. После двукратного экстрагирования и центрифугирования супернатант соединялся (11,3 млс). Путем добавления холодного 100% этанола концентрация этанола в супернатанте доводилась до 80%. После выдержки при -20 С в течение нескольких часов выпавшие фазы собирались центрифугированием и затем промывались холодным раствором этанола концентрацией 95%. Выделенный материал подвергался вакуумной сушке и растворялся в воде до концентрации 10 мг/мл. Условия экстрагирования как для оптимального выхода конечного продукта, так и для удельной активности иммуностимулирующих полисахаридных препаратов из микроводорослей Chlorella и Spirulina были одинаковыми с оптимальными условиями (экстрагирование раствором этанола концентрацией 50% при 60-70 С) экстрагирования препарата NP16847 из микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae. Для микроводоросли Chlorella оптимальные условия приготовления иммуностимулирующего полисахаридного материала включают начальное экстрагирование раствором этанола концентрацией 50% при 70 С. При данных условиях выход конечного продукта составляет 6,5%, а значение ЕС 50 равно 25 нг/мл. Для микроводоросли Spirulina оптимальные условия приготовления иммуностимулирующего полисахаридного материала включают начальное экстрагирование раствором этанола концентрацией 40-50% при температурах от 50 до 70 С. При этих условиях выход предультрафильтрата составляет приблизительно 9,0%, а значение ЕС 50 равно 500 нг/мл. Для сравнения - хотя экстрагирование горячей водой приводит к увеличению выхода конечных продуктов приблизительно в 2 раза, тем не менее, их активность в 20-40 раз ниже активности препаратов, полученных при оптимальных условиях экстрагирования водным раствором этанола. Короче говоря, была разработана простая и эффективная методика выделения препарата NP16847 из микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae с получением оптимального выхода конечного продукта. Способом оптимального экстрагирования при получении предультрафильтрата препарата NP16847 является прямое осаждение спиртом (80% при - 20 С) из двух объединенных экстрактов, полученных экстрагированием раствором этанола концентрацией 50% при 60-70 С в течение 1 ч. Выход ультрафильтрата препарата NP16847 составил 11% сухой массы микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae. При введении дополнительного этапа, включающего ультрафильтрацию для исключения всех материалов массой меньше 100000 Да, можно получить относительно чистый препарат полисахаридов NP16847 с выходом конечного продукта от 4,5 до 5,6%. Значение EC50 как предультрафильтрационного, так и постультрационного препарата было примерно одинаковым (25 нг/мл для предультрафильтрата и 20 нг/мл для постультрафильтрата). В сравнении с материалом NP16847, полученным в примере 1 (экстрагирование рас- 21006318 твором этанола концентрацией 70% при 40 С), этот постультрафильтрационный препарат, полученный при применении оптимальной методики, содержит в 7,5-9,3 раз больше препарата NP16847, активность которого больше в 5 раз. Эта методика хорошо подходит как для приготовления экстракта пищевой добавки (ботанической), так и для сыпучего фармацевтического продукта. Тот же процесс, описанный для получения иммуностимулирующих полисахаридных составов(NP16847) из микроводорослей Aphanizomenon flos-aquae, можно использовать для получения препаратов из других микроводорослей (которые включают вид Chlorella и вид Spirulina), обогащенных иммуностимулирующими полисхаридами (например, тех, которые активируют моноциты/макрофаги). Уникальный углеводородный состав всех трех микроводорослевых полисахаридных препаратов позволяет использовать методику выборочного обогащения полисахаридами, которые являются иммуностимуляторами. При применении традиционной методики экстрагирования горячей водой эти полисахариды экстрагируются очень плохо. Препараты, полученные на основе экстрагирования горячей водой, в 20-40 раз менее активны по сравнению с препаратами, полученными с использованием оптимизированной методики. Фармацевтические композиции Настоящее изобретение также включает дешевые сыпучие полисахаридные препараты. Микроводоросли, из которых выделяют эти полисахаридные препараты, можно вырастить в емкостях, так же как это делается с помощью современных коммерческих способов культивирования этих микроводорослей для употребления людьми. Это означает, что не будет проблем с их поставкой, которые часто являются главным вопросом при разработке лекарств из составов, выделяемых из натуральных продуктов. Концентрации настоящих полисахаридных препаратов в микроводорослях достаточно высоки (от 6,5 до 11% сухой массы микроводорослей), и эти препараты могут выделяться с использованием простых, быстрых и дешевых методик по настоящему изобретению. Так как настоящие полисахаридные препараты применяются в качестве веществ для иммунотерапии при лечении иммунодефицитных заболеваний, рака, инфекционных болезней и при заживлении ран,настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие полисахаридные