Способ получения высококонцентрированного препарата иммуноглобулина для подкожного применения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННОГО ПРЕПАРАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ПОДКОЖНОГО ПРИМЕНЕНИЯ Изобретение относится к способам получения композиции концентрированного G (IgG). Изобретение позволяет получить стабильный, с высокой степенью очистки вирусинактивированный, готовый к использованию продукт с высокой концентрацией IgG. Перекрестные ссылки на родственные заявки По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США No. 61/181606, поданной 27 мая 2009 г., которая специально включена в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Уровень техники Иммуноглобулиновые продукты из плазмы человека впервые были использованы в 1952 г. для лечения иммунодефицита. Сначала способами выбора были способы внутримышечного или подкожного введения IgG. Однако для инъекционного введения больших количеств IgG, необходимых для эффективного лечения различных заболеваний, были созданы продукты для внутривенного введения с более низкими концентрациями IgG (50 мг/мл). Обычно иммуноглобулин (IVIG) для внутривенного введения содержит смешанный иммуноглобулин G (IgG) из плазмы более чем тысячи доноров крови. Обычно содержащие более чем 95% немодифицированного IgG, который обладает интактными Fc-зависимыми эффекторными функциями и содержит только следовые количества иммуноглобулина A (IgA) или иммуноглобулина М (IgM), IVIG представляют собой стерильные, очищенные IgG продукты, используемые преимущественно при лечении трех основных категорий медицинских состояний: 1) иммунодефицитов,таких как Х-связанная гаммаглобулинемия, гипогаммаглобулинемия (первичные иммунодефициты) и состояния приобретенного ослабленного иммунитета (вторичных иммунодефицитов), характеризующиеся низкими уровнями содержания антител; 2) воспалительных и аутоиммунных заболеваний и 3) острых инфекций. Целый ряд коммерческих поставщиков IVIG предлагает разнообразные IVIG продукты. По сравнению с использовавшимися ранее лиофилизированными IVIG продуктами, содержащими только 50 мг/мл белка в растворе после повторного растворения, последние разработки представляют собой 100-мг/мл готовые к использованию, стерильные, жидкие препараты высокой степени очистки концентрированных человеческих IgG антител. Так как IgG продукты, такие как IVIG, получают из смешанной человеческой плазмы, загрязнение патогенами из донорской крови (особенно вирусами, которые, как известно, вызывают у людей различные заболевания) представляет собой серьезную проблему для процесса производства. Другим важным фактором, связанным с IgG продуктами, является их стабильность при хранении,особенно для готовых к использованию препаратов. По сравнению с IVIG препараты иммуноглобулинов для подкожного введения отличаются тем преимуществом, что их можно использовать для домашнего лечения, и тем, что они создают меньше побочных эффектов. Для уменьшения недостатка, связанного с небольшим объемом инъекции препарата на сайт, преимуществом была бы более высокая концентрация препарата IgG (например, препарата, содержащего 200 вместо 100 мг/мл). В четвертом выпуске ряда основополагающих публикаций, касающихся получения и свойств белков сыворотки и плазмы Cohn et al. (J. Am. Chem. Soc, 1946, 68(3): 459-475) впервые описали способы спиртового фракционирования плазменных белков (способ 6), которые позволяют выделять из человеческой плазмы фракции с высоким уровнем содержания IgG. Несколько лет спустя Oncley et al. (J. Am.Chem. Soc., 1949, 71(2): 541-550) расширили способы Кона и опубликовали способ (способ 9), который обеспечивает выделение более чистых IgG препаратов. Указанные способы, хотя и лежали в основе всей индустрии получения факторов крови из плазмы,были не способны обеспечить получение IgG препаратов, обладающих достаточно высокими концентрациями, для лечения ряда связанных с иммунитетом заболеваний, включая синдром Кавасаки, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру и первичные иммунодефициты. Как таковые, были разработаны дополнительные методологии, использующие различные технологии, такие как ионообменная хроматография,для получения IgG препаратов с более высокой степенью чистоты и в более высоких концентрациях. Норре et al. (Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752) и Falksveden (Swedish Patent No. 348942) иFalksveden and Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980) были среди первых, кто использовал для этой цели ионообменную хроматографию. В различных современных способах используют стадию осаждения, такую как осаждение каприлатом (Lebing et al., Vox Sang 2003 (84): 193-201) и фракционирование Кона (I+)II+III осаждение этанолом(Tanaka et al., Braz J. Med Biol. Res 2000 (33)37-30) совместно с колоночной хроматографией. Совсем недавно Teschner et al. (Vox Sang, 2007 (92):42-55) раскрыли способ получения 10% IVIG продукта, в котором криоосадок сначала удаляют из смешанной плазмы и затем осуществляют модификацию CohnOncley, фракционирование холодным этанолом, с последующей S/D обработкой промежуточного продукта, с использованием ионообменной хроматографии, нанофильтрации и необязательно ультрафильтрации/диафильтрации. Однако, несмотря на повышенную степень чистоты, безопасность и выходы, достигаемые указанными способами получения IgG, все еще остается необходимость в препаратах IgG более высоких концентраций, пригодных для подкожного и/или внутримышечного введения. Настоящее изобретение удовлетворяет указанным и другим потребностям и раскрывает способ получения стабильного, с высокой степенью очистки вирус-инактивированного, готового к использованию продукта с высокой концентрацией IgG. Сущность изобретения В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет собой способ получения композиции концентрированного G (IgG). В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет водную композицию, содержащую более чем около 180 г белка на 1 л указанной композиции, где по меньшей мере 95% белка представляет собойIgG, такой как человеческий IgG. В некоторых вариантах осуществления указанную композицию получают способом, обеспечивающим получение продукта, пригодного для подкожного и внутривенного введения, и который можно обрабатывать при повышенной температуре в конечном контейнере для инактивации вирусов, независимо от того, какая из концентраций установлена в интервале значений концентраций от 10 до 22% белка. В некоторых случаях, концентрация белка в указанной композиции составляет точно или около 20% (мас./об.). В других случаях указанная композиция может дополнительно содержать около 0,1-0,3 М глицин. Указанная композиция настоящего изобретения может иметь различные значения рН, такие как около 3-6 или около 4-6. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ получения композиции концентрированного IgG из плазмы при усовершенствовании, включающем стадии: (1) концентрирования белка в препарате плазмы до точно или около 5% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации и (2) дальнейшего концентрирования белка в препарате до точно или около 20% (мас./об.) с помощью диафильтрации. По меньшей мере 95% белка в указанной композиции составляет IgG, такой как человеческий IgG. В некоторых вариантах осуществления стадию (1) осуществляют, используя ультрафильтрационную мембрану с номинальным отсечением по молекулярной массе (NMWCO) 100 кДа или менее. В других вариантах осуществления стадию (2) осуществляют против диафильтрационного буфера глицина с рН 4,20,1. Диафильтрационный буфер в некоторых случаях представляет собой 0,25 М глицин и рН 4,0. В некоторых конкретных вариантах осуществления концентрация белка после стадии (2) оказывается выше, чем 20% (мас./об.) и затем ее доводят до точно или около 20% (мас./об.), добавляя диафильтрационный буфер. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ получения композиции концентрированного IgG из плазмы, включающий стадии:(1) выделения жидкости и осадка из плазмы путем центрифугирования;(2) смешивания предварительно охлажденного этанола с жидкостью со стадии (1) до образования смеси, в которой концентрация этанола составляет точно или около 8% (об./об.);(3) выделения жидкости и осадка из смеси (2) путем центрифугирования;(4) доведения рН и концентрации этанола в жидкости со стадии (3) до точно или около 7,0 и 20-25%(об./об.), соответственно формируя тем самым смесь;(5) выделения жидкости и осадка из смеси (4) путем центрифугирования;(6) повторного суспендирования осадка со стадии (5) в буфере при отношении точно или около 1:15 по массе до получения суспензии;(7) смешивания диоксида кремния (SiO2) с суспензией со стадии (6) и получения фильтрата путем фильтрования;(8) смешивания детергента и холодного спирта с фильтратом, полученным на стадии (7), и получения осадка путем центрифугирования;(9) растворения осадка в водном растворе, содержащем растворитель или детергент, и выдерживания полученного раствора в течение по меньшей мере 60 мин;(10) пропускания раствора, полученного после стадии (9), через катионообменную хроматографическую колонку и элюирования белков, адсорбированных в колонке, в элюат;(11) пропускания элюата, полученного на стадии (10), через анионообменную хроматографическую колонку до получения элюата;(12) пропускания указанного элюата через нанофильтр до получения нанофильтрата;(13) пропускания полученного нанофильтрата через ультрафильтрационную мембрану до получения ультрафильтрата;(14) диафильтрации ультрафильтрата против диафильтрационного буфера до получения раствора с концентрацией белка точно или около 20% (мас./об.);(15) стерилизации раствора, полученного на стадии (14), путем фильтрования полученного раствора через фильтр 0,2 мкм или менее, с получением, таким образом, композиции концентрированного IgG. В некоторых вариантах осуществления стадию (2) осуществляют при температуре от около -2 до 0 С; или смесь со стадии (2) перемешивают в течение по меньшей мере 15 мин и затем выдерживают в течение по меньшей мере 2 ч при температуре от около -2 до 0 С. В некоторых вариантах осуществления стадии (4) перемешивание осуществляют в течение по меньшей мере 15 мин и затем выдерживают в течение по меньшей мере 8 ч при температуре точно или около -7 С. В некоторых вариантах осуществления суспензию со стадии (6) перемешивают в течение около 40-160 мин при температуре от около 2 до 8 С и при рН точно или около 5,0; или диоксид кремния на стадии (7) имеет концентрацию 40 г/кг суспензии со стадии (6) и перемешивание осуществляют при температуре от около 2 до 8 С в течение по меньшей мере около 50 мин. В некоторых вариантах осуществления стадию (8) осуществляют при температуре от около -5 до -10 С. В некоторых вариантах осуществления полученный раствор со стадии (9) включает 1,0% (об./об.) Triton Х-100, 0,3% (об./об.) Tween-80 и 0,3% (об./об.) три(н-бутил)фосфата(TNBP). В некоторых вариантах осуществления полученный раствор со стадии (9) выдерживают при температуре от около 18 до 25 С. В некоторых вариантах осуществления катионообменную хроматографическую колонку на стадии (10) промывают 10 мМ ацетатным буфером с рН 5,50,1 и элюируют буфером 35 мМ одноосновного фосфата натрия, 10 мМ Tris, рН 8,50,1, с проводимостью 5,00,2 мс/см. В некоторых вариантах осуществления рН элюата, полученного на стадии (10), доводят до 6,40,2 и значение проводимости доводят до от около 1,5 до 2,5 мс/см перед стадией (11). В некоторых вариантах осуществления элюат со стадии (11) пропускают через фильтр с размером пор 0,2 мкм или меньше перед стадией (12). В некоторых вариантах осуществления концентрация белка в ультрафильтрате со стадии(13) составляет точно или около 51% (мас./об.). В других вариантах осуществления номинальная отсечка по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны (NMWCO) со стадии (13) составляет 50 кДа или менее, в некоторых вариантах осуществления диафильтрационный буфер со стадии (14) представляет собой 0,25 М глициновый раствор с рН 4,20,1. В других вариантах осуществления концентрация белка в растворе, полученном на стадии (14), выше чем 20% (мас./об.), и затем ее доводят до точно или около 20,40,4% (мас./об.), используя диафильтрационный буфер. В некоторых вариантах осуществления стадии (13) и (14) осуществляют при температуре от около 2 до 8 С. В других вариантах осуществления способ получения дополнительно включает стадию распределения стерилизованного раствора со стадии(15) в контейнеры в стерильных условиях перед тем, как контейнеры запаивают. В других вариантах осуществления описанный выше способ может дополнительно содержать стадию хранения запаянных контейнеров при температуре от около 30 до 32 С в течение около 21-22 дней; или указанный способ может дополнительно включать стадию получения продукта, содержащего 20%IgG, такого же стабильного, как и используемая в настоящее время 10% композиция для внутривенного применения. В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет водную композицию, которая содержит по меньшей мере 18% (мас./об.) иммуноглобулина, например по меньшей мере 20% (мас./об.) иммуноглобулина. В следующем аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения пациента с иммунодефицитом, аутоиммунным заболеванием или с острой инфекцией, включающий введение пациенту эффективного количества указанной композиции, как раскрыто выше. Краткое описание фигур Фиг. 1 представляет собой графическую иллюстрацию новой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы. Определения. Термин "антитело" относится к полипептиду, в основном кодируемому геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулина, или их фрагментами, которые специфически связывают и распознают аналит (антиген). Распознаваемые гены иммуноглобулина включают каппа, лямбда, альфа, гамма, бета,эпсилон и мю гены константных областей так же, как и огромное число вариабельных областей генов иммуноглобулина. Легкие цепи классифицируют или как каппа, или как лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулина, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. В качестве примера структурная единица иммуноглобулина (антитела) состоит из двух пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну "легкую" (около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь(около 50-70 кДа). N-конец каждой из цепей определяет вариабельную область, состоящую из около 100110 или более аминокислот, в основном отвечающий за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (VL) и вариабельная тяжелая цепь (VH) относятся к легкой и тяжелой цепям соответственно. Термин "ультрафильтрация (UF)" охватывает различные способы мембранной фильтрации, в которых гидростатическое давление заставляет жидкость проходить через полупроницаемую мембрану. Суспендированные твердые вещества и солюты с высокой молекулярной массой задерживаются, тогда как вода и низкомолекулярные солюты проходят через такую мембрану. Указанный процесс разделения часто используют для очистки и концентрирования макромолекулярных (103-106 Да) растворов, особенно белковых растворов. Доступен целый ряд ультрафильтрационных мембран в зависимости от размера молекул, которые они удерживают. Ультрафильтрация обычно характеризуется размерами пор мембран от 1 до 1000 кДа и рабочим давлением от 0,01 до 10 бар, и в основном ее используют для отделения коллоидоподобных белков от мелких молекул, таких как сахара и соли. Термин "диафильтрация" относится к использованию таких же мембран, как и для ультрафильтрации, и представляет собой тангенциальную проточную фильтрацию. Во время диафильтрации буфер вводят в рециркуляционный резервуар, тогда как фильтрат удаляют из рабочей установки. В процессах, в которых продукт представляет собой ретентат (например, IgG), диафильтрация приводит к вымыванию компонентов продуктового пула в фильтрат, тем самым изменяя буферы и уменьшая концентрацию не-3 023382 желательных веществ. Как использовано в данном описании, выражение "около" означает приблизительный интервал величиной плюс или минус 10% от указанного значения. Например, выражение "около 20%" охватывает интервал 18-22%. Термин "смешивание" описывает действие, которое вызывает равномерное распределение двух или более различных соединений или веществ в растворе или суспензии с использованием любых способов перемешивания. Указанный термин "смешивание", как использовано в данном описании, не требует полного равномерного распределения всех ингредиентов в растворе или суспензии. В данном описании термин "растворитель" включает любое жидкое вещество, способное растворять или диспергировать одну или более других субстанций. Растворитель может быть неорганическим по природе, таким как вода, или он может быть органической жидкостью, такой как этанол, ацетон, метилацетат, этилацетат, гексан, петролейный эфир и т.