Рекомбинантный ген m вируса гриппа b, кодирующий белок m1 с мутацией m86v

Изобретение обеспечивает ген М вируса гриппа В (РНК-сегмент 7), кодирующий белок M1 с мутацией M86V, и рекомбинантный вирус гриппа В, содержащий белок M1 с мутациейM86V. Мутация M86V приводит к увеличению скорости роста вируса гриппа В. Предложенный рекомбинантный вирус гриппа В может быть использован при изготовлении вакцины для профилактики или лечения инфекции вируса гриппа B. Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к гену М вируса гриппа В, включающего модификацию по меньшей мере одного нуклеотида, расположенного вблизи N-конца гена М, в частности, в любом одном из положений от 265 до 294 нуклеотидной последовательности гена М, а также к вирусу гриппа В, включающего указанный модифицированный ген М. Уровень техники Эпидемии и пандемии, вызываемые вирусными заболеваниями, все еще уносят человеческие жизни и сотрясают мировую экономику. Миллионы потерянных рабочих дней и посещений докторов, сотни тысяч госпитализаций во всем мире (Couch 1993, Ann. NY. Acad. Sci 685;803,), десятки тысяч дополнительных смертей (CollinsLehmann 1953 Public Health Monographs 213:1; Glezen 1982 Am.J.Public Health 77:712) и миллиарды евро в переводе на расходы по здравоохранению, все это происходит благодаря гриппу (Williams et al. 1988, Ann. Intern. Med. 108:616). Оба вируса А и В в прошлом вызывали такие эпидемии у людей, поэтому помимо поверхностных антигенов вируса А важным компонентом любой вакцины, эффективной для снижения заболеваемости гриппом, также являются и поверхностные антигены вируса В. Вирусы гриппа принадлежат семейству Orthomyxoviridae и характеризуются сегментированными геномами, представленными негативными цепями RNA, общие размеры которых составляют от 13,6 до 14,6 т.п.о., соответственно. Геномные вирусные RNA для передачи вируса должны быть упакованы в вирусные частицы. Для RNA-содержащих вирусов способ, с помощью которого собираются вирусные частицы потомства и возникают белок/белковые взаимодействия, является сходным. Образование вирусных частиц обеспечивает эффективный перенос RNA-генома от одной клетки хозяина к другой в одном хозяине или в различных организмах хозяина. Вирионы гриппа состоят из внутреннего рибонуклеопротеинового ядра (спиралеобразного нуклеокапсида), содержащего геном, состоящий из одноцепочечной RNA, и внешней липопротеиновой оболочки, выстланной внутри матриксным белком (M1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из восьми молекул линейных одноцепочечных RNA негативной полярности, которые кодируют одиннадцать (некоторые штаммы гриппа А - десять) полипептидов, включающих RNA-зависимые RNA-полимеразные белки (РВ 2, РВ 1 и РА) и нуклеопротеин (NP),который образует нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (M1, M2 или ВМ 2); два поверхностных гликопротеина, которые составлены из оболочки, содержащей липид: гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA); неструктурный белок (NS1) и белок, обеспечивающий экспорт в ядро (NEP). Большинство штаммом гриппа А также кодируют одиннадцатый белок (PB1-F2), который, как считают, обладает проапоптотическими свойствами, тогда как только вирусы гриппа В экспрессируют белок NB, который может давать вклад в вирулентность вируса (Hatta and Kawaoka, 2003, J. Virol., 77, 6050-6054). Существуют и дополнительные небольшие различия между вирусами гриппа А и В в стратегиях экспрессии их генных продуктов, кодируемых вирусными сегментами генов NA и М (Lamb and Horvath, 1991, TrendsGenet. 7:261-266). Показаны значительные биологические и эпидемиологические различия, заключающиеся в практически полном удерживании вирусов гриппа В у людей, хотя уже были исследования по выделению вируса гриппа В из тюленей, которые указывают на то, что также могут существовать более крупные резервуары различных организмов. Вирусы гриппа А имеют очень широкий спектр носителей инфекции, включающий многих птиц и видов млекопитающих. Транскрипция и репликация генома происходит в ядре, а сборка осуществляется путем отпочковывания от плазматической мембраны. Вирусы могут пересортировывать гены во время смешанных инфекций. Вирус гриппа адсорбируется через НА сиалилолигосахаридами гликопротеинов и гликолипидов клеточной мембраны. После эндоцитоза вириона внутри клеточной эндосомы происходит конформационное изменение в молекуле НА, которое облегчает слияние мембран, инициирующее, таким образом,снятие оболочки. Нуклеокапсид перемещается в ядро, где происходит транскрибирование вируснойmRNA. Вирусная mRNA транскрибируется с помощью уникального механизма, в котором вирусная эндонуклеаза отщепляет кэппированный 5'-конец от клеточных гетерологичных mRNA, которые затем служат в качестве праймеров для транскрипции матриц вирусной RNA с помощью вирусной транскриптазы. Транскрипты терминируются на участках от 15 до 22 оснований от концов их матриц, где последовательности олиго(U) служат сигналами для присоединения участков поли(А). Из восьми молекул вирусных RNA, получаемых таким образом во время репликации гриппа А, шесть являются моноцистронными сигналами, которые транслируются непосредственно в белки, представленные НА, NA, NP и вирусными полимеразными белками, РВ 2, РВ 1 и РА. Другие два транскрипта подвергаются сплайсингу,приводящему к получению двух молекул mRNA от каждого транскрипта, которые транслируются в различных рамках считывания, чтобы образовать M1, M2, NS1 и NEP. Другими словами, восемь сегментов вирусных RNA кодируют одиннадцать белков: девять структурных и два неструктурных белка (NS1 и недавно описанный PB1-F2). Грипп В использует различную стратегию кодировки для 2 белков, а именно NB и ВМ 2. Первый из них транслируется из перекрывающейся рамки считывания гена NA, а последний экспрессируется через перекрывающийся стоп-старт кодон гена М. В настоящее время вакцинация считается лучшим способом защиты людей от гриппа. Если здоровых взрослых людей иммунизируют, то современные вакцины предотвращают клиническое заболевание в 70-90% случаев. Этот уровень снижается до 30-70% у людей старше 65 и снижается еще ниже у людей старше 65, проживающих в домах престарелых (Strategic Perspective 2001: The Antiviral Market. Datamonitor. p. 59). Частые изменения вирусных антигенов вносят дополнительный вклад в большой список умерших, так как даже ежегодная вакцинация не может гарантировать защиту. Вакцинацию проводят с помощью имеющихся в продаже химически инактивированных (убитых) или живых аттенуированных противогриппозных вакцин. К сожалению, инактивированные вакцины едва ли могут вызывать перекрестную защитную иммунную реакцию и, поэтому, вакцинный штамм должен точно соответствовать антигенным свойствам будущего неизвестного пандемического штамма. Считают, что вирусы гриппа, дефектные по репликации, преодолевают проблемы безопасности,связанные с "раздеванием" вируса. Это могут быть мутанты вируса гриппа А, имеющие делеции белкаNS1. Отсутствие