Способ определения генотипа ahasl1, набор для определения генотипа ahasl1 и изолированные полинуклеотиды устойчивых к гербицидам растений подсолнечника с множественными устойчивыми к гербицидам аллелями ahasl1
Номер патента: 23348
Опубликовано: 31.05.2016
Авторы: Зинг Биджай К., Вестон Брижит Дж., Эхартэ Мариель, Витт Шери Р., Зала Карлос, Булос Мариано
Формула / Реферат
1. Способ определения генотипа аллеля AHASL1 А122Т растения подсолнечника, включающий следующие стадии:
(a) получение кодирующей AHASL1 ДНК из растения подсолнечника;
(b) использование ДНК со стадии (а) в качестве матрицы для первой амплификации полимеразной цепной реакцией (ПЦР), содержащей указанную ДНК, полимеразу, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, прямой праймер AHASL1 и обратный праймер AHASL1 дикого типа,
где указанный обратный специфический праймер дикого типа отжигает по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 13 и 3'-терминальный нуклеотид С указанного обратного праймера комплементарен нуклеотиду G, который находится в положении 1 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 13;
(c) использование ДНК со стадии (а) в качестве матрицы для второй ПЦР амплификации, содержащей указанную ДНК, полимеразу, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, прямой праймер AHASL1 и обратный мутантный праймер AHASL1,
где указанный обратный мутантный праймер отжигает по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 14 и 3'-терминальный нуклеотид Т указанного обратного праймера комплементарен нуклеотиду А, который находится в положении 1 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 14;
(d) детектирование продуктов указанной первой и указанной второй ПЦР амплификации.
2. Способ по п.1, где указанный обратный специфический праймер дикого типа содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4.
3. Способ по п.1, где указанный обратный мутантный праймер AHASL1 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5.
4. Способ по п.1, где указанный прямой праймер AHASL1 отжигает нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 12.
5. Способ по п.1, где указанный прямой праймер AHASL1 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.
6. Способ по п.1, где указанная первая и указанная вторая ПЦР амплификации 1(b) и 1(с) осуществляются отдельно.
7. Способ по п.1, где указанная первая и указанная вторая ПЦР амплификации 1(b) и 1(с) осуществляются одновременно.
8. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию детектирования аллели AHASL1 A205V растения подсолнечника.
9. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию детектирования аллеля AHASL1 P197L растения подсолнечника.
10. Способ идентификации аллелей AHASL1 растения подсолнечника, включающий следующие стадии:
(a) получение кодирующей AHASL1 ДНК из растения подсолнечника;
(b) использование указанной ДНК в качестве матрицы для первой амплификации полимеразной цепной реакцией (ПЦР), содержащей указанную ДНК, полимеразу, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, первый прямой праймер AHASL1, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15, и первый обратный праймер AHASL1, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16;
(c) использование указанной ДНК в качестве матрицы для второй ПЦР амплификации, содержащей указанную ДНК, полимеразу, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, второй прямой праймер AHASL1, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17, и второй обратный мутантный праймер AHASL1, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 18;
(d) детектирование продуктов указанной первой и указанной второй ПЦР амплификации.
11. Способ по п.10, где указанная первая и указанная вторая ПЦР амплификации 1(а) и 1(b) осуществляются отдельно.
12. Способ по п.10, где указанная первая и указанная вторая ПЦР амплификации 1(а) и 1(b) осуществляются одновременно.
13. Набор для определения генотипа аллеля AHASL1 А122Т растения подсолнечника, содержащий:
(a) прямой праймер AHASL1 и обратный праймер AHASL1 дикого типа,
где указанный обратный праймер AHASL1 дикого типа отжигает по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 13 и 3'-терминальный нуклеотид С указанного обратного праймера комплементарен нуклеотиду G, который находится в положении 1 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 13;
(b) прямой праймер AHASL1 и обратный мутантный праймер AHASL1,
где указанный обратный мутантный праймер отжигает по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 14 и 3'-терминальный нуклеотид Т указанного обратного праймера комплементарен нуклеотиду А, который находится в положении 1 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 14.
14. Набор по п.13, дополнительно содержащий дезоксирибонуклеотидтрифосфаты и полимеразу, способную катализировать ПЦР амплификацию фрагмента гена AHASL1 подсолнечника, имеющего аллель А122Т, или фрагмента гена AHASL1 растения подсолнечника дикого типа.
15. Набор по п.13, где указанный прямой праймер AHASL1 отжигает нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 12.
16. Набор по п.13, где указанный прямой праймер AHASL1 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.
17. Набор по п.13, где указанный обратный праймер AHASL1 дикого типа содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4.
18. Набор по п.13, где указанный обратный мутантный праймер AHASL1 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5.
19. Набор по п.14, где указанная первая и указанная вторая ПЦР амплификации 11(а) и 11(b) осуществляются отдельно.
20. Набор по п.14, где указанная первая и указанная вторая ПЦР амплификации 11(а) и 11(b) осуществляются одновременно.
21. Набор по п.13, дополнительно содержащий один или более праймеров для детектирования аллеля AHASL1 A205V растения подсолнечника.
22. Набор по п.13, дополнительно содержащий один или более праймеров для детектирования аллеля AHASL1 P197L растения подсолнечника.
23. Набор для идентификации аллелей AHASL1 растения подсолнечника, содержащий:
(а) первый прямой праймер AHASL1, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15, и первый обратный праймер AHASL1, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16;
(b) второй прямой праймер AHASL1, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17, и второй обратный праймер AHASL1, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 18.
24. Набор по п.23, дополнительно содержащий дезоксирибонуклеотидтрифосфаты и полимеразу, способную катализировать ПЦР амплификации фрагмента гена AHASL1 растения подсолнечника, имеющего аллель А122Т; или фрагмента гена AHASL1 растения подсолнечника дикого типа, где первый фрагмент находится между указанным сайтом отжига указанного первого прямого праймера AHASL1 и указанным сайтом отжига указанного первого обратного праймера AHASL1 в гене AHASL1 подсолнечника, и второй фрагмент находится между указанным сайтом отжига указанного второго прямого праймера AHASL1 и указанным сайтом отжига указанного второго обратного праймера AHASL1 в гене AHASL1 подсолнечника.
25. Набор по п.23, где по меньшей мере один из указанных прямых праймеров AHASL1 содержит нарушение комплементарности.
26. Набор по п.24, где указанная первая и указанная вторая ПЦР амплификации 19(а) и 19(b) осуществляются отдельно.
27. Набор по п.24, где указанная первая и указанная вторая ПЦР амплификации 19(а) и 19(b) осуществляются одновременно.
28. Изолированный полинуклеотидный праймер, используемый в способе по п.1 или в наборе по п.13, причем указанный праймер включает одну из следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
29. Изолированный полинуклеотидный праймер, используемый в способе по п.10 или в наборе по п.23, причем указанный праймер включает одну из следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.
Текст
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА AHASL1, НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА AHASL1 И ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ УСТОЙЧИВЫХ К ГЕРБИЦИДАМ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА С МНОЖЕСТВЕННЫМИ УСТОЙЧИВЫМИ К ГЕРБИЦИДАМ АЛЛЕЛЯМИ AHASL1 Описаны способы определения генотипа устойчивых к гербицидам растений подсолнечника,содержащих два различных устойчивых к гербицидам аллеля гена большой субъединицы 1 ацетогидроксикислотной синтазы (AHASL1) подсолнечника, наборы для определения генотипа для гена AHASL1, а также используемые в них изолированные полинуклеотиды (праймеры).(71)(73) Заявитель и патентовладелец: БАСФ АГРОКЕМИКЭЛ ПРОДАКТС Б.Ф. (NL); НИДЕРА С.А. (AR) Область изобретения Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способу определения генотипа устойчивых к гербицидам растений подсолнечника, которые содержат два различных устойчивых к гербицидам аллеля гена большой субъединицы 1 ацетогидроксикислотной синтазы (AHASL1) подсолнечника, к набору для определения генотипа для гена AHASL1, а также к используемым в них изолированным полинуклеотидам (праймерам). Предшествующий уровень техники Ацетогидроксикислотная синтаза (AHAS; ЕС 4.1.3.18, также известная как ацетолактатная синтаза или ALS), является первым ферментом, который катализирует биохимический синтез разветвленных цепей аминокислот валюта, лейцина и изолейцина (Singh (1999), "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine", in Plant Amino Acids, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, p. 227-247). AHAS является местом приложения действия четырех структурно и химически различных семейств гербицидов, включающих сульфонилмочевины (Tan et al. (2005), Pest Manag. Sci. 61:246-57; Mallory-Smith andGerwick (1989), "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines" в Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. and Sonnet, P.E. eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., p. 277-288) и пиримидинилоксибензоаты (Subramanian et al. (1990), Plant Physiol. 94: 239244). Имидазолиноновые и сульфонилмочевинные гербициды широко используются в современном сельском хозяйстве, благодаря их эффективности при очень низкой дозе внесения и относительной нетоксичности для животных. Ингибируя активность AHAS эти семейства гербицидов предотвращают дальнейший рост и развитие восприимчивых растений, включая многие виды сорняков. Примерами коммерчески доступных имидазолиновых гербицидов являются PURSUIT (имазетапир), SCEPTER(имазахин) и ARSENAL (имазапир). Примерами сульфонилмочевинных гербицидов являются хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлоримурон этил, тифенсульфурон метил, трибенурон метил, бенсульфурон метил, никосульфурон, этаметилсульфурон метил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примисульфурон метил, циносульфурон, амидосульфурон, флазасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфурон этил и галосульфурон. Благодаря их высокой эффективности и низкой токсичности имидазолиноновые гербициды благоприятны для применения путем опрыскивания наземной части растений в широкий период вегетации. Возможность опрыскивания гербицидом наземной части растений в широкий период вегетации снижает расходы, связанные с приживаемостью и сохранением растений, и уменьшает необходимость предварительной подготовки перед использованием таких химикатов. Опрыскивание наземной части растений желаемых толерантных видов в результате также позволяет достичь максимального потенциального выхода желаемых видов растений вследствие отсутствия конкурентных видов. Однако возможность использования таких методик распыления зависит от наличия устойчивых к имидазолинону видов желаемых растений в области распыления. Среди большого разнообразия сельскохозяйственных зерновых культур некоторые виды бобовых,такие как соя, являются природно устойчивыми к имидазолиноновым гербицидам, вследствие их способности к быстрому метаболизму гербицидных соединений (Shaner and Robinson (1985), Weed Sci. 33:469-471). Другие зерновые, такие как кукуруза (Newhouse et al. (1992), Plant Physiol. 100:882-886) и рис (Barrett et al. (1989), Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York, p. 195-220) являются до некоторой степени чувствительными к имидазолиноновым гербицидам. Различная чувствительность к имидазолиноновым гербицидам зависит от химической природы отдельного гербицида и различного метаболизма соединения из токсичной в нетоксичную форму в каждом растении (Shaner et al. (1984),Plant Physiol. 76:545-546; Brown et al. (1987), Pestic.Biochem. Physiol. 27:24-29). Другие физиологические различия растений, такие как поглощение и передвижение веществ в растении, также играют важную роль в чувствительности (Shaner and Robinson (1985), Weed Sci. 33:469-471). Устойчивость растений к имдазолинонам, сульфонилмочевинам, триазолопиримидинам и пиримидинилоксибензоатам можно с успехом создать, используя мутагенез семян, микроспор, пыльцы и каллюса в Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (например, канола) Glycine max, Nicotiana tabacum, сахарной свекле (Beta vulgaris) и Oryza sativa (Sebastian et al. (1989), Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson et al.,1989, Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Newhouse et al. (1991), Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan et al.,(1991), Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourand et al. (1993), J. Heredity 84:91-96; Wright and Penner (1998),Theor. Appl. Genet. 96:612-620; патент США 5545822). Во всех случаях единственный частично доминантный ядерный ген обеспечивает устойчивость. Четыре устойчивых к имидазолинону растения пшеницы были предварительно выделены с последующим мутагенезом семян из Triticum aestivum L. cv. Fidel (Newhouse et al. (1992), Plant Physiol. 100:882-886). Исследование наследственности подтверждает,что единственный частично доминантный ген обеспечивает устойчивость. На основании изучения аллелей авторы делают вывод, что мутации в четырех идентифицированных линиях были расположены в одном и том же локусе. Один из резистентных генов культурного сорта растения Fidel был обозначен FS-1 023348 4 (Newhouse et al. (1992), Plant Physiol. 100:882-886). Существующие в природе популяции растений, которые оказались устойчивыми к имидазолиноновым и/или сульфонилмочевинным гербицидам, также были использованы для получения устойчивых к гербицидам селекционных линий подсолнечника. В частности, две линии подсолнечника, которые являются устойчивыми к сульфонилмочевинным гербицидам, были получены с использованием идиоплазмы,берущей начало из дикой популяции подсолнечника однолетнего (Helianthus annuus), в качестве источника свойств устойчивости к гербицидам (Miller and Al-Khatib (2004), Crop Sci, 44:1037-1038), Ранее,White et al. (2002), Weed Sci. 50:432-437) сообщали, что отдельные растения из дикой популяции подсолнечника однолетнего из Южной Дакоты, США, были перекрестно резистентны к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам. Анализ части кодирующей области генов большой субъединицы ацетогидроксикислоной синтазы (AHASL) индивидуальных растений из этой популяции обнаружил точечные мутации, которые дают в результате аминокислотное замещение Ala-Val в белке AHASL подсолнечника, которое соответствует Ala205 в белке AHASL дикого типа Arabidopsis thaliana (White et al.(2003), Weed Sci. 51:845-853). Ранее, Аль-Хатиб и Миллер 2000) Crop Sci. 40:869) сообщали о получении четырех устойчивых к имидазолинону селекционных линий подсолнечника. Компьютерное моделирование трехмерных конформаций комплекса AHAS-ингибитор предсказало различные аминокислоты в предполагаемых местах связывания ингибитора, как в местах, где индуцированные мутации будут вероятно обеспечивать селективную устойчивость к имидазолинонам (Ott et al.(1996), J. Mol. Biol. 263:359-368). Растения табака, полученные с некоторыми из этих рационально обозначенных мутаций в предполагаемых местах связывания фермента AHAS, фактически имели выраженную специфическую устойчивость к единственному классу гербицидов (Ott et al. (1996), J. Mol. Biol. 263:359-368). Растения, устойчивые к имидазолиноновым гербицидам, также описаны в ряде патентов США 4761373, 5331107, 5304732, 6211438, 6211439 и 6222100, особенно описывается использование измененного гена AHAS для вызывания устойчивости к гербицидам в растениях, и особенно описываются некоторые устойчивые к имидазолинону линии кукурузы. В патенте США 5013659 раскрыты растения,проявляющие устойчивость к гербицидам вследствие мутации по меньшей мере одной аминокислоты в одной или более консервативной области. Описанные мутации кодируют либо перекрестную устойчивость к имидазолинонам и сульфонилмочевинам или специфическую устойчивость к сульфонилмочевине, но специфическая устойчивость к имидазолинону не описана. В патенте США 5731180 и патенте США 5767361 обсуждается выделенный ген, имеющий единичное аминокислотное замещение в аминокислотной последовательности AHAS односемядольного растения дикого типа, которое дает в результате специфическую устойчивость к имидазолинону. Кроме того, растения риса, устойчивые к гербицидам, которые препятствуют AHAS, были получены путем воспроизведения мутации и также путем селекции устойчивых к гербицидам растений из пула растений риса, полученных с помощью другой культуры. См. патенты США 5545822, 5736629, 5773703, 5773704, 5952553 и 6274796. В растениях, как и во всех других исследованных организмах, фермент AHAS содержит две субъединицы: большую субъединицу (каталитическая роль) и малую субъединицу (регуляторная роль) (Duggleby and Pang (2000), J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36). Большая субъединица AHAS (также обозначенная здесь как AHASL) может быть кодирована с помощью единичного гена, как в случае Arabidopsis, и сахарной свеклы, или с помощью множества членов семейства генов, как в маисе, каноле и хлопке. Специфические единичные нуклеотидные замещения в большой субъединице обеспечивают ферменту степень чувствительности к одному или более классов гербицидов (Chang and Duggleby (1998), Biochem J. 333:765-777). Например, хлебная пшеница, Triticum aestivum L., содержит три гомологичных гена большой субъединицы ацетогидроксикислотной синтазы. Каждый из генов проявляет значительную экспрессию, основанную на ответе гербицида и биохимических данных из мутантов в каждом из трех генов (Ascenzi et al.