Усовершенствованное определение экспрессии генов

УСОВЕРШЕНСТВОВАННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В изобретении предложен олигонуклеотид, праймер или зонд, содержащий нуклеотидную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Олигонуклеотид, праймер или зонд применим для определения статуса метилирования гена. Олигонуклеотиды могут быть использованы для диагностики или лечения рака. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к определению экспрессии генов CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3. Более конкретно, изобретение относится к способам определения метилированных или неметилированных форм CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 и к соответствующим олигонуклеотидам, праймерам, зондам, парам праймеров и наборам. Способы согласно изобретению включают в себя способы амплификации, в частности, основанные на флуоресценции способы ПЦР в режиме реального времени и ПЦР с анализом в конечной точке, и имеют диагностическое, прогностическое и терапевтическое применение. Описание предшествующего уровня техники настоящего изобретения Раково-тестикулярные (РТ) антигены Раково-тестикулярные (РТ) антигены представляют собой класс ассоциированных с опухолями антигенов, экспрессия которых в норме ограничена зародышевыми клетками в семенниках, яичниках или трофобластными клетками. Обычно такие антигены не экспрессируются в соматических тканях взрослого организма (Simpson et al., Nat. Rev. Cancer, 5(8): 615-625 (2005); Scanlan et al., Immunol. Reviews, 188: 22-32 (2002); Scanlan et al., Cane. Immun., 4: 1-15 (2004. Регуляция генов РТ-антигенов нарушается у пациентов, страдающих раковыми заболеваниями,приводя к аномальной экспрессии указанных антигенов при целом ряде опухолей. Первый идентифицированный РТ-антиген, MAGE-1, был идентифицирован в начале 1990-х годов при клонировании Тклеточных эпитопов (van der Bruggen et al., 1991 Science 13; 254(5038): 1643-7; van der Bruggen et al., 1999Science 254: 1643-1647; Traversah et al., 1992 Immunogenetics, 35(3): 145-152; и патент США 5342774,включенные в настоящий документ посредством ссылки). После этого методика серологического анализа библиотеки экспрессирующих клонов (SEREX) (Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(25) 1181011813 (1995) и патент США 5698396), анализ экспрессии рекомбинантного антигена на поверхности дрожжей (RAYS) (Mischo et al., Cane. Immun., 3: 5-16 (2003 и анализ дифференциальной экспрессии мРНК (Gure et al., Int. J. Cane, 85(5): 726-732 (2000 позволили идентифицировать дополнительные РТантигены. Иммуногенность некоторых РТ-антигенов у пациентов, страдающих раковыми заболеваниями,делает их идеальной мишенью для разработки противоопухолевых вакцин. Идентификация ассоциированных с опухолями антигенов, узнаваемых клеточными или гуморальными эффекторами иммунной системы, открыли новые перспективы для иммунотерапии раковых заболеваний. Концепция иммунотерапии основана на предположении, что антигенные белки, экспрессируемые в опухолях, можно использовать в качестве мишеней в терапевтических подходах на основе аутологичной иммунной системы. Специфичная по отношению к антигену иммунотерапия раковых заболеваний (ASCI) обеспечивает возможность направленного лечения. ASCI имеет два основных компонента: опухолевые антигены, чтобы направлять иммунный ответ специфично против злокачественной клетки,и адъювантные системы, которые включают в себя иммуностимулирующие соединения, выбранные для усиления противоопухолевого иммунного ответа.CTAG1B. Раково-тестикулярным антигеном, представляющим в настоящее время интерес для применения в иммунотерапии раковых заболеваний, является раково-тестикулярный антиген 1 В, кодируемый геном CTAG1B (также известным под названием гена NY-ESO-1). Указанный антиген вначале идентифицировали с использованием SEREX в плоскоклеточной карциноме пищевода в конце 90-х годов в Нью-Йоркском отделении Института Людвига по исследованию рака (Chen et al., PNAS USA,94(5): 1914-1918 (1997); и патент США 5804381, включенные в настоящий документ посредством ссылки). Белок CTAG1B содержит 180 аминокислот и обнаружен в целом ряде опухолей, включая без ограничения рак яичника, рак легкого, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак пищевода,рак мочевого пузыря и меланомы (Konishi J et al. Oncol. Rep. 2004 May; 11(5): 1063-7; Nicholaou T. et al.,Immunol. Cell Biol. 2006 Jun; 84(3): 303-17; Sugita Y. et al. Cancer Res. 2004 Mar 15; 64(6): 2199-204; Velazquez EF et al. Cancer Immun. 