белка NS1 делает этот вирус дефектным по репликации в дыхательных путях вакцинированных млекопитающих. После интраназального введения вакцинный вирус способен запускать абортивную инфекцию в тканях слизистых оболочек без эффекта "раздевания" вируса. В то же время вирус стимулирует локальный цитокиновый ответ и вызывает защитную иммунную реакцию, опосредованную В- и Т-клетками. Для вирусов гриппа В необходима главным образом трудоемкая и требующая много времени адаптация для достижения значительного роста на клетках Vero. Мутанты гриппа В NS1, которые способны реплицироваться с высокими титрами на клетках Vero и которые помимо этого обладают интерферончувствительным фенотипом вследствие уничтожения функции NS1, в литературе описаны не были. В настоящее время опубликована только одна работа, относящаяся к вирусу гриппа В с полной потерейNS1 ORF, который неэффективно реплицируется в клетках Vero (титры, составляющие 1,7-2,5102 БОЕ/мл, с использованием множественности заражения 0,1, и отсутствие детектируемых титров при множественности заражения 0,001, соответственно. Dauber et. al; Journal of Virology, Feb. 2004, p. 18651872). Делеционный мутант вируса гриппа В NS1, состоящий из 16 концевых аминокислот, также является высокоаттенуированным в отношении репликации с максимальными титрами, составляющими примерно 104 БОЕ/мл.(Hai et. al; Journal of Virology ; Nov2008, p. 10580-90). Ввиду необходимости разработки вакцинных композиций высокой безопасности, содержащих антигенные соединения вируса гриппа В, существует огромная потребность в усовершенствовании штаммов вирусов гриппа В, которые аттенуированы вследствие уничтожения функции NS1, но которые все еще демонстрируют способность к быстрому росту в клеточной культуре. Раскрытие изобретения Для клинических изолятов вирусов гриппа В обычно необходима трудоемкая и требующая много времени адаптация, чтобы достичь значительного роста на клетках Vero. В случае вирусов гриппа А не только вирусы дикого типа, но также и мутанты, экспрессирующие укороченный белок NS1, состоящий,например, из 38 аминокислот, или мутанты, полностью утратившие NS1 ORF, способны к репликации с высокими титрами на клетках Vero, дефицитных по интерферону. Эту находку использовали для того,чтобы получить живую аттенуированную вакцину против вируса гриппа А, дефектную по репликации. До настоящего времени эту концепцию не применяли в отношении вирусов гриппа В из-за неспособности мутантов с нефункциональным белком NS1 расти с высокими титрами в тканевой культуре. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что способность к росту может быть значительно увеличена с помощью модификации выбранных нуклеотидов, находящихся вблизи N-концевой части гена М генома вируса гриппа В. Ген М вирусов гриппа В имеет приблизительную длину, составляющую 1,076 т.п.о., и включает ORF для M1 и ВМ 2. Изобретение также охватывает рекомбинантные вирусы гриппа В, включающие указанный выше модифицированный ген М. Предпочтительно вирусы гриппа В являются дефектными по репликации или, по меньшей мере, являются аттенуированными, например, из-за делеций в белке NS1. В частности, настоящее изобретение охватывает рекомбинантный штамм вируса гриппа В, включающий модификацию в любой одной из аминокислот в положении 82-90, предпочтительно в любой одной из аминокислот в положении 85-87, предпочтительно в аминокислоте в положении 86 в белке M1,модифицированный сегмент NS1, кодирующий NS1, утративший функциональный RNA-связывающий домен и С-концевой домен, и необязательно молчащую мутацию в нуклеотиде в положении 950 гена М. Кроме того, настоящее изобретение охватывает вакцинные композиции, содержащие вирус по изобретению и способы профилактического лечения гриппа, а также охватывает способы изготовления вируса, по изобретению. Настоящее изобретение также охватывает выделенную в чистом виде нуклеиновую кислоту, кодирующую ген М по изобретению вируса гриппа, и ее получение. Краткое описание фигур Фиг. 1 - схематический профиль трансляции генов NS вируса гриппа В дикого типа, NS-14, NS-38,NS-57 и NS-80 (а) и дикого типа и NS1 (b). Фиг. 2 - продукты RT-PCR гена NS указанных вирусов, экспрессирующих белок NS1, состоящий из 14, 38, 57, 80 аминокислот, или NS1 дикого типа, соответственно. Фиг. 3 - рост вирусов гриппа B/Malaysia, экспрессирующих белок NS1, состоящий из 14, 38, 57 или 80 аминокислот, или NS1 дикого типа, соответственно, на клетках Vero (а) и А 549 (b). Фиг. 4 - титры мутантов вирусов гриппа B/Malaysia с белками NS1, состоящими из 38 или 80 аминокислот, или с белком NS1 дикого типа, содержащим ген М дикого типа или ген M1-M86V, через 6 дней после трансфекции (а) и мутантов B/Florida, содержащих ген NS1, или с белками NS1, состоящими из 38 или 80 аминокислот, или с белком NS1 дикого типа, содержащим ген М дикого типа или генM1-M86V, через 5 дней после трансфекции (b). Фиг. 5 - сравнение аминокислот, кодируемых геном М, исходного смыва B/Malaysia/2506/04 подобного вируса, с геном M1-M86V и другими последовательностями, опубликованными в базе Genebank. Фиг. 6 - рост вирусов гриппа B/Florida, содержащих ген NS1, содержащий мутацию M1-M86V,или вирусов гриппа В дикого типа, содержащих ген NS1 дикого типа, на клетках Vero (а) и А 549 (b). Фиг. 7 - аминокислотная последовательность белка B/Vienna/33/06 M1, содержащего мутациюM86V (отмеченную полужирным шрифтом, SEQ ID No. 1) (а) и белка B/Thringen/02/06 M1, содержащего мутацию M86V (отмеченную полужирным шрифтом, SEQ ID No. 2) (b). Фиг. 8 - краткое описание сконструированных мутантов NS гриппа В. Генетическая композиция всех сконструированных мутантов гриппа В (а); нуклеотидная последовательность гена M1-M86VB/Vienna/33/06 M, SEQ ID No. 3 (b); нуклеотидная последовательность гена M1-M86V B/Vienna/33/06 М и С 950 Т, SEQ ID No. 4 (с); нуклеотидная последовательность гена M1 дикого типа B/Thringen/02/06 М,SEQ ID No. 5 (d); нуклеотидная последовательность гена M1-M86V B/Thringen/02/06 M, SEQ ID No. 6(е); нуклеотидная последовательность гена М 1-С 950 Т B/Vienna/33/06 M, SEQ ID No. 7 (f); нуклеотидная последовательность гена NS для NS14 B/Vienna/33/06, SEQ ID No. 8 (g); нуклеотидная последовательность гена NS для NS38 B/Vienna/33/06, SEQ ID No. 9 (h); нуклеотидная последовательность гена NS дляNS57 B/Vienna/33/06, SEQ ID No. 10, (i); нуклеотидная последовательность гена NS для NS64B/Vienna/33/06, SEQ ID No. 11 (j); нуклеотидная последовательность гена NS для NS80 B/Vienna/33/06,SEQ ID No. 12 (k); нуклеотидная последовательность гена NS для NS1-В B/Vienna/33/06, SEQ ID No. 13(l); нуклеотидная последовательность гена NS для NS1-В B/Thringen/02/06, SEQ ID No. 14 (m); Фиг. 9 - схематический профиль трансляции IL2-экспрессирующих векторов гриппа В с белкамиNS1, состоящими из 38, 80, 104 и 145 аминокислот, соответственно (а); генетическая композиция всех сконструированных IL2-экспрессирующих векторов гриппа В (b); нуклеотидная последовательность