Интегрированный способ высокопроизводительной идентификации новых пестицидных композиций и его применение

ИНТЕГРИРОВАННЫЙ СПОСОБ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ НОВЫХ ПЕСТИЦИДНЫХ КОМПОЗИЦИЙ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Предложены способы быстрой идентификации последовательностей нуклеиновой кислоты,которые кодируют новые биотоксины. В частности, описаны способы быстрого отбора и скрининга внехромосомного генетического содержимого микроорганизмов для получения новых представляющих интерес последовательностей. Предложены композиции, которые содержат кодирующие последовательности для биотоксинов и полипептиды, и вытекающие из них применения. Композиции и способы применимы, например, для придания пестицидной активности бактериям, растениям, растительным клеткам, тканям и семенам. 025208 Материал прилагаемого перечня последовательностей в полном объеме включен в данный текст путем ссылки. Прилагаемый файл под названием "SGI1530-1WOST25.txt" был создан 17 августа 2012 года, его размер составляет 836 кБ. Содержимое файла можно просмотреть с помощью Microsoft Word на компьютере с установленной системой Window OS. Область техники изобретения Настоящее изобретение в целом относится к области молекулярной биологии. В частности, изобретение относится к идентификации генетических последовательностей, которые кодируют биотоксины, и их применению. Уровень техники Многие виды микроорганизмов, в частности, спорообразующие грамположительные штаммы бактерий, населяющие почвы и прочие сложные экологические системы, вырабатывают широкий спектр белковых токсинов, которые повышают их способность к выживанию и размножению. Многие из этих бактерий часто содержат внехромосомные генетические элементы, включая плазмиды и эписомы, которые могут содержать множество генов. Зачастую подобные гены, кодируемые плазмидами и эписомами,обеспечивают бактерии важные характеристики. Например, один из наиболее широко применяемых биоцидных пестицидов - Кристалл (Cry) - это белок, кодируемый внехромосомным генетическим содержимым подвидов и штаммов Bacillus thuringiensis (Bt). В настоящее время большое количество штаммовBacillus thuringiensis (Bt) и полученных из Bt соединений применяются как микробные пестициды. В состав спор Bt входят кристаллы, которые преимущественно содержат один или более кристаллических и/или цитолитических белков (также известных как -эндотоксины), которые обладают эффективной и специфической инсектицидной активностью против многих вредителей отряда Lepidopteran. Bt-токсины использовались как пестициды для местного применения для защиты сельскохозяйственных культур, а недавно эти белки стали экспрессировать в генетически модифицированных растениях для того, чтобы придать им устойчивость к вредителям Гены, ответственные за выработку данными бактериями инсектицидных белков, кодируются внехромосомной ДНК. В то время как в последние два десятилетие использование микробных токсинов и кодирующих их генов в различных сельскохозяйственных применениях становится все более популярным, процесс распознавания и описания генов микробных токсинов, обладающих многообещающим потенциалом в отношении коммерческого применения, остается трудоемким. Микроорганизмы представляют наиболее многочисленную часть живого мира, и часто считается, что они представляют наибольший единый источник эволюционного и биохимического разнообразия на планете. По факту, общее число микробных клеток на Земле оценивается по меньшей мере в 1030. Прокариоты представляют наибольшую часть среди индивидуальных организмов, которая включает от 106 до 108 отдельных геновидов. Дополнительно сообщалось об огромном генетическом разнообразии бактериальных внехромосомных ДНК. В силу вышесказанного подобные микробные генетические материалы с их огромным биоразнообразием остаются практически нетронутым резервуаром новых генов и соединений с возможностями для коммерческого применения. При этом доступные на данный момент способы отбора коммерчески приемлемых микробных генов не могут эффективно применяться по отношению к данным, плохо изученным ресурсам. Например, те методики, которые в настоящее время применяются для отбора новых кристаллических белков токсинов рода Bacillae, остаются практически неизменными с момента их появления в данной области техники и основаны, главным образом, на занимающих много времени и довольно медленных производственных способах. Традиционные методики идентификации коммерчески приемлемых генов и белков обычно основаны на достижении функций, представляющих интерес. Обычно новые изоляты спорообразующих Bacillae отбираются из среды, после чего подвергаются длительному многоэтапному процессу описания, включающему (1) микроскопический анализ для идентификации штаммов, образующих кристаллические белки, (2) анализ питания и уничтожения нематод и насекомых, (3) анализ вырожденной ПЦР и метод "блуждающей затравки" для восстановления полной длины генетических последовательностей токсинов. Основной недостаток подобного метода заключается не только в его низкой производительности, существенных затратах времени и сил, но и в том, что обнаруженные генетические последовательности могут быть определены лишь после того, как приложены все усилия. В более новых геномических подходах предпринимались попытки секвенировать гены насколько возможно быстро, и идентифицировать их функцию по соответствию с известными генами. Попытки описать геномы микроорганизмов продолжаются с тех пор, как методы молекулярной биологии стали применяться в этих целях. Достижение более высокой продуктивности секвенирования требует технологической революции; по этой причине многочисленные коммерческие компании и научные лаборатории разработали различные способы достижения ультравысокопродуктивного секвенирования. Эти методы часто включают секвенирование и сборку целого генома микроорганизмов, за которыми следует полная аннотация генома, прежде чем новые кодирующие токсины последовательности могут быть потенциально идентифицированы. И все же, так как многие гены токсинов находятся во внехромосомной части микробного генома, остается неясным, насколько эффективным является секвенирование целого генома данного организма с целью идентификации новых генетических элементов, имеющих коммерческую ценность. Было предпринято несколько систематических попыток описания генетического материала,-1 025208 который несет внехромосомная ДНК микроорганизмов, и применения этих описаний в качестве средств для быстрой идентификации микробных генов для коммерческих применений. Один из этих систематических подходов был описан в U.S. Pat. Appln. No. 20100298207, в которой содержание внехромосомной ДНК бактериальных штаммов, которая возможно содержала нужные гены токсинов, было отдельно выделено, секвенировано, собрано и аннотировано прежде чем гены токсинов могли быть идентифицированы. Однако, нужны дополнительные уточнения, так как данный подход требует, чтобы индивидуальные микробные штаммы были выделены и описаны, а внехромосомные нуклеиновые кислоты были выделены из индивидуально культивированных штаммов. Вдобавок, требовался трудоемкий процесс клонирования, когда все библиотеки ДНК были созданы, секвенированы и аннотированы по отдельности и индивидуально для идентификации новых генов токсинов в индивидуально обрабатываемых образцах. В настоящее время метагеномика является одной из наиболее быстро развивающихся областей исследования. Сам термин происходит от такого статистического понятия как мета-анализ (процесс статистического комбинирования отдельных методов анализа) и геномики (всесторонний анализ генетического материала организма). На сегодняшний день традиционная метагеномика часто определяется как применение высокопроизводительного секвенирования к ДНК, полученной непосредственно из природных образцов или группы родственных образцов, путем исключения условия получения чистых культур для секвенирования. В определенной степени традиционная метагеномика является производной геномики микроорганизмов с тем ключевым отличием, что она исключает условие получения чистых культур для секвенирования. Вдобавок, образцы получают из сообществ, а не из выделенных популяций. Хотя метагеномика успешно применялась для идентификации ферментов с необходимой активностью, она основывалась, главным образом, на относительно низкопроизводительном функциональноориентированном скрининге или последовательно-ориентированном скрининге библиотек клонов природных ДНК. Исследование полного генома природных образцов с помощью последовательноориентированной метагеномики было ограничено сложностью видового разнообразия микроорганизмов в большинстве сред и вытекающей отсюда редкостью полноразмерных генов в продуктах метагеномной сборки с малым охватом. Следовательно, необходимы новые способы для того, чтобы обеспечивать быструю и эффективную идентификацию полезных последовательностей нуклеотидов, которые содержатся во внехромосомных ДНК микроорганизмов. В частности, существует потребность идентифицировать большее количество генов микробных токсинов, актуальных в коммерческом плане, и делать это как можно быстрее и эффективнее. В одном из аспектов реализации настоящего изобретения предложен способ интегрированного скрининга в качестве решения данной давно назревшей потребности, для чего предложен способ быстрого и эффективного определения генетического разнообразия генома микроорганизмов и идентификации новых последовательностей, кодирующих токсины и представляющих собой коммерческий интерес, без нужды в трудоемком и относительно низкопроизводительном клонировании или секвенировании полного генома микроорганизмов. Сущность изобретения В раскрытии сущности настоящего изобретения описаны способы быстрой и высокоэффективной идентификации генных последовательностей, кодирующих биотоксины в микроорганизмах. В частности,предложены способы быстрого отбора образцов и скрининга внехромосомного генетического содержимого микроорганизмов для получения новых, представляющих интерес последовательностей. В раскрытии сущности изобретения также описаны выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие новые биотоксины, и композиции, которые содержат подобные молекулы нуклеиновой кислоты. Дополнительно описаны композиции и способы, которые придают пестицидную активность клеткам и организмам, например, микроорганизмам, растениям, клеткам растений, тканям и семенам. Молекулы и последовательности нуклеиновой кислоты согласно настоящему раскрытию сущности изобретения могут применяться, например, для создания ДНК-структур или экспрессионных кассет, подходящих для трансформации и экспрессии в организме-хозяине, включая микроорганизмы и растения. Молекулы нуклеиновой кислоты могут также содержать синтетические последовательности, которые предназначены для оптимальной экспрессии в заданном организме, включая, но не ограничиваясь этим, микроорганизмы и растения. Дополнительно в раскрытие сущности настоящего изобретения включены соответствующие молекулам нуклеиновой кислоты полипептиды, способы получения данных полипептидов и антитела, которые специфически связываются с данными полипептидами. Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу идентификации последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует биотоксин. Этот способ включает (а) создание смешанной популяции молекул внехромосомной ДНК из совокупности микробных изолятов, (б) составление метагеномного набора данных по последовательностям, который включает последовательности нуклеиновой кислоты, полученные из указанной смешанной популяции молекул внехромосомной ДНК, (в) обработку данных из указанного метагеномного набора данных по последовательностям для определения хотя бы одного контига последовательности нуклеиновой кислоты и (г) идентификацию последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует биотоксин путем сравнения упомянутого, по меньшей мере,одного контига последовательности нуклеиновой кислоты из этапа (в) с известными последовательно-2 025208 стями, кодирующими биотоксины. В некоторых реализациях способы согласно данному аспекту настоящего изобретения могут дополнительно включать этап определения таксономической классификации микробных изолятов. В некоторых реализациях совокупность микробных изолятов может быть предварительно отобрана по способности вырабатывать по меньшей мере один биотоксин. В некоторых предпочтительных реализациях способы согласно данному аспекту настоящего изобретения могут дополнительно включать этап определения того, кодирует ли последовательность нуклеиновой кислоты, идентифицированная на этапе (г), новый биотоксин. В одной реализации последовательность нуклеиновой кислоты нового токсина может обладать менее чем 30%-ой идентичностью с любой известнойпоследовательностью биотоксина. В некоторых реализациях последовательность нуклеиновой кислоты нового токсина может обладать менее чем 60%-ой, или менее чем 70%-ой, или менее чем 80%-ой, или менее чем 90%-ой, или менее чем 95%-ой,или менее чем 98%-ой, или менее, чем 99%-ой идентичностью с любой известной последовательностью биотоксина. В отдельных реализациях способов согласно данному аспекту изобретения совокупность микробных изолятов включает по меньшей мере 12 микробных изолятов. В некоторых реализациях совокупность микробных изолятов включает по меньшей мере 24, или по меньшей мере 48, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере 96, или по меньшей мере 200, или по меньшей мере 384, или по меньшей мере 400, или по меньшей мере 500, или по меньшей мере 1500 микробных изолятов. В предпочтительных реализациях данного аспекта изобретения по меньшей мере один из микробных изолятов является бактерией. Бактерии, не ограничиваясь перечисленным, могут принадлежать к следующим видам: Bacillus, Brevibacillus, Clostridia, Paenibacillus, Photorhabdus, Pseudomonas, Serratia, Streptomyces иXenorhabdus. В дополнительных реализациях данного аспекта изобретения метагеномный набор данных по последовательностям может быть составлен путем прямой процедуры секвенирования, которая исключает молекулярное клонирование. Также, согласно другому аспекту настоящего изобретения, описаны выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, идентифицированную с помощью высокопроизводительного способа идентификации генов, который раскрывается в настоящем тексте. В другом дополнительном аспекте настоящего изобретения в раскрытии сущности описаны выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательности нуклеиновой кислоты, которые в жестких условиях гибридизируются с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, комплементарные цепи нуклеотидных последовательностей, которые в жестких условиях гибридизируются с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или их фрагменты; или последовательности нуклеиновой кислоты,которые на 70% или более идентичны любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, комплементарные цепи нуклеотидных последовательностей, которые на 70% или более идентичны любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или их фрагменты; или последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют аминокислотные последовательности, которые на 50% или более идентичны любой из аминокислотных последовательностей, представленных в перечне последовательностей. В раскрытии сущности также предложены структуры нуклеиновой кислоты, которые содержат описанные здесь полинуклеотиды структуры нуклеиновой кислоты содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально связанную с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая соответствует любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая в жестких условиях гибридизируется с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 70% или более идентична любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, который на 50% или более идентичен любой из аминокислотных последовательностей, представленных в перечне последовательностей. В одной предпочтительной реализации гетерологичная нуклеиновая кислота является гетерологичным промотором. В некоторых других предпочтительных реализациях структуры нуклеиновой кислоты согласно данному аспекту настоящего изобретения являются векторными структурами. Подобные векторные структуры применимы для трансформации и экспрессии полинуклеотидов и полипептидов согласно настоящему изобретению в трансгенных клетках и трансгенных организмах, включая, но не ограничиваясь этим, трансгенные растения и трансгенные микроорганизмы. В другом аспекте настоящего изобретения в раскрытии сущности дополнительно предложена клетка-хозяин, включающая в себя структуру нуклеиновой кислоты, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально связанную с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая соответствует любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая в жестких условиях гибридизируется с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в-3 025208 Перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 70% или более идентична любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, который на 50% или более идентичен любой из аминокислотных последовательностей, представленных в перечне последовательностей В некоторых предпочтительных реализациях данного аспекта изобретения подобная клетка-хозяин может являться растительной клеткой или микробной клеткой. В раскрытии сущности изобретения также предложены организмы-хозяева, состоящие из клетокхозяев, которые включают в себя структуру нуклеиновой кислоты, содержащую гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально связанную с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая соответствует любой из нуклеотидных последовательностей,представленных в перечне последовательностей; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая в жестких условиях гибридизируется с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 70% или более идентична любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, который на 50% или более идентичен любой из аминокислотных последовательностей, представленных в перечне последовательностей. В некоторых предпочтительных реализациях данного аспекта изобретения подобный организм-хозяин может быть растением или микроорганизмом. В настоящем раскрытии сущности изобретения также предложены биологические образцы и их потомство, полученные от организмовхозяев, описанных выше. В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается сущность способа для придания организмам пестицидной активности. Данный способ включает введение в организм молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая соответствует любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая в жестких условиях гибридизируется с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, а также ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 70% или более идентична любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, а также ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, который на 50% или более идентичен любой из аминокислотных последовательностей, представленных в перечне последовательностей. В предпочтительной реализации молекула нуклеиновой кислоты транскрибируется и приводит к повышенной стойкости организма к вредителям по сравнению с контрольным организмом. В другом аспекте изобретения в раскрытии сущности дополнительно предложены выделенные полипептиды. Выделенные полипептиды кодируются молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая соответствует любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей; или последовательность нуклеиновой кислоты,которая в жестких условиях гибридизируется с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 70% или более идентична любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, который на 50% или более идентичен любой из аминокислотных последовательностей, представленных в перечне последовательностей. В некоторых предпочтительных реализациях данного аспекта изобретения полипептиды могут обладать пестицидной активностью. В другом аспекте изобретения предложены композиции, содержащие полипептид, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая соответствует любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая в жестких условиях гибридизируется с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в еречне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 70%-ой или более идентична любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в еречне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, который на 50% или более идентичен любой из аминокислотных последовательностей, представленных в еречне последовательностей. Композиции согласно данному аспекту изобретения могут дополнительно обладать одной или более из следующих особенностей. Полипептид может быть выделенным полипептидом. Полипептид может обладать пестицидной активностью. Композиции могут дополнительно содержать носитель Подобный носитель может являться сельскохозяйственно приемлемым носителем Дополнительное вещество или состав могут представлять собой акарицид, бактерицид, фунгицид, инсектицид, микробицид, нематоцид, пестицид или удобрение.