Способ получения частично зрелых дендритных клеток, обладающих повышенной экспрессией интерлейкина il-12

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧАСТИЧНО ЗРЕЛЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК,ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ИНТЕРЛЕЙКИНА IL-12 Настоящее изобретение относится к способу получения частично зрелых дендритных клеток,обладающих повышенной экспрессией интерлейкина IL-12, к частично зрелым дендритным клеткам, полученным данным способом, к фармацевтической композиции, содержащей полученные частично зрелые дендритные клетки, и применению полученных частично зрелых дендритных клеток при производстве медикамента для лечения и/или предотвращения рака и/или микробных или паразитарных инфекций. Фельцман Томас, Дональ Александр Михаель (AT) Саломатина И.С. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ТРИМЕД БИОТЕХ ГМБХ (AT) Настоящее изобретение относится к способу получения и генетическому конструированию (генной инженерии) дендритных клеток (ДК) и их применению. На протяжении последних лет дендритные клетки (ДК) были признаны как важнейший регулятор иммунитета. ДК человека образуются в результате дифференцировки in vitro из гематопоэтических стволовых клеток или моноцитов периферической крови в присутствии факторов роста, как правило, интерлейкина (IL) 4 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF). Последние факты наводят на мысль, что ДК обладают способностью гибко реагировать на столкновение с микробным, травматическим или метаболическим стрессом. Таким образом, ДК не только видоизменяются в подтип, который выполняет особенную функцию, например активацию или толерантность, поляризацию Т-хелперных лимфоцитов на тип 1 или тип 2 (Th1, Th2), но принимают различные функциональные состояния с течением времени в соответствии с проблемами, обнаруженными в данной окружающей среде (фиг. 1). Моноциты покидают кровоток, чтобы проникнуть в разные ткани и стать тем, что условно называется незрелыми ДК (i-ДК). Эти i-ДК являются "стражами", которые проводят анализ окружающей среды,поглощая вещество из внеклеточной жидкости, а также апоптотические тельца из физиологически гибнущих клеток, обрабатывают и представляют это вещество Т-лимфоцитам без костимулирования в форме, вызывающей толерантность. Фенотип i-ДК, вызывающий толерантность, можно считать "молчащим" статусом (default status) ДК. Это состояние сохраняется до тех пор, пока i-ДК не сталкивается с сигналом опасности, который может быть патоген-ассоциированной молекулярной структурой (РАМР), переданной толл-подобными рецепторами (TLR), воспалительными цитокинами или сигналом, произведенным Т-лимфоцитом, наиболее значительно опосредованным CD40/CD40L взаимодействием. Этот процесс называется созреванием ДК, которое согласуется с последовательностью функциональных изменений. Эти функциональные изменения происходят в течение приблизительно 2 дней, после которых ДК достигают статуса, который называется зрелыми ДК (m-ДК). Наиболее заметно, что ДК начинает активировать костимулирующие молекулы, такие как члены семейства В 7 CD80 и CD86. Это дает возможность ДК передавать активирующий, а не подавляющий сигнал Т-лимфоцитам, которые несут Т-клеточный рецептор, способный взаимодействовать с антигенным пептидом в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) на мембране ДК. На этой стадии также происходит зависимая от стимула поляризация при наличии ДК, секретирующих IL-12, а также семейства цитокинов IL-12, способствующих иммунному ответу 1 типа, который потом обеспечивает клеточный иммунитет, опосредованный цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL). Секреция IL-12, как правило, запускается захватом рецепторами TLR их лигандов, например захватом LPS рецепторами TLR4, а также взаимодействием растворимых или мембраносвязанных молекул CD40L с CD40 на ДК. В противоположность этому, отсутствие выработки IL-12 инициирует поляризацию 2 типа, которая вызывает гуморальный иммунный ответ при поддержке В-лимфоцитов. Инициация созревания ДК без секреции IL-12 совершается путем воздействия на i-ДК смеси цитокинов, которая обычно содержит TNF- и PG-E2, а также разные воспалительные цитокины, включая, но не ограничиваясь этим, интерфероны типа I и типа II, IL-1 или IL-6. Высвобождение IL-12 прекращается примерно через 24 ч, указывая, что встреча между ДК и Тлимфоцитами должна происходить в пределах такого интервала времени, чтобы допустить эффективную поляризацию 1 типа и CTL-активацию. В противоположность этому, экспрессия костимулирующих молекул достигает своего максимума через 2 дня. Так как в соответствии с определением зрелая ДК отличается только фенотипически максимальной экспрессией костимулирующих молекул, но не функционально, тип 1 поляризованной ДК, вырабатывающий IL-12, называется полузрелой (sm) ДК. Приблизительно через 2 дня ДК достигает стадии так называемой зрелости. В течение второго дня своей дифференцировки ДК ослабляют свою иммунную стимулирующую способность и приобретают иммуноподавляющие (иммуносупрессорные) свойства путем активирования молекул, которые опосредуют отрицательные регуляторные петли обратной связи (фиг. 1). Биологическое значение этой фазы дифференцировки заключается в необходимости содержания иммунных ответов под строгим контролем. Активированные иммунные клетки, в частности CTL, которые способны убивать другие клетки, представляют собой значительную опасность для организма. Это подтверждается примером патологических последствий иммунных ответов, которые избегают контроля: аутоиммунными болезнями, такими как диабет I типа или рассеянный склероз. Следовательно, та же самая ДК, которая в течение 1 дня после столкновения с сигналом созревания служит затравкой (начинает иммунный ответ, primes) для иммунных ответов,будет уменьшать этот самый иммунный ответ в течение 2 дня процесса своей дифференцировки. Следовательно, зрелые ДК фактически являются, не как первоначально думали, иммуностимулирующими, а скорее иммуноподавляющими клетками и поэтому не отвечающими требованиям терапевтических вмешательств, направленных на стимулирование иммунитета, например, таких, как их применение в иммунотерапии рака или при лечении заболеваний бактериального происхождения. Важно различать незрелые (сохраняющие толерантность), полузрелые ДК (стимулирующие иммунитет) и зрелые (подавляющие иммунитет) ДК (фиг. 1). i-ДК, как подчеркнуто выше, сохраняют толерантность к аутоантигенам. Полузрелая sm-ДК встречает один из стимулов созревания, описанных выше,и безвозвратно передается в дифференцировку в m-ДК в пределах приблизительно 2 дней. Важно, что только в течение первого дня из этих 2 дней возможно выделение IL-12, инициация иммунной поляризации типа I и в результате поддержка CTL-опосредованного иммунного ответа. После того, как созревающая ДК вступает во вторую фазу дифференцировки после первого дня, она приобретает свойства,подавляющие иммунитет. Среди иммунологов принято характеризовать m-ДК посредством экспрессии мембранных молекул, таких как CD80, CD83 или CD86. Однако в противоположность IL-12, максимальная экспрессия которого достигается в течение нескольких часов и утрачивается через 24 ч, эти мембранные молекулы достигают своей максимальной экспрессии только после 48 ч. Для того чтобы ясно различить ДК, секретирующие IL-12, которые описаны здесь, от тех, которые обычно понимаются под названием зрелые ДК, был выбран термин полузрелые ДК. Это, что очень важно, не будет предполагать какого-нибудь функционального недостатка, а только определенную стадию дифференцировки на кинетической временной шкале на фиг. 1. sm-ДК функционально отличается от i-ДК, так же как и от m-ДК.WO 2007/117682 имеет отношение к зрелым дендритным клеткам, которые трансфицированы молекулами m-РНК, кодирующими CD40L.Koya R.С. et al. (J. Immunoth. 26 (2003):451-460) описывают трансфекцию незрелых дендритных клеток вирусами, кодирующими CD40L. Для созревания этих дендритных клеток требуется CD40L. В работе Liu Y. et al. (Cancer Gene Therapy 9 (2002):202-208) раскрывается трансфекция незрелых дендритных клеток вирусами, кодирующими CD40L. Цель настоящего изобретения - предоставить способ получения дендритных клеток на основе генной инженерии. Эти дендритные клетки могут быть использованы для получения фармацевтических препаратов. Настоящее изобретение относится к фармацевтическому препарату, содержащему частично зрелые дендритные клетки, полученные способом, включающим стадии: а) предоставления незрелых дендритных клеток или их клеток-предшественников или частично зрелых дендритных клеток, получаемых путем контактирования незрелых дендритных клеток по меньшей мере с одним фактором созревания дендритной клетки с целью получения частично зрелых дендритных клеток (полузрелые ДК, sm-ДК), что определяется их способностью секретировать IL-12,b) манипулирования клетками стадии а), в частности частично зрелыми дендритными клетками(i) сверхэкспрессировать по меньшей мере одну иммунную молекулу, способную поддерживать Тлимфоцит-стимулирующую способность дендритных клеток, отличающихся длительной секрецией IL12, по меньшей мере в течение 24 ч, предпочтительно по меньшей мере 48 ч, и выбранную из группы,состоящей из CD40L, путем введения молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих по меньшей мере одну указанную молекулу; и/или(ii) ингибировать или предотвратить экспрессию по меньшей мере одной Т-лимфоцит-супрессорной молекулы, действующей внутри дендритных клеток, подвергнутых воздействию первичного фактора созревания, такого как LPS/IFN-, или выделенной из дендритных клеток, подвергнутых воздействию первичного фактора созревания, такого как LPS/IFN-, и выбранной из группы, состоящей из интерлейкина-10 (IL-10) и индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), такого как по меньшей мере один из генов, приведенных в табл. 3, 4 и/или 5, путем "выбивания" гена или его фрагмента, кодирующего указанную по меньшей мере одну Т-лимфоцит-супрессорную молекулу, или путем введения молекул нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекул рибонуклеиновой кислоты для того, чтобы ингибировать или предотвратить экспрессию по меньшей мере одной Т-лимфоцит-супрессорной молекулы, которая является активной внутри дендритных клеток или доставляется из дендритных клеток в Т-клетки иc) необязательно добавление веществ, чтобы трансформировать клетки-предшественники дендритных клеток в дендритные клетки. Фармацевтический препарат согласно настоящему изобретению содержит дендритные клетки, полученные с помощью раскрытых в данном описании способов. Дендритные клетки, которые подвергаются генной инженерии, направленной на сверхэкспрессию молекул, способствующих иммунностимуляции, таких как CD40L, или генной инженерии, направленной на подавление экспрессии иммуносупрессорных молекул, таких как IL-10 или IDO, и вновь установленные молекулы перечислены в табл. 3,4 и 5 ниже, которые показывают кинетику экспрессии в ДК, которая является подобной IL-10 и IDO. Генная инженерия может быть выполнена на любых ДК или клетках-предшественниках, подобных гематопоэтическим стволовым клеткам, независимо от того, подвергались ли эти дендритные клетки воздействию фактора созревания, такого как TLR-лиганд, смесь воспалительных цитокинов, или Т-клетка получила сигналы, такие как CD40L-опосредованный сигнал, или подвергались другой процедуре, направленной на запуск фенотипического сдвига от незрелой к зрелой ДК, или они могут быть в незрелой стадии. (Генные) манипуляции могут быть выполнены до или после воздействия стимула созревания. Предпочтительно применение стимула созревания (или комбинации стимулов созревания) только в течение короткого периода времени, например в течение не дольше чем 24, 12 ч, но особенно предпочтительно в течение 6 ч, а также в течение менее 6 ч. Предпочтительное применение короткого (по меньшей мере 2 ч) стимула созревания в отношении ДК гарантирует, что иммунный лекарственный препарат с ДК после прививки (введения) пациенту сохраняет способность к высокоэффективной инициации Т-клеточной стимуляции. Генная инженерия ДК стремится к улучшению этой основной иммуностимулирующей способности, но не предназначается для ее замены. Клетки-предшественники дендритных клеток, используемые для получения дендритных клеток фармацевтического препарата настоящего изобретения, должны быть трансформированы в дендритные клетки. Средства и способы достижения этого известны в данной области техники."