препараты, которые могут сочетаться с приемлемыми фармацевтическими носителями и наполнителями. Фармацевтические композиции, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают составы, в которых для достижения намеченных целей активные ингредиенты содержаться в эффективных количествах. В частности, терапевтически эффективное количество означает количество, эффективное для предотвращения развития или для облегчения существующих симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение. Определение эффективных количеств является прерогативой специалистов, особенно в свете подробного описания, приведенного ниже. Количество вводимой композиции зависит от состояния, по поводу которого проводится лечение,субъекта, которому предписано лечение, от массы субъекта, степени поражения, способа введения и заключения персонального врача. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может изготавливаться известными способами, например, традиционным смешиванием, растворением, гранулированием, получением драже,растиранием в порошок, эмульгированием, капсулированием, улавливанием или лиофилизацией. Фармацевтические композиции для использования по настоящему изобретению могут составляться традиционными способами, с использованием одного или большего количества физиологически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные средства, упрощающие перевод составов композиций в препараты, которые можно использовать с фармацевтической точки зрения. Форма композиции зависит от выбранного способа ее введения. Препараты для инжекций по настоящему изобретению могут составляться в виде водных растворов, желательно, в виде буферных растворов, обладающих физиологической совместимостью, типа раствора Хенкса, раствора Рингера, или физиологического забуференного раствора. Для введения через слизистую оболочку в композиции применяются проникающие реагенты, соответствующие барьеру, через который они должны проникнуть. Обычно такие проникающие реагенты известны. При введении через рот композиции могут составляться путем сочетания активных составов с известными фармацевтически приемлемыми носителями. Такие носители позволяют составлять составы по настоящему изобретению в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, суспензий,взвесей и т.п. для введения пациенту, подлежащего лечению, через рот. Фармацевтические препараты для орального применения могут включать твердый наполнитель, получаемый, обычно, путем помола результирующей смеси и обработки смеси гранул после добавления подходящих вспомогательных средств, если это необходимо для получения таблеток или ядер драже. Подходящими наполнителями являются, в частности, наполнители типа сахаров, включая лактозу, сахарозу, маннитол, или сорбитол; препараты целлюлозы, например, маисовый крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, смолу трагаканта, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия, и/или поливинилпирролидон. При необходимости могут добавляться расщепляющие вещества, например, структурированный поливинилпирролидол, агар или альгиновая кислота или ее соль типа альгината натрия.- 22006318 Ядра драже покрываются соответствующим покрытием. Для этого можно использовать концентрированный сахарный раствор, который может содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидол, гель каргопола, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, лакообразные растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Для идентификации или для отличия различных композиций по дозам активного состава в покрытия таблеток или драже могут вводиться красящие вещества или пигменты. Фармацевтические препараты, которые можно принимать орально, включают желатиновые капсулы, а также герметичные капсулы, выполненные из желатина и пластификатора, типа глицерина или сорбитола. Желатиновые капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем типа лактозы, связующих, типа крахмалов и/или смазывающих веществ типа талька или стеарата магния и,возможно, стабилизаторов. В мягких капсулах активные составы могут растворяться или находиться в виде взвеси в подходящих жидкостях типа жирных масел, жидкого парафина или жидких полиэтиленгликолей. Кроме того, дополнительно могут вводиться стабилизаторы. Все композиции для орального введения должны быть в дозах, подходящих для такого введения. При трансбуккальном введении составы могут принимать форму таблеток или лепешек, составленных обычным способом. При введении ингаляцией составы для применения по настоящему изобретению обычно доставляются в виде аэрозольного распыления из аэрозольных упаковок или распылителей с применением подходящего газа-вытеснителя, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозольной упаковки единичная доза может отмеряться клапаном, обеспечивающем доставку мерного количества препарата. Капсулы и картриджи, например, из желатина для применения в ингаляторе или инсуффляторе могут содержать смесь порошков соединения и подходящий базовый порошок, типа лактозы или крахмала. Составы могут вводиться парентерально инжекцией, например, введением шарика или непрерывным вливанием. Композиции для инжекций могут быть в виде единичной дозы, например, в ампулах или в виде многодозовых контейнеров с добавлением консерванта. Составы могут быть в виде суспензий,растворов или эмульсий в масляных или водных наполнителях и могут содержать композиционные средства типа суспендирующих, стабилизирующих и/или диспергирующих агентов. Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимом виде. Кроме того, суспензии активного состава могут готовиться в виде соответствующих масляных суспензий. Подходящие липофильные растворители или наполнители включают жирные масла типа масла кунжута или синтетических сложных эфиров жирных кислот типа этилолеата или триглицеридов или липосом. Водные суспензии могут включать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, типа карбоксиметилцеллюлозы натрия, сорбитола или декстрана. Суспензии могут также содержать подходящие стабилизаторы или средства, которые увеличивают растворимость соединений для приготовления растворов высоких концентраций. В другом случае активный ингредиент может присутствовать в виде порошка для соединения перед применением с подходящим носителем (например, со стерильной беспирогенной водой). Композиции могут составляться также в виде ректальных композиций типа клизм с задержкой, например, содержащих обычную суппозитарную основу типа масла какао или других глицеридов. Помимо составов, описанных выше, композиции могут составляться в виде препаратов депо. Такие долгодействующие составы могут вводиться имплантацией (например, подкожно или внутримышечно) или внутримышечной инъекцией. Таким образом, составы, например, могут приготавливаться с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсий в подходящем масле) или ионообменных смол, или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли. В состав фармацевтических композиций могут также входить носители из растворимых твердых фаз или геля или наполнители. К числу таких носителей или наполнителей, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относится карбонат кальция, фосфат кальция,различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры типа полиэтиленгликолей. К числу подходящих путей введения относится, например, оральное, ректальное, чрезмышечное,чрезкожное, или введение через кишечник, парентеральное, включая внутримышечные, подкожные инъекции, инъекции в костный мозг, а также внутриоболочечное, прямое внутрижелудочное, внутривенное,внутрибрюшное, внутриназальное или внутриглазное введение. В другом случае композиция может вводиться местно, а не системно, например, путем введения состава прямо в пораженную зону, часто как депо, или длительно выделяющаяся композиция. Кроме того, лекарство может вводиться с помощью системы доставки лекарства направленного действия, например, в липосоме, покрытой антителом, специфическим к пораженным клеткам. Липосомы нацеливаются на клетки и выборочно забираются клетками. При желании, составы могут быть в виде упаковки или фасовок, содержащих одноразовую дозу или многоразовую дозу, включающую активный ингредиент. Упаковка типа блистера, например, может содержать металлическую фольгу или пластмассовую пленку. К упаковке или фасовке может прилагаться- 23006318 инструкция по применению. Можно приготовить составы, включающие состав по настоящему изобретению, приготовленные в совместимом фармацевтическом носителе, помещенном в соответствующий контейнер и снабженные маркировкой, с указанием состояния, подлежащего лечению. В маркировке могут указываться соответствующие болезненные состояния и применение. Пищевые добавки Пищевые добавки, подходящие для применения по настоящему изобретению, включают составы, в которых активные ингредиенты содержаться в количествах, эффективных для достижения поставленных целей. В частности, эффективное количество означает такое количество, которое оказывает эффективное воздействие и предотвращает развитие или облегчает существующие симптомы субъекта, подвергаемого лечению. Определение эффективных количеств выполняется специалистами, особенно в свете представленного здесь подробного описания. Количество вводимого состава зависит от состояния, подлежащего лечению, субъекта, подвергаемого лечению, массы субъекта, тяжести заболевания, способа введения и решения персонального врача. Ингредиенты пищевой добавки по настоящему изобретению включаются в приемлемые наполнители и/или носители для орального применения. Реальная форма носителя и, таким образом, самой пищевой добавки не может быть критичной. В качестве носителя может применяться жидкость, гель, гелевые капсулы, капсулы, порошок, таблетки (с покрытием или без покрытия), чай и т.п. в качестве подходящего наполнителя и/или носителя может быть мальтодекстрин, карбонат кальция, дикальцийфосфат, трикальцийфосфат, микрокристаллическая целлюлоза, декстроза, рисовая мука, стеарат магния, стеариновая кислота, кроскармеллоза натрия, глюколат натрия на основе крахмала, кросповидон, сахароза, камедь,агар, лактоза, метилцеллюлоза, повидон, карбоксиметилцеллюлоза, кукурузный крахмал, и т.