-4 025208 Композиции могут готовиться в форме эмульсии, коллоида, пылевидного препарата, гранул, таблеток,порошка, спрея или раствора. Композиции могут готовиться путем центрифугирования, концентрации,высушивания, выделения, фильтрации, гомогенизации или осаждения культуры микробных клеток. В других реализациях композиции могут содержать приблизительно от 1 до 99 весовых процентов описанного здесь полипептида. Также в другом аспекте изобретения предложен способ борьбы с вредителями. Данный способ включает контакт или потребление вредителем пестицидно-эффективного количества полипептида, заявленного и описанного в настоящем изобретении. В другом аспекте изобретения предложен способ получения полипептида, обладающего пестицидной активностью. Данный способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует любой из полипептидов, заявленных и описанных в настоящем изобретении, в условиях, в которых экспрессируется молекула нуклеиновой кислоты. В связи с этим,полипептиды могут кодироваться молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая соответствует любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая в жестких условиях гибридизируется с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 70% или более идентична любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, который на 50% или более идентичен любой из аминокислотных последовательностей, представленных в Перечне последовательностей. Также в раскрытии сущности настоящего изобретения предложены очищенные антитела, которые специфически связываются с любыми описанными здесь полипептидами или их пестицидным фрагментом. Полипептиды могут кодироваться молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая соответствует любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая в жестких условиях гибридизируется с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 70% или более идентична любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в перечне последовательностей, или ее комплементарную цепь или фрагмент обоих; или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, которы й на 50% или более идентичен любой из аминокислотных последовательностей, представленных в перечне последовательностей. Эти и другие предметы и признаки настоящего изобретения станут более очевидными после приведенных ниже подробного описания сущности изобретения и формулы изобретения. Подробное описание сущности изобретения Настоящее изобретение относится к составам и способам, применяемым для модуляции в организмах устойчивости к вредителям, в частности, в растениях или клетках растений. Предложены способы быстрой и эффективной идентификации генных последовательностей, кодирующих новый биотоксин. В частности, описаны способы быстрого отбора образцов и скрининга внехромосомного генетического содержимого микроорганизмов для получения новых, представляющих интерес последовательностей. В раскрытии сущности изобретения также описаны выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие новые биотоксины, и композиции, которые содержат подобные молекулы нуклеиновой кислоты. Дополнительно предложены композиции и способы, которые придают пестицидную активность бактериям, растениям, клеткам растений, тканям и семенам. Дополнительно включены последовательности аминокислот, соответствующие полинуклеотидам, а также предложены антитела, которые специфически связываются с данными последовательностями аминокислот. В частности, молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут применяться, например,при получении экспрессионных векторов для последующей трансформации в представляющие интерес организмы, в качестве зондов для изоляции других генов токсинов и для получения измененных пестицидных белков методами, известными в данной области техники, такими как замещение доменов или перестановки в ДНК. Последовательности нуклеиновой кислоты или последовательности аминокислоты также могут являться синтетическими последовательностями, которые предназначены для оптимальной экспрессии в заданном организме, включая, но не ограничиваясь этим, микроорганизм или растение. Полипептиды согласно изобретению находят применение в контроле или уничтожении популяций вредителей, в частности, популяций чешуекрылых, жесткокрылых и нематод, а также используются при получении композиций, обладающих пестицидной активностью. Дополнительно, микробные клетки и клетки растений, полученные способом, соответствующим сущности настоящего изобретения, могут применяться для получения биомассы, микробных продуктов,растительных продуктов, например, продуктов питания, кормов, биотоплива, косметики, медицинских,нутрицевтических, диетических или фармацевтических продуктов.-5 025208 Если не указано иное, все термины данной области техники, условные обозначения и другие научные термины либо терминология, используемые здесь, имеют те же значения, которые обычно подразумеваются специалистами в данной области техники, к которым настоящее изобретение имеет отношение. В некоторых случаях терминам, которые имеют общепринятые значения, здесь дается определение для ясности и/или в качестве справочного материала, а включение подобных определений не должно обязательно толковаться как указание на существенную разницу с тем, что является общепринятым в данной области техники. Многие технологии и процедуры, которые описаны в тексте или на которые даны ссылки, для специалистов в данной области техники являются хорошо известными и обычно применяются с использованием стандартной методологии. Форма единственного числа включает множественное число, если иное четко не предусмотрено контекстом. Например, термин "клетка" включает одну или более клеток, включая их комбинации. Аминокислота: употребляемый здесь термин "аминокислота" обозначает аминокислоты природного происхождения и синтетические аминокислоты, а также аминокислотные аналоги и аминокислотные миметики, которые функционируют аналогично аминокислотам природного происхождения. Аминокислотами природного происхождения являются те, которые кодируются генетическим кодом, включая D/L оптические изомеры, а также те аминокислоты, которые модифицированы позже, например, гидроксипролин, у-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аминокислотными аналогами называются вещества, которые обладают такой же базисной химической структурой, что и аминокислоты природного происхождения, то есть, состоят из связанного с водородом углерода, карбоксильной группы, аминогруппы и радикала, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метилметионинсульфоний. Подобные аналоги содержат модифицированные радикалы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные скелеты, но сохраняют такую же базисную химическую структуру, что и аминокислоты природного происхождения. Аминокислотными миметиками называются химические вещества, которые имеют структуру, отличную от общей химической структуры аминокислот, но функционируют аналогично аминокислотам природного происхождения. Употребляемые здесь взаимозаменяемые термины "биотоксин" или "токсин" обычно обозначают полипептид, обладающий токсическим действием на одного или более вредителей включая, но не ограничиваясь этим, таких насекомых-вредителей как, например, представители отрядов чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых, а также представители круглых червей типа нематод; либо функциональный гомолог данного полипептида. Термин "биотоксин" применяется иногда, чтобы подчеркнуть его биологическое происхождение. В некоторых случаях белки биотоксинов являются выделенными из видов Bacillus. В других реализациях токсины могут быть выделенными из других видов микроорганизмов, включая Clostridium и Paenibacillus. Белки токсинов содержат аминокислотные последовательности, определенные из раскрытых здесь полноразмерных последовательностей нуклеотидов, и аминокислотные последовательности, которые короче полноразмерных последовательностей по причине использования альтернативного нижнего сайта инициации, или по причине процессинга, при котором образуются более короткие белки, обладающие пестицидной активностью. Процессинг может проходить в том организме,в котором экспрессируется белок, или в организме вредителя после попадания в него белка."Состав" обычно обозначает комбинацию активного агента и другого вещества, носителя или состава, инертного (например, детектируемого агента, или маркера, или жидкого носителя) или активного,такого как пестицид. Термины "борьба" либо "борьба с вредителями" или их грамматические эквиваленты при употреблении здесь в отношении обработки пестицидом, должны пониматься как включающие любую пестицидную активность или пестистатическую (подавление, защита, отпугивание, предотвращение и в общем смысле препятствование функционированию вредителей с целью предотвратить нанесение урона растению-хозяину) активность пестицидного состава против данного вредителя с целью повлиять на перемены в питании, росте и/или поведении вредителя на любой стадии развития, включая, без ограничений,уничтожение насекомого, замедление роста, ограничение репродуктивной способности и тому подобное. Таким образом, термины "борьба" либо "борьба с вредителями" или их грамматические эквиваленты,означают не только уничтожение, но также включают такие действия как защита, предотвращение, отпугивание, уничтожение или подавление развития яиц или вылупления, подавление созревания или развития и стерилизацию личинок или имаго вредителей. Контрольный организм: при употреблении в настоящем изобретении "контрольный организм" определяет точку отсчета для оценки измерений в фенотипе испытуемого организма или клетки, и может являться любым подходящим организмом или клеткой. Контрольный организм или клетка могут содержать, например, (а) организм или клетку дикого типа, то есть, того же генотипа, что и стартовый материал для генетического изменения, которое дает в результате испытуемый организм или клетку; (б) организм или клетку того же генотипа, что и стартовый материал, но которые были трансформированы с нулевой конструкцией (то есть, конструкцией, которая не оказывает известного действия на представляющее интерес свойство, такой как конструкция, содержащая ген-репортр); (в) организм или клетку, которые являются нетрансформированными сегрегантами из потомства испытуемого организма или клетки;(г) организм или клетку, которые являются генетически идентичными испытуемому организму или клет-6 025208 ке, но которые не подвергались аналогичной обработке (то есть, обработке пестицидом); (д) сам испытуемый организм или клетку при условии, что представляющий интерес ген не экспрессируется; или (е) сам испытуемый организм или клетку при условии, что они не были подвержены определенной обработке, например, пестицидом или комбинацией пестицидов и/или других химикатов. В отдельных случаях термин "контрольный организм" обозначает организм или клетку, которые используют для сравнения с трансгенным или генетически модифицированным организмом с целью идентификации модулированного фенотипа трансгенного или генетически модифицированного организма. В некоторых случаях "контрольный организм" может обозначать организм, не содержащий экзогенную нуклеиновую кислоту, которая присутствует в представляющем интерес трансгенном организме, но во всем остальном имеет то же генетическое окружение, что и трансгенный организм. В некоторых других случаях используемый здесь подходящий контрольный организм или клетка может иметь генотип, отличный от такового у испытуемого организма или клетки, но при этом может обладать пестицидно-чувствительными характеристиками стартового материала для генетического изменения (изменений), которое дает в результате испытуемый организм или клетку. Например, употребляемый согласно целям раскрытия сущности настоящего изобретения термин "контрольное растение" относится к растительным клеткам, семенам, растительным компонентам, растительным тканям, растительным органам или целому растению, которые используются для сравнения с трансгенным или генетически модифицированным растением с целью идентификации модулированного фенотипа трансгенного или генетически модифицированного растения. В некоторых случаях "контрольное растение" может обозначать растение, не содержащее экзогенную нуклеиновую кислоту, которая присутствует в представляющем интерес трансгенном растении, но во всем остальном имеет то же генетическое окружение, что и трансгенное растение. Подходящее контрольное растение может являться генетически неизмененным или нетрансгенным растением из родительской линии, которая используется для получения испытуемого трансгенного растения. Подходящее контрольное растение может в некоторых случаях являться нетрансгенным сегрегантом трансформационного эксперимента или трансгенным растением, которое содержит экзогенную нуклеиновую кислоту,отличную от представляющей интерес экзогенной нуклеиновой кислоты. Культивирование: употребляемый здесь термин "культивирование" обозначает выращивание клетки либо организма на или в различного типа средах, таких как, например, жидкость, полутвердая или твердая среда, в подходящих условиях, при которых в клетке или организме могут происходить некоторые, если не все, биологические процессы. Например, культивируемая клетка может быть растущей или репродуцирующей и способной осуществлять биологические и/или биохимические процессы, которые включают, не ограничиваясь этим, репликацию, транскрипцию, трансляцию. Домен: "доменами" являются группы, главным образом, сопряженных друг с другом аминокислот в полипептиде, которые могут использоваться для характеристики белковых семейств и/или белковых частей. У подобных доменов имеются свои "отпечатки пальцев" или "подпись", которые могут содержать консервативную первичную последовательность, вторичную структуру и/или трехмерную конформацию. В общем случае домены связаны с in vitro и/или in vivo активностями. Длина домена может составлять от 4 аминокислот до 400 аминокислот, например, от 4 до 50 аминокислот, или от 4 до 20 аминокислот, или от 4 до 10 аминокислот, или от 4 до 8 аминокислот, от 25 до 100 аминокислот, или от 35 до 65 аминокислот, или от 35 до 55 аминокислот, или от 45 до 60 аминокислот, или от 200 до 300 аминокислот, или от 300 до 400 аминокислот. Как детально раскрывается в другом месте данного текста, консервативные области и консервативные домены, которые свидетельствуют о биотоксической активности, подробно описаны в научной литературе и патентах. Эффективное количество: употребляемое здесь выражение "эффективное количество" - это количество, достаточное для достижения практического или желаемого результата. Эффективное количество можно применять в одно или более применений. В терминах управления борьбой с вредителями и/или развитием болезней, подавления или защиты эффективное количество - это количество, достаточное для того, чтобы подавить, стабилизировать, обратить, замедлить или отложить прогрессию инфекции, вызванной данным вредителем, или болезненного состояния. В связи с этим, выражение "пестицидноэффективное количество" употребляется здесь в отношении обработки таким количеством пестицида,которое необходимо для того, чтобы достичь снижения уровня развития вредителя и/или уровня инфекции, вызванной вредителем, по сравнению с тем, что наблюдается в необработанном контрольном организме. Для каждого пестицидного вещества или организма пестицидно-эффективное количество может быть эмпирически определено для каждого типа вредителей, действующих в определенной окружающей среде. Как правило, обработка эффективным количеством данного пестицида при подходящих условиях обработки обеспечивает уменьшение по меньшей мере на 20%; или чаще от 30 до 40%; чаще между 50-60%; еще чаще от 70 до 80% и еще чаще от 90 до 95% по отношению к уровню инфекции, вызванной вредителем, и/или уровню развития вредителя, которые наблюдаются у необработанного контрольного организма. Как упомянуто выше, пестицидно-эффективное количество можно применять в одно или более применений. Экзогенный: термин "экзогенный" при применении по отношению к нуклеиновой кислоте означает,что нуклеиновая кислота является частью рекомбинантной структуры нуклеиновой кислоты и не нахо-7 025208 дится в своей естественной среде. Например, экзогенная нуклеиновая кислота может быть последовательностью, принадлежащей одному виду, и внесенной в другой вид, то есть, являться гетерологичной нуклеиновой кислотой. Как правило, такая экзогенная нуклеиновая кислота вносится в организмы других видов через рекомбинантную структуру нуклеиновой кислоты. Экзогенная нуклеиновая кислота также может являться собственной последовательностью организма, которая была повторно внесена в клетки данного организма. Экзогенную нуклеиновую кислоту, которая содержит собственную последовательность, часто можно отличить от последовательностей природного происхождения по наличию последовательностей неприродного происхождения, связанных с данной экзогенной нуклеиновой кислотой, например, регуляторные последовательности неприродного происхождения, фланкирующие последовательность природного происхождения в рекомбинантной структуре нуклеиновой кислоты. Вдобавок, стабильно трансформированные экзогенные нуклеиновые кислоты могут быть интегрированы на позиции, отличные от той позиции, где находится последовательность природного происхождения. Следует принимать во внимание, что экзогенная нуклеиновая кислота могла быть внесена в клеткупредшественник, а не в рассматриваемую клетку. Например, трансгенное растение, содержащее экзогенную нуклеиновую кислоту, может являться потомством от скрещивания между стабильно трансформированным растением и нетрансгенным растением. Считается, что такое потомство содержит экзогенную нуклеиновую кислоту. Экспрессия: употребляемый здесь термин "экспрессия" обозначает процесс преобразования генетической информации полинуклеотида в РНК путем транскрипции, которая обычно катализируется ферментом, РНК-полимеразой, и далее в белок путем трансляции мРНК на рибосомах. Функциональный гомолог: употребляемый здесь термин "функциональный гомолог" описывает такие белки, которые обладают по меньшей мере одной общей характеристикой. Такие характеристики включают сходство последовательностей, биохимическую активность, сходство транскрипционной схемы и фенотипическую активность. Как правило, функциональный гомолог является полипептидом, обладающим