2007 Jul 12; 7: 11 и Jungbluth et al. 2001, Int. J. Cane, 92(6): 856-860). Спонтанные гуморальные и клеточные иммунные ответы против такого антигена описаны у пациентов сCTAG1B-позитивными опухолями, и идентифицирован ряд ограниченных HLA (антиген лейкоцитов человека) класса I и II пептидов (Jager et al., 1998 J. Exp. Med., 187(2): 265-270; Yamaguchi et al., 2004Clin. Cane. Res., 10(3): 890-961; и Davis et al., 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 (29): 10697-10702). Примерами патентной литературы являются патенты США 6140050, 6251603, 6242052, 6274145,6338947, 6417165, 6525177, 6605711, 6689742, 6723832, 6756044 и 6800730, включенные в настоящий документ посредством ссылки. В клиническом испытании три частично перекрывающихся полученных из CTAG1B пептида с мотивами связывания с HLA-A2 (157-167, 157-165 и 155-163) использовали в вакцине для лечения двенадцати пациентов с метастатическими экспрессирующими NY-ESO-1 опухолями. Это исследование показало, что синтетические пептиды NY-ESO-1 можно безопасно вводить и что они способны вызывать потенциально полезные Т-клеточные ответы (Jager et al., 2000 PNAS USA, 97(22): 12198-12203). Разными группами в белке было идентифицировано несколько эпитопов МНС (главного комплекса гистосовместимости) класса I и II. Подобная коллагену область на N-конце содержит по меньшей мере-1 021100 один эпитоп МНС класса I, называемый А 31. Центральная область содержит несколько эпитопов МНС класса 2, называемых DR1, DR2, DR4, DR7 и DP4. Эта область также содержит несколько эпитопов МНС класса I, называемых В 35, В 51, Cw3 и Cw6. Считается, что С-конец содержит по меньшей мере два эпитопа класса II (DR4 и DP4) и один эпитоп класса I (A2).CTAG2. Вследствие высокой степени сходства последовательности с CTAG1 следующим раковотестикулярным антигеном, представляющим возможный интерес для иммунотерапии, является CTAG2(также известный как ген под названием LAGE-1). Описаны два транскрипта CTAG2, LAGE-Ia и LAGEIb. LAGE-Ib не полностью сплайсируется и кодирует предполагаемый белок примерно из 210 аминокислотных остатков, тогда как генный продукт LAGE-Ia содержит 180 аминокислотных остатков (Sun et al.N-концевые области белков LAGE-1 и NY-ESO-1 высококонсервативны и, предположительно,имеют идентичность более 97%. Однако, LAGE-1 отличается от NY-ESO-1 в центральных областях, которые идентичны только на 62%. С-концы NY-ESO-1 и LAGE-Ia высококонсервативны (идентичность более 97%). Однако С-конец LAGE-Ib длиннее и, предположительно, имеет идентичность менее 50% с такой же областью в LAGE-Ia/NY-ESO-1. Общая информация, имеющая отношение к указанным двум белкам, доступна на веб-сайте LICRPRAME. Антиген PRAME, преимущественно экспрессируемый в меланоме, сначала выделили в виде гена, кодирующего антиген меланомы человека, узнаваемый реактивными по отношению к меланоме цитотоксическими Т-клетками (CTL). PRAME не был определен как РТ-ген из-за следовых уровней его экспрессии в некоторых нормальных тканях взрослого организма, включая эндометрий и надпочечники. Однако, PRAME проявляет другие основные свойства РТ-генов, т.е. высокую экспрессию в семенниках и усиленную регуляцию в различных опухолях, включая меланому (97%), саркому (80%), мелкоклеточный рак легкого (70%), почечно-клеточную карциному (40%) и рак головы и шеи (29%). В случае указанного гена наблюдали пять альтернативно сплайсируемых вариантов транскрипта, кодирующих один и тот же белок. Предполагаемый белок из 509 аминокислот имеет хорошо охарактеризованные эпитопы, презентируемые молекулами HLA-A24 и HLA-A2.al., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4987-4991; Pold et al., 1999 Genomics 59: 161-167; Rogner et al.,1995 Genomics 29: 725-731) и их функция еще не определена (Ohman et al. 2001, Exp Cell Res. 265(2): 18594). Гены MAGE высоко гомологичны, и представители семейства MAGE-А, в частности, гомологичны на 60-98%. Ген MAGE-А 3 человека экспрессируется в различных типах опухолей, включая меланому (Furuta etClinical Biochemistry 39, 259-266), карциному желудка (Honda et al. 2004 British Journal of Cancer 90, 838843), рак прямой и ободочной кишки (Kim et al. 2006 World Journal of Gastroenterology 12, 5651-5657) и рак легкого (НМРЛ) (Scanlan et al. 2002 Immunol. Rev. 188: 22-32; Jang et al. 2001 Cancer Res. 61, 21: 79597963). Экспрессии ни в одной нормальной ткани взрослого организма, за исключением только зародышевых семенников или плаценты, не наблюдается (Haas et al. 1988 Am. J. Reprod. Immunol. Microbiol. 