Стабильные полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты против tnfr1

СТАБИЛЬНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ, ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ АНТИТЕЛА И АНТАГОНИСТЫ ПРОТИВ TNFR1 Изобретение относится к стабильным при хранении единичным вариабельным доменам антитела(dAbs), антагонистам и полиспецифическим лигандам против TNFR1, а также к способам и их применениям. Полипептиды, единичные вариабельные домены антитела (dAbs), антагонисты и полиспецифические лиганды против TNFR1 полезны для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания, такого как артрит или COPD (хроническое обструктивное заболевание легких), а также для легочного введения, перорального введения, доставки в легкое и доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB) Настоящее изобретение относится к полипептидам, единичным вариабельным доменам иммуноглобулина (антитела) против фактора некроза опухоли 1 (TNFR1, р 55, CD120a, P60, член 1 А суперсемейства рецепторов TNF, TNFRSF1A) и антагонистам, содержащим их. Изобретение также относится к способам, применению, препаратам, композициям и устройствам, содержащим или в которых используют такие лиганды против TNFR1. Предшествующий уровень техникиTNFR1 представляет собой трансмембранный рецептор, содержащий внеклеточную область, которая связывает лиганд, и внутриклеточный домен, который лишен присущей ему активности в отношении передачи сигнала, но может связываться с молекулами, передающими сигнал. Комплекс TNFR1 со связанным TNF содержит три цепи TNFR1 и три цепи TNF (Banner et al., Cell, 73(3): 431-445 (1993. ЛигандTNF присутствует в виде тримера, который связан тремя цепями TNFR1 (там же). Три цепи TNFR1 плотно кластеризованы вместе в рецептор-лигандном комплексе, и эта кластеризация является необходимым условием для TNFR1-опосредованной передачи сигнала. Фактически, поливалентные агенты,которые связывают TNFR1, такие как антитела против TNFR1, могут индуцировать TNFR1 кластеризацию и передачу сигнала в отсутствие TNF и обычно используются в качестве агонистов TNFR1 (см., например, Belka et al., EMBO, 14(6): 1156-1165 (1995); Mandik-Nayak et al., J. Immunol, 167: 1920-1928(2001. Соответственно, поливалентные агенты, которые связывают TNFR1, как правило, не являются эффективными антагонистами TNFR1, даже если они блокируют связывание TNF с TNFR1.SEQ ID номера в этом параграфе относятся к нумерации, используемой в WO 2006038027. Внеклеточная область TNFR1 содержит аминоконцевой сегмент из тринадцати аминокислот (аминокислоты 113 из SEQ ID NO: 603 (человек); аминокислоты 1-13 из SEQ ID NO: 604 (мышь, домен 1 (аминокислоты 14-53 из SEQ ID NO: 603 (человек); аминокислоты 14-53 из SEQ ID NO: 604 (мышь, домен 2 (аминокислоты 54-97 из SEQ ID NO: 603 (человек); аминокислоты 54-97 из SEQ ID NO: 604 (мышь, домен 3(мышь, за которыми следует проксимальная к мембране область (аминокислоты 168-182 из SEQ ID NO: 603(человек); аминокислоты 168-183 из SEQ ID NO: 604 (мышь (см. Banner et al., Cell 73(3) 431-445(1993) и Loetscher et al., Cell 61(2) 351-359 (1990. Домены 2 и 3 образуют контакт со связанным лигандом (TNF, TNF) (Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993. Внеклеточная область TNFR1 также содержит участок, называемый прелиганд-связывающим доменом сборки или PLAD (от англ. pre-ligand binding assembly domain) доменом (аминокислоты 1-53 из SEQ ID NO: 603(человек); аминокислоты 1-53 изTNFR1 слущивается с поверхности клеток in vivo в результате процесса, который включает протеолиз TNFR1 в домене 4 или в проксимальной к мембране области (аминокислоты 168-182 из SEQ ID NO: 603; аминокислоты 168-183 из SEQ ID NO: 604) с получением растворимой формы TNFR1. РастворимыйTNFR1 сохраняет способность связывать TNF и таким образом действует в качестве эндогенного ингибитора активности TNF. В WO 2006038027, WO 2008149144 и WO 2008149148 описаны единичные вариабельные домены иммуноглобулина против TNFR1 и антагонисты, содержащие их. В этих документах также описано применение таких доменов и антагонистов для лечения и/или предупреждения состояний, опосредованныхTNF. Желательно предложить единичные вариабельные домены иммуноглобулина против человеческого TNFR1 с улучшенной стабильностью при хранении, антагонисты, лиганды и продукты, содержащие их. Цель этого состоит в обеспечении улучшенных диагностических реагентов для обнаружения человеческого TNFR1 в образцах, а также или альтернативно, в обеспечении улучшенных терапевтических средств для лечения и/или профилактики TNFR1-опосредованных состояний и заболеваний у людей или других млекопитающих. Особенно желательно предложить единичные вариабельные домены иммуноглобулина против TNFR1, содержащие их антагонисты, лиганды и продукты, которые являются мощными нейтрализаторами TNFR1, особенно человеческого TNFR1. Различные аспекты настоящего изобретения удовлетворяют этим желательным характеристикам. Краткое изложение сущности изобретения В одном аспекте в изобретении предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) аминокислотной последовательности DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192,DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1h-574-204,DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211,DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214, где единичный вариабельный домен имеет OD320 менее 1,0, менее 0,9, менее 0,8, менее 0,7, менее 0,6, менее 0,5 или менее 0,4 после инкубации в PBS при 40 С в течение 40 ч. В одном воплощении единичный вариабельный домен имеет OD320 менее 1,0, менее 0,9, менее 0,8, менее 0,7, менее 0,6, менее 0,5, или менее 0,4, как определено следующим тестом:a) 100 мкл 1 мг/мл единичного вариабельного домена в PBS (забуференный фосфатами физиологический раствор) распределяют в планшете для ПЦР;c) аликвоту 50 мкл извлекают и измеряют OD320, например, в устройстве для считывания микропланшетов (например, от Molecular Devices). В одном аспекте в изобретении предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) аминокислотной последовательности DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192,DOM1h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202,DOM1h-574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208,DOM1h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, D0M1h-574-213 или DOM1h-574-214. В одном аспекте в изобретении предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности, выбранной из DOM1h-574-188, DOM1h-574-189,DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195,DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205,DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212,DOM1h-574-213 и DOM1h-574-214, или имеет 1 или 2 аминокислотных изменения по сравнению с указанной аминокислотной последовательностью. В одном аспекте в изобретении предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность,которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) аминокислотной последовательности DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574192, DOM1h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574202, DOM1h-574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214. В одном аспекте в изобретении предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), где нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 70, 75 80, 85,90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) нуклеотидной последовательностиDOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h-574-193,DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h-574-203,DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h-574-209,DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214. В одном аспекте изобретение относится к полиспецифическому лиганду, содержащему единичный вариабельный домен иммуноглобулина по настоящему изобретению и возможно по меньшей мере один единичный вариабельный домена иммуноглобулина, который специфически связывает сывороточный альбумин (SA). В одном воплощении полиспецифический лиганд представляет собой или содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотной последовательности любой конструкции, называемой "DMS", описанной в данной заявке, например любой из DMS5535, 5541, 5542 и 5544. В одном воплощении полиспецифический лиганд представляет собой или содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью любой DMS, раскрытой в данной заявке, например, любой из нуклеотидных последовательностей DMS5535, 5541, 5542 и 5544. В одном воплощении в изобретении предложена нуклеиновая кислота, кодирующая полиспецифический лиганд,содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина против TNFR1 и единичный вариабельный домен против SA, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность любой DMS, описанной в данной заявке, например любой из нуклеотидных последовательностейDMS5535, 5541, 5542 и 5544. Предложен вектор, содержащий такую нуклеиновую кислоту, а также клетка-хозяин, содержащая такой вектор. В одном аспекте в изобретении предложен полиспецифический лиганд, содержащий: (1) единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), который содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) аминокислотной последовательности DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h574-213 или DOM1h-574-214, (2) по меньшей мере один единичный вариабельный домен иммуноглобулина против сывороточного альбумина (SA), который специфически связывает SA, где единичный ва-2 022898 риабельный домен иммуноглобулина против (SA) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности DOM7h-11-3, и (3) возможно где между единичным вариабельным доменом против TNFR1 и единичным вариабельным доменом против SA имеется линкер. В одном воплощении линкер содержит аминокислотную последовательность AST, возможноASTSGPS. Альтернативно, линкер представляет собой AS(G4S)n, где n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, например AS(G4S)3. В одном аспекте в изобретении предложен антагонист TNFR1, содержащий единичный вариабельный домен, полипептид или полиспецифический лиганд из любого предшествующего аспекта изобретения. В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55) по изобретению для пероральной доставки, доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента, легочной доставки, доставки в легкое пациента или системной доставки. В одном аспекте в изобретении предложен антагонист TNFR1 по изобретению для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В одном аспекте в изобретении предложено применение антагониста TNFR1 по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В другом аспекте изобретения предложен полиспецифический лиганд, содержащий или состоящий из DMS5535, DMS5541, DMS5542 или DMS5544. В одном аспекте изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая один из полиспецифических лигандов. В другом аспекте изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности DMS5535, DMS5541, DMS5542 или DMS5544. Кроме того,в изобретении предложены вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, а также клетка-хозяин, возможно нечеловеческая эмбриональная клетка, содержащая вектор. Краткое описание графических материалов Фиг. 1. Выравнивание аминокислотной последовательности для dAbs, выбранных по стабильности и очищенных для характеристики. Последовательности выравнивают против DOM1h-574-156 - dAb, типичного для используемых в качестве исходного dAb для селекции в отношении стабильности. "." в конкретном положении указывает на такую же аминокислоту, как обнаружено в DOM1h-574-156 в этом положении. CDR указаны подчеркиванием и жирным шрифтом (первая подчеркнутая последовательность представляет собой CDR1, вторая подчеркнутая последовательность представляет собой CDR2, и третья подчеркнутая последовательность представляет собой CDR3). Подробное описание изобретения В пределах данного описания изобретение было описано со ссылкой на воплощения таким образом,который позволяет представить ясное и точное описание. Предполагается и следует понимать, что воплощения могут быть различным образом скомбинированы или разделены без отклонения от объема изобретения. Если не определено иначе, все используемые в данном изобретении технические и научные термины имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области (например, в культивировании клеток, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, способах гибридизации и биохимии). Стандартные методы используют для молекулярных, генетических и биохимических способовEd, John WileySons, Inc., которые включены в данное описание посредством ссылки) и химических способов. Единичные вариабельные домены иммуноглобулина (dAb), описанные в данной заявке, содержат участки, определяющие комплементарность (CDR1, CDR2 и CDR3). Локализации CDR и каркасных участков (FR) и система нумерации была определена Kabat и др. (Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991. Аминокислотные последовательности CDR (CDR1, CDR2, CDR3) VH и VL (VK) dAbs,описанные в данной заявке, будут очевидны специалисту в данной области на основании хорошо известной системы нумерации аминокислот по Kabat и определения CDR. Согласно системе нумерации по Kabat CDR-H3 тяжелой цепи имеет варьирующиеся длины, вставки нумеруются между остатком Н 100 и Н 101 буквами вплоть до K (т.е. Н 100, Н 100 А Н 100K, Н 101). CDRs можно альтернативно определить с использованием системы Chothia (Chothia et al., (1989) Конформации иммуноглобулиновых гипервариабельных участков; Nature 342, р. 877-883), согласно AbM или согласно контактному способу являются следующими. См. http://www.bioinf.org.uk/abs/ для подходящих методов определения CDRs. После нумерации каждого остатка можно затем применить следующие определения CDR ("-" означает такие же номера остатков, как показано для Kabat).Kabat - наиболее часто используемый метод, основанный на вариабельности последовательности (с использованием нумерации по Kabat):Chothia - основан на локализации структурных петлевых участков(с использованием нумерации по Chothia): Как использовано в данной заявке, термин "антагонист рецептора фактора некроза опухоли 1 типа(TNFR1)" или "антагонист TNFR1" или тому подобное относится к агенту (например, молекуле, соединению), который связывается с TNFR1 и может ингибировать (т.