генаNS для NS1-38IL2 B/Vienna/33/06, SEQ ID No. 15 (с); нуклеотидная последовательность гена NS дляNS1-80IL2 B/Vienna/33/06, SEQ ID No. 16 (d); нуклеотидная последовательность гена NS для NS1-104IL2B/Vienna/33/06, SEQ ID No. 17 (е); нуклеотидная последовательность гена NS для NS1-145IL2B/Vienna/33/06, SEQ ID No. 18 (f). Фиг. 10 - продукты RT-PCR гриппа B/NS1 дикого типа, вирусов B/NS1-38 и B/NS1-38IL2 после 5 пассажей на клетках Vero. Осуществление изобретения Изобретение обеспечивает изменение нуклеотидной последовательности гена М вируса гриппа В,которая может увеличить способность к росту штамма гриппа В. Такие изменения могут включать делеции и замены. Авторами изобретения было успешно продемонстрировано, что, по меньшей мере, изменение одной единственной аминокислоты в белке M1 гриппа В может приводить к свойствам быстрого роста в клеточной культуре, в частности, в клетках Vero. Это, в свою очередь, может обеспечивать сохранение вирусов, экспрессирующих белки NS1, имеющие длину, укороченную по сравнению с белкамиNS1 дикого типа, или мутантов, несущих в своем составе полную делецию NS1 ORF. В частности, ген М вируса гриппа В в соответствии с настоящим изобретением включает модификацию, по меньшей мере, одного нуклеотида в любом одном из положений 265-294 нуклеотидной последовательности гена М, предпочтительно, по меньшей мере, одного нуклеотида в любом одном из положений 277-285 нуклеотидной последовательности, более предпочтительно по меньшей мере одного нуклеотида в любом одном из положений 280-282 нуклеотидной последовательности. В частности, модифицированный ген М содержит нуклеотиды GTG в положениях 280-282 вместоATG соответствующей последовательности выделенного вируса. Альтернативно модифицированный ген М может также содержать нуклеотиды GTA, GTC, GTT в положениях 280-282. Конечно же, воплощение также охватывает соответствующие кодоны RNA, GUG, GUA, GUC, GUU. В соответствии с альтернативным воплощением настоящего изобретения ген М вируса гриппа В включает по меньшей мере одну модификацию нуклеотида, которая приводит по меньшей мере к одной аминокислотной замене в любом одном из положений аминокислот 82-90, предпочтительно в любом одном из положений аминокислот 85-87, предпочтительно в положении аминокислоты 86 в белке M1. Замененная аминокислота может быть любой аминокислотой; неполярная, гидрофобная аминокислота является предпочтительной. В частности, изменение аминокислоты приводит к замене метионина на валин в положении 86. Конечно же, изобретение охватывает белок M1, включающий, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в любом одном из положений аминокислот 82-90, предпочтительно в любом одном из положений аминокислот 85-87, предпочтительно в положении аминокислоты 86 в белке M1. Замененная аминокислота может быть любой аминокислотой, но предпочтительно неполярной, гидрофобной аминокислотой. В частности, изменение аминокислоты приводит к замене метионина на валин в положении 86. Белок M1 может быть создан с помощью любого метода, известного в этой области техники. Термин "аминокислотная замена" относится к присутствию модифицированной или другой аминокислоты в определенном положении в исходной аминокислотной последовательности этой молекулы. Аминокислотная замена происходит относительно любой другой аминокислоты, которая могла бы находиться в этом положении. Полипептид, который получается в результате изменения аминокислотной последовательности, может включать изменения в посттрансляционных модификациях, таких как гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования или любые другие модификации аминокислот, а также аминокислотную замену. Настоящее изобретение также охватывает рекомбинантный вирус гриппа В, включающий М ген вируса гриппа, по изобретению. В других аспектах вирусы гриппа, дефектные по репликации, содержащие модифицированный ген М в соответствии с изобретением, могут дополнительно содержать модификацию в гене NS, в частности,утрату части или полную утрату белка NS1 (NS1). Вследствие укорачивания или потери экспрессии белка NS1 такие вирусы могут реплицироваться только в клетках, дефицитных по интерферону, но теряют свою способность расти в обычных носителях или организмах. Белок NS1 вируса гриппа А представляет собой полифункциональный белок, который состоит приблизительно из 230 аминокислот и рано и в большом количестве синтезируется при инфекции. Он противодействует противовирусным активностям клетки и является фактором вирулентности. С помощью активности своего С-концевого участка белок NS1 способен ингибировать механизмы процессированияmRNA хозяина. Во-вторых, он облегчает предпочтительную трансляцию вирусной mRNA путем прямого взаимодействия с клеточным фактором инициации трансляции. В-третьих, путем связывания с dsRNA и взаимодействия с предполагаемой клеточной киназой (киназами) белок NS1 способен предотвращать активацию интерферон (IFN-) индуцибельной dsRNA-активируемой киназы (PKR), 2'5'-олигоаденилатсинтетазной системы и цитокиновых транскрипционных факторов. В-четвертых, N-концевая часть NS1 связывается с RIG-I и ингибирует последующую активацию IRF-3, предотвращая транскрипционную индукцию IFN-. Таким образом, белок NS1 ингибирует экспрессию генов INF- или INF-, задерживает развитие апоптоза в инфицированных клетках и препятствует возникновению антивирусного состояния в соседних клетках. Вирусы гриппа В экспрессируют из несплайсированного транскрипта вирусного сегмента NS неструктурный белок, состоящий из 281 аминокислот, называемый NS1-B, который вместе со своим партнером NS1-A обладает способностью связываться с теми же RNA-мишенями и ингибировать активациюPKR in vitro. В противоположность гриппу А, NS1 гриппа В не ингибирует сплайсинг pre-mRNA, но связывается с продуктом интерферон-стимулируемого гена 15 (ISG15) и ингибирует его слияние с клеточными мишенями. Вирусы гриппа А, содержащие модификации в белке NS1, известны в этой области техники. Например, в патенте WO 99/64571 описан полный нокаут сегмента гена NS1, WO 99/64068 раскрывает сегменты гена NS1, которые были частично делетированы. Эти публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки. В настоящее время известны только несколько вирусов гриппа В, содержащих модификации белка NS1, и ни один из этих вирусов, имеющих интерферон-чувствительный фенотип вследствие утраты функции NS1, не растет с высокими титрами на клетках Vero. В настоящем описании описано конструирование таких вирусов с модификациями в белке NS1. В соответствии с настоящим изобретением модификация в белке NS1 может быть делецией, вставкой или заменой по меньшей мере одной аминокислоты, приводящей к дефектному по репликации вирусу гриппа. Предпочтительно модифицированный белок NS1 гриппа В включает делецию по меньшей мере 50% аминокислот NS1, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 90%. Альтернативно функциональность белка NS1 может быть полностью устранена. Белок NS1 вируса гриппа в соответствии с изобретением может утратить функциональный RNAсвязывающий домен. Первичная функция этого домена, локализованного на N-конце белка NS1 (аминокислоты 1-93), состоит в связывании dsRNA и подавлении активации PKR (Dauber et al, J Virol. 