18: 47-51; Takahashi et al. 1995 Cancer Res 55: 3478-382). Важно иметь количественные высокопроизводительные анализы, позволяющие специфично выявлять пациентов, экспрессирующих CTAG1B, CTAG2 и/или PRAME, которым может быть полезна иммунотерапия, отслеживать экспрессию CTAG1B, CTAG2 и/или PRAME в целях определения дозы, идентифицировать образцы, экспрессирующие CTAG1B, CTAG2 и/или PRAME, в клинических испытаниях или просто идентифицировать пациентов раковым заболеванием на ранних стадиях. Описан ряд применимых диагностических способов и применение экстракции РНК и ОТ-ПЦР (например, в публикациях Odunsi etal., Cancer Research 63, 6076-6083, 2003; Sharma et al., Cancer Immunity, vol. 3, p. 19, 2003). Самым большим недостатком имеющихся анализов является то, что они требуют выделения РНК,чтобы оценить экспрессию CTAG1B, CTAG2 и/или PRAME. Получение фиксированной формалином,залитой парафином (FFPE) опухолевой ткани является обычным способом консервации опухолевой ткани в клинических центрах. Фиксация в формалине изменяет структуру молекул РНК в ткани, вызывая поперечное связывание, а также частичную деградацию. Частичная деградация приводит к образованию более мелких кусочков РНК длиною 100-300 оснований. Такие структурные изменения в РНК ограничивают применение РНК, экстрагированной из FFPE-ткани, для измерения уровней экспрессии CTAG1B,CTAG2 и/или PRAME. Метилирование генов Метилирование генов является важным регулятором экспрессии генов. В частности, метилирование по остаткам цитозина, обнаруженное в динуклеотидных парах CpG в промоторной области специфичных-2 021100 генов, может вносить вклад во многие патологические состояния посредством понижающей регуляции экспрессии генов. Например, аномальное метилирование генов супрессоров опухолей может приводить к повышающей или понижающей регуляции таких генов и, следовательно, ассоциировано с наличием и развитием многих раковых заболеваний (Hoffmann et al. 2005 Biochem. Cell Biol. 83: 296-321). Профили аномального метилирования генов часто специфичны для источника ткани. Соответственно, определение статуса метилирования специфичных генов может иметь прогностическое и диагностическое применение и может быть использовано как для определения относительной стадии заболевании, так и для прогнозирования ответа на некоторые типы терапии (Laird. 2003 Nat. Rev. Cancer 3: 253-266). Статус метилирования CTAG1B, CTAG2 и/или PRAME в некоторой степени исследовали в раковых тканях. Было высказано предположение, что метилирование ДНК является молекулярным механизмом,непосредственно отвечающим за высокую экспрессию гена PRAME при хроническом миелоидном лейкозе (CLM). Анализ промотора, экзона 1 и экзона 2 PRAME показал, что PRAME имеет три островкаCpG: островок 201 п.н. расположен в промоторе, островок 204 п.н. находится в экзоне 1 и островок 310 п.н. находится в экзоне 2, из которых только для CpG-островка в экзоне 2 показана эпигенетическая регуляция (Gomez-Roman et al. Leukemia Research 31 (2007) 1521-1528). В ходе сочетания экспериментов по укорочению ДНК/трансфекции с метилированием ДНК также показано, что изменения профиля метилирования в определенных частях регуляторных областей PRAME достаточны для его повышающей регуляции в клетках, которые обычно не экспрессируют данный ген. Также был исследован статус метилирования LAGE-1 (De Smet et al. (1999) Molecular and CellularBiology: 7327-7335). Из-за высокого сходства последовательностей LAGE-1 и LAGE-2/NY-ESO-1 было трудно найти различия в статусе метилирования промоторных последовательностей этих двух генов. Специфичную к метилированию ПЦР (MSP) с визуализацией результатов в геле (основанный на геле MSP-анализ) широко применяют для определения эпигенетического сайленсинга генов (Esteller M etal. Cancer Res 2001; 61: 3225-9), хотя разработаны количественные тесты на основе других методов (LairdDiagn. 