Способ повышения выхода полипептидов

СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ВЫХОДА ПОЛИПЕПТИДОВ Настоящее изобретение относится к способу повышения выхода белка. Способ включает в себя модифицирование набора релевантных характеристик белка до приведения их в оптимальный диапазон или приближения к оптимальному значению для одной или более характеристик в эукариотическом хозяине. Лаан Ван Дер Ян Метске, Ву Лиан,Раубос Йоханнес Андрис, Пареникова Люси, Лос Алрик Питер, Пейдж Ван Ноэль Николас Мария Элизабет, Пел Херман Ян (NL) Фелицына С.Б. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу повышения выхода полипептидов. В частности, оно относится к повышению выхода полипептидов путм модифицирования остова полипептида. Уровень техники Наблюдаемое в последнее время быстрое развитие секвенирования в геноме и мета-геноме выявило большое число генов, которые представляют собой множество потенциально очень интересных белков. Проблемы с экспрессией этих генов значительно сдерживают изучение функций белков, кодируемых этими генами, и, как следствие этого, тормозят потенциальное использование таких белков в экономике. Поскольку во многих случаях вновь открытые гены происходят из организмов, которые в меньшей степени пригодны для крупномасштабного производства или с которыми невозможно работать, используя существующие генно-инженерные методики, чрезвычайно желательно использование общепринятых хозяев-продуцентов, для которых имеются системы переноса генов и разработаны инструменты генной инженерии. В частности, эукариоты, такие как мицелиальные грибы и дрожжи, широко используются как клеточные фабрики в производстве белков, в частности в производстве внеклеточных белков. По причине длительной традиции использования этих видов некоторые из них обычно считаются безопасными (GRAS), что делает их весьма перспективными для производства продуктов, потребляемых человеком. Однако, несмотря на значительные усовершенствования, уровни продукции гетерологичных генов часто оказываются намного ниже, чем наблюдаемые для гомологичных генов. Часто же экспрессия белка отсутствует вообще. Существуют различные способы для повышения уровней продукции белков. Они включают в себя применение сильных промоторов, повышение числа копий, оптимальной последовательности Kozak,стабилизирующих мРНК элементов, использование оптимизированных кодонов (WO 2008/000632) и генов. Однако эти стратегии обычно не гарантируют того, что белки могут продуцироваться на детектируемых уровнях. К настоящему времени наиболее успешный подход к продуцированию гетерологичных белков состоит в их экспрессии в виде трансляционно слитого белка с каким-либо эффективно секретеруемым гомологичным белком. Тем не менее уровни продукции вс ещ значительно отстают и во многих случаях уровни экспрессии проблематично низкие. Низкие уровни экспрессии в процессе ферментации приводят к пониженному выходу продукта при восстановлении. Даже если экспрессия оптимизирована, конечный зрелый белковый продукт может вс ещ продуцироваться с очень низкими выходами из-за больших потерь при последующей обработке. Это может иметь место тогда, когда экспрессированный белок остатся связанным с биомассой. Результатом этого являются большие потери или, в альтернативном случае, требуется использование дорогостоящих и, в некоторых случаях, нежелательных детергентов для солюбилизации белков. Краткое описание фигур Фиг. 1 изображает плазмидную карту вектора экспрессии pKLPGE дикого типа у K.lactis (конструирование описано в примере 1). На фиг. 1 приводится также репрезентативная карта для других плазмид, экспрессирующих pKLPGE. Указаны промотор LAC4, относящийся к PGE-кодирующему гену, и кассета селекционного маркра amdS. ДНК Е. coli может удаляться путм предшествующего трансформации расщепления с помощью рестрикционного фермента SacII. Фиг. 2 изображает плазмидную карту вектора экспрессии pANPGE-3 (конструирование описано в примере 2). На фиг. 2 приводится также репрезентативная карта для других плазмид, экспрессирующихpANPGE. Кроме того, здесь же указаны последовательности промотора GlaA и укороченного GlaA, а также PGE-кодирующие последовательности, которые кодируют вариантные ферменты PGE в соответствии со способом изобретения. ДНК Е. coli может удаляться путм расщепления с помощью рестрикционного фермента NotI до трансформации штаммов A.niger. Фиг. 3 изображает плазмидную карту вектора экспрессии pGBFINZDU дикого типа (конструирование описано в примере 1). На фиг. 3 приводится также репрезентативная карта для других pGBFINZDU-,pGBFINZTB- и pGBFINZTC-плазмид. Указаны glaA-фланкирующие области по отношению к кассете селекционного маркра amdS. Кроме того, здесь же указаны последовательности промотора GlaA и последовательности ZDU, ZTB и ZTC, кодирующие варианты ферментов в соответствии со способом изобретения. ДНК Е. coli может удаляться путм расщепления с помощью рестрикционного фермента NotI до трансформации штаммов A.niger. Фиг. 4 - анализ SDS-ПААГ и вестерн-блот анализ WT6 PGE-мутантных трансформантов A.nigerpANPGE12 16 (А) и pANPGE1330 (В). Проанализированы супернатанты культур на второй день (D2) и третий день (D3). Горизонтальные линии при 14 и 97 кДа приводятся для сопоставления SDS-ПААГ и вестерн-блота. Размер маркра с левой стороны соответствует окрашенному SDS-ПААГ-маркру, а маркр на правой стороне соответствует вестерн-блот-маркру. Фиг. 5 иллюстрирует хитиназную активность в культуральном бульоне штаммов A.niger после 3 дней ферментации, экспрессирующей различные ZDU-конструкты, под контролем промотора glaA. Показана хитиназная активность в культуральном бульоне штаммов A.niger, экспрессирующие вариантыSDU-конструктов, в которых были модифицированы сигнальная последовательность, N-конец и конструкции белков. Детали, касающиеся различных конструктов, представлены в табл. 6. Относительные активности хитиназ представлены в виде измерений оптической плотности при 590 нм. Из всех указанных групп трансформантов три трансформанта были выделены и независимо культивированы. Фиг. 6 изображает SDS-ПААГ-анализ культурального бульона штаммов A.niger WT6 и ZDU после 7 дней ферментации, экспрессирующих варианты ZDU-конструктов под контролем промотора glaA. Детали, касающиеся различных конструктов и экспрессированных белков ZDU, представлены в табл. 6. Из всех указанных групп трансформантов три трансформанта были выделены и независимо культивированы. Фиг. 7 изображает SDS-ПААГ-анализ культурального бульона штаммов A.niger WT6 и ZTB после 4 дней ферментации, экспрессирующих варианты ZTB-конструктов, под контролем промотора glaA. Детали, касающиеся различных конструктов и экспрессированных белков ZTB, представлены в табл. 7. Из всех указанных групп трансформантов три трансформанта были выделены и независимо культивированы. Фиг. 8 изображает SDS-ПААГ-анализ культурального бульона штаммов A.niger WT6 и ZTC после 5 дней ферментации, экспрессирующих варианты ZTC-конструктов, под контролем промотора glaA. Детали, касающиеся различных конструктов и экспрессированных белков ZTB, представлены в табл. 8. Из всех указанных групп трансформантов ZTC дикого типа три трансформанта были выделены и независимо культивированы, из других двух типов штаммов два штамма. Фиг. 9 изображает локальные характеристики белков. Идентификационные номера последовательностей (SEQ ID)SEQ ID NO: 1: оптимизированная по парам кодонов кДНК преджелудочной эстеразы (PGE), процессированная, т.е. не имеющая части, кодирующей сигнальную последовательность.SEQ ID NO: 2: белок преджелудочной эстеразы (PGE) телнка, включающий сигнальную последовательность.SEQ ID NO: 3: ДНК PGE, оптимизированный по характеристикам белок (PFO, ОБХ), вариант KL8,добавлен 1 дополнительный сайт гликозилирования.SEQ ID NO: 19: ДНК хитиназа вариант ZDU-6.SEQ ID NO: 20: белок хитиназа вариант ZDU-6.SEQ ID NO: 21: ДНК хитиназа вариант ZDU-7.SEQ ID NO: 22: белок хитиназа вариант ZDU-7.SEQ ID NO: 29: ДНК эндоглюканаза вариант ZTC-5.SEQ ID NO: 30: белок эндоглюканаза вариант ZTC-5. Подробное описание Настоящее изобретение относится к способу улучшения секретирования целевого полипептида эукариотической клеткой-хозяином путм модифицирования значения набора релевантных характеристик белка в аминокислотном остове полипептида до приведения их в оптимальный диапазон или приближения к оптимальному значению для одной или более характеристик в эукариотическом хозяине. Одним из преимуществ является то, что белки с представляющими интерес функциями, которые до этого момента не секретировались или же секретировались в столь малых количествах, что промышленное применение было бесперспективным, теперь становятся доступными для промышленных процессов,благодаря их улучшенной секреции. Другое преимущество состоит в том, что последующая обработка и выделение полипептидов облегчаются благодаря тому, что сконструированные полипептиды уже отделены от биомассы. В настоящем контексте характеристиками белка являются свойства, которые могут быть расчтным путм вычислены, основываясь на аминокислотной последовательности белка и последовательности ДНК. Модифицирование полипептида в данном случае определяется как любое событие, приводящее к изменению в аминокислотной последовательности полипептида. Модифицирование следует понимать как один или более актов модификации. Модификация может быть осуществлена путм ввода (инсерции), замещения или удаления (делеции) одной или более аминокислот в полипептидном остове. В настоящем контексте термин секреция относится к появлению полипептида во внеклеточной среде, как правило, среде для роста, или для продукции. Полипептид, который секретируется, свободен от биомассы. Уровень секреции можно измерять известными в данной области методами, включая анализы активности (в единицах активности), удельную активность (в единицах на вес белка), количественный ПААГ-анализ, количественную масс-спектрометрию и анализы с использованием антител. Выражение улучшение секреции полипептида подразумевает увеличение количества полипептида, который секретируется во внеклеточную среду клетки. Об улучшении может свидетельствовать тот факт, что полипептид, который нормальным образом не секретируется, например, внутриклеточный полипептид, начинает секретироваться. Улучшение может также состоять в том, что начинает секретироваться полипептид, который, как полагают, должен секретироваться, например, потому что он содержит сигнальную последовательность, и который не секретировался. Улучшение измеряют в сравнении с идентичным хозяину генетическим окружением и идентичными условиями культивирования и ферментации. В этих случаях об улучшенной секреции может свидетельствовать, например, появление полосы белка в полиакриламидном геле, в котором до улучшения такая полоса не наблюдалась. В альтернативном случае улучшение может проявляться в том, что секретируемый в очень малых количествах полипептид обнаруживает повышенные уровни секреции. В одном из вариантов осуществления количество секретируемого пептида определяют, измеряя активность полипептида во внеклеточной среде. По сравнению с ситуацией до улучшения активность во внеклеточной среде может быть повышена на по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20%. Предпочтительно активность повышается на по меньшей мере 25%,по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35% или на по меньшей мере 40%. В более предпочтительном варианте осуществления активность повышается на по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 500% или по меньшей мере 1000%. Активность может повышаться от отсутствия активности до какой-либо активности во внеклеточной среде. В способе изобретения может быть использована любая эукариотическая клетка. Предпочтительно эукариотической клеткой является клетка млекопитающего, насекомого, растения, гриба или водоросли. Предпочтительные клетки млекопитающих включают в себя, например, клетки яичников китайского хомяка (СНО), клетки линии COS, 293 клетки, клетки PerC6 и гибридомы. Предпочтительные клетки насекомых включают в себя, например, клетки Sf9 и Sf21 и их производные. Более предпочтительно,чтобы эукариотической клеткой была грибная клетка, т.