п. (включая смеси из них). Различные ингредиенты и наполнитель и/или носитель смешиваются и формируются с получением желаемой формы с помощью традиционных методик. Единичные дозы регулируются таким образом, чтобы рекомендуемая суточная доза ингредиента размещалась в приемлемом количестве единичных доз. Пищевая добавка может также содержать и другие возможные ингредиенты включая, например,травы, витамины, минералы, энхенсеры, красящие вещества, подслащивающие вещества, вкусовые вещества, инертные ингредиенты и т.п. Такие возможные ингредиенты могут быть либо в натуральном,либо в концентрированном виде. Выбор одного или нескольких из этих ингредиентов определяется составом, дизайном, предпочтениями потребителя и конечного пользователя. Специалистам известно какие количества этих ингредиентов необходимо вводить в пищевые добавки по настоящему изобретению. При выборе этих количеств рекомендуется руководствоваться дозами RDA США для детей и взрослых. Список литературы 1. Хадден Дж.У. Иммуностимуляторы. Иммунология сегодня, 1993 г.14, стр. 275-260. (Hadden.J.W. Immunostimulants. Immunol. Today 1993, 14. 275-260). 2. Масихи К.Н. Иммуномодулирующие препараты для профилактики и терапии инфекций. Международный журнал антимикробных препаратов, 2000 г.,14, стр. 181-191. (Masihi, K.N. Immunomodulatory agents for prophylaxis and therapy of infections, Int. J. Antimicrob. Agents, 2000, 14, 181-191). 3. Ван Кампен К.Р. Иммунотерапия и цитокинез. Семинар по ветеринарной хирургии (Малые животные), 1997 г.,12, стр. 186-192. (Van Kampen, K.R. Immunotherapy and cytokines. Semin. Vet. Med.New York, 1995; pp. 450-458). 6. Уилсон К. Заживление ран: роль макрофагов. Уход в интенсивной терапии. 1997 г.,2, стр. 291296. (Wilson, K. Wound healing: the role of macrophages. Nurs. Crit. Care 1997, 2, 291-296). 7. Кинг Г.К., Ятес К.М., Гринли П.Г., Пиерс К.Р., Форд С.Р., МакАналли Б.Х, Тизард И. Р. Влияние имуностимулятора Ацеманнана в сочетании с хирургией и радиационной терапией на спонтанные фибросаркомы собак и кошек. Журнал американской ассоциации госпиталей для животных. 1995 г.,3,стр. 439-447. (King, G.K.; Yates, K.М.; Greenlee, P.G.; Pierce, K.R.; Ford, С.R.; McAnalley, В.H.; Tizard, I.R.canine and feline fibrosarcomas. J. Am. Animal Hosp. Assoc, 1995, 3: 439-47). 8. Натори Т, Мотоки К., Хига Т., Коезука Я. KRN7000 в качестве нового типа противоопухолевого и иммуностимулирующего лекарства. В книге Лекарство из моря, под ред. Фусетани H., Каргер, Нью Йорк, 2000 г., стр. 86-97. (Natori, Т.; Motoki, K.; Higa, Т.; Koezuka, Y. KRN7000 as a new type of antitumor- 24006318 9. Шу Я.З. Недавняя разработка лекарств на основе натуральных продуктов: перспективы фармацевтической промышленности. Журнал Натуральные продукты, 1998 г.,61, стр. 1053-1071. (Shu. Y.Z.Immunatoxicol. 1999, 27, 609-619). 12. Дантас Д.С., Куейроз М.Л. Действия Chlorella vulgaris на плетки-предшественники костного мозга мышей, инфицированных Usteria monocytogenеs. Международный журнал иммунофармакологии. 1999 г.,21, стр. 499-508. (Dantas, D.С.; Queiroz, M.L. Effects of Chlorella vulgaris on bone marrow progenitor cells of mice infected with Usteria monocytogenеs. Int. J. Immunopharmacol. 1999, 27, 499-508). 13. Къюреши М.А., Гарич Дж.Д., Кидд М.Т. Пищевая Spirulina platensis усиливает гуморальные и клеточно-опосредованные иммунные функции цыплят. Иммунофармакология и иммунотоксикология. 1996 г.18, стр. 465-476. (Qureshi, M.A.; Gariich, J.D.; Kidd, M.Т. Dietary Spirulina platensis enhances humoral and cell-mediated immune functions in chickens. Iminunopharmacol. Immunotoxicol. 1996, 18, 465-476). 14. Матею Б. Санкаранараянан Р., Наир П.П., Варгхесе С., Соманатан Т., Амма Б.П., Амма Н.С. Наир М.К. Оценка хемопрофилактики рака ротовой полости с помощью Spirulina fusiformis. Питание и рак. 1995 г.,24, стр. 197-202. (Mathew, В.; Sankaranarayanan, R.; Nair, P.P.; Varghese, C.; Somanathan, Т.;flos-aquae приводит к быстрому влиянию на циркуляцию и функцию иммунных клеток человека. JANA,2000 г.,2, стр. 50-58. (Jensen, G.S.; Ginsberg, D.I.; Huerta, P.; Citton, M.; Drapeau, C. Consumption ofAphanizomenon flos-aquae has rapid effects on the circulation and function of immune cells in humans. JANA 2000, 2, 50-58). 16. Умезава И., Комияма К. Кислые полисахариды СН-1, выделенные из микроводорослей Chlorellapyrenoidosa и их применение. Патент США 4533548, 1985 г. (Umezawa, I.; Komiyama, K. Acidic polysaccharide CH-1 isolated from Chlorella pyrenoidosa and the use thereof. U.S. Patent 4533548, 1985). 17. Ватанабе С., Сето А. Ингредиент эффективный для активации иммунитета, полученный из микроводорослей Chlorella minutissima. Патент США 4831020, 1989 г. (Watanabe, S.; Seto, A. Ingredientagent. U.S. Patent 4822612, 1989). 20. Нода К., Оно П., Танака К., Окуда М., Ябомае Т., Номото К., Шояма Я. Новый тип модификатора биологической реакции, полученного из микроводорослей Chlorella vulgaris, для которого требуется,чтобы участок белка проявлял противоопухолевую активность. Фитотерапевтические исследования. 