е. одну или более чем одну) функциюTNFR1. Например, антагонист TNFR1 может ингибировать связывание TNF с TNFR1 и/или ингибировать передачу сигнала, опосредованную через TNFR1. Соответственно, TNFR1-опосредованные процессы и клеточные ответы (например, TNF-индуцированная гибель клеток в стандартном анализе цитотоксичности в отношении L929) можно ингибировать с помощью антагониста TNFR1. Как использовано в данной заявке, "пептид" относится к аминокислотам в количестве от примерно двух до примерно 50, которые соединены друг с другом посредством пептидных связей. Как использовано в данной заявке, "полипептид" относится по меньшей мере примерно к 50 аминокислотам, которые соединены друг с другом посредством пептидных связей. Полипептиды, как правило,содержат третичную структуру и свернуты в функциональные домены. Как использовано в данной заявке, пептид или полипептид (например, доменное антитело (dAb,"который устойчив к протеазному расщеплению", по существу, не расщепляется протеазой при инкубации с указанной протеазой в условиях, подходящих для протеазной активности. Полипептид (например,dAb), по существу, не расщепляется, когда не более чем примерно 25%, не более чем примерно 20%, не более чем примерно 15%, не более чем примерно 14%, не более чем примерно 13%, не более чем примерно 12%, не более чем примерно 11%, не более чем примерно 10%, не более чем примерно 9%, не более чем примерно 8%, не более чем примерно 7%, не более чем примерно 6%, не более чем примерно 5%, не более чем примерно 4%, не более чем примерно 3%, не более чем примерно 2%, не более чем примерно 1% или, по существу, ни один из белков не расщепляется протеазой после инкубации с указанной протеазой в течение примерно 1 ч при температуре, подходящей для протеазной активности, например при 37 или 50 С. Деградацию белка можно оценить с использованием любого подходящего метода,например, с помощью ПААГ-ДСН (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) или с помощью функционального анализа (например, связывания лиганда), как описано в данной заявке. Как использовано в данной заявке, "дисплейная система" относится к системе, в которой коллекция полипептидов или пептидов доступна для селекции, основанной на желаемой характеристике, такой как физическая, химическая или функциональная характеристика. Дисплейная система может представлять собой подходящий репертуар полипептидов или пептидов (например, в растворе, иммобилизованных на подходящей подложке). Дисплейная система также может представлять собой систему, в которой используется клеточная система экспрессии (например, экспрессия библиотеки нуклеиновых кислот, например, в трансформированных, инфицированных, трансфицированных или трансдуцированных клетках и экспонирование кодируемых полипептидов на поверхности клеток) или бесклеточная система экспрессии (например, компартментализация и дисплей с использованием эмульсии). Типичные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, кодируемого указанной нуклеиновой кислотой. При применении такой дисплейной системы полипептиды или пептиды, которые имеют желаемую физическую, химическую и/или функциональную характеристику, могут быть селектированы, и нуклеиновую кислоту, кодирующую выбранный полипептид или пептид, можно легко изолировать или извлечь. В данной области известны различные дисплейные системы, которые связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, например, бактериофаговый дисплей (фаговый дисплей, например фагмидный дисплей),рибосомный дисплей, компартментализация и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей,пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, дисплей на плазмиде, ковалентный дисплей и тому подобное (см., например, ЕР 0436597 (Dyax), патент США 6172197 (McCafferty et al.), патент США 6489103 (Griffiths et al Как использовано в данной заявке, "репертуар" относится к коллекции полипептидов или пептидов,которые характеризуются разнообразием аминокислотных последовательностей. Индивидуальные члены репертуара могут иметь общие признаки, такие как общие структурные признаки (например, общая коровая структура) и/или общие функциональные признаки (например, способность связываться с общим лигандом (например, типичным лигандом или целевым лигандом, TNFR1. Как использовано в данной заявке, "функциональный" описывает полипептид или пептид, который имеет биологическую активность, такую как специфическую связывающую активность. Например, термин "функциональный полипептид" включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывает целевой антиген через антигенсвязывающий сайт. Как использовано в данной заявке, "типичный лиганд" относится к лиганду, который связывается со значительной частью (например, по существу, всеми) функциональных членов заданного репертуара. Типичный лиганд (например, общий типичный лиганд) может связываться со многими членами заданного репертуара, даже если члены не обладают специфичностью связывания с общим целевым лигандом. В целом, присутствие на полипептиде сайта, связывающего функциональный типичный лиганд (как показано по способности связывать типичный лиганд), означает, что полипептид правильно свернут и является функциональным. Подходящие примеры типичных лигандов включают суперантигены, антитела,которые связываются с эпитопом, экспрессирующимся на значительной части функциональных членов репертуара, и тому подобное."Суперантиген" представляет собой термин из уровня техники, который относится к типичным лигандам, которые взаимодействуют с членами суперсемейства иммуноглобулинов в сайте, который отличается от целевых лиганд-связывающих сайтов этих белков. Стафилококковые энтеротоксины представляют собой примеры суперантигенов, которые взаимодействуют с Т-клеточными рецепторами. Суперантигены, которые связываются с антителами, включают белок G, который связывается с константной областью IgG (Bjorck and Kronvall, J. Immunol., 133: 969 (1984; белок А, который связывается с константной областью IgG и VH-доменами (Forsgren and Sjoquist, J. Immunol., 97: 822 (1966; и белок L, который связывается с VL-доменами (Bjorck, J. Immunol., 140: 1194(1988. Как использовано в данной заявке, "целевой лиганд" относится к лиганду, который специфически или селективно связывается с полипептидом или пептидом. Например, когда полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, целевой лиганд может быть любым желаемым антигеном или эпитопом. Связывание с целевым антигеном зависит от того, является ли полипептид или пептид функциональным. Используемое в данной заявке антитело относится к IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или фрагменту (такому как Fab, F(ab')2, Fv, дисульфидсвязанный Fv, scFv, полиспецифическое антитело в закрытой конформации, дисульфидсвязанный scFv, диатело), независимо от того, происходит ли оно из любого вида,естественно продуцирующего антитело, или создано посредством технологии рекомбинантных ДНК; или выделено из сыворотки, В-клеток, гибридом, трансфертом, дрожжей или бактерий. Как использовано в данной заявке, "формат антитела", "форматированный" или сходные термины относятся к любой подходящей полипептидной структуре, в которой один или более вариабельных доменов антитела могут быть встроены таким образом, чтобы придать специфичность связывания с антигеном на структуре. В данной области техники известны различные подходящие форматы антител, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела,биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей и/или легких цепей антител, антиген-связывающие фрагменты любого из вышеизложенного (например, Fv-фрагмент (например, одноцепочечный Fv (scFv), дисульфидсвязанный Fv), Fabфрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2-фрагмент), единичный вариабельный домен антитела (например, dAb,VHH, VHH, VL) и модифицированные варианты любого из вышеизложенных (например, модифицированные посредством ковалентного присоединения полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера,или гуманизированный VHH). Фраза "единичный вариабельный домен иммуноглобулина" относится к вариабельному домену антитела (VH, VHH, VL), который специфически связывает антиген или эпитоп независимо от других Vобластей или доменов. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина может присутствовать в формате (например, гомо- и гетеро-мультимера) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для связывания с антигеном посредством единичного вариабельного домена иммуноглобулина (т.е. где единичный вариабельный домен иммуноглобулина связывает антиген независимо от дополнительных вариабельных доменов). "Доменное антитело" или "dAb" представляет собой "единичный вариабельный домен иммуноглобулина" в качестве термина,используемого в данной заявке. "Единичный иммуноглобулиновый вариабельный домен" представляет собой то же, что и "единичный вариабельный домен иммуноглобулина" в качестве термина, используемого в данной заявке. "Единичный вариабельный домен антитела" или "антительный единичный вариабельный домен" представляет собой то же, что и "единичный вариабельный домен иммуноглобулина" в качестве термина, используемого в данной заявке. В одном воплощении единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой человеческий вариабельный домен антитела, но также включает единичные вариабельные домены антитела из другого вида, такие как dAbs грызунов (например, как описано в WO 00/29004, содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте), акулы-няньки и VHH верблюдовых. VHH верблюдовых представляют собой полипептиды единичного вариабельного домена иммуноглобулина, которые происходят из вида, включающего верблюда, ламу, альпака, дромедара и гуанако, которые продуцируют антитела, состоящие из тяжелых цепей,естественно лишенные легких цепей. VHH могут быть гуманизированными."Домен" представляет собой свернутую белковую структуру, которая имеет третичную структуру,не зависящую от остального белка. Как правило, домены отвечают за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены на другие белки без потери функции остальной части белка и/или домена. "Единичный вариабельный домен антитела" представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антитела. Поэтому он включает вариабельные домены полного антитела и модифицированные вариабельные домены, например, в которых один или более петель были заменены последовательностями, которые не характерны для вариабельных доменов антитела, или вариабельные домены антитела, которые были укорочены или содержат N- или С-концевые удлинения, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена. Термин "библиотека" относится к смеси гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека состоит из членов, каждый из которых имеет единичную полипептидную или нуклеиновокислотную последовательность. В этом смысле "библиотека" является синонимом "репертуара". Различия в последовательности между членами библиотеки ответственны за разнообразие, присутствующее в библиотеке. Библиотека может принимать форму простой смеси полипептидов или нуклеиновых кислот или может быть в форме организмов или клеток, например, бактерий, вирусов, животных или растительных клеток и тому подобного, трансформированных библиотекой нуклеиновых кислот. В одном воплощении каждый отдельный организм или клетка содержит только один или ограниченное число членов библиотеки. В одном воплощении нуклеиновые кислоты включены в экспрессирующие векторы для того, чтобы обеспечить экспрессию полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами. Поэтому в одном аспекте библиотека может принимать форму популяции организмов-хозяев, где каждый организм содержит одну или более копий экспрессирующего вектора, содержащего один член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, способной экспрессироваться с получением соответствующего полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев имеет потенциал для кодирования большого репертуара разнообразных полипептидов."Универсальный каркас" представляет собой единичную каркасную последовательность антитела,соответствующую областям антитела, консервативным по последовательности, как определено Kabat("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services), или соответствующую репертуару или структуре иммуноглобулина зародышевой линии человека, как определено Chothia и Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 910-917. В библиотеках и репертуарах можно использовать единичный каркас или набор таких каркасов, которые, как было обнаружено, обеспечивают получение практически любой связывающей специфичности посредством изменения только гипервариабельных участков. Используемый в данной заявке термин "доза" относится к количеству лиганда, вводимого субъекту полностью в одно время (однократная доза) или в двух или более введениях в течение определенного промежутка времени. Например, доза может относиться к количеству лиганда (например, лиганда, содержащего единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который связывается с целевым антигеном), вводимому субъекту в течение одних суток (24 ч) (суточная доза), двух суток, одной недели, двух недель, трех недель или одного или более месяцев (например, посредством единичного введения или посредством двух или более введений). Интервал между дозами может представлять собой любое желаемое количество времени. Как использовано в данной заявке, "гидродинамический размер" относится к кажущемуся размеру молекулы (например, белковой молекулы, лиганда) на основании диффузии молекулы через водный раствор. Диффузия или движение белка через раствор могут осуществляться для получения кажущегося размера белка, где размер задается "радиусом Стокса" или "гидродинамическим радиусом" белковой частицы. "Гидродинамический размер" белка зависит как от массы, так и от формы (конформации), так что два белка, имеющие одинаковую молекулярную массу, могут иметь разные гидродинамические размеры на основании общей конформации белка. Как указано в настоящей заявке, термин "конкурирует" означает, что связывание первой мишени с ее штатным целевым связывающим доменом ингибируется в присутствии второго связывающего домена, который является специфическим для когнатной мишени. Например, связывание может ингибироваться стерически, например, посредством физического блокирования связывающего домена или путем изменения структуры или окружения связывающего домена таким образом, чтобы его аффинность или авидность к мишени уменьшалась. См. WO 2006038027 для деталей того, как выполнять конкурентныеELISA и конкурентные BiaCore эксперименты для определения конкуренции между первым и вторым связывающими доменами. Расчеты "гомологии" или "идентичности" или "сходства" между двумя последовательностями (данные термины используются взаимозаменяемо в данной заявке) осуществляются следующим образом. Последовательности выравнивают для оптимального сравнения (например, бреши можно вводить в одну или обе первую или вторую аминокислотную или нуклеиновокислотную последовательность для оптимального выравнивания, и негомологичные последовательности можно не учитывать для целей сравнения). В воплощении длина эталонной последовательности, выровненной для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%,или по меньшей мере 70, 80, 90, 100% от длины эталонной последовательности. Аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях затем сравнивают. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы являются идентичными по этому положению (используемая в данной заявке "гомология" аминокислот или нуклеиновых кислот эквивалентна "идентичности" аминокислот или нуклеиновых кислот). Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от числа идентичных положений, разделенных последовательностями, с учетом числа брешей и длины каждой бреши, которые необходимо вводить для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Выравнивания и гомологию, сходство или идентичность аминокислотных и нуклеотидных последовательностей, как определено в данной заявке, можно получить или определить с использованием алгоритма BLAST 2 Sequences, используя параметры по умолчанию (Tatusova Т.A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188 (1999. В одном воплощении любого аспекта изобретения единичный вариабельный, антагонист, лиганд или полипептид против TNFR1 нейтрализует TNFR1 (например, человеческий TNFR1) с ND50 (средняя нейтрализующая доза) (или примерно) 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или менее в стандартном анализе MRC5, как определено путем ингибирования TNF-альфа-индуцированной секреции IL-8. В одном воплощении любого аспекта изобретения единичный вариабельный, антагонист, лиганд или полипептид против TNFR1 нейтрализует TNFR1 (например, мышиный TNFR1) с ND50 150, 100, 50,40, 30 или 20 нМ или менее; или от (примерно) 150 до 10 нМ; или от (примерно) 150 до 20 нМ; или от(примерно) 110 до 10 нМ; или от (примерно) 110 до 20 нМ в стандартном анализе L929, как определено путем ингибирования TNF-альфа-индуцированной цитотоксичности. В одном воплощении любого аспекта изобретения единичный вариабельный, антагонист, лиганд или полипептид против TNFR1 нейтрализует TNFR1 (например, TNFR1 яванского макака) с ND50 5, 4,3, 2 или 1 нМ или менее; или от (примерно) 5 до (примерно) 1 нМ в стандартном анализе KI яванского макака, как определено путем ингибирования TNF-альфа-индуцированной секреции IL-8. В одном воплощении любого аспекта изобретения единичный вариабельный домен содержит концевой, возможно С-концевой остаток цистеина. Например, остаток цистеина можно использовать для присоединения ПЭГ к вариабельному домену, например, с использованием малеимидной связи (см., например, WO 04081026). В воплощении любого аспекта изобретения единичный вариабельный домен связан с полиалкиленгликолевой группировкой, возможно полиэтиленгликолевой группировкой. См., например, WO 04081026 для подходящих ПЭГ группировок и методов и тестов конъюгации. Эти описания включены в данную заявку с целью обеспечения описания, например, конкретных полиэтиленгликолей,подлежащих включению в формулу изобретения ниже. В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, содержащему единичный вариабельный домен иммуноглобулина по настоящему изобретению и эффекторную группу или константный домен антитела, возможно Fc-область антитела, где возможно N-конец Fc связан (возможно непосредственно связан) с С-концом вариабельного домена. Любую "эффекторную группу", как описано в WO 04058820,можно использовать в этом аспекте настоящего изобретения, и описание эффекторных групп в WO 04058820 и способы их связывания с вариабельными доменами, описанными в этой публикации, непосредственно включены в данное описание посредством ссылки для обеспечения описания, которое можно использовать, например, в пунктах формулы изобретения данной заявки. В одном аспекте изобретение относится к полиспецифическому лиганду, содержащему единичный вариабельный домен иммуноглобулина по настоящему изобретению и возможно по меньшей мере один единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывается с сывороточным альбумином (SA). В одном воплощении полиспецифический лиганд связывает TNFR1 (например, человеческий TNFR1) с KD (константа диссоциации), которая по меньшей мере в два раза ниже, чем KD мономера TNFR1. Дополнительно