е. дрожжевая клетка, такая как клетка штаммовCandida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, или Yarrowia. Более предпочтительно из Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica и Pichiapastoris, или клетка мицелиальных грибов. Более предпочтительно, чтобы эукариотической клеткой была клетка мицелиальных грибов. Мицелиальные грибы включают в себя все филаментные (нитчатые формы отделов Eumycota иFungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK). Мицелиальные грибы характеризуются стенкой мицелия, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Их вегетативный рост осуществляется путем удлинения гифов, а углеродный катаболизм является облигатно-аэробным. Штаммы мицелиальных грибов включают в себя (но не ограничиваются ими) Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora,Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus,Thielavia, Tolypocladium и Trichoderma. Предпочтительные клетки мицелиальных грибов принадлежат к видам Aspergillus, Chrysosporium,Penicillium, Talaromyces или Trichoderma genus, наиболее предпочтительно к виду Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Trichoderma reesei или Penicillium chrysogenum. Если клет-3 021205 кой-хозяином согласно изобретению является клетка-хозяин Aspergillus, то предпочтительно клеткойхозяином является CBS 513.88 или е производное. Некоторые штаммы мицелиальных грибов являются общедоступными в ряде коллекций культур,таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС), Германское собрание микроорганизмов и клеточных культур GmbH (DSM), Central bureau voor schimmelcultures, CBS (Центральное бюро плесневых культур) и коллекция сельскохозяйственных культур Agricultural Research Service Patent Culture Collection (Northern Regional Research Center, NRRL): Aspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, P. chrysogenumATCC 56765, или ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense ATCC44006 и их производные. В одном из вариантов осуществления изобретения использованы A.niger или K.lactis. В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка является клеткой-хозяином, в которой полипептид продуцируется с помощью рекомбинантной технологии. Подходящие методы трансформации или трансфекции клеток-хозяев можно найти в Лабораторном руководстве по молекулярному клонированию Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), в базовых методах в молекулярной биологии Davis et al. (Basic Methods in Molecular Biology (1986 и в других лабораторных руководствах. Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу продуцирования целевого полипептида путм применения способа согласно изобретению для улучшения секретирования полипептида для случая целевого полипептида и продуцированию полипептида, модифицированного согласно изобретению с помощью рекомбинантной технологии. Настоящее изобретение также относится к указанному полипептиду, полученному рекомбинантным путем. Настоящее изобретение относится также к полипептиду, который может быть получен способом по изобретению для улучшения секреции полипептида. Предпочтительно указанный полипептид получают способом согласно изобретению с целью улучшения секреции этого полипептида. Целевой полипептид, секрецию которого улучшают согласно способу изобретения, может быть любым полипептидом, обладающим представляющей интерес биологической активностью. Полипептидом может быть коллаген или желатин, или же их вариант или гибрид. Полипептидом может быть антитело или его части, антиген, коагулирующий фактор, фермент, гормон или вариант гормона, рецептор или его части, регуляторный белок, структурный белок, репортерный белок или транспортный белок,такой как сывороточный альбумин, например бычий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин человека, или такой как трансферрин, например лактоферрин, белок, принимающий участие в процессе секреции, белок, принимающий участие в процессе укладки (фолдинга), шаперон, пептидный переносчик аминокислот, фактор гликозилирования, транскрипционный фактор, синтетический пептид или олигопептид, белок, который в нативной форме является внутриклеточным белком и секретируется с помощью методов, известных в данной области техники, например путм слияния с сигнальным пептидом и слияния с полипептидом, который секретируется в своей нативной форме. Таким внутриклеточным белком может быть фермент, такой как протеаза, церамидазы, эпоксил-гидролаза, аминопептидаза, ацилазы,альдолаза, гидроксилаза, аминопептидаза, липаза. Полипептидом может быть фермент, секретируемый внеклеточно в своей нативной форме. Такие ферменты могут принадлежать к группам оксидоредуктазы,трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы, каталазы, целлюлазы, хитиназы, кутиназы, дезоксирибонуклеазы, декстраназы, эстеразы. Ферментом может быть карбогидраза, например целлюлазы, такие как эндоглюканазы, -глюканазы, целлобиогидролазы или -глюкозидазы, гемицеллюлазы, или пектинолитические ферменты, такие как ксиланазы, ксилозидазы, маннаназы, галактаназы, галактозидазы,пектин-метилэстеразы, пектинлиазы, пектатлиазы, эндо-полигалактуроназы, экзо-полигалактуроназы,рамногалактуроназы, арабаназы, арабинофуранозидазы, арабиноксилан-гидролазы, галактуроназы, лиазы, или амилолитические ферменты; гидролаза, изомераза, или лигаза, фосфатазы, такие как фитазы, эстеразы, такие как липазы, протеолитические ферменты, оксидоредуктазы, такие как оксидазы, трансферазы или изомеразы. Ферментом может быть фитаза. Ферментом могут быть аминопептидаза, аспарагиназа, амилаза, карбогидраза, карбоксипептидаза, эндо-протеаза, металло-протеаза, серин-протеаза, каталаза, хитиназа, кутиназа, циклодекстрин-гликозилтрансфераза, дезоксирибонуклеаза, эстераза, галактозидаза, -галактозидаза, глюкоамилаза, -глюкозидаза, -глюкозидаза, галопероксидаза, протеиндезаминаза, инвертаза, лакказа, липаза, маннозидаза, мутаназа, оксидаза, пектинолитический фермент,пероксидаза, фосфолипаза, полифенолоксидаза, рибонуклеаза, трансглутаминаза, или глюкозоксидаза,гексозоксидаза, монооксигеназа. Полипептид с улучшенным секретированием может быть гомологичным или гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. Подходящим примером гомологичного полипептида является белок Aspergillus niger, который клонируется в и продуцируется при помощи Aspergillus niger. Подходящие примеры гетерологичной экспрессии включают бактериальный полипептид, например из Е. coli или Bacillus, клонируемые в и продуцируемые мицелиальным грибом или дрожжами,-4 021205 или белок млекопитающего, например быка или козла, который клонируется в и продуцируется мицелиальным грибом или дрожжами, или полипептид из мицелиального гриба, который клонируется в и продуцируется дрожжами, или белок из мицелиального гриба, который клонируется в и продуцируется другим грибом. Кодирующие полипептиды нуклеиновые кислоты предпочтительно оптимизируют, например, путм оптимизации пары кодонов, для экспрессии в релевантной клетке-хозяине. Оптимизация пары кодонов является методом, в котором кодирующие полипептид нуклеотидные последовательности модифицированы, учитывая использование кодонов, в частности пар кодонов, которые используются для получения улучшенной экспрессии кодирующей полипептид нуклеотидной последовательности и/или повышенной продукции кодируемого полипептида. Пары кодонов определяют как набор из двух последовательных триплетов (кодонов) в кодирующей последовательности. Оптимизация пары кодонов проводится предпочтительно так, как описано в WO 2008/000632. Предпочтительно специфичность модифицированного полипептида в существенной степени та же,что и до улучшения секреции. Это означает, например, что в существенной степени сохраняется специфичность к субстрату, или специфичность связывания. В данном контексте выражение в существенной степени сохраняется означает, что сохраняется более 60%, более 70% или более 75% специфичности. Предпочтительно сохраняется более 80, 85 или 90% специфичности. Наиболее предпочтительно, чтобы сохранялось более 95, 96, 97, 98 или 99% специфичности. Согласно способу изобретения уровень активности во внеклеточной среде повышается, что является показателем улучшенной секреции. Однако специфическую активность модифицированного полипептида не следует повышать, если она не начнет снижаться. Иными словами, специфическая активность является предпочтительно в существенной степени такой же или более высокой, чем до улучшения секреции. В предпочтительном варианте осуществления специфическая активность является в существенной степени такой же, как и до улучшения секреции. В данном контексте в существенной степени такой же уровень активности предполагает уровень активности, который отличается менее чем на 15%, предпочтительно менее чем на 12% или менее чем на 10%, предпочтительно менее чем на 8%, менее чем на 6% или менее чем на 4% от уровня активности исходного полипептида. В настоящем контексте термины полипептид и белок используются взаимозаменяемым образом. С помощью данного способа изобретения можно улучшать секрецию полипептидов любого типа. В одном из предпочтительных вариантов осуществления полипептидом является любой из приведнного выше списка. Согласно способу по изобретению значение ряда релевантных характеристик белка в аминокислотном остове модифицируется так, чтобы оно оказалось в оптимальном диапазоне или приблизилось к оптимальному значению для одной или более характеристик белка у эукариотического хозяина. Степень изменения характеристик белка между модифицированным полипептидом и полипептидом сравнения может быть определена двумя путями: как относительное улучшение (RI) и нормализованное относительное улучшение (RIN).RI характеристики белка определяется как абсолютное отклонение (D) характеристики белка от оптимального значения где,FPOI обозначает значение характеристики целевого белка, будучи либо референсным значением, либо PFO (ОБХ), a FOPT является оптимальным значением характеристик.RIN определяется как приведнное отклонение (DN), дающее понятие о том, какие характеристики имеют существенное значение. DN учитывает верхнюю границу (UB) и нижнюю границу (LB) значения характеристики (см. табл. 1). где если если Согласно способу изобретения в полипептидный остов вносятся модификации. В данном контексте термин остов относится к упорядоченной структуре, которая образуется, когда аминокислоты соединяются одна с другой через пептидные связи и образуют последовательность ковалентно связанных аминокислот. В настоящем изобретении предпочтительно осуществляется модифицирование остова зрелого полипептида. В контексте настоящего изобретения зрелый полипептид определяется как полипептид,находящийся в своей конечной функциональной форме после трансляции и посттрансляционного моди-5 021205 фицирования, такого как N-концевой процессинг, С-концевое укорочение, гликозилирование, фосфорилирование и т.д. Полипептид до модифицирования называют исходным, референсным или диким типом(WT) полипептида, чтобы отличить его от образованного из него модифицированного полипептида. Термины исходный, дикого типа и референсный полипептид используются в тексте взаимозаменяемым образом. Когда полипептидом является химерный полипептид, т.е. трансляционно слитый с эффективно секретируемым полипептидом, предпочтительно полипептидом, являющимся нативным для клетки-хозяина, весь химерный полипептид целиком может быть модифицирован согласно изобретению. Если химерный полипептид содержит эффективно секретируемый полипептид в качестве лидерного полипептида, слитого с целевым полипептидом, целевой полипептид предпочтительно является модифицированным. Как известно специалистам в данной области, в результате ошибок процессинга в процессе созревания возможна гетерогенность N-конца зрелого полипептида, так же как и С-конца зрелого полипептида. В частности, такие ошибки процессинга могут происходить при сверхэкспресии полипептида. Кроме того, к гетерогенности может приводить экзо-протеазная активность. Степень, до которой может доходить гетерогенность, зависит также от хозяина и используемых протоколов ферментации. Такие артефакты N-концевого и С-концевого процессинга могут давать более короткие или более длинные полипептиды по сравнению с ожидаемым зрелым полипептидом. В одном из вариантов осуществления способ включает в себя(i) определение оптимального диапазона и оптимального значения для одной или более характеристики белка у эукариотического хозяина;(ii) определение набора релевантных характеристик белка у эукариотического хозяина, которые должны улучшить секрецию полипептида эукариотическим хозяином, если одна или более из этих релевантных характеристик модифицирована в аминокислотном остове полипептида;(iii) модифицирование значения релевантных характеристик белка до приведения их в оптимальный диапазон или приближения к оптимальному значению, определнному в (i), причм (i) и (ii) могут выполняться в любом порядке. Для определения набора релевантных характеристик может быть использован любой метод. В одном из вариантов осуществления релевантный набор характеристик для улучшения секреции полипептида определяется следующим образом:(i) сбор или создание набора данных S, который содержит данные об уровне секреции подходящего количества белков у некоторого эукариотического хозяина и аминокислотные и ДНК-последовательности этих белков. Набор данных S может содержать секретируемые белки (S+). Предпочтительно набор данных S содержит также и несекретируемые белки (S-). Например, можно экспрессировать все предсказанные секретируемые белки у A.niger (Tsang et al., 2009, Fungal Genetics and Biology, 46: S153-160). Секретируемые белки принадлежат к набору S+, а несекретируемые белки принадлежат к набору S-. Для измерения уровня секретирования может быть использован любой метод. Альтернативным образом, набор S- может содержать несекретируемые белки, которые, как известно из литературы, содержатся в эукариотическом хозяине. Белки из S могут быть гомологичными или гетерологичными по отношению к эукариотическому хозяину;(ii) расчт характеристик белка (F) для всех белков в наборе данных S. F может основываться как на последовательности ДНК, так и на аминокислотной последовательности этих белков;(iii) использование методов статистической классификации для выбора поднабора характеристик белка, рассчитанных в (ii) (Fs), которое дат наилучшую эффективность статистического классификатора для различения S+ и S-, согласно должным образом определнному критерию эффективности классификатора. Fs может выводиться как из последовательности ДНК (FsDNA), так и из аминокислотной последовательности (FsAA). Характеристики белка в FsAA являются релевантными характеристиками для модифицирования с целью улучшения секреции белка у соответствующего эукариотического хозяина. Поскольку остов зрелого полипептида модифицируется предпочтительно согласно способу изобретения, характеристики белка рассчитываются предпочтительно на основе ряда зрелых белков. Могут использоваться хорошо известные в практике стандартные методы статистической классификации, такие как линейный дискриминантный классификатор (LDC), квадратичный дискриминантный классификатор (QDC), классификатор по ближайшему среднему (NMC), 1-/k-классификаторы по ближайшему соседу, машина поддерживающих векторов и дерево альтернатив и т.