сходством по последовательностям, с контрольным полипептидом, и выполняющим одну или более биохимическую или физиологическую функцию(-ии) контрольного полипептида. Функциональные гомологи, как правило, обуславливают подобный, но не обязательно такой же самый уровень аналогичных характеристик. Как правило, белки функциональных гомологов обеспечивают аналогичные характеристики там, где количественное определение одного из гомологов составляет по меньшей мере 20% от другого; чаще от 30 до 40%; чаще между 50-60%; еще чаще от 70 до 80%; и еще чаще от 90 до 95%; и еще чаще от 98 до 100% от другого. Функциональный гомолог и контрольный полипептид могут являться полипептидами природного происхождения, а сходство последовательностей может быть вызвано сходящимися или расходящимися эволюционными событиями. В связи с этим в литературе функциональные гомологи иногда называют гомологами, ортологами или паралогами. Вариации функциональных гомологов природного происхождения, такие как полипептиды, кодируемые мутантами или кодирующими последовательностями дикого типа, могут сами быть функциональными гомологами. Используемые здесь функциональные гомологи также могут быть получены путем сайтнаправленного мутагенеза кодирующей последовательности для полипептида биотоксина, или путем комбинации доменов кодирующих последовательностей различных полипептидов биотоксина природного происхождения. Термин "функциональный гомолог" иногда применяется к нуклеиновой кислоте, которая кодирует функционально гомологичный полипептид. Функциональные гомологи могут быть идентифицированы путем анализа результатов выравнивания нуклеотидной и полипептидной последовательности. Например, сделав запрос по базе данных последовательностей нуклеотидов или полипептидов можно идентифицировать гомологи полипептидов биотоксинов. Анализ последовательности может включать применение BLAST, Reciprocal BLAST илиPSI-BLAST анализа недублируемых баз данных с использованием в качестве контрольной последовательности аминокислотной последовательности полипептида синтетазы ацетогидроксикислот. В отдельных случаях аминокислотная последовательность определяется по нуклеотидной последовательности. Как правило, те полипептиды из базы данных, которые обладают более чем 40%-ой идентичностью последовательностей рассматриваются как варианты для дальнейшей оценки соответствия полипептиду биотоксина. Сходство аминокислотной последовательности делает возможной замену в консервативной аминокислоте, такую как замена одного гидрофобного остатка на другой или замена одного полярного остатка на другой. При желании можно вручную провести проверку таких вариантов с целью уменьшить их число для дальнейшей оценки. Ручная проверка может производиться путем отбора тех вариантов,которые содержат домены, присутствующие у полипептидов биотоксина, например, консервативные функциональные домены. Консервативные области могут быть идентифицированы по расположению участка в середине первичной аминокислотной последовательности полипептида биотоксина, которая является повторяющейся последовательностью, образует некоторую вторичную структуру (например, спирали и складчатые бета-слои), создает положительно или отрицательно заряженные домены или представляет собой белковый мотив домена. Смотрите, к примеру, страницу Pfam в сети Интернет по адресу sanger.ac.uk/Software/Pfam/and pfam.janelia.org/, где описаны консенсусные последовательности ряда белко-8 025208 вых мотивов и доменов. Описание информации, которая включена в базу данных Pfam, приводится, например, в Sonnhammer et al. (Nucl. Acids Res., 26:320-322, 1998), Sonnhammer et al. (Proteins, 28:405-420,1997); и Bateman et al. (Nucl. Acids Res., 27:260-262, 1999). Также консервативные области могут быть определены по выравниванию последовательностей одних и тех же либо родственных полипептидов,полученных от близкородственных видов. Предпочтительно, чтобы близкородственные виды принадлежали одному семейству. В некоторых реализациях, приемлемым является выравнивание последовательностей двух различных видов. Как детально раскрывается в другом месте данного текста, консервативные области и консервативные функциональные домены, которые свидетельствуют о биотоксической активности, подробно описаны в научной литературе и патентах. Как правило, полипептиды, обладающие по меньшей мере 40%-ой идентичностью в аминокислотных последовательностях, подходят для идентификации консервативных областей. Консервативные области родственных полипептидов обладают по меньшей мере 45%-ой идентичностью в аминокислотных последовательностях (например, по меньшей мере 50%-ой, по меньшей мере 60%-ой, по меньшей мере 70%-ой, по меньшей мере 80%-ой или, по меньшей мере 90%-ой идентичностью аминокислотных последовательностей). В некоторых реализациях консервативная область обладает, по меньшей мере 92, 94,96, 98 или 99%-ой идентичностью аминокислотных последовательностей. Гетерологичные последовательности: употребляемый здесь термин "гетерологичные последовательности" включает гетерологичные полипептиды и гетерологичные нуклеиновые кислоты и обозначает такие последовательности, которые в природе не являются функционально связанными или прилегающими друг к другу. Например, промотор пшеницы считается гетерологичным последовательности из кодирующей области Bacillus thuringiensis. Также промотор, принадлежащий гену, который кодирует фактор роста пшеницы, считается гетерологичным последовательности, кодирующей рецептор фактора роста пшеницы. Последовательности регуляторных элементов, такие как последовательности нетранслируемых областей или 3'-концевой терминации, которые в природе не принадлежат одному гену как кодирующая последовательность, считаются гетерологичными данной кодирующей последовательности. Элементы, которые в природе являются функционально связанными или сопряженными друг с другом,не считаются гетерологичными друг к другу. С другой стороны, те же самые элементы останутся функционально связанными, но при этом станут гетерологичными друг к другу, если между ними поместить другую промежуточную последовательность. Таким образом, промотер и кодирующие последовательности гена пшеницы, который экспрессирует аминокислотный транспортер, не являются гетерологичными друг к другу, но промотер и кодирующая последовательность гена пшеницы, функционально связанные новым способом, будут гетерологичными. Употребляемый здесь термин "гибридизация" в общем случае обозначает способность молекул нуклеиновой кислоты объединяться путем спаривания комплементарных цепей оснований. Описанные в настоящем изобретении молекулы нуклеиновой кислоты или их фрагменты при определенных условиях способны к специфической гибридизации с другими молекулами нуклеиновой кислоты. В данном контексте считается, что две молекулы нуклеиновой кислоты будут способны к специфической гибридизации друг с другом, если эти две молекулы способны образовывать антипараллельные двухцепочечные структуры нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты считается "комплементарной" другой молекуле нуклеиновой кислоты, если они проявляют полную комплементарность. В данном контексте считается, что молекулы проявляют полную "комплементарность", когда каждый нуклеотид одной из молекул является комплементарным соответствующему нуклеотиду другой. Две молекулы считаются"минимально комплементарными", если они могут гибридизироваться друг с другом со стабильностью,достаточной для того, чтобы позволить им оставаться ренатурированными по отношению друг к другу в стандартных "умеренно жестких" условиях. Аналогично, молекулы считаются "комплементарными",если они могут гибридизироваться друг с другом со стабильностью, достаточной для того, чтобы позволить им оставаться ренатурированными по отношению друг к другу в стандартных "жестких" условиях. Стандартные условия строгости описаны у Sambrook et al., в: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ndEdition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), и Haymes et al. In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985). Отклонения от полной комплементарности являются допустимыми до тех пор, пока данные отклонения полностью не исключают возможность образования молекулами двухцепочечных структур. Таким образом, для того, чтобы описанные в настоящем изобретении молекулы нуклеиновой кислоты или их фрагменты могли служить праймерами или зондами, они должны быть в достаточной степени комплементарными в отношении последовательностей, чтобы образовывать стабильные двухцепочечные структуры при определенных рабочих концентрациях растворителей и солей. Приемлемые условия жесткости, которые стимулируют гибридизацию ДНК, включают, например,применение буфера 6.0 хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) приблизительно при 45 С, за которым следует отмывка 2.0SSC приблизительно при 50 С. Дополнительно, температуру на этапе отмывки можно повышать от умеренно жестких условий, соответствующих комнатной температуре около 22 С,до жестких условий при температуре около 65 С. Как температура, так и концентрация соли могут варь-9 025208 ироваться, либо температура или концентрация соли могут оставаться неизменными в то время, как изменяется другая переменная. Информацию по данной теме можно найти в Current Protocols in MolecularBiology, John WileySons, N.Y. (1989), 6.3.1- 6.3.6. Например, умеренно жесткие условия можно применять для отбора последовательностей нуклеиновой кислоты с более низкой идентичностью с последовательностью заданной нуклеиновой кислоты. Можно применять такие условия, при которых используется приблизительно от 0.15 М до 0.9 М хлорида натрия в интервале температур приблизительно от 20 С до 55 С. Жесткие условия можно применять для отбора последовательностей нуклеиновой кислоты с более высокой степенью идентичности с раскрытыми последовательностями нуклеиновой кислоты (Sambrooket al., 1989, выше). В большинстве случаев жесткие условия включают гибридизацию нуклеиновых кислот в 2SSC-10SSC буфере (полученном при разведении в дистиллированной воде исходного 20SSC раствора, который содержит 3 М хлорида натрия и 0.3 М цитрата натрия, с рН 7.0), 2.5-5 растворе Денхардта (полученном при разведении в дистиллированной воде исходного 50 раствора, который содержит 1% (м/о) бычьего сывороточного альбумина, 1% (м/о) фиколла и 1% (м/о) поливинилпирролидона),10-100 мг/мЛ ДНК из рыбьей спермы и 0.02-0.1% (м/о) ДСН, с инкубацией приблизительно при температурах от 50 до 70 С на протяжении от нескольких часов до целой ночи. За гибридизацией, как правило,следуют несколько этапов отмывки. На этапах отмывки обычно проводят постепенное увеличение жесткости и применяют 0.5SSC - 10SSC буфер и 0.01-0.5% (м/о) ДСН с 15-минутной инкубацией при температурах от 20 до 70 С. Предпочтительно, чтобы сегменты нуклеиновой кислоты оставались гибридизированными после, по меньшей мере, одноразовой отмывки в 0.1SSC буфере при 65 С. В предпочтительной реализации жесткие условия предусматривают прегибридизацию и гибридизацию при 65 С в 5SSC буфере, 5 растворе Денхардта, 100 мг/мЛ расщепленной и денатурированной ДНК из спермы лосося и 1% (м/о) ДСН на протяжении по меньшей мере трех часов, и двухразовую отмывку 2SSC, 0.2% ДСН при 65 С. Согласно некоторым реализациям настоящей заявки, описанные в настоящем изобретении молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется в умеренно жестких или жестких условиях с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты, представленных в перечне последовательностей, либо любые ее комплементарные цепи или фрагменты. Выделенная молекула и в значительной степени очищенная молекула: "выделенная" или "очищенная" молекула нуклеиновой кислоты или белка, либо ее биологически активная часть являются в значительной степени свободными от другого клеточного материала или культуральной среды при получении путем рекомбинантной технологии, или в значительной степени свободными от исходных химических веществ либо других химикатов при химическом синтезе. Употребляемый здесь термин "в значительной степени очищенная" относится к молекуле, практически полностью отделенной от всех других молекул,которые обычно связаны с ней в нормальном состоянии. Предпочтительно, чтобы в значительной степени очищенная молекула принадлежала к преобладающему виду, который присутствует в препарате, который является результатом, часто непрямым, манипуляций экспериментатора с полинуклеотидами или полипептидами. В значительной степени очищенная молекула может быть на 60% свободной, предпочтительно - на 75% свободной, более предпочтительно - на 90% свободной, и наиболее предпочтительно на 95% свободной от других молекул (эксклюзивных или принадлежащих растворителю), которые присутствуют в природной смеси. Термин "в значительной степени очищенная" не включает в себя молекулы, которые находятся в своем природном состоянии. Для нуклеиновых кислот предпочтительно, чтобы"выделенная" нуклеиновая кислота была свободной от последовательностей, которые в естественном состоянии фланкируют нуклеиновую кислоту (то есть, последовательностей, расположенных у 5'- и 3'концов нуклеиновой кислоты) в клетке того организма, из которого получена нуклеиновая кислота. Таким образом, употребляемая здесь фраза "выделенная нуклеиновая кислота" обозначает нуклеиновую кислоту природного происхождения при условии, что одна или обе последовательности, которые непосредственно фланкируют данную нуклеиновую кислоту в естественном геноме, устранены либо отсутствуют. Таким образом, выделенная нуклеиновая кислота включает без ограничений нуклеиновую кислоту, которая существует в виде очищенной молекулы, или молекулу нуклеиновой кислоты, которая включена в состав вектора или рекомбинантного организма. Нуклеиновая кислота, которая находится среди сотен и миллионов других нуклеиновых кислот и входит в состав, например, библиотек кДНК, библиотек геномов или слоев геля, содержащего фрагменты рестрикции геномной ДНК, не считается выделенной нуклеиновой кислотой. В рамках настоящего изобретения термин "выделенная" при употреблении для обозначения молекул нуклеиновой кислоты исключает также выделенные хромосомы. Например, в различных реализациях выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая токсин, может содержать менее чем 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0.5 т.п.н., 0.1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые в естественных условиях фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в той клетке,из которой получена нуклеиновая кислота. Белок токсина, который в значительной степени является свободным от клеточного материала включает белковые препараты, содержащие менее 30, 20, 10 или 5%(сухого веса) белка, не принадлежащего токсину (как правило, называемого здесь "примесным белком").- 10025208 Употребляемые здесь взаимозаменяемые термины "микробный изолят" или "выделенный микробный штамм" относятся к определенным видам, родам, семействам, отрядам или классам микроорганизмов, полученным из образцов, которые содержат более одного микроорганизма, или из смешанных популяций микроорганизмов. Употребляемый здесь термин "выделенный" по отношению к микроорганизму (например, к бактерии или микрогрибу) обозначает микроорганизм, который был удален из и/или очищен от той среды, в которой он существует в естественном состоянии. В связи с этим, в данном контексте "выделенный микробный штамм" - это штамм, который был удален из и/или очищен от своей естественной среды. Таким образом, к "выделенным" микроорганизмам не относятся те, которые находятся в среде своего естественного обитания. Вдобавок, термин "выделенный" не обязательно отображает степень очистки микроба. "В значительной степени чистая культура" микробного штамма обозначает культуру, которая практически не содержит других микробов, кроме требуемого штамма или штаммов микробов. Другими словами, в значительной степени чистая культура микробного штамма практически свободна от других примесей, которые могут включать как микробные примеси, так и нежелательные химические примеси. Дополнительно, используемое здесь выражение "биологически чистый" штамм обозначает штамм, очищенный от веществ, с которыми он обычно ассоциируется в природе. Нужно отметить,что штамм, ассоциированный с другими штаммами или с соединениями либо веществами, которые обычно не сопутствуют ему в природе, так же определяется как "биологически чистый". Монокультура определенного штамма является, конечно, "биологически чистой". Используемый здесь термин "обогащенная культура" выделенного микробного штамма обозначает микробную культуру, которая содержит более чем 50, 60, 70, 80, 90 или 95% выделенного штамма. Метагеномный набор данных по последовательностям в данном контексте обозначает набор последовательностей нуклеиновой кислоты, образцы которых отбирались случайным способом, и, таким образом, получены из совокупности выделенных микроорганизмов. Термин метагеномика происходит от такого статистического понятия как мета-анализ (процесс статистического комбинирования отдельных методов анализа) и геномики (всесторонний анализ генетического материала организма). Нуклеиновая кислота и полинуклеотид: Термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" могут взаимозаменяемо употребляться в данном контексте и обозначают как РНК, так и ДНК, включая кДНК,геномную ДНК, синтетическую ДНК и ДНК или РНК, содержащие аналоги нуклеиновой кислоты. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру. Нуклеиновая кислота может являться двухцепочечной или одноцепочечной (то есть, кодирующая нить и антикодирующая нить). Примеры полинуклеотидов, не имеющие ограничительного характера, включают гены, фрагменты генов, экзоны, интроны,информационную РНК (иРНК), транспортную РНК, рибосомальную РНК, миРНК, микро-РНК, рибозимы, кДНК, гибриды ДНК/РНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, зонды нуклеиновой кислоты и праймеры нуклеиновой кислоты. Полинуклеотид может содержать нестандартные или модифицированные нуклеотиды. Функционально связанный: употребляемые здесь выражения "функционально связанный" или"функционально соединенный" означают наличие функциональной связи между двумя или более последовательностями. Например, функциональная связь между представляющим интерес полинуклеотидом и регуляторной последовательностью (то есть, промотором) - это такая функциональная связь, которая делает возможной экспрессию представляющего интерес полинуклеотида. Функционально связанные элементы могут быть сопряженными или несопряженными. В этом смысле термин "функционально связанный" обозначает такое расположение регуляторной области и транскрибируемой кодирующей последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты, при котором регуляторная область является эффективной в регулировании транскрипции или трансляции представляющей интерес кодирующей последовательности. Например, для того, чтобы функционально связать кодирующую последовательность и регуляторную область, сайт инициации трансляции трансляционной рамки считывания кодирующей последовательности, как правило, располагается между одним и приблизительно пятидесятью нуклеотидами,находящимися ниже регуляторной области. Тем не менее, регуляторная область может располагаться приблизительно на 5,000 нуклеотидов выше сайта инициации трансляции или приблизительно на 2,000 нуклеотидов выше сайта инициации транскрипции. При употреблении в отношении соединения двух кодирующих белки областей выражение "функционально связанный" предполагает то, что кодирующие области принадлежат одной и той же трансляционной рамке считывания. При употреблении в отношении энхансера выражение "функционально связанный" предполагает то, что энхансер усиливает экспрессию определенного представляющего интерес полипептида или полинуклеотидов. Там, где представляющий интерес полинуклеотид или полинуклеотиды кодируют полипептид, кодируемый полипептид продуцируется на повышенном уровне. Процент идентичности последовательностей: при использовании здесь выражения "процент идентичности последовательностей" по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, означает процентное содержание идентичных оснований нуклеиновой кислоты или аминокислотных остатков в линейной последовательности контрольной ("запросной") молекулы по сравнению с тестируемой ("испытуемой") молекулой, когда обе последовательности являются оптимально выровненными. "Процент идентичности последовательностей" определяется путем сравне- 11025208 ния двух оптимально локально выровненных последовательностей через окно сравнения, которое задается длиной локального выравнивания между двумя последовательностями. Аминокислотная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты в окне сравнения могут содержать присоединения либо делеции (например, гэпы или выступы) по сравнению с контрольной последовательностью (которая не содержит присоединений либо делеций) с целью оптимального выравнивания двух последовательностей. Локальное выравнивание между двумя последовательностями включает лишь сегменты каждой из последовательностей, которые считаются в значительной мере идентичными согласно критерию, который в свою очередь зависит от выбранного алгоритма проведения выравнивания (например,BLAST). Процент идентичности последовательностей рассчитывается определением количества позиций, которые занимают идентичное основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток в обоих последовательностях, для получения количества сопряженных позиций, делением количества сопряженных позиций на полное количество позиций в окне сравнения и умножением результата на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено с помощью алгоритма локальной гомологии, разработанного Смитом и Уотерманом (Add. APL. Math. 2:482, 1981), алгоритма глобальной гомологии, разработанного Нидлеманом и Вуншем (J Mol. Biol. 48:443, 1970), метода поиска сходства Пирсона и Липмана (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), эвристических реализаций этих алгоритмов (программное обеспечение NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM, BLASTZ) или визуального изучения. Применительно к данному изобретению "процент идентичности" также может быть определен с помощью программного обеспечения BLASTX версии 2.0 для транслируемых последовательностей нуклеотидов и программного обеспечения BLASTN версии 2.0 для последовательностей полинуклеотидов. В случае если две последовательности были идентифицированы для сравнения, для определения их оптимального выравнивания предпочтительно применять программное обеспечениеGAP и BESTFIT. Как правило, по умолчанию используют значения 5.00 для штрафа за открытие гэпа и 0.30 для штрафа за продолжение гэпа. Термин "значительная идентичность последовательностей" между последовательностями полинуклеотида или полипептида означает полинуклеотид или полипептид, содержащий последовательность, которая обладает, по меньшей мере, 50%-ой идентичностью последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 70%-ой, предпочтительно по меньшей мере 80%-ой, более предпочтительно по меньшей мере 85%-ой, более предпочтительно по меньшей мере 90%-ой, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%-ой и наиболее предпочтительно по меньшей мере 96%, 97,98 или 99%-ой идентичностью последовательности по сравнению с контрольной последовательностью,применяемой в программах. Дополнительно, в данном контексте выражения парная гомология последовательностей или идентичность последовательностей относятся к процентному содержанию остатков,которые являются совпадающими для двух выровненных последовательностей. Семейства аминокислотных остатков, имеющих совпадающие боковые цепи, детально описаны в данной области техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин,фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин,изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Запросные последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислот можно искать по сравнению с испытуемыми последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислот, которые находятся в открытых или собственных базах данных. Подобный поиск может быть выполнен с помощью разработанной в Национальном центре биотехнологической информации программы поиска основного локального выравнивания (NCBI BLAST версия 2.18). Программа NCBI BLAST доступна в сети Интернет на странице Национального центра биотехнологической информации (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Как правило, при работе с NCBI BLAST могут быть использованы следующие параметры: Filter options устанавливаются "по умолчанию", в Comparison Matrix устанавливается "BLOSUM62", в Gap Costs устанавливается "Existence: 11, Extension: 1", в Word Size устанавливается 3, в Expect (E threshold) устанавливается 1e-3, а минимальная длина локального выравнивания устанавливается в размере 50% от длины запросной последовательности. Идентичность и сходство последовательностей также могут быть определены с помощью программного обеспечения GenomeQuest software (Gene-IT, Вустер, Массачусетс, США). Вредитель: употребляемый здесь термин "вредитель" или его грамматические эквиваленты относится к нежелательным организмам, которые могут включать, но не ограничиваются этим, бактерии,грибы, растения (водоросли), нематод, насекомых и других патогенных животных, которые негативно влияют на растения и животных путем их заселения, поражения, заражения или инфицирования. В связи с этим, употребляемый здесь термин "пестицидный" означает возможность вещества или состава снижать скорость роста вредителя, то есть, нежелательного организма, или повышать смертность вредителя. Скорость роста вредителя может быть оценена путем применения любого из множества известных в данной области техники методов, например, путем оценки количества жизнеспособных вредителей в течение продолжительного периода.- 12025208 Употребляемые здесь термины "акарицидный", "афицидный", "бактерицидный", "инсектицидный","микробицидный" или "нематоцидный", или их грамматические эквиваленты относятся к веществам и составам, обладающим пестицидной активностью против организмов, соответствующих таксономической классификации исходного термина, а также относятся к веществам, обладающим пестицидной активностью против организмов, соответствующих разговорным вариантам исходного термина, в случаях,когда разговорные варианты могут не строго соответствовать таксономическим классификациям. Например, термин "инсектицидный" относится к веществам, обладающим пестицидной активностью против организмов, в общем случае известных как насекомые, тип Членистоногие, класс Насекомые. Далее по тексту данный термин также относится к веществам, обладающим пестицидной активностью против организмов, которые в разговорном варианте называются "насекомыми" или "жуками" и принадлежат типу Членистоногих, хотя эти организмы могут быть классифицированы как принадлежащие таксономическому классу, отличному от класса Насекомых. В соответствии с таким пониманием, термин "инсектицидный" может применяться по отношению к веществам, обладающим активностью против арахнид(класс Паукообразные), в частности, клещей (подкласс Клещи), принимая во внимание разговорный вариант термина "насекомые". Термин "акарицидный" относится к веществам, обладающим пестицидной активностью против клещей (Клещи), тип Членистоногие, класс Паукообразные, подкласс Клещи. Термин "афицидный" относится к веществам, обладающим пестицидной активностью против тлей (Настоящие тли), тип Членистоногие, класс Насекомые, семейство Настоящие тли. Понятно, что все эти термины включены в термин "пестицидный" или "пестицид" или их грамматические эквиваленты. Также понятно, что эти термины не обязательно являются взаимоисключающими, то есть, вещества, известные как "инсектициды" могут обладать пестицидной активностью против организмов любого семейства класса Насекомых, включая тлей и организмы, которые в разговорном варианте называются "насекомыми" или "жуками" и включают паукообразных и клещей. Понятно, что "инсектициды" могут также называться акарицидами, если они обладают пестицидной активностью против клещей, или афицидами, если они обладают пестицидной активностью против тлей. Промотор: в данном контексте "промотор" - это нуклеотидная последовательность, способная инициировать транскрипцию в клетке, такой как клетка растения или микробная клетка, и может запускать или способствовать транскрипции описанных в настоящем изобретении последовательностей нуклеотидов или их фрагментов. Подобные промоторы не обязательно должны быть микробного или растительного происхождения. Например, промоторы, полученные из растительных вирусов, такие как промоторCaMV35S (промотор вируса мозаики цветной капусты), или из Agrobacterium tumefaciens, такие как промоторы Т-ДНК, могут применяться в целях настоящего изобретения. Другим неограничивающим примером является tac-промотор (смотрите, например., U.S. Pat. No. 5,840,554), который может быть особенно удобным для экспрессии молекул и последовательностей согласно настоящему изобретению в микробных клетках-хозяевах, таких как клетки Pseudomonas fluorescens. Полипептид (может также взаимозаменяемо употребляться как пептид, белок): Употребляемый здесь термин "полипептид" обозначает соединение из двух или более аминокислотных субъединиц, аминокислотных аналогов или других пептидомиметиков вне зависимости от их посттрансляционной модификации, например, фосфорилирования или гликозилирования. Субъединицы могут быть соединены белковыми связями или другими связями, такими как, например, эфирные связи. В это определение также входят полноразмерные полипептиды, усеченные полипептиды, точечные мутанты, инсерционные мутанты, сплайс-варианты, химерные белки и их фрагменты. Потомство: в данном контексте "потомство" включает потомков определенного растения или линии растений. Потомство рассматриваемого растения включает семена, образуемые F1, F2, F3, F4, F5, F6 и последующими поколениями растений, или семена, образуемые ВС 1, ВС 2, ВС 3 и последующими поколениями растений, или семена, образуемые F1BC1, F1BC2, F1BC3 и последующими поколениями растений. Маркировка F1 обозначает потомство, полученное от скрещивания двух родительских организмов,которые являются генетически отличными. Маркировки F2, F3, F4, F5 и F6 обозначают последующие поколения само- или перекрестно-опыленного потомства растения F1. Регуляторная область: употребляемый здесь термин "регуляторная область" обозначает последовательность нуклеотидов, которая влияет на инициацию и скорость транскрипции или трансляции, а также стабильность и/или подвижность продукта транскрипции или трансляции в заданном организме-хозяине. Подобные регуляторные области могут быть синтетическими или полученными из гетерологичных образцов. Например, регуляторные области, предназначенные для применения в растениях, не обязательно должны иметь растительное происхождение. Регуляторные последовательности включают, но не ограничиваются этим, последовательности промоторов, последовательности энхансеров, ответные элементы,сайты распознавания белков, индуцируемые элементы, последовательности связывания белков, 5' и 3' нетранслируемые области (НТО), сайты инициации транскрипции, терминационные последовательности, последовательности полиаденилирования, интроны и их комбинации. Как правило, регуляторная область содержит, по меньшей мере, коровый (основной) промотор. Регуляторная область также может включать по меньшей мере один контрольный элемент, такой как энхансерная последовательность, вышележащий элемент или вышележащая область активации (BOA). Например, подходящим энхансером- 13025208 является цис-регуляторный элемент (от -212 до -154) из вышележащей области гена октопин синтазы(окс), который может применяться для инициации экспрессии трансгенов биотоксина в клетках растений. Трансгенный организм: употребляемый здесь термин "трансгенный организм" или "рекомбинантный организм" обозначает организм, в геноме которого содержится гетерологичный полинуклеотид. В большинстве случает гетерологичный полинуклеотид стабильно интегрируется в геном так, что этот полинуклеотид передается последующим поколениям. Гетерологичный полинуклеотид может интегрироваться в геном как сам по себе, так и в составе экспрессионной кассеты. Термин "трансгенный" употребляется здесь для обозначения любой клетки, клеточной линии, каллюса, ткани, генотип которых был изменен внесением гетерологичной нуклеиновой кислоты. Термин трансгенный включает как изначально измененные трансгенные организмы, так и те, которые являются результатом полового скрещивания или бесполого размножения изначально измененных организмов. Употребляемый здесь термин трансгенный не включает изменение генома (хромосомного или внехромосомного) традиционными методами селекции растений или природными способами, такими как перекрестное опыление, нерекомбинантные вирусные инфекции, нерекомбинантная трансформация бактериями, нерекомбинантная транспозиция или спонтанные мутации. Вариант: в отношении полипептидов и нуклеиновых кислот термин "вариант" употребляется для обозначения молекулы полипептида, белка или полинуклеотида, которая имеет возникшие синтетически или естественным способом отличия в основных аминокислотных последовательностях по сравнению с контрольным полипептидом или полинуклеотидом соответственно. К примеру, такие отличия включают замены, вставки, делеции либо любые требуемые комбинации подобных изменений в контрольном полипептиде или полинуклеотиде. Полипептидный или белковый варианты могут дополнительно содержать изменения в зарядных и/или посттрансляционных модификациях (таких как гликозилирование, метилирование, фосфорилирование и т.д.). "Функциональные варианты" регуляторных последовательностей полинуклеотидов также включены в композиции согласно настоящему изобретению. Функциональные варианты включают, к примеру, природные регуляторные последовательности полинуклеотидов согласно изобретению, которые содержат одну или более нуклеотидных замен, делеций или вставок, и которые способны инициировать экспрессию функционально-связанной последовательности полинуклеотидов в условиях, аналогичных тем, при которых активен естественный промотор. Функциональные варианты согласно изобретению можно создать путем сайтнаправленного мутагенеза, индуцированной мутации, либо они могут возникать как аллельные варианты (полиморфизм). Когда термин "вариант" употребляется в отношении микроорганизма, он, как правило, обозначает микробный штамм, обладающий идентификационными характеристиками того вида, к которому он принадлежит, и, в то же время,имеет по меньшей мере одну вариацию в нуклеотидной последовательности или идентифицируемый отличный признак по отношению к родительскому штамму, при чем этот признак является генетически установившимся (наследуемым). Вектор: термин "вектор" обозначает структуру нуклеиновой кислоты, предназначенную для переноса между различными клетками-хозяевами. Употребляемый здесь термин "вектор" обозначает репликон, такой как плазмида, фаг или космида, в который может быть вставлен сегмент другой ДНК таким образом, чтобы привести к репликации вставленного сегмента. В общем случае вектор способен к репликации тогда, когда он ассоциирован с подходящими контрольными элементами. В связи с этим термин"вектор" включает клонирующие векторы и экспрессионные векторы, а также вирусные векторы и интегрирующие векторы. В частности, "экспрессионный вектор" - это вектор, который содержит регуляторную область и, таким образом, способен экспрессировать последовательности и фрагменты ДНК в клетке-хозяине (in vivo) и/или в безклеточной среде (in vivo). Все публикации и патентные заявки, упоминающиеся в описании настоящего изобретения, включены посредством ссылок в той же степени, что и в случае, если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была специально и индивидуально указана для включения посредством ссылки. Не исключается, что в ссылках представлен известный уровень техники. В обсуждении ссылок указывается лишь то, что утверждается их авторами, а заявители сохраняют за собой право оспаривать точность и уместность перечисленных работ. Станет предельно ясно, что, несмотря на приведенные здесь ссылки на публикации по известному уровню техники, данные ссылки не предполагают того, что любая из этих работ составляет часть известного уровня техники. Приведенное здесь обсуждение общепринятых методов предназначено исключительно для иллюстративных целей. Для специалиста в данной области техники является очевидным существование других альтернативных методов и реализаций, которые выходят за рамки описания сущности настоящего изобретения. Внехромосомное генетическое содержимое и биотоксины Большая часть генетического разнообразия популяций бактерий находится в содержимом внехромосомной ДНК, включая плазмиды и эписомы. Вариации штаммов на основе содержимого плазмид, хорошо известны для штаммов Bacillus, в частности, Bacillus thuringiensis ("Bt"). Инсектицидные белки,такие как гены дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis, которые находятся преимущественно в круп- 14025208 ных внехромосомных молекулах ДНК, могут быть быстро выявлены путем применения способа(-ов) данного изобретения. Более того, известно, что многие штаммы Clostridia также содержат крупные внехромосомные плазмиды, некоторые из которых, как известно, содержат факторы вирулентности, и, кроме того, токсины, такие как йота-токсины (смотрите, например, Perelle et al., Infect. Immun., 61:5147-5156,1993; а также перечисленные в этой работе ссылки). Вдобавок, было показано, что изменчивость штаммов Clostridia возникает, в основном, благодаря содержимому плазмид (смотрите, например, Katayam etal., Mol. Gen. Genet. 250:17-28, 1996). Таким образом, расшифровка содержимого внехромосомной ДНК множественных штаммов Clostridia даст возможность быстро определить значительную часть генетического разнообразия. Дополнительно сообщалось о наличии в штаммах Clostridia гомолога гена дельтаэндотоксина (Barloy et al., J. Bacteriol. 