д. Как использовано в данном описании, в выражении "обработка детергентным растворителем" растворитель означает органический растворитель (например, три-N-бутилфосфат), который представляет собой часть смеси детергентного растворителя, используемого для инактивации вирусов в липидной оболочке в растворе. Термин "детергент" в данном описании используют взаимозаменяемо с термином "поверхностноактивное вещество" или "поверхностно-активный агент". Поверхностно-активные вещества представляют собой конкретные органические соединения, которые являются амфифильными, то есть содержащими как гидрофобные группы ("хвосты"), так и гидрофильные группы ("головы"), что обеспечивает поверхностно-активным веществам растворимость как в органических растворителях, так и в воде. Поверхностно-активные вещества можно классифицировать по присутствию формально заряженных групп в их "головах". Неионные поверхностно-активные вещества не содержат заряженных групп в своих "головах", тогда как ионные поверхностно-активные вещества содержат заряды в своих "головах". Цвиттерионные поверхностно-активные вещества содержат "головы" с двумя противоположно заряженными группами. Некоторые примеры обычных поверхностно-активных вещества включают: анионные (на основе сульфатного, сульфонатного или карбоксилатного анионов): перфтороктаноатные (PFOA или PFO),перфтороктансульфонатные (PFOS), натрийдодецилсульфатные (SDS), аммонийлаурилсульфатные и другие алкилсульфатные соли, натрийлаурилсульфат (известный так же, как SLES), алкилбензолсульфонат; катионные (основанные на катионах четвертичного аммония): цетилтриметиламмонийбромид(СТАВ) а.k.a. гексадецилтриметиламмонийбромид и другие алкилтриметиламмонийные соли, цетилпиридинийхлорид (СРС), полиэтоксилированный амин животного жира (РОЕА), бензалконийхлорид(ВАС), бензетонийхлорид (BZT); длинноцепочечные жирные кислоты и их соли: включая каприлат, каприловую кислоту, гептаноат, гексановую кислоту, гептановую кислоту, наноевую кислоту, декановую кислоту и т.п.; цвиттерионные (амфотерные): додецилбетаин; кокамидопропилбетаин; кокоамфоглицинат; неионные: алкилполи(этиленоксиды), алкилфенолполи(этиленоксиды), сополимеры поли(этиленоксида и поли(пропиленоксида), (под коммерческими названиями полоксамеры или полоксамины), алкилполигликозиды, включая октилгликозид, децилмальтозид, жирные спирты (например, цетиловый спирт и олеиловый спирт), кокамид МЕА, кокамид DEA, полисорбаты (Tween 20, Tween 80 и т.д.),детергенты Triton и додецилдиметиламиноксид. Как использовано в данном описании, термин лечение "внутривенным введением IgG" или "IVIG" относится, как правило, к терапевтическому способу внутривенного, подкожного или внутримышечного введения композиции IgG иммуноглобулинов пациенту для лечения ряда состояний, таких как иммунодефициты, воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания. IgG иммуноглобулины обычно представляют собой смешанные и полученные из плазмы. Можно использовать целые антитела или их фрагменты. IgG иммуноглобулины можно приготовить в более высоких концентрациях (например,больше чем 10%) для подкожного введение, или приготовить для внутримышечного введения. Это особенно характерно для специальных IgG препаратов, которые получают с более высокими титрами, нежели средние титры для специфических антигенов (например, Rho D фактора, коклюшного токсина, столбнячного токсина, токсина ботулизма, бешенства и т.д.). Для простоты обсуждения такие композиции IgG для подкожного или внутримышечного введения также включены в термин "IVIG" в данном описании. Под выражениями "терапевтически эффективное количество или доза" или "достаточное/эффективное количество или доза" подразумевают такую дозу, которая вызывает эффекты, для создания которых ее и вводят. Точная величина дозы будет зависеть от цели лечения, и будет определяться специалистом с использованием известных методик (см., например, Lieberman, Pharmaceutical DosagePickar, Dosage Calculations (1999) и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003,Gennaro, Ed., Lippincott, WilliamsWilkins; описания которых включены в данное описание посредством ссылки во всей полноте для всех целей). Подробное описание предпочтительного варианта осуществления изобретения В соответствии с обычной практикой в современной медицине, стерилизованные концентрированные препараты иммуноглобулинов (особенно IgG) используют для лечения медицинских состояний, попадающих в три основных класса: иммунодефициты, воспалительные и аутоиммунные заболевания и острые инфекции. Один из обычно используемых IgG продуктов, внутривенного иммуноглобулина илиIVIG, приготавливают для внутривенного введения, например, в 10% концентрации. Концентрированные иммуноглобулины можно также приготовить для подкожного или внутримышечного введения, например, в точной или около 20% концентрации. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции концентрированного G (IgG), включающему стадии:(А) концентрирования первого раствора, содержащего IgG, до концентрации белка от 2 до 10%(мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, где первая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (NMWCO) 100 кДа или менее, таким образом получая первый IgG концентрат;(B) диафильтрации первого IgG концентрата диафильтрационным буфером с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая первый IgG диафильтрат;(C) концентрирования первого IgG диафильтрата до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая второй IgG концентрат;(D) сбора второго IgG концентрата из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы;(E) промывки первой ультрафильтрационной мембраны путем рециркуляции буфера, прошедшего промывку, через первую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, где первую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему промывают объемом буфера, прошедшего промывку,равному по меньшей мере двукратному мертвому объему первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, таким образом получая первый IgG раствор, прошедший промывку;(F) переноса первого IgG раствора, прошедшего промывку, из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы во вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, содержащую вторую ультрафильтрационную мембрану, где площадь поверхности второй ультрафильтрационной мембраны меньше, чем площадь поверхности первой ультрафильтрационной мембраны, и где вторая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (NMWCO) 100 кДа или менее;(G) концентрирования первого IgG раствора, прошедшего промывку, до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей вторую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая третий IgG концентрат;(Н) объединения третьего IgG концентрата из второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы со вторым IgG концентратом, таким образом получая композицию концентрированного IgG. Вариантом указанного способа является способ, где первый раствор, содержащий IgG, концентрируют на стадии (А) до концентрации белка 51% (мас./об.). Другим вариантом указанного способа является способ, где первая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с открытой сеткой или где первая ультрафильтрационная мембрана или вторая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (NMWCO) 90 кДа или менее. Другим вариантом указанного способа является способ, где первая ультрафильтрационная мембрана и вторая ультрафильтрационная мембрана является мембранами с номинальным отсечением по молекулярной массе (NMWCO) 90 кДа или менее. Еще одним вариантом указанного способа является способ, где первая ультрафильтрационная мембрана и вторая ультрафильтрационная мембрана является мембранами с номинальным отсечением по одинаковой молекулярной массе (NMWCO). Другим вариантом указанного способа является способ, где диафильтрационный буфер содержит от 0,2 до 0,3 М глицина и имеет величину рН 4,20,1. Еще одним вариантом указанного способа является способ, где второй IgG концентрат имеет концентрацию белка по меньшей мере 22% (мас./об.). Другим вариантом указанного способа является способ, где площадь поверхности второй ультрафильтрационной мембраны составляет не более десятой части площади поверхности первой ультрафильтрационной мембраны. Другим вариантом указанного способа является способ, где концентрация IgG, полученного на стадии (Н), более чем 20% (мас./об.). Вариантом указанного способа является способ, где рН композиции концентрированного IgG, полученной на стадии (Н), составляет от 4,0 до 6,0. Еще одним вариантом указанного способа является способ, дополнительно содержащий стадии:(I) промывки второй ультрафильтрационной мембраны путем рециркуляции буфера, прошедшего промывку, через вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, таким образом получая второй IgG раствор, прошедший промывку; и(J) регулирования концентрации белка композиции концентрированного IgG, полученной на стадии(Н), путем добавления по крайней мере одной части второго IgG раствора, прошедшего промывку, в композицию концентрированного IgG, полученную на стадии (Н). Другим вариантом указанного способа является способ, в котором IgG представляет собой человеческий IgG. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции концентрированного G (IgG), включающему стадии:(A) концентрирования первого раствора, содержащего IgG, до концентрации белка 51% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая первый IgG концентрат, причем первая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (NMWCO) 60 кДа или менее;(B) диафильтрации первого IgG концентрата диафильтрационным буфером с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая первый IgG диафильтрат, причем диафильтрационный буфер содержит глицин и имеет величину рН 4,20,1;(C) концентрирования первого IgG диафильтрата до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая второй IgG концентрат;(D) сбора второго IgG концентрата из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы;(E) промывки первой ультрафильтрационной мембраны путем рециркуляции буфера, прошедшего промывку, через первую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, таким образом получая первый IgG раствор, прошедший промывку, причем буфер, прошедший промывку, имеет объем, равный по меньшей мере двукратному мертвому объему первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы;(F) сбора первого IgG раствора, прошедшего промывку, из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы во вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, содержащую вторую ультрафильтрационную мембрану, причем вторая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (NMWCO) 60 кДа или менее;(G) концентрирования первого IgG раствора, прошедшего промывку, до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей вторую ультрафильтрационную мембрану, где площадь поверхности второй ультрафильтрационной мембраны составляет не более десятой части площади поверхности первой ультрафильтрационной мембраны, таким образом получая третий IgG концентрат;(Н) объединения третьего IgG концентрата из второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы со вторым IgG концентратом, таким образом получая композицию концентрированного IgG;(I) промывки второй ультрафильтрационной мембраны путем рециркуляции буфера, прошедшего промывку, через вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, таким образом получая второй IgG раствор, прошедший промывку; и(J) регулирования концентрации белка композиции концентрированного IgG, полученной на стадии(Н), путем добавления по крайней мере одной части второго IgG раствора, прошедшего промывку, в композицию концентрированного IgG, полученную на стадии (Н). В другом аспекте настоящее изобретение относится к новому и усовершенствованному способу получения композиций иммуноглобулина с высокой степенью очистки и с высокой концентрацией из смешанной плазмы. В сравнении с использованными ранее способами очистки и концентрирования IgG,авторы изобретения включили стадии ультрафильтрации и приготовления препарата, что обеспечило более высокие концентрации IgG без значительных потерь IgG и при сохранении низких значениях рН в конечной композиции. Обычно концентрация белка в таких продуктах составляет по меньшей мере 18% мас./об., огромное большинство которого (обычно не менее 95%) представляет собой IgG, и рН находится в интервале значений рН 3-6, что облегчает инактивацию патогенов, таких как вирусы, которые могут присутствовать в плазме. Благодаря высокой концентрации IgG и поэтому уменьшенного вводимого объема, продукты настоящего изобретения пригодны для подкожного и/или внутримышечного введения. В некоторых вариантах осуществления IgG продукты имеют вязкость не более чем 18 мПас, и поэтому их также можно использовать для внутривенного введения. Благодаря возможности комбинирования качественных характеристик продуктов для внутривенного введения с требуемой высокой концентрацией для продуктов подкожного и внутримышечного введения, простое разведение также может обеспечить внутривенное введение. Дальнейшим преимуществом IgG композиций настоящего изобретения является то, что они обладают превосходной стабильностью при хранении. В некоторых аспектах настоящее изобретение предоставляет способы получения высококонцентрированных IgG препаратов с конечными концентрациями белка выше, чем около 17% и степенью чистотыIgG по меньшей мере около 95%. В некоторых вариантах осуществления указанные препараты обладают продленной стабильностью и приготовлены для внутривенного, подкожного и/или внутримышечного введения. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет фармацевтические композиции и препараты IgG композиций, созданные в соответствии с предложенным в настоящем изобретении усовершенствованным способом получения. В некоторых вариантах осуществления указанные композиции и препараты обеспечивают улучшенные свойства по сравнению с другими IVIG композициями, существующими на рынке в настоящее время. Например, в некоторых вариантах осуществления предоставленные в данном описании композиции и препараты являются стабильными в течение длительного промежутка времени, в другом варианте осуществления предоставленные в данном описании композиции и препараты характеризуются более высокими концентрациями IgG по сравнению с другими IVIG композициями,существующими на рынке в настоящее время, еще в других вариантах осуществления предоставленные в данном описании композиции и препараты характеризуются более высокими концентрациями IgG и являются стабильными в течение более длительного промежутка времени. В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения иммунодефицита, воспалительных и аутоиммунных заболеваний и острых инфекций, включающий введение IgG композиций,полученных с использованием предоставленных в настоящем изобретении способов.I. Получение концентрированного очищенного препарата IgG.IVIG композиции, включающие целые антитела, раскрыты для лечения некоторых аутоиммунных состояний (см., например, патентные публикации США 2002/0114802, США 2003/0099635 и США 2002/0098182). Раскрытые в указанных ссылках IVIG композиции включают поликлональные антитела. Как правило, препараты иммуноглобулина в соответствии с настоящим изобретением можно получить из любых подходящих исходных материалов, например, из восстановленной плазмы или из источников плазмы. В конкретном примере кровь или плазму отбирают у здоровых доноров. Обычно кровь собирают из образцов тех же видов животных, что и субъект, которому должен быть введен препарат иммуноглобулина (обычно называемый "гомологичными" иммуноглобулинами). Такие иммуноглобулины выделяют из крови, используя соответствующие процедуры, такие как, например, осаждение (спиртовое фракционирование или полиэтиленгликольное фракционирование), хроматографические способы(1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93-102 (1967); патенты США 5122373 и 5177194; описания которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей). В отличие от раскрытых выше способов в одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способы получения концентрированных IgG композиций, в которых используют криочистые исходные материалы. Обычно в предложенных в данном описании способах используют как модифицированные стадии Cohn-Oncley спиртового фракционирования, так и ионообменную хроматографию для достижения превосходных IgG выходов, при этом сохраняя такое же, если не улучшенное, качество, которым характеризуются доступные в настоящее время коммерческие IVIG препараты. Во многих случаях, иммуноглобулин получают из содержащих гаммаглобулин продуктов путем спиртового фракционирования и/или используя способы ионообменной и аффинной хроматографии,которые хорошо известны специалистам в данной области. Обычно используют очищенную фракцию Кона II. Исходная паста фракции Кона II обычно содержит точно или около 95% IgG и включает четыре подтипа IgG. Во фракции II присутствуют различные подтипы примерно в таких же отношениях, которые существуют в собранной человеческой плазме, из которой они получены. Фракцию II далее очищают перед формированием в продукт, который можно вводить. Например, пасту фракции II можно растворить в холодном очищенном водном растворе спирта, и примеси удалить путем осаждения и фильтрования. После окончательного фильтрования суспензию иммуноглобулина можно подвергнуть диализу или диафильтрации (например, используя ультрафильтрационные мембраны с отсечением по номинальной молекулярной массе менее чем или равному 100000 Да) для удаления спирта. Полученный раствор можно концентрировать или разбавить до достижения необходимой концентрации белка и затем очистить способами, известными специалистам в данной области. Препаративные стадии можно использовать для обогащения конкретным изотипом или подтипом иммуноглобулина. Например, хроматографию на протеин А-, протеин G- или протеин Н-сефарозе можно использовать для обогащения иммуноглобулинов в отношении IgG или в отношении специфических IgG подтипов (см.Harlow и Lane, Using Antibodies Cold Spring Harbor Laboratory-Press (1999); Harlow and Lane, Antibodies,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); патент США 5180810). Как будет подробно раскрыто ниже, высококонцентрированные IgG продукты настоящего изобретения получают способом, который содержит много таких же или похожих стадий, что и стадии способа получения IVIG. Дополнительные стадии ультрафильтрации/диафильтрации с использованием открытоканальных мембран, со специфически сконструированными методами последующей промывки (postwash) и составления фармацевтической композиции в конце процесса получения, обеспечивают получение IgG композиций с концентрацией белка (200 мг/мл), что примерно в два раза выше существующих в настоящее время концентраций IVIG (например, GAMMAGARD LIQUID) без влияния на выход и стабильность при хранении. С большинством коммерчески доступных ультрафильтрационных мембран невозможно достичь концентрации IgG 200 мг/мл без существенных потерь белка. Указанные мембраны быстро забиваются и поэтому трудно осуществить адекватную последующую промывку. Поэтому приходится использовать конфигурации с открытоканальными мембранами. Даже с открытоканальными мембранами необходимо использовать специфически сконструированную методику последующей промывки для достижения необходимой концентрации без значительных потерь белка (потерь, менее чем 2%). Еще более удивительным является тот факт, что концентрации белка выше, чем 200 мг/мл не влияют на эффективность инактивации вирусов на стадии хранения с низкими значениями рН. Общий способ получения высококонцентрированных IgG композиций включает следующие стадии. А. Выделение криоосадков. Процесс очистки обычно начинается с оттаивания ранее замороженной смешанной плазмы, которую уже проверили на безопасность и определили качественные параметры. Оттаивание обычно осуществляют при температуре не выше 6 С. Затем осуществляют центрифугирование или фильтрацию на холоде для разделения твердой части и жидкости после того, как плазма оттает, обычно при той же температуре, при которой плазму оттаивают. Жидкую часть (также называемую "криосупернатантной плазмой", после удаления нерастворимого в холодном состоянии белка путем центрифугирования или фильтрования из только что оттаявшей плазмы) затем обрабатывают на следующей стадии. В это время можно осуществить различные дополнительные стадии для выделения фактора восемь, ингибитора байпас активности (FEIBA), фактора IX-комплекса, фактора VII-концентрата или антитромбинового IIIкомплекса, что подробно раскрыто в примере I. В. Получение надосадочной жидкости после фракционирования I. На этой стадии криосупернатантную плазму обычно охлаждают до точно или около 01 С и рН доводят до точно или около 7,0. В некоторых вариантах осуществления рН доводят до значений от около 7,0 до около 7,5, предпочтительно от точно или около 7,1 до точно или около 7,3, наиболее предпочтительно точно или около 7,2. В одном варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,0. В другом варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,1. В другом варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,2. В другом варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,3. В другом варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,4. В другом варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,5. Затем добавляют предварительно охлажденный этанол, причем плазму при этом перемешивают, до достижения необходимой концентрации этанола 8% об./об. В то же время, температуру дополнительно снижают до температуры от около -4 до около 0 С, предпочтительно до около -2 С для осаждения примесей, таких как 2-макроглобулин, 1A- и C-глобулины, фибриноген и фактор VIII. Обычно процесс осаждения включает время выдерживания по меньшей мере около 1 ч, хотя можно также использовать более длительные или более короткие промежутки времени. Затем надосадочную жидкость (надосадочная жидкость I), которая в идеале обогащена IgG, присутствующем в криосупернатантной плазме, собирают путем центрифугирования, фильтрации или другим подходящим способом.C. Осадок со стадии фракционирования II+III. Для дальнейшего увеличения содержания IgG и степени чистоты фракционирования, надосадочную жидкость I подвергают второй стадии осаждения. Обычно рН полученного раствора доводят до значения рН от около 6,8 до около 7,2, предпочтительно точно или около 7,0. Затем при перемешивании к полученному раствору добавляют спирт, предпочтительно этанол, до достижения конечной концентрации спирта от около 20% до около 25% (об./об.). В одном варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 20%. В другом варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 21%. В другом варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 22%. В другом варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 23%. В другом варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 24%. В другом варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 25%. Жидкую часть, называемую также фракцией II+III, надосадочной жидкости, можно дополнительно обработать, чтобы экстрагировать фактор V. Осадок, полученный на этой стадии, обрабатывают затем на следующей стадии, причем в одном варианте осуществления стадии В и С можно также осуществлять вместе.D. Экстрагирование осадка после фракционирований II и III/ Для повторного суспендирования осадка фракции II+III используют холодный экстракционный буфер обычно в отношении 1 ч. осадка в 15 ч. экстракционного буфера. В качестве примера экстракционный буфер содержит 5 мМ одноосновного фосфата натрия и 5 мМ ацетата, значение его рН составляет точно или около 4,50,2 и проводимость составляет точно или около 0,7-0,9 мс/см. В одном варианте осуществления проводимость экстракционного буфера составляет точно или около 0,7 мс/см. В другом варианте осуществления проводимость экстракционного буфера составляет точно или около 0,8 мс/см. В еще одном варианте осуществления проводимость экстракционного буфера составляет точно или около 0,9 мс/см. Экстракционный процесс осуществляют при температуре точно или около 2-8 С. Можно использовать и другие подходящие отношения при повторном суспендировании, например от около 1:8 до около 1:30, или от около 1:10 до около 1:20, или от около 1:12 до около 1:18, или от около 1:13 до около 1:17, или от около 1:14 до около 1:16. В некоторых вариантах осуществления отношения при повторном суспендировании могут составлять точно или около 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14,1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30 или выше. Подходящие растворы для экстрагирования осадка II+III обычно имеют рН от около 4,0 до около 5,5. В некоторых вариантах осуществления полученный раствор имеет рН от около 4,0 до около 5,0. В другом варианте осуществления полученный раствор имеет рН от около 4,5 до около 5,0. В других вариантах осуществления экстракционный раствор имеет рН около 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9,5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5. В одном варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 4,5. В другом варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 4,6. В другом варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 4,7. В другом варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 4,8. В другом варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 4,9. В другом варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 5,0. Проводимость экстракционного буфера предпочтительно составляет от около 0,5 мс-см-1 до около 2,0 мс-см-1. Например, в некоторых вариантах осуществления проводимость экстракционного буфера составляет точно или около 0,5 мс-см-1, или точно или около 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6,1,7, 1,8, 1,9, или около 2,0 мс-см-1. Специалистам в данной области известно, как получить экстракционные буферы с соответствующей проводимостью.E. Обработка высокодисперсным диоксидом кремния и фильтрование. В некоторых вариантах осуществления к суспензии с последней стадии добавляют высокодисперсный диоксид кремния (например, Aerosil 380 или эквивалент) до концентрации точно или около 40 г/кг в суспензии, или эквивалентно 1,8 г/л криосупернатантной плазмы. Перемешивание продолжают при температуре около 2-8 С в течение по меньшей мере 50-70 мин, в некоторых случаях добавляют вспомогательное фильтрующее вещество (например, Hyflo-Supper-Cel от World Minerals, которое используют в концентрации точно или около 0,5 кг/кг суспензии) для облегчения последующей стадии разделения жидкость/твердая часть путем фильтрования. Экстракционный буфер используют для последующей промывки фильтровального пресса. Процесс фильтрования осуществляют при температуре от около 2 до 8 С.F. Фракционирование осадка G. Фильтрат, полученный на последней стадии, затем смешивают с полисорбатом-80 до концентрации точно или около 0,2% мас./об. при перемешивании в течение по меньшей мере 30 мин при температуре от около 2 до 8 С. Затем к полученному раствору примешивают дегидрат цитрата натрия точно или около 8 г/л в течение еще 30 мин перемешивания при температуре от около 2 до 8 С. Затем рН полученного раствора доводят до точно или около 7,00,1. В некоторых вариантах осуществления величину рН регулируют с помощью или гидроксида натрия, или уксусной кислоты. Затем к полученному раствору добавляют холодный спирт до концентрации точно или около 25% об./об. и осуществляют стадию осаждения аналогичную стадии II по Кону.G. Суспензия осадка G. Осадок, полученный на последней стадии, растворяют и фильтруют, используя пористый фильтр с номинальным размером пор 0,2 мкм (например, Cuno VR06 фильтр или эквивалент) перед получением прозрачного фильтрата. В другом варианте осуществления полученный осадок растворяют и затем центрифугируют для выделения осветленной надосадочной жидкости. Н. Обработка растворителем и детергентом. Фильтрат, полученный на последней стадии, используют для обработки растворителем/детергентом. Конкретная смесь для обработки растворителем/детергентом включает 1,0% (об./об.)Triton X-100, 0,3% (об./об.) Tween-80 и 0,3% (об./об.) TNBP, и такую смесь обычно выдерживают при температуре от около 18 до 25 С в течение по меньшей мере 60 мин. Способы детергентной обработки полученных из плазмы фракций хорошо известны специалистам в данной области. В предложенных в данном описании способах обычно можно использовать любую стандартную обработку неионным де-9 023382I. Катионообменная хроматография. Для дальнейшей очистки и концентрирования IgG из S/D обработанного PptG фильтрата можно использовать катионообменную и/или анионообменную хроматографию. Способы очистки и концентрирования IgG с использованием ионообменной хроматографии хорошо известны специалистам в данной области. Например, в патенте США 5886154 раскрыт способ, в котором осадок фракции II+III экстрагируют при низком рН (от около 3,8 и 4,5), с последующим осаждением IgG с использованием каприловой кислоты, и в конце с использованием двух стадий анионообменной хроматографии. В патенте США 6069236 раскрыта схема хроматографической очистки IgG, которая вообще не имеет отношения к осаждению спиртом. В РСТ публикации WO 2005/073252 раскрыт способ очистки IgG, включающий экстрагирование осадка фракции II+III, обработку каприловой кислотой, обработку PEG и одну стадию анионообменной хроматографии. В патенте США 7186410 раскрыт способ очистки IgG, включающий экстрагирование осадка или фракции I+II+III или осадка фракции II с последующей одной стадией анионообмена, осуществляемой при щелочных значениях рН. В патенте США 7553938 раскрыт способ, включающий экстрагирование или осадка фракции I+II+III или осадка фракции II+III, обработку каприлатом и или одну, или две стадии анионообменной хроматографии. В патенте США 6093324 раскрыт способ очистки, включающий использование анионообменной смолы при рН от около 6,0 до около 6,6. В патенте США 6835379 раскрыт способ очистки, основанный на катионообменной хроматографии в отсутствии