д. (Webb, Statistical PatternRecognition, 2nd ed, John Wileysons). В случае применения таких методов, набор данных может быть разделн на подготовительный набор данных и подтверждающий набор данных и при этом могут использоваться хорошо известные в практике проверочные схемы (такие как 10-кратная перекрстная проверка). Могут использоваться любые известные в практике критерии эффективности классификатора, например специфичность, чувствительность, корректность, прецизионность, а также площадь под кривой рабочей характеристики примного устройства (ROC). Может быть использован любой подходящий метод определения оптимального диапазона или оптимального значения характеристик белка. В одном из вариантов осуществления оптимальный диапазон или оптимальное значение характеристик белка для эукариотического хозяина определяются следующим образом:i) сбор или создание набора данных S, который содержит данные об уровне секреции подходящего количества белков у определенного эукариотического хозяина и аминокислотные и ДНКпоследовательности этих белков. Набор данных S может содержать секретируемые белки (S+). Предпочтительно набор данных S содержит также и несекретируемые белки (S-). Например, можно экспрессировать все предсказанные секретируемые белки у A.niger (Tsang et al., 2009, Fungal Genetics and Biology, 46:S153-160). Секретируемые белки принадлежат к набору S+, а несекретируемые белки принадлежат к набору S-. Для измерения уровня секретирования может быть использован любой метод. Альтернативным образом, набор S- может содержать несекретируемые белки, которые, как известно из литературы, содержатся в эукариотическом хозяине;ii) расчт характеристик белка (F) для всех белков в наборе данных S. F может основываться как на последовательности ДНК, так и на аминокислотной последовательности этих белков;iii) определение оптимального значения (Fopt) для каждой характеристики для соответствующего эукариотического хозяина. Оптимальное значение может быть также получено путм измерения среднего значения каждой характеристики белка, рассчитанной из S+. Могут быть использованы любые меры среднего значения, например, среднее геометрическое, среднее гармоническое, среднее арифметическое,усечнное среднее, наиболее часто встречающееся значение и медиана. Рассчитанная мера для среднего значения является оптимальным значением для характеристики для соответствующего эукариотического хозяина. Альтернативным образом, подходит и распределение вероятности для каждой характеристики белка, рассчитанной из S+, так, чтобы распределение значений характеристики хорошо описывалось выбранным распределением вероятности. Может использоваться любое распределение вероятности, например нормальное распределение, экспоненциальное распределение или нормальное распределение логарифма переменной. Среднее значение распределения вероятности является оптимальным значением характеристики для соответствующего эукариотического хозяина;iv) определение оптимального диапазона каждой характеристики для соответствующего эукариотического хозяина: считая, что набор S+ содержит только секретированные белки, нижняя граница оптимального диапазона для характеристики белка определяется как значение, соответствующее 0,3-, 0,2-,0,15 или предпочтительно 0,10- и 0,05-квантиля характеристики белка, рассчитанной из S+. В данном случае значение 0,3, 0,2, 0,15 и т.д. относится к кумулятивным вероятностям. Квантили, соответствующие некоторой кумулятивной вероятности, могут быть рассчитаны с помощью любых статистических методов, например с использованием функции квантилей Statistical Toolbox, Matlab R2007a (The Mathworks Inc). Верхняя граница оптимального диапазона белковой характеристики определяется как значение, соответствующее 0,7-, 0,8-, 0,85- или предпочтительно 0,90- и 0,95-квантиля белковой характеристики, рассчитанной из S+. Альтернативным образом, считая, что весь набор S содержит как секретированные, так и несекретированные белки, нижняя граница оптимального диапазона для характеристики белка может быть определена как значение характеристики белка, ниже которого 70, 80, 85%, предпочтительно 90% или 95% белков в S не секретируются; верхняя граница оптимального диапазона характеристики белка определяется как значение характеристики белка, выше которого 70, 80, 85%, предпочтительно 90 или 95% белков в S не секретируются. Набор релевантных характеристик и оптимальных диапазонов и значений будет меняться от одной клетки-хозяина к другой. Для A. niger релевантные характеристики белка (FsAA), которые должны быть модифицированы для повышения секреции белка, включают (но не ограничиваются ими) частоту основных аминокислот, частоту полярных аминокислот, частоту неполярных аминокислот, частоту очень малых аминокислот, частоту малых аминокислот, частоту заряженных аминокислот, суммарный заряд (при рН 7,2), изоэлектрическую точку, частоту аспарагина, аргинина, изолейцина, цистеина, гистидина, глутамина, валина, лизина, глицина, треонина и лейцина, виток цепи (рассчитанный методом Gamier), мотив цепи PEST, рассчитанный методом EPESTFIND, значения локальной характеристики (LF) для pI, в частности LF1 и LF6, значения LF для GRAVY-оценки (общего среднего значения гидрофобности), в частности LF2 и LF4, значения LF для оценки ароматической составляющей, в частности LF3, LF4 и LF6, атомный состав в отношении серы (S) и локализационные характеристики (например, предсказанные с помощью предсказывающей локализацию программы MultiLoc). Суммарный заряд выражается в тех же единицах, что и заряд протона. Суммарный/суммарный положительный/суммарный отрицательный/ общий заряд на длину выражается в тех же единицах, что и заряд протона, но нормализуется по отношению к длине полипептида. Суммарный заряд полипептида оценивается в заявке исходя из того, что все аминокислоты полностью экспонированы в растворитель, что соседние пептиды не влияют на pK данной аминокислоты и что конститутивные аминокислоты, так же как и N-и С-концы, не модифицированы. Для расчта суммарного заряда полипептида при определнном рН (по умолчанию, рН 7,2) с использованием, например,изоэлектрической функции из биоинформатического инструментального средства Matlab (версияR2008b) или с использованием функции статистики белка (pepstats) в программе EMBOSS Explorer, доступной на http://emboss.sourceforge.net/. Суммарный заряд на длину определяется как суммарный заряд полипептида, поделнный на длину полипептида. Суммарный положительный заряд на длину определн в заявке как суммарный положительный заряд полипептида, рассчитанный путм суммирования парциальных зарядов N-конца и всех остатков лизина, аргинина и гистидина в полипептиде при рН 7,2. Суммарный положительный заряд на длину определяют делением суммарного положительного заряда полипептида на длину полипептида. Суммарный отрицательный заряд на длину определн как суммарный отрицательный заряд полипептида, рассчитанный путм суммирования парциальных зарядов С-конца и всех остатков аспартата,глутамата, цистеина и тирозина в полипептиде при рН 7,2. Суммарный отрицательный заряд на длину определяют делением суммарного отрицательного заряда полипептида на длину полипептида. Общий заряд на длину определн в заявке как общий заряд полипептида, рассчитанный вычитанием из суммарного положительного заряда полипептида (положительное число) отрицательного заряда полипептида (отрицательное число). Общий заряд на длину определяют делением общего заряда полипептида на длину полипептида.GRAVY-оценка определена в заявке как индекс гидрофобности полипептида, определнный как вKyte и Doolittle (1982). Каждая аминокислота имеет показатель гидрофобности от 4,6 до -4,6. 4,6 Присваивается наиболее гидрофобным, а -4,6 наиболее гидрофильным белкам. GRAVY-оценка полипептида предпочтительно определяется согласно Kyte и Doolittle 1982). Kyte, J. and Doolittle, R. (1982). Простой метод для раскрытия гидрофобного характера белка, J. Mol. Biol., 157: 105-132). Оценка ароматической составляющей полипептида рассчитывается в заявке путм суммирования частот трх ароматических аминокислот (Phe, Tyr и Trp) в полипептиде. Алифатический индекс определн как относительный объм, занимаемый алифатическими боковыми цепями. Алифатический индекс полипептида (AI) рассчитывают по формуле Ikai (1980) Алифатические боковые цепи имеют аминокислоты аланин, валин, изолейцин и лейцин. В тех случаях, когда а представляет собой относительный объм боковой цепи валина (а=2,9), а b относительный объм боковых цепей лейцина и изолейцина (b=3,9), fAla, fVal, fIle и fLeu являются частотами аланина, валина, изолейцина и лейцина в полипептиде, соответственно (см. Ikai, A.J. 1980,Термостабильность и алифатический индекс глобулярных белков. J. Biochem., 88: 1895-1898). В отношении GRAVY и алифатического индекса можно также обратиться к Protein Identification andAnalysis Tools on the ExPASy Server (Идентификация белков и аналитический инструментарий на сервереWalker (ed): The Proteomics Protocols Handbook. Humana Press (2005), pp. 571-607). Классы аминокислот на основании их физико-химических свойств Кислые: D, Е. Алифатические: A, I, L, V. Ароматические: F, W, Y. Основные: Н, K, R. Заряженные: D, Е, Н, K, R. Неполярные: А, С, F, G, I, L, М, Р, V, W, Y. Полярные: D, Е, Н, K, N, Q, R, S, Т. Малые: А, С, D, G, N, P, S, Т, V. Очень малые: А, С, Т, S, G. Характеристики, основанные на составе отдельных элементов в последовательности, рассчитывают по частоте fi элемента i. Частота и доля используются в заявке взаимозаменяемым образом. Частота определена как количество раз ni появления элемента i в последовательности, делнное на общее количество элементов в последовательности. Отдельные элементы, например аминокислоты, в последовательностях могут быть объединены во множественные элементы, например очень малые, кислые. Поверхностная доступность аминокислотного остатка в полипептиде может быть определена любым известным в данной области методом. Если полипептид имеет экспериментально определнную структуру, площадь доступной для растворителя поверхности (ASA) приводится в 2 и эта площадь рассчитывается путм прокатки сферы размером с молекулу воды по поверхности белка [1]. После этого ASA трансформируют в относительную площадь поверхности (RSA), которую рассчитывают как ASA данного аминокислотного остатка в полипептидной цепи по отношению к максимально возможной экспозиции этого остатка в центре трипептида, фланкированного либо глицином [2], либо аланином [3]. Остаток с относительной площадью поверхности (RSA), большей порогового значения(RSA, 0 1), считается экспонированным, а остаток с RSA меньшей порогового значения(RSA=, 0==1), считается скрытым. Предпочтительно 0,25 и более предпочтительно =0,25. Предпочтительно 0,25 и более предпочтительно =0,25. Поверхностную доступность можно также предсказать на основании аминокислотной последовательности полипептида, если структура полипептида не доступна. В литературе описываются различные методы предсказания поверхностной доступности по аминокислотной последовательности полипептида, например,как описано в [3]-[6]. Предпочтительно RSA предсказывают с использованием так называемого метода NetSurfP, описанного в [4], который доступен по интернет-адресу http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/. В настоящей заявке поверхностная доступность предсказывается по аминокислотной последовательности зрелого белка. Определение экспонированных и скрытых остатков то же, что и выше. Ссылки[3] Ahmad S., Gromiha M.M., Sarai A. Real value prediction of solvent accessibility from amino acid sequence (Предсказание реальной величины доступности для растворителя аминокислотной последовательности). Proteins 2003, 50(4): 629-635.