2007). Имеется ряд основанных на флуоресценции способов мониторинга в режиме реального времени реакций амплификации нуклеиновых кислот. Одна из таких методик описана в патенте США 6090552 и Европейском патенте 0912597 и имеет коммерческое наименование Amplifluor. Указанный способ также подходит для мониторинга реакций амплификации нуклеиновых кислот в конечной точке. Vlassenbroeck с соавторами (Vlassenbroeck et al., 2008. Journal of Molec. Diagn., V10, No. 4) описывают стандартизованный прямой MSP-анализ в режиме реального времени с применением методики Amplifluor. Целью настоящего изобретения являются усовершенствованные анализы, которым не свойственны недостатки существующих анализов. Краткое описание сущности изобретения Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам и/или анализам для измерения экспрессии. Настоящее изобретение, кроме того, относится к некоторым типам терапии, в частности,основанным на антигенспецифичной иммунотерапии раковых заболеваний (ASCI) лечении пациентов, у которых выявлена экспрессия CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, путем применения олигонуклеотидов, праймеров, зондов, пар праймеров, наборов и/или способов, описанных в настоящем документе. Экспрессию (белка) CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 регистрируют, определяя статус метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, а не измеряя уровень экспрессии самого гена. Авторы настоящего изобретения показали, что результат, показывающий статус метилирования в предлагаемых авторами тестах метилирования, хорошо согласуется с результатами, полученными с использованием анализа ОТ-ПЦР для экспрессии CTAG1B, CTAG2 и/или PRAME в образцах НМРЛ, меланомы и рака молочной железы. В случае образцов, например, тонкоигольных биоптатов немелкоклеточного рака легкого, для которых количественная ОТ-ПЦР оказывается сложной, экспрессия белка, выявляемая благодаря определению статуса метилирования гена MageA3, предоставляет ценную альтернативу. Таким образом, анализы применимы для отбора пациентов (подходящих) для лечения, для прогнозирования вероятности успешного лечения пациента и могут быть использованы для помощи при выборе терапии для пациента. В одном аспекте настоящего изобретения предлагается олигонуклеотид, праймер или зонд, содержащий или по существу состоящий или состоящий из нуклеотидной последовательности, указанной в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63; и такой олигонуклеотид, праймер или зонд применим для определения статуса метилирования гена. Олигонуклеотид, праймер или зонд предпочтительно содержит, по существу состоит или состоит из следующих непрерывно следующих друг за другом последовательностей в порядке от 5'- к 3'-концу:(a) первой нуклеотидной последовательности длиной примерно от 6 до 30 нуклеотидов, причем нуклеотид в указанной первой нуклеотидной последовательности помечен первым остатком, выбранным из донорного остатка и акцепторного остатка пары для молекулярного переноса энергии, причем донор-3 021100 ный остаток при возбуждении испускает флуоресценцию при одной или нескольких конкретных длинах волн, а акцепторный остаток поглощает и/или гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанным донорным остатком;(b) второй одноцепочечной нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 3-20 нуклеотидов;(c) третьей нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 6-30 нуклеотидов, причем нуклеотид в указанной третьей нуклеотидной последовательности помечен вторым остатком, выбранным из указанного донорного остатка и указанного акцепторного остатка, и указанный второй остаток является представителем указанной группы, которым не помечена указанная первая нуклеотидная последовательность, причем указанная третья нуклеотидная последовательность комплементарна в обратном порядке указанной первой нуклеотидной последовательности, так что может образовываться дуплекс между указанной первой нуклеотидной последовательностью и указанной третьей нуклеотидной последовательностью таким образом, что указанные первый остаток и второй остаток оказываются рядом друг с другом, так что когда донорный остаток возбуждается и испускает флуоресценцию, акцепторный остаток поглощает и гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанным донорным остатком; и(d) находящейся на 3'-конце праймера четвертой одноцепочечной нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 8-40 нуклеотидов, которая содержит на своем 3'-конце любую из нуклеотидных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,40,42, 44, 62 и 63; причем когда указанной дуплекс не образуется, указанный первый остаток и указанный второй остаток разделены на такое расстояние, которое предотвращает молекулярный перенос энергии между указанным первым и вторым остатком. Специфичные нуклеотидные