спиртового фракционирования. В одном варианте осуществления раствор растворитель/детергент, содержащий полученный на последней стадии белок, затем пропускают через катионообменную колонну для удаления растворителя и детергента. После отмывки SD реагентов, абсорбированные белки затем элюируют, используя элюирующий буфер с высоким рН. В одном варианте осуществления рН элюирующего буфера составляет от около 7,5 до около 9,5. В другом варианте осуществления рН элюирующего буфера составляет от около 8,0 до около 9,0. В предпочтительном варианте осуществления рН элюирующего буфера составляет точно или около 8,50,1.J. Анионообменная хроматография. рН элюата, полученного на последней стадии, доводят до 6 и разводят до соответствующего значения проводимости для последующей уравновешенной анионообменной колонны. Поступающий из колонны элюат во время загрузки и промывки собирают для дальнейшей обработки.K. Нанофильтрация. Для дополнительного снижения содержания вирусов в предлагаемой изобретением IgG композиции, элюат, полученный из анионообменной колонны можно подвергнуть нанофильтрации, с помощью соответствующего нанофильтрационного устройства. В некоторых вариантах осуществления средний размер пор нанофильтрационного устройства составляет величину от около 15 до около 200 нм. Примеры нанофильтров, которые можно использовать для этой цели, включают, но без ограничений, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N и 75N (Planova). В конкретном варианте осуществления средний размер пор нанофильтра составляет величину от около 15 до около 72 нм, или от около 19 до около 35 нм, или точно или около 15, 19, 35 или 72 нм. В предпочтительном варианте осуществления средний размер пор нанофильтра составляет точно или около 35 нм,как в фильтре Asahi PLANOVA 35N или его эквивалентах.L. Ультрафильтрация и диафильтрация. После нанофильтрации полученный фильтрат затем концентрируют до достижения концентрации белка 51% мас./об. с помощью ультрафильтрации. В некоторых примерах ультрафильтрацию в кассете с открытоканальным экраном, и отсечкой по номинальной молекулярной массе (NMWCO) ультрафильтрационной мембраны 50 кДа или менее. В одном варианте осуществления нанофильтрат можно концентрировать с помощью ультрафильтрации до концентрации белка от около 2 до около 10% (мас./об.). В некоторых вариантах осуществления ультрафильтрацию осуществляют в кассете с открытоканальным экраном и отсечкой по номинальной молекулярной массе (NMWCO) ультрафильтрационной мембраны менее чем около 100 кДа, или менее чем около 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или меньше кДа. В предпочтительном варианте осуществленияNMWCO ультрафильтрационной мембраны составляет не более чем 50 кДа. После завершения стадии ультрафильтрации полученный концентрат можно затем концентрировать, используя диафильтрацию против раствора, пригодного для внутривенного или внутримышечного введения. В некоторых вариантах осуществления диафильтрационный раствор может включать стабилизатор и/или буферный агент. В предпочтительном варианте осуществления стабилизирующим и/или буферным агентом является агент глицин в соответствующей концентрации, например, от около 0,20 М до около 0,30 М, или от около 0,22 М до около 0,28 М, или от около 0,24 М до около 0,26 мМ, или в концентрации точно или около 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0. В предпочтительном варианте осуществления диафильтрационный буфер содержит точно или около 0,25 М глицина. В предпочтительном варианте осуществления после завершения стадии ультрафильтрации полу- 10023382 ченный концентрат подвергают диафильтрации против 0,25 М глицинового раствора с низким рН. Обычно минимальный обменный объем в 6 раз больше исходного объема концентрата, и полученный раствор концентрируют до концентрации белка более чем 20% мас./об. В конце процессов диафильтрации и концентрирования значение рН полученного раствора обычно составляет величину от 4,4 и 4,9. Обычно минимальный обменный объем по меньшей мере примерно в 3 раза выше исходного объема концентрата или по меньшей мере в около 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более раз больше исходного объема концентрата. Полученный IgG раствор можно сконцентрировать до конечной концентрации белка от около 5 до около 22% (мас./об.), или от около 10 до около 22% (мас./об.), или от около 15 до около 22%(мас./об.), или от около 18 до около 22% (мас./об.), или от около 20 до около 22%, или до конечной концентрации точно или около 5, или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22% или выше. В предпочтительном варианте осуществления IgG раствор концентрируют до конечной концентрации белка точно или около от 20 и 22%. Обычно в конце процесса концентрирования рН полученного раствора составляет величину от около 4,6 и 5,1. М. Составление лекарственной формы. После завершения стадии диафильтрации концентрацию белка в полученном растворе доводят, используя диафильтрационный буфер, до конечной концентрации от около 5 до около 20% (мас./об.), или от около 10 до около 20% (мас./об.), или от около 15 до около 20% (мас./об.), или от около 18 до около 20% (мас./об.), или до конечной концентрации около 5, или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%. В предпочтительном варианте осуществления конечная концентрация белка в полученном растворе составляет величину точно или около от 19% до 21%. В предпочтительном варианте осуществления после завершения диафильтрации концентрацию белка полученного раствора доводят до величины немного большей, чем 20% мас./об., например точно или около 20,404% мас./об., используя диафильтрационный буфер.N. Дополнительная стерилизация. Полученный объемный раствор лекарственной формы затем стерилизуют, сначала фильтруя через мембранный фильтр с абсолютным размером пор 0,2 мкм или менее. Затем полученный раствор в асептических условиях распределяют в конечные контейнеры для соответствующей герметизации, при этом отбирают образцы для тестирования. Конечной стадией является стадия хранения герметизированных контейнеров при температуре от 30 до 32 С в течение длительного промежутка времени, например 21-22 дня.II. Концентрированные IgG композиции. В одном аспекте настоящее изобретение относится к водной IgG композиции, полученной представленным выше способом. Обычно IgG композиции, полученные раскрытыми в данном описании новыми способами, отличаются высоким содержанием IgG и высокой степенью чистоты. Например, предложенные изобретением IgG композиции могут иметь концентрацию белка по меньшей мере около 15%(мас./об.), причем содержащийся IgG имеет степень чистоты больше чем 90%. Указанные IgG композиции столь высокой степени чистоты пригодны для терапевтического введения, например для подкожного и/или внутримышечного введения. В одном варианте осуществления предложенные изобретением IgG композиции пригодны для внутривенного введения, например путем разведения перед введением. В одном варианте осуществления концентрация IgG составляет точно или около 20% и ее используют для подкожного или внутримышечного введения. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет водную IgG композицию,полученную способом, включающим стадии:(1) выделения жидкости и осадка из плазмы путем центрифугирования;(2) смешивания предварительно охлажденного этанола с жидкостью со стадии (1) до получения смеси, в которой концентрация этанола составляет точно или около 8% (об./об.);(3) выделения жидкости и осадка из смеси (2) путем центрифугирования;(4) доведения величины рН и концентрация этанола в жидкости, полученной на стадии (3), до точно или около 7,0 и 20-25% (об./об.) соответственно, тем самым формируя смесь;(5) выделения жидкости и осадка из смеси со стадии (4) путем центрифугирования;(6) повторного суспендирования осадка со стадии (5) в буфере при отношении около 1:15 по массе до получения суспензии;(7) смешивания диоксида кремния (SiO2) с суспензией со стадии (6) и получения фильтрата путем фильтрования;(8) смешивания детергента и холодного спирта с фильтратом, полученным на стадии (7), и получения осадка путем центрифугирования;(9) растворения осадка в водном растворе, включающем растворитель или детергент, и выдерживания полученного раствора в течение по меньшей мере 60 мин;(10) пропускания полученного раствора со стадии (9) через катионную хроматографическую колонну и элюирования белков, абсорбированных на колонке, в элюат;(11) пропускания элюата, полученного на стадии (10), через анионообменную хроматографическую колонку для получения элюата;(12) пропускания полученного элюата через нанофильтр до получения нанофильтрата;(13) пропускания нанофильтрата через ультрафильтрационную мембрану до получения ультрафильтрата;(14) диафильтрации ультрафильтрата против диафильтрационного буфера до получения раствора с концентрацией белка точно или около 20% (мас./об.); и(15) стерилизации раствора, полученного на стадии (14), путем фильтрования полученного раствора через фильтр 0,2 мкм или менее, с получением, таким образом, композиции концентрированного IgG. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет водные IgG композиции, с концентрацией белка от около 150 до около 250 г/л. В некоторых вариантах осуществления концентрация белка в IgG композиции составляет величину от около 175 до около 225 г/л, или от около 200 до около 225 г/л, или имеет любую подходящую концентрацию в указанных интервалах, например точно или около 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250 г/л или выше. В предпочтительном варианте осуществления водная IgG композиция имеет концентрацию белка точно или около 200 г/л. В наиболее предпочтительном варианте осуществления концентрация белка водной IgG композиции составляет точно или около 204 г/л. Предложенные изобретением способы позволяют получать IgG композиции с очень высокой степенью чистоты. Например, в одном варианте осуществления по меньшей мере около 95% всего содержания белка в предложенной изобретением композиции составляет IgG. В других вариантах осуществления по меньшей мере около 96% белка представляет собой IgG, или по меньшей мере около 97, 98, 99, 99,5 или более всего белка указанной композиции представляет собой IgG. Аналогично, предложенные в настоящем изобретении способы позволяют получать IgG композиции, с крайне низкими уровнями содержания загрязняющих агентов. Например, в некоторых вариантах осуществления предложены IgG композиции, содержащие менее чем около 100 мг/л IgA. В других вариантах осуществления IgG композиции содержат менее чем около 50 мг/л IgA, предпочтительно менее чем около 35 мг/л IgA, наиболее предпочтительно менее чем около 20 мг/л IgA.III. Фармацевтические композиции. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие очищенный IgG, полученный предложенными настоящим изобретением способами. Как правило, содержащие IgG фармацевтические композиции и лекарственные формы, полученные раскрытыми в данном описании новыми способами, отличаются высоким содержанием IgG и высокой степенью чистоты. Например, предложенные в настоящем изобретении IgG фармацевтические композиции и лекарственные формы могут иметь концентрацию белка по меньшей мере около 15%(мас./об.) и степень чистоты содержащегося IgG больше чем 90%. IgG композиции столь высокой степени чистоты пригодны для терапевтического введения, например для подкожного и/или внутримышечного введения, в одном варианте осуществления, предложенные в настоящем изобретении IgG композиции пригодны для внутривенного введения, например, используя разведение перед введением. В одном варианте осуществления концентрация IgG соответствует точно или около 20%, и ее используют для подкожного или внутримышечного введения. В одном варианте осуществления предложенные в настоящем изобретении фармацевтические композиции получают, создавая водные IgG композиции, используя предложенный в настоящем изобретении способ. Как правило, лекарственную композицию подвергают по меньшей мере одной, предпочтительно по меньшей мере двум, наиболее предпочтительно по меньшей мере трем стадиям инактивации и удаления вирусов. Неограничивающие примеры стадий инактивации и удаления вирусов, которые можно осуществить, используя предложенные в настоящем изобретении способы, включают обработку растворителем детергентом (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrmolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 и Kreil et al.,Transfusion 2003 (43):1023-1028, обе из которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей), нанофильтрацию (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 иYuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8:2021-2024, обе из которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей), и инкубирование при низких значениях рН при высоких температурах (Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 и Louie et al., Biologicals 1994 (22):13-19). В некоторых вариантах осуществления предложены фармацевтические лекарственные формы с содержанием IgG от около 175 до около 225 г/л IgG. Как правило, указанные IVIG лекарственные формы получают путем выделения IgG композиции из плазмы, используя раскрытый в настоящем изобретении способ, концентрируя полученную композицию и получая лекарственную форму концентрированной композиции в растворе, пригодном для внутривенного введения. Такие IgG композиции можно сконцентрировать, используя любой подходящий способ, известный специалистам в данной области. В одном варианте осуществления указанную композицию концентрируют путем ультрафильтрации/диафильтрации. В некоторых вариантах осуществления в ультрафильтрационном устройстве, которое используют для концентрирования указанной композиции, используют ультрафильтрационную мембрану с отсечением по номинальной молекулярной массе (NMWCO) менее чем около 100 кДа или менее чем около 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или меньше кДа. В предпочтительном варианте осуществленияNMWCO ультрафильтрационной мембраны составляет не более чем 50 кДа. Замену буфера можно осуществить, используя любую подходящую методику, известную специалистам в данной области. В конкретном варианте осуществления замену буфера осуществляют путем диафильтрации. В конкретном варианте осуществления предложена фармацевтическая композиция IgG, где IgG композицию выделяют из плазмы, используя способ, включающий стадии:(1) выделения жидкости и осадка из плазмы путем центрифугирования;(2) смешивания предварительно охлажденного этанола с жидкостью со стадии (1) до получения смеси, в которой концентрация этанола составляет точно или около 8% (об./об.);(3) выделения жидкости и осадка из смеси (2) путем центрифугирования;(4) доведения рН и концентрации этанола в жидкости со стадии (3) до точно или около 7,0 и 20-25%(5) выделения жидкости и осадка из смеси со стадии (4) путем центрифугирования;(6) повторного суспендирования осадка со стадии (5) в буфере при отношении от около 1 до 15 по массе до получения суспензии;(7) перемешивания диоксида кремния (SiO2) с суспензией со стадии (6) и получения фильтрата путем фильтрования;(8) смешивания детергента и холодного спирта с фильтратом, полученным на стадии (7), и получения осадка путем центрифугирования;(9) растворения осадка в водном растворе, включающем растворитель или детергент, и выдерживания полученного раствора в течение по меньшей мере 60 мин;(10) пропускания полученного раствора после стадии (9) через катионообменную хроматографическую колонну и злюирования белков, абсорбированных на колонне, в элюат;(11) пропускания элюата, полученного на стадии (10), через анионообменную хроматографическую колонну до получения элюата;(12) пропускания элюата через нанофильтр до получения нанофильтрата;(13) пропускания нанофильтрата через ультрафильтрационную мембрану до получения ультрафильтрата;(14) осуществления диафильтрации ультрафильтрата против диафильтрационного буфера до получения раствора с концентрацией белка около 20% (мас./об.); и(15) стерилизации раствора, полученного на стадии (14), путем фильтрования полученного раствора через фильтр 0,2 мкм или менее, с получением, таким образом, композиции концентрированного IgG. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет фармацевтические IgG композиции, с концентрацией белка от около 150 до около 250 г/л. В некоторых вариантах осуществления концентрация белка в IgG композиции составляет величину от около 175 до около 225 г/л, или от около 200 до около 225 г/л, или любую подходящую концентрацию в указанных интервалах, например точно или около 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240,245, 250 г/л или выше. В предпочтительном варианте осуществления водная IgG композиция включает концентрацию белка точно или около 200 г/л. В особенно предпочтительном варианте осуществления указанная водная IgG композиция включает концентрацию белка точно или около 204 г/л. Предложенные в настоящем изобретении способы позволяют получать IgG фармацевтические композиции очень высокой степени чистоты. Например, в одном варианте осуществления по меньшей мере около 95% полного содержания белка в предложенных в настоящем изобретении композициях составляет IgG. В других вариантах осуществления по меньшей мере около 96% белка составляет IgG, или по меньшей мере около 97, 98, 99, 99,5% или более от полного содержания белка в указанных композициях составляет IgG. Аналогично, предложенные в настоящем изобретении способы обеспечивают возможность получения фармацевтических композиций IgG, которые содержат крайне низкие уровни содержания загрязняющих агентов. Например, в некоторых вариантах осуществления предложены IgG композиции, которые содержат менее чем около 100 мг/л IgA. В других вариантах осуществления IgG композиции содержат менее чем около 50 мг/л IgA, предпочтительно менее чем около 35 мг/л IgA, наиболее предпочтительно менее чем около 20 мг/л IgA. Предложенные в настоящем изобретении фармацевтические композиции обычно содержат один или более буферных агентов или стабилизирующих рН агентов, пригодных для внутривенного введения. Неограничивающие примеры буферных агентов, пригодных для создания предложенных в настоящем изобретении IgG композиций, включают глицин, цитрат, фосфат, ацетат, глутамат, тартрат, бензоат, лактат, гистидин или другие аминокислоты, глюконат, малат, сукцинат, формиат, пропионат, карбонат или любые их комбинации с соответствующим значением рН. Как правило, буферного агента достаточно для поддержания соответствующего значения рН в композиции в течение длительного промежутка времени. В предпочтительном варианте осуществления буферным агентом является глицин. В некоторых вариантах осуществления концентрация буферного агента в указанной композиции составляет от около 100 до около 400 мМ, предпочтительно от около 150 до около 350 мМ, более предпочтительно от около 150 до около 300 мМ, наиболее предпочтительно от около 175 до около 225 мМ. В наиболее предпочтительном варианте осуществления концентрированная композиция IgG содержит от около 150 до около 250 мМ глицина, наиболее предпочтительно около 200 мМ глицина. В другом предпочтительном варианте осуществления концентрированная композиция IgG содержит точно или около 250 мМ глицина. В некоторых вариантах осуществления рН композиции составляет величину от около 4,1 до около 5,6, предпочтительно от около 4,4 до около 5,3, наиболее предпочтительно от около 4,6 до около 5,1. В особенно предпочтительных вариантах осуществления рН композиции может составлять около 4,1, 4,2,4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5 или 5,6. В некоторых вариантах осуществления предложенные в настоящем изобретении фармацевтические композиции могут необязательно дополнительно включать агент для регулирования осмолярности указанной композиции. Неограничивающие примеры регулирующих осмолярность агентов включают маннит, сорбит, глицерин, сахарозу, глюкозу, декстрозу, левулозу, фруктозу, лактозу, полиэтиленгликоли,фосфаты, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, глюконоглюкогептонат кальция, диметилсульфон и т.п. Обычно предложенные в настоящем изобретении лекарственные формы характеризуются такими значениями осмолярности, которые сравнимы с физиологическими значениями осмолярности около 285295 ммоль/кг (Lacy et al., Drug Information Handbook - Lexi-Comp 1999: 1254). В некоторых вариантах осуществления осмолярность композиции составляет от около 200 до около 350 ммоль/кг, предпочтительно от около 240 до около 300 ммоль/кг. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления осмолярность композиции составляет около 200, или 210, 220, 230, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275,280, 285, 290, 295, 300, 310, 320, 330, 340, 340 или 350 ммоль/кг. Предложенные в настоящем изобретении лекарственные формы IgG обычно стабильны в жидкой форме в течение длительного промежутка времени. В некоторых вариантах осуществления лекарственные формы являются стабильными в течение по меньшей мере около 3 месяцев при комнатной температуре или по меньшей мере в течение около 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 месяцев при комнатной температуре. Указанные композиции также обычно стабильны в течение по меньшей мере около 18 месяцев при хранении в холодильнике (обычно от около 2 до около 8 С) или в течение по меньшей мере около 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42 или 45 месяцев при хранении в холодильнике.IV. Введение препаратов IgG. В соответствии с общепринятой в современной медицине практикой стерилизованные препараты концентрированных иммуноглобулинов (особенно IgG) используют для лечения медицинских состояний, которые попадают в указанные три основных класса: иммунодефициты, воспалительные и аутоиммунные заболевания и острые инфекции. Указанные препараты IgG можно также использовать при лечении рассеянного склероза (особенно рецидивирующего-ремиттирующего рассеянного склероза илиRRMS), болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Очищенные препараты IgG настоящего изобретения пригодны для использования в указанных целях так же, как для других клинически приемлемых применений препаратов IgG.FDA разрешил использование IVIG для лечения при различных показаниях, включая трансплантацию аллогенного костного мозга, хронический лимфоцитарный лейкоз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), педиатрический HIV, первичный иммунодефицит, болезнь Кавасаки, хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию (CIDP) и при трансплантации почек у реципиентов с высоким содержанием антител, или в случае донора с несовместимой группой крови. В некоторых вариантах осуществления предложенные в настоящем изобретении IVIG композиции можно использовать для лечения или стабилизации указанных заболеваний и состояний. Более того, применения вне зарегистрированных показаний для IVIG обычно предложены для лечения или стабилизации различных показаний, например синдрома хронической усталости, псевдомембранозного колита, вызванного C. difficle, дерматомиозита и полимиозита, офтальмопатии Грейвса, синдрома Жулиан-Барра, мышечной дистрофии, миозита с включенными тельцами, синдрома ЛамбертИтона, красной волчанки, многофокальной моторной нейропатии, рассеянного склероза (MS), тяжелой миастении, неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении, инфекции парвовируса В 19, обыкновенной пузырчатки, посттрансфузионной пурпуры, отторжения почечных трансплантатов, при спонтанных абортах/преждевременных родах, синдрома мышечной скованности, опсоклонус-миоклонуса, тяжелого сепсиса и септического шока при критических состояниях взрослых пациентов, токсического эпидермального некроза, хронического лимфоцитарного лейкоза, множественной миеломы, Х-связанной гаммаглобулинемии и гипогаммаглобулинемии. В некоторых вариантах осуществления предложенные в настоящем изобретении IVIG композиции можно использовать для лечения или стабилизации указанных заболеваний и состояний. И, наконец, было предложено экспериментальное использование IVIG для лечения или стабилизации заболеваний, включая первичный иммунодефицит, RRMS, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона (U.S. Patent Application Publication No. U.S. 2009/0148463, которые включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей). В некоторых вариантах осуществления пред- 14023382 ложенные в настоящем изобретении IVIG композиции можно использовать для лечения или стабилизации первичного иммунодефицита, RRMS, болезни Альцгеймера или болезни Паркинсона. В некоторых вариантах осуществления, включающих ежедневное введение, эффективное вводимое пациенту количество должен определить лечащий врач, с учетом индивидуальных особенностей, таких как возраст, масса, тяжесть заболевания, способ введения (например, внутривенное или подкожное) и реакции на лечение. В некоторых вариантах осуществления препарат иммуноглобулина настоящего изобретения можно вводить пациенту в количестве от около 5 до около 2000 мг/кг ежедневно. В дополнительных вариантах осуществления препарат иммуноглобулина можно вводить в количествах по меньшей мере около 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 мг/кг. В дополнительных вариантах осуществления препараты иммуноглобулина можно вводить пациенту в дозах вплоть до около 100, до около 150, до около 200, до около 250, до около 300, до около 400 ежедневно. В других вариантах осуществления дозы препаратов иммуноглобулина могут быть больше или меньше. Далее препараты иммуноглобулинов можно вводить в виде одной или нескольких доз в день. Клиницисты, знакомые с заболеваниями, которые лечат препаратами IgG, могут определить соответствующие дозы для конкретного пациента в соответствии с критериями, известными специалистам в данной области. Один из обычно используемых IgG продуктов, иммуноглобулин для внутривенного введения илиIVIG, приготавливают в форме для внутривенного введения. Благодаря тому, что IgG препарат настоящего изобретения обеспечивает исключительно высокую концентрацию иммуноглобулина (20% мас./об. или выше), что существенно уменьшает объем терапевтически эффективной дозы, указанные композиции настоящего изобретения особенно благоприятны для подкожного и/или внутримышечного введения пациенту, хотя даже внутривенное введение остается вариантом выбора способа введения. Термин "эффективное количество" относится к такому количеству иммуноглобулинового, особенноIgG, препарата, которое обеспечивает улучшение или реабилитацию болезненного состояния подлежащего лечению пациента (например, первичного иммунодефицита, RRMS, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и т.д.). Эффективное количество, которое следует вводить пациенту, может определить врач с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе, тяжести заболевания, способа введения (например,внутривенного или подкожного) и реакции на указанное лечение. В некоторых вариантах осуществления препарат иммуноглобулина настоящего изобретения можно вводить пациенту в количестве от около 5 до около 2000 мг/кг ежедневно. В дополнительных вариантах осуществления указанный препарат иммуноглобулина можно вводить в количествах по меньшей мере около 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 мг/кг. В дополнительных вариантах осуществления препарат иммуноглобулина можно вводить пациенту в дозах вплоть до около 100, до около 150, до около 200, до около 250, до около 300, до около 400 мг/кг ежедневно. В других вариантах осуществления дозы препарата иммуноглобулина могут быть больше или меньше. Далее препараты иммуноглобулина можно вводить как одну или несколько доз в день. Клиницисты, знакомые с заболеваниями, которые лечат препаратами IgG, могут определить соответствующую дозу для пациента в соответствии с критериями, известными специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления концентрированный IgG препарат можно вводить пациенту в дозе от около 5 до около 2000 мг/кг за введение. В некоторых вариантах осуществления указанная доза может быть по меньшей мере около 5, или по меньшей мере около 10, или по меньшей мере около 20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850,900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или по меньшей мере около 2000 мг/кг. В соответствии с настоящим изобретением продолжительность курса лечения может определить врач, и она может составлять один день или длиться более месяца. В некоторых вариантах осуществления курс лечения может длиться от 1 до 6 месяцев. Величина дозы и частота введения концентрированного IgG зависит, наряду с другими, от таких факторов, как подлежащее лечению заболевание или состояние и тяжесть заболевания или состояние пациента. Обычно для первичной иммунной дисфункции дозу от около 100 до около 400 мг/кг массы тела вводят примерно каждые 3-4 недели. При неврологических и аутоиммунных заболеваниях дозу вплоть до 2 г/кг массы тела применяют в течение трех-шести месяцев, как пятидневный курс один раз в месяц. Такой курс обычно дополняют поддерживающей терапией, включающей введение от около 100 и до около 400 мг/кг массы тела примерно один раз каждые 3-4 недели. Обычно пациенту вводят дозу или осуществляют лечение примерно один раз каждые 14-35 дней или примерно каждые 21-28 дней. Частота лечения будет зависеть, наряду с другими факторами, от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и тяжести заболевания или состояния пациента. В предпочтительном варианте осуществления предложен способ лечения иммунодефицита, аутоиммунного заболевания или острой инфекции у нуждающегося в этом человека, причем указанный способ включает введение фармацевтической IgG композиции настоящего изобретения. Примеры Представленные далее примеры приведены только с целью иллюстрации и, никоим образом, не ограничения изобретения. Специалисты в данной области легко узнают различные некритические параметры, которые можно изменить или модифицировать, получая практически такие же или аналогичные результаты. Пример 1. Исследование стабильности различных IgG концентраций и лекарственных форм. 1. Цель. Целью настоящего исследования является сравнение стабильности при хранении композиций с низким значением рН (0,25 М глицин, рН 4,4-4,9 при измерении в концентрированном растворе) и с высокой концентрацией белка с композицией с нейтральным рН (22,5 г/л глицина, 3 г/л NaCl рН 7), которую в настоящее время используют для внутримышечно и подкожно вводимых препаратов иммуноглобулинов. 2. Схема эксперимента. Все исследования начинают, используя концентрации нанофильтрата до 5% белка. Осуществляют десятикратный обмен буфера против 0,15 М глицина (самая низкая исследованная концентрация глицина), с последующей конечной концентрацией до нужного значения, выше 20% белка. Если во время первой серии экспериментов используют 0,5 м 2 полиэфирную Millipore мембрану с отсечением по молекулярной массе 30K (нормальный фильтр), то вторую серию экспериментов осуществляют, используя 0,5 м 2 полиэфирсульфоновую Millipore мембрану с открытым фильтром, которая больше пригодна для растворов с более высокой вязкостью, и фракции после промывки концентрируют, используя второе ультрафильтрационное/диафильтрационное устройство с мембраной с меньшей поверхностью (0,1 м 2, открытый фильтр) для того, чтобы уменьшить потери выхода. Конечные контейнеры или подготавливают и хранят при низких значениях рН, или осуществляют хранение при низких значениях рН в объеме, после чего их доводят до нейтральных значений рН перед хранением. Таблица 1 Общий обзор стадий ультрафильтрации/диафильтрации 3. Способы тестирования. рН: рН измеряют, используя Knick Portamess type 911 ХРН, снабженный электродом Mettler Toledo. Лот 405-DPA-SC-S8/120 и РТ 1000 температурным зондом. Белок: концентрации белка определяют, используя Biuret. Распределение по размерам молекул исследуют, используя высокоэффективную хроматографию с исключением по размерам. АСА титры определяют в соответствии с рекомендациями Европейской Фармакопеи. 