1998 г.,2, стр. 309-319. (Noda. K.; Ohno, N.; Tanaka, K.; Okuda, M.; Yadomae, Т.; Nomoto, K.; Shoyama,Y. A new type of biological response modifier from Chlorella vulgaris which needs protein moiety to show anantitumor activity. Phytother Res. 1998, 2, 309-319). 21. Танака Т., Ямада А., Нода К., Хасегава Т, Окуда M., Шояма Я., Номото К. Новый гликопротеин,полученный из штамма СК 22 водоросли Chlorella vulgaris, демонстрирует антиметастазный иммуногенный потенциал. Иммунология и иммунотерапия рака. 1998 г.,45, стр. 313-320. (Tanaka, Т.; Yamada, A.;Shoyama, Y. A water-soluble antitumor glycoprotein from Chlorelia vulgaris. Planta Med. 1996, 62, 423-426). 23. Мацуеда С., Шинпо К., Танака К., Абе К., Карасава X. Исследования противоопухолевого гликопротеина, полученного из Chlorelia vulgaris. II. Научные отчеты университета Хиросаки. 1983 г.,30,стр. 127-131. (Matsueda, S.; Shinpo, K.; Tanaka, K.; Abe, K.; Karasawa, H. Studies on anti-tumor active glycoprotein from Chforella vulgaris. II. Sci. Rep. Hirosaki Univ. 1983, 30, 127-131). 24. Моримото А., Нагацу А., Мкраками Н., Сакакибара Дж., Токуба X., Нашино X, Ивашима А. Стимулирующие противоопухолевую активность глицерогликолипиды, полученные из зеленых водо- 25006318 рослей Chlorella vulgaris. Фитохимия. 1995 г.,40, стр. 1433-1437. (Morimoto, A.; Nagatsu, A.; Murakami,N.; Sakakibara, J.; Tokuda, H.; Nishino, H.; Iwashima, A. Anti-tumor-promoting glyceroglycolipids from thegreen alga Chlorella vulgaris. Phytochemisfry 1995, 40, 1433-1437). 25. Мишима Т., Мурата Дж., Тойошима М., Фуджи X., Накиджима М., Хайаши Т., Като Т., Сайки И. Угнетение инвазии опухоли и метастаз с помощью спирулана кальция (Ca-SP), новый сульфатированный полисахарид, полученный из сине-зеленых водорослей Spirulina platensis. Клинические эксперименты на метастазах. 1998 г.,16, стр. 541-550. (Mishima, Т.; Murata, J.; Toyoshima, М.; Fujii, H.; Nakajima,M.; Hayashi, Т.; Kato, Т.; Saiki, I. Inhibition of tumor invasion and metastasis by calcium spirulan (Ca-SP), anovel sulfated polysaccharide derived from a blue-green alga Spirulina platensis. Clin. Exp. Metastasis 1998, 76,541-550). 26. Ли Дж.Б., Хайаши Т., Хайаши К., Санкава У., Меада М., Немото Т., Наканиши X. Дальнейшее очищение и структурный анализ спирулана кальция, полученного из микроводорослей Spirulina platensis. Журнал натуральных продуктов. 1998 г.,61, стр., 1101-1104. (Lee, J.В.; Hayashi, Т.; Hayashi, K.;(Hayashi, Т.; Hayashi, K.; Kojima, I. Antiviral polysaccharide. U.S. Patent 5585365, 1996). 28. Ванг X., Зенг Х.П., Янг С.З. Выделение, очистка и некоторые свойства водорастворимых полисахаридов, полученных из микроводорослей Spirulina platensis. Jingxi Huagong, 1999 г.,16, 26-29.(Wang, H.; Zeng, H.P.; Yang, S.Z. Isolation, purification and some properties of the water-soluble polysaccharides from Spirulina platensis. Jingxi Huagong 1999, 16, 26-29). 29. By Дж., Жанг С., Лиу Я. Выделение, очистка и иммунологическая активность внеклеточных полисахаридов ЕР II, полученных из микроводорослей Spirulina maxima. Yaowu Shengwu Jishu. 1999 г.,6,стр. 99-102. (Wu, J.; Zhang, C.; Liu, Y. Isolation, purification and immunological activities of extracellularpolysaccharide EP II from Spirulina maxima. Yaowu Shengwu Jishu 1999, 6, 99-102). 30. Жанг Я.У.Х., Гао Дж., Шен З., Лин В., Фу X. Новая технология сепарации и очистки полисахаридов из микроводорослей Spirulina platensis. Shipin Yu Fajiao Gongye. 1999 г.,25, стр. 15-18. (Zhang,Y.; U, H.; Gao, J.; Shen, Z.; Lin, W.; Fu, H. New process for separation and purification of polysaccharides fromTumor-induced immune dysfunction: the macrophage connection. J. Leukoc. Biol. 1998, 64, 275-290). 32. Морриссетте Н., Голд Е., Адерем А. Макрофаг: клетка на все сезоны. Тенденции в биологии клетки. 1999 г.,9, стр. 199-201. (Morrissette, N.; Gold, E.; Aderem, A. The macrophage: a cell for all seasons. Trends Cell. Biol. 1999, 9, 199-201). 33. Гордон С. Роль макрофага в иммунном регулировании. Иммунологические исследования. 1998 г.,149, стр. 685-688. (Gordon, S. The role of the macrophage in immune regulation. Res. Immunol. 1998,149, 685-688). 34. Адамс Д.О., Хамильтон Т.А. Молекулярная основа активации макрофагов: разнообразие и его происхождение. В книге Макрофаг - естественная иммунная система. Под ред. Левис С.Е., МакГи Дж. О'Д. Оксфорд Юниверсити Пресс Инк., Нью Йорк, 1992 г., стр. 75-114. (Adams, D.О.; Hamilton, Т.A. Molecular basis of macrophage activation: diversity and its origins. In The Natural Immune System: The Macrophage; Lewis, C.E., McGee, J.O'D., Eds.; Oxford University Press Inc.: New York, 1992; pp. 75-114). 35. Мэй М.Дж., Гош С. Передача сигнала через NF-каппа В. Иммунология сегодня. 1998 г.,19,стр. 80-88. (May, M.J.; Ghosh, S. Signal transduction through NF-kappa В Immunol. Today 1998, 79, 80-88). 36. Баерле П.А., Хенкель Т. Функция и активация NF-каппа В в иммунной системе. Ежегодный обзор иммунологии. 