(2003), International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref. No. S10-17). Кодирующие последовательности всех трех генов разделяют обширную гомологию на нуклеотидном уровне (WO 03/014357). Секвенированием генов AHASL из различных сортов Triticum aestivum, была найдено, что молекулярной основой толерантности к гербицидам в большинстве IMI-толерантных (имидазолинон-толерантных) линий является мутация S653(At)N, характеризующаяся замещением аспарагина на серии в положении эквивалентном аминокислоте 653 в Arabidopsis thaliana (WO 03/01436; WO 03/014357). Эта мутация обусловлена единичным нуклеотидным полиморфизмом (SNP) в последовательности ДНК, кодирующей белок AHASL. Также известно, что множество генов AHASL встречается в двудольных видах растений. Ранее,Колкман с сотр. 2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159) описали идентификацию, клонирование и секвенирование трех генов AHASL (AHASLI, AHASL2 и AHASL3) из устойчивых к гербицидам и дикого типа генотипов подсолнечника (Helianthus annuus L.). Колкман с сотр. сообщали, что устойчивость к гербицидам была обусловлена либо Pro197Leu (использованы номенклатурные положения аминокислотAHASL Arabidopsis) замещением или Ala205Val замещением в белке AHASL 1 и что каждое из этих замещений обеспечивает устойчивость и к имидазолиноновым, и к сульфонилмочевинным гербицидам. Благодаря их высокой эффективности и низкой токсичности, имидазолиноновые гербициды благоприятны для сельскохозяйственного использования. Однако возможность использования имидазолиноновых гербицидов в определенных системах производства зерновых зависит от наличия устойчивых к имидазолинону сортов интересующих зерновых культур. Для получения таких устойчивых к имидазолинону сортов производителям растений необходимо разрабатывать селекционные линии, устойчивые к имидазолинону. Таким образом, необходимы дополнительные устойчивые к имидазолинону селекционные линии и сорта зерновых растений, а также способы и композиции для получения и использования устойчивых к имидазолинону селекционных линий и сортов. Сущность изобретения Настоящее изобретение представляет новые устойчивые к гербицидам растения подсолнечника, которые содержат два различных устойчивых к гербицидам аллеля гена большой субъединицы 1 ацетогидроксикислотной синтазы (AHASL1) подсолнечника. В частности, растения подсолнечника по изобретению имеют повышенную устойчивость к гербицидам, ингибирующим ацетогидроксикислотную синтазу(AHAS), по сравнению с растениями подсолнечника дикого типа. Устойчивые к гербицидам растения подсолнечника по изобретению содержат первый аллель AHASL1 и второй аллель AHASL1, причем первый и второй аллели AHASL1 кодируют первый и второй устойчивый к гербициду белок подсолнечника AHASL1 соответственно. Первый аллель AHASL1 кодирует белок подсолнечника AHASL1, содержащий А 122 Т аминокислотное замещение. Второй аллель AHASL1 кодирует белок подсолнечникаAHASL1, содержащий A205V аминокислотное замещение или P197L аминокислотное замещение. Также представлены части растений подсолнечника, ткани, клетки и семена, которые содержат первый и второй аллели AHASL1. Настоящее изобретение далее представляет способ получения гибридных растений подсолнечника,которые обладают устойчивостью по меньшей мере к одному ингибирующему AHAS гербициду. Способ включает перекрстное опыление первого растения подсолнечника со вторым растением подсолнечника так, чтобы получить гибридные семена подсолнечника, которые можно будет высеять и затем вырастить гибридные растения подсолнечника, в частности F1 гибрид растения подсолнечника. Первое растение подсолнечника содержит в своем геноме по меньшей мере одну копию первого аллеля гена AHASL1, и второе растение подсолнечника содержит в своем геноме по меньшей мере одну копию второго аллеля гена AHASL1. Предпочтительно первое растение подсолнечника является гомозиготным для первого аллеля, и второе растение подсолнечника является гомозиготным для второго аллеля. Первый аллель кодирует белок AHASL1 подсолнечника, содержащий А 122 Т аминокислотное замещение. Второй аллель кодирует белок AHASL1 подсолнечника, содержащий A205V аминокислотное замещение или P197L аминокислотное замещение. Настоящее изобретение дополнительно представляет способы контроля сорняков или нежелательной растительности в окрестности растений подсолнечника по изобретению. Один способ включает нанесение эффективного количества ингибирующего AHAS гербицида, в частности имидазолинонового или сульфонилмочевинного гербицида, на сорняки и растения подсолнечника. Другой способ включает контактирование семян подсолнечника по настоящему изобретению перед посевом и/или после проращиваниях эффективным количеством ингибирующего AHAS гербицида, в частности имидазолинонового или сульфонилмочевинного гербицида. Настоящее изобретение далее предлагает семена подсолнечника по настоящему изобретению, обработанные эффективным количеством ингибирующего AHAS гербицида. Растения подсолнечника и семена, используемые в этих способах, содержат в своем геноме первый аллель AHASL1 и второй аллель AHASL1. Первый аллель AHASL1 кодирует белок AHASL1 подсолнечника, содержащий А 122 Т аминокислотное замещение. Второй аллель AHASL1 кодирует белок AHASL1 подсолнечника, содержащий A205V аминокислотное замещение или P197L аминокислотное замещение. Настоящее изобретение далее представляет способы контроля паразитических сорняков Orobanchecumana и Orobanche септа, также известных как заразиха, на пораженных растениях подсолнечника. Способ включает нанесение эффективного количества имидазолинонового гербицида, на сорняки и устойчивые к гербицидам растения подсолнечника по настоящему изобретению, в частности растения подсолнечника, содержащие два А 122 Т аллеля или растения подсолнечника, содержащие один AHASL1 А 122 Т аллель и один A205V AHASL1 аллель. Настоящее изобретение представляет диагностические способы для идентификации аллелей генаAHASL1 в индивидуальном подсолнечнике. Такие диагностические способы включают амплификацию полимеразной цепной реакцией (ПЦР) специфических областей гена AHASL1, с использованием праймеров, предназначенных для отжига специфических сайтов в генах AHASL1 подсолнечника, таких как,например, сайты при или вблизи мутаций гена AHASL1. Дополнительно представлены праймеры, используемые в этих способах и наборы для осуществления способа. Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлено графическое изображение влияния листового нанесения имазапира на высоту растений в течение 14 дней после обработки для гомозиготных материалов с мутациями А 122 Т иA205V и гетерозиготных генотипов А 205 + А 122 Т. Средняя высота (% от необработанных участков) обозначается символами и границы погрешности представляют стандартное отклонение от средних значений. На фиг. 2 представлено графическое изображение влияния листового нанесения имазапира на показатель фитотоксичности (PI) в течение 14 дней после обработки для гомозиготных материалов с мутациями А 122 Т и A205V и гетерозиготных генотипов А 205 + А 122 Т. Среднее значение PI обозначается символами и границы погрешности представляют стандартное отклонение от средних значений. На фиг. 3 представлено графическое изображение влияния листового нанесения имазапира на накопление биомассы в течение 14 дней после обработки для гомозиготных материалов с мутациями А 122 Т иA205V и гетерозиготных генотипов А 205 + А 122 Т. Среднее значение сухой биомассы (% от необработанных участков) обозначается символами и границы погрешности представляют стандартное отклонение от средних значений. На фиг. 4 представлена фотографическая иллюстрация продуктов ПЦР амплификации с использованием праймеров p-AHAS18/pAHAS-19 и последующим электрофорезом в агарозном геле. Полоса 1HI; полоса 9 и 10: L2. На фиг. 5 представлена фотографическая иллюстрация продуктов ферментативного сбраживания продуктов ПЦР амплификации с BmgB I и последующим электрофорезом в агарозном геле. Полоса М,молекулярный массовый маркер; полоса 1: ВТК 47 (дикий тип); полоса 2: GM40 (А 122 Т); полоса 3: F1 растение из перекрестного cmsBTK47GM40; и полоса 4: cmsGM40 (A122T). На фиг. 6 представлена фотографическая иллюстрация продуктов ПЦР амплификации, полученных с использованием p-AHAS NIDF/AHAS 122 TMU комбинации. Полоса 1, молекулярный массовый маркер (25 п.о. маркер), полоса 2, молекулярный массовый маркер (100 п.о. маркер), полоса 3, 122 индивидуальный гомозиготный, полоса 4, 205 гомозиготный индивидуальный, полоса 5, 197 гомозиготный индивидуальный, полоса 6, WT (гаплотип 1), полоса 7, 122/WT индивидуальный, полоса 8, 122/205 индивидуальный, линия 9, 122/197 индивидуальный, линия 10, вода (негативный контроль), полоса 11, молекулярный массовый маркер (25 п.о. маркер), полоса 12, молекулярный массовый маркер (100 п.о. маркер). На фиг. 7 представлена фотографическая иллюстрация продуктов ПЦР амплификации, полученных с использованием p-AHAS NIDF 7 AHAS 122 TWT комбинации. Полоса 1, молекулярный массовый маркер (25 п.о. маркер), полоса 2, молекулярный массовый маркер (100 п.о. маркер), полоса 3, 122 гомозиготный индивидуальный, полоса 4, 205 гомозиготный индивидуальный, полоса 5, 197 гомозиготный индивидуальный, полоса 6, WT (гаплотип 1), полоса 7, 122/WT индивидуальный, полоса 8, 122/205 индивидуальный, линия 9, 122/197 индивидуальный, линия 10, вода (негативный контроль), полоса 11, молекулярный массовый маркер (25 п.о. маркер), полоса 12, молекулярный массовый маркер (100 п.о. маркер). На фиг. 8 представлено сравнение последовательности, показывающее различие в нуклеотидных последовательностях гаплотипов AHASL1 подсолнечника, где геномная ДНК подсолнечника каждого гаплотипа (Нар) амплифицирована с использованием пары праймеров p-AHAS NIDF/AHAS122TWT или пары праймеров р-AHAS NIDF/AHAS 122 TMU. Положение праймеров указано стрелками. Положения нуклеотидной последовательности, кодирующей (АСС)n повтор (кодирует поли-Thr область в предполагаемом транспортном пептиде) и INDELs в нуклеотидной последовательности AHASL1, выделены жирным шрифтом и цветом соответственно. (АСС)п повтор и INDELS предполагаются в соответствующей части нуклеотидной последовательности AHASL1, которая кодирует транспортный пептид AHASL1. Положение единичного нуклеотидного полиморфизма А 122 Т (SNP) указано с помощью ( ). Числа в конце последовательностей показывают существующий размер фрагмента каждого гаплотипа, амплифицированного либо с парой праймеров p-AHAS NIDF/AHAS122TWT (Hap1-5) либо с парой праймеров pAHAS NIDF/AHAS 122 TMU (Нар 6). На фиг. 9 представлена фотографическая иллюстрация продуктов ПЦР амплификации, полученных с использованием экстрактов ДНК из тканей подсолнечника из растений, которые являются или гетерозиготными для аллеля AHASL1 А 122 Т (НЕТ), гомозиготными (MUTANT) для аллеля AHASL1 А 122 Т,или дикого типа при локусе AHASL1 (WT). ПЦР амплификация выполнялась, как описано в примере 7 и продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2% (мас./об.) агарозном геле. На фиг. 10 представлено графическое изображение повреждений растений (средний % фитотоксичности) при дозе 200 г аи/га имазамокса, определяемое на 9-12 дни после обработки (левая половина) и на 25-30 дни после обработки (правая половина) расположенные в четырех местностях в 2007 для четырех разных типов гибридов. Четыре местности использовали: Велва, СД, США; Анжер, Фр; Сантэ, Фр; и Формоза, Арканзас. Четыре различных типа гибридов, представленные на фиг. 10, представляют собой А 122 Т гомозиготный (CLHA-Plus гомо), А 122 Т/А 205 (CLHA-Plus/IMISUN гетеро), А 122 Т гетерозиготный (CLHA-Plus гетеро), и A205V гомозиготный (IMISUN гомо). На фиг. 11 представлено графическое изображение повреждений растений различных типов гибри-4 023348 дов подсолнечника, перенесших CLHA-Plus мутацию, после нанесения имазамокса. Четыре различных типа гибридов, представленные на фиг. 11, представляют собой А 122 Т гомозиготный (CLHA-Plus гомо),А 122 Т/А 205 (CLHA-Plus/IMISUN гетеро), А 122 Т гетерозиготный (CLHA-Plus/WT гетеро), и A205V гомозиготный (IMISUN гомо). На фиг. 12 представлено графическое изображение повреждения растений различных типов гибридов подсолнечника, перенесших CLHA-Plus мутацию, после нанесения имазапира (CLHA-Plus гомозиготный: b=0.200.06, Р 0.48 CLHA-Plus/IMISUN гетерозиготный: b: 0.260.07, Р 0.0019; CLHAPlus/WT: b: 0.550.18, P0.0109). Четыре различных типа гибридов, представленные на фиг. 12, представляют собой А 122 Т гомозиготный (CLHA-Plus гомо), А 122 Т/А 205 (CLHA-Plus/IMISUN гетеро),А 122 Т гетерозиготный (CLHA-Plus/WT гетеро), и A205V гомозиготный (IMISUN гомо). На фиг. 13 представлено графическое изображение активности фермента AHAS (выраженной как процент от необработанного контроля) четырех линий подсолнечника в присутствии 100 мкМ имазамокса (левая половина) или 100 мкМ имазапира (правая половина). На фиг. 14 представлено графическое изображение активности фермента AHAS (выраженной как процент от необработанного контроля) пяти линий подсолнечника в присутствии повышенных уровней имазамокса. Перечень последовательностей Нуклеиново-кислотные и аминокислотные последовательности, приведенные в указанном перечне последовательностей, показаны с использованием стандартных буквенных аббревиатур для нуклеотидных оснований и трехбуквенных кодов для аминокислот. Последовательности нуклеиновых кислот следуют стандартному условному обозначению начало при 5' конце последовательности и направлены вперед (например, справа налево в каждой линии) к 3' концу. Показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но понятно, что комплементарные цепи будут включаться с помощью' любых ссылок в представленную цепь. Аминокислотные последовательности следуют стандартному условному обозначению начало при амино-конце последовательности и направлены вперед (например,справа налево в каждой линии) к карбокси-концу.SEQ ID NO: 1 представляет нуклеотидную последовательность p-AHAS18.SEQ ID NO: 2 представляет нуклеотидную последовательность p-AHAS19.SEQ ID NO: 3 представляет нуклеотидную последовательность p-AHAS NIDF.SEQ ID NO: 4 представляет нуклеотидную последовательность AHAS 122 TWT.SEQ ID NO: 5 представляет нуклеотидную последовательность AHAS 122 TMU.SEQ ID NO: 6 представляет нуклеотидную последовательность части AHASL1 гаплотипа 1 подсолнечника (Нар 1), который показан на фиг. 8.SEQ ID NO: 7 представляет нуклеотидную последовательность части AHASL1 гаплотипа 2 подсолнечника (Нар 2), который показан на фиг. 8.SEQ ID NO: 8 представляет нуклеотидную последовательность части AHASL1 гаплотипа 3 подсолнечника (Нар 3), который показан на фиг. 8.SEQ ID NO: 9 представляет нуклеотидную последовательность части AHASL1 гаплотипа 4 подсолнечника (Нар 4), который показан на фиг. 8.SEQ ID NO: 10 представляет нуклеотидную последовательность части AHASL1 гаплотипа 5 подсолнечника (Нар 5), который показан на фиг. 8.SEQ ID NO: 11 представляет нуклеотидную последовательность части AHASL1 гаплотипа 6 подсолнечника (Нар 6), который показан на фиг. 8.SEQ ID NO: 12 представляет нуклеотидную последовательность, соответствующую положению праймера p-AHAS NIDF внутри нуклеотидной последовательности AHASL1, показанной на фиг. 8 (см. верхнюю стрелку на фиг. 8). Праймер p-AHAS NIDF отжигает нуклеотидную последовательность, которая является комплементом нуклеотидной последовательности, представленной в виде SEQ IDNO: 12.SEQ ID NO: 13 представляет нуклеотидную последовательность места отжига праймера AHAS 122TWT внутри нуклеотидных последовательностей AHASL1 Hapl-Нар 5 (SEQ ID NO: 6-10 соответственно),показанных на фиг. 8 (см. нижнюю стрелку на фиг. 8).SEQ ID NO: 14 представляет нуклеотидную последовательность места отжига праймера AHAS 122TMU внутри нуклеотидной последовательности AHASL1 Нарб (SEQ ID NO: 11), показанной на фиг. 8(см. нижнюю стрелку на фиг. 8).SEQ ID NO: 15 представляет нуклеотидную последовательность HA122CF.SEQ ID NO: 16 представляет нуклеотидную последовательность HA122wt.SEQ ID NO: 17 представляет нуклеотидную последовательность HA122mut.SEQ ID NO: 18 представляет нуклеотидную последовательность HA122CR.SEQ ID NO: 19 представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую устойчивый к гербицидам белок AHASL1, содержащий аминокислотное замещение А 122 Т, линий подсолнечника S4897 иSEQ ID NO: 20 представляет часть длины аминокислотной последовательности устойчивого к гер-5 023348SEQ ID NO: 21 представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый устойчивый к гербицидам белок AHASL1, содержащий аминокислотное замещение P197L, линии подсолнечникаSEQ ID NO: 22 представляет аминокислотную последовательность зрелого устойчивого к гербицидам белка AHASL1, кодируемого нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 21.SEQ ID NO: 23 представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый устойчивый к гербицидам белок AHASL1, содержащий аминокислотное замещение A205V, гаплотипа 5 Helianthusannuus, как описанная в Банке Генов подAY541455 и Колкманом с сотр. (2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159. SEQ ID NO: 23 соответствует нуклеотидам 244-1959 нуклеотидной последовательности из Банка ГеновAY541455.SEQ ID NO: 24 представляет аминокислотную последовательность зрелого устойчивого к гербицидам белка AHASL1, кодируемого нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 23.SEQ ID NO: 24 соответствует аминокислотам 82-652 аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью из Банка ГеновAY541455. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к устойчивым к гербицидам растениям подсолнечника, содержащим в своем геноме два различных аллеля гена AHASL1 подсолнечника. Каждый из двух различных аллелей кодирует белок AHASL1 подсолнечника, который содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности AHASL1 подсолнечника дикого типа одной или более аминокислотами. Каждый из аллелей AHASL1 по настоящему изобретению придает растению подсолнечника повышенную устойчивость или толерантность к ингибирующим AHAS гербицидам, в частности имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам. Настоящее изобретение далее относится к способам изготовления этих растений подсолнечника и способам контроля сорняков или нежелательной растительности, произрастающей вблизи растений подсолнечника по настоящему изобретению. Настоящее изобретение основано на открытии, что F1 гибрид растения подсолнечника, который содержит единичную копию каждого из двух различных устойчивых к гербициду аллелей AHASL1 подсолнечника, включает коммерчески допустимые уровни устойчивости к AHAS гербицидам. Таким образом, настоящее изобретение находит применение для получения гибридных растений подсолнечника,путем предоставления производителям растений поддержки, например, первой линии подсолнечника,которая является гомозиготной для первого устойчивого к гербицидам аллеля AHASL1 и второй линии подсолнечника, которая является гомозиготной для второго устойчивого к гербицидам аллеля AHASL1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения способы включают использование толерантных к гербицидам или устойчивых к гербицидам растений. "Толерантное к гербицидам" или "устойчивое к гербицидам" растение означает, что растение является толерантным или устойчивым по меньшей мере к одному гербициду при уровне, при котором обычно гибнут или задерживают рост обычные растения или растения дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения толерантные к гербицидам растения по изобретению содержат толерантный к гербицидам или устойчивый к гербицидам белок AHASL. Термин "толерантный к гербицидам белок AHASL" или "устойчивый к гербицидам белокAHASL" означает, что такой белок AHASL проявляет более высокую активность AHAS по сравнению с активностью AHAS белка AHASL дикого типа в присутствии по меньшей мере одного гербицида, который мешает активности AHAS и при концентрации или уровне гербицида, который ингибирует активность AHAS белка AHASL дикого типа. Более того, активность AHAS такого толерантного к гербицидам или устойчивого к гербицидам белка AHASL может быть обозначена как "толерантная к гербицидам" или "устойчивая к гербицидам" активность AHAS. Для настоящего изобретения термины "толерантный к гербицидам" и "устойчивый к гербицидам" используются взаимозаменяемо и имеют эквивалентные значения и эквивалентный объем. Аналогично,термины "толерантность к гербицидам" и "устойчивость к гербицидам" используются взаимозаменяемо и имеют эквивалентные значения и эквивалентный объем. Аналогично, термины "устойчивый к имидазолинону" и "устойчивость к имидазолинону" используются взаимозаменяемо и имеют эквивалентные значения и эквивалентный объем с терминами "толерантный к имидазолинону" и "толерантность к имидазолинону" соответственно. Настоящее изобретение представляет растения, ткани растений, клетки растений и клетки-хозяева с повышенной устойчивостью или толерантностью по меньшей мере к одному гербициду, в частности,имидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербициду. Предпочтительное количество или концентрация гербицида представляет собой "эффективное количество" или "эффективную концентрацию". Под "эффективным количеством" или "эффективной концентрацией" понимают количество и концентрацию, соответственно, которые достаточны для уничтожения или ингибирования роста похожих рас-6 023348 тений дикого типа, тканей растений, клеток растений или клеток-хозяев, но при этом указанное количество не уничтожает или не ингибирует сильно рост устойчивых к гербицидам растений, тканей растений,клеток растений или клеток-хозяев по настоящему изобретению. Обычно, эффективным количеством или эффективной концентрацией гербицида является количество или концентрация, которые традиционно используются в сельскохозяйственных производственных системах для уничтожения интересующих сорняков. Такие количества известны или могут быть легко определены средним специалистом в данной области. В одном из вариантов осуществления изобретения предлагаются растения подсолнечника, которые содержат коммерчески допустимые уровни устойчивости или толерантности к ингибирующему AHAS гербициду. До тех пор пока другое не указано или другое не очевидно из контекста, растения подсолнечника, которые содержат такой уровень устойчивости или толерантности к ингибирующему AHAS гербициду являются устойчивыми или толерантными к нанесению эффективного количества или эффективной концентрации по меньшей мере одного ингибирующего AHAS гербицида. Как указано выше, эффективным количеством или концентрацией гербицида является количество или концентрация, которые традиционно используются в сельскохозяйственных производственных системах для уничтожения интересующих сорняка или сорняков, и такие количества известны или могут быть легко определены средним специалистом в данной области. Под "похожими растениями дикого типа, тканями растений, клетками растений или клеткамихозяевами" понимаются растения, ткани растений, клетки растений или клетки-хозяева, соответственно,которые не имеют свойств устойчивости к гербицидам и/или полинуклеотидов по изобретению, которые раскрыты здесь. Использование термина "дикого типа" не означает, что растения, ткани растений, клетки растений или клетки-хозяева не имеют рекомбинантную ДНК в их геноме, и/или не имеют свойств устойчивости к гербицидам, которые различны с раскрытыми в настоящем описании. До тех пор, пока ясно не указано другое, термин "растение" означает растение на любой стадии развития, а также любую часть или части растения, которые могут быть прикреплены или отделены от целого неповрежденного растения. Такие части растения включают, но не ограничиваются ими, органы,ткани и клетки растения. Примеры частей растений включают стебель, лист, корень, соцветие, цветок,цветок компактного соцветия, фрукт, цветоножку, плодоножку, тычинку, пыльник, рыльце, столбик, завязь, лепесток, чашелистик, плодолистик, конец корня, корневой чехлик, корневой волосок, листовой волосок, семенной волосок, пыльцевое зерно, микроспору, семядолю, гипокотиль, эпикотиль, ксилему,флоэму, паренхиму, эндосперм, клетку-спутник, замыкающую клетку и любые другие известные органы,ткани и клетки растения. Кроме того, общепризнано, что семя является растением. В одном из вариантов изобретение предлагает растения подсолнечника, содержащие в своем геноме по меньшей мере одну копию мутантного аллеля AHASL1 А 122 Т и по меньшей мере одну копию мутантного аллеля AHASL1 А 205 Т. Такое растение подсолнечника содержит коммерчески допустимый уровень толерантности по меньшей мере к одному ингибирующему AHAS гербициду, в частности имидазолиноновому гербициду. Такие растения находят применение в сельском хозяйстве, особенно в методах контроля сорняков, включающих использование имидазолиноновых гербицидов, как описано здесь. В другом варианте, изобретение предлагает растения подсолнечника, содержащие в своем геноме по меньшей мере одну копию мутантного аллеля AHASL1 А 122 Т и по меньшей мере одну копию мутантного аллеля AHASL1 P197L. Такое растение подсолнечника содержит коммерчески допустимый уровень толерантности по меньшей мере к одному ингибирующему AHAS гербициду, в частности сульфонилмочевинному и/или имидазолиноновому гербициду. Такие растения находят применение в сельском хозяйстве, особенно в методах контроля сорняков, включающих использование имидазолиноновых и/или сульфонилмочевинных гербицидов, как описано здесь. Настоящее изобретение включает использование растения подсолнечника, содержащего генAHASL1, который содержит А 122 Т мутацию. Такой ген AHASL1 кодирует белок AHASL1, содержащий А 122 Т аминокислотное замещение. Настоящее изобретение не зависит от использования редких сортов,линий подсолнечника или растений, содержащих ген AHASL1 с А 122 Т мутацией. Любое растение подсолнечника, содержащее по меньшей мере один аллель гена AHASL1 с А 122 Т мутацией может быть использовано в описанных здесь способах. В одном из вариантов осуществления изобретения ген AHASL1 с А 122 Т мутацией содержит полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 19 или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 20. Примером линии подсолнечника, содержащей по меньшей мере одну копию мутантного аллеляAHASL1 А 122 Т, является GM40 (см. WO 2007005581 и предварительную патентную заявку США 60/695952; поданную 1 июля 2005 г.; оба включены здесь с помощью ссылки). Хранение семян подсолнечника GM40 было осуществлено в патентном депозитарии Американской коллекции типовых культур (АТСС), Манассас, VA 20110 США, 17 мая 2005, и присвоен АТСС патентный депозитарный номер РТА-6716. Срок хранения линии подсолнечника GM40 был указан не менее 30 лет и не менее 5 лет после последнего требования предоставления образца депозита и является общепринятым в АТСС. Кроме того, заявители удовлетворили все требования 37 C.F.R.1.801-1.809, включающие предоставле-7 023348 ние критериев жизнеспособности образца. Другим примером линии подсолнечника, содержащей по меньшей мере одну копию мутантного аллеля AHASL1 А 122 Т является GM1606 (см. WO 2007005581). Хранение семян подсолнечника GM1606 было осуществлено в патентном депозитарии Американской коллекции типовых культур (АТСС), Манассас, VA 20110 США, 19 мая 2006 г., и получен АТСС патентный депозитарный номер РТА-7606. Срок хранения линии подсолнечника GM1606 был указан не менее 30 лет и не менее 5 лет после последнего требования предоставления образца депозита и является общепринятым в АТСС. Кроме того, заявители удовлетворили все требования 37 C.F.R.1.801-1.809, включающие предоставление критериев жизнеспособности образца. Настоящее изобретение включает использование растения подсолнечника, содержащего генA205V аминокислотное замещение. Настоящее изобретение не зависит от использования редких сортов,линий подсолнечника или растений, содержащих ген AHASL1 с A205V мутацией. Любое растение подсолнечника, содержащее по меньшей мере один аллель гена AHASL1 с A205V мутацией, может быть использовано в описанных здесь способах. В одном из вариантов осуществления изобретения генAHASL1 с A205V мутацией содержит полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность,представленную в виде SEQ ID NO: 23 или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 24. Растения подсолнечника, содержащие по меньшей мере один аллель гена AHASL1 с A205V мутацией, широко используются в коммерческом производстве подсолнечника и являются легкодоступными. Любой сорт такого коммерчески доступного растения подсолнечника может быть использован в описанных здесь способах. Такими сортами являются доступные от различных коммерческих компаний (например, Nidera S.A., Буэнос-Айрес, Арентина; Dekalb Genetics Corporation, Dekalb, Иллинойс, США; Mycogen Seeds, Индианаполис, Индиана, США; Seeds 2000, Breckenridge, Миннесота, США; Triumph SeedCompany, Rails, Техас, США,), источников и включают, но не ограничиваются ими, Paraiso 101CL, Paraiso 102CL, DKF38,-80CL, 8H429CL, 8H419CL, 8H386CL, 8H358CL, 629CL, 630,CL, 4682NS/CL,4880NS/CL, Barracuda, Charger, Viper, 620CL, 650CL и 660CL. Кроме того, семена растений подсолнечника, содержащих по меньшей мере один аллель гена AHASL1 с A205V мутацией, сохраняются в Национальном центре сохранения генетических источников, Форт Коллинз, Колорадо, и могут быть получены по номерам PI 633749 и PI633750. Настоящее изобретение включает использование растения подсолнечника, содержащего генP197L аминокислотное замещение. Настоящее изобретение не зависит от использования редких сортов,линий подсолнечника или растений, содержащих ген AHASL1 с P197L мутацией. Любое растение подсолнечника, содержащее по меньшей мере один аллель гена AHASL1 с P197L мутацией может быть использовано в описанных здесь способах. Растения подсолнечника, содержащие по меньшей мере один аллель гена AHASL1 с P197L были раскрыты в WO 2006024351 и патентной заявке США 11/659007,дата международной подачи 29 июля 2005; обе включены здесь с помощью ссылки. В одном из вариантов осуществления изобретения ген AHASL1 с P197L мутацией содержит полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 21 или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 22. О трех линиях подсолнечника, содержащих по меньшей мере один аллель гена AHASL1 с P197L мутацией, сообщалось в публикации Департамента США Службы сельскохозяйственных исследований. Три линии представляют собой НА 469, RHA 470 и RHA 471. Семена каждой из трех линий могут быть получены у Seedstocks Project, Department of Plant Sciences, Loftsgard Hall, North Dakota State University,Fargo, ND 58105, US. Настоящее изобретение включает растения подсолнечника с мутациями в гене AHASL1 подсолнечника. Эти мутации дают начало белкам AHASL1 подсолнечника, которые содержат специфические аминокислотные замещения в их аминокислотных последовательностях по сравнению с аминокислотными последовательностями белка AHASL1 подсолнечника дикого типа. Такие аминокислотные замещения включают, например, А 122 Т, A205V и P197L. Под "А 122 Т" понимают замещение треонина на аланин в положении белка AHASL1 подсолнечника, которое соответствует положению аминокислоты 122 в белкеAHASL1 Arabidopsis thaliana. Под "A205V" понимают замещение валина на аланин в положении белкаAHASL1 подсолнечника, которое соответствует положению аминокислоты 205 в белке AHASL1 Arabidopsis thaliana. Под "P197L" понимают замещение лейцина на пролин в положении белка AHASL1 подсолнечника, которое соответствует положению аминокислоты 197 в белке AHASL1 Arabidopsis thaliana. Если не указано другое или другое не очевидно из контекста, указанные здесь положения аминокислот в белке AHASL1 подсолнечника являются соответствующими положениям в хорошо изученном белке AHASL1 Arabidopsis thaliana. Положения аминокислот в белке AHASL1 подсолнечника, которые соответствуют положениям аминокислот 122, 197 и 205 в AHASL1 Arabidopsis thaliana, являются 107,182 и 190 соответственно. См. WO 2007005581 (табл. 4) для дополнительной информации о положениях известных аминокислотных замещений, которые придают устойчивость к гербицидам белкам AHASL, и соответствующих им положениям в белках AHASL1 подсолнечника и Arabidopsis thaliana. Настоящее изобретение представляет белки AHASL с аминокислотными замещениями в отдельных положениях аминокислот внутри консервативных областей описанных здесь белков AHASL1 подсолнечника. Кроме того, обычный специалист должен понимать, что такие положения аминокислот могут меняться в зависимости от того, добавляются ли аминокислоты или удаляются из, например, Nтерминального конца аминокислотной последовательности. Таким образом, изобретение охватывает аминокислотные замещения при перечисленных положениях или эквивалентных положениях. Под "эквивалентным положением" понимают положение, которое находится внутри такой же консервативной области, как в приведенных примерах положения аминокислоты. Такие консервативные области известны из уровня техники (см. табл. 1 в WO 20070055581) или могут быть определены путем сравнения последовательностей или другими методами, известными из уровня техники. Настоящее изобретение далее представляет способ получения гибридных растений подсолнечника,которые обладают устойчивостью по меньшей мере к одному ингибирующему AHAS гербициду. Способ включает перекрстное опыление первого растения подсолнечника со вторым растением подсолнечника так, чтобы получить гибридные семена подсолнечника, которые можно будет высеять и затем вырастить гибридные растения подсолнечника, в частности F1 гибрид растения подсолнечника. Первое растение подсолнечника содержит в своем геноме по меньшей мере одну копию первого аллеля гена AHASL1, и второе растение подсолнечника содержит в своем геноме по меньшей мере одну копию второго аллеля гена AHASL1. Предпочтительно первое растение подсолнечника является гомозиготным для первого аллеля, и второе растение подсолнечника является гомозиготным для второго аллеля. Первый аллель кодирует белок AHASL1 подсолнечника, содержащий А 122 Т аминокислотное замещение. Второй аллель кодирует белок AHASL1 подсолнечника, содержащий A205V аминокислотное замещение или P197L аминокислотное замещение. Способ получения гибридного растения подсолнечника может далее включать сбор семян, с получением в результате указанного скрещивания или селекции по меньшей мере одного потомка растения подсолнечника из указанного скрещивания, который содержит в своем геноме указанный первый и указанный второй аллели. Такое потомство может быть отобрано с помощью любых известных из уровня техники методов, включая ПЦР амплификацию всего или части гена AHASL1 для определения аллелей,которые присутствуют в растении. ДНК для использования в ПЦР амплификации может быть получена из части семени подсолнечника, полученных в результате скрещивания или части растения, выращенного из такого семени. В примере 2, представленном ниже, приведен предпочтительный способ по изобретению отбора желаемого потомства растения, который включает ПЦР амплификацию. Альтернативно,потомство растения может быть отобрано путем оценки продуктивности потомства растения в тесте на устойчивость к гербицидам в тепличных или полевых условиях, как описано ниже. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения гибридное растение подсолнечника по изобретению получали путем скрещивания первого растения подсолнечника, которое является гомозиготным для аллеля A205V AHASL1 со вторым растением подсолнечника, которое гомозиготно для аллеля AHASL1 А 122 Т. Все полученные в результате гибридные семена и растения, выращенные из таких семян, проверяли на содержание в их геноме одного аллеля A205V AHASL1 и одного аллеляAHASL1 А 122 Т. В этом предпочтительном варианте либо первый, либо второй подсолнечник может быть донором пыльцы для скрещивания. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения гибридное растение подсолнечника по изобретению получали путем скрещивания первого растения подсолнечника, которое является гомозиготным для аллеля P197L AHASL1 со вторым растением подсолнечника, которое гомозиготно для аллеля AHASL1 А 122 Т. Все полученные в результате гибридные семена и растения, выращенные из таких семян, проверяли на содержание в их геноме одного аллеля P197L AHASL1 и одного аллеляAHASL1 А 122 Т. В этом предпочтительном варианте либо первый, либо второй подсолнечник может быть донором пыльцы для скрещивания. Для целей настоящего изобретения, пока другое не указано или не следует из контекста, "потомком растения" является любое растение, которое происходит из по меньшей мере одного растения по изобретению и включает, но не ограничивается ими, первую, вторую, третью, четвертую, пятую, шестую, седьмую, восьмую, девятую и десятую генерацию потомков растения по изобретению. Предпочтительно такие потомки обладают повышенной устойчивостью к по меньшей мере одному имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа, и такие потомки содержат по меньшей мере один мутантный аллель AHASL1, выбранный из группы, состоящей из А 122 Т, A205V и P197L аллелей. Еще более предпочтительно, такие потомки обладают повышенной устойчивостью к по меньшей мере одному имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа, и такие потомки содержат по меньшей мере два различных мутантных аллеля AHASL1, выбранных из группы, состоящей из А 122 Т,A205V и P197L аллелей. В одном варианте осуществления изобретения растения подсолнечника по изобретению содержат аллель А 122 Т и продуцируют семена, содержащие экстрагируемое масло, которое содержит по меньшей мере 85% (мас./мас.) олеиновой кислоты или 850 г олеиновой кислоты/кг масла. Предпочтительно % содержания олеиновой кислоты в масле семян подсолнечника по настоящему изобретению определяли стандартными методами анализа растительных масел, такими как, например,способы, описанные в Official Methods of Analysis of Association of the Official Analytical Chemists (1990)W. Horwitz, ed., 14th ed., Washington, D.C. и/или AOCS - American Oil Chemists' Society, Official and Tentative Methods of the American Oil Chemists'Society (1998) 5th ed, Chicago, Illinois. Настоящее изобретение предлагает способы усиления толерантности или устойчивости растений,тканей растений, клеток растений или клеток-хозяев по меньшей мере к одному гербициду, который мешает активности фермента AHAS. Преимущественно, таким гербицидом является имидазолиноновый гербицид, сульфонилмочевинный гербицид, триазолопиримидиновый гербицид, пиримидинилоксибензоатный гербицид, сульфониламино-карбонилтриазолиноновый гербицид или их смеси. Более предпочтительно, таким гербицидом является имидазолиноновый гербицид, сульфонилмочевинный гербицид или их смеси. Для настоящего изобретения, имидазолиноновые гербициды включают, но не ограничиваются ими, PURSUIT (имазетапир), CADRE (имазапик), RAPTOR (имазамокс), SCEPTER (имазахин), ASSERT (имазетабенз), ARSENAL (имазапир), производные любого из вышеуказанных гербицидов и смесь двух или более вышеуказанных гербицидов, например, имазапир/имазамокс(ODYSSEY). Более специфично, имидазолиноновый гербицид может быть выбран, но не ограничен ими, из 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновой кислоты, 2-(4-изопропил)-4 метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновой кислоты, 5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо 2-имидазолин-2-ил)никотиновой кислоты,2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имдазолин-2-ил)-5(метоксиметил)никотиновой кислоты,2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5 метилникотиновой кислоты, и смеси метил-6-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-ттолуата и метил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-р-толуата. Использование 5-этил-2(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновой кислоты и 2-(4-изопропил-4-метил-5 оксо-2- нмидазолин-2-ил)-5- (метоксиметил)никотиновой кислоты является предпочтительным. Еще более предпочтительно использование 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5(метоксиметил)никотиновой кислоты. Для настоящего изобретения сульфонилмочевинные гербициды включают, но не ограничиваются ими, хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлоримурон этил, тифенсульфурон метил, трибенурон метил, бенсульфурон метил, никосульфурон, этаметсульфурон метил, римсульфурон,трифлусульфурон метил, триасульфурон, примисульфурон метил, циносульфурон, амидосульфурон,флазасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфурон этил, галосульфурон, азимсулфурон, циклосульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон метил, форамсульфурон, иодосульфурон, оксасульфурон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон,производные любого из вышеуказанных гербицидов и смесь двух или более вышеуказанных гербицидов. Триазолопиримидиновые гербициды по изобретению включают, но не ограничиваются ими, хлорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, и пеноксулам. Пиримидинилоксибензоатные гербициды по изобретению включают, но не ограничиваются ими, биспирибак, пиритиобак, пириминобак, пирибензоксим и пирифталид. Сульфониламино-карбонилтриазолиноновые гербициды включают,но не ограничиваются ими, флукарбазон и пропоксикарбазон. Общепризнано, что пиримидинилоксибензоатные гербициды тесно связаны с пиримидинилтиобензоатными гербицидами и обобщены под заголовком последнего имени Американским научным обществом (Weed Science Society of America). Следовательно, гербициды по настоящему изобретению включают пиримидинилтиобензоатные гербициды, включая, но не ограничиваясь ими, пиримидинилоксибензоатные гербициды, описанные выше. Устойчивые к гербицидам растения подсолнечника по изобретению находят применение в способах контроля сорняков. Таким образом, настоящее изобретение далее представляет способ контроля сорняков в окрестности устойчивых к гербицидам растений подсолнечника по изобретению. Способ включает нанесение эффективного количества гербицида на сорняки и устойчивые к гербицидам растения подсолнечника, где растения имеют повышенную устойчивость к по меньшей мере одному гербициду, в частности имидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербициду, по сравнению с растением подсолнечника дикого типа. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение представляет способы контроля паразитических сорняков, известных как заразиха (Orobanche spp.), на пораженных растениях подсолнечника. Такие Orobanche sp. включают, например, Orobanche cumana и Orobanche cernua. Способ включает нанесение эффективного количества имидазолинонового гербицида на сорняки и устойчивое к гербицидам растение подсолнечника по настоящему изобретению, в частности растение подсолнечника, содержащее две копии AHASL1 А 122 Т аллеля или растение подсолнечника, содержащее одну копию AHASL1 А 122 Т аллеля и одну копию A205V AHASL1 аллеля. В предпочтительном варианте имидазолиноновый гербицид является имазапиром. Предпочтительно ингибирующий AHAS гербицид наносят на последней стадии вегетации и/или на ранней репродуктивной стадии. Более предпочтительно гербицид наносят на ранней репродуктивной стадии. Наиболее предпочтительно гербицид наносят на стадии роста R1. Если не указано другое, состояния роста подсолнечника, указываемые здесь, являются стадиями роста, как они определены в работе Schneiter and Miller (1981), Crop Sci. 21:901-903. Для предлагаемых растений подсолнечника, имеющих повышенную устойчивость к гербицидам, в частности имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, может применяться широкий ряд составов при защите растений от сорняков, чтобы усилить рост растений и ослабить конкуренцию за питательные вещества. Гербицид может использоваться сам по себе до появления, после появления сорняков, для предпосевного контроля сорняков и во время сева в областях, окружающих описанные здесь растения, или может быть использован имидазолиноновый гербицидный состав, содержащий другие добавки. Гербицид также может быть использован при обработке семян. Добавки, вводимые в имидазолиноновые или сульфонилмочевинные гербицидные составы, включают другие гербициды, детергенты,адъюванты, рассеивающие агенты, агенты для прилипания, стабилизирующие агенты и т.п. Гербицидный состав может быть влажным или сухим препаратом и может включать, но не ограничивается ими,текучие порошки, эмульгируемые концентраты и жидкие концентраты. Гербицид и гербицидные составы могут наноситься в соответствии с общепринятыми методами, например, распылением, орошением,опылением или подобным образом. Настоящее изобретение предлагает не трансгенные и трансгенные семена с повышенной толерантностью к по меньшей мере одному гербициду, в частности ингибирующему AHAS гербициду, а точнее иадидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербицидам. Такие семена включают, например, не трансгенные семена подсолнечника, обладающие свойствами устойчивости к гербицидам, растения подсолнечника S4897, растения подсолнечника GM40, растения подсолнечника GM1606, растения подсолнечника с АТСС патентным депозитарным номером РТА-6716, или растения подсолнечника с АТСС патентным депозитарным номером РТА-7606, и трансгенные семена, содержащие молекулу полинуклеотида по изобретению, который кодирует устойчивый к гербицидам белок AHASL. Настоящее изобретение предлагает способы, которые включают использование по меньшей мере одного ингибирующего AHAS гербицида, выбранного из группы состоящей из имидазолиноновых гербицидов, сульфонилмочевинных гербицидов, триазолопиримидиновых гербицидов, пиримидинилоксибензоатных гербицидов, сульфониламино-карбонилтриазолиноновых гербицидов или их смесей. В этих способах, ингибирующий AHAS гербицид может быть применен любым известным из уровня техники способом, включая, но не ограничиваясь ими, обработку семян, обработку почвы и лиственную обработку. Перед применением ингибирующий AHAS гербицид может быть превращен в привычные формы,например, растворы, эмульсии, суспензии, дусты, порошки, пасты и гранулы. Выбор формы зависит от намеченной цели; в каждом случае должно гарантироваться высокое качество и распределение вещества по изобретению. Формы получали известными способами (см., например, US 3060084, ЕР-А 707 445 (для жидких концентратов), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry's ChemicalTechnology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-04438), например, путем разбавления активного вещества вспомогательными подходящими для состава агрохимикатами, такими как растворители и/или носители, если желательно, эмульгаторами, сурфактантами и диспергаторами, консервантами, антивспенивающими агентами, антизамерзающими агентами, для обработки семян составы также необязательно содержат красители и/или связывающие и/или гелеобразующие агенты. Примерами подходящих растворителей являются вода, ароматические растворители (например,продукты Solvesso, ксилол), парафины (например, фракции минерального масла), спирты (например,метанол, бутанол, пентанол, бензиловый спирт), кетоны (например, циклогексанон, гаммабутиролактон), пирролидоны (NMP, NGP), ацетаты (гликоль диацетат), гликоли, диметиламиды жирных кислот, жирные кислоты и эфиры жирных кислот. В принципе, также могут быть использованы смеси растворителей. Примерами подходящих носителей являются земляные природные минералы (например, каолины,глины, тальк, мел) и земляные синтетические минералы (например, высокодисперсные кремнезем, силикаты). Подходящими эмульгаторами являются не ионные и анионные эмульгаторы (например, полиоксиэтиленовые эфиры жирного спирта, алкилсульфонаты и арилсульфонаты). Примерами диспергаторов являются жидкие лигнин-сульфитные отходы и метилцеллюлоза. Подходящими сурфактантами являются соль щелочного металла, соль щелочноземельного металла и аммониевая соль лигносульфоновой кислоты, нафталинсульфоновой кислоты, фенолсульфоновой кислоты, дибутилнафталинсульфоновой кислоты, алкил арилсульфонаты, алкилсульфаты, алкилсульфона- 11023348 ты, сульфаты жирных спиртов, жирные кислоты и сульфатированные гликолевые эфиры жирного спирта, кроме того, конденсаты сульфонированного нафталина и производного нафталина и формальдегида,конденсаты нафталина или нафталинсульфоновой кислоты с фенолом и формальдегидом, полиоксиэтиленовый эфир октилфенола, этоксилированный изооктилфенол, октилфенол, нонилфенол, алкилфеноловый эфир полигликоля, трибутифениловый эфир полигликоля, тристеарилфениловый эфир полигликоля,алкиларильные полиэфирные спирты, конденсаты спирта и этиленоксида жирного спирта, этоксилированное касторовое масло, полиоксиэтиленалкиловые эфиры, этоксилированный полиоксипропилен, ацеталь полигликолевого эфира лаурилового спирта, эфиры сорбита, лигносульфитные жидкие отходы и метилцеллюлоза. Веществами, пригодными для приготовления непосредственно распыляемых растворов, эмульсий,паст или масляных дисперсий, являются средне- или высококипящие фракции минеральных масел, такие как керосин или дизельное масло, кроме того, каменноугольные масла и растительные или животные масла, алифатические, циклические и ароматические углеводороды, например, толуол, ксилол, парафин,тетрагидронафталин, алкилированные нафталины или их производные, метанол, этанол, пропанол, бутанол, циклогексанол, циклогексанон, изофорон, высокополярные растворители, например диметилсульфоксид, N-метилпирролидон или вода. Антизамерзающие агенты, такие как глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль и бактерициды,также могут быть добавлены в составы. Подходящими антивспенивающими агентами являются, например, антивспенивающие агенты на основе силикона или стеарата магния. Подходящими консервантами являются, например, дихлорофен и энзилалкогольгеминформаль. Составы для обработки семян могут дополнительно содержать связующее и необязательно красители. Связующее может добавляться для улучшения адгезии активного материала к семени после обработки. Подходящими связующими являются блок-сополимерные ЕО/РО сурфактанты, а также поливиниловые спирты, поливинилпирролидоны, полиакрилаты, полиметилакрилаты, полибутены, полиизобутены, полистиролы, полиэтиленамины, полиэтиленамиды, полиэтиленимины (Lupasol, Polymin), полиэфиры, полиуретаны, поливинилацетат, тилос и сополимеры, полученные из этих полимеров. При желании, в состав также могут быть включены красители. Подходящими красителями или красящими веществами для составов для обработки семян являются Родамин В, C.I. Пигмент красный 112,C.I. Сольвент красный 1, пигмент голубой 15:4, пигмент голубой 15:3, пигмент голубой 15:2, пигмент голубой 15:1, пигмент голубой 80, пигмент желтый 1, пигмент желтый 13, пигмент красный 112, пигмент красный 48:2, пигмент красный 48:1, пигмент красный 57:1, пигмент красный 53:1, пигмент оранжевый 43, пигмент оранжевый 34, пигмент оранжевый 5, пигмент зеленый 36, пигмент зеленый 7, пигмент белый 6, пигмент коричневый 25, основной фиолетовый 10, основной фиолетовый 49, кислый красный 51,кислый красный 52, кислый красный 14, кислый голубой 9, кислый желтый 23, основной красный 10,основной красный 108. Примером подходящего гелеобразующего агента является караген (Satiagel). Порошки, материалы для распыления и пылевидные продукты могут быть получены путем смешивания или совместного измельчения активных субстанций с твердым носителем. Гранулы, например покрытые гранулы, пропитанные гранулы и гомогенные гранулы, могут быть получены путем связывания активных веществ с твердыми носителями. Примерами твердых носителей являются минеральные земли, такие как силикагели, силикаты, тальк, каолин, глины, известняк, известь,мел, бол, лесс, доломит, диатомовая земля, кальция сульфат, магния сульфат, магния оксид, земельные синтетические материалы, удобрения, такие как, например, аммония сульфат, аммония фосфат, аммония нитрат, мочевины и продукты из растительных источников, такие как зерновая мука, мука из древесной коры, древесная мука и мука из ореховой скорлупы, целлюлозные порошки и другие твердые носители. В основном, составы содержат от 0.01 до 95 мас.%, предпочтительно от 0.1 до 90 мас.%, ингибирующего AHAS гербицида. В этом случае, ингибирующие AHAS гербициды имеют чистоту от 90 до 100% по массе, предпочтительно от 95 до 100% по массе (согласно спектру ЯМР). Для целей обработки семян, соответствующие составы могут быть разбавлены в 2-10 раз до концентраций в готовом к использованию препарате от 0.01 до 60% от массы активного вещества, преимущественно от 0.1 до 40% по массе. Ингибирующие AHAS гербициды могут использоваться как таковые в форме их составов или применяются формы, получаемые из них, например, в форме непосредственно распыляемых растворов, порошков, суспензий или дисперсий, эмульсий, масляных дисперсий, паст, пылевидных продуктов, материалов для орошения или гранул, путем обрызгивания, распыления, опыления, орошения или полива. Использование определенной формы зависит от назначенных целей; они предназначены в каждом случае гарантировать наилучшее возможное вложение ингибирующего AHAS гербицида по изобретению. Используемые водные формы могут быть приготовлены из эмульсионных концентратов, паст или влажных порошков (распыляемые порошки, масляные дисперсии) путем добавления воды. Для получе- 12023348 ния эмульсий, паст или масляных дисперсий субстанции, как таковые или растворенные в масле или растворителе, могут быть гомогенизированы в воде с помощью увлажнителя, вещества для повышения клейкости, диспергатора или эмульгатора. Однако также возможно получение концентратов, состоящих из активного вещества, увлажнителя, вещества для повышения клейкости, диспергатора или эмульгатора, и если необходимо, растворителя или масла, и такие концентраты пригодны для разбавления водой. Концентрация активного соединения в готовых к применению препаратах может варьироваться в относительно широких пределах. В основном от 0.0001 до 10%, предпочтительно от 0.01 до 1% по массе. Ингибирующий AHAS гербицид может также успешно использоваться в процессе сверхнизкого объема, что делает возможным применение составов содержащих свыше 95 мас.