или альтернативно, в одном воплощении полиспецифический лиганд имеет период полувыведения, который по меньшей мере в 5, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 раз больше, чем для мономера. Дополнительно или альтернативно, в одном воплощении полиспецифический лиганд имеет конечный период полувыведения по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 суток у человека (например, как определено эмпирически у людей-добровольцев или как рассчитано с использованием стандартных способов, знакомых специалисту, путем экстраполяции периода полувыведения лиганда в животной системе, например у мыши, собаки и/или примата, не являющегося человеком (например, яванский макак, бабуин, макак-резус, например, когда домен против SA перекрестно реагирует с человеческим SA и SA животного. В одном воплощении полиспецифических лигандов по изобретению лиганд представляет собой антагонист TNFR1 (например, человеческого TNFR1), возможно TNFR1-опосредованной передачи сигнала. В одном воплощении в настоящем изобретении предложены вариабельный домен, полиспецифический лиганд или антагонист в соответствии с изобретением, который имеет период полувыведения t в диапазоне от (или примерно) 2,5 ч или более. В одном воплощении нижний предел диапазона составляет(или составляет примерно) 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 или 12 ч. Дополнительно или альтернативно, период полувыведения t составляет (или составляет примерно) вплоть до и включая 21 или 25 суток. В одном воплощении верхний предел диапазона составляет (или составляет примерно) 12, 24 ч, 2, 3, 5, 10, 15, 19, 20,21 или 22 суток. Например, вариабельный домен или антагонист в соответствии с изобретением имеет период полувыведения t в диапазоне от 12 до 60 ч (или от примерно 12 до примерно 60 ч). В другом воплощении он будет находиться в диапазоне от 12 до 48 ч (или от примерно 12 до примерно 48 ч). Еще в другом воплощении он будет находиться в диапазоне от 12 до 26 ч (или от примерно 12 до примерно 26 ч). В качестве альтернативы использованию двухкомпартментного моделирования, специалист обычно знаком с использованием некомпартментного моделирования, которое можно использовать для определения конечных периодов полувыведения (в этой связи термин "конечный период полувыведения", используемый в данной заявке, означает конечный период полувыведения, определенный с использованием некомпартментного моделирования). Пакет аналитических программ WinNonlin, например версию 5.1(доступную от Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, США), можно использовать, например, для моделирования кривой таким образом. В этом случае в одном воплощении единичный вариабельный домен, полиспецифический лиганд или антагонист имеет конечный период полувыведения по меньшей мере (или по меньшей мере примерно) 8, 10, 12, 15, 28, 20 ч, 1, 2, 3, 7, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24 или 25 суток. В одном воплощении верхний предел данного диапазона составляет (или составляет примерно) 24, 48, 60, или 72, или 120 ч. Например, конечный период полувыведения составляет (или составляет примерно) от 8 до 60 ч, или от 8 до 48 ч, или от 12 до 120 ч, например, у человека. Дополнительно или альтернативно к вышеупомянутым критериям, вариабельный домен или антагонист в соответствии с изобретением имеет значение AUC (площадь под кривой) в диапазоне от (или примерно) 1 мгмин/мл или более. В одном воплощении нижний предел диапазона составляет (или составляет примерно) 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 или 300 мгмин/мл. Дополнительно или альтернативно, вариабельный домен, полиспецифический лиганд или антагонист в соответствии с изобретением имеетAUC в диапазоне (или примерно) вплоть до 600 мгмин/мл. В одном воплощении верхний предел диапазона составляет (или составляет примерно) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 или 50 мгмин/мл. Преимущественно вариабельный домен или антагонист будет иметь AUC в (или примерно в) диапазоне, выбранном из группы, состоящей из следующих значений: от 15 до 150 мгмин/мл, от 15 до 100 мгмин/мл, от 15 до 75 мгмин/мл и от 15 до 50 мгмин/мл. Один или более из t-альфа, t-бета и конечных периодов полувыведения, а также значения AUC,приведенные в данной заявке, можно получить у человека и/или животного (например, мыши или примата, не являющегося человеком, например бабуина, резуса, яванского макака) путем предложения одного или более единичных вариабельных доменов против TNFR1 (или других связывающих группировок,определенных в данной заявке), связанных либо с ПЭГ, либо с единичным вариабельным доменом (или связывающей группировкой), который специфически связан с сывороточным альбумином, например мышиным и/или человеческим сывороточным альбумином (SA). Размер ПЭГ может составлять (или может составлять примерно) по меньшей мере 20 кДа, например 30, 40, 50, 60, 70 или 80 кДа. В одном воплощении ПЭГ представляет собой 40 кДа, например, 220 кДа ПЭГ. В одном воплощении для получения t-альфа, t-бета и конечных периодов полувыведения или AUC, упомянутых в данной заявке, предложен антагонист, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина против TNFR1, связанный с единичным вариабельным доменом иммуноглобулина против SA. В одном воплощении ПЭГ представляет собой 40 кДа, например, 220 кДа ПЭГ. Например, антагонист содержит только один такой вариабельный домен против TNFR1, например один такой домен, связанный только с одним вариабельным доменом против SA. В одном воплощении для получения t-альфа, t-бета и конечных периодов полувыведения или AUC, упомянутых в данной заявке, предложен антагонист, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина против TNFR1, связанный с ПЭГ, например 40-80 кДа ПЭГ, например 40 кДа ПЭГ. Например, антагонист содержит только один такой вариабельный домен противTNFR1, например один такой домен, связанный с 40 кДа ПЭГ. В одном воплощении полиспецифического лиганда по изобретению лиганд содержит единичный вариабельный домен против SA (например, HSA), который содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности DOM7h-11, DOM7h-11-3, DOM7h-11-12, DOM7h-11-15, DOM7h-14, DOM7h14-10, DOM7h-14-18 или DOM7m-16 (см. WO 04003019, WO 2008096158 и находящиеся на совместном рассмотрении патентные заявки USSN 61/163987 и 61/163990, поданные 27 марта 2009 г., описания которых включены в данную заявку, включая конкретно последовательности dAb против сывороточного альбумина). Альтернативно или дополнительно, в воплощении полиспецифический лиганд содержит линкер, предложенный между единичным вариабельным доменом против TNFR1 и единичным вариабельным доменом против SA и содержащий аминокислотную последовательность AST, возможно ASTSGPS. Альтернативно, линкер представляет собой AS(G4S)n, где n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, напримерAS(G4S)3. Например, лиганд содержит (с N- к С-концу) DOM1h-574-16-AST-DOM7h-11; или DOM1h574-72-ASTSGPS-DOM7m-16; или DOM1h-574-72-ASTSGPS-DOM7h-11-12. В одном аспекте в изобретении предложен полиспецифический лиганд, содержащий (1) единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), который содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или по меньшей мере на 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h574-213 или DOM1h-574-214, (2) по меньшей мере один единичный вариабельный домен иммуноглобулина против сывороточного альбумина (SA), который специфически связывается с SA, где единичный вариабельный домен иммуноглобулин против (SA) содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности DOM7h-11-3, и (3) возможно где между единичным вариабельным доменом противTNFR1 и единичным вариабельным доменом против SA имеется линкер, содержащий аминокислотную последовательность AST, возможно ASTSGPS. Альтернативно, линкер представляет собой AS(G4S)n, гдеAS(G4S)n, где n равно 1,2,3, 4, 5, 6, 7 или 8, например AS(G4S)3. В этом примере или аспекте лиганд возможно адаптирован для введения пациенту внутрисосудисто, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно или посредством ингаляции. В одном примере лиганд предложен в виде сухой порошковой или лиофилизированной композиции (которую возможно смешивают с разбавителем перед введением). В одном аспекте в изобретении предложен полиспецифический лиганд, содержащий (1) единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), который содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или по меньшей мере на 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h574-213 или DOM1h-574-214, (2) по меньшей мере один единичный вариабельный домен иммуноглобулина против сывороточного альбумина (SA), который специфически связывается с SA, где единичный вариабельный домен иммуноглобулина против (SA) содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности DOM7h-14-10, и (3) возможно где между единичным вариабельным доменом противTNFR1 и единичным вариабельным доменом против SA имеется линкер, содержащий аминокислотную последовательность AST, возможно ASTSGPS. Альтернативно, линкер представляет собой AS(G4S)n, гдеn равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, например AS(G4S)3. В этом примере или аспекте лиганд возможно адаптирован для введения пациенту внутрисосудисто, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно или посредством ингаляции. В одном примере лиганд предложен в виде сухой порошковой или лиофилизированной композиции (которую возможно смешивают с разбавителем перед введением). В изобретении предложен антагонист TNFR1, содержащий единичный вариабельный домен, полипептид или полиспецифический лиганд из любого аспекта или воплощения изобретения. Например, антагонист или вариабельный домен по изобретению является моновалентным для связывания TNFR1. Например, антагонист или вариабельный домен по изобретению является моновалентным или, по существу,моновалентным, как определено с помощью стандартного SEC-MALLS (эксклюзионная хроматография/многоугловое лазерное светорассеяние). На существенную моновалентность указывает не более чем 5, 4, 3, 2 или 1% вариабельного домена или антагониста, присутствующего не в моновалентной форме,как определено с помощью стандартного SEC-MALLS. В одном воплощении антагонист по изобретению содержит первый и второй единичные вариабельные домены иммуноглобулина против TNFR1, где каждый вариабельный домен соответствует любому аспекту или воплощению изобретения. Первый и второй единичные вариабельные домены иммуноглобулина в одном примере идентичны. В другом примере они различаются. В одном примере аминокислотная последовательность антагониста или каждого единичного вариабельного домена против TNFR1 в антагонисте по изобретению идентична аминокислотной последовательности DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192,DOM1h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202,DOM1h-574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208,DOM1h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214. В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий вариабельный домен против TNFR1 согласно любому аспекту изобретения, для пероральной доставки, доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента, легочной доставки, доставки в легкое пациента или системной доставки. В другом аспекте в изобретении предложено применение антагонистаTNFR1 из любого аспекта изобретения в изготовлении лекарственного средства для пероральной доставки. В другом аспекте в изобретении предложено применение антагониста TNFR1 из любого аспекта изобретения в изготовлении лекарственного средства для доставки в ЖК тракт пациента. В одном примере антагонист или вариабельный домен устойчив к трипсину, эластазе и/или панкреатину (см. WO 2008149143). В одном аспекте в изобретении предложено применение антагониста TNFR1 из любого аспекта изобретения в изготовлении лекарственного средства для легочной доставки. В другом аспекте в изобретении предложено применение антагониста TNFR1 из любого аспекта изобретения в изготовлении лекарственного средства для доставки в легкое пациента. В одном примере антагонист или вариабельный домен устойчив к лейкозиму. В одном аспекте в изобретении предложен способ пероральной доставки или доставки лекарственного средства в ЖК тракт пациента или в легкое или в легочную ткань пациента, где способ включает введение пациенту фармацевтически эффективного количества антагониста TNFR1 по изобретению. В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55) для связывания с TNFR1 человека, мыши или яванского макака, имеющий последовательность CDR1, которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательностиCDR1 из DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214. Возможно, антагонист также имеет последовательность CDR2, которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательности CDR2 из выбранной последовательности. Возможно, дополнительно или альтернативно, антагонист также имеет последовательность CDR3, которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательности CDR3 из выбранной последовательности. В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55) для связывания с TNFR1 человека, мыши или яванского макака, имеющий последовательность CDR2, которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательностиCDR2 из DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214. Возможно, антагонист также имеет последовательность CDR3, которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательности CDR3 из выбранной последовательности. В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55) для связывания с TNFR1 человека, мыши или яванского макака, имеющий последовательность CDR3, которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательностиCDR3 из DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214. В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55) для связывания с TNFR1 человека, мыши или яванского макака, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, содержащий последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 единичного вариабельного домена, выбранного из DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191,DOM1h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201,DOM1 h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207,DOM1h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574214. В изобретении предложен антагонист TNFR1 из любого аспекта для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В изобретении предложено применение антагониста TNFR1 из любого аспекта в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В одном воплощении антагониста или применения состояние выбрано из группы, состоящей из артрита, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника и хронического обструктивного заболевания легких. В одном примере артрит представляет собой ревматоидный артрит или ювенильный ревматоидный артрит. В одном примере воспалительное заболевание кишечника выбрано из группы,состоящей из болезни Крона и неспецифического язвенного колита. В одном примере хроническое обструктивное заболевание легких выбрано из группы, состоящей из хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита и эмфиземы. В одном примере пневмония является бактериальной пневмонией. В одном примере бактериальная пневмония является стафилококковой пневмонией. В изобретении предложен антагонист TNFR1 из любого аспекта для лечения и/или профилактики респираторного заболевания. В изобретении предложено применение антагониста TNFR1 из любого аспекта в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики респираторного заболевания. В одном примере респираторное заболевание выбрано из группы, состоящей из воспаления легких, хронического обструктивного заболевания легких, астмы, пневмонии, гиперчувствительного пневмонита, легочного инфильтрата с эозинофилией, заболевания легких, вызванного факторами окружающей среды, пневмонии, бронхоэктаза, муковисцидоза, интерстициального заболевания легких, первичной легочной гипертензии, легочной тромбоэмболии, расстройств плевры, расстройств средостения, расстройств диафрагмы, гиповентиляции, гипервентиляции, апноэ во сне, острого респираторного дистресссиндрома, мезотелиомы, саркомы, отторжения трансплантата, реакции "трансплантат против хозяина",рака легких, аллергического ринита, аллергии, асбестоза, аспергиллемы, аспергиллеза, бронхоэктаза,хронического бронхита, эмфиземы, эозинофильной пневмонии, идиопатического фиброза легких, инвазивного пневмококкового заболевания, гриппа, нетуберкулезных микобактерий, плеврального выпота,пневмокониоза, пневмоцистоза, пневмонии, актиномикоза легких, легочного альвеолярного протеиноза,легочной формы сибирской язвы, отека легких, легочной эмболии, легочного воспаления, легочного гистиоцитоза X, легочной гипертензии, легочного