последовательности на 3'-конце позволяют определять статус метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3. Такие праймеры предпочтительно связываются с неметилированными формами гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 после обработки соответствующим реагентом (которые обсуждаются в настоящем документе). Свойства таких олигонуклеотидов обсуждаются в настоящем документе, и такое обсуждение применимо с соответствующими поправками. Специфичные нуклеотидные последовательности способны праймировать осуществляемый полимеразой нуклеиновых кислот синтез нуклеотидной последовательности, комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, содержащей часть метилированной или неметилированной ДНК гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3. Наиболее предпочтительно олигонуклеотид, праймер или зонд состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 или 61 и применим для амплификации части представляющего интерес гена. Кроме того, предлагается пара праймеров, включающая в себя праймер, содержащий или по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Подходящие пары праймеров могут быть легко определены специалистом в данной области на основе смыслового и антисмыслового праймера, направляющих амплификацию соответствующей части рассматриваемого гена (который обсуждается в настоящем документе). Примеры пары праймеров согласно изобретению указаны в табл. 1. В п.6 формулы изобретения также перечислены подходящие пары праймеров. В следующем аспекте предлагается набор, содержащий по меньшей мере один праймер, пару праймеров или набор праймеров, содержащий или по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Набор предназначен для определения статуса метилирования гена, в частности такого гена, как CTAG1B,CTAG2, PRAME и/или MageA3. В следующем аспекте изобретение относится к способу определения статуса метилирования гена(a) осуществление контакта/обработки ДНК-содержащего образца реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с получением определяемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;(b) амплификацию по меньшей мере части представляющего интерес метилированного или неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, из которых по меньшей мере один праймер сконструирован так, чтобы он связывался только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК, соответственно, после обработки реагентом, причем по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63 (в зависимости от ситуации).-4 021100 В следующем аспекте предлагается способ диагностики рака или предрасположенности к развитию рака, предусматривающий определение статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/илиMageA3 в образце с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, описанных в настоящем документе, причем присутствие неметилированного CTAG1B, CTAG2,PRAME и/или MageA3 в образце является показателем наличия рака или предрасположенности к развитию рака. В следующем аспекте предлагается способ определения наличия позитивной по CTAG1B, CTAG2,PRAME и/или MageA3 опухоли, предусматривающий определение статуса метилирования генаCTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 в образце с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, описанных в настоящем документе, причем присутствие неметилированного CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 является показателем наличия позитивной по CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 опухоли. Под позитивной по CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 опухолью подразумевают любую опухоль или опухолевые клетки (выделенные из организма пациента), которые экспрессируют антиген CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3. Кроме того, изобретение относится к способу идентификации и/или отбора пациента, подходящего для лечения иммунотерапевтическим средством на основе CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3,предусматривающему определение статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/илиCTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 не метилирован, то субъекта (предпочтительно) идентифицируют и/или отбирают для лечения иммунотерапевтическим средством на основе CTAG1B, CTAG2,PRAME и/или MageA3. Таким образом, пациентов с неметилированным CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 предпочитают пациентам, у которых ген метилирован. Альтернативно, если