2006Dec;80(23):11667-77). В соответствии с изобретением термин "функциональный С-концевой домен" может включать участок белка NS1, который обеспечивает ингибирование механизмов процессирования mRNA хозяина, то есть его активность подавляет IFN-ответ клеток хозяина.NS1 гриппа В, видимо, утрачивает С-концевой эффекторный домен с функцией, сходной с NS1 гриппа А. С-концевой домен белка NS1 (положения аминокислот 84-281) вируса гриппа В в основном отвечает за ингибирование ответа IFN-/ (Dauber et al, J Virol. 2006 Dec;80(23):11667-77). В соответствии с изобретением С-концевой домен белка NS1 гриппа В может стать нефункцио-4 024036 нальным. Этот домен может быть полностью или частично делетированным, а также могут быть заменены или вставлены аминокислоты, а оставшийся домен может быть проанализирован на функциональность, как описано в этой области техники (Dauber et al, J Virol. 2006 Dec;80(23):11667-77). Мутация гена М, по изобретению, обеспечивает генерацию мутантов гриппа В, которые экспрессируют укороченный белок NS1 (например, состоящий менее чем из 80 аминокислот), таким образом несущий чувствительный к интерферону фенотип. Такие мутанты можно было бы особо использовать в качестве живых аттенуированных вакцинных штаммов, обладающих высокой безопасностью и эффективностью. Модификация в гене М по изобретению может, в частности, усиливать способность к росту указанного дефектного по репликации гриппа В. Например, вирус гриппа В, экспрессирующий белок NS1, состоящий из 80 аминокислот (NS1-80), содержащий мутацию M1-M86V, достигал титров в диапазоне от 5105 до 5107 TCID50, тогда как сходный вирус с белком M1 дикого типа растет только до значенийTCID50 3103-3105. Вирусы, содержащие белок NS1, который состоит менее чем из 80 аминокислот, например, 14, 38, 57 или 64 аминокислот, были сохранены только с помощью модификации в гене М по изобретению и росли до титров, составляющих диапазон 1104-3108 TCID50. Мутацию M1-M86V также можно было вводить в другой базовый вирус гриппа В другого генетического подтипа (например, аналогичного Jiangsu/10/03), чтобы подтвердить, что улучшенная способность к росту, в особенности у укороченных мутантов NS1 является скорее универсальным, а не специфичным к штамму свойством. МутацияM1-M86V, по изобретению, в этом базовом вирусе обеспечивает генерацию вируса NS1-В с полностью делетированной NS1 ORP, растущего в клетках Vero до высоких титров в диапазоне от 107 до 108TCID50/мл. В соответствии со специфическим воплощением изобретения рекомбинантный вирус гриппа может включать:c) необязательно молчащую мутацию в положении 950 последовательности нуклеотидов гена М. В альтернативном воплощении изобретения рекомбинантный дефектный по репликации вирус гриппа В также можно применять в качестве средства для экспрессии гетерологичных последовательностей, например, для экспрессии хемокинов или цитокинов, или их фрагментов. В частности, это может быть рекомбинантный вируса гриппа, включающий:c. гетерологичную последовательность, вставленную между донорным сайтом сплайсинга и акцепторным сайтом сплайсинга сегмента гена NS1.d. необязательно молчащую мутацию в положении 950 последовательности нуклеотидов гена М. В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения гетерологичная последовательность экспрессирует цитокины или хемокины, или их фрагменты или производные. Цитокины представляют собой небольшие секретируемые белки, которые опосредуют и регулируют иммунный ответ, воспаление и гемопоэз. Самая большая группа цитокинов стимулирует пролиферацию и дифференцировку иммунных клеток. В эту группу включены интерлейкины, которые являются цитокинами, продуцируемыми лейкоцитами, и интерфероны, которые могут продуцироваться различными типами клеток. Интерфероны (IFN) представляют собой семейство встречающихся в природе гликопротеинов, продуцируемых клетками иммунной системы позвоночных, включающих млекопитающих,птиц, рептилий и рыб, в ответ на инфицирование агентами, такими как бактерии, вирусы, паразиты и опухолевые клетки. У людей существует три основных класса интерферонов. Интерфероны, относящиеся к типу I, включают 14 подтипов IFN-альфа и единственные изоформы IFN-бета, омега, каппа и эпсилон. Интерфероны, относящиеся к типу II, состоят из IFN-гамма, а недавно открытый третий класс состоит из IFN-лямбда с тремя различными изоформами. Клетки Th1 секретируют в основном IL-2, IFN- и TNF-, тогда как клетки Th2, которые важны в гуморальных иммунных реакциях, секретируют цитокины, такие как IL-4, IL-5 и IL-10. Цитокины, относящиеся к типу Th2, опосредуют ответы гиперчувствительности замедленного типа, направленные на внутриклеточные патогены, и ингибируют ответы Th1. Хемокины, исходно происходящие из хемоаттрактантных цитокинов, на самом деле включают более чем 50 участников и представляют собой семейство небольших, индуцибельных, секретируемых белков с небольшой молекулярной массой (6-12 kDa в своей мономерной форме), которые играют решающую роль во время иммунного надзора и воспалительных процессов. В зависимости от своей функции в иммунитете и воспалении, они могут подразделяться на два класса. Воспалительные хемокины продуцируются многими клетками различных тканей, а также лейкоцитами, мигрирующими в ответ на бактериальные токсины и воспалительные цитокины, подобные IL-1, TNF и интерферонам. Их основная функция состоит в рекрутировании лейкоцитов для защиты хозяина и в процессе воспаления. Хоминговые хемокины, с другой стороны, конститутивно экспрессируются в определенных участках лимфоидных тканей. В иммунной системе они управляют перемещением и хомингом лейкоцитов и дендритных клеток. Эти хемокины, как показано для ВСА-1, SDF-1 или SLC, контролируют перемещение и рециркуляцию лимфоцитов в контексте созревания, дифференцировки, активации и обеспечивают их правильный хоминг во вторичных лимфоидных органах. В соответствии с настоящим изобретением было показано, что биологически активные цитокины или хемокины, или производные, или их фрагменты могут стабильно и эффективно экспрессироваться,используя открытую рамку считывания, отличающуюся от ORF, экспрессирующей белок NS1. Альтернативно, дополнительные лидерные последовательности, отличающиеся от природных сигнальных пептидов, могут быть слиты с цитокинами или хемокинами, которые затем могут поддерживать эффективную секрецию белка и демонстрировать высокоэффективную индукцию иммунного ответа in vivo. Неожиданно было обнаружено, что хемокины и цитокины также могут быть эффективно экспрессированы, если аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому цитокину/хемокину слита с частью белка NS1 через аминокислотную