Клетки-предшественники дендритных клеток" включают моноциты, гематопоэтические клетки и т.д. Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения дендритных клеток, включающему стадии:a) предоставления незрелых дендритных клеток;b) контактирования указанных незрелых дендритных клеток по меньшей мере с одним фактором созревания дендритных клеток для получения частично зрелых дендритных клеток (полузрелых ДК, smДК) что определяется их способностью секретировать IL-12; иc) манипулирования частично зрелыми дендритными клетками (полузрелыми ДК, sm-ДК), вырабатывающими IL-12, стадии b) чтобы:(i) сверхэкспрессировать по меньшей мере одну иммунную молекулу, способную к сохранению Тлимфоцит-стимулирующей способности дендритных клеток, отличающихся длительной секрецией IL-12 в течение по меньшей мере 24 ч, предпочтительно по меньшей мере 48 ч или дольше, и по меньшей мере одну иммунную молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD40L, путем введения молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере одну указанную молекулу; и/или(ii) ингибировать или предотвратить экспрессию по меньшей мере одной Т-лимфоцит-супрессорной молекулы, действующей внутри дендритной клетки, подвергнутой воздействию первичного фактора созревания, такого как LPS/IFN-, или выделенной из дендритных клеток, подвергнутых воздействию первичного фактора созревания, такого как LPS/IFN-, и выбранной из группы, состоящей из интерлейкина 10 (IL-10) и индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), например, по меньшей мере один из генов, приведенных в табл. 3 и 4, путем "выбивания" гена или его фрагмента, кодирующего по меньшей мере одну указанную Т-лимфоцит-супрессорную молекулу, или путем введения молекул нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекул рибонуклеиновой кислоты, чтобы ингибировать или предотвратить экспрессию по меньшей мере одной Т-лимфоцит-супрессорной молекулы, которая является активной в дендритной клетке или доставляется из дендритных клеток в Т-клетки. Генетически сконструированные ДК, выделяющие IL-12, стадии b) способов, описанных выше,сверхэкспрессируют по меньшей мере одну молекулу, способную расширить Т-лимфоцитстимулирующее временное окно и/или полностью предотвратить его закрытие через 24 ч, которая отличается непрерывной секрецией дольше чем 24 ч, при введении молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих по меньшей мере одну иммуностимулирующую молекулу; или показывают ингибированную или подавленную экспрессию по меньшей мере одной молекулы, которая участвует в нормальном дифференцировочном продвижении ДК после воздействия какого-либо эффективного стимула созревания от Тлимфоцит-стимулирующего в Т-лимфоцит-супрессорное временное окно, которое начинает открываться через 24 ч после созревания; и/или ингибируют или предотвращают экспрессию по меньшей мере одной молекулы, которая выполняет функцию в опосредовании супрессии Т-лимфоцитов дендритными клетками, которые развиваются, чтобы принять иммуноподавляющий фенотип. Это достигается путем "выбивания" гена или его фрагмента, кодирующего по меньшей мере одну указанную молекулу и/или путем введения молекул нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекул рибонуклеиновой кислоты, чтобы ингибировать или предотвратить экспрессию, по меньшей мере, одной молекулы, которая вмешивается в нормальное развитие ДК после воздействия стимула созревания от иммуностимулирующего к иммуноподавляющему фенотипу; и/или препятствованием сигналам, которые передаются от ДК к Т-клеткам,вызывая подавление активности этой Т-клетки и таким образом, подавляя иммунный ответ. Дендритные клетки настоящего изобретения максимально увеличивают стимуляцию Т-лимфоцитов, в частности активацию CTL путем использования генной инженерии, чтобы расширить стимулирующее временное окно (приблизительно 24 ч) или полностью предотвратить закрытие этого стимулирующего временного окна через 24 ч. В противоположность IL-10 или IDO, могут быть использованы другие молекулы, которые вовлечены в иммунносупрессорную функцию ДК, которая начинается приблизительно через 24 ч после воздействия какого-либо стимула созревания (табл. 3, 4 и 5). Предпочтительно это будут молекулы, которые намечены для использования в производстве генетически сконструированных иммуностимулирующих ДК. Особенно предпочтительно использовать молекулы, которые показывают экспрессию в два раза больше в представленных данных микроанализа ДНК (табл. 3 и 4), более предпочтительно сверхэкспрессию по меньшей мере в шесть раз. Числа, приведенные в табл. 3 и 4, показывают кратную сверхэкспрессию, как указано в заглавии соответствующей колонки. Особенно предпочтительно в иммунотерапии ДК подавить экспрессию молекул, которые, по-видимому, связаны с иммунносупрессией, как показано в примере, изображенном на фиг. 9. Путем изменения стратегии, приведенной выше, возможна разработка генетически сконструированного Т-лимфоцит-супрессорного иммунного лекарственного препарата с ДК для лечения патологической сверхактивности иммунной системы, например, при аллергиях или аутоиммунных болезнях, а также при трансплантации органов и стволовых клеток. Иммуносупрессия физиологически опосредуется ДК, которая дифференцируется в течение более чем 24 ч, после воздействия какого-либо стимула созревания. Иммуноподавляющая способность такой ДК увеличивается при препятствовании экспрессии Тлимфоцит-стимулирующих молекул в течение первых 24 ч дифференцировки ДК; и/или при сверхэкспрессировании молекул, которые обеспечивают подавление Т-лимфоцитов, при помощи генной инженерии ДК согласно стратегии, изложенной выше. Применение sm-ДК в качестве мишени для генетической манипуляции является главной и критической частью настоящего изобретения. Иммуностимулирующие эффекты m-ДК, которые были опубликованы раньше, являются главным образом следствием крайне искусственных экспериментальных условий, при которых многие из этих экспериментов были проведены, например, использование синтетических пептидов, которые не существуют в природе, вместо действительных мишеней ДК: нативных белковых антигенных молекул или даже целых клеток, обе из этих мишеней требуют полностью различных механизмов поглощения и переработки дендритными клетками. Многие другие исследователи использовали мышиную систему для своей исследовательской работы, при этом существуют критические различия между людьми и мышами, которые вызывают много путаницы. Однако, в настоящее время общепринято, что m-ДК имеют иммуноподавляющие свойства. Неожиданно оказалось, что дендритные клетки, полученные способами согласно настоящему изобретению, показывают более широкое стимулирующее окно (т.е. повышенную и удлиненную экспрессию IL-12). Было обнаружено, что генная инженерия полузрелых (sm)ДК - ДК, в которых процесс физиологической дифференцировки запускается воздействием какого-либо стимула созревания, способного инициировать секрецию IL-12 из ДК, но который, однако, удаляется через промежуток времени от 2 до 12 ч, более предпочтительно через 6 ч - чтобы сверхэкспрессировать CD40L молекулу имеет возможность сохранять свою Т-лимфоцитстимулирующую способность в течение по меньшей мере 24 ч, предпочтительно 48 ч, и даже вплоть до пяти или даже десяти дней. Кроме того, предпочтительно культивировать такие генетически сконструированные ДК в среде, содержащей IFN-. Такие ДК приводятся в состояние sm-ДК, как правило, с помощью 6-часовой экспозиции с лигандом Toll-подобного рецептора (TLR), предпочтительно, но не исключительно, липополисахаридом (LPS), к тому же, предпочтительно в присутствии IFN- (см. табл. 1), и генетически разработанные с целью сверхэкспрессировать CD40L, приобретают фенотип, который отличается длительной секрецией IL-12 в течение по меньшей мере одного, предпочтительно трех, и даже вплоть до пяти дней и сохранением иммуностимулирующей способности в аллогенной смешанной реакции лимфоцитов (алло-MLR) в течение по меньшей мере 24 ч, предпочтительно 48 ч, в пределах пяти дней. В применении к разработке иммунотерапии ДК, это подтверждает существование раннего иммуностимулирующего и более позднего иммуноподавляющего окна дифференцировки ДК и ассоциированной функции. Основным принципом в разработке стимулирующей ДК-иммунотерапии может, следовательно, быть расширение начального стимулирующего окна, для того, чтобы более эффективно запустить иммуноактивацию и уменьшить или закрыть более позднее иммуноподавляющее окно, или наоборот, в случае разработки подавляющей ДК-иммунотерапии (фиг. 1). В общем, для получения иммуностимулирующей ДК-терапии ("ДК иммунотерапии"; "иммунотерапии") для лечения, например, рака или инфекционных болезней, необходимо применить к ДК первоначальный стимул созревания, такой как LPS/IFN-, для того, чтобы инициировать физиологическую дифференцировку из i-ДК в sm-ДК. Другие лиганды TLR (табл. 1) могут служить для той же самой цели, какLPS; комбинации лигандов TLR могут давать более сильный, но не качественно другой сигнал. Если стимулирующий потенциал Т-лимфоцит-стимулирующей ДК-иммунотерапии основывается только на искусственной манипуляции переноса гена без первоначального воздействия на TLR-лиганд,опосредованного стимулом созревания (например, с помощью прямой генной инженерии незрелых ДК),важные вклады в функцию ДК будут потеряны, и Т-лимфоцит-стимулирующая ДК-иммунотерапия не сможет достичь своей полной возможности. Критическое различие генетически разработанной ДКиммунотерапии согласно настоящему изобретению по сравнению с ДК-иммунотерапией, которая производится только путем воздействия фактора созревания или комбинацией факторов, например LPS/IFN(sm-ДК), состоит в том, что для последней является решающим, что sm-ДК иммунотерапия применяется в течение соответствующего короткого окна дифференцировки ДК. Такая стимулирующая ДКиммунотерапия, следовательно, должна применяться в ближайшее время после воздействия стимула созревания, тогда как генная инженерия, например путем сверхэкспрессии CD40L, стремится к расширению иммуностимулирующего временного окна дифференцировки ДК, меньше учитывая решающее время применения, но, что наиболее важно, предотвращая развитие ДК от иммуностимулирующего в иммуноподавляющий фенотип (фиг. 1). Сопоставимое улучшение иммуностимулирующей способности ДК может быть достигнуто путем подавления молекул, предположительно являющихся критически связанными с иммуносупрессией, как показано с помощью профиля экспрессии, который является сходным с экспрессией известных иммуносупрессорных молекул IL-10 или IDO (перечисленные на фиг. 3, 4 и 5); или молекул, которые, как уже показано, являются вовлеченными в иммуносупрессию, так как их подавление в ДК приводило к улучшенной Т-клеточной стимулирующей способности созданных ДК (фиг. 9). Кроме того, иммуностимулирующее временное окно более старой sm-ДК-иммунотерапии закрывается через 24 ч, тогда как новая генетически разработанная ДК-иммунотерапия будет дольше сохранять свой Т-лимфоцит-стимулирующий потенциал в течение по меньшей мере одного, предпочтительно трех, но в пределах пяти дней. Аналогичная концепция остается в силе для Т-лимфоцит-супрессорной ДКиммунотерапии. Сначала незрелые ДК нуждаются в воздействии обычного стимула созревания, такого как LPS/IFN-, для того, чтобы инициировать дифференцировку по направлению к m-ДК-фенотипу, соответствующему Т-лимфоцит-супрессорному