178:3099-3105, 1996). Известно, что многие микробные плазмиды также содержат факторы вирулентности, ответственные за инфекционность или степень инфекции, вызываемой бактериальными патогенами. Соответственно,многие белки, экспрессируемые плазмидными геномами, могут оказаться ценными в качестве вакцин. Например, сообщалось, что оба вида плазмид Bacillus anthracis - pXO1 и рХО 2 - кодируют белки, необходимые для патогенеза инфекции сибирской язвы. рХО 2 кодирует белки, которые вырабатывают защитную капсулу, окружающую бактерию. Плазмид a pXO1 кодирует три белка, составляющие комплекс токсина сибирской язвы: летальный фактор (ЛФ), фактор, вызывающий отк (ФО), и защитный антиген(ЗА). Белок ЗА (защитного антигена) является основой для вакцины против сибирской язвы. Быстрая и эффективная расшифровка бактериальных плазмид даст информацию, с помощью которой можно создать базу данных белков, которые могут служить эффективными вакцинами. Опухолеиндуцирующие и симбиотические плазмиды являются обычными среди штаммов Agrobacterium и Rhizobium (Van Larebeke et al., Nature, 252:169-170, 1974). Таким образом, с помощью расшифровки бактериальных плазмид, в особенности полученных из известных растительных патогенов, можно идентифицировать гены, которые принимают участие во взаимодействиях между растениями и патогенами, включая гены, которые приводят к наличию или необходимы для вирулентности и авирулентности. В неограничивающих иллюстративных примерах инсектицидные белки, такие как гены дельтаэндотоксинов Bacillus thuringiensis, часто находятся в крупных внехромосомных молекулах ДНК. Таким образом, изоляция и секвенирование внехромосомной ДНК штаммов Bacillus, таких как штаммы Bacillusthuringiensis, вероятно приведет к идентификации новых генов дельта-эндотоксинов. Подобные гены токсинов являются потенциально ценными для контроля насекомых-вредителей.Bacillus thuringiensis является грамположительной спорообразующей почвенной бактерией, обладающей способностью вырабатывать кристаллические включения, которые являются особенно токсичными для определенных отрядов и видов насекомых, но безопасны для растений и многих других нецелевых организмов. Традиционные методы глубинного брожения можно применять для получения больших количеств Bt-спор, делая Bt-бактерии коммерчески привлекательными в качестве ресурса для инсектицидных композиций. Композиции, содержащие штаммы Bacillus thuringiensis или их инсектицидные белки, широко применяются как экологически приемлемые инсектициды для борьбы с сельскохозяйственными насекомыми-вредителями или контроля насекомых векторов многих болезней человека или животных. Кристаллические (Cry) белки (дельта-эндотоксины), полученные из Bacillus thuringiensis, обладают потенциальной инсектицидной активностью преимущественно против личинок Чешуекрылых (Lepidoptera), Двукрылых (Diptera) и Жесткокрылых (Coleoptera). Также сообщалось, что данные белки проявляют пестицидную активность против вредителей отрядов Перепончатокрылых (Hymenoptera), Равнокрылых (Homoptera), Пухоедов (Phthiraptera), Власоедов (Mallophaga) и Клещей (Acari), а также против других типов беспозвоночных, таких как Круглые черви (Nemathelminthes), Плоские черви (Platyhelminthes) и Саркомастигофоры (Sarcomastigorphora). На сегодняшний день известно более 600 видов кристаллических белков с широким диапазоном специфичности и токсичности. Эти кристаллические белки и соответствующие гены изначально были классифицированы на основе, главным образом, их структуры и инсектицидного спектра действия (смотрите, например, Feitelson, In Advanced Engineered Pesticides, Ed.Kim, L., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., pp. 63-71, 1993). Основными классами были: Lepidopteraспецифический (I), Lepidoptera- и Diptera-специфические (II), Coleoptera-специфический (III), Dipteraспецифический (IV) и нематодо-специфические (V) и (VI). Позже белки были классифицированы по подсемействам; наиболее близкородственные белки в составе каждого семейства были обозначены соответствующими подразделению буквами, таким как Cry1A, Cry1B, Cry1C и т.д. Еще более близкородственные белки в составе каждого подразделения получили такие названия, как Cry1 С 1, Cry1C2. Описание более поздней номенклатуры Cry-генов было сделано на основе идентичности аминокислотных последовательностей, а не связанной с насекомым целевой специфичности (Crickmore et al., Microbiol. and Mol. Bio. Reviews, 62:807-813, 1998). В этой классификации каждому токсину присвоено уникальное наименование, включающее первый иерархический уровень (арабские цифры), второй иерархический уровень (заглавные буквы), третий иерархический уровень (строчные буквы) и четвертый иерархический уровень (другое число арабскими цифрами). В новой классификации для обозначения- 15025208 первого иерархического уровня арабские цифры были заменены на римские. Белкам, обладающим менее,чем 45%-ой идентичностью последовательностей, присваиваются различные первые иерархические уровни, а критериями для присвоения второго и третьего иерархических уровней являются 78 и 95% соответственно. Как правило, кристаллические белки не проявляют инсектицидной активности до тех пор, пока не будут всосаны и растворены в желудочно-кишечном тракте насекомого. В желудочно-кишечном тракте насекомого всосанный протоксин гидролизируется протеазами до активной молекулы токсина. Этот токсин связывается с рецепторами апикальной щеточной каемки в желудочно-кишечном тракте данной личинки и внедряется в апикальную мембрану, создавая ионные каналы и поры, что приводит к гибели личинки. В общем случае дельта-эндотоксины имеют пять консервативных доменов из последовательностей(смотрите, например, de Maagd et al., Trends Genetics 17:193-199, 2001). Первый консервативный структурный домен состоит из семи альфа-спиралей и принимает участие во внедрении в мембрану и образовании пор. Домен II состоит из трех складчатых бета-слоев, образующих конфигурацию греческого ключа, а домен III состоит из двух антипараллельных складчатых бета-слоев, скрученных в форме "рулета"(de Maagd et al., 2001, выше). Домены II и III принимают участие в распознавании рецепторов и связывании, и, таким образом, считаются определяющими специфичность токсина. Кроме дельта-эндотоксинов существует еще несколько известных классов инсектицидных и пестицидных белковых токсинов. Другие виды инсектицидных белков были найдены у В. thuringiensis и Bacillus cereus, а среди них - вегетативные инсектицидные белки или Vip-белки. Vip-белки секретируются в ходе вегетативного роста и не обладают каким-либо сходством с Cry- или Cyt-токсинами. В настоящее время все последовательности, относящиеся к описанным Vip-белкам, делятся на три разных семества:Vip1, Vip2, и Vip3. Недавно номенклатурный комитет по Bacillus thuringiensis предложил классифицировать данные белки в три класса, семь подклассов и дальнейшие подразделения (Crickmore et al., 2005, по Интернет-адресу www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/NeilCrickmore/Bt/). Vip3-белки имеют отличный диапазон хозяев, который включает несколько основных видов чешуекрылых вредителей. Как и Cry-токсины,Vip3 А-белки должны активироваться протеазами перед распознаванием на поверхности желудочнокишечного эпителия мембранных белков весом в 80-кДа и 100-кДа, отличных от тех, которые распознаются Cry-токсинами. Изначально механизмом действия предполагался апоптоз, но недавно было показано, что, подобно Сrу-токсинам, активированные Vip3 А-токсины являются порообразующими белками,способными создавать в мембране стабильные ионные каналы. Vip1- и Vip2-белки являются двумя компонентами бинарного токсина, который проявляет токсичность по отношению к жесткокрылым. Vip1Aa1 и Vip2Aa1 в общем случае являются весьма действенными против злаковых корневых червей, в частности, Diabrotica virgifera virgifera и Diabrotica longicornis. Токсины VIP1/VIP2 совместно с другими бинарными ("А/Б") токсинами. А/Б-токсины, такие как VEP-, С 2-, CDT-, CST-токсины или вызывающие отек токсины В. anthracis и летальные токсины оказывают сильное действие на насекомых через механизм,который, как считается, включает рецептор-опосредованный эндоцитоз, за которым следует клеточная токсификация. Описание метода скрининга В раскрытии сущности настоящего изобретения предложен интегрированный подход для быстрой и эффективной идентификации и изоляции полезных генов. В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ быстрой и высокоэффективной идентификации последовательностей генов, кодирующих биотоксины в микроорганизмах. В частности, данный способ обеспечивает быстрый и эффективный отбор образцов и скрининг внехромосомного генетического содержимого микроорганизмов для получения новых представляющих интерес последовательностей Данный способ включает быстрое секвенирование и характеристику смешанных популяций молекул внехромосомной ДНК, полученных из совокупности микробных изолятов Данный способ ориентирован на внехромосомную ДНК и предупреждает повторное клонирование и секвенирование хромосом организма-хозяина, таким образом, позволяя фокусироваться на генах, которые кодируются внехромосомной ДНК, например, биотоксинах. Данный способ включает составление метагеномного набора данных, который содержит нуклеотидные последовательности, полученные из смешанной популяции молекул внехромосомной ДНК, обработку и сравнение указанных последовательностей из метагеномного набора данных с известными последовательностями с целью идентифицировать новые нуклеотидные последовательности В некоторых предпочтительных аспектах настоящего изобретения обрабатываемые ДНК-последовательности можно транслировать во всех шести рамках считывания, а результирующую аминокислотную последовательность можно сравнить с известными белковыми последовательностями. Представляющие интерес микроорганизмы включают, но не ограничиваются этим, бактерии, грибы, водоросли и другие организмы. Описанные здесь интегрированные способы скрининга могут применяться для быстрой идентификации и клонирования новых генов, которые являются гомологичными существующим генам. В частности, упомянутые выше способы скрининга могут применяться для идентификации новых генов, которые обладают малой гомологичностью к известным генам, и которые было бы трудно идентифицировать- 16025208 другими способами, такими как гибридизация. Рабочий процесс скрининга обычно начинается с создания совокупности выделенных микробов и продолжается изоляцией внехромосомной ДНК, высокопроизводительным секвенированием, процессом считывания последовательностей и сборкой. В процессе сбора и анализа данных по последовательностям гены собираются в короткие последовательности (риды) или более длинные последовательности (контиги), либо и в те, и в другие. Анализ состава совокупности данных (то есть, анализ метагеномных данных) применяется на нескольких этапах данного рабочего процесса, а для облегчения анализа, как правило,нужны базы данных. Все этапы данного рабочего процесса будут детально описаны ниже в раскрытии сущности настоящего изобретения. Природные образцы, включая почву, растительные ткани, насекомых и образцы воды могут быть собраны в различных экосистемах, в которых произрастают коренные растения, обладающие филогенетическим сходством с заданными сельскохозяйственными культурами. Культуральную изоляцию растительно-ассоциированных микробов можно проводить в несколько этапов путем определения популяций,обитающих в почве, в ризосфере и филлосфере. Индивидуальные образцы можно обрабатывать отдельно или, наоборот, множественные образцы из географически уникальных мест собирают вместе перед дальнейшей обработкой, что может быть исключительно эффективным для определения разнообразия микроорганизмов во всем регионе с использованием единого процесса изоляции. К образцам можно применять методы выделения микробных клеток, за чем следует последовательное разведение и посев в высокоселективную хромогенную среду, предназначенную для изоляции Bacillus thuringiensis (Bt). Btизоляты можно отобрать из колонии, архивировать и вырастить индивидуально в культурах небольшого объема в препаратах для последующего выделения внехромосомной ДНК. Популяции микробов, не являющихся Bt-микробами, можно отобрать аналогичным способом, то есть, путем посева природных образцов в различные обогащенные и изоляционные среды или путем отбора специфических штаммов на основе их филогенеза из существующих архивов с целью создания композитных культур, которые часто могут быть составлены из нескольких сотен индивидуальных выделенных культур. Для изоляции внехромосомной ДНК из композитных культур можно применять наборы для выделения крупных плазмидных структур (QIAGEN, Inc.). В некоторых реализациях настоящего изобретения в рабочий процесс,предлагаемый QIAGEN, могут быть внесены изменения, чтобы сделать процедуру лизиса более жесткой для лизируемых грамположительных клеток. Полученная в результате очищенная внехромосомная ДНК, содержащая минимум геномных примесей, может после этого быть количественно оценена и приготовлена для высокопроизводительного секвенирования следующего поколения. Так как выделение внехромосомной ДНК обычно проводится для композитных культур, полученные в результате очищенные образцы ДНК представляют собой смешанные популяции внехромосомной ДНК, которую, как правило, получают от сотен отдельных изолятов. После выделения пул внехромосомных нуклеиновых кислот может быть подвергнут процессу высокопроизводительного секвенирования с целью создания метагеномных наборов данных. Этап обработки метагеномных данных по последовательностям, который включает сборку, генное прогнозирование и генную аннотацию, можно применять для идентификации генов, потенциально обладающих представляющей интерес активностью. Как будет детально описано ниже, с помощью способа согласно настоящему изобретению, были идентифицированы несколько генов токсинов, которые принадлежат многим основным классам Bt-токсинов, включая Cry-, VIP- и Cyt-гены. Согласно данным табл. 1 и Перечня последовательностей было обнаружено несколько новых полноразмерных и частичных кодирующих биотоксин генов, а также множество обнаруженных ранее генов. Составление метагеномного набора данных В настоящее время метагеномика является одной из наиболее быстро развивающихся областей исследований. Сам термин происходит от такого статистического понятия как мета-анализ (процесс статистического комбинирования отдельных методов анализа) и геномики (всесторонний анализ генетического материала организма). На сегодняшний день традиционная метагеномика часто определяется как применение высокопроизводительного секвенирования к ДНК, полученной непосредственно из природных образцов или группы родственных образцов. В определенной степени традиционная метагеномика является производной геномики микроорганизмов с тем ключевым отличием, что она исключает условие получения чистых культур для секвенирования. Вдобавок, образцы получают из сообществ, а не из выделенных популяций. Теоретически, метагеномный анализ природных микробных сообществ может быть разделен на два основных подхода: функционально-ориентированный и последовательно-ориентированный скрининг метагеномных библиотек. Оба метода скрининга включают выделение природной ДНК и создание малых или больших инсерционных библиотек (смотрите, например, Simon и Daniel,Appl. Environ. Microbiol. 77:1153-1161, 2011). Хотя метагеномика успешно применялась для идентификации ферментов с необходимой активностью, она основывалась, главным образом, на относительно низкопроизводительном функциональноориентированном скрининге или последовательно-ориентированном скрининге библиотек клонов природных ДНК. Исследование полного генома природных образцов с помощью последовательноориентированной метагеномики было ограничено сложностью видового разнообразия микроорганизмов- 17025208 в большинстве сред и вытекающей отсюда редкостью полноразмерных генов в продуктах метагеномной сборки с малым охватом. Интегрированный способ скрининга согласно одному из аспектов настоящего изобретения предлагает решение данной давно назревшей потребности с помощью способа быстрого и эффективного определения генетического разнообразия генома микроорганизмов и идентификации новых последовательностей, представляющих собой коммерческий интерес, без нужды в трудоемком составлении библиотек клонов или секвенировании полного генома микроорганизмов. Некоторые реализации настоящего изобретения включают составление метагеномного набора данных. Как обсуждалось выше, традиционная метагеномика часто определяется как применение высокопроизводительного секвенирования к ДНК, полученной непосредственно из природных образцов или группы родственных образцов путем исключения условия получения чистых культур для секвенирования. В контексте настоящей заявки термин "метагеномный набор данных" относится к случайно отобранным данным по последовательностям ДНК, полученной от совокупности выделенных микробов. Данные по последовательностям из метагеномных наборов данных по последовательностям часто объединяются в более крупные контиги. В общем смысле термин "контиг" ("contig" - от англ. "contiguous" примыкающий, сопряженный) относится к серии перекрывающихся последовательностей нуклеиновой кислоты, которые вместе представляют собой консенсусную область молекулы нуклеиновой кислоты. В типичных программах секвенирования генома контиг обозначает перекрывающиеся участки последовательностей (риды), являющиеся результатом повторной сборки небольших фрагментов ДНК, образующихся при стратегии секвенирования "снизу-вверх", которая включает разрывание ДНК на множество небольших фрагментов ("низ"), секвенирование этих фрагментов, их повторную сборку обратно в контиги и, в некоторых случаях, в полный геном ("верх"). Таким образом, употребляемый здесь термин "контиг" обозначает сопряженные отрезки внехромосомной ДНК, содержащие множество перекрывающихся ридов. Как правило, метагеномный набор данных содержит данные по коротким последовательностям ридов, длиной по меньшей мере в 10 Мпно, по меньшей мере 20 Мпно, предпочтительно по меньшей мере 30 Мпно, более предпочтительно по меньшей мере 40 Мпно и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50 Мпно, и может быть использован для получения методом компьютерного моделирования представляющих коммерческий интерес генов и последовательностей, таких как гены, кодирующие биотоксины. Методы секвенирования, которые подходят для реализации способа настоящего изобретения Последовательность молекул внехромосомной нуклеиновой кислоты может быть определена путем применения ряда методов, в частности, высокопроизводительных методов секвенирования следующего поколения, которые иногда называют массивно-параллельными методами секвенирования. Эти высокопроизводительные методы секвенирования хорошо известны и описаны в технической и научной литературе, например, в обзоре Lin et al. (Recent patents on Biomedical Engineering, 1:60-67, 2008) и других приведенных здесь ссылках. В некоторых реализациях секвенирование можно проводить прямо на молекулах внехромосомной нуклеиновой кислоты путем применения прямых процедур секвенирования, которые не требуют молекулярного клонирования. Хотя клонирование молекул нуклеиновой кислоты является относительно простым, прямое секвенирование нуклеиновых кислот, как правило, устраняет потребность в субклонировании и создание множества раздробленных библиотек, минимизирует количество секвенирующих реакций и сильно ускоряет получение информации по результатам секвенирования и сборку полных последовательностей. Преимущества прямого секвенирования нуклеиновых кислот включают устранение клонирующих артефактов и перекрестного контаминирования библиотек или полимеразных цепных реакций (ПЦР). Это очень важно для проведения секвенирования близкородственных организмов, так как обеспечивает объективное полное покрытие геномов с малым количеством лишних секвенирующих реакций и приводит к значительному выигрышу при обработке данных. Стандартные методы прямого секвенирования нуклеиновых кислот являются известными в данной области техники. Смотрите, например,Lin et al. (2008, выше); Lilian et al., (Quarterly Rev. Biophysics, 169-200, 2002). Секвенирование молекул внехромосомной нуклеиновой кислоты также может проводиться одним из нескольких традиционных методов секвенирования,которые включают, но не ограничиваются этим,традиционные основанные на применении геля методики, а также те, которые включают секвенирование путем синтеза (СПС), секвенирование путем дотирования, секвенирование путем гибридизации и многие другие более новые методы секвенирования, использующие нанотранзисторную схему, сканирующую туннельную микроскопию, нанопроводные молекулярные сенсоры и тому подобное. Стандартные основанные на применении геля методики преимущественно проистекают из методологии, разработанной Sanger et al. в 1970-х (Sanger et al., 1977), которая включает секвенирование путем терминации цепи и сепарацию гелем. В этом методе смешанная популяция фрагментов нуклеиновой кислоты, представляющих терминации на каждом основании, была создана с использованием 'терминаторов' - 2',3'-дидезокси- и арабинонуклеозидных аналогов нормальных дезоксинуклеозидтрифосфатов. Их размещают в электрофорезном геле, а последовательность может 'считываться' по порядку фрагментов в геле. Аналогичный метод секвенирования, который основан на химическом распаде фрагментов нуклеиновой кислоты на основания был разработан Махат и Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977).