последовательность, функционирующую в качестве сигнального пептида, например, это может быть частью мышиного сигнального пептида Ig-каппа. В соответствии с настоящим изобретением гетерологичная последовательность предпочтительно кодирует интерлейкин 2 (IL-2) или его фрагмент или производное. IL-2 включает секреторные сигнальные последовательности и является иммуномодулирующей молекулой, происходящей из Т-клеток, необходимой для клональной экспансии антиген-активируемых Т-клеток. Секреция IL-2 CD4+ Тлимфоцитами обладает множественными биологическими эффектами, такими как индукция пролиферации Т-хелперных и Т-киллерных клеток и стимуляция Т-клеток для продукции других цитокинов. Кроме того, IL-2 также может активировать В-клетки, NK-клетки и макрофаги. Если IL-2 экспрессируется рекомбинантными вирусами, инфицирующими нелимфоидные клетки, его секреция может значительно уменьшить патогенез вирусной инфекции и модифицировать иммунный ответ. Также известно, что IL-2 действует как иммуностимулятор. В соответствии с настоящим изобретением в объем изобретения включен любой фрагмент или производное цитокинов и хемокинов, которые все еще являются биологически активными, то есть демонстрируют иммуномодулирующие активности. Альтернативно, цитокины/хемокины также можно выбирать из группы, состоящей из IL-15, GMCSF, CCL3 или CCL20, или их производных или фрагментов. Альтернативно, это также может быть любым эпитопом или иммуномодулирующим участком изMycobacterium tuberculosis, например, ESAT-6. Альтернативно гетерологичные последовательности также могут включать химерные белки, являющиеся цитокинами или хемокинами или их фрагментами или производными, слитыми с антигенными белками или антигенными пептидами. Слияние может происходить как непосредственно, так и с помощью последовательностей пептидных линкеров, имеющих протяженность по меньшей мере из 4 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере из 5 аминокислот, например, линкерными последовательностями в соответствии с изобретением являются GGGS или GGGGS. Примеры химерных белков IL-2 известны в этой области техники. Например, это может быть IL-2PE40 (где РЕ является экзотоксином A Pseudomonas), DAB389-IL-2 (где DAB является дифтерийным токсином) или IL-2 Вах (где Вах является проапоптотическим белком человека) (Aqeilan R. et al., Biochem.J., 2003, 129-140). В соответствии с настоящим изобретением нуклеотидные последовательности гетерологичных последовательностей, которые вводят в вектор вируса гриппа, дефектного по репликации, демонстрируют по меньшей мере 80% идентичности с их нативными последовательностями, предпочтительно по меньшей мере 85% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности. Таким образом, изобретение включает любую оптимизацию нуклеотидной последовательности с точки зрения использования кодонов. Альтернативно, гетерологичная последовательность может включать эпитопы В-клеток или Тклеток, например, эпитоп В-клеток гемагглютинина (НАТВ) вируса гриппа, например, эпитоп А-петли гемагглютинина (НА) вируса гриппа или его части, или пептиды, представленные одним из иммунодоминантных эпитопов НА, соответствующих аминокислотной последовательности 150-159 (Caton et al.,1982, Cell, 417-427). Эпитоп также может принадлежать ассоциированному с меланомой эндогенному ретровирусу(MERV), как описано в патенте WO 06/119527. В соответствии со специфическим воплощением сегмент гена NS1 может содержать функциональные природные донорные и акцепторные сайты сплайсинга, то есть донорные и акцепторные сайты сплайсинга сохраняются как природные сайты, то есть нуклеотиды не модифицируют с помощью искусственных способов. Любые модификации нуклеотидов в сайтах сплайсинга, встречающихся в природе из-за модификаций вирусов гриппа вследствие адаптаций к окружающей среде или естественного развития штаммов,-6 024036 являются природными модификациями и не попадают под термин "синтетические или искусственные модификации". Альтернативно могут быть изменены последовательности, окружающие донорный сайт сплайсинга и/или расположенные выше акцепторного сайта сплайсинга в направлении против хода транскрипции. Предпочтительно можно проводить изменение или модификацию в пределах 3 нуклеотидов 5'-конца и/или 8 нуклеотидов 3'-конца в области 5'-границы интрона NS, а также 100 нуклеотидов 5'-конца и/или 2 нуклеотидов 3'-конца в области 3'-границы интрона NS. Преимущественным для модификации активности сплайсинга является подход с включением синтетических последовательностей. Если, например, вставка гетерологичной последовательности увеличивает размер интрона NS, то чтобы повысить эффективность сплайсинга и, таким образом увеличить генетическую стабильность рекомбинантного сегмента NS, может быть предпочтительным модифицировать последовательности, окружающие донорные и/или акцепторные сайты сплайсинга. Например, их можно модифицировать так, чтобы изменялась последовательность, окружающая донорный сайт сплайсинга для повышения гомологии с 5'-концом U1 snRNA человека, и/или последовательность, расположенную выше акцепторного сайта сплайсинга в направлении против хода транскрипции, содержащую точку ветвления (lotch et al. 1986, Proc Natl Acad Sci USA. 83:5444-8; Nemeroff et al. 1992, Mol Cell Biol. 12:962-70) и пиримидиновый участок, заменяют последовательностью, которая усиливает сплайсинг сегмента NS. Для оптимизации сплайсинга предпочтительная последовательность, вводимая с 5'-конца акцепторного сайта сплайсинга, включает лариатную консенсусную последовательность и пиримидиновый участок. С точки зрения стабильности вирусного вектора и скорости экспрессии гетерологичной последовательности может быть важным вводить синтетическую/модифицированную последовательность, содержащую лариатную консенсусную последовательность и пиримидиновый участок в специфическом положении в гене NS, например, непосредственно на участке, расположенном выше акцепторного сайта сплайсинга в направлении против хода транскрипции. Кроме того, для того чтобы модифицировать уровень сплайсинга сегмента NS, может быть необходимым варьировать расстояние между лариатной консенсусной последовательностью и пиримидиновым участком, (Plotch S. and Krug R., 1986, Proc.Natl.Acad.Sci., 83, 5444-5448; Nemeroff M. et al., 1992,Mol.Cell.Biol., 962-970). Например, рекомбинантный штамм гриппа В может включать аминокислотную последовательность, показанную в виде SEQ ID. No. 1 или 2, или нуклеотидную последовательность, показанную в виде любой из последовательностей SEQ ID Nos. 3-18, или их производное, имеющее по меньшей мере 98% идентичности последовательности, предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности последовательности, предпочтительно по меньшей мере 99,5%. В соответствии с изобретением термин "рекомбинантный" должен охватывать все штаммы гриппа,которые были получены с помощью рекомбинантных технологий, например, с помощью метода обратной генетики. Поэтому штаммы гриппа в