окну дифференцировки ДК. Генная инженерия с целью сверхэкспрессировать Т-лимфоцит-супрессорные молекулы в результате ДК-иммунотерапии может быть сделана до созревания незрелых ДК с помощью стимула созревания, такого как LPS/IFN-, а также при нацеливании на клетки-предшественники ДК, такие как моноциты периферической крови, или гематопоэтические стволовые или клетки-предшественники, особенно, но не исключительно, когда используют методы переноса генов, которые дают в результате устойчивую интеграцию в геном, такой как перенос ретровирусного гена. В дополнение к генной инженерии до воздействия стимула созревания, генная инженерия может быть сделана через 6 и до 48 ч после инициирования созревания с помощью, например,LPS/IFN-. Когда незрелые ДК генетически конструируют, чтобы сверхэкспрессировать иммуносупрессорные молекулы, важный вклад в отношении физиологической Т-лимфоцит-супрессорной активности ДК дольше, чем 24 ч, после воздействия стимула созревания может быть утрачен, по этой причине авторы предпочитают генную инженерию ДК только в комбинации с экспозицией этих ДК перед (даже на уровне клетки-предшественника) или после генной инженерии со стимулом созревания, таким какLPS/IFN-. Без генной инженерии Т-лимфоцит-супрессорного ДК-иммунопрепарата применение такой подавляющей ДК-иммунотерапии должно быть осуществлено в течение подавляющего окна дифференцировки ДК, тогда как Т-лимфоцит-супрессорный ДК-иммунопрепарат, генетически разработанный,чтобы сверхэкспрессировать молекулы, которые опосредуют подавление активности Т-лимфоцита, дает возможность гораздо более гибкого введения пациенту. Таблица 1 Лиганды TLR Посредством генной инженерии ДК, которые получили также LPS/IFN- или подобный стимул созревания перед и после генной инженерии, чтобы сверхэкспрессировать Т-лимфоцит-стимулирующие молекулы и молекулы, которые предотвращают закрытие иммуностимулирующего окна, будет возможна ДК-дифференцировка для того, чтобы расширить иммуностимулирующее временное окно дифференцировки ДК. Было решено, продемонстрировать осуществимость настоящего изобретения путем использования переноса гена CD40L, так как взаимодействие CD40, экспрессированного из ДК, и CD40L, экспрессированного из активированных Т-лимфоцитов, посылает сигнал сильной активации и созревания дендритным клеткам. Такие эксперименты предпочтительно выполняют в присутствии IFN-, который является критическим кофактором в созревании ДК, и все эксперименты с CD40L-трансгенными клетками, представленными в примерах, были сделаны в присутствии IFN-. Тот же самый принцип, как перенос гена CD40L, может быть применен к другим молекулам, которые придают улучшенную стимулирующую способность ДК. Альтернативно, Т-лимфоцит-супрессорная ДК-иммунотерапия может быть разработана при помощи "выбивания" (разрушения) экспрессии молекул, таких как CD40 или IL-12 или подобных молекул, или при помощи сверхэкспрессии молекул, которые дают подавление Т-лимфоцитов в результате иммунотерапии ДК. Посредством воспрепятствования экспрессии и/или функции Т-лимфоцит-супрессорных молекул,иммуноподавляющее окно ДК дифференцировки может быть закрыто или сделано уже или сдвинуто к более позднему моменту времени. Осуществимость этого подхода продемонстрирована с помощью подавления экспрессии молекул, которые препятствуют активации Т-лимфоцитов дендритными клетками. Улучшение функции Т-лимфоцитов с помощью подавления произведенных ДК сигналов, подавляющих Т-лимфоциты, как, например, фермент IDO, который метаболизирует триптофан, от которого в большой степени зависят активированные Т-лимфоциты, в кинуренины, которые имеют проапоптотические эффекты на активированные Т-лимфоциты, показано в разделе примеры. В качестве второго примера была намечена экспрессия IL-10, который считается относящимся к прототипу иммуносупрессорной молекулы и который экспрессируется ДК во время иммуноподавляющего временного окна дифференцировки. Для того чтобы подавить экспрессию молекул-мишеней, предпочтительно используют РНК-интерференцию, но той же самой цели могут служить другие методы, такие как внутриклеточная экспрессия одноцепочечных моноклональных антител или антисмысловая РНК. Альтернативно,сверхэкспрессия указанных молекул (например, IDO или IL-10) или подобных молекул может служить для разработки Т-лимфоцит-супрессорной ДК-иммунотерапии на основе предзрелых sm-ДК. Результаты в разделе "Примеры" (фиг. 9) показывают, что подавление экспрессии молекул, которые имеют кинетику экспрессии, сравнимую с IL-10 и/или IDO, также дает в результате улучшенную Т-клеточную стимулирующую способность генетически сконструированных ДК. Структура и свойства ДК нуждаются в описании в динамике, чтобы принять во внимание стадии развития ДК. Каждая из этих стадий может быть охарактеризована в отсутствие или в присутствии определенных маркерных молекул. Это также указывает, что молекулярные особенности ДК зависят от специфической стадии дифференцировки этой ДК и условий, которые заставили ДК принять определенный путь дифференцировки. Пластичность развития ДК также объясняет, почему полезно использовать, что называется, полузрелый тип 1 ДК (sm-ДК 1) ("активирующие Т-клетки дендритные клетки, отличающиеся выработкой интерлейкина-12"). Чтобы инициировать сдвиг от функции сохранения толерантности к иммуностимулирующей стадии, ДК нуждаются в воздействии стимула созревания (фактора созревания дендритных клеток). Это открывает иммуностимулирующее временное окно, во время которого ДК наиболее значительно выделяет IL-12, как ответ на комбинацию LPS и IFN- или подобных реагентов, которые добавляют к культуре, вырабатывающей ДК. IL-12 действует через специфический рецептор на хелперных Т-лимфоцитах и заставляет их принять Th1 фенотип, приводящий к поддержке цитолитического иммунитета. Для того чтобы сделать возможным это ДК/Т-лимфоцит взаимодействие и развитие цитоли-6 023106 тического иммунитета, ДК предпочтительно инокулируют в организм (например, человека) в начальный момент времени в течение иммуностимулирующего окна. В частности, предпочтительным является то,что указанные ДК вводят через 6 ч после стимула созревания. Очевидно, инокуляция связана с удалением культуральной среды ДК, которая содержит фактор созревания дендритных клеток (например, стимулирующие молекулы LPS и IFN-). Достаточно устойчивый сигнал передается в ДК путем 2-, предпочтительно 4-, более предпочтительно 6-часовой экспозиции с указанными факторами созревания (например,LPS и IFN-) так, чтобы после указанной экспозиции ДК безвозвратно приговаривалась к процессу полного созревания и уже не зависела от присутствия лигандов, т.е. факторов созревания ДК. Формально,однако, во время применения ДК еще не завершают процесс своего созревания, который занимает 1-2 дня. sm-ДК 1-модель получает оптимальное преимущество иммуностимулирующего временного окна в течение первых 24 ч после инициирования созревания и перед тем, как откроется иммуносупрессорное временное окно и начнет модулировать с понижением (понижать) иммунный ответ. На начальной фазе после воздействия стимула созревания, такого как LPS/IFN-, ДК обладают сильными иммуноактивирующими свойствами (активирующее окно, фиг. 1), тогда как на более поздних стадиях их развития они вступают в иммуноподавляющую фазу (супрессорное окно, фиг. 1). Молекулярные механизмы Т-клеточной активации хорошо изучены и поняты. События, инициирующие регуляторные петли отрицательной обратной связи, и их молекулярная природа изучены значительно меньше. Таким образом, разработка ДК-иммунотерапии согласно настоящему изобретению стремится к расширению иммуностимулирующего окна для усиления активации иммунитета и регулированию с понижением(downscaling) или закрытию иммуноподавляющего окна, таким образом блокируя регуляторные петли отрицательной обратной связи в ДК. Это было достигнуто с помощью генной инженерии ДК или с помощью сверхэкспрессирующих иммуностимулирующих генов в дополнение к экспозиции их с факторами созревания ДК до или после генной инженерии, таким как LPS/IFN-, или с помощью подавления иммуносупрессорных генов посредством РНК-интерференции. Экспрессию множества иммуностимулирующих или иммуносупрессорных генов можно модулировать, следуя одному и тому же основному принципу. Осуществимость этого подхода путем сверхэкспрессии иммуностимулирующей молекулыCD40L или путем подавления иммуносупрессорных молекул IL-10 и IDO показана в разделе "Примеры". Комбинации сверхэкспрессии и подавления могут усилить эффективность ДК-иммунотерапии, только следуя той же самой основной логике. Т-лимфоцит-супрессорная ДК-иммунотерапия для лечения патологической чрезмерной активности иммунной системы может быть разработана по аналогии с Тлимфоцит-стимулирующей ДК-иммунотерапией посредством генной инженерии ДК, первоначально подвергнутых воздействию стимулов созревания, таких как LPS/IFN-, посредством генной инженерии полученной в результате sm-ДК с целью сверхэкспрессии иммуносупрессорных молекул и/или подавления иммуностимулирующих молекул в ДК. Согласно новой Т-лимфоцит-стимулирующей или супрессорной ДК-иммунотерапии на основе генной инженерии, которая описана в настоящем изобретении, частично зрелые sm-ДК подвергаются манипулированию путем введения в указанные ДК молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей, по меньшей мере, одну иммуностимулирующую или иммуносупрессорную молекулу, и/или молекул нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекул рибонуклеиновой кислоты (например, si-РНК), чтобы ингибировать или предотвратить экспрессию по меньшей мере одной иммуносупрессорной или иммуностимулирующей молекулы. Экспрессия иммуностимулирующих, так же как и иммуноподавляющих молекул, в ДК может находиться под влиянием или может быть вызвана разными способами, в соответствии с чем, предпочтительно модулировать указанные варианты экспрессии введением молекул нуклеиновой кислоты, как описано выше. Например, перенос молекулы нуклеиновой кислоты можно выполнить с помощью лентивирусных"проводников" переноса гена, а также трансфекцией, опосредованной липосомами. Тот же самый принцип, однако, будет выполняться, когда используется (используются) векторы других вирусов, таких как ретровирусы или аденовирусы, или невирусные векторы, или такие технологии, как генная пушка или поликатионная технология, или когда используется любой другой перенос гена. Было разработано несколько стратегий для введения чуждых генов в клетки, включая прямое введение плазмид или ДНК-липосомных комплексов и заражение модифицированными вирусами. Однако безопасность и эффективность являются важными факторами при разработке протоколов терапии, которая использует подобные методы переноса генов. Например, протеины, которые являются лечебными в контексте одной ткани, могут быть вредными в другой. Таким образом, особенно желательными являются транскрипционно-нацеленные векторы, которые могут ограничивать экспрессию терапевтической последовательности по отношению к соответствующим клеткам. Более того, в некоторых случаях здесь может существовать терапевтическое окно для определенных протеинов, такое, что уровни экспрессии ниже или выше определенных порогов могут быть неэффективными или токсичными соответственно. Поэтому, также было бы желательно создать конструкции и разработать методы, которые сделают возможным экзогенный контроль экспрессии, с тем, чтобы уровни терапевтического протеина можно было повышать или понижать в соответствии с терапевтической необходимостью. Традиционные способы переноса генов на вирусной или невирусной основе можно использовать для введения нуклеиновых кислот, кодирующих соответствующие молекулы, в ДК настоящего изобретения или, альтернативно, нуклеиновых кислот, которые ингибируют транскрипцию или трансляцию указанных молекул, таких как si-РНК или антисмысловые РНК. Системы доставки невирусных векторов включают ДНК плазмиды, "оголенную" нуклеиновую кислоту и нуклеиновую кислоту в комплексе со средством доставки, например липосомой. Системы доставки вирусных векторов включают ДНК и РНК вирусы, которые имеют или эписомальный или интегрированный геном после доставки в клетку. Обзор методов доставки генов см. в работах Anderson, Science 256:808-813 (1992); NabelFeigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); MitaniCaskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology и Neuroscience 8:35-36 (1995); KremerPerricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995);Haddada et al., in Current Topics in Microbiology и Immunology Doerfler и Bohm (eds) (1995); и Yu et al.,Gene Therapy 1:13-26 (1994). Также можно использовать небольшие интерферирующие молекулы РНК. В клетках млекопитающих введение длинной ds-РНК (30 nt) часто возбуждает сильный противовирусный ответ, примерами которого являются неспецифическое ингибирование белкового синтеза и деградация РНК. Феномен РНК-интерференции описан и обсужден, например, в работе Bass, Nature 411:428-29 (2001); Elbahir et al.,Nature 411:494-98 (2001); и Fire et al., Nature 391:806-11 (1998), где также обсуждены способы создания интерферирующей РНК. Последовательности si-РНК, использованные в настоящем изобретении, составляют предпочтительно меньше, чем 100 пар оснований, типично 30 п.