4. Принятые критерии. Установлены следующие критерии: распределение по размеру молекул с помощью ВЭЖХ: мономеры и олигомеры/димеры: 90%. Агрегаты: 10% (% для ВВ введения). АСА титр: расход менее чем 50% СН 50 единиц/мг белка для ВВ введения. 5. Результаты и обсуждение. 5.1. Сравнение содержания агрегатов и фрагментов и АСА титров для препаратов, приготовленных при низких значениях рН (4,7 и при рН 7,0). В следующей табл. 2 представлено содержание агрегатов и фрагментов так же, как значение АСА титра после 3 месяцев хранения при 28-30 С для стандартных лекарственных форм (рН 4,7, 0,25 М глицин; или рН 7,0, 22,5 г/л глицина, 3 г/л NaCl) при различных концентрациях белка. Таблица 2 Содержание фрагментов, агрегатов и значение АСА титров после 3 месяцев хранения при температуре 28-30 С при низких значениях рН и при рН 7,0 для различных концентраций белка Представленные результаты четко показывают, что композиции с низким рН содержат меньше агрегатов и имеют более низкие значения АСА титров после 3 месяцев хранения при температуре 28-30 С.AU АСА титры лекарственных форм с рН 7 находятся выше критериев приемлемости, установленных для указанного теста. В табл. 2 приведены значения после 3 месяцев хранения при температуре 2-8 С. Таблица 3 Содержание фрагментов, агрегатов и значения АСА титров после 3 месяцев хранения при температуре 2-8 С при низких значениях рН и при рН 7,0 для различных концентраций белка Результаты, полученные при температуре 2-8 С, подтверждают тенденцию, наблюдающуюся при температуре 28-30 С. Значения АСА титров находятся ниже пределов, определенных как критерии приемлемости, хотя лекарственные формы с рН 7,0, по-видимому, имеют более высокие значения. Концентрации белка не оказывают влияния на результаты, полученные для тестированных параметров. 5.2. Влияние различных процедур концентрирования на содержание агрегатов и фрагментов так же,как и на значения АСА титров для препаратов IGSC60 (Ph 4,7, А-сетка) и IGSC62 (Ph. 4,7, V-сетка, концентрации после последующей промывки с меньшей UF-системой). В следующей табл. 4 представлено содержание агрегатов и фрагментов так же, как значения АСА титров после 3 месяцев хранения при 28-30 С для лекарственных форм с низкими значениями рН для различных способов концентрирования при различных концентрациях белка. Таблица 4 Содержание агрегатов и фрагментов так же, как значения АСА титров после 3 месяцев хранения при 28-30 С для лекарственных форм с низкими значениями рН для различных способов концентрирования при различных концентрациях белка Полученные данные демонстрируют одинаковые результаты после 3 месяцев хранения для обеих концентраций. В табл. 5 представлены соответствующие результаты, полученные при 2-8 С: содержание агрегатов и фрагментов и значения АСА титров после 3 месяцев хранения при температуре 2-8 С при низких значениях рН для различных способов концентрирования белка. Таблица 5 Значения, полученные при температуре 2-8 С, подтверждают результаты, полученные при температуре 28-30 С. Способ концентрирования не влияет на стабильность продукта. Что касается сравнения двух систем, то система с основным способом концентрирования и другая для концентрирования после промывки, которая приводит к более высоким выходам, то считают, что указанный способ более пригоден для крупномасштабного производства. 6. Выводы. Из результатов, полученных в проведенных исследованиях, можно сделать следующие выводы. Композиции с низким рН обеспечивают более низкие значения АСА титров, меньшее содержание агрегатов и фрагментов после 3 месяцев хранения при температурах 2-8 С и 28-30 С. После 3 месяцев хранения при температуре 28-30 С значения АСА титров для лекарственных форм с нейтральными значениями рН находятся выше критериев приемлемости. Концентрация белка не оказывает влияния на результаты, полученные для тестированных параметров. Способ концентрирования не влияет на стабильность получаемого продукта. Адекватные значения после промывки можно получить только с мембранами с открытой сеткой. На основании указанных выводов было решено создать новый IgG продукт для подкожного введения с низким значением рН композиции, со способом концентрирования с использованием второго меньшего устройства для концентрирования после промывки и ультрафильтрационного/диафильтрационного устройства с мембранами с открытыми сетками и при содержании белка 20%+2%. Пример 2. Ультрафильтрация и композиция SUBQ NG. 1. Предпосылки. Такую информацию собирают во время получения продукта в промышленном масштабе и для доклинических 20% лотов. Способ, который используют для производства 20% лотов перед стадией нанофильтрации, описан выше. Ультрафильтрацию/диафильтрацию усовершенствуют для концентрирования полученного раствора до 20% (пределы: 18-22%). Для снижения потерь выхода до минимума последующую промывку ультрафильтрационного устройства, использованного для диафильтрации, концентрируют, используя второе меньшее устройство, снабженное такими же мембранами, и затем добавляют к основному раствору. Неожиданно оказалось, что на инактивацию вирусов во время хранения при низких значениях рН не влияет концентрация белка в растворе. Аналогичное уменьшение количества вирусов достигается в 10% растворе (GAMMAGARD LIQUID) и в 20% растворе. Поэтому хранение при низких значениях рН, в качестве стадии уменьшения содержания вирусов, поддерживают для 20% продукта. 2. Описание процесса. Ультрафильтрация. Концентрацию глицина в нанофильтрате доводят до нужного значения 0,25 М. Полученный раствор концентрируют до концентрации белка 62% мас./об. с помощью ультрафильтрации (UF). Обычно концентрацию белка определяют, измеряя AU280-320. Используют коэффициент экстинкции 14,1. рН доводят до 5,20,2. В качестве UF мембраны используют мембрану с отсечением по молекулярной массе(Nominal Molecular Weight Cut Off) (NMWCO) 50000 Да или менее и сконструированную конкретно для продуктов с высокой вязкостью (например, V сетка от Millipore). Например, Millipore Pellicon Biomax сNMWCO в 50 кДа или менее. Материал мембран представляет собой полиэфирсульфон. Осуществляют диафильтрацию полученного концентрата против 0,25 М раствора глицина, рН 4,20,2. Минимальный обменный объем равен 10 Х от исходных объемов концентратов. На протяжении всех операций ультрафильтрации/диафильтрации полученный раствор выдерживают при температуре 420 С. После диафильтрации полученный раствор концентрируют до достижения концентрация белка не менее 22% мас./об. Температуру полученного раствора доводят до 2-8 С. Концентрацию белка можно определить, используя UV считывающее устройство и используя значение коэффициента экстинкции 14,1. Для выделения всего оставшегося в системе белка осуществляют последующую промывку первой большой ультрафильтрационной системы, используя по меньшей мере двукратный мертвый объем в рециркуляционном режиме, чтобы обеспечить вымывание всего белка. Затем промывки после первой ультрафильтрационной системы концентрируют до достижения концентрации белка по меньшей мере 22% мас./об., используя вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, снабженную мембраной того же типа, размеры которой в десять раз или менее меньше размеров первой мембраны. Концентрат последующих промывок добавляют к основному раствору. Затем промывают вторую ультрафильтрационную систему. Полученные последующие промывки используют для доведения концентрации белка в конечном объеме на стадии 14. Температуру полученного раствора устанавливают 2-8 С. Композиции. Концентрацию белка дополнительно доводят до 20,40,4% мас./об., используя последующие промывки второй, меньшей системы ультрафильтрации, и/или диафильтрационный буфер. рН доводят до значения 4,4-4,9, при необходимости. Пример 3. Получение 20% лотов. 1. Введение. Данное сообщение раскрывает доклиническое получение и в нем суммированы результаты нового исследовательского препарата иммуноглобулина Бакстера "SUBQ NG, 20%," который представляет собой 20% (мас./об.) жидкий поливалентный препарат человеческого иммуноглобулина для подкожного применения. Процесс получения осуществляют, как описано в "подробном описании изобретения", используя раскрытый выше способ концентрирования. Фракционирование начинают, выделяя криоосадок. Полученную криосупернатантную плазму можно использовать для выделения различных неочищенных факторов коагуляции и ингибиторов перед последующим фракционированием холодным спиртом. Выбира- 18023382 ют семь схем для порционной адсорбции неочищенных факторов коагуляции и ингибиторов из криосупернатантной плазмы до SUBQ NG, 20% очистки и называют их схемами 1-7 в следующей таблице. Таблица 6 Для доклинических SUBQ NG 20% получение исходных материалов по Кону, полученных для схем 1, 3 и 6, выбирают для покрытия широкого разнообразия различных опций адсорбции. Различные процессы адсорбции раскрыты Teschner et al., 2007, в Vox Sang. 92:42-55; Polsler et al., 2008, Vox Sang. 94:184-192; в U.S. Patent Nos. 6395880 и 5409990 и Prothrombm complex: Brummelhuis in Methods of Plasma Protein Fractionation (J.M. Curling Editor, Academic Press, 1980). Применение спиртового фракционирования по Кону приводит к получению основной промежуточной IgG фракции, называемой осадком G, которую в дальнейшем обрабатывают до конечного продукта,используя хроматографическую очистку. Дальнейшие процедуры включают катионообменную (CMсефароза, быстрый поток) хроматографию и анионообменную хроматографию (ANX-сефароза, быстрый поток) и включают три независимые стадии инактивации вирусов, а именно: обработку растворителем/детергентом (смесь 1% Triton X-100, 0,3% три-N-бутилфосфат и 0,3% полисорбат-80),нанофильтрацию (Asahi Pilanova 35 нм) и хранение при низких значениях рН в течение 3 недель при повышенной температуре. Для достижения более высокой концентрации белка для подкожного введения на стадии ультрафильтрации/диафильтрации следует использовать фильтр с открытыми каналами. Предпочтительно используют второе устройство ультрафильтрации/диафильтрации для концентрирования последующей промывочной фракции для удаления всего белка после первого устройства.SUBQ NG 20% представляет собой жидкую композицию иммуноглобулина G (IgG), в которой по меньшей мере 95% белка является гаммаглобулином. Полученный продукт является изотоническим, и его получают с низким рН. При концентрации белка 10% на конечной стадии концентрирования рН составляет 4,4-4,9. Конечное значение рН 20% раствора можно определить после длительных исследований стабильности. Конечный раствор содержит 180-220 г белка и только 0,1-0,3 моль глицина на 1 л раствора. Жидкий препарат представляет собой прозрачное до слегка бледно-желтого вещество, практически не содержащее видимых частиц. 2. Результаты и баланс масс доклинических лотов. 1. Доклинический лот: SC00107NG. Опция поглощения 1: опция 6: F IX, F VII, AT-III. Номер лота исходного материала: осадок G VNELGl71 (US-источник). Номер лота конечного контейнера: SC00107NG. 2. Доклинический лот: SC00207NG. Опция поглощения 3: FEIBA, AT-III. Номер лота исходного материала: осадок G VNELGl73 (US-источник). Номер лота конечного контейнера: SC00207NG. 3. Доклинический лот: SC00307NG. Опция поглощения 1: без стадии адсорбции. Номер лота исходного материала: осадок G LB0790301 (US-источник). Номер лота конечного контейнера: SC00307NG. В конечном объеме уровень содержания примесей в препарате иллюстрируется низкими уровнями содержания основных примесей, которые значительно ниже 0,1% от полного количества IgG. Распределение по размерам молекул в 20% продукте на этой конечной стадии процесса аналогично распределению в одном из GAMMAGARD LIQUID/KIOVIG конечных контейнеров. Этот факт свидетельствует о том, что концентрации до 20% белка не оказывают негативного воздействия на целостность молекул IgG. 3. Дополнительные результаты, полученные при характеризации доклинических партий. Предварительные критерии выделения для конечных контейнеров определяют на основании требований соответствующих инстанций для подкожного введения человеческих иммуноглобулинов, спецификаций для конечных контейнеров, существующих в настоящее время продуктов для подкожного введение и GAMMAGARD LIQUID/KIOVIG спецификаций. Осуществляют дополнительные тесты контроля качества для оценки уровня содержания примесей в продукте или примесей, связанных с процессами обработки. Далее проводят дополнительную характеризацию соответствующего спектра антител в конечных контейнерах и сравнивают с результатами, полученными для доклинических IVIG, 10% TVR лотов. Полученные результаты представлены в следующей таблице. Таблица 8 Титры антител и коэффициенты обогащения оказываются величинами одного порядка для трех доклинических SUBQ NG 20% конечных контейнеров и для доклинических GAMMAGARD LIQUID/KIOVIG лотов. Таблица 9 Тесты качественного контроля SUBQ NG 20% конечного контейнера Удаление примесей в продукте и примесей, связанных с процессом получения продукта, оказываются удовлетворительными для всех трех лотов. 4. Выводы. Три лота конечных контейнеров SUBQ NG 20% успешно подготавливают в масштабе 200 л. Выбирают три схемы адсорбции, чтобы покрыть широкое разнообразие стадий адсорбции перед стадией фракционирования спиртом, а именно: опция 1, US источник плазмы без стадии адсорбции,опция 3, US источник плазмы после FEIBA, AT-III адсорбции,опция 6, US источник плазмы после F-LX, F-VII, AT-III адсорбции. Регистрация параметров процесса во время доклинического получения и характеризация промежуточных и конечного продукта показывает, что не существует очевидных детектируемых различий между указанными тремя лотами. Все конечные контейнеры удовлетворяют относящимся к продукту предварительным техническим условиям, независимо от того, какой тип исходного материала выбирают. Пример 4. Исследование хранения 20% препаратов. 1. Введение.SUBQ NG 20% представляет собой 20% (мас./об.) жидкий поливалентный препарат человеческого иммуноглобулина для подкожного введения. SUBQ NG 20% получают описанным выше способом. В этих исследованиях суммируют результаты, полученные при хранении 3 доклинических лотов и одного лота применимости при температурах 2-8 С и 28-30 С (только лот применимости) в течение вплоть до 6 месяцев. 2. Цель. Целью указанного исследования является оценка стабильности при хранении SUBQ NG 20% конечных контейнеров при температурах 2-8 С и 28-30 С. 3. Параметры индикации стабильности. Основными типами разложения являются денатурирование, агрегация и фрагментация, которые приводят к изменению распределения молекул по размерам в образце. Поэтому анализ распределения молекул по размерам с использованием высокоэффективной хроматографии с исключением по размерам является основным параметром, характеризующим стабильность. 4. Исследование партий и первичная упаковка. Результаты, касающиеся стабильности, представленные в указанном протоколе, получают для док- 21023382 линических лотов SC00107NG, SC00207NG и SC00307NG, а также для лота применимости IgGSC 62/1. 