соответствии с изобретением содержат модификацию в гене М,но не нуждаются в каких-либо дополнительных модификациях в нуклеотидной или аминокислотной последовательности, если сравнивать с исходным штаммом. Также изобретение охватывает вакцинную композицию, включающую иммуногенно индуцирующее эффективное количество вируса в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Также в композиции могут содержаться адьюванты. В соответствии с изобретением термин "иммуногенный" означает, что вирус способен вызывать гуморальный или клеточный иммунный ответ и предпочтительно оба ответа. Иммуногенная структура также является антигенной. Иммуногенно индуцирующее эффективное количество вируса вызывает гуморальный или клеточный иммунный ответ и предпочтительно оба ответа, если его вводят животному,предпочтительно человеку. Вакцинную композицию можно применять для профилактики заболевания гриппом, включающей введение пациенту-человеку, нуждающемуся в лечении, иммуногенно индуцирующее эффективное количество композиции. Вакцинные композиции могут содержать полный вирус гриппа В в соответствии с изобретением, но также реассортантные штаммы, в которых часть вирусных сегментов происходит из различных штаммов и сегментов вируса гриппа В, в особенности белок M1 происходит из рекомбинантного вируса гриппа В в соответствии с изобретением. Мутацию M1-M86V по изобретению можно затем вводить в любой другой штамм гриппа В. Композиции могут быть использованы в методах или в качестве лекарственных средств для предупреждения, оказания помощи, обезвреживания, лечения и/или облегчения инфекции вирусом гриппа. Конечно, изобретение включает применение молекулы М вируса гриппа в соответствии с изобретением при изготовлении лекарственного средства для лечения инфекции вирусом гриппа. Иммуногенные композиции могут включать как живой, так и инактивированный вирус гриппа В,относящийся к изобретению. Вирус может быть инактивирован с помощью методов, хорошо известных специалистам в этой области техники. В традиционных методах для инактивации применяют формалин и нагревание. Живая иммуногенная композиция может быть предпочтительной вследствие повышенной иммуногенности. Получение таких живых рекомбинантных иммуногенных композиций может быть выполнено с помощью общепринятых методов, включающих выращивание вируса в клеточной культуре или в оплодотворенных яйцах (например, в оплодотворенных куриных яйцах) с последующей очисткой. Термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный органом управления федерального правительства или правительства штата или зарегистрированный в США. Термин "носитель" относится к разбавителю, адьюванту, эксипиенту или среде, вместе с которыми вводят фармацевтическую композицию (например, иммуногенную или вакцинную композицию). В качестве жидких носителей, в особенности для инъецируемых растворов, также можно использовать солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина. Подходящие эксипиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, натрия стеарат, моностеарат глицерина, тальк, натрия хлорид, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т. д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в книге "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin. Композицию следует выбирать в соответствии со способом введения. Специфическая композиция может зависеть также от того, является ли вирус живым или он инактивирован. Термин "адьювант" относится к соединению или смеси, которая усиливает иммунный ответ на антиген. Профилактический и/или терапевтический эффект иммуногенных композиций по изобретению частично основан на обеспечении или индукции иммунного ответа (например, гуморального иммунного ответа). В одном аспекте иммуногенные композиции индуцируют возникновение детектируемого титра антител к антигенам вируса гриппа В в сыворотке крови как у субъекта, так и в модели гриппа на животных (например, в моделях на мышах, хорьках, крысах или собаках). Титр антитела в сыворотке крови можно определить, используя методики, известные специалисту в этой области техники, например, с помощью иммуноанализов, таких как ELISA, или с помощью тестов ингибирования гемагглютинина. В соответствии с изобретением также включен способ создания вируса, где способ включает применение рекомбинантной экспрессионной системы, которая экспрессирует молекулу М вируса гриппа,по изобретению. В соответствии с настоящим изобретением экспрессионная система может быть любой полезной плазмидой, например, описанной в работе Hoffmann et al. Hoffmann et al. 2000, Proc Natl AcadSci USA. 97:6108-13), или линейной экспрессионной конструкцией в соответствии с ЕР 07450177. Для развития реассортантов и/или экспрессии модифицированных штаммов вируса гриппа может быть использована система обратной генетики в клетках Vero. Технология уже хорошо известна в этой области техники (Pleschka S. et al., 1996, J. Virol., 70(6), 4188-4192, Neumann and Kawaoka, 1999, Adv. Virus Res., 53, 265-300, Hoffmann et al. 2000, Proc Natl Acad Sci USA. 97:6108-13). Клетки, используемые для культивирования вирусов с помощью среды для культивирования, могут быть любыми клетками, которые растут in vitro в синтетической среде, и могут быть использованы для выращивания вирусов. В настоящем изобретении термин "клетки" означает культивирование индивидуальных клеток, тканей, органов, клеток насекомых, птичьих клеток, клеток млекопитающих, клеток гибридом, первичных клеток, стабильных клеточных линий и/или клеток, созданных с помощью генноинженерных методов, таких как рекомбинантные клетки, экспрессирующие вирус. Они могут быть, например, клетками BSC-1, клетками LLC-MK, клетками CV-1, клетками СНО, клетками COS, мышиными клетками, клетками человека, клетками HeLa, клетками 293, клетками VERO, клетками MDBK, клетками(клетки сетчатки человека), эмбриональными клетками цыплят или производными, клетками оплодотворенных яиц, клетками оплодотворенных куриных яиц или их производными. Предпочтительно клеточная линия является линией клеток VERO. Среда для культивирования, применяемая для получения вирусов, может быть любой средой, известной в предшествующем уровне техники, которую применяют для культивирования вирусов. Предпочтительно среда является синтетической средой. Это может быть, например, основная среда, такая как модифицированная среда Игла MEM, минимальная незаменимая среда MEM, среда Игла в модификации Дюльбекко D-MEM, среда D-MEM-F12, Е-среда Вильямса, среда RPMI и их аналоги и производные. Это также может быть специальной средой для культивирования клеток и роста вирусов, такой как VP-SFM,OptiPro SFM, среда AIM V, HyQ SFM4MegaVir, EX-CELL Vero SFM, EPISERF, ProVero, любая среда для клеток 293 или СНО и их аналоги и производные. Эти среды могут быть дополнены любыми добавками, известными в предшествующем уровне техники, которые применимы для культивирования клеток и вирусов, например, сывороткой крови животных и ее фракциями