о. или короче, и созданы с помощью известных в данной области техники способов. Типичные si-РНК согласно данному изобретению могут иметь до 29 п.о., 25 п.о., 22 п.о., 21 п.о., 20 п.о., 19 п.о., 15 п.о., 10 п.о., 5 п.о. или любое целое число около этого или между этими числами. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения предшественники для производства незрелых ДК получают из кожи, селезенки, костного мозга, тимуса, лимфатических узлов, пуповинной крови или, наиболее предпочтительно, из периферической крови. ДК, использованные в способе согласно настоящему изобретению, могут быть непосредственно выделены из соответствующего источника или получены из клеток-предшественников. Специалист в данной области техники знает соответствующие способы. Например, предшественники ДК и незрелые ДК можно выделить путем сбора несвернувшейся периферической крови, гематопоэтических стволовых клеток, с помощью афереза лимфоцитов или путем получения лейкоцитарных пленок, розеткообразования, центрифугирования, центрифугирования в градиенте плотности (например, с использованием Фиколла (такого как FICOLLPAQUE), PERCOLO (коллоидные частицы диоксида кремния (диаметром 15-30 нм), покрытые не поддающимся диализу поливинилпирролидоном (PVP), сахарозы и т.п.), дифференциального лизиса клеток,фильтрации и т.д. В определенных вариантах осуществления популяцию лейкоцитов можно получить,например, путем сбора крови от субъекта, ее дефибринирования, удаления тромбоцитов и лизирования красных клеток крови. Предшественники ДК, моноциты или миелоидные предшественники или стволовые клетки можно использовать для дифференцировки i-ДК. Моноциты необязательно можно извлечь из периферической крови, например, воспользовавшись их способностью прилипать к пластиковым поверхностям, путем центрифугирования в градиенте плотности, промывки моноклональных антител, противоточного центрифугирования и т.п. Если ДК, полученные способом согласно настоящему изобретению, используют для лечения индивидуумов, i-ДК можно получить из данного индивидуума, которого следует лечить, или от здорового индивидуума, у которого HLA соответствует индивидууму, нуждающемуся в лечении. Предшественники ДК могут быть выращены и дифференцированы в подходящей культуральной среде. Подходящие среды для культуры тканей включают, например, RPMI 1640 и DMEM. Среды для культуры тканей могут быть дополнены человеческой аутологичной или смешанной сывороткой доноров, но не сывороткой из какого-либо коровьего источника, аминокислотами, витаминами, цитокинами,такими как GM-CSF и IL-4, или IL-13, или IFN-, и двухвалентными катионами, чтобы способствовать дифференцировке клеток. Клетки-предшественники предпочтительно также можно культивировать в средах клинического качества без сыворотки. Типичная комбинация цитокинов, используемая с культуральной средой для дендритных клеток, содержит GM-CSF и IL-4, или IL-13, или IFN-. С целью применения стимула созревания в отношении ДК, который приведет их в sm-ДК-статус дифференцировки (до или после генной инженерии или на стадии клетки-предшественника ДК, такой как моноцит или гематопоэтическая стволовая или клетка-предшественник), который является предпочтительным статусом для ДК-иммунотерапии настоящего изобретения, генной инженерии, эффективное количество по меньшей мере одного фактора созревания ДК приводят в контакт с i-ДК. По меньшей мере один фактор созревания ДК предпочтительно выбирают из группы, состоящей из термоинактивированной или обработанной формалином бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ), предпочтительно компонентов клеточной стенки БЦЖ, БЦЖ-выработанных липоарабидоманнанов или компонентов БЦЖ, липополисахаридов (LPS), полученных от Е.coli или инактивированных грамположительных или грамотрица-8 023106 тельных микроорганизмов, соединения имидазохинолина, предпочтительно соединения имидазохинолин-4-амина, в частности 4-амино-2-этоксиметил-х-диметил-1H-имидазол [4,5-с]хинолин-1-этанола или 1-(2-метилпропил)-1 Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амина, или его производных (см., например,WO 00/47719), синтетического двухцепочечного полирибонуклеотида, предпочтительно поли-I:С, природной двухцепочечной РНК или РНК вирусов или их фрагментов, или синтетических аналогов, или синтетических или природных молекул нуклеиновой кислоты, содержащих неметилированные CpGмотивы. Большинство из этих соединений являются агонистами TLR (см. табл. 1 для сравнения). В настоящем изобретении особенно предпочтительно использовать LPS в качестве фактора созревания дендритных клеток. Однако, в принципе, также возможно использовать TLR-агонисты, отдельно или в комбинации с IFN-. В принципе, также возможно подвергнуть i-ДК действию смеси цитокинов для созревания, которая обычно включает, но не ограничивается этим, фактор некроза опухоли а (TNF-), IL-1, IL-6 и простагландин Е 6, или действию частей такой комбинации. Более того, возможно инициироватьCD40/CD40L сигнальный путь. Это можно сделать посредством контактирования i-ДК с рекомбинантными молекулами CD40L или гибридными белками, составленными из домена CD40L и другого белка,например, IgG-Fc, в растворимой форме или в форме, иммобилизованной на поверхности, например,культуральной чашки или наночастицы, или с первичными клетками или линиями клеток, генетически созданными для экспрессии CD40L, или с активированными Т-лимфоцитами, которые физиологически повышают экспрессию CD40L. Сигнал CD40/CD40L может быть применен в любой комбинации с TLRагонистами, воспалительными цитокинами. Несомненно, любая комбинация по меньшей мере двух из указанных факторов созревания может быть использована согласно настоящему изобретению. Предпочтительно по меньшей мере один (предпочтительно по меньшей мере 2, 3, 5, 10) фактор созревания дендритных клеток контактирует с дендритными клетками в присутствии IFN-. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения i-ДК до стадии с) генной инженерии контактируют с эффективными количествами по меньшей мере одного фактора созревания дендритных клеток в течение по меньшей мере 2 ч, предпочтительно в течение по меньшей мере 6 ч, в частности в течение по меньшей мере 12 ч и в течение максимум до 24 ч. Время созревания зависит от различных параметров (например, фактора созревания ДК). С помощью способов,известных в данной области техники, время контакта и другие параметры следует выбирать так, что i-ДК только частично созревают в sm-ДК. Маркеры клеточной поверхности можно обнаружить с помощью методов анализа, хорошо знакомых для данной области техники, например, проточной цитометрии и иммуногистохимии. Также клетки можно проконтролировать на выработку цитокинов (например, с помощью ELISA, другого иммуноанализа, или посредством использования наборов олигонуклеотидов или наборов белков). По меньшей мере одну молекулу, способную опосредовать созревание i-ДК в sm-ДК, вырабатывающие IL-12, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из LPS, в присутствии IFN-, для того,чтобы подготовить ДК для стадии генной инженерии с целью производства нового Т-лимфоцитстимулирующего или супрессорного ДК-иммунопрепарата с улучшенными свойствами. По меньшей мере одной молекулой, способной дать возможность ДК сохранить свой иммуностимулирующий фенотип, отличающийся, например, секрецией IL-12 за пределами физиологического иммуностимулирующего окна около 24 ч, таким образом, предоставляя им улучшенные возможности по сравнению с sm-ДК,является CD40L, обычно, но не обязательно в присутствии IFN-. Здесь авторы изобретения предпочли использовать подход, который основывается на предоставлении возможности sm-ДК искусственно экспрессировать CD40L, чего они не могут в норме, с помощью методов генной инженерии, описанных выше. Однако возможно экспрессировать CD40L не из самой ДК, а скорее из вспомогательной первичной клетки или клеточной линии, активированного Т-лимфоцита или использовать растворимые или иммобилизованные рекомбинантные CD40L молекулы или гибридные белки. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна молекула, которая препятствует экспрессии молекул ДК, которая опосредует Т-лимфоцит-супрессорную активность, является выбранной из группы, состоящей из интерлейкина-10 (IL-10) и индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO). Молекула, которая опосредует Т-лимфоцит-супрессорную активность, также может быть выбрана из молекул, перечисленных в табл. 2 и 3 раздела "Примеры", в соответствии с чем предпочтительными являются молекулы, демонстрирующие двукратную сверхэкспрессию в данных ДНК-микроанализа профиля экспрессии, но особенно предпочтительными являются молекулы, демонстрирующие шестикратную или более высокую сверхэкспрессию. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один антиген выбирают из группы:a) состоящей из опухолевых антигенов, вирусных антигенов, бактериальных антигенов или любых других микробных или паразитных антигенов человека; илиb) состоящей из антигенов окружающей среды, которые вызывают аллергию, аутоантигенов, к которым был возбужден иммунный ответ, который вызывает болезнь, или трансплантационных антигенов. Для того чтобы создать новый Т-лимфоцит-стимулирующий или супрессорный ДК-9 023106 иммунопрепарат с улучшенными возможностями на основе sm-ДК, которые способны вызывать специфический усиленный иммунный ответ или усиленную иммуносупрессию в отношении антигена у индивидуума, i-ДК предпочтительно "нагружают" по меньшей мере одним антигеном до их контактирования с предпочтительным стимулом LPS/IFN- для получения sm-ДК, за этим следует генная инженерия. "Загрузка" антигеном необходима для того, чтобы "проинструктировать" Т-лимфоциты против какого антигена они должны становиться активными или к какому антигену они будут толерантными. Антигены для"загрузки" ДК можно получить из больной ткани, например опухолевый антиген или вирусные антигены из зараженных вирусом клеток. Они могут быть фрагментами или мертвого или живого микроорганизма или мертвой или живой прокариотической клетки человека или животного, например, опухолевой клеткой человека или животного. Антиген может быть рекомбинантным белком или синтетическим пептидом, вирусным или невирусным рекомбинантным вектором экспрессии на основе ДНК или природной или синтетической РНК, кодирующей антиген. Альтернативно, антигены могут представлять собой антигены окружающей среды, которые инициируют иммунную дисфункцию, такую как аллергия, аутоантиген, патологический аутоиммунный ответ на который вызывает болезнь, или антиген, который определяет отторжение трансплантата органа или стволовых клеток, например молекулы МНС. Следует отметить, что в случае индукции толерантности Т-лимфоцит-супрессорной ДК-иммунотерапией к аллогенному трансплантату, "загрузка" может быть не нужна, так как орган или стволовые клетки ДК донора несут те же самые молекулы МНС, как трансплантат. Очевидно, что в этих последних ситуациях ДКиммунотерапия будет разрабатываться таким образом, чтобы она подавляла иммунитет к аллергену,трансплантационному антигену или аутоантигену. Для доставки антигена в ДК можно использовать разные методы, такие как пассивная экспозиция, которая дает возможность ДК фагоцитировать белковый или пептидный антиген, антиген-белковый комплекс, клетки или клеточные мембраны, экспрессирующие антигены или антигенные пептиды, экзосомы, липосомы, содержащие антигены или антигенные пептиды, нуклеиновые кислоты, кодирующие антигены или антигенные пептиды (возможно включенные в плазмиды или вирусные векторы) или общую РНК из опухолевой клетки. Эти способы были раскрыты,например, в W099/03499. Такие носители могут быть вирусной или невирусной природы или могут представлять собой наночастицы. Антигены могут являться опухолевыми антигенами, вирусными антигенами, бактериальными антигенами и т.