5. Результаты. В следующей табл. 11 приведены результаты для доклинических конечных контейнеров после хранения в течение вплоть до 12 месяцев. Таблица 10 Стабильность доклинических SUBQ 20% партий при температуре 2-8 С Таблица 11 Стабильность лота применимости IgGSC 62/1 при температурах 2-8 С и 28-30 С 6. Выводы. Полученные результаты подтверждают тот факт, что полученный продукт удовлетворяет определенным ранее техническим условиям в отношении исследованных параметров вплоть до 18 месяцев хранения при температурах 2-8 С и 28-30 С. Пример 5. Обработка при низких значениях рН для инактивации вирусов. Цель и обоснование. Введение. Раствор иммуноглобулина для подкожного введения (человеческий), 14-20%, с тройным уменьшением содержания вирусов (TVR) раствор, в дальнейшем называемый раствором Subcuvia NG, получают из смешанной человеческой плазмы. После стадии массового захвата для удаления факторов коагуляции/ингибиторов, очистку Subcuvia NG начинают с модифицированного спиртового фракционирования по Кону, приводящего к основному промежуточному осадку G, с последующим продолжающимся процессом, включающим хроматографическую очистку, так же, как с тремя отличающимися стадиями инактивации вирусов/удаления вирусов. В рассматриваемом исследовании снижение эффективности вирусов при хранении конечных контейнеров при низких значениях рН исследуют более подробно. Дальнейший процесс очистки включает следующие стадии: обработку повторно суспендированного осадка G растворителем/детергентом (S/D), катионообменной хроматографии с использованием карбоксиметилметил (СМ)-сефароза быстрого потока и анионообменной хроматографии с использованиемANX-Sepharose быстрого потока, нанофильтрации, ультрафильтрации-диафильтрации, регулирования рН и фильтрации и заполнения контейнеров в стерильных условиях. После асептического заполнения,раствор Subcuvia NG отправляют на хранение в конечном контейнере при низких значениях рН (для схе- 22023382 матической иллюстрации процесса приготовления см. представленную ниже схему). Схема процесса. Технологическая схема процесса А, представленная на фиг. 2, представляет собой общий вид дальнейшей части схемы получения раствора Subcuvia NG, начиная со стадии 10. Использованное в рассматриваемом исследовании обычным способом полученное производное эквивалентно технологической стадии "конечный контейнер, предварительное хранение". Схема процесса В, представленная на фиг. 2, представляет собой общий вид последующего процесса, использованного в настоящем исследовании, включая отбор образцов для определения титра вирусов. Цель. Для обеспечения высокой степени безопасности в отношении потенциального переноса вирусов,три специализированные стадии инактивации/удаления вирусов, которые дополняют друг друга по типу действия, объединяют в способ получения раствора Subcuvia NG: обработка растворителем/детергентом (стадия 11),нанофильтрация (стадия 14),хранение при низких значениях рН при повышенной температуре в конечном контейнере (постасептическое заполнение). Эффективность и надежность хранения при низких значениях рН и повышенной температуре в отношении инактивации вирусов уже были исследованы в предыдущих исследованиях, в которых был использован IGIV 10% TVR, продукт эквивалентный Subcuvia NG, но содержащий 10% белка для внутривенных применений. Данные, полученные в результате указанных исследований, демонстрируют, что все исследованные вирусы в липидной оболочке были эффективно и надежно инактивированы, причем вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV) продемонстрировал самую медленную кинетику инактивации. Кроме того, можно продемонстрировать, что указанная стадия процесса далее вносит вклад в вирусную безопасность способа получения с учетом мелких ДНК вирусов без липидной оболочки. SubcuviaNG и IGIV 10% TVR представляют собой продукты иммуноглобулина, где Subcuvia NG представляет собой вариант продукта для подкожного введения, и IGIV 10% TVR представляет собой вариант продукта для внутривенного введения. Оба получают одинаковым способом вплоть до стадий ультрафильтрация/диафильтрации и разработки композиции, где различие состоит только в том, что концентрацию белка в Subcuvia NG доводят до 14-20% вместо 10%. Поэтому эффективность и надежность стадии хранения при низких значениях рН и повышенной температуре при получении Subcuvia NG (см. The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products Evaluation of Medicines for Human Use (2001): CPMP Biotechnology Working Party - Note for Guidanceon Plasma-Derived Medicinal Products, CPMP/BWP/269/95 (rev. 3 с инактивацией BVDV и MMV оценивают, устанавливая выбранные критические параметры процесса до верхнего и нижнего пределов, установленных для способа производства (то есть время, температура: нижний предел; рН: верхний предел). Кроме того, с целью дальнейшего изучения надежности указанной стадии инактивации температуру понижают для указанного промежутка времени на протяжении опытов в малом масштабе. Как обсуждалось выше, были использованы следующие оболочечные вирусы и вирусы без оболочки. Вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV) в качестве модели для вируса гепатита С (HCV) и для других мелких РНК вирусов в липидной оболочке. Мелкий мышиный вирус (MMV) в качестве модели для человеческого парвовируса В 19 (В 19V) и для других мелких ДНК вирусов без липидной оболочки. В соответствии с рекомендациями СРМР 268/95 (The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products Human Medicines Evaluation Unit (1996): CPMP Biotechnology Working Party- Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution и Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses, CPMP/BWP/268/95 (пересмотрено проводились исследования в уменьшенной модели соответствующей стадии получения. Валидность результатов, полученных на стадии получения в уменьшенном масштабе "хранения при низких значениях рН и повышенной температуре" в отношении инактивации вирусов при получении раствора Subcuvia NG, демонстрируют путем сравнения параметров, указанных для этой стадии для крупномасштабного производства и параметров процессов,осуществляемых в уменьшенном масштабе. Кроме того, выбранные биохимические параметры контролируют и сравнивают с соответствующими параметрами крупномасштабного процесса. Материалы, способы и оборудование Вирусы и клетки. Используют BVDV, штамм NADL (биологически клонированный, АТСС VR-1422), полученный из коллекции американских типовых культур (American Type Culture Collection) (АТСС; Rockville,Maryland). Вирус размножают на MDBK клетках (АТСС CCL-22) в соответствии со стандартными рабочими методиками и титруют на ВТ клетках (АТСС CRL-1390).MMV, штамм-прототип (АТСС VR-1346), получают из американской коллекции типовых культур(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland). Вирус размножают в соответствии со стандартными рабочими методиками и титруют на А 9 клетках (АТСС CCL-1.4). Схема теста. Следующие лоты полученного обычным способом Subcuvia NG промежуточного, перед "хранением при низких значениях рН и повышенной температуре", то есть после стадии асептического заполнения контейнеров, получают от Baxter's PPD Products Support departvent, Industriestrasse 131, Vienna, Austria: лот номер IGSC64 с концентрацией белка 13,5%,лот номер IGSC64 с концентрацией белка 20,9%. Материал поставляют в конечном контейнере при температуре 2-8 С и используют в течение 6 месяцев. Буферы/растворы. Растворы для регулирования рН. Величину рН регулируют, используя 0,5 М NaOH или 0,5 М HCl. (Все растворы хранят при комнатной температуре и используют в течение 12 месяцев.) Препарат 0,5 М хлористо-водородной кислоты (HCl) Реагенты, т.е. дистиллированную воду и HCl, объединяют при комнатной температуре. Препарат 0,5 М гидроксида натрия (NaOH) Соответствующее количество NaOH растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре. Растворы для измерения величины рН. Величину рН измеряют как непосредственно, так и в разбавленных растворах в соответствии с указаниями Европейской Фармакопеи (ЕР). Для измерения величины рН в соответствии со способом ЕР,концентрированный белок разводят до 1%, используя 0,9% раствор NaCl. 0,9% раствор NaCl приготавливают следующим образом: 9,00,9 г NaCl растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют на фильтре 0,2 мкм, хранят при комнатной температуре и используют в течение 12 месяцев. Среда для клеточной культуры. Среду, которую используют для культуры клеток или определения тира вирусов, приготавливают в соответствии со стандартными рабочими методиками для получения титров вирусов BVDV и MMV. Анализы титрования вирусов.TCID50 анализ. Образцы, содержащие вирусы, титруют, используя TCID50 анализы, в соответствии со стандартными методиками процедур. Коротко, сериальные 1/2 log разведения образцов приготавливают в соответствующей среде для культуры тканей и 100 мкл каждого из разведений помещают в 8 лунок микротитровального планшета, засеянного соответствующей индикаторной клеточной линией. Микротитровальные планшеты хранят в контейнерах с регулируемой влажностью и содержанием СО 2 при температуре 362 С. Оценку цитопатических эффектов осуществляют путем визуального исследования клеток под микроскопом после 7 дней хранения. Средние инфекционные дозы культур тканей (TCID50) рассчитывают в соответствии с распределением Пуассона и выражают как log10 [TCID50/мл]. Титрование BVDV. Исследования осуществляют, используя MMV-инфицированные образцы. Для снижения предела детектирования BVDV-инфицированных образцов взятых из Subcuvia NG промежуточного после 20 и 27 дней хранения при низких значениях рН, полученные образцы титруют следующим образом: в дополнении к стандартному TCID50 анализу, образцы 1:3,16 разведения (0,5 logs) и следующие два 1/2 log разведения (для разведения используют соответствующую среду для культуры клеток) добавляют во все лунки (100 мкл на лунку) 96-луночных микротитровальных планшетов, засеянных соответствующей индикаторной клеточной линией. Хранение клеток и оценку цитопатического эффекта для соответствующих вирусов осуществляют, как раскрыто выше (TCID50 анализ). Результаты рассчитывают следующим образом: рассчитывают отношение Rvol объема, титрованного в объемном титровании, и объема, титрованного в регулярном TCID50 анализе. log10 Rvol вычитают из титра вируса, определенного в TCID50 анализе, и результат представляют как титр вируса, определенный объемным титрованием. Пример. Образец анализируют (TCID50 анализ), используя микротитровальный планшет в серийных 0,5 log разведениях (все 12 столбцов) и обнаруживают, что лунки негативны для разведения 0 (т.е. неразбавленные). Расчет в соответствии с распределением Пуассона дает значение титра вируса 0,11 log10[TCID50/мл]. Соответствующий полный объем анализируемого образца составляет 1,17 мл. Тот же самый образец (разбавление 0) вносят во все лунки микротитровального планшета (титрование основного объема). Поэтому полный объем вносимого образца составляет 9,6 мл. Отношение объемов: Rvol=9/6:1,17=8,21; log10 (Rvol)=0,91. Рассчитанный титр вируса составляет затем 0,11-0,91; т.е. -0,80. Верхний предел интервала достоверности титров вируса рассчитывают аналогично. Расчет титра вируса, когда в следующих кинетических образцах не оценивают инфекционность. Там, где в последовательных кинетических образцах не детектируется инфекционности вирусов вплоть до конечного образца после завершения хранения при низких значениях рН, объем всех последовательных негативных образцов, использованных для лунок в TCID50 анализе с отчетливо негативными результатами, принимают во внимание для расчета предела детектирования в анализе. Для этого используют следующую формулу (см. также Appendix 1): с X1 (i=1, 2, 3,n) индивидуальными титрами вируса [log10(TCID50/мл)] для n последовательных негативных образцов. Если все последовательные негативные образцы имеют один и тот же титр, т.е. х, формула упрощается до Цитотоксичность. Цитотоксичность промежуточного процесса для индикаторной клеточной линии вируса используют из имитационно-зараженного Subcuvia NG промежуточного, т.е. зараженного ВТ-средой для инфицированных клеток (5% лошадиная сыворотка) вместо вирусного источника, так же, как из имитационнозараженного, с установленным рН (рН 4,90,1) и отфильтрованного на фильтре 0,45 мкм исходного материала для каждой клеточной линии для определения цитотоксичности. Образцы анализируют подобно содержащим вирус образцам, т.е. их серийно разводят и хранят с индикаторной клеточной линией. После хранения определяют наивысшую не токсичную концентрацию. Что касается вариаций в этих биологических системах, отклонения в 0,5 log для стадии рассматривают как незначительные при сравнении цитотоксичности зараженных вирусом и имитационно-зараженных образцов.Указанный состав ВТ-среды для инфицированных клеток следующий: DMEM (содержащая 45 г/л(об./об.) пирувата натрия+2% (об./об.) бикарбоната натрия (7,5%)+1% (об./об.) неосновных аминокислот+5% (об./об.) лошадиной сыворотки. Интерференция. Для образцов с низкими значениями титров вируса необходимо оценить влияние матрикса образца на характеристики анализа. Для образцов с высокими титрами вируса соответствующую часть серий разведения, то есть часть, где оценивают вирус-позитивные и вирус-негативные лунки, осуществляют при высоких разведениях образца. Соответственно влиянием матрикса образца, который также разводят на нескольких log10 стадиях, на определение инфекционность вируса можно пренебречь. Взаимодействие с определениями низких титров вируса для образцов, содержащих промежуточноеSubcuvia NG, измеряют следующим образом: образцы отбирают из имитационно-меченного с установленным рН (рН 4,90,1) и отфильтрованного на 0,45 мкм фильтре исходного материала (промежуточногоSubcuvia NG) разводят 1:3,16, используя соответствующую среду для культуры тканей и метят 1:100 заранее разведенной (в соответствующей среде для культуры тканей, т.е. ВТ среде для ВТ клеток/BVDV и А 9 средой для А 9 клеток/MMV) вирусной исходной суспензией до номинального значения титра 2 или 3log10 [TCID50/мл] и титруют, как описано выше. Титры, полученные для меченных промежуточных процессов, сравнивают со значениями для меченных контрольных сред клеточных культур. Расчет коэффициента уменьшения вирусов. Анализ эффективности инактивации вирусов в процессе осуществляют в соответствии с рекомендациями СРМР 268/95 [3], используя следующую формулу: где R = коэффициент уменьшения содержания вируса;V2 = объем материала после стадии; Т 2 = концентрация вируса после стадии [TCID50/мл]. Объемы и титры для каждого меченого образца до и после обработки используют для расчета R. В тех случаях, когда вирус не определяется, пределы детектирования используют в качестве титра вируса для расчетов. В соответствии со стандартными рабочими процедурами расчеты осуществляют, используя титры вирусов (log10 [TCID50/мл), приведенные до двух знаков после запятой; коэффициенты уменьшения округляют до первого десятичного знака. Определение значимых параметров. Время, температура [С]. Время хранения определяют с помощью хронометров; температуру измеряют, используя Pt-100 сенсоры, и непрерывно регистрируют. Величина рН. Величину рН определяют в соответствии со стандартными рабочими процедурами, используя стандартный лабораторный рН-метр при непосредственных измерениях, а также применяя способ, специфицированный в Европейской Фармакопее (ЕР), т.