% активного соединения, или даже нанесение активного соединения без добавок. Далее приведены примеры составов. 1. Продукты для разбавления водой для лиственного нанесения. Для обработки семян такие продукты могут наноситься разбавленными или неразбавленными.A) Водорастворимые концентраты (SL, LS). 10 мас.ч. ингибирующего AHAS гербицида растворяли в 90 мас.ч. воды или водорастворимого растворителя. Как альтернатива, добавляли увлажнители или другие вспомогательные вещества. Ингибирующий AHAS гербицид растворяли при разбавлении водой, при этом получали состав с 10% (мас./мас.) ингибирующего AHAS гербицида.B) Дисперсионные концентраты (DC). 20 мас.ч. ингибирующего AHAS гербицида растворяли в 70 мас.ч. циклогексанона с добавлением 10 мас.ч. диспергатора, например, поливинилпирролидона. Разбавление водой дает дисперсию, при этом получают состав с 20% (мас./мас.) ингибирующего AHAS гербицида.C) Эмульсионные концентраты (ЕС). 15 мас.ч. ингибирующего AHAS гербицида растворяли в 7 мас.ч. ксилола с добавлением додецилбензолсульфоната кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 мас.ч.). Разбавление водой дает эмульсию, при этом получают состав с 15% (мас./мас.) ингибирующего AHAS гербицида.D) Эмульсии (EW, ЕО, ES). 25 мас.ч. ингибирующего AHAS гербицида растворяли в 35 мас.ч. ксилола с добавлением додецилбензолсульфонага кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 мас.ч.). Эту смесь вводили в 30 мас.ч. воды с помощью эмульгирующего устройства (например, Ultraturrax) и переводили в гомогенную эмульсию. Разбавление водой дает эмульсию, при этом получают состав с 25% (мас./мас.) ингибирующего AHAS гербицида.E) Суспензии (SC, OD, FS). В шаровой мельнице измельчали 20 мас.ч. ингибирующего AHAS гербицида с добавлением 10 мас.ч. диспергатора, увлажнителя и 70 мас.ч. воды или органического растворителя с получением хорошей суспензии ингибирующего AHAS гербицида. Разбавление водой дает стабильную суспензию ингибирующего AHAS гербицида, при этом получают состав с 20% (мас./мас.) ингибирующего AHAS гербицида.F) Вододиспергируемые гранулы и водорастворимые гранулы (WG, SG). 50 мас.ч. ингибирующего AHAS гербицида смешивали с 50 массовыми частями диспергаторов и увлажнителей и получали вододиспергируемые гранулы или водорастворимые гранулы с помощью технических средств (например, экструдер, скруббер с разбрызгивающим устройством, псевдоожиженный слой). Разбавление водой дает стабильную дисперсию или раствор ингибирующего AHAS гербицида,при этом получают состав с 50% (мас./мас.) ингибирующего AHAS гербицида.G) Вододиспергируемые порошки и водорастворимые порошки (WP, SP, SS, WS). 75 мас.ч. ингибирующего AHAS гербицида измельчали в роторно-статорной мельнице с добавлением 25 мас.ч. диспергаторов, увлажнителей и силикагеля. Разбавление водой дает стабильную дисперсию или раствор ингибирующего AHAS гербицида, при этом получают состав с 75% (мас./мас.) ингибирующего AHAS гербицида. I) Гелевые составы (GF) В шаровой мельнице измельчали 20 мас.ч. ингибирующего AHAS гербицида с добавлением 10 мас.ч. диспергатора, 1 мас.ч. гелеобазующего агента, увлажнителя и 70 мас.ч. воды или органического растворителя с получением суспензии ингибирующего AHAS гербицида. Разбавление водой дает стабильную суспензию ингибирующего AHAS гербицида, при этом получают состав с 20% (мас./мас.) ингибирующего AHAS гербицида. Этот гелевый состав пригоден для обработки семян. 2. Продукты для нанесения неразбавленными при листовой обработке. Для обработки семян такие продукты могут наноситься разбавленными.B) Гранулы (GR, FG, GG, MG). Половину массовой части ингибирующего AHAS гербицида измельчали и объединяли с 95,5 мас.ч. носителей, при этом получают состав с 0,5% (мас./мас.) ингибирующего AHAS гербицида. Подходящими способами являются экструзия, сушка распылением и в псевдоожиженном слое. Получают гранулы для применения неразбавленными при листовом нанесении. Обычные составы для обработки семян включают, например, текучие концентраты FS, растворыLS, порошки для сухой обработки DS, диспергируемые в воде порошки для суспензионной обработкиWS, водорастворимые порошки SS и эмульсии ES и ЕС и гелевый состав GF. Эти составы можно наносить на семена разбавленными или неразбавленными. Нанесение на семена выполняется перед посевом либо прямо на семена. В предпочтительном варианте осуществления для обработки семян используется состав FS. Обычно, состав FS может содержать 1-800 г/л активного ингредиента, 1-200 г/л поверхностно-активного вещества, от 0 до 200 г/л антизамерзающего агента, от 0 до 400 г/л связующего, от 0 до 200 г/л пигмента и до 1 литра растворителя, предпочтительно воду. Для обработки семян, семена устойчивых к гербицидам растений по изобретению обрабатывали гербицидами, предпочтительно гербицидами, выбранными из группы, состоящей из ингибирующихAHAS гербицидов, таких как амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфомурон, этаметсульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, имазосульфурон, иодосульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, пирисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, имазаметабенз, имазамокс, имазапик, имазапир, имазахин, имазетапир, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пенокссулам, биспирибак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид, пиритиобак и их смеси, или составом, содержащим ингибирующий AHAS гербицид. Термин обработка семян содержит все известные из уровня техники подходящие методики обработки семян, такие как обмазка семян, покрытие семян, опыление семян, пропитка семян и дражирование семян. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, еще одним объектом изобретения является способ обработки почвы путем нанесения, в частности с помощью рядовой сеялки: либо гранулированного состава, содержащего ингибирующий AHAS гербицид, как композиция/состав (например, гранулированный состав, необязательно с одним или более твердым или жидким сельскохозяйственно приемлемым носителем и/или необязательно с одним или более сельскохозяйственно приемлемым поверхностно-активным веществом. Этот способ преимущественно применим, например, в грядах зерновых,маиса, хлопка и подсолнечника. Настоящее изобретение также включает семена с покрытием или семена удерживающие состав, содержащий по меньшей мере один ингибирующий AHAS гербицид, выбранным из группы, включающей амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфомурон, этаметсульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, имазосульфурон, иодосульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон,оксасульфурон, пирисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон,тритосульфурон, имазаметабенз, имазамокс, имазапик. имазапир, имазахин, имазетапир, клорансулам,диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пенокссулам, биспирибак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид и пиритиобак. Термин "семя" охватывает семена и отростки растений во всех случаях включая, но не ограничиваясь ими, сами семена, части семян, корневые побеги, клубнелуковицы, луковицы, фрукты, клубни, зерна,черенки, отрезанные побеги и т.п., и означает в предпочтительном варианте сами семена. Термин "с покрытием и/или удерживающие" в основном означает, что активный ингредиент находится большей частью на поверхности продукта размножения во время нанесения, хотя большая или меньшая часть ингредиента может проникать в продукт размножения в зависимости от способа нанесения. Когда указанные продукты размножения вырастают в растения, они могут абсорбировать активный ингредиент. Обработка семян нанесением ингибирующего AHAS гербицида или состава, содержащего ингибирующий AHAS гербицид, выполняется путем разбрызгивания или опыления семян перед посадкой растения и перед всходами растений. При обработке семян соответствующие составы применяются путем обработки семян эффективным количеством ингибирующего AHAS гербицида или состава, содержащего ингибирующий AHAS гербицид. Дозы нанесения в основном составляют от 0.1 г до 10 кг а.и. (активного ингредиента) (или смеси а.и. или состава) на 100 кг семян, предпочтительно от 1 г до 5 кг на 100 кг семян, в частности от 1 г до 2.5 кг на 100 кг семян. Для специфических сельскохозяйственных культур, таких как салат-латук, доза может быть выше. Настоящее изобретение предлагает способ борьбы с нежелательной растительностью или контроля сорняков, включающий контактирование семян устойчивых растений по изобретению перед посадкой и/или после всходов с ингибирующим AHAS гербицидом. Способ далее включает посадку семян, на- 14023348 пример, в почву на поле или в горшечную землю в теплице. Способ находит, в частности, применение при борьбе с нежелательной растительностью или контроле сорняков в непосредственной близости от семян. Под контролем нежелательной растительности понимают уничтожение сорняков и/или другое препятствие или ингибирование нормального роста сорняков. Под сорняками, в широком смысле, понимают все те растения, которые растут в месте, где они нежелательны. Сорняки по настоящему изобретению, включают, например, двудольные и односемядольные сорняки. Двудольные сорняки включают, но не ограничиваются ими, сорняки рода: Другие двудольные сорняки включают, но не ограничиваются ими, паразитические растения, которые поражают подсолнечники, в частности, Orobanche sp. (broomrape), такие как, например, Orobanchecumana и Orobanche cernua. Кроме того, сорняки по настоящему изобретению включают, например, сельскохозяйственные растения, которые произрастают в нежелательном месте. Например, самосевное растение маиса, находящееся в поле, на котором преобладающим является растение сои, может рассматриваться как сорняк, если растение маиса является нежелательным в поле с растениями сои. Растения подсолнечника по изобретению могут быть трансформированы с одним или более интересующими генами. Интересующие гены по изобретению сильно зависят от желаемого результата. Например, могут быть интересны различные изменения в фенотипе, включая модификацию состава жирных кислот в растении, изменение содержания аминокислот в растении, изменение растительных насекомых и/или патогенных защитных механизмов, и т.п. Эти результаты могут быть достигнуты путем обеспечения экспрессии гетерологичных продуктов или увеличенной экспрессии эндогенных продуктов в растении. Альтернативно, результаты могут быть достигнуты путем обеспечения восстановления экспрессии одного или более эндогенных продуктов, в частности ферментов или ко-факторов в растении. Это изменения дают в результате изменение в генотипе трансформированного растения. В одном из вариантов осуществления изобретения, интересующие гены включают устойчивые к насекомым гены, такие как, например, гены белка токсина Bacillus thuringiensis (патенты США 5366892; 5747450; 5736514; 5723756; 5593881; и Geiser et al. (1986), Gene 48:109). Настоящее изобретение предлагает диагностические способы для идентификации аллелей генаAHASL1 в отдельном подсолнечнике. Такие диагностические способы, которые описаны ниже, находят применение в способах воспроизводства коммерческих культур подсолнечника с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам. Используемые при описании этих способов термины определены ниже."Праймер" - одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий 5' конец и 3' конец, который способен к отжигу сайта отжига на целевой цепи ДНК, и праймер служит в качестве точки инициации синтеза ДНК с помощью ДНК полимеразы, в частности в полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификации. Такой праймер может быть или не быть полностью комплементарным сайту отжига на целевой ДНК. Сайт "отжига" на цепи целевой ДНК - это сайт, в котором праймер способен к отжигу в способах по настоящему изобретению. В основном для амплификации фрагмента гена с помощью ПЦР используется пара праймеров, которая отжигает обратные цепи двухцепочечной молекулы ДНК. Общепринято и используется здесь, пока другое не указано или не следует из контекста, что "прямой праймер" отжигает не кодирующую цепь гена и "обратный праймер" отжигает кодирующую цепь. Далее определены термины "мутантный аллель", "мутантный аллель AHASL1" или аллель "мутантного гена AHASL1". Пока другое не указано или не следует из контекста, эти термины относятся к полинуклеотиду, который кодирует толерантный к имидазолинону белок AHASL1, содержащий единичное аминокислотное замещение по сравнению с белком AHASL1 дикого типа. Такое единичное аминокислотное замещение включает, например, А 122 Т, A205V и P197L. Обычно, такое единичное аминокислот- 15023348 ное замещение является результатом единичного нуклеотидного замещения в последовательности, кодирующей AHASL1. Наоборот, пока не указано другое, термины "аллель дикого типа", "аллель AHASL1 дикого типа" или аллель "гена AHASL1 дикого типа" относятся к полинуклеотиду, который кодирует белок AHASL1. Изобретение включает применение праймеров для ПЦР амплификации. Эти праймеры подробно описаны ниже."Прямой праймер AHASL1" - это праймер, который может быть использован в способах по изобретению, включающих ПЦР амплификацию фрагмента аллеля AHASL1 подсолнечника, где фрагмент распространяется в 5' направлении из места мутации, что дает начало А 122 Т аминокислотному замещению. Предпочтительно комплемент места отжига "прямого праймера AHASL1" находится на 5' стороне(АСС)n повтора, который показан на фиг. 8."Обратный праймер AHASL1 дикого типа" представляет собой обратный праймер, который может быть использован в способах, включающих ПЦР амплификацию фрагмента аллеля AHASL1, который не содержит мутаций, что дает начало А 122 Т аминокислотному замещению. Место отжига обратного праймера показано на фиг. 8. 3'-терминальный (или 3' концевой) нуклеотид обратного праймера AHASL1 дикого типа отжигает G, который означает место SNP в Нар 1-Нар 5 на фиг. 8. 3'-терминальный нуклеотид обратного праймера AHASL1 является С."Обратный мутантный праймер AHASL1" представляет собой обратный праймер, который может быть использован в способах, включающих ПЦР амплификацию фрагмента мутантного аллеля AHASL1,содержащий мутацию, что дает начало А 122 Т аминокислотному замещению. Место отжига обратного праймера показано на фиг. 8. 3'-терминальный (или 3' концевой) нуклеотид обратного мутантного праймера AHASL1 отжигает А в Нар 6, который означает место SNP на фиг. 8. 3'-терминальный нуклеотид обратного праймера AHASL1 дикого типа является Т. Настоящее изобретение представляет способы определения генотипа AHASL1 подсолнечника. Способ включает выделение геномной ДНК из растения подсолнечника и использование геномной ДНК,или образца, или части ее в качестве матрицы для ПЦР амплификации, содержащей геномную ДНК, полимеразу, деоксирибонуклеотида трифосфаты, прямой праймер AHASL1 и обратный праймер AHASL1 дикого типа. Обратный праймер AHASL1 дикого типа содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 13, где нуклеотид, который является 3' концевым нуклеотидом указанного обратного праймера AHASL1 дикого типа, является комплементом нуклеотида, который находится в положении 1 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13. Далее способ включает использование геномной ДНК, или образца, или части ее в качестве матрицы для второй ПЦР амплификации, содержащей геномную ДНК, полимеразу, деоксирибонуклеотида трифосфаты, указанный прямой праймер AHASL1 и мутантный обратный праймер AHASL1. Обратный мутантный праймерAHASL1 содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 14, где нуклеотид, который является 3' концевым нуклеотидом указанного обратного мутантного праймераAHASL1, является комплементом нуклеотида, который находится в положении 1 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14. Далее способ включает определение продуктов указанных первой и второй амплификации. Обратный праймер AHASL1 дикого типа и обратный мутантный праймер AHASL1 по изобретению отжигают нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 13 и 14, соответственно, при условиях, подходящих для ПЦР амплификации части генов AHASL1 или подсолнечника, показанных на фиг. 8. Обратный праймер AHASL1 дикого типа и обратный мутантный праймер AHASL1 дополнительно имеют 3' концевой нуклеотид, который состоит из нуклеотида, который находится в месте мутации, которая дает начало А 122 Т аминокислотному замещению. Каждый из обратных праймеров, может быть, но не обязательно, полностью комплементарным его сайту отжига и не должен превышать полную длину сайта отжига. Кроме того, обратный праймер AHASL1 дикого типа и обратный мутантный праймер AHASL1 могут содержать дополнительные нуклеотиды на их 5' конце, удаленном от сайта отжига. Такие дополнительные нуклеотиды могут быть, но не обязательно, полностью или даже частично комплементарными части гена AHASL1 подсолнечника. Дополнительный 5' нуклеотид может включать, например, последовательности узнавания фермента рестрикции. В одном из вариантов осуществления, обратный праймер AHASL1 дикого типа и обратный праймер AHASL1 дикого типа содержат нуклеотидные последовательности, представленные в виде SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно. Способы определения генотипа AHASL1 подсолнечника включают использование прямого праймера AHASL1. В отличие от обратного праймера AHASL1 дикого типа и обратного мутантного праймераAHASL1, которые отжигают в месте мутации, которая дает начало А 122 Т аминокислотному замещению,сайт отжига нуклеотида прямого праймера AHASL1 соответствует области гена AHASL1 подсолнечника, которая представляет собой 5' области (АСС)n, показанной на фиг. 8, так, что гаплотипы 1-6 можно различать по длине (т.