нокардиоза, туберкулеза легких, легочной веноокклюзионной болезни, ревматоидного заболевания легких, саркоидоза и гранулематоза Вегенера. Полипептиды, dAbs и антагонисты Полипептид, лиганд, dAb, лиганд или антагонист может экспрессироваться в Е coli или в видахPichia (например, P. pastoris). В одном воплощении лиганд или мономер dAb секретируется в количестве по меньшей мере примерно 0,5 мг/л при экспрессии в Е. coli или в видах Pichia (например, Р. pastoris). Хотя лиганды и мономеры dAb, описанные в данной заявке, могут секретироваться при экспрессии в Е.coli или в видах Pichia (например, Р. pastoris), их можно продуцировать с использованием подходящего способа, такого как синтетические химические способы или способы биологического производства, в которых не используют Е. coli или виды Pichia. В некоторых воплощениях полипептид, лиганд, dAb, лиганд или антагонист не содержит вариабельный домен иммуноглобулина верблюдовых (Camelid) или одну или более каркасных аминокислот,которые являются уникальными для вариабельных доменов иммуноглобулина, кодируемых сегментами гена антитела зародышевой линии верблюдовых, например, в положении 108, 37, 44, 45 и/или 47. В одном воплощении вариабельный домен против TNFR1 по изобретению содержит остаток G в положении 44 согласно Kabat и возможно содержит одну или более аминокислот, специфичных для верблюдовых, в других положениях, например, в положении 37 или 103. Антагонисты TNFR1 согласно изобретению могут быть моновалентными или поливалентными. В некоторых воплощениях антагонист является моновалентным и содержит один связывающий сайт, который взаимодействует с TNFR1, где связывающий сайт представлен полипептидом или dAb по изобретению. Моновалентные антагонисты связывают один TNFR1 и не могут индуцировать сшивание или кластеризацию TNFR1 на поверхности клеток, что может приводить к активации рецептора и сигнальной трансдукции. Моновалентные антагонисты согласно изобретению могут связывать домен 1, домен 2,домен 3 или домен 4 TNFR1. В воплощении моновалентный антагонист связывает домен 4 TNFR1. В других воплощениях моновалентный антагонист связывает эпитоп, который охватывает более чем один домен TNFR1. Таким образом, в одном воплощении моновалентный антагонист может связывать оба домена 1 и 2, домены 1 и 3, домены 1 и 4, домены 2 и 3, домены 2 и 4, домены 3 и 4, домены 1, 2 и 3, домены 1, 2 и 4,д или домены 1, 3 и 4 TNFR1. В других воплощениях антагонист TNFR1 является поливалентным. Поливалентные антагонистыTNFR1 могут содержать две или более копий конкретного связывающего сайта для TNFR1 или содержать два или более различных связывающих сайтов, которые связывают TNFR1, где по меньшей мере один из связывающих сайтов представлен полипептидом или dAb по изобретению. Например, как описано в данной заявке, антагонист TNFR1 может быть димером, тримером или мультимером, содержащим две или более копий конкретного полипептида или dAb по изобретению, которые связывают TNFR1 или два или более различных полипептидов или dAbs по изобретению, которые связывают TNFR1. В одном воплощении поливалентный антагонист TNFR1, по существу, не оказывает агонистического влияния наTNFR1 (действует в качестве агониста TNFR1) в стандартном клеточном анализе (т.е. когда присутствует в концентрации 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ, 1000 и 5000 мкМ, приводит к не более чем примерно 5% TNFR1-опосредованной активности, индуцируемой с помощью TNF (100 пг/мл) в анализе). В некоторых воплощениях поливалентный антагонист TNFR1 содержит два или более связывающих сайтов для желаемого эпитопа или домена TNFR1. Например, поливалентный антагонист TNFR1 может включать два или более связывающих сайтов, которые связываются с тем же эпитопом в домене 1TNFR1 или связывается с тем же эпитопом в домене 4 TNFR1. В других воплощениях поливалентный антагонист TNFR1 содержит два или более связывающих сайтов, представленных полипептидами или dAbs по изобретению, которые связываются с различными эпитопами или доменами TNFR1. Например, поливалентные антагонисты TNFR1 могут содержать связывающие сайты для доменов 1 и 2, доменов 1 и 3, доменов 1 и 4, доменов 2 и 3, доменов 2 и 4, доменов 3 и 4, доменов 1, 2 и 3, доменов 1, 2 и 4 или доменов 1, 3 и 4 TNFR1. В одном воплощении такие поливалентные антагонисты не обладают агонистической активностью в отношении TNFR1, когда присутствуют в концентрации примерно 1 нМ, или примерно 10 нМ, или примерно 100 нМ, или примерно 1 мкМ,или примерно 10 мкМ в стандартном анализе цитотоксичности L929 или в стандартном анализе HeLa IL8, как описано в WO 2006038027. Другие антагонисты TNFR1 не ингибируют связывание TNF с TNFR1. Такие лиганды (и антагонисты) могут быть полезны в качестве диагностических агентов, поскольку они могут быть использованы для связывания или обнаружения, количественного определения или измерения TNFR1 в образце и не будут конкурировать с TNF в образце за связывание с TNFR1. Таким образом, можно осуществить точное определение наличия и количества TNFR1 в образце. В других воплощениях полипептид, лиганд, dAb или антагонист связывает TNFR1 и антагонизирует активность TNFR1 в стандартном клеточном анализе с ND50 не более 100 нМ и при концентрации не более 10 мкМ dAb антагонизирует активность TNFR1 не более чем на 5% в анализе. В конкретных воплощениях полипептид, лиганд, dAb или антагонист, по существу, не оказывает агонистического влияния на TNFR1 (действует в качестве агониста TNFR1) в стандартном клеточном анализе (т.е. когда присутствует в концентрации 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ, 1000 или 5000 мкМ, приводит не более чем к примерно 5% TNFR1-опосредованной активности, индуцированной TNF (100 пг/мл) в анализе). В некоторых воплощениях полипептид, лиганд, dAb или антагонист по изобретению является эффективным в моделях хронических воспалительных заболеваний при введении эффективного количества. Как правило, эффективное количество составляет от примерно 1 до примерно 10 мг/кг (например,примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 или примерно 10 мг/кг). Модели хронического воспалительного заболевания (см. модели, описанные в WO 2006038027) признаются специалистами в данной области для прогнозирования терапевтической эффективности у людей. В конкретных воплощениях полипептид, лиганд, dAb или антагонист является эффективным в стандартной мышиной модели коллаген-индуцированного артрита (см. WO 2006038027 для подробной информации о модели). Например, введение эффективного количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста может уменьшать средний артритный индекс при суммировании четырех конечностей в стандартной мышиной модели коллаген-индуцированного артрита, например, на от примерно 1 до примерно 16, от примерно 3 до примерно 16, от примерно 6 до примерно 16, от примерно 9 до примерно 16 или от примерно 12 до примерно 16 по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста может замедлять появление симптомов артрита в стандартной мышиной модели коллаген-индуцированного артрита, например, на примерно 1 сутки, примерно 2 суток, примерно 3 суток, примерно 4 суток, примерно 5 суток, примерно 6 суток, примерно 7 суток, примерно 10 суток, примерно 14 суток, примерно 21 сутки или примерно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста может приводить к среднему артритному индексу при суммировании четырех конечностей в стандартной мышиной модели коллаген-индуцированного артрита от 0 до примерно 3, от примерно 3 до примерно 5, от примерно 5 до примерно 7, от примерно 7 до примерно 15, от примерно 9 до примерно 15, от примерно 10 до примерно 15, от примерно 12 до примерно 15 или от примерно 14 до примерно 15. В других воплощениях полипептид, лиганд, dAb или антагонист является эффективным в модели артрита у мышей ARE (см. WO 2006038027 для подробной информации о модели). Например, введение эффективного количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста может уменьшать средний артритный индекс в модели артрита у мышей ARE, например, на от примерно 0,1 до примерно 2,5, от примерно 0,5 до примерно 2,5, от примерно 1 до примерно 2,5, от примерно 1,5 до примерно 2,5 или от примерно 2 до примерно 2,5 по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста может замедлять появление симптомов артрита в модели артрита у мышей ARE, например, на примерно 1 сутки, примерно 2 суток, примерно 3 суток, примерно 4 суток, примерно 5 суток, примерно 6 суток, примерно 7 суток, примерно 10 суток,примерно 14 суток, примерно 21 сутки или примерно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста может приводить к среднему артритному индексу в модели артрита у мышей ARE от 0 до примерно 0,5, примерно 0,5 до примерно 1, от примерно 1 до примерно 1,5, от примерно 1,5 до примерно 2 или от примерно 2 до примерно 2,5. В других воплощениях полипептид, лиганд, dAb или антагонист является эффективным в модели воспалительного заболевания кишечника (IBD) у мышей ARE (см. WO 2006038027 для подробной информации о модели). Например, введение эффективного количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста может уменьшать средний индекс острого и/или хронического воспаления в модели IBD у мышей ARE, например, на от примерно 0,1 до примерно 2,5, от примерно 0,5 до примерно 2,5, от примерно 1 до примерно 2,5, от примерно 1,5 до примерно 2,5 или от примерно 2 до примерно 2,5 по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида,лиганда, dAb или антагониста может замедлять появление симптомов IBD в модели IBD у мышей ARE,например, на примерно 1 сутки, примерно 2 суток, примерно 3 суток, примерно 4 суток, примерно 5 суток, примерно 6 суток, примерно 7 суток, примерно 10 суток, примерно 14 суток, примерно 21 сутки или примерно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста может приводить к среднему индексу острого и/или хронического воспаления в модели IBD у мышей ARE от 0 до примерно 0,5, от примерно 0,5 до примерно 1, от примерно 1 до примерно 1,5, от примерно 1,5 до примерно 2 или от примерно 2 до примерно 2,5. В других воплощениях полипептид, лиганд, dAb или антагонист является эффективным в мышиной модели IBD, индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS) (см. WO 2006038027 для подробной информации о модели). Например, введение эффективного количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста может уменьшать индекс средней тяжести в мышиной DSS модели IBD, например, от примерно 0,1 до примерно 2,5, от примерно 0,5 до примерно 2,5, от примерно 1 до примерно 2,5, от примерно 1,5 до примерно 2,5 или от примерно 2 до примерно 2,5 по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста может замедлять появление симптомов IBD в мышиной DSS модели IBD, например, на примерно 1 сутки, примерно 2 суток, примерно 3 суток, примерно 4 суток, примерно 5 суток, примерно 6 суток, примерно 7 суток, примерно 10 суток, примерно 14 суток, примерно 21 сутки или примерно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда,dAb или антагониста может приводить к среднему индексу тяжести в мышиной DSS модели IBD от 0 до примерно 0,5, от примерно 0,5 до примерно 1, от примерно 1 до примерно 1,5, от примерно 1,5 до примерно 2 или от примерно 2 до примерно 2,5. В конкретных воплощениях полипептид, лиганд, dAb или антагонист является эффективным в мышиной модели хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), вызванного табачным дымом(см. WO 2006038027 и WO 2007049017 для подробной информации о модели). Например, введение эффективного количества лиганда может уменьшать или замедлять появление симптомов ХОЗЛ по сравнению с подходящим контролем. Имеются животные модельные системы, которые можно использовать для скрининга эффективности антагонистов TNFR1 (например, лигандов, антител или их связывающих белков) в защите против или лечении заболевания. Способы тестирования системной красной волчанки (SLE) у восприимчивых мышей известны в данной области (Knight et al. (1978) J. Exp. Med, 147: 1653; Reinersten et al. (1978) NewEng. J. Med., 299: 515). Астенический бульбарный паралич (MG, myasthenia gravis) тестируют на самках мышей SJL/J посредством индукции заболевания растворимым белком AchR (рецептор ацетилхолина) из других видов (Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). Артрит индуцируют у восприимчивого штамма мышей посредством инъекции коллагена II типа (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Была описана модель, где адъювантный артрит индуцируют у восприимчивых крыс посредством инъекции микобактериального белка теплового шока (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). Тиреоидит индуцируют у мышей посредством введения тиреоглобулина, как описано (Maron et al. (1980) J. Exp. Med.,152: 1115). Инсулинозависимый сахарный диабет (IDDM) возникает естественным путем или может быть индуцирован в некоторых линиях мышей, таких как описанные в Kanasawa et al. (1984)Diabetologia, 27: 113. EAE (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) у мышей и крыс служит моделью MS (рассеянный склероз) у человека. В этой модели демиелинизирующее заболевание индуцируют путем введения основного миелинового белка (см. Paterson (1986) Textbook of Immunopathology,Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: иSatoh et al. (1987) J. Immunol, 138: 179). Как правило, лиганды (например, антагонисты) будут использоваться в очищенной форме вместе с фармакологически приемлемыми носителями. В общем, эти носители включают водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе солевые и/или буферные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой, декстрозу и хлорид натрия и раствор Рингера с лактатом. Подходящие физиологически приемлемые адъюванты, если необходимо сохранить полипептидный комплекс в суспензии, можно выбрать из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты. Внутривенные носители включают жидкости и питательные наполнители и электролиты на основе,например, декстрозы Рингера. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как противомикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). Можно использовать различные подходящие препараты,включая препараты с пролонгированным высвобождением. Лиганды (например, антагонисты) по настоящему изобретению можно использовать в виде отдельно вводимых композиций или в сочетании с другими агентами. Они могут включать различные иммунотерапевтические лекарственные средства, такие как циклоспорин, метотрексат, адриамицин или цисплатин и иммунотоксины. Фармацевтические композиции могут включать "коктейли" различных цитотоксических или других агентов в сочетании с лигандами по настоящему изобретению или даже комбинации лигандов в соответствии с настоящим изобретением, имеющих различные специфичности, такие как лиганды, выбранные с использованием различных целевых антигенов или эпитопов, независимо от того,объединяются ли они перед введением или нет. Путь введения фармацевтических композиций в соответствии с изобретением может представлять собой любой из обычно известных специалистам в данной области. Для терапии, включая без ограничения иммунотерапию, выбранные лиганды по изобретению можно вводить пациенту в соответствии со стандартными методами. Введение можно осуществлять любым подходящим способом, включая парентеральное, внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное, подкожное, трансдермальное введение, посредством легочного пути или также, соответственно, посредством прямой инфузии с использованием катетера. Дозировка и частота введения будут зависеть от возраста, пола и состояния пациента, одновременного введения других лекарственных средств, противопоказаний и других параметров, которые должны быть приняты во внимание врачом. Введение может быть локальным (например, локальная доставка в легкое посредством легочного введения, например, интраназального введения) или системным, как указано. Лиганды по изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Этот метод, как было показано, является эффективным с обычными иммуноглобулинами, и можно использовать известные в данной области методы лиофилизации и восстановления. Специалисту в данной области понятно, что лиофилизация и восстановление могут приводить к различной степени потери активности антител (например, что касается обычных иммуноглобулинов, то антитела IgM в большей степени теряют активность, чем антитела IgG) и что используемые уровни можно увеличивать для компенсации. Композиции, содержащие лиганды (например, антагонисты) по настоящему изобретению или их коктейль, можно вводить для профилактического и/или терапевтического лечения. При некоторых терапевтических применениях количество, достаточное для достижения по меньшей мере частичного ингибирования, подавления, модулирования, уничтожения или какого-либо другого