д., в общем, любым пептидом или полипептидом, к которому осуществляется иммунный ответ или реакция. В этом отношении ДК могут быть сенсибилизированы к одному или нескольким антигенам согласно различным методикам, известным в данной области техники. Термин "сенсибилизированный" означает, что антиген или его часть является выставленным на поверхности ДК, предпочтительно в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости(МНС). В принципе, ДК могут быть введены пациенту без предварительной "загрузки" антигеном и получить возможность поглощения антигена in vivo, например, путем инъекции прямо в опухоль или в ее область, в метастазы или в дренирующую лимфатическую систему, включая лимфатические узлы и первичную и/или вторичную лимфоидную ткань. По существу, только присутствие антигена и его представление Т-лимфоциту определяет ДК-иммунотерапию, а не путь, которым антиген передается ДК. Обзор методов "загрузки" ДК дан в работе R.M. SteinmanJ. Banchereau (Nature, Vol. 449/27 September 2007, p. 419-426) и в ссылках там же."Загруженные" антигеном и генетически сконструированные ДК настоящего изобретения можно использовать для терапевтического модулирования иммунных ответов при различных иммунологических дисфункциях в зависимости от антигена, "загруженного" в указанные клетки, а также физиологического функционального статуса ДК, путем использования разных сигнальных молекул, таких как факторы созревания ДК, или путем генной инженерии ДК. Подобные дисфункции могут включать, но не ограничиваются этим, рак, который может быть представлен как неспособность иммунной системы отторгнуть трансформированные и мутировавшие клетки; инфекционную болезнь, например, в контексте тяжести и в других отношениях неизлечимых микробных инфекций или дисфункции у иммуноскомпрометированных индивидуумов, в частности во время трансплантации органа или стволовых клеток. Другие иммунные дисфункции, которые можно лечить таким ДК-иммунопрепаратом, могут вытекать из иммунологической гиперактивности, например, против антигенов окружающей среды, приводящей к аллергическим реакциям, или в ситуациях, когда иммунная система атакует своего "хозяина", вызывая аутоиммунные болезни. Наконец, на основе способов настоящего изобретения может быть разработан такой ДК-иммунопрепарат, который препятствует отторжению трансплантата органа или стволовой клетки/клетки-предшественника, включая индуцированные клетки-предшественники (iPS), созданные путем генной инженерии других клеток, таким образом, способствуя принятию трансплантата его хозяином. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один антиген выбирают из группы, состоящей из опухолевых антигенов, вирусных антигенов и бактериальных антигенов. Генетически сконструированные ДК согласно настоящему изобретению могут быть "загружены" любым антигеном, к которому необходимо вызвать, подавить или предотвратить иммунный ответ у индивидуума. Особенно предпочтительными являются опухолевые антигены. Новый генетически сконструированный ДК-иммунопрепарат с улучшенной Т-лимфоцитстимулирующей или супрессорной способностью согласно настоящему изобретению можно сохранить до введения пациенту, например, путем хранения при криогенной температуре (криоконсервации) или до созревания как i-ДК, после частичного созревания как sm-ДК, до или после генной инженерии как усовершенствованные ДК. Вещества для криоконсервации, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются этим, диметилсульфоксид (DMSO), глицерин, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, альбумин, декстран, сахарозу, этиленгликоль, и-эритритол, D-рибитол, D-маннитол, D-сорбитол, иинозитол, D-лактозу, холинхлорид, аминокислоты, метанол, ацетамид, глицеролмоноацетат и неорганические соли. Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей новый генетически сконструированный ДК-иммунопрепарат с улучшенной Т-лимфоцитстимулирующей или супрессорной способностью согласно настоящему изобретению. ДК настоящего изобретения могут быть заключены в состав с физиологически приемлемыми переносчиками, эксципиентами, буферами и/или разбавителями с помощью способов и композиций, хорошо известных специалистам в данной области. Новый генетически сконструированный ДК-иммунопрепарат с улучшенной Т-лимфоцитстимулирующей или супрессорной способностью может быть прямо введен субъекту, нуждающемуся в иммуномодуляции. Обычно, примерно от 10 до 10 клеток являются включенными (are suspended) в фармацевтически приемлемый переносчик. Если лечению подвергается индивидуум, страдающий от рака,клетки предпочтительно вводят в здоровый лимфатический узел, предпочтительно в паховую область(однако любой лимфатический узел без опухоли и несущий опухоль (метастатический) будет служить целью), прямо в опухоль или в область около нее, смежную с ней или находящуюся в циркуляторном или лимфатическом контакте с опухолью или в опухолевое ложе, или в метастаз. ДК-иммунопрепарат можно применять подкожно или внутрь кожи, чтобы дать возможность перемещения в лимфатические узлы. В принципе также возможно введение ДК-иммунопрепарата в кровоток или в виде однократного введения, или в виде вливания в течение более длительного периода времени в периферическую кровь,или через катетер в кровеносный сосуд (артерию или вену), который снабжает больной орган или область тела, или воротную вену, или легочную вену или артерию и т.п. Можно использовать имплантируемые высвобождающие устройства, которые доставляют непрерывный поток ДК-препарата в опухоль или метастазы, лимфатический узел, кровоток или кожу. Новый генетически сконструированный ДК-иммунопрепарат с улучшенной Т-лимфоцитстимулирующей или супрессорной способностью настоящего изобретения можно вводить любыми способами, подходящими для композиции и способа введения. Например, клетки можно объединить с фармацевтически приемлемым переносчиком и вводить с помощью шприца, катетера, канюли и т.п. Как указано выше, клетки можно поместить в медленно высвобождающую матрицу. При введении в этой форме, композицию можно вводить с помощью способов, подходящих для использованной матрицы. Другие методы и способы введения, подходящие для настоящего изобретения, хорошо известны специалистам в данной области. Композиции настоящего изобретения можно использовать отдельно при лечении индивидуума, или композиции можно использовать в комбинации с другим способом лечения опухоли. Например, способы настоящего изобретения можно использовать в комбинации с хирургическим удалением опухоли; до,одновременно с или после рентгенотерапии и/или химиотерапии (цитотоксическими лекарственными средствами, апоптотическими агентами, антителами и т.п.); криотерапией; брахитерапией; другими формами иммунотерапии (выращенные ex vivo Т-лимфоциты, специфические к опухолевым антигенам, NKклетки, цитокины и факторы роста, антитела, специфические к опухолевым антигенам или структураммишеням опухолевой ткани, которые являются критичными для выживания опухолевых клеток, такие как кровеносные сосуды и т.д.); генной терапией с использованием вирусных и невирусных векторов и т.п. Более того, ДК-иммунопрепарат настоящего изобретения можно вводить с другим агентом, который действует как адъювант в отношении созревания дендритной клетки и/или процессинга антигена в опухоли или области около опухоли или смежной с опухолью. Эти способы, все без исключения, также можно использовать в комбинации. Комбинированное лечение может быть одновременным или последовательными и может быть проведено в любом порядке, который определен лечащим врачом. Другой аспект настоящего изобретения касается применения дендритных клеток согласно настоящему изобретению для производства медикамента для лечения и/или предотвращения рака и/или микробных или паразитарных инфекций; или для лечения и/или предотвращения аллергических реакций,аутоиммунных болезней или отторжения трансплантата стволовых клеток или органа. Частично зрелые дендритные клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно можно использовать в предотвращении рака и/или лечении рака. В каждом случае дендритные клетки "нагружают" по меньшей мере одним опухолевым антигеном. Например, но без ограничения, клетки можно вводить прямо в опухоль, в опухолевое ложе после хирургического удаления или резекции опухоли, около опухоли (peri-tumorally),в дренирующий лимфатический узел, находящийся в прямом контакте с опухолью, в кровеносный сосуд или лимфатический проток, ведущий в опухоль или питающий опухоль, или орган, пораженный опухолью, например, воротную вену или легочную вену или артерию и т.п. Введение частично зрелых дендритных клеток настоящего изобретения можно применять одновре- 11023106 менно с другими или после других видов лечения опухоли, такими как химиотерапия или рентгенотерапия. Более того, частично зрелые дендритные клетки изобретения можно вводить совместно с другими средствами, которые действуют как адъюванты для созревания дендритных клеток и/или переработки антигена в опухоли или в районе около опухоли или смежном с опухолью. В добавление к этому, дендритные клетки также могут быть включены в состав или соединены с матрицей с медленным высвобождением для имплантации в область в опухоли или около опухоли или в опухолевое ложе, так что клетки медленно высвобождаются в опухоль или опухолевое ложе для контакта с опухолевыми антигенами. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения медикамент вводят индивидууму до, одновременно с или после рентгенотерапии и/или противоопухолевой или противомикробной химиотерапии, или любой терапии, направленной на лечение аллергических реакций или отторжения трансплантата стволовых клеток или органа. Дендритные клетки согласно настоящему изобретению также можно применять в комбинации с другими видами лечения рака, для того, чтобы достигнуть даже большего положительного эффекта. Другой аспект настоящего изобретения относится к применению дендритной клетки согласно настоящему изобретению для производства медикамента для лечения и/или предотвращения иммунологической болезни, вызванной патологической чрезмерной реакцией иммунной системы против антигенов окружающей среды, таких как аллергены, или против аутоантигенов в процессе аутоиммунного заболевания. Указанный медикамент предпочтительно вводят индивидууму до, одновременно с или после других способов воздействия, направленных на лечение или предотвращение аллергических реакций или аутоиммунной болезни. Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к применению дендритной клетки согласно настоящему изобретению для производства медикамента для лечения и/или предотвращения иммунологического отторжения аллогенного трансплантата стволовых клеток, предпочтительно использованных в лечении гематологических злокачественных новообразований, или для лечения и/или предотвращения отторжения аллогенного трансплантата органа. Указанный медикамент предпочтительно вводят индивидууму до, одновременно с или после других способов воздействия, направленных на лечение или предотвращение отторжения аллогенного трансплантата стволовых клеток или органа. Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими фигурами и примерами, однако, не ограничивается этим. Фиг. 1 показывает пластичность развития ДК в схематическом представлении кинетики процесса дифференцировки ДК. Фиг. 2 показывает контроль качества базовой "конструкции" sm-ДК 1. Фиг. 3 представляет результаты переноса гена CD40L. Фиг. 4 показывает качество и количество секреции IL-12 и IL-10. Фиг. 5 показывает потенциал для цитолитической активности (квадрат, CD40L трансгенные ДК; ромб, GFP трансгенные ДК; треугольник, контрольные ДК). Фиг. 6 показывает иммуностимулирующую способность LPS-активированных ДК, блокированных для экспрессии IL-10. Фиг. 7 показывает иммуностимулирующую способность LPS-активированных ДК с "молчащей" экспрессией IDO. Фиг. 8 показывает экспериментальный дизайн экспериментов по анализу профиля экспрессии ДК. Фиг. 9 а показывает примеры улучшенных пролиферативных ответов после подавления экспрессии молекул-мишеней в ДК, установленных в экспериментах по анализу профиля с использованием РНКинтерференции. Фиг. 9b показывает дополнительные примеры генов, которые после подавления их экспрессии в ДК с помощью si-РНК приводят к улучшенной стимулирующей способности таких генетически сконструированных ДК для аллогенных лимфоцитов, как показано по сравнению с контрольной siРНК-трансфекцией или нетрансфицированными ДК, как указано. Пример. Способ получения Т-лимфоцит-стимулирующего или супрессорного ДК-иммунопрепарата с помощью генной инженерии. Аферез лейкоцитов. Лейкоциты собирали с помощью устройства для афереза лейкоцитов Amicus (Baxter, Deerfield, Иллинойс) от здоровых добровольцев и пациентов, страдающих от различных неоплазий, леченых в контексте клинических испытаний, которые были одобрены ответственным экспертным советом института. Все участники давали информированное согласие для этих исследований согласно Хельсинской Декларации Всемирной медицинской ассоциации. Количество клеток и субпопуляции определяли на счетчике клеток Sysmex (Sysmex, Bornbarch, Германия) и/или с помощью проточной цитометрии. Накопление моноцитов. Моноциты собирали с помощью адгезии на пластике, как описано ранее, с использованием AIM-V(Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 1% человеческой смешанной АВ плазмы человека(Octaplas, Octapharma, Вена, Австрия) или среды CellGro (CellGenix, Freiburg, Германия). В отношении поточных процедур авторы изобретения следовали инструкциям, предоставленным производителями. С помощью сепаратора клеток Elutra (Gambro BCT, Lakewood, CO) моноциты накапливали из продукта афереза лейкоцитов путем загружения в камеру для элютриации при сохранении скорости центрифугирования 2400 об/мин. Впоследствии скорость центрифугирования и поток среды для элютриации(PBS/HSA Baxter, Нью-Джерси, штат Нью-Джерси) удерживали постоянными для фракционирования клеток. Альтернативно, отбор моноцитов проводили с помощью системы для отбора клеток CliniMACS(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Германия), которая использует CD14-покрытые магнитные микроносители для удерживания моноцитов в магнитной колонке. Другой вариант накопления моноцитов -это элиминация Т и В-лимфоцитов для обогащения моноцитов - был осуществлен с помощью магнитного клеточного селектора Isolex 300i (Nexell, Irvine, CA). Лимфоциты удерживали в магнитной колонке посредством соединения их с магнитными микроносителями, покрытыми CD2 и CD19, и сбора элюат. Конечные продукты всех процедур накопления были охарактеризованы с помощью проточной цитометрии. Проточная цитометрия. Продукты афереза лейкоцитов и накопления лимфоцитов исследовали на общие лейкоциты, Тлимфоциты, В-лимфоциты, моноциты и гранулоциты с помощью мечения антителами анти-CD45-FITC,анти-CD3-PerCP, анти-CD19-АРС, анти-CD14-АРС и анти-CD15-FITC (BD Pharmingen San Diego, CA),соответственно, используя систему Trucount (Becton Dickinson, Нью-Джерси, NJ). Меченые клетки анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA). В анализы были включены контрольные антитела соответствующего изотипа. Получение ДК. Моноциты, выделенные с помощью соответствующих методов накопления, описанных выше, культивировали при плотности 1106 моноцитов/см 2 или в среде AIM-V с добавлением 2% смешанной человеческой АВ плазмы или в среде CellGro при 37 С во влажном инкубаторе, в течение 6 дней. В культуральную среду добавляли 1000 U/мл человеческого GM-CSF и 300 U/мл человеческого IL-4 (обе от CellGenix, Фрайбург, Германия) и заменяли на одинаковый объем AIM-V/2%OP или CellGro плюс GM-CSF иIL-4 на 3 день. Созревание проводили на 6 день путем добавления 50 нг/мл IFN- (Boehringer Ingelheim,Вена, Австрия) и липополисахарида (LPS, штамм Е.coli 0111:В 4, Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния,США), в пределах 1-1000 нг/мл к культуре в течение 6 ч, чтобы получить полузрелые (sm)ДК, которые потом были заморожены; ДК-вакцины пациентов были изготовлены с LPS клинического качества (USPharmacopeia, Бетесда, Мэриленд). Иммунофенотипирование ДК. Статус созревания ДК определяли, используя следующие антитела: анти-CD86-АРС (BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния), анти-CD80-РЕ (Immunotech, Beckman Coulter, Фуллертон, Калифорния),анти-CD83-АРС (все три от BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния), анти-МНС I-PE, анти-МНС IIFITC (оба от Dako Cytomation, Carpinteria, Калифорния) и анти-CD45-PerCP (BD Pharmingen, Сан-Диего,Калифорния). Жизнеспособность ДК измеряли путем окрашивания пропидий иодидом (Sigma, St. Louis,МО). Клетки анализировали с помощью проточного цитометра FACS Calibur. В анализы были включены контрольные антитела соответствующего изотипа. Обнаружение IL-12 с помощью метода ELISA. Концентрации IL-12 в супернатанте культур ДК измеряли, как описано ранее. Аллогенные смешанные реакции лейкоцитов. Аллогенные клетки-респондеры РВМС были выделены с помощью градиентного центрифугирования из периферической крови. Стимулированные ДК (10000, 2000 или 400) помещали в трех экземплярах вместе с 105 клетками-респондерами в 200 мкл среды AIM-V с добавлением 2% смешанной человеческой плазмы на 96-луночные планшеты с круглым дном. Для положительного эталона 105 клеток-респондеров стимулировали с помощью 100 нг/мл стафилококкового энтеротоксина А/В (SEA/SEB, Toxin Technologies Inc., Сарасота, Флорида). На 4 день совместную культуру инкубировали в течение следующих 18 ч с раствором тритий тимидина 1 Ci (NEN Life Science Products, Бостон, Массачусетс). Наконец, клетки собирали с помощью коллектора Skatron (Lier, Норвегия). Включенный тритий тимидин подсчитывали с использованием планшетного ридера Trilux-plate (Wallac Oy, Турку, Финляндия). Альтернативно, аллогенные РВМС метили CFSE (Molecular Probes, Eugene, OR) и смешивали с ДК в соотношении 1/5, 1/10,1/20, 1/40 и 1/80. Для контролей не добавляли ДК или SEA/SEB. Наконец, РВМС метили анти-CD3PerCP и анализировали с помощью проточного цитометра FACS Calibur. Определяли процент CD3 положительных CFSE отрицательных Т-лимфоцитов. Перенос лентивирусного гена в sm-ДК. С использованием лентивирусной системы экспрессии ViraPower Lentiviral Expression System (от компании Invitrogen) лентивирусные частицы были получены путем котрансфекции клеточной линиипроизводителя 293FT с pLP-плазмидами, кодирующими вирусные структурные белки, полимеразу и обратную транскриптазу (pLP/VSVG, pLP-1, pLP-2) и плазмидами, содержащими GFP или CD40L. Через 72 ч после котрансфекции, весь супернатант собрали и концентрировали 100 с помощью ультрацентрифугирования. ДК росли и созревали при условиях, описанных выше. ДК собирали через 48 или 6 ч после инициации созревания соответственно. Затем предзрелые sm-ДК были преобразованы лентивирусными частицами (250 мкл 100 концентрированный лентивирусный супернатант /1106 ДК) в комбинации с 6 мкг/мл Polybrene (от компании Sigma-Aldrich) плюс IL-4, GM-CSF и IFN- в стандартных концентрациях. Для качественного контроля IL-12 супернатант был взят через 24 ч, а экспрессию GFP/CD40L измерили через 48 ч после стандартных процедур. РНК-интерференция вДК. ДК изготавливали согласно стандартным процедурам, описанным выше. На 6 день 10 ДК трансфицировали 100 пмоль ген-специфической si-РНК с использованием реагента для трансфекции (Dharmacon) согласно инструкциям производителей. Через 12 ч после трансфекции ДК стимулировали LPS/IFN- в течение 6 ч. Все используемые условия аналогичны методам, описанным выше. Результаты. ДК-иммунопрепараты, применяемые в настоящее время, используют ДК, полученные из моноцитов, которые заряжены антигеном какой-либо природы, как описано во введении, и подвергнуты воздействию стимула созревания, который обладает способностью инициировать высвобождение IL-12 из ДК. Фенотип ДК, отличающийся секрецией IL-12, обладает способностью вызывать поляризацию иммунной системы типа 1, которая поддерживает цитолитический иммунитет. Это значит, что стимулирующую ДК-иммунотерапию необходимо применить у пациента в течение временного окна секреции IL-12, чтобы дать возможность представить антигены из ДК Т-лимфоцитам в присутствии IL-12 (фиг. 1). Новый генетически сконструированный ДК-иммунопрепарат с улучшенной Т-лимфоцит-стимулирующей или подавляющей способностью преодолевает это ограничение, так как генные манипуляции с ДК дают возможность оставить открытым иммуностимулирующее окно в течение более длинного периода времени. В следующих примерах генетически созданный ДК-иммунопрепарат был изготовлен и исследован. Использовали перенос лентивирусного гена или трансфекцию на основе липосомы для того, чтобы доставить ДНК или РНК в ДК, но можно полагать, что для этого может послужить любая технология доставки нуклеиновой кислоты. Как пример сверхэкспрессии иммуностимулирующего гена в ДКиммунопрепарате, были созданы ДК с использованием переноса лентивирусного гена для экспрессии молекулы CD40L. Функциональные исследования подтвердили, что такой сконструированный ДКиммунопрепарат обладает повышенным потенциалом для стимулирования иммунных ответов. Кроме того, показано, что подавление иммуносупрессорных молекул IL-10 и IDO также усиливает стимулирующую способность сконструированных ДК вместе с молекулами si-РНК, разработанными для РНКинтерференции для IL-10 и IDO. Для того чтобы установить дополнительные ДК молекулы, вовлеченные в иммуносупрессорные петли обратной связи, были проделаны анализы профиля экспрессии полной геномной ДНК с помощью ДНК-микроанализов. На основе анализа кластеров, который сгруппировал гены с профилем экспрессии, похожим на профиль IL-10 или IDO, был создан список генов, которые имеют возможность отрицательно регулировать иммунные ответы. Таким образом, подавление этих генов при ДК-иммунотерапии будет улучшать ее иммуностимулирующую способность. Следовательно, ДКиммунотерапия генетически разработанная для того, чтобы дать возможность специфической модуляции определенных компонентов иммунной системы, способствует лечению связанных с иммунной системой дисфункций. В конечном счете показаны примеры функциональных последствий подавления геновмишеней, которые экспрессируются с кинетикой, похожей на кинетику IL-10 или IDO в экспериментах по анализу профиля экспрессии ДК с использованием РНК-интерференции. В совместных культурах с аллогенными Т-лимфоцитами наблюдали улучшенную способность таких генетически сконструированных ДК вызывать пролиферацию, свидетельствующую об усиленной стимуляции Т-лимфоцитов. Фиг. 2 показывает контроль качества базовой "конструкции" sm-ДК 1, которая использовалась для генной инженерии. ДК-иммунопрепарат соответствует определенному критерию контроля