е. пар оснований п.о.) результирующих продуктов ПЦР. Последовательности этих гаплотипов близи мест А 122 Т мутации показаны на фиг. 8. В одном из вариантов осуществления изобретения прямой праймер AHASL1 отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую комплемент нуклеотидной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 12. В предпочтительном варианте осуществления изобретения прямой праймер AHASL1 содержит нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 3, и в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения прямой праймер AHASL1 содержит нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 3 с необязательными дополнительными нуклеотидами на 5' конце праймера. Такие дополнительные нуклеотиды могут быть, но не требуется обязательно, полностью или даже частично комплементарными части гена AHASL1 подсолнечника. Дополнительные 5' нуклеотиды могут включать, например, последовательности узнавания фермента рестрикции. Настоящее изобретение далее представляет способ идентификации аллелей AHASL1 в растении подсолнечника. Способ включает выделение геномной ДНК из растения подсолнечника и использование геномной ДНК, или образца, или части ее по меньшей мере в одной ПНР амплификации. ПНР амплификация включает использование геномной ДНК в качестве матрицы для амплификации полимеразной цепной реакцией, содержащей геномную ДНК, полимеразу, деоксирибонуклеотида трифосфаты, первый прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 15, первый обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в видеSEQ ID NO: 16, второй прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 17, и второй обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность,представленную в виде SEQ ID NO: 18. Далее способ включает детектирование продуктов указанных первой и второй амплификации. Альтернативно, две или даже три раздельные ПЦР амплификации могут быть использованы в способах по изобретению. Когда используются две раздельные амплификации, первая ПЦР амплификация включает использование геномной ДНК в качестве матрицы для первой амплификации полимеразной цепной реакцией, содержащей геномную ДНК, полимеразу, деоксирибонуклеотида трифосфаты, первый прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 15, и первый обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в видеSEQ ID NO: 16. Вторая ПЦР амплификация включает использование геномной ДНК в качестве матрицы для второй амплификации полимеразной цепной реакцией, содержащей геномную ДНК, полимеразу,деоксирибонуклеотида трифосфаты, второй прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 17, и второй обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 18. Первая ПЦР амплификация может, необязательно, содержать третий праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 18, вторая ПЦР амплификация может, необязательно, содержать третий праймер,содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 15. Добавление такого необязательного праймера в одну или в обе первую и вторую ПЦР амплификации дает возможность получения продукта контроля связи, который амплифицируется с помощью пары праймеров, содержащей нуклеотидные последовательности, представленные в виде SEQ ID NO: 15 и 18. Далее способ включает детектирование продуктов указанных первой и второй ПЦР амплификации. Когда используются три отдельных ПЦР амплификации, первая и вторая ПЦР амплификации являются такими же, как описанные выше. Третья ПЦР амплификация включает использование геномной ДНК в качестве матрицы для третьей амплификации полимеразной цепной реакцией, содержащей геномную ДНК, полимеразу, деоксирибонуклеотида трифосфаты, первый прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 15, и второй обратный праймер,содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 18. Далее способ включает детектирование продуктов указанных первой, второй и третьей ПЦР амплификации. В одном из вариантов осуществления изобретения первый прямой праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую по существу из SEQ ID NO: 15, первый обратный праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую по существу из SEQ ID NO: 16, второй прямой имеет нуклеотидную последовательность, состоящую по существу из SEQ ID NO: 17, и/или второй обратный имеет нуклеотидную последовательность, состоящую по существу из SEQ ID NO: 18. Для настоящего изобретения праймер, "состоящий по существу из" указанной последовательности, означает, что праймер состоит из полной указанной последовательности, но может дополнительно включать нуклеотиды на 5' конце праймера. Такие дополнительные нуклеотиды могут быть, но не обязательно, полностью или частично комплементарными целевому гену для амплификации. Поскольку синтез ДНК инициируется с 3' конца праймера, такие дополнительные нуклеотиды не заменяют стартовый сайт для синтеза ДНК, если сравнивать с праймером, который является идентичным за исключением дополнительных нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения первый прямой праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 15, первый обратный праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 16, второй прямой праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 17, и/или второй обратный праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 18. Пока не указано другое, "полимераза" относится к ДНК полимеразе, в частности ДНК полимеразе,которая пригодна для использования в одной или более ПЦР амплификации по настоящему изобретению. В способах по изобретению, результаты ПЦР амплификации могут быть детектированы, например,с помощью электрофореза в агарозном геле продуктов ПЦР, последующим этидиум-бромидным окрашиванием ДНК в геле и визуализацией в присутствии УФ-света. Способы по изобретению включают использование ПЦР для амплификации ДНК. Могут быть разработаны олигонуклеотидные праймеры для применения в ПЦР реакциях, чтобы амплифицировать соответствующие последовательности ДНК из геномной ДНК или кДНК, экстрагированных из любых интересующих организмов. Способы разработки ПЦР праймеров хорошо известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York); включенных здесь в виде ссылки. См. также Innis et al., eds. (1990), PCRPress, New York); Dietmaier et al., eds. (2002), Rapid Cycle Real Time PCR - Methods and Applications,(Springer Verlag, New York); Theophilus and Raphley, eds. (2002), PCR Mutation Detection Protocols (Humana Press, New York); and Bartlett and Stirling, eds. (2003), PCR Protocols (Humana Press, New York); все из которых включены здесь с помощью ссылки. Другие известные способы ПНР, которые также могут быть использованы в способах по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, способы, использующие парные праймеры, вложенный праймеры, единичные специфические праймеры, дегенеративные праймеры, ген-специфические праймеры, смешанные ДНК/РНК праймеры, вектор-специфические праймеры, частично-несопряженные праймеры и т.п. Использование термина "праймер" или "ПЦР праймер" не означает ограничение настоящего изобретения до праймеров, содержащих ДНК. Среднему специалисту в данной области должно быть понятно, что такие праймеры могут быть составлены, например, из деоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов,и их комбинаций. Такие деоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды включают встречающиеся в природе молекулы и синтетические аналоги. Хотя изобретение не зависит от числа нуклеотидов в ПЦР праймерах, предполагается, что часть ПЦР праймера, который отжигает комплементарную ему цель на матрице ДНК, будет в основном составлять от 10 до 50 смежных нуклеотидов, предпочтительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, или более смежных нуклеотидов. Однако ПЦР праймер по изобретению может далее содержать на его 5' конце дополнительные нуклеотиды, которые не проводят отжига цели,такой как последовательность ДНК, содержащая один или более сайтов узнавания фермента рестрикции. Способы по изобретению включают применение ДНК полимераз для ПЦР амплификации ДНК. Любая ДНК полимераза, известная из уровня техники, которая способна к амплификации целевой ДНК с помощью ПЦР, может быть использована в способах по изобретению. Способы по изобретению не зависят от частной ДНК полимеразы для ПЦР амплификации ДНК, только от таких полимераз, которые способны к амплификации одного или более генов AHASL растений или их фрагментов. Предпочтительно ДНК полимеразы по изобретению являются термоустойчивыми ДНК полимеразами, включая, но не ограничиваясь ими: Taq полимеразы; Pfu полимеразы; термоустойчивые ДНК полимеразы из Thermococcusgorgonarious, которые также известны как Tgo ДНК полимеразы; термоустойчивые ДНК полимеразы изThermococcus litoralis такие как, например, которые также известны как Vent ДНК полимеразы (Perler,F. et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5577), термоустойчивые ДНК полимеразы из Pyrococcus species GB-D такие как, например, которые также известны как Deep Vent ДНК полимеразы (Xu, M. et al.(1993), Cell 75, 1371-1377); и модифицированные версии и их смеси. Способы по настоящему изобретению включают амплификацию последовательности целевой ДНК с помощью ПЦР. В отдельных вариантах осуществления изобретения последовательность целевой ДНК амплифицируют прямо из образца, содержащего геномную ДНК, выделенную по меньшей мере из одного растения или его части, органа, ткани или клетки. Среднему специалисту в данной области техники должно быть ясно, что количество или концентрация геномной ДНК будет зависеть от разного числа факторов, включающих, но не ограничиваясь ими, условия ПЦР (например, температура отжига, температура денатурации, число циклов, концентрации праймеров, концентрации dNTP и т.п.), термоустойчивая ДНК полимераза, последовательность праймеров и последовательность цели. Обычно, в описанных здесь вариантах осуществления изобретения концентрация геномной ДНК составляет по меньшей мере от около 5 до около 100 нг/мкл. В дополнение к ПЦР амплификации способы по изобретению могут включать различные методы молекулярной биологии, включая, например, выделение ДНК, в частности выделение геномной ДНК,разрушение ДНК или продуктов ПЦР путем рестрикции ферментами и нуклеазами, лигирование ДНК,секвенирование ДНК, электрофорез в агарозном геле, электрофорез полиакриламидном геле в, гельэлектрофорез в любых других матрицах, пригодных для электрофоретического разделения ДНК, детектирование ДНК с помощью окрашивания бромистым этидием и т.п. Такие методы хорошо известны из(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Способы по изобретению включают использование геномной ДНК, выделенной из растения. Способы по изобретению не зависят от геномной ДНК, выделенной каким либо частным способом. Любой известный из уровня техники способ выделения из растения или очистки геномной ДНК, которая может быть использована как источник матричной ДНК для ПЦР амплификации описанной выше, может применяться в способах по изобретению. См., например, Stein et al. 2001) Plant Breeding, 12:354-356); Clark,ed. 1997) Plant Molecular Biology - A Laboratory Manual, Springer-Verlag, New York, p. 3-15); Miller et al.,1988 Nucleic Acids Research, 16:1215); все из которых включены здесь с помощью ссылки. Предпочтительно такие способы выделения растительной геномной ДНК пригодны или могут быть адаптированы средним специалистом в данной области для выделения геномной ДНК из относительно большого ряда образцов тканей растений. В одном из вариантов осуществления изобретения геномную ДНК выделяли из растения подсолнечника с использованием DNeasy набора в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen Inc.,Valencia, CA, USA). В другом варианте осуществления изобретения геномную ДНК выделяли из растения подсолнечника с использованием MagneSil набора в соответствии с инструкциями производителя(Promega Corp., Madison, WI, USA). Для способов по настоящему изобретению геномная ДНК может быть выделена из целого растения или любой его части, ткани или клетки. Например, геномная ДНК может быть выделена из сеянцев, листьев, стеблей, корней, соцветий, семян, зародышей, побегов, колеоптилей, пыльников, рылец, культивируемых клеток и т.п. Кроме того, изобретение не зависит от выделения геномной ДНК из растений или их частей, органов, тканей или клеток, которые находятся на любой стадии развития. Способы могут использовать геномную ДНК, которая выделена, например, из сеянца или зрелого растения или любой их части, органа, ткани или клетки. Кроме того, изобретение не зависит от растения, которое выращено при каких-либо особых условиях. Растения могут быть выращены, например, в полевых условиях, в теплице или ростовой камере, в культуре, или даже на гидропонике в теплице или ростовой камере. Обычно, растения выращивают при условиях, когда свет, температура, питательные вещества и влажность благоприятны для роста и развития растений. Способы по изобретению включают детектирование продуктов ПЦР амплификации. Обычно, ПЦР продукты детектируют путем первого разделения продуктов в субстрате по молекулярной массе и затем детектируют каждый из отделенных ПЦР продуктов в субстрате. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ПЦР продукты детектировали с помощью электрофореза в агарозном геле ПЦР продуктов с последующим окрашиванием бромистым этидием ДНК в геле и визуализацией в геле путем флуоресценции в присутствии УФ-света. Однако любые методы детектирования, пригодные для разделяемых полинуклеотидов могут быть использованы для детектирования ПЦР продуктов по изобретению,включая, но не ограничиваясь ими, гель электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию, капиллярный электрофорез и т.п. Субстраты для таких методов включают, например, агарозу, полиакриламид, диэтиламиноэтилцеллюлозу, гидроксиалкилцеллюлозу, сефарозу, полиоксиэтилен и т.п. ПЦР амплификации по изобретению могут включать использование одного или более праймеров, которые помечены, например, радиоактивно или флуоресцентным красителем, люминесцентной меткой, парамагнитной меткой или любой другой меткой, пригодной для детектирования нуклеиновых кислот. Когда ПЦР амплификации включают использование одного или более таких меченых праймеров, этап детектирования может включать детектирование радиоактивной, флуоресцентной, люминесцентной, парамагнитной или другой метки любым известным из уровня техники способом, пригодным для обнаружения такой метки. Настоящее изобретение также предлагает наборы для выполнения описанных выше способов определения генотипов AHASL1 подсолнечника. Такие наборы включают праймеры по настоящему изобретению, в частности, прямой праймер AHASL1, обратный праймер AHASL1 дикого типа и обратный мутантный праймер AHASL1, как описанные выше. Предпочтительно прямой праймер AHASL1 содержит нуклеотидную последовательность, которая соответствует области гена AHASL1 подсолнечника, которая является 5' участка (АСС)n, показанного на фиг. 8, обратный праймер AHASL1 дикого типа отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 13, и обратный мутантный праймер AHASL1 отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 14. Более предпочтительно, прямой праймер AHASL1 содержит нуклеотидную последовательность, которая соответствует области гена AHASL1 подсолнечника, которая является 5' участка (АСС)n, показанного на фиг. 8, обратный праймер AHASL1 дикого типа отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 13, и обратный мутантный праймер AHASL1 отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 14. Более предпочтительно, прямой праймер AHASL1,обратный праймер AHASL1 дикого типа, и обратный мутантный праймер AHASL1 содержат молекулыNO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно. Наборы по изобретению необязательно могут содержать одну или более следующих составляющих: полимераза, деоксирибонуклеотида трифосфаты, и инструкции по выполнению способа. Настоящее изобретение также предлагает наборы для выполнения способов идентификации аллелей AHASL1 в растениях подсолнечника. Такие наборы содержат праймеры по настоящему изобретению, в частности первый прямой праймер, первый обратный праймер, второй прямой ираймер и второй обратный праймер, как описанные выше. Первый прямой праймер содержит нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 15, первый обратный праймер содержит нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 16, второй прямой праймер содержит нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 17, и второй обратный праймер содержит нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 18. Наборы необязательно могут содержать одну или более следующих составляющих: полимераза, деоксирибонуклеотида трифосфаты, и инструкции по выполнению способа. Кроме того, изобретение представляет праймеры, используемые в способах, включающих описанную выше ПЦР амплификацию. Такие праймеры содержат нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO: 3,4, 5, 15, 16, 17 и 18. Артикли "а" и "an" используемые в тексте на английском языке относятся к одному или более, чем одному (например, по меньшей мере одному) грамматическому объекту артикля. Например, "an element" означает один или более элементов. Под используемым здесь словом "содержит" или вариациями, такими как "содержат" или "содержащий", следует понимать заключает в себе добавления определенных элементов, целых чисел или этапов, или группы элементов, целых чисел или этапов, но не исключение любого другого элемента, целого числа или этапа или группы элементов, целых чисел или этапов. Следующие примеры приведены с целью иллюстрации, но не с целью ограничения. Пример 1. Фенотипические взаимодействия устойчивых к имидазолинону мутаций в AHASL1 подсолнечника.GM40 и GM1606 представляют собой полученные мутацией, линии подсолнечника, которые показывают высокие уровни толерантности к имидазолинонам, вследствие точечной мутации в кодоне 122(Arabidopsis thaliana номенклатура) AHASL1 (WO 2007005581 и предварительная патентная заявка США 60/695952; поданная 1 июля 2005 г.). Было показано, что А 122 Т мутация и выведенные гомозиготные линии, и гибриды с такими мутациями показывают лучшую толерантность к имазамоксу, чем уже известные, коммерчески применяемые, гомозиготные подсолнечники Clearfield с A205V мутацией приAHASL1 (WO 2007005581). Оба мутанта показывают недостаточное доминирование над чувствительным аллелем дикого типа, чему имеется много других примеров в литературе. Настоящее изобретение основано на открытии, что А 122 Т придает почти полное преобладание по устойчивости к имидазолинонам над A205V при применении гербицида в интервале от 0.5 х до 6 х коммерческих доз. Настоящее изобретение предлагает гетерозиготные A122T/A205V растения подсолнечника, которые проявляют такой же уровень толерантности и характер ответа на увеличенные дозы имидазолинонов, как и гомозиготные А 122 Т растения подсолнечника. Таким образом, более высокий уровень толерантности к имидазолинонам может быть получен путем аллельного замещения A205V на А 122 Т только в одной родительской линии подсолнечника Clearfield, которая в сою очередь позволяет более быстрое развертывание этого нового аллеля в культуре подсолнечника. Для определения фенотипических взаимодействий резистентного гена А 122 Т и гена Imr1 (A205V),уже описанного в IMI-R подсолнечниках (НА 425), F1, F2 и BC1F1 популяции из гибрида GM40(А 122 Т)/НА 425 (A205V) были оценены при двух дозах внесения гербицида (80 и 320 г а.