[4] Bent Petersen et al. A generic method for assignment of reliability scores applied to solvent accessibility predictions (Общий метод присвоения оценок достоверности, применяемых к предсказаниям доступности для растворителя). ВМС Structural Biology 2009, 9: 51.[5] Dor О., Zhou Y. Real-SPINE: an integrated system of neural networks for real-value prediction of protein structural properties (Real-SPINE: интегрированная система нейронных сетей для достоверного предсказания структурных свойств белков путм направленного изучения). Proteins 2007, 68(1): 76-81.[6] Faraggi E., Xue В., Zhou Y. Improving the prediction accuracy of residue solvent accessibility and real-value backbone torsion angles of proteins by guided-learning through a two-layer neural network (Повышение точности предсказаний доступности остатков для растворителя и истинных углов петлей белков путм направленного обследования посредством двухслойной нейронной сети). Proteins 2009, 74(4): 847856. Оптимальные значения и диапазоны значений для A.niger приведены в табл. 1. Таблица 1 А. Нижняя граница (LB), верхняя граница (UB) и оптимальные значения (FOPT) характеристик белка Все характеристики в табл. 1, рассчитанные по всей белковой последовательности, основаны на длине всего белка. Все характеристики, рассчитанные по последовательности зрелого белка, экспонированные остатки и скрытые остатки основаны на длине зрелого белка. Предпочтительно оптимальные значения и диапазоны характеристик выбраны из табл. 2. Эти характеристики носят название первичных характеристик, а другие характеристики, т.е. характеристики в табл. 1, которых нет в табл. 2, являются вторичными характеристиками.Y означает, что характеристика является первичной характеристикой в соответствующей колонке всего белка или зрелого белка. Все характеристики, рассчитанные по всей белковой последовательности, основаны на длине всего белка. Все характеристики, рассчитанные по последовательности зрелого белка, экспонированные остатки и скрытые остатки основаны на длине зрелого белка. Для K.lactis предпочтительные первичные характеристики приведены в табл. 3. Таблица 3. Первичные характеристики и их значения для зрелых белков в K.lactis В ещ одном варианте осуществления секрецию полипептида улучшают с помощью следующих операций:i) расчт характеристик белка для полипептида;ii) установление того, являются ли одна или более характеристик белка полипептида вне пределов оптимального диапазона или существенно отклоняется от оптимального значения для эукариотического хозяина, где существенное отклонение определено как разница в 20, 30, 40 или более 50% от оптимального значения;iii) рациональное изменение аминокислотной последовательности полипептида, в результате которого значение одной или более FsAA полипептида оказывается в оптимальном диапазоне или сдвигается в сторону оптимального значения в достаточной степени, предпочтительно уменьшения разницы между характеристикой белка полипептида и оптимальным значением характеристики белка на 10, 15, 20 или более 30%. Предпочтительно модифицируются совместно 2, 3, 4 или 5 характеристик белка и более предпочтительно модифицируются в сочетании более 10, 15 или 20 характеристик белка. Оптимальный диапазон предпочтительно бертся из табл. 1 и более предпочтительно оптимальный диапазон бертся из табл. 2. В альтернативном случае оптимальный диапазон бертся из табл. 3. В приведнной выше операции iii) аминокислотная последовательность может быть разумным образом изменена с помощью каких-либо известных в данной области методов. Это может быть, например,достигнуто с помощью(ii) выравнивание гомологичных последовательностей с целевой последовательностью;(iii) идентифицирование аминокислот, которые являются критичными для функциональных свойств белков;(iv) введение желаемых характеристик аминокислотной последовательности при сохранении функциональных свойств;(vi) перевод конечной модифицированной последовательности обратно в последовательность гена с использованием наиболее оптимальных кодонов для данного хозяина;(vii) клонирование и экспрессия перестроенного полипептида в хозяине. Подвергается модифицированию предпочтительно по меньшей мере 5% аминокислот аминокислотного остова, более предпочтительно по меньшей мере 10%, ещ более предпочтительно по меньшей мере 15% и ещ более предпочтительно модифицируется по меньшей мере 20% аминокислот аминокислотного остова. Подвергается модифицированию предпочтительно по меньшей мере 5 аминокислот аминокислотного остова, более предпочтительно по меньшей мере 10 аминокислот, ещ более предпочтительно по меньшей мере 15 аминокислот, ещ более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, ещ более предпочтительно по меньшей мере 25 аминокислот и ещ более предпочтительно модифицируется по меньшей мере 30 аминокислот аминокислотного остова. Согласно изобретению предпочтительно улучшаются первичные характеристики, в то время как вторичные характеристики сохраняются в определнных границах. Вследствие этого оценка F общей оптимальности определена на основе значений DN всех n первичных характеристик и всех вторичных характеристик гдеявляется взвешивающим фактором между 0 и 1, включительно (01). Предпочтительно 0,5, более предпочтительно 0,4 и наиболее предпочтительно =0,3; р составляет от 1 до 5, включительно (1 р 5), предпочтительно р=2 (F в этом случае представляет эвклидово расстояние); предпочтительно =0,3 и р=2. Предпочтительно достигается улучшение F-оценки на по меньшей мере 5% по отношению к белку сравнения дикого типа, более предпочтительно на по меньшей мере 10%, ещ более предпочтительно на по меньшей мере 15%, ещ более предпочтительно на по меньшей мере 20% и ещ более предпочтительно достигается улучшение на по меньшей мере 30%. Предпочтительно модифицируются по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 характеристик, более предпочтительно по меньшей мере 10, ещ более предпочтительно по меньшей мере 15, ещ более предпочтительно по меньшей мере 20, ещ более предпочтительно по меньшей мере 25 и ещ более предпочтительно модифицируются по меньшей мере 30 характеристик. Предпочтительно улучшаются по меньшей мере 2,3, 4 или 5 характеристик, более предпочтительно по меньшей мере 10, ещ более предпочтительно по меньшей мере 15, ещ более предпочтительно по меньшей мере 20, ещ более предпочтительно по меньшей мере 25 и ещ более предпочтительно улучшаются по меньшей мере 30 характеристик, в то время как ухудшаются предпочтительно менее 10, более предпочтительно менее 5 и ещ более предпочтительно ухудшаются менее 4 характеристик. Этими характеристиками предпочтительно являются первичные характеристики. Гомологичные последовательности предпочтительно находятся путм проведения поиска в соответствующих базах данных с использованием программы BLAST. Гомологичные последовательности предпочтительно имеют по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с целевой последовательностью. Наиболее предпочтительно, если гомологичные последовательности предпочтительно имеют приблизительно 50% идентичности с целевой последовательностью. Специалист в данной области должен быть знаком с тем фактом, что имеются несколько различных компьютерных программ для выравнивания двух последовательностей и определения гомологии между двумя последовательностями (Kruskal, J.В. (1983),Обзор сравнения последовательностей под редакцией D. Sankoff and J. В. Kruskal, Разрывы и искажения времени, редактирование цепочек и макромолекулы: теория и практика сравнения последовательностей, с. 1-44, Addison Wesley). Для выравнивания может быть использован любой известный в данной области метод. Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определн, например, с использованием алгоритма Needleman и Wunsch для выравнивания двух последовательностей (Needleman, S. В. and Wunsch, С. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). В соответствующей области техники известны методы идентифицирования аминокислот, являющихся ключевыми для представляющих интерес важнейших функциональных свойств. В число пригодных для этого инструментов входит использование трхмерной структуры или трхмерной модели целевого белка, мутагенез представляющих интерес белков и использования сайт-насыщенных библиотек для установления функционально нейтральных замен по отношению к функциональным заменам. При введении характеристик аминокислотных последовательностей замены предпочтительно выбирают таким образом, чтобы в данном положении аминокислота, которая в большей степени соответствует требуемым параметром аминокислотной последовательности, была выбрана из группы аминокислот, которые содержатся в гомологичных последовательностях. Для идентифицирования допустимых замен, которые отсутствуют в природных гомологах, могут быть использованы примы моделирования из существующего уровня техники. Предпочтительными ссылками, о примах моделирования, позволяющих создать новые последовательности, способные складываться данным образом, являются(Kuhlman В., Dantas G., Ireton G.C., Varani G., Stoddard B.L., Baker D. (2003) Проектирование упаковки нового глобулярного белка с точностью на атомном уровне, Science 302, 1364-8. Baker D. (2006) Предсказание и проектирование макромолекулярных структур и взаимодействий, Philos. Trans. R. Soc.Lond., В., Biol. Sci. 361, 459-63. Проектирование de novo белка: приближение к полностью автоматическому выбору последовательностей, Journal of Molecular Biology, Volume 273, Issue 4, 7 November 1997,с. 789-796, Bassil I. Dahiyat, Catherine A. Sarisky, Stephen L. Mayo). Метод расчта из существующего уровня техники позволяет создавать многочисленные потенциальные последовательности, которые могут адаптироваться к данному белковому фолдингу. Путм введения оптимизации характеристик в оценочные функции, которые используются для отфильтровывания наиболее оптимальных последовательностей, наиболее оптимальные последовательности для данного продуцирующего хозяина могут быть выбраны путм расчта. Характеристики белка, которые могут быть модифицированы согласно способу изобретения, включают в себя композиционные, физиологические и структурные характеристики. Подходящими примерами таких характеристик являются количество аминокислот, молекулярная масса, изоэлектрическая точка, суммарный заряд при определнном рН, GRAVY-оценка, алифатический индекс, индекс нестабильности, композиционные признаки, атомный состав, касающийся атомов С, Н, N, О и S, частота аминокислот, частота дипептидов, частота трипептидов, частота кислых аминокислот, частота алифатических аминокислот, частота ароматических аминокислот, частота основных аминокислот и характеристики,указанные в табл. 1. Настоящее изобретение охватывает также и сочетание модифицированных характеристик. Модифицированными в сочетании предпочтительно являются 2, 3, 4 или 5 характеристик белка. Более предпочтительно модифицирование в сочетании 10, 15 или 20 характеристик белка. Наиболее предпочтительно модифицирование в сочетании 25 или 30 характеристик белка. В одном из вариантов осуществления изобретения вводятся один или более сайтов гликозилирования при одновременном модифицировании других характеристик белка. В другом варианте осуществления изобретения модифицируется частота заряженных аминокислот при одновременном модифицировании других характеристик белка. В ещ одном варианте осуществления изобретения модифицируется частота полярных аминокислот при одновременном модифицировании других характеристик белка. Характеристика белка, рассчитанная по всей аминокислотной или ДНК-последовательности, является средним значением для всего белка, которое может не выявлять локальных свойств белка. Например, какой-либо белок мог бы быть в среднем гидрофильным, но при этом содержать большую внутреннюю гидрофобную область. Локальные свойства белка можно рассчитывать на основе аминокислотной или ДНК-последовательности, например, методом, предложенным Benita et al. (Benita et al., 2006. Molecular and Cellular Proteomics, 5: 1567-1580). Чтобы рассчитать локальное свойство какой-либо характеристики белка, можно рассчитывать характеристику белка локально в скользящем окне соответствующего числа аминокислот или нуклеотидов. Полученное значение после этого откладывается на кривой по длине аминокислотной или ДНКпоследовательности белка, как это иллюстрируется на фиг. 9. Может быть определн ряд локальных характеристик Например, LF1 соответствует тмно-серой площади на фиг. 1, a LF2 соответствует светло-серой площади на фиг. 1. Площадь можно рассчитать, используя метод трапеций (Benita et al., 2006. Molecularand