1999 г.,12, стр. 141-179. (Baeuerle, P.A.; Henkel, Т. Function and activation of NFkappa В in the immune system. Annu. Rev. Immunol. 1994, 12, 141-179). 37. Чанг С.С., Жанг Дж., Ломбарди Л., Нери А., Далла-Фавера Р. Механизм экспрессии и роль в транскрипционном контроле протоонкогена NFKB-2/LYT-10. Онкоген, 1994 г.,9 стр. 923-933. (Chang,С.С.; Zhang, J.; Lombardi, L.; Neri, A.; Dalla-Favera, R. Mechanism of expression and role in transcriptionalcontrol of the proto-oncogene NFKB-2/LYT-10. Oncogene, 1994, 9, 923-933). 38. Йорк У.С., Дарвил А.Г., МкНейл M., Стевенсон Т.Т., Альюершрайм П. Выделение и получение характеристик стенок клеток растений и компонентов стенок клеток. Методы энзимологии. 1986 г.,118, стр. 3-40. (York, W.S.; Darvill, A.G.; McNeil, M.; Stevenson, Т.Т.; Albsrsheim, P. Isolation and characterization of plant cell walls and cell wall components. Methods Enzymol. 1986, 118, 3-40). 39. Хакомори С. Быстрое перметилирование гликолипидов и полисахаридов, катализированных метилсульфинилкарбанионом в диметилсульфоксиде. Биохимический журнал. Токио, 1964 г.,55, стр. 205-208. (Hakomori, S. Rapid permethylation of glycolipids and polysaccharides, catalyzed by methylsuffinylcarbanion in dimethyl sulfoxide. J. Biochem. Tokyo 1964, 55, 205-208). 40. Азади П., О'Нейл М.А., Бергманн С., Дарвил А.Г., Альбершайм П. Остов пектинового полисахарида рамногалактуронана I расщеплен эндогидролазой и эндолиазой. Гликобиология, 1995 г.,5, стр.polysaccharide rhamnogalacturonan I is cleaved by an endohydrolase and an endolyase. Glycobiology 1995, 5,783-789). 41. Стугерон Р.Дж. Моносахариды: колориметрический анализ. В книге Методы в биохимии растений, т. 2, гл. 1. Под ред. Дей П.М., Харбом Дж.Б. Академик Пресс. Нью Йорк, 1990 г., стр. 4-12. (Sturgeon, R.J. Monosaccharides: colorimetric assays. In Methods in Plant Biochemistry, vol. 2, chapter 1; Dey,P.M., Harbome, J.В., Ed.; Academic Press: New York, 1990; pp. 4-12). 42. Су С., Вивиер Р.Г., Диксон М.С., Томас Н., Кендрик М.К., Уиллиямсон Н.М., Ансон Дж.Г., Хоустон Дж.Г., Крайг Ф.Ф. Высокопроизводительный RT-PCR анализ множественных транскриптов с помощью методики выделения РНК на микроплате. Биометодики. 1997 г.,22, стр. 1107-1113. (Su, S.;Craig, F.F. High-throughput RT-PCR analysis of multiple transcripts using a microplate RNA isolation procedure. Biotechniques, 1997, 22, 1107-1113). 43. Жанг К., Лью M., Лью К., Ван X., Шангхао Л. Предварительное выделение и спектральные характеристики фикоцианина из Gymnodinium cyanium. Kexue Tongbao. 1982 г.,27, стр. 115-117. (Zhang,X.; Liu, M.; Liu, Q.; Wan, H.; Shanghao, L. Preliminary isolation and spectral characteristics of phycocyanin ofGymnodinium cyanium. Kexue Tongbao 1982, 27, 115-117). 44. Огава К., Тезука С., Цуча Я., Танабе Я. Ивамото X. Фикоцианин в виде красящего вещества жевательной резинки. Патент Японии 54138156, 1979 г. (Ogawa, K.; Tezuka, S.; Tsucha, Y.; Tanabe, Y.;Iwamoto, H. Phycocyanin as a chewing gum coloring agent. Japanese Patent 54138156, 1979). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Иммуностимулирующие препараты, выделяемые из микроводорослей, содержащих полисахариды, экстрагируемые растворителем в виде воды или в виде смеси воды и хотя бы одного низшего алкилового спирта, в котором алкиловая часть состоит из 1-4 атомов углерода и в которой активные полисахариды имеют явную молекулярную массу приблизительно более 2 миллионов Да. 2. Иммуностимулирующий препарат по п.1, отличающийся тем, что иммуностимулирующая активность проявляется в виде активации моноцитов/макрофагов. 3. Иммуностимулирующий препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae. 4. Иммуностимулирующий препарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae. 5. Иммуностимулирующий препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa. 6. Иммуностимулирующий препарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa. 7. Иммуностимулирующий препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis. 8. Иммуностимулирующий препарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis. 9. Иммуностимулирующий препарат по п.3, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из маннозы, глюкозы, рамнозы, галактозы, фукозы,метилированных сахаров и N-ацетилированных аминосахаров. 10. Иммуностимулирующий препарат по п.4, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из маннозы, глюкозы, рамнозы, галактозы, фукозы,метилированных сахаров и N-ацетилированных аминосахаров. 11. Иммуностимулирующий препарат по п.5, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из арабинозы, галактозы, рамнозы, глюкозы и метилированных сахаров. 12. Иммуностимулирующий препарат по п.6, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из арабинозы, галактозы, рамнозы, глюкозы и метилированных сахаров. 13. Иммуностимулирующий препарат по п.7, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из рамнозы, глюкуроновой кислоты, фукозы, галактозы и метилированных сахаров. 