и. га-1 имазапира). Не чувствительные растения наблюдались в F2 и BC1F1 популяциях, полученных из этого гибрида,когда потомство оценивалось при меньшей дозе гербицида, показывая, что резистентные гены в GM40 и НА 425 являются аллелями одного и того же локуса и, что оба показывают одинаковый уровень устойчивости к имидазолинону при 1 дозе нанесения гербицида. Когда F2 и BC1F1 популяции обсчитали при большей дозе гербицида (320 г а.и. га-1), которая дискриминирует обоих родителей, наблюдалась сегрегация чувствительности. Были определены только два фенотипических класса, резистентный (устойчивый) класс с растениями без каких-либо повреждений или слабыми симптомами и чувствительный фенотип, который был уничтожен подобно контрольной линии НА 425. Наблюдаемые сегрегационные отношения свыше 450 исследованных F2 растений не существенно отличались от сегрегационного соотношения 3:1. Для подтверждения этих результатов, F1 растения были подвергнуты возвратному скрещиванию с НА 425 и полученные в результате ВС 1F растения были исследованы при дозе имазапира 320 г а.и. га-1. Наблюдаемые сегрегационные отношения дали хороший подбор 1:1 R:S отношение, подтверждающее, что резистентный ген в GM40 показывает полное доминирование над резистентным геном НА 425 и что оба являются аллелями с одним и тем же локусом, AHASL1. Для дальнейшего подтверждения этих результатов был использован принцип молекулярных марке- 20023348 ров. Ген AHASL1 присутствует в полиморфизме простого повтора последовательности (SSR), который дискриминирует линии, переносящие Imr1 аллель из любого другого генотипа подсолнечника (Kolkmanet al. (2004), Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159). ПЦР амплификация фрагмента гена AHASL1, содержащего этот SSR, с использованием праймеров p-AHAS18 и p-AHAS19 дала продукт длиной 321 п.о. (пар оснований) для GM40 и ВТК 47 (исходная линия мутагенеза) и фрагмент длиной 312 п.о. для НА 425. Полиморфизм такой длины, обнаруженный в GM40 и НА 425, использовали для исследования сегрегации вF2 и BC1F1 популяциях, полученных скрещиванием обеих линий. Восемьдесят растений из F2 популяции и 50 растений из BC1F1 популяции были отобраны путем случайной выборки для выделения ДНК,повреждены нанесением имазапира в дозе 320 г а.и. га-1 и подвергнуты определению генотипа с использованием этого маркера. В F2 популяции 22 растения были убиты гербицидом (S) и 58 не показали симптомов поражения или проявили слабое поражение (R). Наблюдаемое сегрегационное отношение для резистентности не существенно отличалось (Р 0.61) от установленного сегрегационного отношения для полностью доминантного фактора сегрегации в F2 (3R:1S). Наблюдаемая сегрегация для AHASL1 SSR маркера (19 А/А: 39 А/В: 22 В/В) соответствует ожидаемому сегрегационному отношению для кодоминантного маркера, отобранного в F2 (1:2:1, Р 0.87). Все чувствительные растения, генотипированные дляAHASL1 SSR были гомозиготными для НА 425 гаплотипа (В/В), когда R-растения были либо гетерозиготными (А/В) либо гомозиготными для GM40 гаплотипа (А/А) (табл. 4, фиг. 1). Далее была осуществлена косегрегация устойчивых к гербицидам фенотипов и гаплотипов AHASL1 на 50 BC1F1 потомках,отобранных по устойчивости. Наблюдаемые сегрегационные отношения по устойчивости соответствовали отношению 1:1 (Р 0.78), ожидаемому для сегрегации в одном локусе ВС 1. AHASL1 SSR гаплотипы полностью косегрегировали с фенотипами по реакции к гербициду, 23 А/В: 27 В/В. Чувствительные потомки были гомозиготными для НА 425 гаплотипа (В/В), в то время как устойчивые потомки были гетерозиготными для НА 425 и GM40 гаплотипов (А/В). Эти результаты подтверждают, что резистентный ген в GM40 отличается от резистентного гена в НА 425, что оба являются аллельными вариантами локуса AHASL1 и, наконец, что ген, присутствующий в GM40, является полностью доминантным над Imr1 аллелем. Пример 2. Ответ гомозиготных А 122 Т/А 122 Т и A205V/A205V и гетерозиготного A122T/A205V на имазапир на уровне целого растения. Этот эксперимент был проведен, чтобы определить количественно и сравнить чувствительность к имазапиру гибридов подсолнечника, несущих А 122 Т и A205V мутации в гомозиготных (А 122 Т/А 122 Т или A205V/A205V) и гетерозиготных (A122T/A205V) состояниях в различных генетических средах и на уровне целого растения. Материалы. В полевых условиях были получены семена различных видов подсолнечника (табл. 1). Таблица 1 Используемые материалы подсолнечника, их генеалогия и тип мутации Линии L1 и L2 являются линиями с мужской стерильностью и восстановленным размножением, соответственно, которые несут A205V аллель в гомозиготных условиях. L5, BTK 47, являются поддерживающими линиями, которые были использованы в качестве исходного материала для разработки линии(АТСС патентный депозитарный номер РТА-6716; см. WO 2007005581). L4 является реставрирующей линией BC2F4, полученной из скрещивания R7013/GM40, с использованием маркера, способствующего обратному скрещиванию, для отбора растений самых похожих с родительской формой, с которой гибрид скрещивается вновь, в каждой генерации обратного скрещивания. R701 является подходящей реставрирующей линией с хорошей объединяющей способностью. После двух генераций обратного скрещивания были выделены наиболее похожие растения с R701 и их потомство было отобрано по устойчивости к имазапиру. Гомозиготные А 122 Т растения были отобраны среди резистентного потомства с использова- 21023348 нием молекулярной маркерной диагностики А 122 Т мутации, которая описана выше. CMS GM40 является мужской стерильной версией GM40, которую получили из BC1F1 генерации из скрещиванияcmsBTK47/2 GM40, с использованием того же самого диагностического маркера для различения гомо и гетерозиготных растений для А 122 Т аллеля. Методы. Диагностический маркер для А 122 Т мутации. Аллель-специфический ПЦР анализ описан для высокопроизводительного определения генотипа растений подсолнечника, несущих А 122 Т мутацию в AHASL1. Анализ позволяет: (1) определить индивидуумы, которые несут мутацию; (2) определить зиготность этих индивидуумов; и (3) и различить резистентные растения, которые несут эту мутацию, среди растений, которые содержат A205V мутацию. ПЦР праймеры были взяты из предлагаемых Kolkman et al. 2004) Theor. Appl. Genet. 109: 11471159) для амплификации фрагмента последовательности AHASL1 подсолнечника, которая включает А 122 Т мутацию и полиморфизм инсерция-делеция ("INDEL") и которая может быть использована для отличения последовательности А 122 Т мутации от последовательности уже известной мутации A205V. Названия и последовательности этих праймеров следующие: Реакционная смесь имела следующий состав: 1 U Taq ДНК полимеразы, 70 нг геномной ДНК подсолнечника, 25 мкг BSA, и имела конечную концентрацию 100 мкМ каждого dNTP (дезоксинуклеозидтрифосфат), 0.25 мкМ каждого праймера, 90 мМ Tris-HCl рН 8, 20 мМ (NH4)2SO4 и 2.5 мМ MgCl2. ПЦР программа состоит из начального этапа денатурации при 94 С в течение 2 мин, последующих 40 циклов по 30 с при 94 С, 30 с при 56 С и 30 с при 72 С, с последующим удлинением конечной стадии при 72 С до 10 мин. Предсказанный размер фрагмента ВТК 47 (или GM40), использующего вышеуказанные праймеры,составляет 321 и.о. и предсказанный размер фрагмента, основанного на GenBank Accession No.AY541455 для гаплотипа подсолнечника, который несет A205V мутацию, составляет 312 п.о. На фиг. 4 показано, что описанная ПЦР реакция позволяет дискриминировать оба мутанта А 122 Т и A205V на основании наличия INDEL полиморфизма между их последовательностями. Амплифицированные продукты были подвергнуты рестрикции и полученные в результате фрагменты были растворены в агарозном геле. Реакция рестрикции осуществлялась с 10 мкл амплифицированного продукта, BSA 1X (100 мкг/мл), NEBuffer 3 1X (100 мМ NaCl, 50 мМ Tris HCl, 10 мМ MgC12, 1 мМ дитиотреитола рН 7,9) и 2,5U BmgB I. Эту смесь инкубировали при 37 С в течение 3 ч. Предсказанный размер фрагмента после рестрикции для растений дикого типа и А 122 Т был следующим: Дикий тип представил фрагменты 183 + 138 п.о. GM40 (А 122 Т): представил фрагменты 183 + 76 + 62 п.о. Гетерозиготные индивидуумы представили фрагменты 183 + 138 + 76 + 62 п.о. На фиг. 5 показано, что с использованием этого метода были получены фрагменты предусмотренного размера и что этим методом возможно детектировать А 122 Т переносы из растений дикого типа, и также, что возможна дискриминация между гомо и гетерозиготными индивидуумами для А 122 Т мутации. Обработки гербицидом. Семена высевали в чашки Петри и, после прорастания, проростки переносили в горшки диаметром 10 см в горшечную среду, состоящую из равных частей вермикулита, почвы и песка. Растения выращивали в теплице в условиях естественного освещения, дополненного натрий галоидными лампами 400 W для обеспечения длины дня 16 ч. Дневная и ночная температура были 25 и 20 С соответственно. На стадии V2-V4 (SchneiterMiller (1981) Crop Sci. 21:901-903) 10 растений каждого генотипа случайной выборкой отбирали для каждой обработки, состоящей из восьми доз имазапира (0, 40, 80, 160, 240, 320, 400 и 480 г аи/га, соответствующих необработанным, 0.5 х, 1 х, 2 х, 3 х, 4 х, 5 х и 6 х соответственно), и определяли начальную биомассу. Эксперимент проводили по схеме рандомизированных блоков с полной факториальной (линия подсолнечника х обработка) систематизацией и 10 репликациями. В день нанесения гербицида десять растений каждого генотипа отрезали при семядольном узле и сушили при 60 С в течение 48 ч для определения начальной сухой массы. Оставшиеся растения поддерживали 14 дней после обработки имазапиром (DAT) и определяли их высоту, показатель фитотоксичности (PI) и сухую биомассу наземной части. Высоту определяли как расстояние между семядольным узлом и высшей точкой каждого растения. Данные биомассы наземной части из каждой линии были преобразованы в биомассу, накопленную после нанесения гербицида путем вычитания средней начальной биомассы для каждого образца. Данные о сухой биомассы были преобразованы в процент от необработанных контрольных растений внутри каждой лини для обеспечения прямого сравнения между группами. PI имеет фенотипическую шкалу от 0 до 9, по которой оценивали каждое растение путем визуального обследования. Растения без каких-либо симптомов регистрировали как"0", с повышенными уровнями низкорослости и хлорозом по сравнению с необработанными контрольными растениями регистрировали как "1"-"4", с повышенными уровнями дефектов листьев и некрозом листьев регистрировали от "5" до "8", и погибшие растения с полным некрозом до верхней точки регист- 22023348 рировали как "9". Результаты. Высота. Снижение высоты восприимчивой линии было 85% при низшей дозе нанесения имазапира (0.5 х). От 1 х до 6 х снижение высоты снижение высоты этой линии было приблизительно 85% от необработанных контрольных растений. Высота линий подсолнечника и гибрида, несущих A205V мутацию в гомозиготном состоянии, не отличалась от необработанных контрольных при применяемой дозе имазапира 0.5 х или 1 х. От 2 х до 6 х, эти линии показывали заметное снижение роста, которое составляло 69.6%3.9 от необработанного контроля (табл. 2 и фиг. 1). А линии подсолнечника, несущие А 122 Т мутацию в гомозиготном состоянии показывали уменьшенное снижение высоты (от 0.1 до 18.8% от необработанного контроля для 0,5 х и 6 х доз имазапира соответственно). Обе группы линий показали заметные различия в их ответе на увеличение дозы гербицида от 2 х до 6 х (табл. 2 и фиг. 1). Материалы с обоими мутантными аллелями при AHASL1 (гетерозиготы A122T/A205V) показали снижение роста от 0.6% до 38.2%2.7 от необработанного контроля для 0,5 х и 6 х доз нанесения гербицида. Это снижение высоты для гетерозиготных материалов не отличается от снижения, наблюдаемого для гомозигот А 122 Т/А 122 Т, но было меньше, чем зарегистрированное для гомозигот A205V/A205V(фиг. 1). Фактически, среднее снижение роста в гетерозиготных материалах не отличалось от наблюдаемого для гомозиготных А 122 Т/А 122 Т растений при любых дозах нанесения гербицида, но статистически отличалось от наблюдаемого для гомозиготных A205V/A205V растений при дозах нанесения гербицида от 2 х до 6 х (табл. 2). Показатель фитотоксичности. Оба мутанта в гомозиготном состоянии показали большие различия в ответе на увеличение дозы гербицида от 0.5 х до 6 х (фиг. 2). Линии подсолнечника, несущие А 122 Т мутацию в гомозиготном состоянии, показали более слабое снижение размера листьев и яркости зеленого цвета, чем контрольные растения, при повышении доз гербицида (табл. 3). А растения, несущие A205V мутацию, не показали каких-либо повреждений при дозе гербицида 0.5 х или 1 х, но уровень повреждений (хлороз, деформация листьев и некроз листьев) быстро увеличивался для доз от 2 х до 6 х (табл. 3). Два мутанта в гомозиготном состоянии существенно отличались друг от друга по показателю фитотоксичности от 2 х до 6 х (табл. 3). Гетерозиготные A122T/A205V материалы показали такой же характер ответа как гомозиготные А 122 Т/А 122 Т материалы. Фактически они показали только ярче зеленый цвет, чем контрольные растения, при любой дозе нанесения гербицида, и меньший размер листьев, чем контрольные растения, при дозах 5 х и 6 х, для которых определяли PI равный 1 при высшей дозе (фиг. 2). Сухая масса биомассы наземной части. Кривые доза - ответ для сухой массы мутантов А 122 Т и A205V показаны на фиг. 3. Вес биомассы экземпляра А 122 Т в гомозиготном состоянии снижался по сравнению с контрольными растениями при дозах 4 х, 5 х и 6 х, и это снижение достигало 25% для высшей дозы. В тоже время, сухая масса экземпляраA205V снижалась по сравнению с контрольными растениями при дозах от 0.5 х (40 г аи/га) до 6 х. Оба мутанта показали заметные различия между ними в отношении их вариабельности от 0.5 х до 6 х доз(табл. 4). Гетерозиготные A122T/A205V материалы показали совершенно такую же тенденцию как гомозиготные А 122 Т материалы (фиг. 3, табл. 4). Они показали снижение веса биомассы от 0.3 до 33% для доз нанесения гербицида от 0.5 х до 6 х, которое не отличалось от данных, зарегистрированных для гомозиготных А 122 Т индивидуумов при любой дозе. Однако гетерозиготные материалы показали заметные различия по сравнению с гомозиготными A205V индивидуумами для накопления сухого вещества при дозах нанесения гербицидов от 3 х до 6 х (табл. 4). Выводы. Гетерозиготные материалы, несущие оба мутантных аллеля при локусе AHASL1, показали такой же уровень толерантности и характер ответа для высоты растений, показателя фитотоксичности и накопления сухого вещества при увеличении дозы нанесения имазапира, как и гомозиготные А 122 Т материалы,и этот уровень толерантности был лучше, чем проявляемый гомозиготными A205V материалами. Таблица 2 Влияние различных доз имазапира на высоту растений на 14 день после обработки для трех генотипов подсолнечника, несущих A205V мутацию, трех генотипов, несущих А 122 Т мутацию, двух генотипов,несущих A205V/A122T мутацию, и одной чувствительной линии, : Средние значения являются статистически отличными от необработанного контроля при 0.05 и 0.01 уровне значимости соответственно. Таблица 3 Влияние различных доз имазапира на показатель фитотоксичности на 14 день после обработки для трех генотипов подсолнечника, несущих A205V мутацию, трех генотипов, несущих А 122 Т мутацию, двух генотипов, несущих A205V/A122T мутацию, и одной чувствительной линии, : Средние значения являются статистически отличными от необработанного контроля при 0.05 и 0.01 уровне значимости соответственно. Таблица 4 Влияние различных доз имазапира на накопление биомассы на 14 день после обработки для трех генотипов подсолнечника, несущих A205V мутацию, трех генотипов, несущих А 122 Т мутацию, двух генотипов, несущих A205V/A122T мутацию, и одной чувствительной