Cellular Proteomics, 5: 1567-1580). Для расчта локальных характеристик можно выбрать подходящий верхний и нижний пороги, а также размер скользящего окна. Скользящее окно может иметь любой размер. Может, например, быть использован размер окна из 21 аминокислоты или пар оснований. Значение верхнего и нижнего порогов можно выбирать так, чтобы вмещались экстремумы на кривой. Например, более высокий верхний порог учтт больше экстремумов, чем более низкий. Предпочтительно выбирать верхний и нижний пороги так,- 13021205 чтобы максимизировать критерии Фишера для набора данных S+ и S-. Критерии Фишера определяются как где S- и S+ обозначают средние значения локальных характеристик, рассчитываемые по наборамS- и S+, соответственно, a 2S- и 2S+ обозначают отклонения значений локальных характеристик, рассчитанных по наборам S- и S+, соответственно. Определнные выше локальные характеристики могут быть рассчитаны для любых белковых характеристик, например GRAVY-оценки, оценки ароматической составляющей и изоэлектрической точки. В дополнение к характеристикам, которые могут быть получены из последовательностей успешно секретируемого белка, было отмечено, в частности, что повышение гидрофильности доступной для растворителя поверхности целевых белков очень эффективно в отношении увеличения количества секретируемого из клеток растворимого белка. Более конкретно, повышается не только экспрессия, но при этом также значительно больше белка накапливается в культуральном бульоне в растворимой форме, не связанной с биомассой или каким-либо другим нерастворимым материалом. Данные белки с улучшенной поверхностной гидрофильностью можно было бы получать при значительно более высокой секреции. При удалении биомассы (с помощью фильтрации или центрифугирования) основная часть продуцированного белка в конечном итоге оказывается в фильтрате или супернатанте. Повышение гидрофильности может быть осуществлено с помощью замены неполярных аминокислот более полярными аминокислотами; замены менее полярных аминокислот более полярными аминокислотами; замены неполярных аминокислот заряженными аминокислотами. Повышение гидрофильности как таковой с помощью увеличения количества более полярных или заряженных аминокислот, по существу, меняет аминокислотный состав и как таковое может рассматриваться как композиционные характеристики, которые могут быть взяты на вооружение для повышения секреции. Неполярные аминокислоты выбирают из группы А, V, L, I, С, М, F. Аминокислоты G, Р, Y, W можно считать неполярными в полярном окружении и полярными в неполярном окружении. Более полярные остатки выбирают из группы S, T, N, Q, D, E, H, R, K. Заряженные остатки выбирают из группы D, E, H,R, K. Кислые и отрицательно заряженные остатки выбирают из Е, D. Основные и положительно заряженные остатки выбирают из Н, K, R. Используется сравнительная шкала полярности: [А, V, L, I, M, F,С][G, P, Y, W][S, Т][N, Q, Н][D, Е, K, R]. Известно, что области высокогидрофобной поверхности обладают тенденцией приводить к нежелательной агрегации или нежелательному налипанию на биомассу, в результате чего в продуцирующем хозяине возникает высокая продукционная нагрузка, накопление белка в хозяине и заторможенная секреция или е отсутствие. Отмечалось, что замены, которые повышают общую гидрофильность, очень эффективны для улучшения секреции, в частности, если в числе этих остатков имеются остатки, доступные для растворителя (остатки на поверхности белка). Более конкретно, было отмечено, что при замене неполярных остатков более полярными остатками в доступных областях поверхности доля полярных остатков может даже превысить долю полярных остатков, установленную верхними границами анализа композиционных характеристик. Несовместимость характеристик последовательности целевого белка с требованиями хозяина можно компенсировать повышением гидрофильности целевого белка, более конкретно, введением дополнительного заряда, распределнного таким образом, что положительный и отрицательный заряды оказываются равномерно распределнными по поверхности, исключая горячие точки отрицательного или положительного заряда. Хотя и существуют определнные прогнозирующие средства для предсказания того, какие аминокислоты обладают вероятностью оказаться на поверхности с учтом аминокислотной последовательности, эффективность этих средств весьма низка, когда требуется предсказать доступные для растворителя неполярные, или гидрофобные участки. По этой причине для модулирования гидрофильности доступной поверхности белка необходима трхмерная структура или трхмерная структурная модель. Трхмерная структура белка может быть определена методом рентгеновской кристаллографии и с помощью ЯМР. Кроме того, для создания достоверных трхмерных моделей для данных последовательностей может быть применено сравнительное моделирование, или моделирование на основе шаблона с использованием трхмерных структур гомологичных белков (http://en.wikipedia.org/wiki/Homologymodeling). Различные серверы и пакеты программного обеспечения для сравнительного моделирования можно найти на: http://en.wikipedia.org/wiki/Proteinstructurepredictionsoftware. Что касается недавнего обзора предсказания белковых структур и моделирования (см. Yang Zhang,Current Opinion in Structural Biology 2008,18: 342-348). На основе атомных координат и трхмерной структуры или трхмерной модели можно рассчитать доступную поверхность с помощью известных в данной области методов. Хорошо известным методом является расчт с использованием алгоритма со скользящим шариком, разработанного Frederic Richards(1977, Areas, volumes, packing and protein structure (площади, объмы, упаковка и структура белка), Annu Rev Biophys Bioeng, 6: 151-176). См. также http://en.wikipedia.org/wiki/Accessiblesurfacearea. При определении доступной поверхности, чтобы избежать того, чтобы замены исказили взаимодействие между отдельными полипептидами (мономерами) в мультимере (например, димере, тримере, тетрамере и т.д.), следует принимать в расчт четвертичную структуру конечного зрелого белка. Модулирование поверхности включает мечение площадей, где неполярные остатки доступны из растворителя, образуя потенциальные липкие участки, которые могли бы препятствовать нормальной секреции и отбору продукта; исключение площадей, которые играют функциональную роль, например активного центра в карманах общего типа и связывающих карманах, в частности для субстрата, косубстратов и кофакторов; замена неполярных остатков на более полярные остатки, в том числе на заряженные остатки; замена полярных остатков на более полярные остатки или заряженные остатки; перераспределение заряженных остатков, чтобы избежать появления областей с высоким отрицательным зарядом или областей с высоким положительным зарядом. Вместо замены участков гидрофобных поверхностей такие области можно также экранировать,осуществляя вблизи неполярных областей гликозилирование. В случае первичной структуры повышенная гидрофильность представлена путм сравнения числа полярных остатков до и после модифицирования, например При рассмотрении доступной поверхности вклад разных полярных аминокислот может быть выражен в виде доли доступной поверхности, образованной какой-либо одной аминокислотой или какой-либо группой аминокислот, по отношению ко всей доступной поверхности. Например, общая доступная поверхность заряженных остатков может быть рассчитана и сравнена со всей площадью доступной поверхности. Полярная доступная поверхность может быть рассчитана при учте всех полярных остатков. О повышении гидрофильности поверхности белков говорят в том случае, когда доля полярной поверхности увеличивается за счт неполярной поверхности. В принципе можно также проводить гликозилирование и оценивать экранированную в результате гликозилирования площадь. Распределение зарядов можно осуществлять любым доступным методом,включая визуальное изучение. В одном из вариантов осуществления модифицируемые для улучшения секреции характеристики представляют собой перераспределение поверхностных зарядов, распределение полярной и неполярной площадей, фрагменты последовательности, такие как гликозилирование, или их сочетание. Специалисту понятно, что модифицирование одной из характеристик, например какой-либо аминокислоты, во многих случаях повлечт за собой модифицирование какой-либо другой характеристики, например атомного состава в отношении атомов С, Н, N, О, S. Следует иметь в виду, что способы согласно настоящему изобретению могут быть успешно объединены с какой-либо существующей технологией или с комбинацией одной или более из этих технологий с целью повышения уровней продукции белка. В их число входят (но не ограничивая собой) применение сильных промоторов, увеличение количества копий, оптимальная последовательность Kozak, стабилизирующие мРНК элементы и использование оптимизированных кодонов (WO 2008/000632). Примеры Штаммы A.nigerWT 1. Этот штамм используется в качестве штамма дикого типа. Этот штамм депонирован в институте CBS под депозитным номером CBS 513.88.WT 2. Этот штамм A.niger представляет собой штамм WT 1, в котором делетирован ген, кодирующий глюкоамилазу (glaA). WT 2 сконструирован с использованием метода MARKER-GENE FREE (без гена-маркра), описанного в ЕР 0635574 В 1. В этом патенте подробно описано, как удалить glaAспецифичные ДНК-последовательности в геноме CBS 513.88. Результатом этой процедуры является не содержащий ген-маркр рекомбинантный (glaA) штамм A.niger CBS 513.88, не содержащий в конечном итоге никаких чужеродных ДНК-последовательностей.WT 3. Чтобы разрушить ген pepA, кодирующий главную внеклеточную аспартат-протеазу РерА вWT 2, удаляют РерА-специфичные ДНК-последовательности в геноме WT 2, как это описано van denJ. (1997) - Разрушение трх кислых протеаз в Aspergillus niger - влияние на спектр протеазы, внутриклеточный протеолиз и деградацию целевых белков, Eur J Biochem. 247(2): 605-13). Результатом этой процедуры является не содержащий гена-маркра штамм WT 3, представляющий собой штамм- 15021205WT 4. Для удаления гена hdfA в WT 3 использован метод, ранее детально описанный в WO 05/095624, в результате чего образуется Aspergillus niger WT 4 ( glaA, pepA, hdfA).WT 5. Этот штамм A.niger представляет собой штамм WT 4, включающий делецию, результатом которой является оксалат-дефицитный штамм A. niger. WT 5 сконструирован с использованием метода,описанного в ЕР 1157100 и US 6936438, в котором оксалат-дефицитный штамм получают делецией генаWT 6. Этот штамм A. niger представляет собой штамм WT 5, содержащий делецию трх генов, кодирующих -амилазы (amyB, amyBI и amyBII), в три последовательные стадии. Конструирование векторов делеции и делеция этих трх генов в геноме детально описана в WO 2005095624. Векторы pDELAMYA, pDEL-AMYBI и pDEL-AMYBII, описанные в WO 2005095624, использованы согласно методу без гена-маркра, описанному в ЕР 0635574 В 1. Результатом описанной выше процедуры является WT 6, представляющий собой оксалат-дефицитный, не содержащий гена-маркра амилаза-отрицательный(glaA, pepA, hdfA, amyA, amyBI и amyBII) рекомбинантный штамм A.niger CBS 513.88, не содержащий в конечном итоге никаких чужеродных ДНК-последовательностей. Штамм WT 6 как таковой имеет низкий амилазный фон, имеет повышенное отношение HR/NHR для более эффективного нацеливания последовательностей и более оптимизирован для экстрацеллюлярной экспрессии белка и детектирования по сравнению с WT 1. Штаммы K.lactis Для оценки экспрессии PGE и е вариантов в K.lactis использованы два штамма. GG799 (New England Biolabs) и производное K.lactis CBS 685.97, обозначаемое в заявке также WT 7, которое более детально описано в патенте US 6265186 В 1. Штамм K.lactis WT 7 получен из CBS 685.97 с помощью мутагенеза (классическое усовершенствование штамма) и генной инженерии. Оценка хитиназной активности Реакционная смесь содержит 3 мг хитин-азура (Sigma), 0,5 мл 0,1 М Na-цитрат-фосфатного буфера,рН 5.0 и 0,1 мл анализируемого образца (культурального бульона). Реакционную смесь инкубируют 24 ч при 37 С при встряхивании, центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин и измеряют оптическую плотность при 590 нм (OD590).