е. после разведения до 1% белка 0,9% раствором NaCl. В дальнейшем рН с суффиксом (ЕР) означает измерение рН в соответствии с ЕР способом, тогда как рН без суффикса означает непосредственное измерение. Определение других параметров. Распределение по размерам молекул (MSD). ВЭЖХ-SEC (высокоэффективная жидкостная хроматография - хроматография с исключением по размерам (эксклюзионная ВЭЖХ анализы распределения молекул по размерам осуществляют в департаменте Analytical Biochemistry, Baxter, Vienna, Austria, в соответствии со стандартными рабочими процедурами. Эксклюзионный ВЭЖХ анализ всех образцов "крупномасштабных" лотов (полученных в департаменте PPD Products, Support, Baxter, Vienna, Austria) осуществляют в соответствии с указанным тестом. Таким образом, для подтверждения сравнимости между результатами тестов для образцов имитационно-меченых опытов (накопленными в более мелкомасштабных процессах во время проведенных исследований) и результатами тестов "крупномасштабных" лотов, проводят анализ MSD образцов имитационно-меченых образцов в соответствии с таким же тестом в том же самом департаменте. Электрофорез на ацетатцеллюлозной мембране. Электрофорез на ацетатцеллюлозной мембране (САЕ) осуществляют в соответствии со стандартными рабочими процедурами в департаменте ACV Chemistry, Baxter, Vienna, Austria. Округление. Округление осуществляют в соответствии со стандартной практикой. Аналитические результаты округляют до того же числа после запятой, что и у установленных параметров для соответствующих параметров процесса изготовления, или как задано точностью анализа. Расчеты осуществляют без округления аналитических результатов и округляют только конечный результат. Оборудование. Используют стандартный лабораторный рН-метр. Используют аналитические весы Mettler AT-100 и лабораторные весы Sartorius BP3100P. Фильтрование осуществляют на фильтре 0,45 мкм, используя PVDF мембранные фильтры (MillexHV или их эквиваленты). Время процесса регистрируют лабораторными таймерами. Используют боксы с биозащитой. Клетки хранят в Heraeus CO2-инкубаторах с контролируемой влажностью. Для перемешивания используют магнитные мешалки/бруски для перемешивания. Температуру регулируют с помощью криостатов Haake или Julabo и/или используя нагревательный блок с перемешиванием. Температуру измеряют, используя Pt-100 сенсоры, соединенные с самописцами R 1000 YOKOGAWA. Протокол исследований. Для исследования надежности стадии производства "хранение при низких значениях рН и повышенной температуре" Subcuvia NG в отношении инактивации вирусов, ключевые параметры, определяющие эффективность инактивации вирусов определяют, как описано ниже. Опыты осуществляют в условиях, подходящих для исследования надежности инактивирования вирусов при хранении в условиях низких значениях рН. Сравнение условий для крупномасштабного процесса и опыта в небольшом масштабе представлено в табл. А. Концентрация белка. Так как Subcuvia NG представляет собой экспериментальный продукт, интервал значений концентраций белка для готовой нерасфасованной смеси в настоящее время достаточно широко определен, т.е. составляет приблизительно 14-20%, и в дальнейшем может быть сужен. Таким образом, для исследования надежности обработки при низких значениях рН, проводят два опыта (схемы опытов) при двух экстремальных из возможных концентраций белков. Схема опыта 1 предусматривает концентрацию белка 13,5%; схема опыта 2 предусматривает концентрацию белка 20,9%. Концентрация белка в материале, полученном обычным способом, предоставлена департаментомPPD Products Support. Концентрацию белка материала, полученного обычным способом, заново не определяют, так как данные уже получены из анализов, проведенных после получения промежуточного Subcuvia NG, получаемого обычным способом. Так как материал, который используют в маломасштабном процессе, фильтруют в стерильных условиях и хранят при температуре 2-8 С перед началом маломасштабного процесса (то есть не подвергают каким-либо процедурам замораживания/оттаивания), какиелибо изменения в концентрации белка не предполагаются в конечной композиции профильтрованного в стерильных условиях промежуточного соединения. Величина рН. При производстве устанавливают интервал рН 4,4-4,9 (непосредственное измерение) для SubcuviaNG конечного контейнера на протяжении хранения при низких значениях рН. Для исследования эффективности и надежности обработки при низких значениях рН в условиях менее благоприятных для инактивации вирусов оба опыта осуществляют при более высоких установленных пределах, то есть при рН 4,90,1. Величину рН измеряют после введения метки и устанавливают на уровне верхнего предела, при необходимости. После хранения при низких значениях рН в течение 27 дней 5 ч, величину рН снова измеряют, используя способ непосредственного измерения рН и способ, рекомендованный Европейской Фармакопеей, то есть разбавляя до концентрации белка 1%, используя 0,9% раствор NaCl. Температура. В указанном процессе производства температуру на время хранения при низких значениях рН устанавливают 30-32 С. Для исследования надежности при хранении при низком рН в условиях менее благоприятных для инактивации вирусов, все маломасштабные опыты осуществляют в более низких пределах температурного интервала, то есть при 301 С. Для исследования потенциального влияния флуктуации температуры, температуру снижают до 251 С на 6 ч каждую неделю (то есть снижение температуры начинают в день 0,7, 14, 20 и день 27 хранения; нумерация дней относится к календарным дням, т.е. день 0 представляет собой день начала хранения). Ложно, снижение температуры до 251 С на 6 ч проводят дважды в неделю в первую и вторую недели хранения, то есть в течение дней 0 и 4 первой недели хранения и в течение дней 7 и 10 в течение второй недели хранения при низких значениях рН. Время. Время хранения обычно находится в интервале от 21 дня (необходимых для инактивации BVDV) до 28 дней (верхний предел исходя из технических/логистических соображений). Для исследования эффективности и надежности обработки при низких значениях рН в условиях менее благоприятных для инактивации вирусов, все маломасштабные опыты осуществляют ниже пределов указанных для интервала времен хранения; т.е. в течение 20 дней 4 ч для кратковременного варианта и хранения в течение 27 дней 5 ч для более длительного варианта. Меченое промежуточное хранят при низких значениях рН и повышенной температуре в течение 27 дней 5 ч, но образцы для определения титра вирусов отбирают через 20 дней 4 ч хранения, чтобы исследовать вирусный клиренс после 3 недель хранения (см. также табл. А). В целом, все 4 опыта с мечеными вирусами (2 с BVDV, и 2 с MMV) осуществляют для исследования надежности и эффективности инактивирования вирусов на стадии производства "хранение при низких значениях рН и повышенной температуре". Кроме того, проводят два немеченых контрольных опыта без введения метки для получения образцов для определения биохимических параметров. Кроме того,проводят два имитационно-меченых контрольных опыта, и образцы, отобранные в указанных опытах,используют для исследования потенциального эффекта (то есть цитотоксичности и вредного воздействия) процесса промежуточных на анализ титра вирусов. Для дальнейшей демонстрации эквивалентности маломасштабных процессов и крупномасштабных процессов осуществляют следующие биохимические анализы для конечного продукта до и после хранения при низких значениях рН: распределение по размерам молекул и ацетатцеллюлозный электрофорез. Таблица А Процесс и биохимические параметры маломасштабных опытов, сравнение с крупномасштабным производственным процессом. Параметры, интервалы для которых отличаются от крупномасштабного процесса, примененные для маломасштабного процесса, представлены жирным шрифтом 1 Так как Subcuvia NG представляет собой экспериментальный продукт, концентрация белка более узко еще не определена. Таким образом, два маломасштабных опыта осуществляют при двух экстремальных из возможных концентраций белка. 2 Так как период хранения еще не определен более узко, он зависит от результатов исследования клиренса вирусов. 3 Оба опыта осуществляют в течение 27 дней 5 ч и образцы для определения титров вирусов отбирают в 20 день хранения, так как данные об инактивации вирусов для варианта крупномасштабного производства соответствуют 21-22 дням хранения. 4 Температуру снижают до 251 С на 6 ч один раз в каждую неделю хранения (т.е. снижение температуры начинают в дни 0, 7, 14, 20 и 27; причем нумерация дней относится к календарным дням,т.е. днем 0 является день, в который начинают стадию хранения). Как уже обсуждалось в разделе 4.1.1 ("Температурный профиль"), снижение температуры до 251 С на 6 ч ошибочно осуществляют дважды в неделю в первую неделю и вторую неделю хранения (см. также DRl0407). 5 Способ, осуществленный в соответствии с указаниями Европейской Фармакопеи. Экспериментальная методика Из-за сложности последовательности, стадии введения вирусной метки, установления рН и фильтрования на фильтре 0,45 мм иллюстрируют на технологической схеме, представленной на фиг. 3 (толщина стрелок указывает на относительные объемы). Исходный материал. Для опыта 1 отбирают полученный обычным способом материал (номер лота IGSC64) с концентрацией белка 13,5%. Указанный материал используют для осуществления опытов при нижнем пределе возможной концентрации белка, при верхнем пределе рН интервала (то есть BVDV: 4,97 и MMV: 4,93) и при низшем пределе температурного интервала (то есть при 29,4 С). Для опыта 2 выбирают полученный обычным способом материал (номер лота IGSC64) с концентрацией белка 20,9%. Указанный материал используют для осуществления опытов при верхнем пределе возможной концентрации белка, при верхнем пределе интервала рН (то есть BVDV: 4,92 и MMV 4,86) и при нижнем пределе температурного интервала (то есть 29,4 С). Вирусная метка: BVDV, MMV. Хранение. В 45,5 мл каждого из исходных материалов вводят метку, используя 4,5 мл исходной суспензии вирусов, и отбирают образец 1 мл после 1-2 мин перемешивания. Образец немедленно разводят в отношении 1:3,16 (то есть 1 об. образца плюс 2,16 об. клеточной культуральной среды) соответствующей клеточной культуральной средой и титруют. Затем отбирают еще 3 мл образца и фильтруют через 0,45 мкмPVDF мембрану. Один мл отфильтрованного материала немедленно разводят в отношении 1:3,16 соответствующей клеточной культуральной средой и титруют. Установление значения рН. Величину рН аликвоты в 35 мл меченого вирусом исходного материала доводят до рН 4,90,1 (оба опыта), используя 0,5 М раствор НС 1 при перемешивании. Затем полученный материал разделяют на две аликвоты. Одну аликвоту в 30 мл используют для "хранения при низких значениях рН" и аликвоту в 5 мл используют для "удерживания температурного контроля (см. раздел "контроли удерживания"). Величину рН другой аликвоты в 10 мл меченого вирусом исходного материала доводят до рН 7,00,1, используя 0,5 М раствор NaOH, где 5 мл материала с установленным значением рН используют для "контроля удерживания рН". Остальные 5 мл материала с установленным значением рН используют для "объединенного контроля удерживания рН и температуры" (см. раздел "контроли удерживания"). Контроли удерживания. Для исследования механизма инактивации вирусов, т.е. выяснения того, происходит ли это за счет рН или за счет температуры, три контроля удерживания хранят в различных условиях: Каждую из 5 мл аликвот меченого вирусом и с установленным значением рН (рН 7,00,1) исходного материала фильтруют через 0,45 мкм PVDF мембранный фильтр в криоампулу. Одну аликвоту хранят при температуре 301 С вместе с меченым материалом процесса и затем хранят при указанной температуре до конца указанного процесса (рН контроль удерживания, "рННС"). Другую аликвоту одновременно хранят при температуре 2-8 С в течение 27 дней 5 ч (объединенный контроль удерживания рН и температуры, "с НС"). 5-мл аликвоту меченого вирусом с установленным значением рН (рН 4,90,1) и профильтрованного на 0,45-мкм фильтре исходного материала (см. выше "Установление рН") одновременно хранят при температуре 2-8 С до конца процесса (контроль удерживания температуры, "t НС"). Минимальный объем каждого из контролей удерживания после фильтрования всегда составляет более чем 3 мл, так что доступен соответствующий объем для определения титра вирусов после периода хранения. Хранение при низких значениях рН. Аликвоту в 30 мл меченого вирусом и с установленным значением рН (рН 4,90,1) Subcuvia NG промежуточного фильтруют через 0,45 мкм PVDF мембранный фильтр в 50 мл стеклянный пузырек. Минимальный объем Subcuvia NG промежуточного после фильтрования всегда оказывается более чем 24 мл. Таким образом, оказывается доступным достаточный объем для определения титра вирусов после периода хранения. Затем температуру уравновешивают при 301 С при перемешивании туда и обратно медленными движениями, используя водяную баню, причем температуру водяной бани регулируют в криостате с регулировкой температуры с внешним температурным сенсором. Внешний температурный сенсор и дополнительный Pt 100 электрод расположены в 50 мл стеклянном пузырьке, эквивалентном тому, который используют для хранения при низких значениях рН, причем каждый из них заполнен 30 мл воды, что является максимально возможным количеством меченого материала процесса после фильтрования. Температуру регистрируют непрерывно. Как только температура материала достигает 29 С,начинают отбор образца. Каждый из образцов немедленно разводят в отношении 1:3,16 (т.е. 1 об. образца плюс 2,16 об. клеточной культуральной среды) соответствующей холодной культуральной средой(которую хранят при температуре 2-8 С) для предотвращения дальнейшей инактивации вируса за счет низкого значения рН, и титруют. Во всех опытах промежуточное Subcuvia NG хранят при перемешивании (вперед и назад медленными движениями) при температуре 301 С в течение всего процесса в течение 27 дней 5 ч, со снижением температуры до 251 С в течение по меньшей мере 6 ч (6 ч) один раз в течение каждой недели хранения. Ошибочно, такое снижение температуры до 251 С на 6 ч осуществили дважды в неделю в первую неделю хранения и во вторую неделю хранения, т.е. в течение дней 0 и 4 хранения в первую неделю и в течение дней 7 и 10 хранения во вторую неделю хранения при низких значениях рН. Для рассмотрения, обращайтесь к разделу 4.1.1 ("Температурный профиль"). Далее отбирают образцы в соответствии с планом отбора образцов (см. раздел 3.2), немедленно разводят, как описано выше, и титруют. После завершения хранения при низких значениях рН при температуре 301 С,величину рН определяют непосредственным измерением и измерением по способу, рекомендованному в Европейской Фармакопее (то есть при разведении до 1% белка, используя 0,9% раствор NaCl). Контрольный опыт без вируса. Осуществляют два контрольных опыта, как раскрыто для меченых вирусом опытов, в которых обрабатывают немеченое и профильтрованное на 0,45-мкм фильтре промежуточное Subcuvia NG. Используют те же самые параметры процессов, что и установлены для меченых вирусом опытов 1 и 2 соответственно, за исключением того, что рН материала не устанавливают. Образцы для определения биохимических параметров отбирают в соответствии с планом отбора образцов (см. раздел 3.2). Цитотоксичность имитационно-меченого исходного материала (меченого 0,9:10 ВТ-средой для инфицированных клеток; образец фильтруют, как описано выше, перед титрованием) и имитационномеченого и с установленным значением рН промежуточного Subcuvia NG после фильтрования на 0,45 мкм фильтре. Образцы для определения цитотоксичности отбирают в соответствии с планом отбора образцов (см. раздел 3.2).Указанная композиция ВТ-среды для инфицированных клеток следующая: DMEM (содержащая 4,5 г/л D-глюкозы)+1% (об./об.) L-глутамина (200 мМ)+1% (об./об.) гентамицинсульфата (10 мг/мл)+1%