линии, : Средние значения являются статистически отличными от необработанного контроля при 0.05 и 0.01 уровне значимости соответственно. Пример 3. Толерантность к гербициду гомозиготных линий и гетерозиготных А 122 Т и A205V по сравнению с гетерозиготными линиями обоих мутантов (A122T/A205V) в полевых условиях. Этот эксперимент был проведен, чтобы сравнить толерантность к гербициду гибридов подсолнечника и линий различных генотипов, несущих А 122 Т и A205V мутации в гомозиготном (А 122 Т/А 122 Т или A205V/A205V), гетерозиготном (А 122 Т/- или A205V/-) и дважды сложенном гетерозиготном(A122T/A205V) состояниях в полевых условиях. Материалы. Были использованы материалы подсолнечника, приведенные в табл. 5. Таблица 5 Перечень данных Способы. Семена из каждой позиции табл. 5 получали при оптимальных условиях производства семян в Южной Америке в сезоне 2005-2006. Опытное поле было расположено в Северной Дакоте, США, 2006. Образцы были объединены по схеме полностью рандомизированных блоков с использованием метода расщеплнная делянка, состоящей из 3 повторов для каждой комбинации обработки. Фактор А (табл. 6) это обработка гербицидом, а фактор В - это образец подсолнечника. Размер делянки был 4 ряда х 12 фут и норма высева соответствовала местной агрономической практике. Таблица 6 Фактор А - перечень обработок гербицидомNIS = неионное поверхностно-активное вещество. Распыляемый объем: 10 галлонов на акр (GPA) (или 100 л/га) для ранцевого распыления или 20 GPA (или 200 л/га) для закрепленных на тракторе бонов. Стадия роста при нанесении гербицида: 2-4 листа. Позицию 15 (WT линия сохранения) оставляли не опыленной при всех обработках блока. Оценку фитотоксичности проводили на 7 и 21 дни после нанесения гербицида. Фитотоксичность регистрировалась как количество поврежденных растений (в процентах), причем показатель "0" указывает на отсутствие повреждений растений на делянке относительно необработанной делянки. Показатель"100" указывает на полный некроз (гибель) растений на делянке относительно необработанной делянки. Данные подвергали ANOVA анализу и средние значения из 3 повторений представлены в табл. 7(фитотоксичность на 7 день после обработки) и табл. 8 (фитотоксичность на 21 день после обработки). Результаты. При дозе имазапира 160 г аи/га не было значительных различий в фитотоксичности между дважды гетерозиготными образцами A205V/A122T и гомозиготными образцами A205V и А 122 Т на 7 день и 21 день после обработки (DAT). Фитотоксичность гетерозиготных образцов A205V была значительно выше,чем дважды гетерозиготных A205V/A122T и гомозиготных образцов на 7 и 21 DAT (порядка 20-43% для гетерозиготных образцов A205V на 21 DAT). Фитотоксичность гетерозиготных образцов также увеличивалась в промежуток времени оценки с 7 DAT по 21 DAT. He было существенного увеличения фитотоксичности с 7 DAT по 21 DAT для A205V/A122T дважды гетерозиготных А 122 Т/А 122 Т и A205V/A205V гомозиготных образцов. Три уровня имазамокса, 50 г аи, 100 г аи и 200 г/аи/га, тестировали на всех образцах (исключая образец 15). При 200 г аи/га имазамокса гетерозиготные A205V/A122T линии (фитотоксичность 2-3% на 21DAT) демонстрировали существенно меньшую фитотоксичность, чем гомозиготные A205V/A205V линии (фитотоксичность 15-22% на 21 DAT) и эквивалентную фитотоксичность с гомозиготными А 122 Т/А 122 Т линиями (фитотоксичность 3-5% на 21 DAT). Обсуждение. Дважды гетерозиготные образцы A205V/A122T проявляли толерантность к гербициду эквивалентную с гомозиготными образцами А 122 Т/А 122 Т и значительно превосходящую толерантность к гербицидам гомозиготных образцов A205V/A205V, как показано при высшем уровне обработки имазомоксом(200 г аи/га). Единичный уровень обработки имазаяиром, 160 g г аи/га, был недостаточно высоким, чтобы показать существенные различия в фитотоксичности между дважды гетерозиготными образцамиA205V/A122T и гомозиготными образцами, но он был достаточен, чтобы продемонстрировать более высокую толерантность, полученную при стекинге двух гетерозиготных мутаций A205V/A122T вместе по сравнению с каждой гетерозиготной мутацией. На основе данных обработки имазамоксом А 122 Т мутация, когда она скомплектована с A205V му- 26023348 тацией в гетерозиготном состоянии, приводит к более сильной толерантности к гербициду, чем A205V мутация в гомозиготном состоянии. Описанный выше эксперимент раскрывает взаимодействие между двумя аллельными мутантамиAHASL1 в подсолнечнике. Мутация в кодоне 122 имеет существенно большую толерантность к гербициду, чем любые ранее описанные мутации AHAS в подсолнечнике, причем мутация в кодоне 205 обеспечивает промежуточные уровни резистентности. Поскольку аллель 122 показывает доминирование над аллелем 205, гетерзиготные генотипы, несущие оба мутанта, имеют такой же уровень толерантности, как гомозиготные 122. Благодаря изучению повышенной толерантности к гербициду, настоящее изобретение представляет способы, которые позволяют разрабатывать новые и высокоэффективные гербицидные продукты для производства подсолнечника. Также настоящее изобретение предлагает растения подсолнечника с коммерческими уровнями толерантности к гербициду, произведенные с помощью выполнения единственного на настоящий день генного замещения в гибридах подсолнечника Clearfield, которое представляет собой A205V/A205V, настоящее изобретение находит применение в повышенной эффективности размножения при производстве толерантных к гербициду гибридов подсолнечника и также предлагает развертывание А 122 Т мутации в коммерческих гибридах подсолнечника. Таблица 7 Показатели фитотоксичности (% поражения культур), зарегистрированные на 7 день после обработки Таблица 8 Показатели фитотоксичности (% поражения культур), зарегистрированные на 21 день после обработки (DAT) Пример 4. Толерантность к гербициду гомозиготных А 122 Т/А 122 Т или A205V/A205V и гетерозиготных образцов A122T/A205V при листовом нанесении имазапира на поздней вегетативной или ранней репродуктивной стадиях развития растения для контроля заразихи.Orobanche cumana и Orobanche cernua (заразиха) представляют собой два паразитических растения,которые поражают подсолнечник во многих областях производства в мире. Оба вида инфицируют растения подсолнечника последовательно от V6 до стадии цветения (R5). Предлагалось использовать имидазолиноновый гербицид, такой как имазетопир, для контроля заразихи путем нанесения гербицида на содержащие А 205 растения подсолнечника на стадии развития от V10 до Rl (WO 1999065312). Применение этого подхода для контроля Orobanche было успешным и фитотоксичность была незначительной. Здесь авторы показывают, что толерантность А 122 Т/А 122 Т или A122T/A205V гибридов лучше, чем толерантность A205V гомозиготных растений, когда имидазолиноновый гербицид, такой как имазапир,применяют при 2 х повторах во время ранних репродуктивных стадий развития (R1). В этом сообщении авторы показывают применимость А 122 Т/А 122 Т и A122T/A205V для контроля Orobanche в подсолнечнике. Материалы. Линии H1, Н 2 и Н 3, как описанные в табл. 9. Гибрид Н 5 представляет F1, созданный скрещиванием между L3 х R701, а гибрид Н 6 представляет F1, созданный скрещиванием между L1 х R701. Методы. Семена каждого вида были получены при оптимальных условиях производства семян в Лагуна Бланка (Формоза, Аргентина) в 2005. Полевые испытания были проведены в Венадо Туерта (Сайта Фе,Аргентина) в 2006. Образцы были расположены по схеме полностью рандомизированных блоков, состоящей из 3 повторов для каждой комбинации обработки. Фактор А -онтогенетическая стадия развития подсолнечника (V8 и R1) и фактор В - тип подсолнечника. Размер делянки был 5 рядов х 6 метров, растения распределяли через 25 см внутри каждого ряда. На стадии V8 или R1 наносили 160 г аи/га имазапйра + 0.25% (v/v) NIS путем распыления объема 100 л/га с использованием ранцевого распылителя. Оценку фитотоксичности проводили на 7 и 21 дни после нанесения гербицида. Фитотоксичность регистрировалась как количество поврежденных растений (в процентах), причем показатель "0" указывает на отсутствие повреждений растений на делянке относительно необработанной делянки. Показатель от 1 до 15 указывает на повышенный уровень хлороза на делянке, причем "15" указывает на общее пожелтение делянки. Показатель от "20" до "49" указывает на повышенный уровень низкорослости, деформаций и некроза. Показатель "50" указывает на гибель (полный некроз) растений. Данные подвергли ANOVA анализу. Средние значения каждого образца сравнивали с использованием LSD теста при 0.01 уровне значимости. Результаты. Средние значения показателя фитотоксичности (PI), подсчитанные на 14 и 21 дни после обработки(DAT), представлены в табл. 9 и 10. Почти все гибриды проявили слабые симптомы хлороза при обрызгивании на V8 стадии развития растения. Единственным исключением был гетерозиготный 122/WT гибрид, который продемонстрировал полное пожелтение на 14 DAT (табл. 9). Это пожелтение исчезало на 21 DAT (табл. 10). Также, на 21DAT не было различий между линиями в отношении PI (табл. 10). С другой стороны, когда гибриды обрызгали на R1 стадии развития растения и оценили на 14 DAT,обнаружили две хорошо различающиеся группы материалов. Одна группа проявляла только симптомы хлороза (PI менее чем 11.7), в то время как вторая группа проявляла симптомы хлороза наряду с низкорослостью и деформацией (PI больше чем 35). Первая группа состояла из линий, несущих по меньшей мере один аллель А 122 Т (т.е. гибриды А 122 Т/А 122 Т, A122T/A205V и A122/WT), а вторая группа состояла из гибридов, несущих A205V мутацию в обоих гомозиготном и гетерозиготном состоянии(A205V/A205V, A205V/WT). Различие в PI между обеими группами были хорошо заметны (р 0.01; табл. 9). На 21 DAT, однако, для A122/WT гибрида повысилась оценка PI (от 11.7 до 23.3), в то время как, для А 122 Т/А 122 Т и A122T/A205V гибридов понизились их значения PI от 2.3-4.3 до 1.7-0.7. Различия между этими двумя последними гибридами и A122T/WT были хорошо заметны на 21 DAT (табл. 10). Линии,содержащие A205/A205V и A205V/WT, также показали очень высокие значения PI, причем многие растения проявили признаки ожога верхушки и повреждения точек роста (табл. 10). Вывод. Результаты показывают, что гибриды A205V/A205V или A205V/WT нельзя обрызгивать имазапиром после V8, потому что они показали повышенную фитотоксичность и серьзное повреждение после его нанесения. Гибриды А 122 Т/А 122 Т и A122T/A205V проявляли только симптомы хлороза после нанесения имазапира. Это подтверждает, что А 122 Т/А 122 Т и A122T/A205V растения подсолнечника демонстрируют лучший уровень толерантности к имидазолиноновым гербицидам, когда они наносятся на стадии R1, чем A205V/A205V или A205V/WT материал. Таким образом, линии, содержащие А 122 Т/А 122 Т и A122T/A205V объединения, могут быть использованы для контроля Orobanche с помощью имазапира путем нанесения гербицида на R1 (поздней вегетативной или ранней репродуктивной) стадии развития растения. Таблица 9 Средние значения показателя фитотоксичности, оцененного на 14 день после обработки (DAT) имазапиром (160 г аи/га), нанесенного в две разные стадии развития растения (V8 и R1), для мутаций А 122 Т иA205V и гетерозиготных генотипов А 122/А 205, A122/WT и A205/WT. Различные буквы указывают на значительные различия при р 0.01LSD-значение (p0,01) = 10.04. Остаточный средний квадрат = 20.0. Средний квадрат генотипа = 476.22 (р 2.2 е-16).
МПК / Метки
МПК: C12N 15/82, C12N 9/88
Метки: устойчивых, устойчивыми, множественными, набор, растений, аллелями, полинуклеотиды, ahasl1, изолированные, определения, генотипа, подсолнечника, способ, гербицидам
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-23348-sposob-opredeleniya-genotipa-ahasl1-nabor-dlya-opredeleniya-genotipa-ahasl1-i-izolirovannye-polinukleotidy-ustojjchivyh-k-gerbicidam-rastenijj-podsolnechnika-s-mnozhestvennymi-usto.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ определения генотипа ahasl1, набор для определения генотипа ahasl1 и изолированные полинуклеотиды устойчивых к гербицидам растений подсолнечника с множественными устойчивыми к гербицидам аллелями ahasl1</a>
Устойчивые к гербицидам, ингибирующим ahas, растения подсолнечника с двумя различными аллелями ahasl1 и способы их применения
Номер патента: 19952
Опубликовано: 30.07.2014
Авторы: Эхартэ Мариель, Зинг Биджай К., Вестон Брижит Дж., Булос Мариано, Витт Шери Р., Зала Карлос
МПК: C12N 9/88, C12N 15/82
Метки: аллелями, устойчивые, ahas, способы, применения, ингибирующим, различными, гербицидам, подсолнечника, растения, ahasl1, двумя
Формула / Реферат:
1. Устойчивое к гербициду растение подсолнечника, содержащее два различных устойчивых к гербицидам аллеля гена большой субъединицы 1 ацетогидроксикислотной синтазы (AHASL1), содержащих первый аллель и второй аллель, где указанный первый аллель кодирует первый белок AHASL1, содержащий замещение аланина на треонин в положении аминокислоты, которое соответствует положению 7 в SEQ ID NO: 20, и указанный второй аллель кодирует второй белок AHASL1,...
Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов
Номер патента: 20462
Опубликовано: 28.11.2014
Авторы: Эчарте Адриана-Мариель, Ассензи Роберт, Сала Карлос-Альберто, Уитт Шерри Р., Булос Мариано
МПК: A01H 5/00, C12N 9/88, C12N 15/82...
Метки: ацетогидроксикислотной, применение, подсолнечника, кодирующие, субъединицы, синтазы, резистентные, полинуклеотиды, белков, растения, большие, гербицидам, растений, полинуклеотидов
Формула / Реферат:
1. Растение подсолнечника, содержащее обработанный мутагеном рекомбинантный или синтетический полинуклеотид большой субъединицы ацетогидроксикислотной синтазы (AHASL) подсолнечника или потомство этого растения подсолнечника, где указанный AHASL полинуклеотид подсолнечника кодирует AHASL полипептид подсолнечника, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID №: 2, в которой по сравнению с последовательностью дикого типа аланин в положении 7...
Линия клеток растения сахарной свеклы и растение сахарной свеклы, устойчивые к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, семена указанного растения, способы получения указанной клеточной линии и гибридных растений свеклы, устойчивых к данным гербицидам, и применение имидазолинонового гербицида для борьбы с сорняками, растущими на полях с указанными растениями сахарной свеклы
Номер патента: 3297
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Пеннер Доналд, Райт Терри Р.
Метки: данным, растение, клеток, устойчивые, растущими, полях, свеклы, гербицидам, сахарной, применение, линия, указанной, указанными, клеточной, получения, борьбы, растения, сорняками, имидазолинонового, растениями, линии, устойчивых, гербицида, семена, способы, гибридных, имидазолиноновым, растений, сульфонилмочевинным, указанного
Формула / Реферат:
1. Линия клеток растения сахарной свеклы с мутированным геном ацетолактатсинтазы, в котором в положении 562 цитозин замещен на тимин и в положении 337 гуанин замещен на аденин, устойчивая к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, способная регенерировать в растение сахарной свеклы, причем указанная устойчивость передается при общепринятом кроссбридинге регенерированных растений с растениями, чувствительными к данным гербицидам. 2....
Химерная конструкция, включающая, по крайней мере, два гена устойчивости растений к гербицидам, линия растительных клеток, содержащая указанную конструкцию, растение, устойчивое, по крайней мере, к двум гербицидам, и способ обработки растений гербицидами
Номер патента: 2980
Опубликовано: 26.12.2002
Авторы: Пэллетт Кен, Дероз Ришар, Сэллан Ален, Пелиссье Бернар
МПК: A01H 5/00, C12N 15/82
Метки: химерная, клеток, крайней, устойчивости, содержащая, конструкция, растений, линия, конструкцию, растительных, мере, двум, гербицидами, включающая, гербицидам, способ, два, устойчивое, обработки, гена, растение, указанную
Формула / Реферат:
1. Химерная конструкция, включающая, по меньшей мере, два элементарных химерных гена, каждый из которых содержит элементы регулирования, необходимые для его транскрипции в растениях, и кодирующую последовательность, которая кодирует фермент, сообщающий растениям устойчивость к одному гербициду, отличающаяся тем, что одна из кодирующих последовательностей кодирует гидроксифенил пируват диоксигеназу (HPPD). 2. Химерная конструкция по п.1,...
Способ избирательного применения гербицида имазетапира для послевсходовой обработки культурных сортов подсолнечника, устойчивых или толерантных к этому гербициду, и его применение для борьбы с сорнымрастением-паразитом заразихой (orobanche cernua loefl./o. cumana waller)
Номер патента: 3279
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Алонсо Арнедо Луис Карлос, Сальяго Берналь Франсиско Хосе, Лопес Руис-Калеро Герман, Родригес Охеда МА Исабель, Рефоио Пирис Антонио, Фернандес Эскобар Хуан
МПК: A01N 43/50
Метки: имазетапира, устойчивых, cumana, борьбы, подсолнечника, послевсходовой, гербициду, применения, заразихой, сортов, толерантных, обработки, orobanche, способ, этому, гербицида, культурных, cernua, waller, избирательного, применение, сорнымрастением-паразитом
Формула / Реферат:
1. Способ избирательного применения гербицида имазетапира для борьбы с сорным растением-паразитом заразихой (Orobanche cernua Loefl./O. cumana Waller) на культивируемом сорте подсолнечника, устойчивом или толерантном к гербициду, где гербицид используют на послевсходовой фазе культивируемого подсолнечника для разового или двукратного внесения раствора гербицида с помощью обычной машины для внесения ядохимикатов с регуляцией давления и объема...
Предыдущий патент: Способ отделения и количественного определения содержания кислот, образующих нафтенаты, ("arn-кислот") в неочищенной нефти
Следующий патент: Опалубочная система для изготовления сборных бетонных элементов
Случайный патент: Способ получения арктического керосина и дизельного топлива