измеряемого параметра популяции выбранных клеток определяют как "терапевтически эффективную дозу". Количества, необходимые для достижения этой дозировки, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния собственной иммунной системы пациента, но обычно варьируются от 0,005 до 10,0 мг лиганда, напримерdAb или антагониста, на килограмм массы тела при дозах от 0,05 до 2,0 мг/кг/доза, являющихся наиболее часто используемыми. Что касается профилактических применений, то композиции, содержащие лиганды по настоящему изобретению или коктейли из них, также можно вводить в аналогичных или чуть более низких дозировках для предупреждения, ингибирования или замедления наступления заболевания(например, для поддержания ремиссии или состояния покоя или для предупреждения острой фазы). Ква- 14022898 лифицированный врач сможет определить подходящий интервал между дозами для лечения, подавления или предупреждения заболевания. Когда лиганд TNFR1 (например, антагонист) вводят для лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания, тогда его можно вводить вплоть до четырех раз в сутки, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз в месяц или один раз каждые два месяца, в дозе, например, от примерно 10 мкг/кг до примерно 80 мг/кг, от примерно 100 мкг/кг до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 70 мг/кг, от примерно 1 до примерно 60 мг/кг, от примерно 1 до примерно 50 мг/кг, от примерно 1 до примерно 40 мг/кг, от примерно 1 до примерно 30 мг/кг, от примерно 1 до примерно 20 мг/кг,от примерно 1 до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 5 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 2,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг,примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг или примерно 10 мг/кг. В конкретных воплощениях лиганд TNFR1 (например,антагонист) вводят для лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания один раз каждые две недели или раз в месяц в дозе от примерно 10 мкг/кг до примерно 10 мг/кг(например, примерно 10 мкг/кг, примерно 100 мкг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 или примерно 10 мг/кг.) Лечение или терапия, выполняемые с использованием композиций, описанных в данной заявке,считаются "эффективными", если один или более симптомов уменьшаются (например, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на один пункт в клинической шкале оценки) по сравнению с такими симптомами, присутствующими до лечения, или по сравнению с такими симптомами у индивидуума (в человеческой или животной модели), не подвергнутого лечению такой композицией, или другим подходящим контролем. Очевидно, что симптомы будут меняться в зависимости от целевого заболевания или расстройства, но могут быть измерены обычным квалифицированным врачом или специалистом. Такие симптомы можно измерить, например, посредством мониторинга уровня одного или более биохимических показателей заболевания или расстройства (например, уровней фермента или метаболита, коррелирующих с заболеванием, влияющих на число клеток и т.д.), посредством мониторинга физических проявлений (например воспаления, размера опухоли и т.д.) или с помощью принятой шкалы клинической оценки, например расширенной шкалы инвалидизации (для рассеянного склероза), опросника Ирвина относительно воспалительного заболевания кишечника (32 пункта оценивают качество жизни относительно функции кишечника, системных симптомов, социальных функций и эмоционального статуса показатель колеблется от 32 до 224, более высокие показатели указывают на лучшее качество жизни),шкалы оценки качества жизни при ревматоидном артрите или другой принятой шкалы клинической оценки, известной в данной области. Устойчивое (например, одни сутки или больше, или дольше) снижение симптомов заболевания или расстройства по меньшей мере на 10% или на один или более пунктов по заданной клинической шкале является показателем "эффективного" лечения. Аналогично, профилактика, осуществляемая с использованием композиции, как описано в данной заявке, является "эффективной", если появление или тяжесть одного или более симптомов замедляется, уменьшается или отменяется относительно таких симптомов у подобного индивидуума (человеческая или животная модель), не подвергнутого воздействию композиции. Композицию, содержащую лиганд (например, антагонист) или их коктейль, в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в профилактических или терапевтических применениях для обеспечения изменения, инактивации, уничтожения или удаления выбранной целевой популяции клеток у млекопитающего. Кроме того, выбранные репертуары полипептидов, описанных в данной заявке, можно использовать экстракорпорально или in vitro, выборочно уничтожая, истощая или иным образом эффективно удаляя целевую клеточную популяцию из гетерогенной совокупности клеток. Кровь млекопитающего можно объединять экстракорпорально с лигандами, посредством чего нежелательные клетки уничтожаются или иным образом удаляются из крови для возвращения млекопитающему в соответствии со стандартными методами. Композицию, содержащую лиганд (например, антагонист), в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в профилактических или терапевтических применениях для обеспечения изменения, инактивации, уничтожения или удаления выбранной целевой популяции клеток у млекопитающего. Лиганды (например, анти-TNFR1 антагонисты, dAb мономеры) можно вводить или готовить в виде препаратов вместе с одним или более дополнительными терапевтическими или активными агентами. Когда лиганд (например, dAb) вводят с дополнительным терапевтическим агентом, тогда лиганд можно вводить до, одновременно или после введения дополнительного агента. Как правило, лиганд и дополнительный агент вводят способом, который обеспечивает перекрывание терапевтического эффекта. В одном воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста В одном воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения артрита (например, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита, псориатического артрита), включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом,терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста TNFR1 в соответствии с изобретением. В другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения псориаза, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста TNFR1 в соответствии с изобретением. В другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения воспалительного заболевания кишечника (например, болезни Крона, неспецифического язвенного колита), включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста TNFR1 в соответствии с изобретением. В другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения хронического обструктивного заболевания легких (например, хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита, эмфиземы), включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом,терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста TNFR1 в соответствии с изобретением. В другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения пневмонии (например, бактериальной пневмонии, такой как стафилококковая пневмония), включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста TNFR1 в соответствии с изобретением. В изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения других легочных заболеваний, в дополнение к хроническому обструктивному заболеванию легких и пневмонии. Другие легочные заболевания, которые можно лечить, подавлять или предупреждать в соответствии с изобретением, включают, например, муковисцидоз и астму (например, стероид-устойчивую астму). Таким образом,в другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения легочного заболевания (например, муковисцидоза, астмы), включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста TNFR1 в соответствии с изобретением. В конкретных воплощениях антагонист TNFR1 вводят посредством легочной доставки, например,посредством ингаляции (например, внутрибронхиальной, интраназальной или пероральной ингаляции,интраназальных капель) или посредством системной доставки (например, парентеральной, внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной, подкожной). В другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения септического шока, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, dAb или антагониста TNFR1 в соответствии с изобретением. В другом аспекте изобретения предложена композиция, содержащая полипептид, лиганд, dAb или антагонист TNFR1 в соответствии с изобретением и фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или эксципиент. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения заболевания с использованием полипептида, лиганда, dAb или антагониста TNFR1 или композиции в соответствии с настоящим изобретением. В воплощении заболевание представляет способ рак или воспалительное заболевание, например ревматоидный артрит, астму или болезнь Крона. В другом аспекте изобретения предложена композиция, содержащая полипептид, единичный вариабельный домен, лиганд или антагонист, согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. В конкретных воплощениях полипептид, лиганд, единичный вариабельный домен, антагонист или композицию вводят посредством легочной доставки, например, посредством ингаляции (например, внутрибронхиальной, интраназальной или пероральной ингаляции, интраназальных капель) или посредством системной доставки (например, парентеральной, внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной, подкожной). В одном аспекте изобретения предложено устройство для легочной доставки, содержащее полипептид, единичный вариабельный домен, лиганд, композицию или антагонист в соответствии с изобретением. Устройство может представлять собой ингалятор или устройство для интраназального введения. В других воплощениях любой из лигандов, описанных в данной заявке (например, антагонист или единичный вариабельный домен), дополнительно содержит группировку, увеличивающую период полувыведения, такую как полиалкиленгликолевая группировка, сывороточный альбумин или его фрагмент,рецептор трансферрина или его трансферрин-связывающий участок или группировка, содержащая связывающий сайт для полипептида, который увеличивает период полувыведения in vivo. В некоторых воплощениях группировка, увеличивающая период полувыведения, представляет собой группировку, содержащую связывающий сайт для полипептида, который увеличивает период полувыведения in vivo,- 16022898EGF и авимера. В других воплощениях группировка, увеличивающая период полувыведения, представляет собой полиэтиленгликолевую группировку. В одном воплощении антагонист содержит (возможно состоит из) единичный вариабельный домен по изобретению, связанный с полиэтиленгликолевой группировкой(возможно, где группировка имеет размер от примерно 20 до примерно 50 кДа, возможно примерно 40 кДа линейного или разветвленного ПЭГ). Ссылка сделана на W0 04081026 для более подробной информации о ПЭГилировании dAbs и связывающих группировок. В одном воплощении антагонист состоит из мономера dAb, связанного с ПЭГ, где мономер dAb представляет собой единичный вариабельный домен в соответствии с изобретением. Этот антагонист может быть предложен для лечения воспалительного заболевания, состояния легких (например, астмы, гриппа или ХОЗЛ) или рака и возможно подходит для внутривенного введения. В других воплощениях группировка, увеличивающая период полувыведения, представляет собой антитело или фрагмент антитела (например, единичный вариабельный домен иммуноглобулина), содержащий связывающий сайт для сывороточного альбумина или неонатального Fc-рецептора. Изобретение также относится к композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей лиганд по изобретению (например, антагонист или единичный вариабельный домен) и физиологически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях композиция содержит носитель для внутривенного, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутриартериального, интратекального, внутрисуставного,подкожного введения, легочного, интраназального, вагинального или ректального введения. Изобретение также относится к устройству для доставки лекарственного средства, содержащему композицию (например, фармацевтическую композицию) по изобретению. В некоторых воплощениях устройство для доставки лекарственного средства содержит множество терапевтически эффективных доз лиганда. В других воплощениях устройство для доставки лекарственного средства выбрано из группы,состоящей из устройства для парентеральной доставки, устройства для внутривенной доставки, устройства для внутримышечной доставки, устройства для внутрибрюшинной доставки, устройства для трансдермальной доставки, устройства для легочной доставки, устройства для внутриартериальной доставки,устройства для интратекальной доставки, устройства для внутрисуставной доставки, устройства для подкожной доставки, устройства для интраназальной доставки, устройства для вагинальной доставки, устройства для ректальной доставки, шприца, устройства для трансдермальной доставки, капсулы, таблетки,небулайзера, ингалятора, атомайзера, генератора аэрозоля, генератора тумана, сухого порошкового ингалятора, дозирующего ингалятора, дозирующего распылителя, дозирующего генератора тумана, дозирующего атомайзера и катетера. Лиганд (например, единичный вариабельный домен, антагонист или полиспецифический лиганд) по изобретению может быть отформатирован, как описано в данной заявке. Например, лиганд по изобретению можно отформатировать с целью изменения периода полувыведения из сыворотки in vivo. При желании, лиганд может дополнительно содержать токсин или токсиновую группировку, как описано в данной заявке. В некоторых воплощениях лиганд содержит поверхностно-активный токсин, такой как генератор свободных радикалов (например, селен-содержащий токсин) или радионуклид. В других воплощениях токсин или токсиновая группировка представляет собой полипептидный домен (например, dAb),имеющий связывающий сайт со специфичностью связывания в отношении внутриклеточной мишени. В конкретных воплощениях лиганд представляет собой IgG-подобный формат, который обладает специфичностью связывания в отношении TNFR1 (например, человеческого TNFR1). В одном аспекте в изобретении предложен слитый белок, содержащий единичный вариабельный домен по изобретению. Вариабельный домен может быть слит, например, с пептидом или полипептидом или белком. В одном воплощении вариабельный домен слит с антителом или фрагментом антитела, например, моноклональным антителом. Как правило, слияния можно достичь путем экспрессии слитого продукта с последовательности единичной нуклеиновой кислоты или путем экспрессии полипептида,содержащего единичный вариабельный домен, и последующего объединения этого полипептида в больший белок или формат антитела с использованием методов, которые являются общепринятыми. В одном воплощении единичный вариабельный домен иммуноглобулина, антагонист или слитый белок содержит константный домен антитела. В одном воплощении единичный вариабельный домен иммуноглобулина, антагонист или слитый белок содержит Fc антитела, возможно, где N-конец Fc связан(возможно, непосредственно связан) с С-концом вариабельного домена. В одном воплощении единичный вариабельный домен иммуноглобулина, антагонист или слитый белок содержит группировку, увеличивающую период полувыведения. Группировка, увеличивающая период полувыведения, может представлять собой полиэтиленгликолевую группировку, сывороточный альбумин или его фрагмент, рецептор трансферрина или его трансферрин-связывающий участок, или антитело или фрагмент антитела, содержащие связывающий сайт для полипептида, который увеличивает период полувыведения in vivo. Группировка, увеличивающая период полувыведения, может представлять собой антитело или фрагмент антитела, содержащие связывающий сайт для сывороточного альбумина или неонатального Fc-рецептора. Группировка, увеличивающая период полувыведения, может представлять собой dAb, антитело или фрагмент антитела. В одном воплощении предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина,или антагонист, или слитый белок, такой что вариабельный домен (или вариабельный домен, представленный антагонистом или слитым белком) дополнительно содержит полиалкиленгликолевую группировку. Полиалкиленгликолевая группировка может представлять собой полиэтиленгликолевую группировку. Дополнительное обсуждение представлено ниже. Сделана ссылка на WO 2006038027, в которой описаны единичные вариабельные домены иммуноглобулина против TNFR1. Описание этого документа включено в данную заявку во всей своей полноте, в частности, для обеспечения применений, форматов, способов отбора, способов получения, способов приготовления фармацевтических препаратов и анализов единичных вариабельных доменов, лигандов, антагонистов против TNFR1 