-Глюкозидазная активность с использованием в качестве субстрата п-нитрофенил(pNP)-глюкопиранозида Приготовляют исходный 3 мМ раствор pNPглюкопиранозида (Sigma N7006) в 50 мМ натрийацетатном буфере, рН 4,5. Анализ: инкубируют при 40 С 250 л исходного раствора субстрата (3 mM) + 250 л разбавленного ферментного образца. Реакцию останавливают при t = 0, 10, 20 и 30 мин, смешивая 100 л инкубируемого раствора с 100 л 1 М карбоната натрия. Определяют экстинкцию при 405 нм с использованием считывающего устройства МТР reader. Активность выражают в моль выделившегося-Глюкозидазная активность с использованием в качестве субстрата целлобиозы Приготовляют исходный раствор целлобиозы (Sigma C7252) для конечной концентрации 10 мМ в 50 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 4,5. Для анализа смешивают 2000 л исходного раствора субстрата(10 mM) и 100 л разбавленного ферментного образца и инкубируют при 40 С. Реакцию останавливают при t = 0, 10, 20 и 30 мин, смешивая 100 л инкубируемой смеси со 100 л 50 мМ гидроксида натрия. Образцы подвергают ультрафильтрации и анализируют с использованием высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD), проводимой на Dionex DX-500, оборудованным импульсным амперометрическим детектором ED 40. Активность выражают в моль выделившейся глюкозы/мл/мин. Эндоглюканазная активность с использованием AZO-карбоксиметилцеллюлозы Анализ проводят в соответствии с методикой Megazyme S-ACMC 04/07 (Megazyme International Ireland Ltd, http://secure.megazvme.com/downloads/en/data/ S-ACMC.pdf). Активность измеряют на 2% AZOкарбоксиметилцеллюлозе в 100 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 4,6, при 40 С. Для анализа смешивают 250 л исходного раствора субстрата (2%) и 250 л разбавленного ферментного раствора. Через 30 мин добавляют 1250 л раствора преципитата. Реакции останавливают добавлением раствора преципитата: 300 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5, с 20 мМ ацетата цинка в 76%-м этаноле. После центрифугирования в течение 10 мин при 1000g измеряют на спектрофотометре экстинкцию супернатанта при 590 нм. Активность выражают в моль выделившегося красителя/мл/мин. Чашечный тест с трибутирином Чашечный скрининг-тест на родамин В-липазу проводят с трибутирином (С 4) в качестве субстрата. Обычно для скрининга на присутствие липазной активности в образцах используют чашечный тест с использованием родамина В, адаптируя для этого тест, описанный в литературе (Kouker G., Jaeger K.E.,Appl. and Environ. Microbiol, 1987, 211-213). Все используемые реагенты являются аналитически чисты- 16021205 ми. Готовят эмульсию гуммиарабика, растворяя 17,9 г NaCl и 0,41 г KH2PO4 в 400 мл Н 2 О и добавляя затем 540 мл 87%-го глицерина, после чего медленно прибавляют 6,0 г гуммиарабика и после растворения доводят общий объм раствора до 1000 мл с помощью воды. Раствор родамина В готовят, растворяя родамин В в этаноле в концентрации 20 мг/мл. Готовят 4%ный раствор агарозы растворением при нагревании 4 г агарозы в 100 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,5. Используемым для скрининга липазной активности субстратом является трибутирин. Проведение чашечного теста: 1 мл субстрата и 1,5 мл эмульсии гуммиарабика смешивают с 5 мл буферного раствора и подвергают обработке ультразвуком с использованием Soniprep с амплитудой 20 цм в течение 260 с или (альтернативно) диспергатора Ultra Turax в течение 2 мин (зелная установка). К полученному раствору добавляют 7,5 мл горячего раствора агарозы вместе со 150 л родамина В. Конечный раствор вливают в чашку Петри. Чашки выдерживают перед их использованием в холодильнике. Непосредственно перед использованием с помощью пипетки-репликатора проделывают отверстия диаметром 3 мм. Через отверстие с помощью пипетки вливают 10 л раствора, проверяемого на липазную активность, после чего чашку инкубируют 18-24 ч при 37 С. Флуоресцентное сияние вокруг отверстия свидетельствует о липазной активности. Тест с п-нитрофенилбутиратом Активность преджелудочной эстеразы (PGE) определяют при 37 С при конечной концентрации используемого в качестве субстрата 1 мМ п-нитрофенилбутирата по отношению к внутреннему ферментному стандарту. Раствор субстрата получают, готовя исходный 50 мМ раствор п-нитрофенилбутирата в ацетонитриле, который затем разбавляют 5 раз 0,1 М натрий-фосфатным буфером, рН 6,7, содержащим 0,2% БСА и 2% Тритона Х-100. Добавляют 120 л 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 6,7, содержащего 0,2% БСА, и 15 л раствора субстрата. После подогрева до 37 С добавляют 15 л образца в подходящем разбавлении (разбавление 0,1 М натрий-фосфатным буфером, рН 6,7, содержащим 0,2% БСА), после чего в течение 5 мин спектрофотометрически измеряют повышение оптической плотности при 405 нм в процессе инкубации при 37 С. Реакцию образца корректируют по контрольному фону (инкубирование вместо образца 15 л 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 6,7, содержащего 0,2% БСА) и после коррекции по контролю она составляет от 0,05 до 0,5 dAbs. Внутренний стандарт калибруют с помощью титрометрического анализа на трибутирин, проводимого при рН 6,0 и 30 С. 5 мл Раствора образца с PGE (приготовленного в очищенной на milli-Q воде) добавляют к 30 мл подогретой эмульсии трибутирин/гуммиарабик (93 и 57 г/л воды, соответственно). В течение 5 мин измеряют с помощью титрования с 0,02 н. NaOH высвобождающуюся свободную жирную кислоту. Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) Предварительная обработка образца. 30 л Образца добавляют к 35 л воды и 25 л буфера для образца NuPAGE LDS (4) фирмы Invitrogen и 10 л восстанавливающего агента для образца NuPAGE(10) фирмы Invitrogen. Образцы нагревают в течение 10 мин в термосмесителе при 70 С. Электрофорез (SDS-ПААГ) проводят дважды в соответствии с инструкциями поставщика (Invitrogen, гель: 4-12% Bis-Tris-гель, буфер: разделительный буфер MES SDS, время прогона: 35 мин). Для блоттинга используется один из двух гелей. На гели (NuPAGE BisTris, Invitrogen) наносят 10 л растворов образцов и 1 л маркра М 12 (Invitrogen). Электрофорез проводят в геле при напряжении 200 В в системе XCELL Surelock в 600 мл 20 кратного буфера MES-SDS во внешней буферной мкости и 200 мл 20-кратного буфера MES-SDS, содержащего 0,5 мл антиоксиданта (NuPAGE Invitrogen), во внутренней буферной мкости. После прогона гели фиксируют в течение 1 ч 50 мл смеси 50% метанол/7% уксусная кислота, дважды промывают деминерализованной водой и окрашивают в течение ночи с помощью Sypro Ruby (50 мл, Invitrogen). После промывки геля в течение 10 мин деминерализованной водой получают изображения с использованием Typhoon 9200 (610 ВР 30, Green (532 nm), PMT 600V, 100 micron). Вестерн-блоттинг Поликлональное антитело против PGE Поликлональные антитела против PGE были заказаны у Eurogentec (Бельгия) с использованием быстрой 28-дневной программы и двух синтезированных пептидов PGE в качестве антигенов. Антитело против PGE было апробировано против находящегося в продаже ферментного препарата Piccantase С(DFS) (данные не приведены). Вестерн-блоттинг проводят согласно методу анализа S2300. Мембрана: NC 0,45 м. Время прогона: 90 мин при 25 В. Буфер: буфер для переноса с метанолом. После переноса на мембрану проводятся следующие операции. Блокирование мембраны в течение 2 ч в 20 мл обезжиренного молока (1% обезжиренное молоко в Антитело 1. SY0716, кролик; растворение 40 л антитела в 20 мл PBST в течение ночи при комнатной температуре (1:500). Ополаскивание мембраны с помощью PBS-T с последующей промывкой 320 мин буфером PBST. Антитело 2. ECL Plex, козье антитело против кролика IgG-Су 3 кролика (GE Healthcare), растворение 10 л ECL Plex в 25 мл PBST в течение 1 ч в темноте (1:2500). Четырхкратное ополаскивание мембраны с последующей промывкой 210 мин в PBST. Промывка 210 мин в PBS. Изображение мембраны получено с помощью Typhoon 9200 (670 ВР 30, зелный (532 нм), ФЭУ 450 В, 100 м). Молекулярно-биологические методы В приведнных здесь примерах с использованием известных специалистам молекулярнобиологических методов (см. SambrookRussell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, CSHLPress, Cold Spring Harbor, NY, 2001) были сверхэкспрессированы несколько генов, а экспрессия других была понижена, как описано ниже. Все векторы для замены гена, описанные и использованные, были спроектированы согласно известным принципам и сконструированы согласно рутинным процедурам клонирования. По существу, эти векторы содержат приблизительно 1-2 Кб фланкирующих областей соответствующих последовательностей с открытой рамкой считывания (ORF) для нацеливания гомологичной рекомбинации на заданные участки генома. Кроме того, между прямыми повторами векторы содержат двунаправленный селекционный маркр amdS штамма A.nidulans для трансформации. В методе, применяемом для делеции генов во всех примерах заявки, используется линейная ДНК, которая интегрируется с геномом в гомологичном участке фланкирующих последовательностей с помощью двойного перекреста хромосом, заменяя таким образом удаляемый ген геном amdS. После трансформации прямые повторы позволяют удалить селекционный маркр в процессе (второго) события гомологичной рекомбинации. Удаление маркра amdS может быть произведено с помощью посева на фтор-ацетамидных средах, в результате чего происходит отбор не содержащих маркирующего гена штаммов. При использовании этой стратегии трансформации и последующего обратного отбора, который также описан как метод MARKER-GENE FREE (без генамаркра) в ЕР 0635574 В 1, маркр amdS может использоваться неограниченно в программах модифицирования штаммов. Общая процедура для разрушения гена изображена на фиг. 6 в WO 2006040312. Общий принцип проектирования векторов делеции ранее описан в ЕР 635574 В и WO 98/46772, а использование общего клонирующего вектора pGBDEL для конструирования векторов делеции и процедуры обратного отбора описаны, в частности, в WO 06/040312. Примеры общего принципа проектирования векторов экспрессии и, более конкретно, векторов экспрессии pGBFIN для сверхэкспресси генов, трансформации, использования маркров и селективных сред можно найти в WO 199846772, WO 199932617, WO 2001121779, WO 2005095624, ЕР 635574 В и WO 2005100573. Ферментации во встряхиваемых колбах. Штаммы A.niger предварительно культивируют в 20 мл среды на CSL (100-мл колба с перегородкой), как описано в примерах раздела Ферментации Aspergillus niger во встряхиваемых колбах в WO 99/32617. После роста в течение 18-24 ч при 34 С и 170 об/мин 10 мл культуры переносят в ферментационную среду (FM). Ферментацию в ферментационной среде проводят в 500-мл колбах с перегородкой,заполненных 100 мл ферментационного бульона, при 34 С и 170 об/мин в течение указанного ряда дней,в основном как описано в WO 99/32617. Среда CSL состоит из (в количестве на 1 л): 100 г тврдых материалов кукурузного экстракта (Roquette), 1 г NaH2PO4 Н 2 О, 0,5 г MgSO47H2O, 10 г глюкозыН 2 О и 0,25 г Basildon (противовспениватель). Ингредиенты растворяют в деминерализованной воде и с помощью NaOH или H2SO4 доводят рН до 5,8; заполняют 100-мл колбы с перегородкой и пенополистирольным шариком 20 мл ферментационного бульона и стерилизуют в течение 20 мин при 120 С. Ферментационная среда (FM) состоит из (в количестве на 1 л): 150 г мальтозыН 2 О, 60 г Soytone(пептон), 1 г NaH2PO4H2O, 15 г MgSO47H2O, 0,08 г Tween 80, 0,02 г Basildon (противовспениватель), 20 г MES (2-(N-морфолино)этансульфокислоты), 1 г L-аргинина. Ингредиенты растворяют в деминерализованной воде и с помощью NaOH или H2SO4 доводят рН до 6,2; заполняют 500-мл колбы с перегородкой и пенополистирольным шариком 100 мл ферментационного бульона и стерилизуют в течение 20 мин при 120 С. Для ферментации K.lactis во встряхиваемых колбах одну колонию трансформанта K.lactis PGE инокулируют в 100 мл (в колбу) среды YEP(4%)-D/MES, содержащей (на 1 л) 10 г дрожжевого экстракта, 20 г бактопептона, 40 г глюкозы и 100 мМ MES, рН 6,7. Ферментацию ведут при 30 С во встряхиваемом инкубаторе при 280 об/мин. Супернатант собирают на 2-й и 3-й день и анализируют как описано ниже. Пример 1. Конструирование векторов экспрессии K.lactis и A.niger для ферментов дикого типа и вариантов ферментов согласно способу изобретения В этом примере сконструирован ряд векторов экспрессии для вариантов ферментов изобретения. Все варианты для экспрессии в Kluyveromyces были клонированы в векторе pKLPGE, очень близком к вектору экспрессии pKLAC2 (New England Biolabs). Общую схему всех векторов pKLPGE можно видеть на фиг. 1. Все варианты для экспрессии в Aspergillus были клонированы в векторе экспрессии pGBFIN-5 или pGBTOP. Конструирование, общая схема и применение этих векторов подробно описаны в WO 199932617. Конструкты K.lactis Преджелудочная эстераза (PGE) телнка является промышленно важным ферментом и полная длина е кДНК-последовательности опубликована Timmermans et. al. (1994, Gene 147: 259-262). Для экспрессии PGE in Kluyveromyces lactis эта кДНК-последовательность была оптимизирована по парам кодонов (SEQ ID No. 1) и получена синтетически (например, DNA2.0, USA, GeneArt, Sloning, Германия). Была получена экспрессирующая конструкция, содержащая слитый с пре(про-)сигнальной последовательностью -фактора K.Lactis участок процессинга пре(про-)сигнальной последовательности KREAEA Kex. С помощью сайтов рестрикции HindIII и NotI синтетический ген был клонирован в вектор экспрессииK.lactis с образованием pKLPGE-WT (фиг. 1), который содержал также селекционный маркр amdS. Кроме того, были спроектированы варианты PGE с улучшенными белковыми характеристиками согласно способу изобретения. Эти мутанты отличаются от фермента PGE дикого типа с оптимизированными парами кодонов (SEQ ID NO. 2) в том, что касается числа сайтов гликозилирования и/или гидрофобности. Гены, кодирующие мутантный фермент PGE, также были оптимизированы по парам кодонов и получены синтетическим путм, как описано выше. Варианты были клонированы в вектор экспрессииK.lactis, как это в основном описано выше, с использованием участков клонирования XhoI and NotI. Все относящиеся к нуклеотидам и белкам подробности для PGE-конструктов можно найти в табл. 4. Таблица 4. Обзор ферментов PGE дикого типа и мутантов, экспрессированных в K.lactis Конструкты A.niger Для экспрессии преджелудочной эстеразы (PGE) телнка в A.niger кДНК-последовательность была оптимизирована по парам кодонов (SEQ ID NO. 12) и получена синтетически (например, DNA2.0, USA,GeneArt, Sloning, Германия). Оптимизированный по парам кодонов кодирующий PGE ген был получен синтетическим путем и слит с белком-переносчиком укороченной глюкоамилазой (tAG). Слитый фрагмент был введн в вектор экспрессии A.niger - pGBTOP, как показано для pANPGE-3 на фиг. 2. Ген A.niger дикого типа An08g09030, кодирующий предполагаемую хитиназу (ZDU, ЕС 3.2.1.14,Uniprot A5AB48) был идентифицирован в последовательности генома A.niger (EMBL: АМ 269948 АМ 270415; Pel et al., Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88 (Секвенирование генома и анализ универсальной клеточной фабрики Aspergillus niger CBS 513.88), Nat Biotechnol. 