или аналогами, аминокислотами, факторами роста, гормонами, буферами, микроэлементами, трипсином, натрия пируватом, витаминами, L-глутамином и биологическими буферами. Предпочтительно среда является OptiPRO SFM, дополненной L-глутамином и трипсином. С помощью модификации гена М по изобретению скорость роста мутантов гриппа В с укороченным NS1 может быть увеличена, по меньшей мере, примерно в 100-1000 раз, как показано для вирусаNS1-38, где вирусные титры (TCID50) немодифицированных и улучшенных генов М могут быть сравнимыми по величине. Для вирусов гриппа В, экспрессирующих белок NS1, состоящий из 14, 57 или 80 аминокислот, соответственно, мутация в гене М совершенно необходима для размножения таких вирусов. Такие вирусы могут расти вплоть до титров, составляющих примерно 106-108 TCID50. Еще одно воплощение изобретения представляет собой полученную в чистом виде нуклеиновую кислоту, кодирующую ген М вируса гриппа, по изобретению, и/или рекомбинантный вирус гриппа В,содержащий модифицированный ген М. Кроме того, изобретение включает способ получения указанной нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением, где способ включает введение нуклеотидной последовательности в вектор, кодирующий молекулу М изобретения. Если применяют DNA-вектор, то указанный вектор представляет собой систему транскрипции для минус-смысловой RNA вируса гриппа. Например, он может быть вектором, который был применен в работе Hoffmann et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA. 97:6108-13. Описание, приведенное ниже, будет полностью понятным путем отсылки к следующим примерам. Такие примеры, однако, являются иллюстрацией способов осуществления одного или нескольких воплощений настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Пример 1. Вирусы гриппа В, экспрессирующие укороченные белки NS1, для применения в качестве дефектной по репликации живой аттенуированной противогриппозной вакцины. Создавали систему обратной генетики для конструирования адаптированного к клеткам Vero штамма вируса гриппа В (B/Vienna/33/06, субтипированного как B/Malaysia/2506/04) как представителя линии B/Victoria/2/87 (Hoffmann et. al. 2000, PNAS 97(11):6108-13). НА и NA клонировали из вируса гриппа B/Thringen/02/06 (B/Jiangsu/10/03-like). Путем введения кодирующей мутации в белке M1 (замена метионина на валин в положении 86 аминокислотной последовательности), можно получить мутанты вируса гриппа, экспрессирующие укороченный вариант белка NS1, состоящего из 14, 38, 57 и 80 аминокислот, которые были названы B/Malaysia NS1-14, NS1-38, NS1-57 или NS1-80, соответственно. Трансляцию NS1 прекращали с помощью двух последовательных стоп-кодонов в рамке считывания и удаляли нетранслируемую часть, расположенную ниже стоп-кодонов по ходу транскрипции до сигнальной последовательности сплайсинга NEP (фиг. 1 а). Из-за различного размера гена NS вирусы, содержащие белки NS1 различной длины можно было различать в соответствии с их размером с помощью RT-PCR (фиг. 2). Все созданные мутанты реплицировались с высокими титрами на дефицитных по интерферону клетках Vero (фиг. 3 а), но были аттенуированы на интерферон-компетентных клетках А 549 (фиг. 3b). Модификация в гене М по изобретению может, в частности, усиливать способность к росту указанных дефектных по репликации вирусов гриппа В. Например, по результатам анализа, проведенного через 6 дней после трансфекции ,вирус гриппа В, экспрессирующий белок NS1, состоящий из 80 аминокислот(NS1-80), содержащий мутацию M1-M86V, растет с титрами, составляющими примерно 5,62104 TCID50,в противоположность титрам, составляющим примерно 1,33104 TCID50, сходного вируса, который не содержит какую-либо модификацию в M1 (фиг. 4 а). Вирус гриппа В, экспрессирующий белок NS1, состоящий из 38 аминокислот (NS1-38), вообще не может быть сохранен без адаптивной мутации M1, но растет до средних титров, составляющих примерно 3,16102 TCID50, если введена мутация M1-M86V(фиг. 4 а). Этот эффект был еще более выражен при втором пассаже после трансфекции, что отражено в титрах (табл. 1). Такую же эффективность сохранения наблюдали в случае вирусов гриппа В, экспрессирующих белок NS1, состоящий из 14 или 57 аминокислот, соответственно, которые сохранялись только в присутствии мутации M1-M86V (данные не приведены). Последующие адаптивные пассажи на клеткахVero приводили к высоким титрам всех мутантов NS1 в диапазоне величин log TCID50, равным 6,5-8,5,которые необходимы для эффективного получения вакцин (фиг. 3 а). Мутация, по изобретению, может иметь лишь небольшой эффект на рост вирусов с NS1 дикого типа или не обладать никаким эффектом вовсе. Спустя 6 дней после трансфекции, вирус гриппа В с NS1 дикого типа, содержащий немодифицированный ген М, растет даже с немного более высокими титрами, чем аналогичный вирус, содержащий мутацию M1-M86V (табл. 1). Это можно объяснить вариациями роста между различными пассажами, как показано для случаев роста в первом пассаже после трансфекции (TCID50 1,78107) для гена М дикого типа, в сравнении с TCID50, составляющим 2,82107, для M1-M86V, оба вируса содержали ген NS дикого типа). Таблица 1 Титры вирусов (TCID50) гриппа В с NS80 дикого типа или NS38-белком NS1 в комбинации либо с геном М дикого типа, либо с M1-M86V геном М спустя 4 дня после трансфекции анализировали во 2-ом пассаже после трансфекции. Таким образом, только эта новая мутация обеспечивает размножение мутантов вируса гриппа В,которые экспрессируют укороченный белок NS1 (то есть, включающий менее 80 первых N-концевых аминокислот) с нефункциональным NS1, который, следовательно, несет чувствительный к интерферону фенотип. Такие мутанты могли бы применяться в качестве вакцинных штаммов. Эта мутация никогда не была описана ранее и не была обнаружена в базе данных секвенирования NIBSC. Фиг. 5 демонстрирует сравнение последовательности гена М исходного смыва штамма, подобного B/Malaysia/2506/04, с геномM1-M86V и другой последовательности, опубликованной в базе данных Genebank. Пример 2. Мутация в белке M1 (M86V), по изобретению, обеспечивает размножение вирусов гриппа В с укороченными белками NS1 на клетках Vero в различных линиях гриппа В. Чтобы проанализировать мутацию M1-M86V в других штаммах вируса гриппа В, создавали систему обратной генетики для размножения вируса гриппа B/Thringen/02/06 (подобного B/Jiangsu/10/03) как представителя линии B/Yamagata/16/88, и вводили описанную мутацию в белок M1 (M86V). В соответствии с рекомендациями WHO, касающихся вакцинных штаммов гриппа, предназначенных для сезона 2008/2009 в северном полушарии, применяли НА и NA вируса, подобного B/Florida/04/06. Были получены мутанты вируса гриппа В, экспрессирующие укороченный вариант белка NS1, состоящего из 38 и 80 аминокислот, или мутант с полной делецией в NS1 ORF (NS1-В) (фиг. 1b), в котором NS2/NEP экспрессируется в виде моноцистройной RNA, которые были названы B/Florida NS1-38, NS1-80 или NS1-В,соответственно. Как