14. Иммуностимулирующий препарат по п.8, отличающийся тем, что компоненты гликозила активных полисахаридов в значительной степени состоят из рамнозы, глюкуроновой кислоты, фукозы, галактозы и метилированных сахаров. 15. Фармацевтическая композиция, состоящая из иммуностимулирующих препаратов по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемого носителя или наполнителя.- 27006318 16. Пищевая добавка, состоящая из иммуностимулирующих препаратов по любому из пп.1-14 и носителя или наполнителя, приемлемого для пищевой добавки. 17. Способ усиления иммунной функции индивидуума, нуждающегося в таком лечении, состоящий во введении упомянутому индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции по п.15. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что индивидуум страдает вирусной, бактериальной или грибковой инфекцией. 19. Способ по п.17, отличающийся тем, что индивидуум страдает раком. 20. Способ по п.17, отличающийся тем, что индивидуум страдает иммунодефицитом. 21. Способ по п.17, отличающийся тем, что индивидуумом является человек. 22. Способ по п.17, отличающийся тем, что индивидуумом является животное. 23. Способ усиления иммунной функции индивидуума, нуждающегося в таком лечении, состоящий во введении упомянутому индивидууму эффективного количества пищевой добавки по п.16. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что индивидуум страдает вирусной, бактериальной или грибковой инфекцией. 25. Способ по п.23, отличающийся тем, что индивидуум страдает раком. 26. Способ по п.23, отличающийся тем, что индивидуум страдает иммунодефицитом. 27. Способ по п.23, отличающийся тем, что индивидуумом является человек. 28. Способ по п.23, отличающийся тем, что индивидуумом является животное. 29. Процесс получения препарата из пищевых микроводорослей, обогащенных иммуностимулирующими полисахаридами, включающий следующие этапы: а) получение экстракта экстрагированием из микроводорослей с помощью растворителя в виде воды или смеси воды и хотя бы одного низшего алкилового спирта, в котором алкиловая часть состоит из 1-4 атомов углерода при температуре от 4 до 100 С;b) возможное концентрирование экстракта до небольшого объема, что желательно при большом объеме препарата;c) осаждение полисахаридного препарата из экстракта средствами осаждения;d) сепарация осажденного полисахаридного препарата средствами сепарации;e) промывка выпавшей фазы по этапу (d) спиртом 95%. 30. Процесс по п.29, отличающийся тем, что в качестве спирта при экстрагировании используется этанол. 31. Процесс по п.29, отличающийся тем, что в качестве спирта при экстрагировании используется метанол. 32. Процесс по п.29, отличающийся тем, что в качестве спирта при экстрагировании используется пропанол. 33. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что предпочтительная концентрация спирта на этапе а) составляет 20-80%. 34. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что предпочтительная температура экстрагирования составляет от 40 до 80 С. 35. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae. 36. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa. 37. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis. 38. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) выпариванием растворителя, желательно при пониженном давлении. 39. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) лиофилизацией. 40. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) путем диализа. 41. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе с) полисахаридный препарат осаждается путем введения этанола до получения конечной концентрации этанола приблизительно 80%. 42. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе с) полисахаридный препарат осаждается путем охлаждения экстракта. 43. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе с) полисахаридный препарат осаждается путем добавления соли. 44. Процесс по п.43, отличающийся тем, что в качестве соли применяется сульфат аммония. 45. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем фильтрации. 46. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем центрифугирования.- 28006318 47. Процесс по любому из пп.29-32, отличающийся тем, что на этапе е) осажденный полисахаридный препарат промывается раствором этанола концентрацией 95%. 48. Процесс по любому из пп.29-32, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления ультрафильтрацией практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 100000 Да. 49. Процесс по любому из пп.29-32, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления с помощью размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 2 миллионов Да. 50. Способ лечения индивидуума иммуностимулирующим полисахаридным препаратом с целью стимулирования у индивидуума моноцитной/макрофаговой активности путем введения индивидууму эффективного количества полисахаридного препарата, полученного экстрагированием из пищевых микроводорослей в сочетании с приемлемым носителем. 