2007 Feb; 25 (2):221-231). кДНК-последовательность хитиназы ZDU дикого типа может быть идентифицирована как SEQ ID NO. 17, а соответствующая ей белковая последовательность хитиназы ZDU дикого типа как SEQ ID NO. 18. Кодирующая последовательность An08g09030 была оптимизирована по парам кодонов (подробно в WO 2008000632), а последовательность инициации трансляции промотора глюкоамилазы glaA модифицирована до CACCGTCAAA ATG-3' во всех созданных экспрессирующих конструкциях (также подробно в WO 2006/077258). Кроме того, была использована оптимальная последовательность терминации трансляции и, следовательно, во всех экспрессирующих конструктах последовательность терминации трансляции 5'-TGA-3' дикого типа была заменена на 5'ТААА-3' (подробно в WO 2006/077258). Оптимизированный конструкт хитиназы ZDU был целиком синтезирован в виде фрагмента PacI-AscI, субклонирован и выверен по последовательности. Рестрикционные участки PacI-AscI на концах синтезированных фрагментов были использованы для обеспечения клонирования в большом векторном фрагменте вектора экспрессии pGBFIN-5, ретрицированного с помощью PacI-AscI с образованием вектора экспрессии pGBFINZDU дикого типа (фиг. 3). Кроме того, аналогичным путм, как для хитиназы ZDU, были оптимизированы по парам кодоновchrysosporium (ZTC, EC 3.2.1.4, Uniprot Q66NB6) (подробно в WO 2008000632) и со всеми соответствующими контрольными элементами, клонирован в виде фрагментов PacI-AscI в pGBFIN-5, в результате чего получены pGBFINZTB дикого типа и pGBFINZTC дикого типа, соответственно. Оптимизации характеристик белка (ОБХ) согласно способу настоящего изобретения были применены на преджелудочной эстеразе телнка, на белковой последовательности хитиназы A.niger и на белковых последовательностях -глюкозидазы Т.emersonii и эндоглюконазы P.chrysosporium. Кодирующие последовательности, содержащие проектируемые варианты преджелудочной эстеразы телнка, были целиком синтезированы в виде фрагментов EcoRI-SnaBI и выверены на последовательность. Синтезированные фрагменты были клонированы в векторе pGBTOP с образованием экспрессирующих конструкций pANPGE. Все относящиеся к нуклеотидам и белкам подробности для A.niger PGE-конструктов можно найти в табл. 5. Таблица 5. Экспрессирующие конструкции фермента дикого типа и вариантов для А.niger,ссылки и их свойства Кодирующие последовательности, содержащие заданные варианты хитиназы, -глюкозидазы и эндонуклеазы были целиком синтезированы в виде фрагментов PacI-AscI, субклонированы и выверены по последовательностям. Рестрикционные участки PacI-AscI на концах синтезированных фрагментов были использованы для клонирования в большом векторном фрагменте вектора экспрессии pGBFIN-5, рестрицированного с помощью PacI-AscI с образованием вариантных векторов экспрессии pGBFIN. Варианты экспрессирующей конструкции были названы, как указано ниже, и из табл. 6 можно получить характеристики и ссылки на соответствующие нуклеотидные и белковые последовательности pGBFINZDUконструктов, из табл. 7 - pGBFINZTB-конструктов и из табл. 8 - pGBFINZTC-конструктов. Таблица 6. Конструкты экспрессии фермента дикого типа и вариантов для A.niger,ссылки и их свойства Таблица 7. Экспрессирующие конструкции фермента дикого типа и вариантов для А.niger,ссылки и их свойства Таблица 8. Экспрессионные конструкции фермента дикого типа и вариантов для А. niger,ссылки и их свойства Пример 2. Анализ на экспрессию и секрецию PGE дикого типа и с оптимизированными белковыми признаками в K.lactis Штаммы K.lactis GG799 или K.lactis WT 7 трансформируют с помощью всех K.lactis pKLPGEконструктов (табл. 4), которые также содержат селекционный маркр amdS. Для каждой из трансформаций очищают 20 колоний на селективной среде, содержащей ацетамид. Часть колонии используют для создания матричной ДНК для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью определения количества копий PGE-конструкта в каждом штамме. На каждый конструкт 3 трансформанта, являющиеся положительными при ПЦР-скрининге, подвергают дальнейшему скринингу в чашечном тесте, содержащем в качестве ферментного субстрата трибутирин. Для фермента PGE дикого типа при использовании чашечного теста с трибутирином не было отмечено отчтливого обусловленного активностью сияния. Не показал также положительного результата в отношении продукции PGE и анализ супернатанта на SDSПААГ. Неожиданным оказалось, что у 4 из 5 мутантов PGE с оптимизированными белковыми характеристиками можно было наблюдать в чашечном тесте с трибутирином отчтливое определяемое активностью сияние. Для дикого типа и мутантной PGE был выращен ряд трансформантов во встряхиваемых колбах, после чего культуральный бульон и супернатант исследовали на липазную активность с использованием в качестве субстрата pNP-бутирата. Результаты разных тестов на активность для PGE-мутантов приведены в табл. 9. Таблица 9. Тесты на активность PGE дикого типа и вариантов с оптимизированными характеристиками белка Для трансформантов K.lactis pKLPGE-WT (PGE с оптимизированными парами кодонов) (разное число копий) получена максимальная активность 0,2 ед./мл. В результате оптимизации характеристик белка PGE, в том виде как он экспрессировался в pKLPGE-12, для указанного мутанта PGE наблюдается повышение активности более чем в 50 раз. Ряд вариантов мутантов PGE-9, PGE-11 и PGE-12 были подвергнуты ферментации в более крупном масштабе, подтвердив улучшенную секрецию (данные не показаны). В данном примере показано, что с помощью модифицирования ряда сайтов гликозилирования и изменения полярности выходящих на поверхность гидрофобных частей фермента (определнных на основе моделирования PGE) нам удалось резко улучшить экспрессию и секрецию фермента PGE в K.lactis. При этом значительная активность была обнаружена также в супернатанте. Пример 3. Анализ на экспрессию и секрецию PGE дикого типа и PGE с оптимизированными характеристиками белка у A.nigerA.niger WT 6 трансформируют совместно с конструктом pGBAAS, содержащим в себе селекционный маркр A.nidulans amdS и вариантные pANPGE-плазмиды (табл. 5). Для каждой из трансформаций очищают по 20 колоний на содержащей ацетамид селективной среде, после чего приготовляют споровые пластинки так, как это описано в WO 99/32617. Для отбора трансформантов A.niger, которые являются настоящими котрансформантами, то есть они содержат как PGE, так и кассеты amdS, использовали ПЦР (не показано). Результаты показали, что по меньшей мере 50% из 20 отобранных трансформантов содержат одну или более копий экспрессирующего PGE конструкта. Эти PGE-содержащие трансформанты были использованы для дальнейшей работы. Споры PGE-трансформантов были собраны и использованы для ферментации во встряхиваемых колбах в ферментационной среде. В день 2 образцы супернатанта были собраны и проскринированы на липазную активность с использованием чашечного теста с трибутирином. В собранных образцах из трансформантов A.niger pANPGE-3 удалось выявить лишь очень небольшое обусловленное активностью сияние (данные не приводятся). Для трансформантов pANPGE-12 иpANPGE-13 было получено большое обусловленное активностью сияние (данные не приводятся). Для каждого из конструктов pANPGE-3, pANPGE-12 и pANPGE-13 трансформанты (1-3), показавшие наибольшую активность в чашечном тесте с трибутирином, были исследованы на липазную активность с использованием в качестве субстрата п-нитрофенилбутирата. Результаты разных тестов на активность мутантов PGE приведены в табл. 10. Таблица 10. PGE дикого типа с оптимизированными характеристиками белка,экспрессированные в A.niger Образцы супернатанта WT6 и отобранные трансформанты pANPGE-1216 и pANPGE-1330 были затем проанализированы на геле SDS-ПААГ (Invitrogen) и с помощью вестерн-блоттинга с использованием поликлональных антител к PGE (см. фиг. 4). Для варианта A.niger PGE с оптимизированными характеристиками белка pANPGE-12 в геле SDS-ПААГ была обнаружена полоса, соответствующая зрелойPGE. При использовании поликлонального антитела к PGE удалось обнаружить в супернатантах обоих трансформантов полосы перекрстной гибридизации. Полоса с наибольшей молекулярной массой (примерно 55 кДа) возможно соответствует мутанту зрелой PGE, а полосы перекрстной гибридизации с более низкой молекулярной массой возможно могут быть результатом протеолитической деградации. Можно сделать вывод, что изменяя полярность выходящих на поверхность частей фермента (определнных на основе моделирования PGE) в соответствии с правилами оптимизации характеристик белка,нам удалось резко улучшить экспрессию фермента PGE в A.niger. При этом высокая ферментативная активность была обнаружена также в супернатанте. Пример 4. Экспрессия в A.niger грибковых ферментов дикого типа и с оптимизированными характеристиками белка Приготовленные в примере 1 экспрессирующиеся конструкции pGBFINZDU, pGBFINZTB иpGBFINZTC вводились с помощью трансформации с использованием А.niger, как описано ниже. Для введения различных pGBFINZDU-, pGBFINZTB- и pGBFINZTC-векторов (табл. 6-8, соответственно) в штамм WT6 была проведена трансформация с последующей селекцией трансформантов, как описано вWO 1998/46772 и WO 1999/32617. Вкратце, выделяют линейную ДНК у всех pGBFIN-конструктов и используют для трансформации A.niger WT 6. Трансформанты отбирают на ацетамидной среде и производят очистку колоний в соответствии со стандартными методиками. Колонии анализируют на наличие интеграции в участке glaA и на копийность с использованием ПЦР. Отбирают три независимых трансформанта для каждого из pGBFINZDU-, pGBFINZTB- и pGBFINZTC-конструктов с близкими (по результатам анализа) копийностями (предположительно с единственной копией) и присваивают названия,используя номер трансформирующей плазмиды, например ZDU-WT-1, ZDU-WT-2, ZDU-WT-3, ZDU-6-1,ZDU-6-2, ZDU-6-3 и т.