- 18025208 Секвенирование путем синтеза с использованием меченных флуорофором и являющихся обратимыми терминаторами нуклеотидов считается наиболее стандартной платформой секвенирования путем синтеза. Иногда его называют "флуоресцентным секвенированием на месте" (FISSEQ). Обычно оно включает следующие этапы: закрепление ДНК, предназначенной для секвенирования, на твердой поверхности, затем добавление полимеразы и меченных нуклеотидов с расщепляемыми химическими группами, чтобы закрыть ОН-группу, находящуюся на 3'-конце дезоксирибозы, так, что инкорпорация нуклеотидов завершает реакцию. Последовательность может быть считана с маркеров, которые использовались для нуклеотидов. Метод пиросеквенирования является еще одним СПС-методом, разработанным Ronaghi et al. (Ronaghi et al., Anal. Biochem. 242,1: 84-9, 1996; Ronaghi, Genome Res. 11:3-11, 2001). Вкратце, он основан на детекции пирофосфата (ПФ), который высвобождается во время синтеза ДНК, то есть, когда неорганический ПФ высвобождается после инкорпорации нуклеотида ДНК-полимеразой. Высвобожденный ПФ затем конвертируется в АТФ АТФ-сульфурилазой. Репортерный фермент люциферазы использует АТФ, чтобы генерировать свечение, которое регистрируется камерой прибора с зарядовой связью (ПЗС). Световой сигнал пропорционален числу инкорпорированных нуклеотидов (например, А, ТТ, ЦЦЦ и т.д.), а так как Г, А, Т и Ц нуклеотиды добавляются пошагово в цикл секвенирования,получить последовательности ДНК становится легко. Пиросеквенирование включено в ультравысокопроизводительный метод секвенирования в комбинации с несколькими методами, такими как использование матрицы, содержащей микрогранулы и помещенной в микротехнологически изготовленные реакционные лунки пиколитрового объема, которые соединены с оптическими волокнами. В настоящее время доступны несколько основанных на методе пиросеквенирования коммерческих платформ для секвенирования, таких как Genome Sequencer 20 System и Genome Sequencer FLX System от 454 Life Science/Roche Diagnostics, а также технология "Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET)" производстваUS200701728190. Также можно применять другие основанные на СПС методы, включающие, но не ограничивающиеся этим, те, которые продаются Intelligent Bio-Systems Inc. (смотрите, например, EuropeanPat. Appln. No. EP1790736), Affymetrix Inc. (смотрите, например, U.S. Pat. Appln. No. US20070105131). В некоторых реализациях изобретения предпочтение отдается Genome Analyzersystem от Illumina Inc.(например, U.S. Pat. Appln. No. US20077232656), которая также основана на методе СПС. Специалист в данной области техники поймет, что предпочтительно и зачастую необходимо генерировать данные по последовательностям с обоих концов (что также известно под названием двухстороннего или парностороннего секвенирования) фрагмента матричной ДНК, чтобы поддержать или поспособствовать сборке раздробленных последовательностей. Двухстороннее секвенирование также подойдет для определения характеристики перестройки генома, а также вставки или делеции, как в случае определения характеристики ракового генома. Широко известен ряд методов "двухстороннего секвенирования", таких как те, что описаны в U.S. Pat. Appln. Nos. US20077244567, US20060024681,US20070172839, US20060292611, US20077270951 и US20077282337, и которые можно применять как методы настоящего изобретения. В отдельных реализациях можно применять другие высокопроизводительные методы секвенирования, основанные на методах молекулярных колоний и флуоресцентного секвенирования на месте. Вкратце, метод молекулярных колоний - это метод амплификации ДНК на месте на тонкой полиакриламидной пленке. Подвижность ДНК ограничена полиакриламидным гелем, поэтому амплифицированная ДНК локализируется в геле и образует так называемые "колонии" - колонии из полимераз. На предметном стекле микроскопа может образовываться до 5 миллионов колоний (то есть, 5 миллионов ПЦР). Также в качестве метода настоящего изобретения можно применять варианты метода молекулярных колоний,которые включают колонии флуоресцентных секвенирующих гранул и PMAGE (от англ. "polony multiplex analysis of gene expression" -мультиплексный анализ генной экспрессии, в котором объединены метод молекулярных колоний и метод секвенирования путем лигирования). Другие высокопроизводительные методы секвенирования, устройства и системы, которые также можно применять на практике в настоящем изобретении, включают нанопоровое секвенирование (смотрите, например, U.S. Pat. Appln. Nos. US20070190542, US20070042366, US20070048745, US20060231419,и US20070178507) и секвенирование путем гибридизации (СПГ) (смотрите, например, U.S. Pat. Appln.No. US20070178516, US20077276338 и US20060287833). Также в качестве метода настоящего изобретения можно применять ряд высокопроизводительных методов секвенирования путем лигирования. Примеры подобных методов включают, но не ограничиваются этим, метод "массивно-параллельного опознавательного секвенирования" (смотрите, например,Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000; U.S. Pat. Appln. No. US20006013445). В некоторых вариантах этого метода молекулы ДНК параллельно амплифицируются на микрогранулах во время цепной полимеразной реакции в эмульсии. Затем миллионы гранул фиксируются в полиакриламидном геле и секвенируются при помощи метода секвенирования путем лигирования. Особенно удобными могут быть такие устройства и системы, как SOLiD (Supported Oligo Ligation Detection), которые производит AppliedBiosystems/Life Inc. Также можно применять более новый вариант, который основан на аналогичном методе секвенирования путем лигирования в комбинации с эмульсией ПЦР.- 19025208 Специалист в данной области техники поймет, что предпочтительно и зачастую необходимо применять комбинации различных методов секвенирования для получения хорошего качества сборки и аннотации микробных метагеномных данных по последовательностям. Способы таксономической идентификации Часто в случае, если микроорганизм был отобран с помощью методов скрининга, которые раскрываются в настоящем изобретении, бывает полезно идентифицировать его таксономически. Специалист в данной области техники признает, что таксономическая классификация микробных изолятов может быть определена рядом методов, включающих, но не ограничивающихся этим, (1) гибридизацию нуклеиновой кислоты-зонда с молекулой нуклеиновой кислоты указанных микробных изолятов; (2) амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты указанных микробных изолятов; (3) иммунологический анализ молекул указанных микробных изолятов; (4) секвенирование молекулы нуклеиновой кислоты, полученной из указанных микробных изолятов; либо комбинацию двух или более из этих методов. Идентификация организма, следовательно, может включать до семи различных уровней анализа,причем каждый метод анализа может основываться на различных характеристиках организма. Подобные методы анализа могут включать анализ на основе нуклеиновой кислоты (например, анализ индивидуальных специфических генов, как их наличия, так и их точной последовательности, либо экспрессии определенного гена или семейства генов), анализ на основе белка (например, на функциональном уровне,используя прямые или непрямые методы анализа ферментов, или на структурном уровне, используя иммунологический анализ), и так далее. Перед тем как проводить интенсивный молекулярный анализ выделенных культур, будет целесообразно удостовериться, что микробная культура получена из одной клетки и, соответственно, является чистой культурой (за исключением тех случаев, которые обсуждались в другом месте раскрытия сущности настоящего изобретения, когда микроорганизмы были намеренно смешаны). Часто микроорганизмы могут быть распознаны путем прямого микроскопического анализа (выглядят ли все клетки образца одинаково при рассмотрении), изучения характеристик окрашивания, простого молекулярного анализа (такого, как определение изменчивости длины фрагментов ДНК при простой рестрикции (ПДРФ и так далее. В отдельных реализациях изобретения, тем не менее, не обязательно проводить этап подтверждения чистоты, так как смешанные микробные культуры будут выявлены при последующем анализе. а) Анализ на основе нуклеиновой кислоты. В отдельных реализациях изобретения методы, применяющиеся для идентификации микроорганизмов, включают амплификацию и секвенирование генов, полученных из очень малого количества клеток. Соответственно, при проведении процедур возникает проблема концентрации клеток и их ДНК из разреженных суспензий. Проводимые процедуры могут применяться для идентификации клеток по последовательности генов или для идентификации клеток, содержащих определенные гены или семейства генов. Термин "амплификация нуклеиновой кислоты" в общем случае относится к методам, которые увеличивают количество копий молекулы нуклеиновой кислоты в образце или препарате. Методы, применяемые для амплификации нуклеиновой кислоты хорошо известны в данной области техники. Примером амплификации нуклеиновой кислоты может служить полимеразная цепная реакция (ПЦР), при которой биологический образец, взятый у объекта исследования, приводится в контакт с парой олигонуклеотидных праймеров в условиях, которые обеспечивают гибридизацию праймеров и матрицы нуклеиновой кислоты в образце. В подходящих условиях праймеры удлиняются, диссоциируют с матрицы, после чего ренатурируются, удлиняются и диссоциируют, увеличивая число копий нуклеиновой кислоты. Другие примеры in vitro методов амплификации включают амплификацию с замещением цепей; изотермическую амплификацию без транскрипции; амплификацию репарации цепной реакции; лигазную цепную реакцию; амплификацию лигазной цепной реакции с заполнением гэпа; парное лигазное распознавание и ПЦР; и РНК-амплификацию без транскрипции. В дополнение к тем праймерам, которые описаны в иллюстративных примерах, были разработаны и продолжают разрабатываться новые праймеры для отдельных видов или филогенетических групп микроорганизмов. Подобные узконаправленные праймеры можно применять согласно описанным здесь способам для скрининга и/или идентификации исключительно микроорганизмов, которые представляют интерес. Способы приготовления и применения праймеров нуклеиновой кислоты описаны, например в Sambrook et al. (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989), Ausubel et al. (ed.) (In Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, New York, 1998). Пары амплификационных праймеров можно получить из известной последовательности, например, с помощью компьютерных программ, предназначенных для этих целей, таких как Праймер (Primer) (Уайтхедский Институт биомедицинских исследований, Кембридж, Массачусетс). Специалист в данной области техники признает, что специфичность конкретного зонда или праймера возрастает с увеличение его длины. Таким образом, к примеру, праймер, содержащий 30 последовательных нуклеотидов кодирующего рРНК нуклеотида либо его ограничивающую область, соединится с заданной последовательностью с более высокой специфичностью, чем соответствующий праймер, содержащий всего 15 нуклеотидов. Таким образом, с целью по- 20025208 лучения более высокой специфичности выбираются такие зонды и праймеры, которые содержат, по меньшей мере, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более последовательных нуклеотидов заданной последовательности нуклеотидов, такой как 16S рРНК. Стандартные методы приготовления нуклеиновых кислот, которые используются для практического применения нуклеиновых кислот (например, ПЦР), включают экстракцию фенол/хлороформом или применение какого-либо из существующих и имеющихся в продаже наборов для выделения ДНК. Еще один возможный способ амплификации ДНК состоит во внесении клеток прямо в реакционную смесь для амплификации нуклеиновой кислоты в расчете на денатурационный этап амплификации, на котором происходит лизирование клеток и высвобождение ДНК. Продукт реакций амплификации нуклеиновой кислоты можно дополнительно охарактеризовать с помощью одного или более стандартных методов, которые хорошо известны в данной области техники и включают электрофорез, изучение характера расщепления рестрикционной эндонуклеазы, гибридизацию или лигирование олигонуклеотидов и/или секвенирование нуклеиновых кислот. В случаях, когда для идентификации клеток применяются гибридизационные методы, целесообразным может быть применение ряда методов, использующих меченые зонды, включая флуоресцентное мечение, радиоактивное мечение и нерадиоактивное мечение. б) Анализ на основе белка. В дополнение к анализу нуклеиновых кислот отобранные с помощью способов согласно настоящему изобретению микроорганизмы можно охарактеризовать и идентифицировать непосредственно на основе наличия (или отсутствия) специфических белков. Подобный анализ может быть основан на изучении активности специфических белков, например, с помощью ферментного анализа, или по ответу совместно культивируемых организмов, или просто по присутствию специфического белка (которое может быть определено, к примеру, иммунологическими методами, такими как местное иммунофлюоресцентное окрашивание антител). Методы ферментного анализа: В качестве примера можно привести метод, в котором флуоресцентный или хромогенный аналог субстрата вносят в питательную среду (например, для культуры, выращиваемой на титрационном микропланшете), за чем следует инкубация и скрининг на наличие продуктов реакции, и, таким образом, культуры идентифицируют на основе их ферментативной активности. Ответ при совместной культивации: В некоторых реализациях настоящего изобретения ферментную активность микробного изолята можно анализировать на основе ответа (или степени ответа) совместно культивируемого организма (такого, как репортерный организм). Также для идентификации организмов, отобранных и выделенных из определенной природной среды, можно применять ряд методов, основанных на связывании, по меньшей мере, одного антитела или полученной из антитела молекулы и молекулы, а именно, эпитопа молекулы, принадлежащей микроорганизму. Антимикробные белковые антитела можно получить путем применения стандартных процедур, которые описаны во многих публикациях, включая Harlow and Lane (Antibodies, A Laboratory Manual,CSHL, New York, 1988). To, что конкретный агент связывается, главным образом, лишь с одним белком данного микроорганизма, легко можно определить, применяя или адаптируя стандартные процедуры. Один из подходящих методов in vitro анализа использует процедуру вестерн-блоттинга (описанного во многих типовых публикациях, включая Harlow and Lane; Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, NewYork, 1988). Более короткие фрагменты антител (полученные из антител молекулы, например, FAb-фрагменты,Fv-фрагменты, и одноцепочечные Fv-фрагменты (SCFvs могут также служить специфическими связывающими агентами. Способы получения таких фрагментов являются стандартными. Выявление антител, которые связываются с клетками, аналитическими методами настоящего изобретения проводится с применением стандартных методов, например, метода твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), который использует обнаруживаемый сигнал, например, флуоресцентный или люминисцентный сигнал. Полинуклеотиды и полипептиды настоящего изобретения В другом аспекте настоящего изобретения в раскрытии сущности описаны новые выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, молекулы нуклеиновой кислоты, которые взаимодействуют с этими молекулами нуклеиновой кислоты, молекулы нуклеиновой кислоты, которые гибридизируются с этими молекулами нуклеиновой кислоты, и выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют такой же самый белок вследствие вырожденности кода ДНК. Дополнительные реализации настоящей заявки также включают полипептиды, кодируемые выделенными молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в настоящем изобретении. Полинуклеотиды и полипептиды, описанные в настоящем изобретении, предпочтительно являются"биологически активными" по отношению к структурным характеристикам, таким как способность нуклеиновой кислоты гибридизироваться с другой молекулой нуклеиновой кислоты или способность полипептида быть связанным антителом (или конкурировать с другой молекулой за подобное связывание). Как вариант, подобная характеристика может быть каталитической и, таким образом, приводить к спо- 21025208 собности молекулы опосредовать химическую реакцию или ответ. Полинуклеотиды и полипептиды, описанные в настоящем изобретении, также могут быть рекомбинантными. Употребляемый здесь термин рекомбинантный обозначает любую молекулу (например, ДНК,пептид и т.д.), которая является результатом, в том числе непрямым, манипуляций экспериментатора с полинуклеотидами или полипептидами. Молекулы нуклеиновой кислоты или их фрагменты, описанные в настоящем изобретении, способны специфически гибридизироваться с другими молекулами нуклеиновой кислоты в определенных условиях. В данном контексте две молекулы нуклеиновой кислоты считаются способными специфически гибридизироваться друг с другом в том случае, если две молекулы способны образовывать антипараллельную двухцепочечную структуру нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты считается"комплементарной" другой молекуле нуклеиновой кислоты, если они проявляют полную комплементарность. В данном контексте считается, что молекулы проявляют "полную комплементарность", если каждый нуклеотид одной из молекул является комплементарным соответствующему нуклеотиду другой. Две молекулы считаются "минимально комплементарными", если они могут гибридизироваться друг с другом со стабильностью, достаточной для того, чтобы позволить им оставаться соединенными друг с другом, по меньшей мере, в стандартных "умеренно жестких" условиях. Аналогично, молекулы считаются"комплементарными", если они могут гибридизироваться друг с другом со стабильностью, достаточной для того, чтобы позволить им оставаться соединенными друг с другом, по меньшей мере, в стандартных"жестких" условиях. Стандартные жесткие условия описаны в Sambrook et al., In: Molecular Cloning, Aal. In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985). Следовательно,отклонения от полной комплементарности являются допустимыми до тех пор, пока данные отклонения полностью не исключают возможность образования молекулами двухцепочечной структуры. Таким образом, для того, чтобы описанная в настоящем изобретении молекула нуклеиновой кислоты или ее фрагмент могла служить праймером или зондом, она должна быть в достаточной степени комплементарной в отношении последовательности, чтобы образовывать стабильнуюдвухцепочечную структуру. Приемлемые условия строгости, которые стимулируют гибридизацию ДНК, включают, например,применение буфера 6.0 хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) приблизительно при 45 С, за которым следует отмывка 2.0SSC приблизительно при 50 С. Эти условия известны специалистам в данной области техники, или же, их можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, N.Y. 6.3.1-6.3.6 (1989). Например, концентрация соли на этапе отмывки может быть подобрана от умеренно жестких условий, которым соответствует 2.0SSC буфер при температуре 50 С, до жестких условий, которым соответствует 0.2SSC буфер при температуре 50 С. Дополнительно, температуру на этапе отмывки можно повышать от умеренно жестких условий при комнатной температуре приблизительно в 22 С до жестких условий при 65 С. Как температура, так и концентрация соли могут варьироваться, либо температура или концентрация соли могут оставаться неизменными в то время, как изменяется другая переменная. В предпочтительной реализации нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению будет специфически гибридизироваться с одной или более последовательностями нуклеиновой кислоты, перечисленных в Перечне последовательностей, или их комплементарными цепями в умеренно жестких условиях, например, приблизительно в 2.0SSC и при 65 С. В отдельном предпочтительной реализации нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению будет содержать те молекулы нуклеиновой кислоты, которые специфически гибридизируются с одной или более последовательностями нуклеиновой кислоты, перечисленных в Перечне последовательностей, или их комплементарными цепями в жестких условиях. В другой реализации в настоящем изобретении описаны последовательности нуклеотидов, которые кодируют полипептиды. Кодируемые полипептиды могут представлять собой как полный белок, кодируемый геном, представляемым полинуклеотидом, или могут быть фрагментами кодируемого белка. Предпочтительно, чтобы описанные здесь полинуклеотиды кодировали полипептиды, которые составляют существенную часть от полного белка, и, что более предпочтительно, составляют часть полного белка, достаточную для того, чтобы обеспечить соответственную биологическую активность. В частности, интерес представляют те полинуклеотиды, описанные в настоящем изобретении, которые кодируют полипептиды, принимающие участие в выработке биотоксинов. Субпопуляция молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, содержит фрагменты описанных полинуклеотидов, которые состоят из олигонуклеотидов размером, по меньшей мере в 15, предпочтительно по меньшей мере 16 или 17, более предпочтительно по меньшей мере 18 или 19, или еще более предпочтительно по меньшей мере 20 или более последовательных нуклеотидов. Подобные олигонуклеотиды представляют собой фрагменты более крупных молекул, которые содержат последовательности, соответствующие последовательностям полинуклеотидов, представленным в Перечне последовательностей, и применяются, к примеру, в качестве интерферирующих молекул, зондов и праймеров для выявления полинуклеотидов согласно настоящему изобретению.