51. Способ по п.50, отличающийся тем, что иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для усиления заживления ран. 52. Способ по п.50, отличающийся тем, что иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для лечения рака. 53. Способ по п.50, отличающийся тем, что иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для лечения иммунодефицита. 54. Способ по п.50, отличающийся тем, что иммуностимулирующий полисахаридный препарат вводится для лечения вирусной, бактериальной или грибковой инфекции. 55. Способ по п.50, отличающийся тем, что индивидуумом является человек. 56. Способ по п.50, отличающийся тем, что индивидуумом является животное. 57. Способ по п.50, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae. 58. Способ по п.50, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa. 59. Способ по п.50, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis. 60. Процесс по п.33, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae. 61. Процесс по п.33, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa. 62. Процесс по п.33, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis. 63. Процесс по п.33, отличающийся тем, что предпочтительная температура экстрагирования составляет от 40 до 80 С. 64. Процесс по п.33, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) выпариванием растворителя, желательно при пониженном давлении. 65. Процесс по п.33, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) лиофилизацией. 66. Процесс по п.33, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) путем диализа. 67. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе с) полисахаридный препарат осаждается путем введения этанола до получения конечной концентрации этанола приблизительно 80%. 68. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе с) полисахаридный препарат осаждается путем добавления соли. 69. Процесс по п.68, отличающийся тем, что в качестве соли применяется сульфат аммония. 70. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе с) полисахаридный препарат осаждается путем охлаждения экстракта. 71. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем фильтрации. 72. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем центрифугирования. 73. Процесс по п.33, отличающийся тем, что на этапе е) осажденный полисахаридный препарат промывается раствором этанола концентрацией 95%. 74. Процесс по п.33, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 100000 Да ультрафильтрацией. 75. Процесс по п.33, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 2 миллионов Да с помощью размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии.- 29006318 76. Процесс по п.34, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Aphanizomenon flos-aquae. 77. Процесс по п.34, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Chlorella pyrenoidosa. 78. Процесс по п.34, отличающийся тем, что в качестве микроводорослей используются микроводоросли Spirulina platensis. 79. Процесс по п.34, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) выпариванием растворителя, желательно при пониженном давлении. 80. Процесс по п.34, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) лиофилизацией. 81. Процесс по п.34, отличающийся тем, что концентрирование по этапу b) выполняется (при необходимости) путем диализа. 82. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе с) полисахаридный препарат осаждается путем введения этанола до получения конечной концентрации этанола приблизительно 80%. 83. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе с) полисахаридный препарат осаждается путем добавления соли. 84. Процесс по п.83, отличающийся тем, что в качестве соли применяется сульфат аммония. 85. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе с) полисахаридный препарат осаждается путем охлаждения экстракта. 86. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем фильтрации. 87. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе d) осажденный полисахаридный препарат сепарируется путем центрифугирования. 88. Процесс по п.34, отличающийся тем, что на этапе е) осажденный полисахаридный препарат промывается раствором этанола концентрацией 95%. 89. Процесс по п.34, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 100000 Да ультрафильтрацией. 90. Процесс по п.34, включающий также очистку выпавшей фазы путем ее растворения в воде и путем удаления практически всех компонентов молекулярной массой менее приблизительно 2 миллионов Да с помощью размерно-эксклюзивной колоночной хроматографии.
МПК / Метки
МПК: C07H 1/08, A61K 31/715
Метки: сильнодействующие, иммуностимуляторы, микроводорослей
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-6318-silnodejjstvuyushhie-immunostimulyatory-iz-mikrovodoroslejj.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Сильнодействующие иммуностимуляторы из микроводорослей</a>
Предыдущий патент: Производные хиназолина, содержащие эти соединения лекарственные средства, их применение и способ их получения
Следующий патент: Комбинация действующих веществ с биорегуляторными свойствами
Случайный патент: Лебедочное устройство