было в случае мутантов B/Malaysia, представителя линии B/Victoria/2/87, мутацияM1-M86V оказывала лишь небольшое воздействие на способность к сохранению вирусов B/Florida NS180 и NS1 дикого типа, представителей линии Yamagata (фиг. 4b). Это было продемонстрировано с помощью немного повышенных титров спустя 5 дней после трансфекции по сравнению с мутантами, содержащими ген М дикого типа (фиг. 4b). Вирусные титры мутанта NS1-38, содержащего мутацию M1M86V, были примерно выше на 4 порядка, чем у аналогов с M1 дикого типа. Из-за мутации M1-M86V нам удалось сохранить вирус NS1-В, который достигал титров, составляющих 4 log спустя 5 дней после трансфекции (фиг. 4b). Чтобы продемонстрировать дефектный по репликации фенотип вируса NS1-В, мы исследовали его способность расти на IFN-дефицитных клетках Vero (фиг. 6 а) и IFN-компетентных клетках А 549(фиг. 6b) в сравнении с соответствующим вирусом дикого типа. Оба вируса демонстрировали сравнимую кинетику роста на клетках Vero и достигали титров в диапазоне 107-108 TCID50/мл. Репликация вирусаNS1-В была полностью ограничена в IFN-компетентных клетках А 549, которые демонстрировали отсутствие роста выше предела детекции, составляющего 2102 TCID50/мл, тогда как вирус с NS1 дикого типа реплицировался с высокими титрами, составляющими 3,15108 TCID50/мл. Мутантные вирусы NS180 и NS1-38 демонстрировали промежуточную способность к репликации (данные не приведены). Эти результаты показывают, что адаптивная мутация M1 не только обладает эффектом, оптимизирующий рост, в одном штамме вируса, но видимо также эффективна в других линиях вируса гриппа В. Кроме того, результаты показывают, что эта мутация необходима для сохранения вируса NS1-В, растущего с высокими титрами на клетках Vero, у которого полностью удалена NS1 ORF. Таким образом,это универсальная концепция для размножения дефектных по репликации вирусов гриппа В, механизм аттенуации которых основан на удалении NS1, главного антагониста интерферона. Пример 3. Вектор вируса гриппа В из гена NS, экспрессирующий интерлейкин 2 человека с помощью стратегии бицистронной экспрессии, в качестве потенциальной живой аттенуированной противогриппозной вакцины с улучшенной иммуногенностью, в особенности для пожилых людей. Кассету (TAATG), перекрывающую стоп-старт кодон, а затем последовательность, кодирующуюIL2 человека, вставляли после положений 38, 80, 104 или 145 аминокислот белка NS1 вируса гриппа В,соответственно. Кроме того, синтетическая последовательность из 29 нуклеотидов, включающая лариатную консенсусную последовательность, за которой следует оптимизированный сайт сплайсинга, удлиненный участок, состоящий из 20 пиримидиновых оснований (opt. splice), заменяет часть между стопкодоном IL2 и акцепторным сайтом сплайсинга NS2 (ЕР 7450176.8) (фиг. 9 а). С помощью введения мутации белка M1 (M86V), по изобретению, нам удалось сохранить вирусB/NS1-38IL2 гриппа В в базовом вирусе гриппа B/Thringen/02/06 (подобного B/Jiangsu/10/03). Без модификаций, по изобретению, в белке M1 такой вирус нежизнеспособен. Хотя рост B/NS1-38IL2 был слегка снижен по сравнению с "пустым" вектором B/NS1-38, был достигнут титр, превышающий 6 log10TCID50/мл (табл. 2). Этот исходный материал затем пассировали пять раз на клетках Vero, чтобы контролировать генетическую стабильность. Не было обнаружено появление мутантов с делецией, как было показано по присутствию полос в RT-PCR с ожидаемым размером гена NS без появления более низкомолекулярных полос PCR, которые потенциально отражают присутствие делеционных мутантов (фиг. 10). Клетки Vero, инфицированные B/NS1-38IL2, секретировали высокий уровень, составляющий более чем 2,5 мкг/мл IL2, в противоположность недетектируемому уровню IL2 в неинфицированных клетках(имитация), клетках, инфицированных B/NS1-38 или B/NS1 дикого типа (табл. 2). Такие векторы можно было бы использовать в качестве живых противогриппозных вакцин с повышенной иммуногенностью, в особенности для пожилых людей, как уже было показано для вируса гриппа A (Ferko, Kittel et al 2006). Таблица 2. Репликация в клетках Vero и уровни экспрессии IL2 человека для указанных вирусов Мы исследовали иммуногенность созданных вирусов во всех 3 примерах. Из этих результатов мы сделали вывод, что мутация M1-M86V, по изобретению, не оказывает негативного влияния на иммуногенность сконструированных вирусов, как было показано с помощью результатов по сравнительной иммуногенности соответствующих вирусов гриппа А. Список последовательностей ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Рекомбинантный ген М вируса гриппа В (РНК-сегмент 7), кодирующий белок M1, который включает замену по меньшей мере одного нуклеотида в триплете 280-282, которая приводит к замене метионина в положении 86 последовательности белка M1 на валин, где указанная замена в гене М обусловливает увеличенную скорость роста вирусов гриппа В, имеющих укороченные белки NS1 и предназначенных для производства вакцин. 2. Ген М вируса гриппа В (РНК-сегмент 7) по п.1, включающий нуклеотиды GTG, GTA, GTC, GTT,GUG, GUA, GUC, GUU в положениях 280-282. 3. Рекомбинантный вирус гриппа В, включающий белок M1, кодируемый геном по п.1. 4. Вирус гриппа В по п.3, где указанный вирус является реассортантным вирусом. 5. Вирус гриппа В по любому из пп.3 или 4, где вирус является аттенуированным или дефектным по репликации, предпочтительно полностью дефектным по репликации. 6. Вирус гриппа В по любому из пп.3-5, включающий модифицированный ген NS1 (РНК-сегмент 8), кодирующий белок NS1, утративший функциональный РНК-связывающий домен и функциональный С-концевой домен. 7. Вирус гриппа В по любому из пп.3-6, включающий молчащую мутацию в положении 950 нуклеотидной последовательности гена М (РНК-сегмента 7). 8. Вирус гриппа В по любому из пп.3-7, включающий гетерологичную последовательность, кодирующую хемокины, цитокины или их производные или фрагменты, вставленную между донорным сайтом сплайсинга и акцепторным сайтом сплайсинга гена NS1 (РНК-сегмента 8). 9. Вирус гриппа В по любому из пп.3-8, включающий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, 4, 7-12 или 15. 10. Вирус гриппа В по любому из пп.3-8, включающий любую нуклеотидную последовательность,представленную в SEQ ID NO: 6 или 16-18. 11. Вирус гриппа В по любому из пп.3-8, включающий полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или ее производной, идентичной по меньшей мере на 98%. 12. Вирус гриппа В по любому из пп.3-8, включающий полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или ее производной, идентичной по меньшей мере на 98%. 13. Вакцинная композиция для профилактики или лечения инфекции вируса гриппа В, включающая иммуногенно индуцирующее эффективное количество вируса по любому из пп.3-12 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. 14. Применение вируса гриппа В по любому из пп.3-12 для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения инфекции вируса гриппа В.