качества. Панель А показывает чистоту, жизнеспособность и выход ДК, полученных из моноцитов периферической крови. Такие моноциты собирают с помощью афереза лейкоцитов, а моноциты собирали с помощью противоточного центрифугирования (элютриации). В присутствии IL-4 и GM-CSF моноциты дифференцируют in vitro в пределах шести дней в i-ДК. i-ДК "заряжают" антигеном и потом подвергают воздействию стимула созревания, состоящего из LPS и IFN-, в течение 6 ч и замораживают. На этой стадии их называют полузрелыми, так как, хотя они необратимо переданы для продолжения своего созревания, они еще не могут показать типичные фенотипические и функциональные характеристики m-ДК. Что наиболее важно, на этой стадии (иммуностимулирующее окно, приблизительно 0-24 ч после инициирования созревания, фиг. 1) ДК инициирует иммунитет в отличие от более поздних стадий (иммуноподавляющее окно, приблизительно 24-48 ч после инициирования созревания, фиг. 1). Однако при клиническом применении их вводят пациенту на этой стадии дифференцировки, когда они завершают свое созревание и запускают иммунные ответы (до 24 ч), но потом (приблизительно на 24 ч) также вступают - согласно их физиологической программе развития, инициированной стимулом созревания - в иммуносупрессорную стадию, которую авторы стремятся предотвратить с помощью генетически сконструированного ДКиммунопрепарата. Для контроля качества одну аликвоту ДК-иммунопрепарата размораживали и рекультивировали в течение 2 дней, чтобы дать ДК завершить процесс созревания. В течение этих двух дней они секретиру- 14023106(панель В; показано значениеSEM от трех индивидуумов). Также они показывают изменения в модели экспрессии критических мембранных молекул ДК (панель С). Наконец, ДК подвергаются проверке эффективности алло-MLR (панель D) посредством совместного культивирования с CFSE-мечеными аллогенными РВМС в указанных соотношениях, которые запускают клеточное деление, которое связано с разбавлением CFSE и уменьшением флюоресценции. Гистограммы показывают процент пролиферирующих клеток от трех индивидуумов (значениеSEM). Первоначальный стимул также необходим для инициации иммуноподавляющих петель обратных связей. В общем, в ответ на более сильную активацию специфическим стимулом будет происходить более сильная обратная передача сигналов, для того, чтобы понизить иммуноактивацию до ее базисного уровня, таким образом, предотвращая иммунный ответ от выхода из-под контроля и порождения аутоиммунных болезней. Таким образом, было обнаружено, что стимул созревания LPS/IFN- приводит к самым высоким количествам выделения IL-12, а также к самым высоким количествам выделенного IL-10. Таблица 2 Характеристики базовой "конструкции" sm-ДК 1 для вакцинации от рака Описание стимулирующей ДК-иммунотерапии, усиленной с помощью сверх экспрессии молекулыCD40L. С целью расширения иммуностимулирующего окна ДК, которое характеризуется секрецией IL-12(фиг. 1), ДК были генетически сконструированы, чтобы сверхэкспрессировать CD40L. Эта молекула обычно выделяется из активированных Т-лимфоцитов и взаимодействует с CD40 на ДК, передающих критический активирующий сигнал на ДК. Этот эксперимент был спланирован как пример переноса активирующей молекулы в иммунный препарат ДК. Однако, в принципе, идентичную процедуру можно использовать для других стимулирующих молекул, или для того, чтобы создать супрессорный иммунный препарат с ДК, при этом иммуносупрессорные молекулы могут сверхэкспрессироваться из ДК. В частности, обоснованием для переноса гена CD40L в ДК было:(i) предоставление возможности ДК стать независимыми от активирующих Т-лимфоцитов для доставки CD40L-сигнала в ДК;(ii) было предположено и обнаружено в настоящих экспериментах, что вследствие постоянного присутствия CD40L на самой ДК при экспрессии из конститутивно активного промотора, ДК была способна секретировать IL-12 в течение более длинного периода времени, чем когда ДК подвергались обычному стимулу созревания, такому так LPS/IFN-;(iii) общее количество IL-12, выделенного из ДК, было значительно выше по сравнению со стимулом LPS/IFN- или CD40L/IFN- в отдельности, и кинетика секреции IL-12 была качественно отличной,начинаясь вскоре после того, как был применен стимул, таким образом расширяя иммуностимулирующее окно ДК-дифференцировки;(iv) даже через 48 ч после воздействия LPS/IFN-, когда ДК истощили свою способность секретировать IL-12, перенос гена CD40L давал возможность ДК начинать вторую фазу секреции IL-12 (фиг. 3). Фиг. 3 показывает перенос гена CD40L. На панели А показана экспрессия GFP или CD40L после переноса лентивирусного гена в 6-часовых sm-ДК и 48-часовых m-ДК. Все измерения, показанные здесь,были сделаны через 48 ч после экспозиции пред-зрелых ДК с лентивирусным вектором. ЭкспрессияCD40L из ДК вызывала усиленную секрецию IL-12 по сравнению с i-ДК, ДК, подвергнутыми воздействию одного LPS/IFN-, или GFP сконструированными 6-часовыми sm-ДК и 48-часовыми m-ДК (панель В). Усиленное выделение IL-12 после переноса гена GFP, вероятно, вызывается вирусной двухцепочечной РНК, которая подает сигналы через рецепторы TLR (см. табл. 1), которые экспрессируются в 6 часовых-sm-ДК, но больше не экспрессируются в 48-часовых LPS/IFN- m-ДК. Профиль экспрессии функционально важных мембранных молекул ДК (панель С) не изменялся при переносе лентивирусного гена в ДК (темные столбики гистограмм, незрелые ДК; светлые столбики гистограмм, m-ДК). Секреция цитокинов IL-12 и IL-10 была качественно и количественно разной в ДК, которые были подвергнуты воздействию LPS/IFN-, CD40L/IFN- или комбинации обоих (фиг. 4). Секреция IL-12 была почти вдвое выше, когда применяли комбинацию стимулов, по сравнению с одним стимуломCD40IVIFN- и также значительно выше по сравнению с одним стимулом LPS/IFN-. Кроме того, секреция IL-12 из ДК, подвергнутых воздействию комбинированного стимула LPS/IFN-/CD40L, уже явно обнаруживалась в значительных количествах после 12 ч, тогда как LPS/IFN- и CD40L/IFN- запускали биологически значимые уровни секреции IL-12 только между 12 и 24 ч после воздействия первоначального сигнала созревания. Это наблюдение находится в соответствии с целью настоящего изобретения по расширению иммуностимулирующего окна дифференцировки ДК с целью улучшения стимулирующей способности ДК-иммунопрепарата. Максимальная экспрессия IL-10 была одинаковой, когда ДК подвергали воздействию одного LPS/IFN-/CD40L или CD40L/IFN-, но была ниже при использовании толькоLPS/IFN- для созревания ДК. Однако иммуносупрессорный цитокин IL-10 обнаруживался уже через 12 ч в биологически значимых уровнях после CD40L/IFN- передачи сигнала, тогда как комбинированный стимул LPS/IFN-/CD40L показал кинетику, сходную с кинетикой ДК, созревших только под воздействием LPS/IFN-. Раннее высвобождение IL-10, как после CD40L/IFN- стимуляции, отрицательно вмешивается в иммуностимулирующее окно дифференцировки ДК, и его следует избегать в случае желательного иммуностимулирующего лечения ДК. Был сделан вывод, что результирующий эффект в балансе между иммуностимулирующей и иммуносупрессорной способностью комбинации стимулов LPS/IFN/CD40L, принимая во внимание модель секреции IL-12 и IL-10, является очевидным в отношении улучшенной иммуностимулирующей способности по сравнению с применением одного LPS/IFN- илиCD40L/IFN-. В отличие от ранее опубликованных работ использованные здесь ДК получают комбинацию стимулов созревания. Физиологически, фаза, в которой ДК может активировать Т-лимфоциты (отличающаяся секрецией IL-12) и вторая фаза, в которой ДК будет подавлять активность Т-лимфоцитов(отличающаяся секрецией IL-10 и истощением триптофана с помощью активности фермента IDO), будет запускаться путем контактирования i-ДК с адекватным стимулом созревания, таким как LPS/IFN- (фиг. 1). Здесь продемонстрировано, что первоначальная экспозиция с LPS/IFN- (или другим агонистом TLR в присутствии IFN-), с последующей генной инженерией ДК для сверхэкспрессии молекул, таких какCD40L, сохраняет фенотип ДК, способный к активации Т-лимфоцитов и предотвращает ДК от получения супрессорного фенотипа (фиг. 4). Секреция IL-12 сохраняется в течение более длинного периода времени, чем физиологическое временное окно 20-24 ч, когда генную инженерию проводят через 6 или 48 ч после первоначального созревания через TLR-сигнальный путь в присутствии IFN-. Фиг. 4 показывает количество и качество IL-12 и IL-10 секреции. ДК подвергали воздействию указанного стимула созревания в присутствии IFN-. Концентрации IL-12 и IL-10 в культуральном супернатанте измеряли в указанные моменты времени. Особо важное значение в настоящем замысле генетически сконструированного Т-лимфоцитстимулирующего ДК-иммунопрепарата состоит в том, что IL-12-секретирующие ДК обладают способностью, через посредство поляризации 1 типа иммунного ответа, инициировать цитолитический иммунитет. Таким образом, был дополнительно исследован потенциал Т-лимфоцитов, подвергнутых воздействию CD40L-трансгенных ДК, запускать цитолитические иммунные ответы посредством анализа содержания гранзима В в CD8 положительных CTL (фиг. 5). Действительно, было обнаружено, что совместное культивирование CTL с CD40L-трансгенными ДК приводило к явно усиленной экспрессии гранзима В по сравнению с контрольными GFP-трансгенными ДК или нетрансфектированными m-ДК. Это является сильным признаком улучшенного цитолитического потенциала таких CTL и, таким образом, предоставляет доказательство, что экспрессия CD40L из ДК-иммунопрепарата улучшила иммуностимулирующую способность. Фиг. 5 показывает потенциал для цитолитической активности. Общий процент CTL был только слабо увеличен, когда РВМС совместно культивировали с CD40L-трансгенными ДК (левая панель, квадраты) по сравнению с GFP-трансгенными ДК (ромбы) и нетрансфектированными m-ДК (треугольники). При анализе экспрессии гранзима В в CTL, совместно культивированных с CD40L-трансгенными ДК,было обнаружено явное увеличение (правая панель, квадраты) по сравнению с GFP-трансгенными ДК(ромбы) и нетрансфектированными m-ДК (треугольники). Описание ДК-иммунопрепарата с улучшенной стимулирующей способностью в отношении Тлимфоцитов при конструировании с целью понижения экспрессии иммуносупрессорного цитокина IL10. Основываясь на предположении ДК-иммунотерапии, при которой экспрессия молекул, опосредующих иммуносупрессию, является подавленной, были разработаны эксперименты с целью блокировать экспрессию гена IL-10 в ДК с помощью РНК-интерференции с использованием пула из 4 мишеньспецифических si-РНК (фиг. 6). Это дало в результате очень стойкое и воспроизводимое подавление экспрессии IL-10 в LPS/IFNактивированных ДК, ведущее к более высокой секреции IL-12 по сравнению с контрольными "молчащими" m-ДК. Это наблюдение намекает на аутокринный путь, основанный на IL10, выделенном из ДК, связанных с IL-10 рецепторами на той же самой ДК, приводящий к измененной (с понижением) выработке IL-12. В остальных случаях не было обнаружено иммунофенотипических различий между генетически сконструированными и нормальными ДК, как оценено с помощью CD80, CD86,- 16023106 МНС класса I, и II экспрессии. Самое главное, в алло-MLR наблюдалась значительно большая эффективность ДК-иммунопрепарата, разработанного с целью подавления секреции IL-10, чтобы активировать Т-лимфоциты, по сравнению с контрольными экспериментами. Кроме того, процент клеток CD25+FoxP3+ в CD4+ Т-клеточной популяции, предположительно популяция регуляторных Т-клеток (Tregs), которая подавляет иммунные ответы, был уменьшен, вероятно,вследствие IL-10 "молчания" в LPS/IFNактивированных ДК. Фиг. 6 показывает иммуностимулирующую способность LPS/IFNактивированных ДК, блокированных для экспрессии IL-10 с помощью генной инженерии. За 12 ч перед активацией LPS/IFN-, ДК были трансфицированы пулом из четырех IL-10-специфических si-РНК или неспецифических контрольных si-РНК. Затем выделенные аллогенные CD3+ Т-клетки стимулировали с помощью 6-часовых LPSзрелых ДК (m-ДК) или