и тому подобного таким образом, чтобы эти описания можно было применить специально и точно в контексте настоящего изобретения, в том числе для обеспечения точного описания для введения в формулу изобретения настоящего описания. Анти-TNFR1 по изобретению представляет собой единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который возможно представляет собой человеческий вариабельный домен или вариабельный домен, который содержит или происходит из человеческих каркасных областей (например, каркасные области DP47 или DPK9). В некоторых воплощениях вариабельный домен основан на универсальной каркасной области, как описано в данной заявке. В некоторых воплощениях полипептидный домен (например, единичный вариабельный домен иммуноглобулина), который имеет связывающий сайт со специфичностью связывания в отношении TNFR1,устойчив к агрегации, обратимо разворачивается (см. WO 04101790, идеи которой включены в данную заявку посредством ссылки). Молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и клетки-хозяева В изобретении также предложены выделенные и/или рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие лиганды (единичные вариабельные домены, слитые белки, полипептиды, лиганды с двойной специфичностью и полиспецифические лиганды), как описано в данной заявке. В одном аспекте в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота,кодирующая полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина согласно изобретению. В одном воплощении нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательностьDOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h-574-193,DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h-574-203,DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h-574-209,DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214. В одном аспекте в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190,DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h-574-196,DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206,DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214, и где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывается с TNFR1. В одном аспекте в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85,90, 95, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности DOM1h-574-188, DOM1h-574-189,DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195,DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205,DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212,DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214, и где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывается сTNFR1. В одном аспекте в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности DOM1h-574-188,DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1h-574-194,DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1h-574-204,DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211,DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214, и где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывается с TNFR1. В одном аспекте в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательностиDOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1h-574-209,DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574-214, и где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывается с TNFR1. В одном аспекте в изобретении предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по изобретению. В одном аспекте в изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по изобретению или вектор. Предложен способ получения полипептида, содержащего единичный вариабельный домен иммуноглобулина, включающий поддержание клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты или вектора, посредством чего продуцируется полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина. Возможно, способ дополнительно включает стадию выделения полипептида и возможно получение варианта, например мутантного варианта, имеющего улучшенную аффинность (KD); ND50 для нейтрализации TNFR1 в стандартном анализе MRC5,L929 или KI яванского макака, чем у выделенного полипептида. Нуклеиновые кислоты, называемые в данной заявке "выделенными", представляют собой нуклеиновые кислоты, которые были отделены от нуклеиновых кислот геномной ДНК или клеточной РНК из источника их происхождения (например, поскольку она существует в клетках или в смеси нуклеиновых кислот, такой как библиотека) и включают нуклеиновые кислоты, полученные способами, описанными в данной заявке, или другими подходящими способами, включая практически чистые нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты, полученные с помощью химического синтеза, с помощью комбинаций биологических и химических методов, и рекомбинантные нуклеиновые кислоты, которые выделяют (см., например, Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. и J.S. Crowe, Gene,101: 297-302(1991. Нуклеиновые кислоты, называемые в данной заявке "рекомбинантными", представляют собой нуклеиновые кислоты, которые были получены с помощью методологии рекомбинантных ДНК, в том числе и нуклеиновые кислоты, которые образуются с помощью процедур, которые основаны на методе искусственной рекомбинации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и/или клонирование в вектор с использованием рестрикционных ферментов. В некоторых воплощениях выделенная и/или рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую лиганд, как описано в данной заявке, где указанный лиганд содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 91%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 93%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью dAb, которое связывается с TNFR1, описанным в данной заявке, например, DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1h-574-190, DOM1h-574-191,DOM1h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1h-574-201,DOM1h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1h-574-204, DOM1h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1h-574-207,DOM1h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1h-574-213 или DOM1h-574214. Идентичность нуклеотидной последовательности можно определить по всей длине нуклеотидной последовательности, которая кодирует выбранное dAb против TNFR1. В изобретении также предложен вектор, содержащий молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по изобретению. В некоторых воплощениях вектор представляет собой экспрессирующий вектор,содержащий один или более элементов, контролирующих экспрессию, или последовательности, которые функциональным образом связаны с рекомбинантной нуклеиновой кислотой по изобретению. В изобретении также предложена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты или вектор по изобретению. Подходящие векторы (например, плазмиды, фагмиды), элементы, контролирующие экспрессию, клетки-хозяева и способы получения рекомбинантных клетокхозяев по изобретению хорошо известны в данной области, и примеры более подробно описаны в данной заявке. Подходящие экспрессирующие векторы могут содержать ряд компонентов, например, точку начала репликации, селектируемый маркерный ген, один или более элементов, контролирующих экспрессию,таких как элемент контроля транскрипции (например, промотор, энхансер, терминатор) и/или один или более сигналов трансляции, сигнальную последовательность или лидерную последовательность и тому подобное. Элементы, контролирующие экспрессию, и сигнальная последовательность, если они присутствуют, могут быть представлены вектором или другим источником. Например, транскрипционные и/или трансляционные регуляторные последовательности клонированной нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь антитела, можно использовать для прямой экспрессии. Промотор может быть предложен для экспрессии в желаемой клетке-хозяине. Промоторы могут быть конститутивными или индуцибельными. Например, промотор может быть функциональным образом связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело, цепь антитела или его участок, так что он управляет транскрипцией нуклеиновой кислоты. Имеются различные подходящие промоторы для прока- 19022898 риотических (например, промоторы lac, tac, Т 3, Т 7 для Е. coli) и эукариотических (например, ранний или поздний промотор обезьяньего вируса 40, промотор из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса, промотор цитомегаловируса, поздний промотор аденовируса) хозяев. Кроме того, экспрессирующие векторы обычно содержат селектируемый маркер для селекции клеток-хозяев, несущих вектор, и, в случае реплицируемого экспрессирующего вектора, точку начала репликации. Гены, кодирующие продукты, которые придают устойчивость к антибиотикам или лекарственным средствам, представляют собой обычные селектируемые маркеры и могут быть использованы в прокариотических (например, ген лактамазы (устойчивость к ампициллину), ген Tet устойчивости к тетрациклину) и эукариотических клетках (например, неомицин (G418 или генетицин), gpt (микофеноловая кислота), ампициллин или гены устойчивости к гигромицину). Маркерные гены дигидрофолатредуктазы позволяют осуществлять селекцию с помощью метотрексата в различных хозяевах. Гены, кодирующие генный продукт ауксотрофных маркеров хозяина (например, LEU2, URA3, HIS3), часто используют в качестве селектируемых маркеров в дрожжах. Также рассматривается применение вирусных (например,бакуловирусных) или фаговых векторов и векторов, которые способны интегрироваться в геном клеткихозяина, таких как ретровирусные векторы. Подходящие экспрессирующие векторы для экспрессии в клетках млекопитающих и прокариотических клетках (Е. coli), клетках насекомых (клетки DrosophilaSchnieder S2, Sf9) и дрожжах (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) хорошо известны в данной области. Подходящие клетки-хозяева могут представлять собой прокариотические клетки, включая бактериальные клетки, такие как Б. coli, В. subtilis и/или другие подходящие бактерии; эукариотические клетки,такие как грибковые или дрожжевые клетки (например, Pichiapastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa) или другие низшие эукариотические клетки, и клетки высших эукариот, такие как клетки насекомых (например, клетки Drosophila Schnieder S2, клеткиMolecular Biology, Greene Publishing Associates and John WileySons Inc. (1993. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой выделенную клетку-хозяина и не является частью многоклеточного организма (например, растения или животного). В некоторых воплощениях клетка-хозяин не является человеческой клеткой-хозяином. В изобретении также предложен способ получения лиганда (например, лиганда с двойной специфичностью, полиспецифического лиганда) по изобретению, включающий поддержание рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей рекомбинантную нуклеиновую кислоту по изобретению, в условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, посредством чего экспрессируется рекомбинантная нуклеиновая кислота и продуцируется лиганд. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает выделение лиганда. Ссылка делается на WO 2006038027 для деталей описания, которое применимо к воплощениям настоящего изобретения. Например, релевантное описание относится к получению лигандов на основе единичного вариабельного домена иммуноглобулина, библиотечным векторным системам, конструированию библиотек, комбинированию единичных вариабельных доменов, характеристике лигандов, структуре лигандов, скелетам, белковым каркасам, диверсификации канонической последовательности, анализам и терапевтическим и диагностическим композициям и применениям, а также определениям "функциональным образом связанный", "наивный", "предупреждение", "подавление", "лечение" и "терапевтически эффективная доза". Форматы Увеличенный период полувыведения полезен в применениях in vivo иммуноглобулинов, особенно антител, и в еще большей степени фрагментов антител малого размера. Такие фрагменты (Fvs, дисульфидсвязанные Fvs, Fabs, scFvs, dAbs) подвергаются быстрому выведению из организма; таким образом,хотя они способны быстро достигать большинства частей тела, и быстро производятся и просты в обращении, их применения in vivo ограничивались лишь коротким временем их существования in vivo. Одно воплощение изобретения решает эту проблему путем обеспечения увеличенного периода полувыведения лигандов in vivo и, следовательно, более продолжительного времени пребывания в организме функциональной активности лиганда. Методы фармакокинетического анализа и определение периода полувыведения лиганда знакомы специалистам в данной области. Детали можно найти в Kenneth, A. et al. ChemicalApproach (1996). Ссылка также делается на "Pharmacokinetics", M GibaldiD Perron, опубликованнуюMarcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982), в которой описаны фармакокинетические параметры, такие как периоды полувыведения t-альфа и t-бета и площадь под кривой (AUC). Определения периода полувыведения и AUC представлены выше. В одном воплощении в настоящем изобретении предложены лиганд (например, полипептид, вариабельный домен, антагонист, полиспецифический лиганд) или композиция, содержащая лиганд в соответствии с изобретением, имеющие период полувыведения t в диапазоне от 15 мин или более. В одном воплощении нижний предел диапазона составляет 30, 45 мин, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 или 12 ч. Дополнительно или альтернативно, лиганд или композиция в соответствии с изобретением имеют период полувыведения t в диапазоне вплоть до и включая 12 ч. В одном воплощении верхний предел диапазона составляет 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 ч. Пример подходящего диапазона составляет от 1 до 6 ч, от 2 до 5 ч или от 3 до 4 ч. В одном воплощении в настоящем изобретении предложен лиганд (например, полипептид, вариабельный домен, антагонист, полиспецифический лиганд) или композиция, содержащая лиганд в соответствии с изобретением, имеющие период полувыведения t в диапазоне от примерно 2,5 ч или более. В одном воплощении нижний предел диапазона составляет примерно 3 ч, примерно 4 ч, примерно 5 ч,примерно 6 ч, примерно 7 ч, примерно 10 ч, примерно 11 ч или примерно 12 ч. Дополнительно или альтернативно, лиганд или композиция в соответствии с изобретением имеют период полувыведения t вплоть до и включая 21 сутки. В одном воплощении верхний предел диапазона составляет примерно 12 ч, примерно 24 ч, примерно 2 суток, примерно 3 суток, примерно 5 суток, примерно 10 суток, примерно 15 суток или примерно 20 суток. В одном воплощении лиганд или композиция в соответствии с изобретением будут иметь период полувыведения t в диапазоне от примерно 12 до примерно 60 ч. В другом воплощении он будет находиться в диапазоне от примерно 12 до примерно 48 ч. В другом воплощении он будет находиться в диапазоне от примерно 12 до примерно 26 ч. Дополнительно или альтернативно к вышеприведенным критериям, в настоящем изобретении предложен лиганд или композиция, содержащая лиганд в соответствии с изобретением, имеющие значение AUC (площадь под кривой) в диапазоне от примерно 1 мгмин/мл или более. В одном воплощении нижний предел диапазона составляет примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 30,примерно 100, примерно 200 или примерно 300 мгмин/мл. Дополнительно или альтернативно, лиганд или композиция в соответствии с изобретением имеют AUC в диапазоне вплоть до примерно 600 мгмин/мл. В одном воплощении верхний предел диапазона составляет примерно 500, примерно 400,примерно 300, примерно 200, примерно 150, примерно 100, примерно 75 или примерно 50 мгмин/мл. В одном воплощении лиганд в соответствии с изобретением имеет AUC в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из следующих диапазонов: от примерно 15 до примерно 150 мгмин/мл, от примерно 15 до примерно 100 мгмин/мл, от примерно 15 до примерно 75 мгмин/мл и от примерно 15 до примерно 50 мгмин/мл. Полипептиды и dAbs по изобретению и антагонисты, содержащие их, можно отформатировать для получения большего гидродинамического размера, например, посредством присоединения ПЭГ группы,сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей мере, его трансферрин-связывающего участка, Fc-области антитела или путем конъюгирования с доменом антитела. Например, полипептиды dAbs и антагонисты, отформатированные в виде большего антиген-связывающего фрагмента антитела или в виде антитела (например, в формате Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv). Гидродинамический размер лигандов (например, dAb мономеров и мультимеров) по изобретению можно определить с использованием способов, которые хорошо известны в данной области. Например,гель-фильтрационную хроматографию можно использовать для определения гидродинамического размера лиганда. Подходящие гель-фильтрационные матрицы для определения гидродинамических размеров лигандов, такие как сшитые агарозные матрицы, хорошо известны и легко доступны. Размер формата лиганд (например, размер ПЭГ группировки, присоединенной к dAb мономеру) может варьироваться в зависимости от желаемого применения. Например, если предполагается, что лиганд должен покинуть кровообращение и проникнуть в периферические ткани, то желательно поддерживать небольшой гидродинамический размер лиганда для облегчения просачивания из кровотока. Альтернативно, если желательно, чтобы лиганд оставался в системном кровообращении в течение более длительного периода времени, то размер лиганда может быть увеличен, например, посредством форматирования в виде Ig-подобного белка. Увеличение периода полувыведения посредством нацеливания на антиген или эпитоп, который увеличивает период полувыведения in vivo Гидродинамический размер лиганда и его период полувыведения из сыворотки можно также увеличить посредством конъюгации или ассоциации TNFR1-связывающего полипептида, dAb или антагониста по изобретению со связывающим доменом (например, антителом или фрагментом антитела), который связывает антиген или эпитоп, который увеличивает период полувыведения in vivo, как описано в данной заявке. Например, TNFR1-связывающий агент (например, полипептид) может быть конъюгирован или связан с антителом или фрагментом антитела против сывороточного альбумина или против неонатального Fc-рецептора, например, dAb, Fab, Fab' или scFv против SA или против неонатального Fcрецептора, или с аффителом против SA или аффителом против неонатального Fc-рецептора, или авимером против SA, или анти-SA-связывающим доменом, который содержит каркас, выбранный, но не огра- 21022898 ничивающийся этим, из группы, состоящей из CTLA-4, липокалина, SpA, аффитела, авимера, GroE1 и фибронектина (см. WO 2008096158 для описания этих связывающих доменов, которые вместе с их последовательностями включены в данную заявку посредством ссылки и составляют часть настоящего описания). Конъюгирование относится к композиции, содержащей полипептид, dAb или антагонист по изобретению, которые связаны (ковалентно или нековалентно) со связывающим доменом, который связывает сывороточный альбумин. Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения in vivo, включают, например, белки слияния лиганда, специфичного к рецептору трансферрина, и нейрофармацевтического агента(см. патент США 5977307, идеи которого включены в данную заявку посредством ссылки), рецептор эндотелиальных клеток капилляров головного мозга, трансферрин, рецептор трансферрина (например,растворимый рецептор трансферрина), инсулин, рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF 1),рецептор инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF 2), рецептор инсулина, фактор X свертывания крови,1-антитрипсин и HNF 1 (гепатоцитарный ядерный фактор 1). Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки, также включают гликопротеин альфа-1 (орозомукоид; AAG), антихимотрипсин альфа-1 (ACT), микроглобулин альфа-1 (белок НС; AIM), антитромбин III(МВР), миоглобин (Муо), преальбумин (транстиретин; PAL), ретинол-связывающий белок (RBP) и ревматоидный фактор (RF). Подходящие белки из внеклеточного матрикса включают, например, коллагены, ламинины, интегрины и фибронектин. Коллагены являются основными белками внеклеточного матрикса. В настоящее время известно примерно 15 типов молекул коллагена, обнаруженных в различных частях тела, например коллаген I типа (составляет 90% коллагена тела), обнаруженный в костях, коже, сухожилиях, связках, роговице, внутренних органах, или коллаген II типа, обнаруженный в хряще, межпозвоночном хряще, хорде и стекловидном теле глаза. Подходящие белки из крови включают, например, белки плазмы крови (например, фибрин, -2 макроглобулин, сывороточный альбумин, фибриноген (например, фибриноген А, фибриноген В), сывороточный амилоидный белок А, гаптоглобин, профилин, убиквитин, утероглобулин и -2 микроглобулин), ферменты и ингибиторы ферментов (например, плазминоген, лизоцим, цистатин С,альфа-1-антитрипсин и панкреатический ингибитор трипсина), белки иммунной системы, такие как иммуноглобулиновые белки (например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, легкие цепи иммуноглобулинов (каппа/лямбда, транспортные белки (например, ретинол-связывающий белок, -1 микроглобулин), дефензины (например, бета-дефензин 1, дефензин 1 нейтрофилов, дефензин 2 нейтрофилов и дефензин 3 нейтрофилов) и тому подобное. Подходящие белки, обнаруженные в гематоэнцефалическом барьере или в нервной ткани, включают, например, рецептор меланокортина, миелин, аскорбатный транспортер и тому подобное. Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки in vivo, также включают белки, локализованные в почках (например, полицистин, коллаген IV типа, органический анионный транспортер KI, антиген Хейманна), белки, локализованные в печени (например, алкогольдегидрогеназу, G250), белки, локализованные в легких (например, секреторный компонент, который связывает IgA), белки, локализованные в сердце (например, HSP 27, который ассоциирован с дилатационной кардиомиопатией), белки, локализованные в коже (например, кератин), специфические белки костей,такие как морфогенетические белки (BMPs), которые являются подгруппой суперсемейства белков трансформирующего фактора роста, которые демонстрируют остеогенную активность (например, ВМР 2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-8), опухолеспецифические белки (например, антиген трофобласта, рецептор герцептина, рецептор эстрогена, катепсины (например, катепсин В, которые можно обнаружить в печени и селезенке. Подходящие специфические для заболевания белки включают, например, антигены, экспрессирующиеся только на активированных Т-клетках, включая LAG-3 (ген активации лимфоцитов), остеопротегериновый лиганд (OPGL; см. Nature 402, 304-309 (1999, OX40 (член семейства рецепторов TNF, экспрессирующийся на активированных Т-клетках и, в частности, активирующийся в клетках, продуцирующих Т-лимфотропный вирус человека I типа (HTLV-I); см. Immunol. 165 (1): 263-70 (2000. Подходящие специфические для заболевания белки также включают, например, металлопротеазы (ассоциированные с артритом/видами рака), включая CG6512 дрозофилы, человеческий параплегин, человеческийFtsH, человеческий AFG3L2, мышиный ftsH; и ангиогенные факторы роста, включая кислотный фактор роста фибробластов (FGF-1), основный фактор роста фибробластов (FGF-2), фактор роста эндотелия сосудов/фактор проницаемости сосудов (VEGF/VPF), трансформирующий фактор роста- (TGF), фактор некроза опухоли-альфа (TNF), ангиогенин, интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-8 (IL-8), тромбоцитарный фактор роста эндотелия (PD-ECGF), плацентарный фактор роста (P1GF), midkine тромбоцитарный фактор роста-ВВ (PDGF) и фракталкин. Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки in vivo, также включают стрессовые белки, такие как белки теплового шока (HSPs). HSPs обычно обнаруживаются внутри клеток. Когда они обнаруживаются вне клеток, то это является показателем того, что клетка умерла, и ее содержимое вылилось. Эта незапрограммированная клеточная гибель (некроз) происходит в результате травмы, заболевания или повреждения, внеклеточные HSPs запускают ответ со стороны иммунной системы. Связывание с внеклеточным HSP может приводить к локализации композиций по изобретению в участке заболевания. Подходящие белки, участвующие в Fc-транспорте, включают, например, рецептор Брамбелла(Brambell) (также известный как FcRB). Этот Fc-рецептор имеет две функции, которые обе являются потенциально полезными для доставки. Функции представляют (1) транспорт IgG от матери к ребенку через плаценту, (2) защиту IgG от деградации, таким образом пролонгирование периода полувыведения из сыворотки. Считается, что рецептор повторно использует IgG из эндосом (см. Holliger et al., Nat Biotechnol 15(7): 632-6 (1997.dAbs, которые связывают сывороточный альбумин В изобретении в одном воплощении предложен лиганд, полипептид или антагонист (например, лиганд с двойной специфичностью, содержащий dAb против TNFR1 (первое dAb, который связывается сTNFR1, и второе dAb, которое связывает сывороточный альбумин (SA), где второе dAb связывает SA сKD, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса, от примерно 1 нМ до примерно 1,примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40,примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 100, примерно 200, примерно 300, примерно 400 или примерно 500 мкМ (т.е. от 10-9 до 510-4 М) или от примерно 100 нМ до примерно 10 мкМ, или от примерно 1 до примерно 5 мкМ, или от примерно 3 до примерно 70 нМ, или от примерно 10 нМ до примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4 или примерно 5 мкМ. Например, от примерно 30 до примерно 70 нМ, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса. В одном воплощении первое dAb (или мономер dAb) связывает SA (например, HSA) с KD, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса, примерно 1, примерно 50, примерно 70, примерно 100, примерно 150,примерно 200, примерно 300 нМ или примерно 1, примерно 2 или примерно 3 мкМ. В одном воплощении для лиганда с двойной специфичностью, содержащего первое dAb против SA и второе dAb к TNFR1,аффинность (например, KD и/или Koff, как измерено методом поверхностного плазмонного резонанса,например, с использованием BiaCore) второго dAb к его мишени составляет от примерно 1 до примерно 100000 раз (например, от примерно 100 до примерно 100000, или от примерно 1000 до примерно 100000,или от примерно 10000 до примерно 100000 раз) аффинности первого dAb для SA. В одном воплощении сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (HSA). Например,первое dAb связывает SA с аффинностью примерно 10 мкМ, в то время как второе dAb связывает свою мишень с аффинностью примерно 100 пМ. В одном воплощении сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (HSA). В одном воплощении первое dAb связывает SA (например, HSA) с KD примерно 50, например, примерно 70, примерно 100, примерно 150 или примерно 200 нМ. Подробности о лигандах с двойной специфичностью можно найти в WO 03002609, WO 04003019, WO 2008096158 и WO 04058821. В одном воплощении лиганды по изобретению могут включать dAb, которое связывает сывороточный альбумин (SA) с KD, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса, от примерно 1 нМ до примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40, примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 100, примерно 200, примерно 300, примерно 400 или примерно 500 мкМ (т.е. от примерно 10-9 до примерно 510-4 М) или от примерно 100 нМ до примерно 10 мкМ, или от примерно 1 до примерно 5 мкМ, или от примерно 3 до примерно 70 нМ, или от примерно 10 нМ до примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4 или примерно 5 мкМ. Например, от примерно 30 до примерно 70 нМ, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса. В одном воплощении первое dAb (или мономер dAb) связывает SA (например, HSA) с KD, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса, примерно 1, примерно 50, примерно 70, примерно 100, примерно 150, примерно 200, примерно 300 нМ или примерно 1, примерно 2 или примерно 3 мкМ. В одном воплощении первое и второе dAbs связаны с помощью линкера, например линкера из 1-4 аминокислот или из 1-3 аминокислот или более чем 3 аминокислот или более чем 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 15 или 20 аминокислот. В одном воплощении более длинный линкер (более 3 аминокислот) используют для увеличения эффективности (KD одного или обоих dAbs в антагонисте). В конкретных воплощениях лигандов и антагонистов dAb связывает человеческий сывороточный альбумин и конкурирует за связывание с альбумином с dAb, выбранным из группы, состоящей изDOM7m-16. В некоторых воплощениях лигандов и антагонистов dAb связывает человеческий сывороточный альбумин и конкурирует за связывание с альбумином с dAb, выбранным из группы, состоящей из MSA16, MSA-26 (см. WO 04003019 относительно описания этих последовательностей и их нуклеиновокис- 23022898 лотных аналогов, которые включены в данную заявку посредством ссылки и являются частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте),(см. WO 2007080392 относительно описания этих последовательностей и их нуклеиновокислотных аналогов, которые включены в данную заявку посредством ссылки и являются частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте; SEQ ID NO в этом параграфе представляют собой последовательности, представленные в WO 2007080392),(см. WO 2008096158 относительно описания этих последовательностей и их нуклеиновокислотных аналогов, которые включены в данную заявку посредством ссылки и являются частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте). Альтернативные названия приведены в скобках после dAb, например, dAb8 имеет альтернативное название, которое представляет собой dAb10, т.е. dAb8 (dAb10). В некоторых воплощениях dAb связывает человеческий сывороточный альбумин и содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью dAb, выбранной из группы, состоящей из DOM7h-11, DOM7h-11-3,DOM7h-11-12, DOM7h-11-15, DOM7h-14, DOM7h-14-10, DOM7h-14-18 и DOM7m-16. В некоторых воплощениях dAb связывает человеческий сывороточный альбумин и содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью dAb, выбранной из группы, состоящей из(SEQ ID NO в этом параграфе представляют собой последовательности, упомянутые в WO 2007080392), Например, dAb, которое связывает человеческий сывороточный альбумин, может содержать аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с DOM7h-11-3 или DOM7h-14-10. Например, dAb, которое связывает человеческий сывороточный альбумин, может содержать аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с(SEQ ID NO в этом параграфе представляют собой последовательности, упомянутые в WO 2007080392), или В некоторых воплощениях dAb связывает человеческий сывороточный альбумин и содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью dAb, выбранной из группы, состоящей из(SEQ ID NO в этом параграфе представляют собой последовательности, упомянутые в WO 2007080392), В более конкретных воплощениях dAb представляет собой VK dAb, которое связывает человеческий сывороточный альбумин и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из(SEQ ID NO в этом параграфе представляют собой последовательности, упомянутые в WO 2007080392), В более конкретных воплощениях dAb представляет собой VH dAb, которое связывает человеческий сывороточный альбумин и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из dAb7h30 иdAb7h31. В более конкретных воплощениях dAb представляет собой dAb7h11 или dAb7h14. В одном примереdAb представляет собой DOM7h-11-3. В другом примере dAb представляет собой DOM7h-14-10. В других воплощениях dAb, лиганд или антагонист связывает человеческий сывороточный альбумин и содержит один, два или три CDRs из любых вышеприведенных аминокислотных последовательностей, например один, два или три CDRs из DOM7h-11-3, DOM7h-14-10, dAb7h11 или dAb7h14. Подходящие VHH верблюдовых, которые связывают сывороточный альбумин, включают описанные в WO 2004/041862 (Ablynx N.V.) и в WO 2007080392 (эти VHH последовательности и их нуклеиновокислотные аналоги включены в данную заявку посредством ссылки и являются частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте), такие как последовательность A (SEQ ID NO: 518), последовательность В (SEQ ID NO: 519), последовательность С (SEQ ID NO: 520), последовательность D (SEQ ID NO: 521), последовательность Е (SEQ ID NO: 522), последовательность F (SEQ ID NO: 523), последовательность G (SEQ ID NO: 524), последовательность Н (SEQ ID NO: 525), последовательность I (SEQ ID NO: 526), последовательность J (SEQ ID NO: 527), последовательность K (SEQ ID NO: 528), последовательность L (SEQ ID NO: 529), последовательность М (SEQ ID NO: 530), последовательность N (SEQ ID NO: 531), последовательность О (SEQ ID NO: 532), последовательность Р (SEQ ID NO: 533), последовательность Q (SEQ ID NO: 534), где эти номера последовательностей соответствуют указанным в WO 2007080392 или WO 2004/041862 (Ablynx N.V.). В некоторых воплощениях VHH верблюдовых связывает человеческий сывороточный альбумин и содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с ALB1, описанной в WO 2007080392 или любой из SEQ IDNO: 518-534, где эти номера последовательностей соответствуют указанным в WO 2007080392 или WO 2004/041862. В некоторых воплощениях лиганд или антагонист содержит dAb против сывороточного альбумина,которое конкурирует с любым dAb против сывороточного альбумина, описанным в данной заявке, за связывание с сывороточным альбумином (например, человеческим сывороточным альбумином). В альтернативном воплощении антагонист или лиганд содержит связывающую группировку, специфичную в отношении SA (например, человеческого SA), где указанная группировка содержит неиммуноглобулиновые последовательности, как описано в WO 2008096158, описание этих связывающих группировок, способы их получения и селекции (например, из различных библиотек) и их последовательности включены в данную заявку посредством ссылки в качестве части раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте). Конъюгирование с группировкой, увеличивающей период полувыведения (например, альбумином) В одном воплощении (одну или более) группировку, увеличивающую период полувыведения (например, альбумин, трансферрин и их фрагменты и аналоги), подвергают конъюгированию или ассоциации с TNFR1-связывающим полипептидом, dAb или антагонистом по изобретению. Примеры подходящих альбумина, фрагментов альбумина или вариантов альбумина для применения в TNFR1 связывающем формате описаны в WO 2005077042, это описание включено в данную заявку посредством ссылки и является частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте. В частности, следующие альбумин, фрагменты альбумина или варианты альбумина можно использовать в настоящем изобретении:SEQ ID NO: 1 (как описано в WO 2005077042, эта последовательность прямо включена в настоящее описание посредством ссылки); фрагмент или вариант альбумина, содержащий или состоящий из аминокислот 1-387 из SEQ ID NO: 1 в WO 2005077042; альбумин, или его фрагмент, или вариант, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) аминокислот 54-61 из SEQ ID NO: 1 в WO 2005077042; (б) аминокислот 76-89 из SEQ ID NO: 1 в WO 2005077042; (в) аминокислот 92-100 из SEQ ID NO: 1 в WO 2005077042; (г) аминокислот 170-176 из SEQ ID NO: 1 в WO 2005077042; (д) аминокислот 247-252 изSEQ ID NO: 1 в WO 2005077042; (л) аминокислот 478-486 из SEQ ID NO: 1 в WO 2005077042; и (м) аминокислот 560-566 из SEQ ID NO: 1 в WO 2005077042. Другие примеры подходящих альбумина, фрагментов и аналогов для применения в TNFR1 связывающем формате описаны в WO 03076567, описание которой включено в данную заявку посредством ссылки и является частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте. В частности, следующие альбумин, фрагменты или варианты можно использовать в настоящем изобретении: человеческий сывороточный альбумин, как описано в WO 03076567, например, на фиг. 3 (информация об этой последовательности прямо включена в настоящее описание посредством ссылки); человеческий сывороточный альбумин (НА), состоящий из одной негликозилированной полипептидной цепи из 585 аминокислот с молекулярной массой согласно формуле 66500 (см. Meloun et al.,FEBS Letters 55: 136 (1975); Behrens et al., Fed. Proc. 34: 591 (1975); Lawn et al., Nucleic Acids Research 9: 6102-6114 (1981); Minghetti et al., J. Biol. Chem. 261: 6141 (1986; полиморфный вариант, или аналог, или фрагмент альбумина, как описано в Weitkamp, et al., Ann.Hum. Genet. 37: 219 (1973); фрагмент или вариант альбумина, как описано в ЕР 322094, например, НА(1-373), НА(1-388), НА(1389), НА(1-369) и НА(1-419) и фрагменты между 1-369 и 1-419; фрагмент или вариант альбумина, как описано в ЕР 399666, например, НА(1-177) и НА(1-200) и фрагменты между НА(1-Х), где X имеет любой номер от 178 до 199. Когда (одну или более) группировку, увеличивающую период полувыведения (например, альбумин,трансферрин и их фрагменты и аналоги), используют для форматирования TNFR1-связывающих полипептидов, dAbs и антагонистов по изобретению, ее можно конъюгировать с использованием любого подходящего способа, например, посредством прямого слияния с TNFR1-связывающей группировкой (например, dAb против TNFR1), например, с использованием единичной нуклеотидной конструкции, которая кодирует слитый белок, где слитый белок кодируется в виде одной полипептидной цепи с группировкой, увеличивающей период полувыведения, локализованной на N- или С-конце относительноTNFR1-связывающей группировки. Альтернативно, конъюгирование может быть достигнуто с использованием пептидного линкера между группировками, например, пептидного линкера, описанного в WO 03076567 или WO 2004003019 (эти описания линкера включены в настоящее описание посредством ссылки для обеспечения примеров применения в настоящем изобретении). Как правило, полипептид,который увеличивает период полувыведения из сыворотки in vivo, представляет собой полипептид, который встречается в природе in vivo и который устойчив к деградации или удалению с помощью эндогенных механизмов, которые удаляют нежелательный материал из организма (например, человека). Например, полипептид, который увеличивает период полувыведения из сыворотки in vivo, можно выбрать из белков внеклеточного матрикса, белков, обнаруженных в крови, белков, обнаруженных в гематоэнцефалическом барьере или в нервной ткани, белков, локализованных в почках, печени, легких, сердце, коже или костях, стрессовых белков, специфических для заболевания белков или белков, вовлеченных вFc-транспорт. В воплощениях изобретения, описанных в данном описании, вместо применения единичного вариабельного домена против TNFR1 ("dAb") в антагонисте или лиганде по изобретению, предполагают,что специалист может использовать полипептид или домен, который содержит одну, или более, или все 3CDRs из dAb по изобретению, которое связывает TNFR1 (например, CDRs, перенесенные на подходящий белковый каркас или скелет, например аффитело, SpA каркас, домен рецептора LDL класса А или доменEGF). Описание, в целом, следует истолковывать соответственно для обеспечения описания антагонистов с использованием таких доменов вместо dAb. В связи с этим см. WO 2008096158 для подробного описания того, как получить различные библиотеки на основании белковых каркасов, селекции и характеристики доменов из таких библиотек, описание которых включено посредством ссылки. Поэтому в одном воплощении антагонист по изобретению содержит единичный вариабельный домен иммуноглобулина или доменное антитело (dAb), которые обладают специфичностью связывания в отношении TNFR1 или определяющих комплементарность участков такого dAb в подходящем формате. Антагонист может представлять собой полипептид, который состоит из такого dAb или состоит, по существу, из такого dAb. Антагонист может представлять собой полипептид, который содержит dAb (илиCDRs из dAb) в подходящем формате, таком как формат антитела (например, IgG-подобный формат,scFv, Fab, Fab', F(ab')2) или лиганд с двойной специфичностью, который содержит dAb, которое связывает TNFR1, и второе dAb, которое связывает другой целевой белок, антиген или эпитоп (например, сывороточный альбумин). Полипептиды, dAbs и антагонисты в соответствии с изобретением можно отформатировать в виде множества подходящих форматов антител, которые известны в данной области, таких как IgG-подобные форматы, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей и/или легких цепей антител, антиген-связывающие фрагменты любого из вышеизложенного (например, Fv-фрагмент (например, одноцепочечный Fv (scFv), дисульфидсвязанный Fv),Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2-фрагмент), единичный вариабельный домен (например, VH, VL), dAb и модифицированные варианты любого из вышеизложенного (например, модифицированные посредством ковалентного присоединения полиалкиленгликоля (например, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, полибутиленгликоля) или другого подходящего полимера). В некоторых воплощениях в изобретении предложен лиганд (например, антагонист против TNFR1),который находится в IgG-подобном формате. Такие форматы имеют стандартную четырехцепочечную структуру молекулы IgG (2 тяжелые цепи и две легкие цепи), в которой одна или более вариабельных областей (VH и/или VL) заменены dAb по изобретению. В одном воплощении каждая из вариабельных областей (2 VH-области и 2 VL-области) заменена dAb или единичным вариабельным доменом, по меньшей мере один из которых представляет собой анти-TNFR1 dAb в соответствии с изобретением. dAb(s) или единичный(е) вариабельный(е) домен(ы), которые включены в IgG-подобный формат, могут иметь одинаковую специфичность или разные специфичности. В некоторых воплощениях IgG-подобный формат представляет собой тетравалент и может иметь одну (только анти-TNFR1), две (например, антиTNFR1 и анти-SA), три или четыре специфичности. Например, IgG-подобный формат может быть моноспецифическим и содержит 4 dAbs, которые имеют одинаковую специфичность; биспецифическим и содержит 3 dAbs, которые имеют одинаковую специфичность, и другое dAb, которое имеет другую специфичность; биспецифическим и содержит два dAbs, которые имеют одинаковую специфичность, и дваdAbs, которые имеют одинаковую специфичность, третье dAb с другой специфичностью и четвертое dAb со специфичностью, отличной от первого, второго и третьего dAbs; или тетраспецифическим и содержит четыре dAbs, каждое из которых имеет разную специфичность. Могут быть получены антигенсвязывающие фрагменты IgG-подобных форматов (например, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, scFv). В одном воплощении IgG-подобные форматы или антиген-связывающие фрагменты могут быть моновалентными в отношении TNFR1. Если желательна активация комплемента и/или функция антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), то лиганд может представлять собой IgG1-подобный формат. При необходимости, IgG-подобный формат может содержать мутантную константную область (вариант константной области тяжелой цепи IgG) для минимизации связывания с Fc-рецепторами и/или способности фиксировать комплемент (см., например, Winter et al., GB 2209757 В; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, December 22, 1994). Лиганды по изобретению (например, полипептиды, dAbs и антагонисты) могут быть отформатированы в виде слитого белка, который содержит первый единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который подвергают слиянию непосредственно со вторым единичным вариабельным доменом иммуноглобулина. При желании, такой формат может дополнительно содержать группировку, увеличивающую период полувыведения. Например, лиганд может содержать первый единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который слит непосредственно со вторым единичным вариабельным доменом иммуноглобулина, который слит непосредственно с единичным вариабельным доменом иммуноглобулина, который связывает сывороточный альбумин. Как правило, ориентация полипептидных доменов, которые имеют связывающий сайт со специфичностью связывания в отношении мишени, независимо от того, содержит ли лиганд линкер, являются вопросом выбора конструкции. Однако некоторые ориентации, с линкерами или без них, могут обеспечивать лучшие характеристики связывания, чем другие ориентации. Все ориентации (например, dAb1 линкер-dAb2; dAb2-линкер-dAb1), охватываемые изобретением, представляющие собой лиганды, которые содержат ориентацию, обеспечивающую желательные характеристики связывания, можно легко идентифицировать посредством скрининга. Полипептиды и dAbs в соответствии с изобретением, включая dAb мономеры, димеры и тримеры,могут быть связаны с Fc-областью антитела, содержащей один или оба Сн 2 и Сн 3 домена и возможно шарнирную область. Например, векторы, кодирующие лиганды, связанные в виде единичной нуклеотидной последовательности с Fc-областью, можно использовать для получения таких полипептидов. Кроме того, в изобретении предложены димеры, тримеры и полимеры вышеупомянутых dAb мономеров. Примеры Биофизические свойства фрагментов антител играют ключевую роль в определении того, можно ли фрагмент антитела разрабатывать в качестве терапевтического агента или нет. Одним из этих биофизических свойств является устойчивость (стабильность) фрагмента антитела к осаждению при хранении. Ускоренное тестирование стабильности представляет собой метод, используемый для оценки стабильности более быстрыми темпами путем инкубации белка при повышенных температурах в течение длительных периодов времени и последующего определения уровня осаждения. Поэтому авторы изобретения охарактеризовали семь dAbs против TNFR1 по их ускоренному тестированию стабильности. В связи с очень разными свойствами (особенно, разными Т.пл.) отдельных исследуемых dAbs, все ускоренные исследования стабильности этих dAbs осуществляли при 40 С. Протокол, используемый для ускоренного тестирования стабильности, следующий: все белки подвергали замене буфера на PBS и доводили до концентрации 1 мг/мл. Четыре аликвоты (соответствующие 4 временным точкам; 0, 2, 23 и 47 ч) по 250 мкл готовили в 0,5-мл эппендорфах. Первые образцы (вре- 28022898 менная точка 47 ч) помещали в сушильный шкаф при температуре 40 С; через 24 ч вторые 250 мкл аликвоты (временная точка 23 ч) помещали в сушильный шкаф; еще через 20 ч третьи 250 мкл аликвоты(временная точка 2 ч) помещали в сушильный шкаф; 0 ч аликвоты хранили при температуре 4 С в течение этого исследования. Все аликвоты хранили при температуре 4 С до тех пор, пока их не помещения в сушильный шкаф при 40 С. В общей сложности через 47 ч все аликвоты удаляли из сушильного шкафа и центрифугировали при 16100g в течение 10 мин. А 280 каждого образца измеряли, используя УФустройство для считывания 96-луночного планшета, чтобы контролировать количество белка, который остался еще в растворе. Эти данные использовали для вычисления концентрации белка для каждого белка в каждой временной точке и их, в свою очередь, наносили на график относительно времени для контроля потери белка с течением времени. Пример 1. Тестирование dAbs против TNFR1 в отношении ускоренной стабильности Для dAbs против NFR1 оценивали шесть родственных dAbs против TNFR1, т.е. DOM1h-574-72,DOM1h-574-109, DOM1h-574-133, DOM1h-574-138, DOM1h-574-156 и DOM1h-574-180, а также неродственное dAb против TNFR1 DOM1h-131-206. Генетические конструкции всех этих dAbs, клонированные с помощью Sall/Notl в pDOM13 (экспрессирующий вектор, происходящий из pBR322), подвергали трансформации в Е. coli HB2151, с последующей экспрессией белка в супернатанте. dAbs очищали из супернатанта посредством одностадийной очистки на Protein-A Streamline (GE Healthcare кат.17-1281-03) с последующей элюцией с помощью 100 мМ глицина рН 2,0 и нейтрализацией 200 мМ трис рН 8. После концентрирования dAbs подвергали замене буфера на PBS посредством диализа и тестировали в отношении ускоренной стабильности при 1 мг/мл. Результаты ускоренной стабильности представлены в табл. 1, в которой приведено количество dAb в растворе в каждой временной точке в виде процента количества dAb, присутствующего при t=0 ч. Таблица 1. Ускоренная стабильность dAbs против TNFR1 при инкубации при 1 мг/мл в PBS при 40 С. Значения представляют количество dAb в растворе в каждой временной точке в виде процента количества dAb, присутствующего при t=0 ч. Анти-TNFR1 dAbs линии DOM1h-574, за исключением DOM1h-574-133, имеют тенденцию осаждаться в течение первых 47 ч, что приводит к существенному снижению количество белка в растворе в этой временной точке. Напротив, анти-TNFR1 dAb DOM1h-131-206 не остается в растворе в течение этого периода времени. Поэтому стабилизация dAb, делающая его более устойчивым к осаждению в исследовании ускоренной стабильности, является полезной. Пример 2. Селекции и скрининг анти-TNFR1 dAb линии DOM1h-574 в отношении улучшенных биофизических свойств Для идентификации новых dAbs с улучшенной устойчивостью к осаждению после инкубации при повышенных температурах конструировали склонные к ошибкам ПЦР-библиотеки на основании пяти анти-TNFR1 dAbs: DOM1h-574-156, DOM1h-574-109, DOM1h-574-138, DOM1h-574-162 и DOM1h-574180. Склонные к ошибкам библиотеки получали с использованием этих клонов в векторе pDOM13 в качестве матрицы и затем подвергали двум раундам склонных к ошибкам ПЦР, используя GeneMorph II(Stratagene, кат.200550). В первом раунде 50 нг вектора амплифицировали в течение 30 циклов в объеме 50 мкл с использованием олигонуклеотидов AS9 и AS339 и следующего профиля амплификации: 2 мин 95 С и затем 30 циклов: 15 с 95 С, 30 с 50 С, 1 мин 72 С и в конце 10 мин 72 С. Во втором раунде 0,4 мкл первого продукта склонной к ошибкам ПЦР реакции использовали в качестве матрицы во втором раунде мутагенеза с GeneMorph II (Strategene) в объеме 200 мкл с использованием гнездовых праймеров AS639 и AS65 и профиля амплификации: 2 мин 95 С и затем 35 циклов: 15 с 95 С, 30 с 50 С, 1 мин 72 С и в конце 10 мин 72 С. ПЦР-продукты очищали на 2% Е-гелях с использованием набора Qiagen Gel Extraction и разрезали с помощью рестриктаз Sall и Notl (NEB). Продукты реакции переваривания пропускали через 2% Е-гель и ДНК-вставки, кодирующие dAb, очищали из Е-гелей с использованием набора Qiagen Gel Extraction. Очищенные вставки лигировали в вектор pDOM33 для фагового дисплея с использованием набора ДНКлигазы Т 4 (NEB): 40 мкл 30 нМ 0,7 мкг/мкл Sall/Notl-разрезанного вектора pDOM33 30 мкл 300 нМ вставки 400 мкл Н 2 О 50 мкл 10 буфер