д., соответственно. Отобранные штаммы ZDU, ZTB и ZTC, а также A.niger WT6 используют для проведения экспериментов во встряхиваемых колбах со 100 мл ферментационной среды, как описано выше, при 34 С и 170 об/мин в инкубационной качалке с использованием 500-мл встряхиваемой колбы с перегородкой. После дня 3, дня 4 и дня 5 ферментации забирают образцы для определения количества образовавшегося внеклеточного белка с помощью гель-электрофореза и анализа хитиназной активности. Продукцию хитиназы, экспрессируемой каждым из A. niger ZDU-трансформантов, содержащим различные конструкты, измеряют в культуральном супернатанте. Измеренные уровни хитиназной активности в день 3 показаны на фиг. 5. Кроме того, образцы культурального супернатанта, взятые в день 4,анализируют с помощью гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия и окрашивания(фиг. 6). Из полученных результатов ясно, что оптимизированные характеристики белка оказывают положительное влияние на секрецию белка и повышенные уровни активности фермента хитиназы. Результаты приведены в табл. 6. Продукцию -глюкозидазы, экспрессируемой каждым из A.niger ZTB-трансформантов, содержащим различные конструкты, измеряют в культуральном супернатанте. Образцы культурального супернатанта, взятые в день 4, анализируют с помощью гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия и окрашивания (фиг. 7). Из полученных результатов ясно, что оптимизированные характеристики белка оказывают положительное влияние на секрецию белка и детектируемую, а потому повышенную экспрессию белка для фермента -глюкозидазы. Кроме того, с использованием в качестве субстрата pNP-глюкопиранозида была определена активность взятого в день 3 образца супернатанта при рН 4,5 и 40 С. Супернатант -глюкозидазы, которая была подвергнута оптимизации характеристик белка, показал повышение активности до 20 раз по сравнению с исходной -глюкозидазой, кодируемой геном с оптимизированными кодонами. Фоновая активность -глюкозидазы-предшественника, которая была измерена для пустого хозяина, была в два-четыре раза ниже, чем активность исходной -глюкозидазы, кодируемой геном с оптимизированными кодонами. Активность измеряли также с использованием в качестве субстрата целлобиозы при рН 4,5 и 40 С. Измеренное повышение активности составило по меньшей мере 30 раз по сравнению с исходной -глюкозидазой, кодируемой геном с оптимизированными кодонами(пустые штаммы-хозяева обладают от трх до десяти раз более низкой активностью по сравнению с родительской -глюкозидазой, кодируемой геном с оптимизированными кодонами). Результаты приведены в табл. 7. Продукцию эндоглюканазы, экспрессируемой каждым из A. niger ZTC-трансформантов, содержащим различные конструкты, измеряют в культуральном супернатанте. Образцы культурального супернатанта, взятые в день 4, анализируют с помощью гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия и окрашивания (фиг. 7). Из полученных результатов ясно, что оптимизированные характеристики белка оказывают положительное влияние на секрецию белка и детектируемую, а потому повышенную экспрессию белка для фермента эндоглюканазы. Активность эндоглюканазы в образцах супернатанта,взятых в день 3, определяют при рН 4,5 и 40 С, используя в качестве субстрата AZOкарбоксиметилцеллюлозу. Супернатант эндоглюканазы, которая была подвергнута оптимизации характеристик белка, показал повышение активности более чем в 350 раз по сравнению с геном с оптимизированными кодонами, экспрессированном в том же хозяине. Следует отметить, что столь высокое повышение активности обусловлено очень низкой базовой активностью в пустом штамме (не детектируемой с помощью SDS-ПААГ). В случае эндоглюканазы, кодируемой геном с оптимизированными кодонами,измеренная активность была приблизительно равной базовой активности, наблюдаемой в пустом штамме-хозяине. Результаты приведены в табл. 8. Ясно, что приведнные примеры показывают, что способ изобретения, состоящий в оптимизации характеристик белка, может быть использован для улучшение секреции и продукции целевых белков и ферментов. Кроме того, полученные результаты показывают, что способ изобретения может иметь широкое применение для улучшения экспрессии белков в каком-либо хозяине, в то время как экспрессирующая конструкция и хозяин уже были подвергнуты нескольким другим оптимизациям, таким, например, как сильный промотор, улучшенная последовательность инициации трансляции, оптимизированное применение кодонов и пар кодонов и/или улучшенный хозяин для экспрессии белка. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ улучшения секреции целевого полипептида эукариотической клеткой-хозяином, который включает в себя модифицирование значения набора релевантных характеристик белка в аминокислотном остове полипептида до приведения их в оптимальный диапазон или приближения к оптимальному значению для одной или более характеристик в эукариотическом хозяине путем модифицирования остова полипептида, где характеристики белка представляют собой свойства, которые могут быть расчтным путм вычислены, основываясь на аминокислотной последовательности белка и последовательности ДНК, где способ включает в себя(i) определение оптимального диапазона и оптимального значения для одной или более характеристик белка у эукариотического хозяина;(ii) определение набора релевантных характеристик белка у эукариотического хозяина, которые должны улучшить секрецию полипептида эукариотическим хозяином, если одна или более из этих релевантных характеристик модифицированы в аминокислотном остове полипептида; и(iii) модифицирование значения релевантных характеристик белка до приведения их в оптимальный диапазон или приближения к оптимальному значению, определнному в (i), причм (i) и (ii) могут выполняться в любом порядке. 2. Способ по п.1, в котором релевантный набор характеристик определяется следующим образом:a) сбор или создание набора данных S, который содержит данные об уровне секреции подходящего количества белков у определенного эукариотического хозяина и аминокислотные и ДНКпоследовательности этих белков;b) расчт белковых характеристик (F) для всех белков в наборе данных S;c) использование методов статистической классификации для выбора поднабора белковых характеристик (Fs), которое дат наилучшую эффективность статистического классификатора для различения секретируемых белков S+ и несекретируемых белков S- в наборе данных S, согласно должным образом определнному критерию эффективности классификатора. 3. Способ по п.2, в котором характеристики белка рассчитываются на основе набора зрелых белков. 4. Способ по п.1-3, в котором оптимальный диапазон или оптимальное значение характеристик белка для эукариотического хозяина определяются следующим образом:a) сбор или создание набора данных S, который содержит уровни секреции подходящего количества белков у некоторого эукариотического хозяина и аминокислотные и ДНК-последовательности этих белков;b) расчт характеристик белка (F) для всех белков в базе данных S;c) определение оптимального значения (Fopt) для каждой характеристики для соответствующего эукариотического хозяина путм аппроксимации распределения вероятности для каждой белковой характеристики, рассчитанной из S+, так, чтобы распределение значений характеристики хорошо описывалось выбранным распределением вероятности;d) определение оптимального диапазона каждой характеристики для эукариотического хозяина. 5. Способ улучшения секреции полипептида эукариотическим хозяином по любому из пп.1-4, который включает в себя:i) расчт характеристик белка для полипептида;ii) установление того, является ли одна или более характеристика белка полипептида за пределами оптимального диапазона или существенно отклоняется от оптимального значения для эукариотического хозяина;iii) рациональное изменение аминокислотной последовательности полипептида, в результате которого значение одной или более характеристик белка выведенной из аминокислотной последовательностиFsAA полипептида оказывается в оптимальном диапазоне или сдвигается в сторону оптимального значения в достаточной степени, определяемые как относительное улучшение RI или нормализованное относительное улучшение RIN, где изменение, определяемое символами RI или RIN, предпочтительно больше 10, 15, 20% и наиболее предпочтительно больше 30%. 6. Способ по п.1-5, в котором остов полипептида модифицирован по одной или более из следующих характеристик: количество аминокислот, молекулярная масса, изоэлектрическая точка, суммарный заряд при определнном рН, GRAVY-оценка, алифатический индекс, индекс нестабильности, композиционные признаки, атомный состав, касающийся атомов С, Н, N, О и S, частота аминокислот, частота дипептидов,частота трипептидов, частота кислых аминокислот, частота алифатических аминокислот, частота ароматических аминокислот, частота основных аминокислот, локальные характеристики, локализационные характеристики, Паттери гликозилирования и частота заряженных аминокислот. 7. Способ по п.1-6, в котором остов полипептида модифицирован по одной или более из следующих характеристик: частота основных аминокислот, частота полярных аминокислот, частота неполярных аминокислот, частота очень малых аминокислот, частота малых аминокислот, частота заряженных аминокислот, суммарный заряд при рН 7,2, изоэлектрическая точка, частота Asn, Arg, Ile, Cys, His, Gln, Val,Lys, Gly, Thr и Leu, соответственно, локализационные характеристики, виток цепи, рассчитанный методом Gamier, мотив PEST, рассчитанный методом EPESTFIND, значения локальной характеристики (LF) для pI, значения LF для GRAVY-оценки (общего среднего значения гидрофобности), значения LF для оценки ароматической составляющей, состав по сере (S). 8. Способ по п.1-6, в котором остов полипептида модифицирован по одной или более характеристике, выбранной из группы, состоящей из pI, суммарного заряда, суммарного заряда на длину, суммарного положительного заряда на длину, суммарного отрицательного заряда на длину, общего заряда на длину, GRAVI-оценки, оценки ароматической составляющей, алифатического индекса, частоты очень малых аминокислот, частоты малых аминокислот, частоты полярных аминокислот, частоты неполярных аминокислот, частоты заряженных аминокислот, частоты кислых аминокислот, частоты основных аминокислот, частоты алифатических аминокислот и частоты Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile,Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val, соответственно. 9. Способ по п.1-8, в котором остов полипептида модифицирован по одной или более характеристике, выбранной из группы, состоящей из pI, суммарного заряда (рН 7,2), суммарного заряда (рН 7,2) на длину, суммарного положительного заряда (рН 7,2) на длину, общего заряда (рН 7,2) на длину, алифатического индекса, частоты малых аминокислот, частоты полярных аминокислот, частоты неполярных аминокислот, частоты заряженных аминокислот, частоты кислых аминокислот, частоты аминокислот и частоты Arg, Gin, Glu, Lys, Phe и Thr, соответственно. 10. Способ по п.1-8, в котором остов полипептида модифицирован по одной или более характеристике, выбранной из группы, состоящей из сайтов гликозилирования, GRAVI-оценки, частоты полярных аминокислот, частоты неполярных аминокислот, частоты заряженных аминокислот, частоты кислых аминокислот, частоты основных аминокислот, частоты Glu, Lys и Thr, соответственно. 11. Способ по п.1-10, в котором по меньшей мере 5% аминокислот аминокислотного остова модифицированы, более предпочтительно по меньшей мере 10%, ещ более предпочтительно по меньшей мере 15% и ещ более предпочтительно модифицированы по меньшей мере 20% аминокислот аминокислотного остова. 12. Способ по п.1-10, в котором по меньшей мере 5 аминокислот аминокислотного остова модифицированы, более предпочтительно по меньшей мере 10 аминокислот, ещ более предпочтительно по меньшей мере 15 аминокислот, ещ более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, ещ более предпочтительно по меньшей мере 25 аминокислот и ещ более предпочтительно модифицированы по меньшей мере 30 аминокислот аминокислотного остова. 13. Способ по п.1-12, в котором достигнуто улучшение F-оценки по меньшей мере на 5% по сравнению с референсным белком дикого типа, более предпочтительно по меньшей мере на 10%, ещ более предпочтительно по меньшей мере на 15%, ещ более предпочтительно по меньшей мере на 20% и ещ более предпочтительно достигнуто улучшение по меньшей мере на 30% и при этом F-оценка рассчитывается по формуле гдеявляется взвешивающим фактором между 0 и 1 (01), предпочтительно 0,5, более предпочтительно 0,4 и наиболее предпочтительно =0,3, р составляет от 1 до 5, включительно (1 р 5) и предпочтительно p=2. 14. Способ по п.1-13, в котором модифицированы по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 характеристик, более предпочтительно по меньшей мере 10, ещ более предпочтительно по меньшей мере 15, ещ более предпочтительно по меньшей мере 20 и ещ более предпочтительно модифицированы по меньшей мере 30 характеристик. 15. Способ по п.1-14, в котором улучшены по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 характеристик, более предпочтительно по меньшей мере 10, ещ более предпочтительно по меньшей мере 15, ещ более предпочтительно по меньшей мере 20, ещ более предпочтительно по меньшей мере 25 и ещ более предпочтительно улучшены по меньшей мере 30 характеристик, при том, что предпочтительно ухудшены менее 10, более предпочтительно менее 5 и ещ более предпочтительно ухудшены менее 4 характеристик. 16. Способ по п.1-15, в котором характеристиками являются первичные характеристики. 17. Способ по п.1-16, в котором остов полипептида модифицирован по одной или более другой характеристике белка. 18. Способ по п.1-17, в котором модифицирован остов зрелого полипептида. 19. Способ по п.1-18, в котором эукариотической клеткой является дрожжевая клетка или клетка мицелиальных грибов. 20. Способ по п.1-19, в котором полипептидом является полипептид млекопитающих или бактериальный полипептид. 21. Способ по п.1-20, в котором специфичность модифицированного полипептида остатся в основном той же самой, что и до улучшения секреции. 22. Способ по п.1-21, в котором специфическая активность модифицированного полипептида остатся в основном той же самой, что и до улучшения секреции. 23. Способ по п.1-22, в котором улучшение секреции измеряют по повышению активности и в котором активность в внеклеточной среде повышается по меньшей мере на 5%. 24. Способ по п.1-23, в котором полипептидом является фермент, мембранный белок, гормон или рецептор. 25. Способ продуцирования целевого полипептида включающий в себя применение способа по любому из пп.1-24 к целевому полилептиду и продуцирование модифицированного полипептида с помощью рекомбинантной технологии.