- 22025208 В некоторых реализациях те молекулы нуклеиновой кислоты, которые представляют собой фрагменты кодирующих токсины нуклеотидных последовательностей, также включены в настоящее изобретение. "Фрагментом токсина" называется часть нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок токсина. Фрагмент нуклеотидной последовательности может кодировать биологически активную часть белка токсина, либо это может быть фрагмент, который можно использовать в качестве гибридизационного зонда или ПЦР-праймера и применять согласно способам, раскрытым ниже. Молекулы нуклеиновой кислоты, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности токсина,содержат, по меньшей мере, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200,1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100,2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000,3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350 сопряженных нуклеотидов, или в зависимости от предполагаемого использования, вплоть до того количества нуклеотидов, которое содержится в описанной здесь полноразмерной нуклеотидной последовательности, кодирующей токсин. Термин "сопряженные нуклеотиды" обозначает нуклеотидные остатки, которые непосредственно прилегают друг к другу. Фрагменты нуклеотидных последовательностей согласно настоящему изобретению будут кодировать белковые фрагменты, которые сохраняют биологическую активность белка токсина и, следовательно, сохраняют пестицидную активность. Под выражением "сохранять активность" подразумевается, что фрагмент будет обладать по меньшей мере 30%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70, 80, 90, 95% или более пестицидной активности белка токсина. Методы определения пестицидной активности хорошо известны в данной области техники. Смотрите, например, Czapla and Lang (J. Econ. Entomol. 83:2480-2485, 1990);and U.S. Pat. No. 5,743,477). Фрагмент кодирующей токсин нуклеотидной последовательности, которая кодирует биологически активную часть белка согласно изобретению, будет кодировать по меньшей мере 15, 25, 30, 50, 75, 100,125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100 сопряженных аминокислот, либо вплоть до полного количества аминокислот, которое содержится в полноразмерном белке токсина согласно изобретению. В некоторых реализациях фрагмент является фрагментом протеолитического расщепления. Например, фрагмент протеолитического расщепления может иметь N-терминальное или С-терминальное окончание, состоящее по меньшей мере из 100 аминокислот,около 120, около 130, около 140, около 150 или около 160 аминокислот, родственных любой из аминокислотных последовательностей, представленных в Перечне последовательностей. В некоторых реализациях включенные в изобретение фрагменты возникают в результате удаления С-терминального кристаллизационного домена, например, путем расщепления белка или вставки в кодирующую последовательность стоп-кодона. Описанные здесь варианты полинуклеотидов также представляют интерес для настоящего изобретения. Подобные варианты могут иметь природное происхождение, включая гомологичные полинуклеотиды, полученные от одного либо от разных видов, или это могут быть варианты неприродного происхождения, например, синтезированные путем применения методов химического синтеза полинуклеотиды или те, что получемы с помощью рекомбинантной ДНК-технологии. В отношении нуклеотидных последовательностей вырождение генетического кода обеспечивает возможность замены, по меньшей мере,одного основания в кодирующей белок последовательности гена другим основанием без изменения аминокислотной последовательности воспроизводимого геном полипептида. Следовательно, ДНК согласно настоящему изобретению также может содержать любую последовательность оснований, которая является результатом изменения любой последовательности нуклеотидов из Перечня последовательностей путем замены в соответствии с вырожденностью генетического кода. Ссылки на публикации, в которых описывается применение кодонов, доступны для всеобщего ознакомления. Специалист в данной области техники также признает, что изменения могут быть внесены путем мутации нуклеотидных последовательностей согласно изобретению и, таким образом, приводить к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемых белков токсинов без изменения биологической активности этих белков. Следовательно, вариантные выделенные молекулы нуклеиновой кислоты можно создать путем внесения одной или более нуклеотидных замен, добавок или делеций в соответствующую описанную здесь нуклеотидную последовательность таким образом, что одна или более аминокислотных замен, добавок или делеций будут внесены в кодируемый белок. Мутации можно вносить стандартными методами, такими как сайтнаправленный мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие вариантные нуклеотидные последовательности также включены в настоящее изобретение. Например, консервативные аминокислотные замены можно провести на одном или более прогнозируемых, заменимых аминокислотных остатках. "Заменимым" аминокислотным остатком является такой остаток, который может быть изменен по сравнению с природной последовательностью белка токсина без изменения биологической активности, в то время как для биологической активности требуется "незаменимый" аминокислотный остаток. "Консервативной аминокислотной заменой" является та замена,при которой аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком с аналогичной боковой цепью. В данной области техники были определены семейства аминокислотных остатков с аналогичны- 23025208 ми боковыми цепями. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями(например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Как обсуждалось в другом месте данного текста, дельта-эндотоксины, в общем случае, имеют пять консервативных доменов из последовательностей и три консервативных структурных домена (смотрите,например, de Maagd et al., 2001, выше). Первый консервативный структурный домен состоит из семи альфа-спиралей и принимает участие во внедрении в мембрану и образовании пор. Домен II состоит из трех складчатых бета-слоев, образующих конфигурацию греческого ключа, а домен III состоит из двух антипараллельных складчатых бета-слоев, скрученных в форме "рулета" (de Maagd et al., 2001, выше). Домены II и III принимают участие в распознавании рецепторов и связывании, и, таким образом, считаются определяющими специфичность токсина. Аминокислотные замены могут быть проведены в неконсервативных областях, которые сохраняют функциональность. В общем случае, подобные замены не проводились бы для консервативных аминокислотных остатков или для аминокислотных остатков, находящихся в составе консервативного мотива, где эти остатки играют существенную роль в белковой активности. Примеры остатков, которые являются консервативными и могут играть существенную роль в белковой активности, включают, например, одинаковые среди всех белков остатки, содержащиеся в ряде аминокислотных последовательностей согласно настоящему изобретению и в известных последовательностях токсинов. Примеры остатков, которые являются консервативными, но для которых возможны консервативные аминокислотные замены с условием сохранением активности, включают, например, остатки, имеющие среди всех белков только консервативные замены, содержащиеся в ряде аминокислотных последовательностей согласно настоящему изобретению и в известных последовательностях токсинов. В любом случае, специалисту в данной области техники будет понятно, что функциональные варианты могут содержать минимальное количество консервативных или неконсервативных изменений в консервативных областях. И наоборот, вариантные нуклеотидные последовательности можно создавать путем случайного внесения мутаций по всей длине или части длины кодирующей последовательности, как при насыщающем мутагенезе, а полученные мутанты можно сортировать по способности придавать токсическую активность для того, чтобы идентифицировать таких мутантов, которые сохранили активность. После мутагенеза кодируемый белок может экспрессироваться рекомбинантным способом, а активность белка можно определить стандартными аналитическими методами. Применяя такие методы, как ПЦР, гибридизация и тому подобные, можно идентифицировать соответствующие последовательности токсинов, при чем эти последовательности должны обладать значительной идентичностью с последовательностями согласно изобретению. Смотрите, например, Sambrook и Russell (2001, выше). Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, которые являются вариантами описанных здесь полинуклеотидов, в большинстве случаев будут обладать значительной идентичностью с описанными здесь полинуклеотидами. Особенный интерес представляют гомологи полинуклеотидов, которые обладают по меньшей мере 50%-ой идентичностью последовательностей, по меньшей мере 60%-ой идентичностью последовательностей, по меньшей мере 70%-ой идентичностью последовательностей, по меньшей мере 80%-ой идентичностью последовательностей, по меньшей мере 85%-ой идентичностью последовательностей и более предпочтительно по меньшей мере 90, 95-ой, или даже большей, например,96, 97, 98 или 99%-ой идентичностью последовательностей по сравнению с любой из описанных здесь полинуклеотидных последовательностей. Специалист в данной области техники также признает, что после того, как новый ген токсина будет идентифицирован, молекулы нуклеиновой кислоты и их фрагменты, соответствующие новому гену токсина, можно применять для идентификации микробных штаммов или изолятов, во внехромосомном генетическом содержимом которых в естественном состоянии находится последовательность нуклеиновой кислоты, идентичная последовательности нового гена токсина, который представляет интерес. Подобные микробные штаммы или изоляты можно легко идентифицировать, применяя описанные выше молекулы нуклеиновой кислоты или их фрагменты для сортировки микробной популяции. Скрининг бактериальных колоний путем применения среди прочих методов ПЦР или гибридизационных методов на основе ДНК, гибридизационных методов на основе антител, считается общепринятым в данной области техники. Молекулы нуклеиновой кислоты и их фрагменты согласно настоящему изобретению можно применять для получения других молекул нуклеиновой кислоты от тех же самых видов. Подобные молекулы нуклеиновой кислоты включают молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат полную кодирующую белок последовательность, промоторы и фланкирующие последовательности таких молекул. Вдобавок, такие молекулы нуклеиновой кислоты включают молекулы нуклеиновой кислоты, которые коди- 24025208 руют другие токсины или представителей генного семейства. Подобные молекулы можно легко получить, применяя описанные выше молекулы нуклеиновой кислоты и их фрагменты для скрининга библиотек кДНК или библиотек внехромосомных ДНК, составленных по данным, полученным от вырабатывающих токсины микроорганизмов. Методы создания таких библиотек хорошо известны в данной области техники. Молекулы нуклеиновой кислоты и их фрагменты согласно настоящему изобретению можно также применять для получения гомологов нуклеиновой кислоты. Подобные гомологи включают молекулы нуклеиновой кислоты из разных аллелей одного вида или из других организмов, включая молекулы нуклеиновой кислоты, которые полностью или частично кодируют гомологи белка токсина других организмов, последовательности генетических элементов, такие как промоторы и транскрипционные регуляторные элементы. Подобные молекулы можно легко получить, применяя описанные выше молекулы нуклеиновой кислоты и их фрагменты для скрининга библиотек кДНК или библиотек внехромосомных ДНК, составленных по данным, полученным от этих видов микроорганизмов. Методы создания таких библиотек хорошо известны в данной области техники. Молекулы гомологов могут отличаться по своим нуклеотидным последовательностям от тех, которые содержатся в одном или более нуклеотидах, представленных в Перечне последовательностей, или их комплементарных цепях, так как для стабильной гибридизации полная комплементарность не нужна. Таким образом, молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению также включают молекулы, которые могут не обладать "полной комплементарностью", хотя при этом способны специфически гибридизироваться с молекулами нуклеиновой кислоты. В конкретной реализации для получения подобных последовательностей может применяться метод ПЦР с быстрой амплификацией 3'- или 5'-концов кДНК. Для получения одной или более из описанных выше молекул нуклеиновой кислоты можно применять любой из множества известных в данной области техники методов. Для этой цели можно применять автоматизированные синтезаторы нуклеиновых кислот. Вместо подобного синтеза можно использовать описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты для того, чтобы определить пару праймеров, которые могут быть использованы вместе с полимеразной цепной реакцией для амплификации и получения любой желаемой молекулы нуклеиновой кислоты или ее фрагмента, которые являются стандартными в данной области техники. Дополнительно, вырожденность генетического кода, которая позволяет различным нуклеотидным последовательностям кодировать один и тот же белок или пептид, также является известной в данной области техники. В одном из аспектов настоящего изобретения одна или более молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению отличаются по нуклеотидным последовательностям от тех, которые кодируют полипептид токсина или его фрагмент и принадлежат группе, состоящей из нуклеотидных последовательностей из Перечня последовательностей, вследствие вырожденности генетического кода так,что они кодируют тот же белок, но при этом отличаются по нуклеотидным последовательностям. Также в дополнительном варианте настоящего изобретения описаны одна или более молекул нуклеиновой кислоты, которые отличаются по нуклеотидным последовательностям от тех, которые кодируют полипептид токсина или его фрагмент и принадлежат группе, состоящей из нуклеотидных последовательностей из Перечня последовательностей, вследствие того, что различные нуклеотидные последовательности кодируют полипептид, содержащий один или более консервативных аминокислотных остатков. Понятно, что генетические кодоны, способные кодировать подобные консервативные замены, хорошо известны в данной области техники. В изобретении также описаны полипептиды, которые кодируются полинуклеотидами согласно изобретению. В данной области техники известно, что одна или более аминокислот в последовательности могут быть заменены другой аминокислотой(-ами), заряд и полярность которой аналогичны таковым у замещенной аминокислоты, то есть, происходит консервативная аминокислотная замена, приводящая к биологически/функционально молчащему изменению. Консервативные замены для аминокислоты в последовательности полипептида можно выбрать среди других представителей класса, к которому принадлежит данная аминокислота. Аминокислоты можно разделить на четыре следующих группы: (1) кислотные (отрицательно заряженные) аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; (2) основные (положительно заряженные) аминокислоты, такие как аргинин, гистидин и лизин; (3) нейтральные полярные аминокислоты, такие как серии, треонин, тирозин, аспарагин и глутамин; (4) нейтральные неполярные (гидрофобные) аминокислоты, такие как глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан, цистеин и метионин. Консервативные аминокислотные замены в пределах природной последовательности полипептидов можно провести путем замены одной аминокислоты в пределах одной из этих групп другой аминокислотой в пределах той же самой группы. Биологически функциональные эквиваленты полипептидов или их фрагменты согласно настоящему изобретению могут содержать 10 или менее консервативных аминокислотных замен, более предпочтительно - около 7 или менее консервативных аминокислотных замен, и наиболее предпочтительно - около 5 или менее консервативных аминокислотных замен. В предпочтительных реализациях настоящего изобретения полипептид содержит приблизительно от 5 до 500 консер- 25025208 вативных замен, более предпочтительно приблизительно от 10 до 300 консервативных замен, еще более предпочтительно приблизительно от 25 до 150 консервативных замен и наиболее предпочтительно приблизительно от 5 до 25 консервативных замен или от 1 до 5 консервативных замен. Таким образом, кодирующая нуклеотидная последовательность будет содержать соответствующие основные замены, которые позволят ей кодировать биологически функциональные эквивалентные формы белков или их фрагменты согласно настоящему изобретению. В другом аспекте настоящего изобретения полипептиды биотоксинов также включены в настоящее изобретение. В реализации этого аспекта под "полипептидом биотоксина" подразумевается полипептид,содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую любой из аминокислотных последовательностей, перечисленных в Перечне последовательностей. В некоторых реализациях полипептиды биотоксинов кодируются молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая соответствует любой из нуклеотидных последовательностей, перечисленных в Перечне последовательностей; или последовательностью нуклеиновой кислоты, которая в жестких условиях гибридизируется с любой из нуклеотидных последовательностей, перечисленных в Перечне последовательностей, или ее комплементарной цепью или фрагментом обоих; последовательностью нуклеиновой кислоты, которая на 70% или более идентична любой из нуклеотидных последовательностей, перечисленных в Перечне последовательностей, или ее комплементарной цепью или фрагментом обоих. В некоторых реализациях полипептиды биотоксинов обладают 50%-ой или более высокой идентичностью с любой из аминокислотных последовательностей, перечисленных в Перечне последовательностей. Как более детально описано в другом месте данного текста, полипептиды биотоксинов могут быть эффективными, к примеру, в придании пестицидной активности рекомбинантному организму в случае,если они экспрессируются в этом организме, или в борьбе с организмами-вредителями. Такие полипептиды биотоксинов, как правило, содержат, по меньшей мере, один домен, индикативный для пестицидной активности. Описанные здесь примеры индикативных для пестицидной активности Pfam-доменов,которые Заявители идентифицировали в полипептидах биотоксинов, включают EndotoxinM (PF00555) домен (смотрите, например, Li et al., Nature 353: 815-21, 1991; Cygler et al., J. Mol. Biol. 254 (3): 447-64,1995; Ghosh et al., Acta Crystallogr. D 57: 1101-1109, 2001); RicinBlectin (PF00652) домен, AerolysinChem. 