IL-10 (темные столбики) или контрольных-молчащих (светлые столбики) в отношении 1:3 = ДК:Т-клетки. CD4+, CD8+, (панель А) и CD4+CD25+FoxP3+ Т-клетки (панель В) были проанализированы на 6 день совместного культивирования с использованием системы Trucount и проточного цитометра FACS LSRII. Иммунный фенотип, а также секреция IL-10 и IL-12 были измерены через 48 ч после активации LPS/IFN- с помощью проточной цитометрии и метода ELISA соответственно (панель С). Иммунофенотипический анализ сравнивает LPS/IFNактивированные ДК (светлая гистограмма) с iДК (темная гистограмма) в IL-10-молчащих ДК (панель D) или контрольных-молчащих ДК (панель Е). Описание Т-лимфоцит-стимулирующего ДК-иммунопрепарата, разработанного для подавления экспрессии иммуносупрессорного фермента IDO. Для подавления экспрессии известной иммуносупрессорной эффекторной молекулы IDO использовали si-РНК (фиг. 7). Для того чтобы оптимизировать трансфекцию si-РНК и эффективность подавленияIDO, сначала использовали HeLa клетки, активированные IFN-. Потом ДК были трансфицированы при оптимизированных условиях. И в тех и других, HeLa клетках и ДК, экспрессия IDO, как показано в экспериментах с использованием вестерн-блоттинга, могла быть "молчащей". IDO "молчащие" ДК, ДК,трансфицированные зашифрованными (scrambled) контрольными si-РНК, и i-ДК использовали как стимуляторы в анализе эффективности алло-MLR. Наблюдалось, что стимулирующий потенциал IDO "молчащих" ДК был значительно выше по сравнению с ДК, трансфицированными зашифрованными si-РНК или i-ДК. Это оставалось верным в отношении CD8+ CTL, а также CD4+ Th-клеток. Фиг. 7 показывает иммуностимулирующую способность LPS/IFNактивированных ДК с "молчащей" экспрессией IDO. Во-первых, эффективное подавление IDO в клетках HeLa (панель А), а также ДК(панель В), было продемонстрировано с использованием вестерн-блоттинга. Для того чтобы исследовать стимулирующую активность IDO "молчащих" ДК на CD8+ CTL (панель С) и CD4+ Th лимфоциты (панель D), РВМС совместно культивировали с IDO-молчащими ДК (квадраты), контрольными молчащими ДК (ромбы, scra = зашифрованная последовательность) или i-ДК (треугольники). Во всех случаях стимулирующая способность IDO-молчащих ДК была выше контрольных. Иммуноподавляющие молекулы ДНК-микроанализы полного генома были использованы для получения профилей экспрессии ДК,подвергнутых воздействию стимулов созревания LPS/IFN-, CD40L/IFN- сигнального пути или комбинации LPS/IFN-/CD40L сигнального пути, а также соответствующих контролей (фиг. 8). Фиг. 8 показывает анализ профиля экспрессии ДК. ДК были подвергнуты воздействию указанного стимула созревания или были оставлены незрелыми. РНК извлекали в указанные моменты времени и проводили анализ профиля экспрессии, используя ДНК-микроанализы полного генома. Результаты анализа профиля экспрессии были изучены с помощью CarmaWeb (Comprehensive R based Microarray Analysis, Bioinformatics, Грац и Тирольский Институт Исследований Рака, Австрия). Все данные были сгруппированы в 20 кластеров, которые использовали базовый алгоритм базовых программных средств CarmaWeb, и установили кластеры, которые содержали IDO и IL-10. Гены в этих кластерах имеют профиль экспрессии, подобных профилю двух известных иммуносупрессорных ДК молекул, что привело к заключению, что они обладают функцией в иммунной регуляции ДК, которая также является иммуносупрессорной (табл. 3 и 4). Таблица 3 Кластер экспрессии IDO. Согласно алгоритму CarmaWeb перечисленные гены имеют профиль экспрессии, который напоминает профиль IDO (название гена INDO), предполагая функцию, подобную функцииIDO (числа представляют собой логарифм с основанием 2 относительно незрелых ДК) Таблица 4 Кластер экспрессии IL-10. Согласно алгоритму CarmaWeb перечисленные гены имеют профиль экспрессии, который напоминает профиль IL-10 (название гена IL10), предполагая функцию, подобную функцииIL-10 (числа представляют собой логарифм с основанием 2 относительно незрелых ДК) В настоящих ДНК-микроанализах также были установлены гены, индуцированные в ДК после передачи сигнала LPS/IFN- или CD40L/IFN- с вовлечением в регуляцию генов IL-10, TSLP, INDO,IL2RA, CSF-2 и CSF-3, все из которых, как известно, обладают иммуноподавляющим действием. Для того чтобы установить возможные главные переключатели иммунной регуляции, была получена сеть регуляторов для этих генов с помощью программного обеспечения Pathway Studio с использованиемResnet 5 (версия 1.2; январь, 2007), базы данных путей метаболизма и молекулярных взаимодействий у млекопитающих, полученной от PubMed и из 44 журналов, находящихся в открытом доступе. Путем загрузки данных микроанализа от по-разному активированных ДК в регуляторную сеть, возможные главные переключатели, индуцированные в созревающих ДК (табл. 5), затем могли быть отобраны. Таблица 5 Главные переключатели иммунной регуляции Фиг. 9 показывает примеры улучшенных пролиферативных ответов после подавления экспрессии молекул-мишеней в ДК, установленных в анализе профиля экспрессии с использованием РНКинтерференции. Показано, что гены, демонстрирующие кинетику экспрессии ДК, подобную IL-10, IDO или принадлежащую кластеру главных переключателей иммунорегуляции, вовлечены в отрицательные регуляторные иммуносупрессорные петли обратной связи. Были разработаны эксперименты, подобные тем, в которых экспрессия IL-10 или IDO была подавлена с помощью РНК-интерференции. ДК трансфицировали si-РНК специфическими генами из табл. 3, 4 или 5. На фиг. 9 показаны гены MAPKAPK2,IRF2, PHF11, IRF4, JAK1, СЕВРВ и ETV6. После инициации созревания путем 6-часового воздействияLPS/IFN-g, генетически сконструированные ДК совместно культивировали с аллогенными Тлимфоцитами в течение 6 дней. Аллогенные Т-лимфоциты пометили CFSE, флуоресцентным красителем, который входит в клетку, связывается с белками и удерживается внутри клетки; избыток CFSE отмывали. С каждым клеточным делением интенсивность флуоресценции Т-лимфоцитов уменьшалась наполовину, что давало возможность оценки пролиферации Т-лимфоцитов на 6 день совместного культивирования. В качестве контролей использовали нетрансфицированные ДК или ДК, трансфицированные контрольной si-РНК. Улучшенная способность генетически сконструированных ДК стимулировать аллогенные Т-лимфоциты предоставляет доказательство вовлеченности si-РНК-нацеленных генов в отрицательные регуляторные петли обратной связи. Более того, это указывает на то, что ДК-иммунопрепарат,который генетически разработан для подавления таких генов будет иметь улучшенный терапевтический эффект по сравнению с традиционной иммунотерапией. Заключение. С помощью настоящего изобретения предоставлено доказательство, что возможности иммунотерапии дендритными клетками (ДК) можно модулировать посредством генной инженерии. Продемонстрировано, что сверхэкспрессия иммуностимулирующих молекул в ДК, так же как и подавление иммуносупрессорных молекул, приводит к иммуностимулирующей способности. Это может найти применение в качестве ДК-вакцины при раке или в противоинфекционной иммунотерапии ДК, когда ДК "заряжают" полученными опухолевыми антигенами или антигенами, полученными от микробов, подвергают воздей- 26023106 ствию стимула созревания и конструируют, как описано. Кроме того, представленные здесь данные означают, что иммуноподавляющее лечение ДК может быть выполнено посредством понижения иммуностимулирующих молекул и путем сверхэкспрессии молекул, подавляющих иммунитет. Такая супрессивная ДК-иммунотерапия может иметь применение при лечении аллергии или аутоиммунной реакции, а также в трансплантологии для того, чтобы вызвать толерантность иммунной системы реципиента трансплантата к трансплантированной ткани. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения частично зрелых дендритных клеток, обладающих повышенной экспрессией интерлейкина-12 (IL-12) в течение по меньшей мере от 2 до 10 дней, включающий стадии:a) получения незрелых дендритных клеток путем сбора предшественников незрелых дендритных клеток, таких как лейкоциты и обогащенные моноциты;b) загрузки незрелых дендритных клеток по меньшей мере одним антигеном, выбранным из группы, состоящей из опухолевых антигенов, вирусных антигенов, бактериальных антигенов или любых других микробных или паразитарных патогенов человека;c) контактирования загруженных незрелых дендритных клеток в течение по меньшей мере от 2 до максимально 24 ч с одним, по меньшей мере, первичным фактором созревания дендритных клеток, представляющим собой LPS/IFN-, для получения частично зрелых дендритных клеток, отличающихся способностью секретировать IL-12; иd) ингибирования/предотвращения экспрессии по меньшей мере одной Т-лимфоцитсупрессирующей молекулы путем нокаутирования кодирующего ее гена или его фрагмента, где Тлимфоцит-супрессирующая молекула действует внутри дендритной клетки, подвергнутой воздействию первичного фактора созревания LPS/IFN- и вырабатывающей IL-12, и где Т-лимфоцит-супрессирующая молекула выбрана из группы, состоящей из интерлейкина-10 (IL-10), индоламин-2,3-диоксгеназы (IDO),MAPKAPK2, IRF2, PHF11, IRF4, JAK1, СЕВРВ, ETV6, NBL1, FOXP1, RGS16, KIAA1659, RELA, JUNB. 2. Способ по п.1, где контактирование осуществляется в течение 4 ч. 3. Способ по п.1, где контактирование осуществляется в течение 6 ч. 4. Способ по п.1, где контактирование осуществляется в течение 12 ч. 5. Способ по любому из пп.1-4, где ингибирование/предотвращение экспрессии осуществляется путем введения молекул нуклеиновой кислоты. 6. Способ по любому из пп.1-5, где ингибирование/предотвращение экспрессии осуществляется путем введения молекул антисмысловой рибонуклеиновой кислоты. 7. Способ по любому из пп.1-6, где ингибирование/предотвращение экспрессии осуществляется путем внутриклеточной экспрессии одноцепочечных моноклональных антител. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что предшественники незрелых дендритных клеток или незрелые дендритные клетки получают из кожи, селезенки, костного мозга, тимуса, лимфатических узлов,пуповинной крови или периферической крови. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что первичный фактор созревания дендритных клеток выбирают из группы, состоящей из агонистов TLR, таких как термоинактивированная или обработанная формалином бацилла Кальметга-Герена (БЦЖ), компоненты клеточной стенки БЦЖ, БЦЖ-выработанные липоарабидоманнаны или компоненты БЦЖ, липополисахарида (LPS), выделенного из Escherichia coli или инактивированных грамположительных или грамотрицательных микроорганизмов, соединения имидазохинолина, соединения имидазохинолин-4-амина, соединения 4-амино-2-этоксиметил-х-диметил-1 Нимидазола, [4,5-с]хинолин-1-этанола или 1-(2-метилпропил)-1 Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амина, или его производного, синтетического двухцепочечного полирибонуклеотида, поли-I:С, природной двухцепочечной РНК или РНК вирусов или фрагментов РНК, или синтетических аналогов, или синтетической или природной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей неметилированные CpG-мотивы, комбинации цитокинов, фактора некроза опухолей(TNF-), IL-1, IL-6 или простагландина Е 6, CD40L, рекомбинантного CD40L или гибридных белков, содержащих домен CD40L, или при использовании первичных клеток линий клеток, генетически созданных, чтобы экспрессировать CD40L, или при использовании активированных Т-лимфоцитов, которые физиологически повышают экспрессию CD40L, таких как Тлимфоциты. 10. Частично зрелые дендритные клетки, обладающие повышенной экспрессией интерлейкина-12(IL-12) в течение по меньшей мере от 2 до 10 дней, полученные способом по любому из пп.1-9. 11. Фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения рака и/или микробных или паразитарных инфекций, содержащая частично зрелые дендритные клетки по п.10. 12. Применение частично зрелых дендритных клеток по п.10 при производстве медикамента для лечения и/или предотвращения рака и/или микробных или паразитарных инфекций.