271:10786-10792, 1996); CryBPl (PF07029) домен (смотрите, например, Dervyn et al., J. Bacteriol. 177:2283-2291, 1995; Zhang et al., J. Bacteriol. 179:4336-4341, 1997); PA14 (PF07691) домен (смотрите,например, Rigden et al.Jrends Biochem. Sci. 29:335-339, 2004); и Fve (PF09259) домен (смотрите,например, Paaventhan et al., J Mol Biol. 332:461-470, 2003). Более детальное описание специфическихPfam-доменов можно найти на различных информационных ресурсах, таких как Интернет-страницы"www.sanger.ac.uk" или "pfam.janelia.org". Дополнительно, в прилагающемся Перечне последовательностей детально описаны специфические полипептиды, которые прогнозируемо содержат один или более индикативных pfam-доменов. Таким образом, различные практические применения последовательностей биотоксинов из перечня последовательностей для специалиста в данной области техники являются совершенно очевидными на основе их сходства с известными последовательностями. Также описаны фрагменты, биологически активные части и их варианты, которые можно использовать в практическом применении способов согласно настоящему изобретению. "Фрагменты" или "биологически активные части" включают фрагменты полипептидов, содержащие аминокислотные последовательности, в достаточной степени идентичные любой из аминокислотных последовательностей из Перечня последовательностей, и проявляющие пестицидную активность. Биологически активной частью белка токсина может быть полипептид, имеющий длину, к примеру, в 10, 25, 50, 100 или более аминокислот. Такие биологически активные части могут быть приготовлены с помощью рекомбинантных технологий и оценены с точки зрения пестицидной активности. Методы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области техники. Смотрите, например, Czapla и Lang J. Econ. Entomol. 83:2480-2485 (1990); Andrews et al., Biochem. J. 252:199-206 (1988); Marrone et al., J. of Economic Entomology 78:290-293 (1985); WO2011009182A2; and U.S. Pat. No. 5,743,477. В применениях согласно настоящему изобретению фрагмент содержит, по меньшей мере, 8 сопряженных аминокислот, соответствующих любой из аминокислотных последовательностей из Перечня последовательностей. Настоящее изобретение включает другие фрагменты, такие, например, как любой фрагмент белка, состоящего из более- 26025208 чем 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900,950, 1000, 1050,1100, 1150, 1200, 1250 или 1300 аминокислот. Как описано в другом месте данного текста, под "вариантами" подразумеваются белки или полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 60, 65, приблизительно 70, 75, приблизительно 80, 85, приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны любой аминокислотной последовательности, перечисленной в Перечне последовательностей. Варианты также включают полипептиды, которые кодируются молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, содержащую любую из нуклеотидных последовательностей, перечисленных в Перечне последовательностей, или ее комплементарной цепю, в жестких условиях. Варианты включают полипептиды с аминокислотной последовательностью, отличной вследствие мутагенеза. Вариантные белки, включенные в настоящее изобретение, являются биологически активными в том смысле, что они продолжают обладать требуемой биологической активностью природного белка, то есть, сохраняют пестицидную активность. Методы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области техники. Смотрите, например,Czapla и Lang (1990, supra); Andrews et al., Biochem. J. (1988, supra); Marrone et al., (1985, supra); PCT Publication No. WO2011009182A2; и U.S. Pat. No. 5,743,477. Измененные или усовершенствованные варианты Предполагается, что ДНК-последовательности токсина могут быть изменены рядом методов, и что эти изменения могут привести к тому, что последовательности ДНК будут кодировать белки с аминокислотными последовательностями, отличными от тех, которые кодировал токсин согласно настоящему изобретению. Этот белок может быть изменен различными способами, включая аминокислотные замены,делеции, процессирование и вставки одной или более аминокислот из Перечня последовательностей,которые включают приблизительно до 2, приблизительно до 3, приблизительно до 4, приблизительно до 5, приблизительно до 6, приблизительно до 7, приблизительно до 8, приблизительно до 9, приблизительно до 10, приблизительно до 15, приблизительно до 20, приблизительно до 25, приблизительно до 30,приблизительно до 35, приблизительно до 40, приблизительно до 45, приблизительно до 50, приблизительно до 55, приблизительно до 60, приблизительно до 65, приблизительно до 70, приблизительно до 75,приблизительно до 80, приблизительно до 85, приблизительно до 90, приблизительно до 100, приблизительно до 105, приблизительно до 110, приблизительно до 115, приблизительно до 120, приблизительно до 125, приблизительно до 130 или более аминокислотных замен, делеций или вставок. Способы подобных манипуляций известны в данной области техники. Например, варианты аминокислотной последовательности белка токсина можно получить путем мутаций в ДНК. Также можно применить одну из нескольких форм мутагенеза и/или направленное развитие. В некоторых аспектах изменения, внесенные в аминокислотную последовательность, не будут существенно влиять на функциональность белка. Такие варианты будут обладать требуемой пестицидной активностью. Вместе с тем понятно, что способность токсина придавать пестицидную активность можно усовершенствовать путем применения подобных методов к составам согласно настоящему изобретению. Например, можно экспрессировать токсин в клетке-хозяине, которая характеризуется высоким уровнем ошибок включения оснований во время репликации ДНК, такой как XL-1 Red (Stratagene). После культивирования в подобных штаммах можно выделить ДНК токсина (например, путем обработки плазмидной ДНК или путем амплификации ПЦР и клонирования результирующего фрагмента ПНР в вектор), культивировать мутации токсина в немутагенном штамме и идентифицировать мутировавшие гены токсина, обладающие пестицидной активностью, например, путем применения аналитического способа тестирования пестицидной активности. И наоборот, в белковую последовательность многих белков можно внести изменения в области амино- или карбоксильного конца без существенного влияния на активность. Данный процесс может включать вставки, делеций или изменения, осуществляемые с помощью современных молекулярных методов, таких как ПЦР, включая ПЦР-амплификацию, которая изменяет или продлевает кодирующую белок последовательность посредством включения аминокислотных кодирующих последовательностей в олигонуклеотидах, которые задействованы в ПЦР-амплификации. Как вариант, добавочные белковые последовательности могут включать целые кодирующие белок последовательности, такие как те, что повсеместно применяются в данной области техники для создания слитых белков. Обычно подобные слитые белки применяются для (1) повышения экспрессии представляющего интерес белка, (2) привнесения связывающего домена, ферментной активности или эпитопа, чтобы обеспечить очищение белка,выявление белка или другое известное в данной области техники экспериментальное использование, (3) целевой секреции или трансляции белка в субклеточную органеллу, такую как периплазматическое пространство грамотрицательной бактерии или эндоплазматический ретикулум эукариотической клетки,причем последнее часто приводит к гликозилированию белка. Вариантные нуклеотидные и аминокислотные последовательности согласно настоящему изобретению также включают последовательности, полученные путем мутагенных и рекомбинантных процедур,таких как перестановки в ДНК. С помощью такой процедуры одна или более различных областей токсина, кодирующих белок, можно использовать для создания нового белка токсина, обладающего требуе- 27025208 мыми свойствами. Таким образом, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов создаются из популяции родственных в отношении последовательностей полинуклеотидов, которые содержат области последовательностей, имеющие существенную идентичность, и могут быть гомологично рекомбинированы invitro или in vivo. Например, с помощью данного подхода мотивы последовательностей, которые кодируют представляющий интерес домен, могут быть перетасованы между геном токсина согласно изобретению и другими генами токсинов с целью получения нового гена, кодирующего белок с улучшенным представляющим интерес свойством, таким как повышенная инсектицидная активность. Методики подобных перестановок в ДНК известны в данной области техники. Другим механизмом для получения измененных белков дельта-эндотоксинов является обмен или перетасовка доменов. Домены II и III могут быть перетасованы между белками дельта-эндотоксинов, что приводит к образованию гибридных или химерных токсинов с улучшенной пестицидной активностью или другим целевым спектром. Методы получения рекомбинантных белков и тестирования их пестицидной активности хорошо известны в данной области техники. Специалист в данной области техники также признает, что ряд известных в данной области техники методов можно использовать для получения одного или более из описанных выше полипептидов. Полипептиды согласно изобретению могут быть химически синтезированными или, как вариант, могут быть получены путем применения стандартных рекомбинантных технологий к гетерологичным экспрессионным системам, таким как Е. coli, дрожжи, насекомые и т.д. Гены бактерий довольно часто содержат множественные метионин-инициаторные кодоны непосредственно вблизи открытой рамки считывания. Часто инициация трансляции на одном или более из этих кодонов приводит к образованию функционального белка. Подобные инициаторные кодоны могут включать АТГ-кодоны. Тем не менее, такие бактерии как виды Bacillus также распознают ГТГ-кодон как стартовый кодон,а белки, которые инициируют трансляцию на ГТГ-кодонах первой аминокислотой содержат метионин. Более того, не часто удается определить априори, какой из этих кодонов будет использоваться бактерией в естественных условиях. Таким образом, становится понятно, что использование одного из альтернативных метиониновых кодонов также может привести к созданию белков токсинов, которые обуславливают пестицидную активность. Эти белки токсинов включены в настоящее изобретение и могут применяться согласно способам настоящего изобретения. Информация из Перечня последовательностей В данной части описания изобретения содержится информация о последовательностях нуклеотидов и полипептидов, подготовленная с помощью программы Patentln Версия 3.5. Отмечено, что приведенные в Перечне последовательностей последовательности биотоксинов отвечают одному или нескольким известным гомологам соответствующих последовательностей. Некоторые последовательности содержат"pfam-домены, которые указывают на отдельные применения. Более детальное описание специфическихpfam-доменов можно найти на различных информационных ресурсах, таких как Интернет-страницы"www.sanger.ac.uk" или "pfam.janelia.org". Таким образом, различные практические применения последовательностей биотоксинов из перечня последовательностей для специалиста в данной области техники являются совершенно очевидными на основе их сходства с известными последовательностями. Приведенные в Перечне последовательностей последовательности биотоксинов отвечают одному или нескольким известным гомологам соответствующих последовательностей. Некоторые последовательности содержат "Pfam-домены, которые свидетельствуют об их пестицидной активности. Свидетельствующие о пестицидной активности Pfam-домены, которые были идентифицированы Заявителями среди последовательностей биотоксинов и описаны здесь, включают EndotoxinM (PF00555) домен, Ricin В lectin (PF00652) домен, Aerolysin (PF01117) домен, Bacthurtoxin (PF01338) домен, ЕТХМТХ 2(PF03318) домен, СВМ 6 (PF03422) домен, BinarytoxB (PF03495) домен, ADPribexoTox (PF03496) домен, EndotoxinC (PF03944) домен, EndotoxinN (PF03945) домен, Toxin10 (PF05431) домен, BotulinumHA-17 (PF05588) домен, CryBPl (PF07029) домен, РАИ (PF07691) домен и Fve (PF09259) домен. В секции "Примечания" Перечня последовательностей приведены аннотации к некоторым последовательностям биотоксинов, в которых указаны некоторые их полезные применения, например, для придания организмам пестицидной активности или борьбы с организмами-вредителями. Таким образом, различные практические применения последовательностей биотоксинов из Перечня последовательностей для специалиста в данной области техники являются совершенно очевидными на основе их сходства с известными последовательностями. Дополнительная информация о возможных применениях последовательностей основана на их сходстве с последовательностями из доступных баз данных. В записях из снкции "Примечания" Перечня последовательностей, помеченных как "NCBI GI:" и "NCBI Desc:", приведена дополнительная информация по соответствующим последовательностям. В некоторых случаях в соответствующих общедоступных записях на Интернет-странице www.ncbi.nlm.nih.gov приводятся публикации, которые содержат данные, свидетельствующие о применении аннотированных последовательностей. Как видно из информации Перечня последовательностей, нуклеотиды и полипептиды согласно изобретению иногда применимы, в зависимости от соответствующей индивидуальной последовательности,- 28025208 для создания трансгенных организмов с одной или более измененными характеристиками, такими как,например, пестицидная активность. В настоящее изобретение дополнительно включены нуклеотиды,которые кодируют описанные выше полипептиды, такие как те, что включены в Перечень последовательностей, а также их комплементарные цепи и/или фрагменты, включая их альтернативные варианты на основе вырожденного генетического кода. Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к интегрированной концепции изоляции и идентификации новых нуклеотидных последовательностей, которые кодируют биотоксины. Под "новыми последовательностями" подразумеваются нуклеотидные последовательности, которые обладают менее, чем 30%-ой идентичностью, предпочтительно - менее, чем 60%-ой идентичностью, более предпочтительно - менее чем 80%-ой идентичностью, наиболее предпочтительно - менее чем 90, 91, 92, 93, 94,95, 96, 97, 98, или 99%-ой идентичностью с любой из последовательностей, используемой для сравнения. Также включены антитела к полипептидам согласно изобретению или их вариантам или фрагментам. В данной области техники хорошо известен ряд методов и техник для получения антител (смотрите,например, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, N.Y.; U.S. Pat. No. 4,196,265), которые могут быть использованы для получения антител согласно раскрытому здесь изобретению. Применение способа согласно изобретению Описанный здесь способ применим для составления больших метагеномных наборов данных, которые содержат представляющие коммерческую ценность последовательности генов. Способ изоляции и секвенирования внехромосомных нуклеиновых кислот, являющихся специфическими к бактериям, имеет несколько преимуществ над применяемыми на данный момент методами идентификации генов. Вопервых, так как гены идентифицируются по последовательности ДНК, данный способ дает большую возможность идентификации генов, обладающих меньшим сходством по ДНК с известными генами, по сравнению с методом гибридизации. Во-вторых, так как внехромосомный геном микробных штаммов составляет часть от полноразмерного генома (1-20%), это даст возможность быстро отобрать образцы внехромосомных геномов множества родственных и неродственных бактерий и быстро идентифицировать представляющие интерес гены. В-третьих, так как из-за различий во внехромосомном генетическом содержимом существует множество вариаций внутри штамма, данный способ будет очень эффективным для определения основных различий в бактериальных группах. Вдобавок, эффективность данного способа возрастает с расширением имеющегося набора данных по последовательностям. В случае если для отдельно взятого микроорганизма процентное содержание новых выявленных клонов сокращается от 50% до 1%, эффективность описанного здесь способа может возрасти в 3-16 раз по отношению к методу секвенирования полного генома (для размера вставки в 15 т.п.н.). Хотя здесь описаны только специфические виды бактерий, понятно, что способы согласно настоящему изобретению в действительности можно применять ко всем микроорганизмам, которые содержат внехромосомную ДНК, включая виды бактерий и грибов. Внехромосомная ДНК может быть выделена из этих микроорганизмов и обработана согласно настоящему изобретению с целью идентификации новых генов токсинов. Более того, понятно, что не обязательно выделить и/или очищать микробные клетки с целью изоляции и анализа содержимого внехромосомной ДНК, то есть, данный способ можно применять к образцам, взятым из смешанных популяций, или образцам неизвестного происхождения, таким как образцы природного происхождения. Соответственно, в некоторых реализациях изобретения предложены новые системы для скрининга смешанных популяций микроорганизмов, обогащенных образцов либо их изолятов на наличие полинуклиотидов, которые кодируют молекулы, обладающие токсической активностью, в случае, если микробные образцы, штаммы или изоляты содержат, по меньшей мере, один ген токсина, который несет внехромосомная ДНК Способ(ы) согласно настоящему изобретению дает возможность выявления новых молекул токсинов in vitro и, в частности, новых молекул токсина, полученных из некультивированных или культивированных образцов Применяя способ(ы) согласно настоящему изобретению можно выделить, секвенировать и провести скрининг больших популяций внехромосомной ДНК При желании способ(ы) согласно настоящему изобретению может позволить провести скрининг и идентифицировать invitro полинуклеотиды и кодируемые этими полинуклеотидами полипептиды, принадлежащие широкому диапазону образцов природного происхождения. В другой реализации внехромосомные нуклеиновые кислоты из совокупности изолятов после индивидуального выделения можно объединить с целью создания популяции внехромосомных нуклеиновых кислот, которые подходят для последующего секвенирования, сборки, аннотации и идентификации генов. И, наоборот, перед этапом выделения ДНК можно объединить совокупность микробных изолятов,что в конечном итоге тоже приводит к созданию популяции внехромосомных нуклеиновых кислот. Для получения объединенной популяции внехромосомных нуклеиновых кислот можно объединить две или более популяции внехромосомных нуклеиновых кислот. Микроорганизмы, из которых может быть выделена внехромосомная ДНК, включают прокариотические микроорганизмы, такие как Eubacteria и Archaebacteria, низшие эукариотические микроорганизмы, такие как грибы, водоросли и простейшие Микроорганизмы могут являться культивированными