ген не метилирован, то субъекта предпочтительно не идентифицируют и не выбирают для лечения иммунотерапевтическим средством на основе CTAG1B, CTAG2, PRAME и/илиMageA3. В родственном аспекте изобретение относится к способу прогнозирования вероятности успешного лечения рака, предусматривающему определение статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 в образце, полученном от пациента, с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе, причем если ген не метилирован, то вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим средством на основеCTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 выше, чем в том случае, когда ген метилирован. Альтернативно, отсутствие неметилированного CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 в образце свидетельствует, что вероятность устойчивости к лечению иммунотерапевтическим средством на основеCTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 выше, чем в том случае, когда ген не метилирован. Таким образом, выявление метилированного гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 свидетельствует о том, что возможность успешного лечения иммунотерапевтическим средством мала. В следующем родственном аспекте изобретение относится к способу подбора подходящей схемы лечения рака, предусматривающему статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/илиMageA3 в образце, полученном от пациента, с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда,пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе, причем если ген не метилирован, то для лечения выбирают иммунотерапевтическое средство. Альтернативно, если ген не метилирован, то лечение иммунотерапевтическим средством противопоказано. Также предлагается способ лечения рака у субъекта, предусматривающий введение иммунотерапевтического средства, причем субъекта для лечения выбирают на основе измерения статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 согласно любому из способов согласно изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа,которые описаны в настоящем документе. Предпочтительно во всех различных описанных в настоящем документе аспектах выявление неметилированного гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 соответствует повышенному уровню белка CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, предусматривающему измерение статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 согласно любому из способов согласно изобретению и/или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе, и затем введение пациенту композиции, содержащей CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, описанной в настоящем документе. Композицию предпочтительно вводят, если обнаружено, что ген CTAG1B, CTAG2, PRAME и/илиMageA3 неметилирован. В следующем аспекте предлагается способ лечения пациента, подверженного рецидиву опухоли,экспрессирующей CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, когда у пациента была удалена опухолевая-5 021100 ткань, причем способ предусматривает измерение статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2,PRAME и/или MageA3 в опухолевой ткани любым из способов согласно изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе, и затем введение пациенту композиции, содержащей CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, описанной в настоящем документе. Композицию предпочтительно вводят, если обнаружено, что ген CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 является неметилированным. В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается применение композиции, содержащейCTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, для производства лекарственного средства для лечения страдающего опухолью пациента, причем пациент отобран для лечения на основе измерения статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 согласно любому из способов, предлагаемых в изобретении, или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе. Также предлагается композиция, содержащаяCTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, для применения при лечении страдающего опухолью пациента, причем пациент отобран для лечения на основе измерения статуса метилирования гена CTAG1B,CTAG2, PRAME и/или MageA3 согласно любому из способов, предлагаемых в изобретении, или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе. В еще одном варианте предлагается применение композиции, содержащей CTAG1B, CTAG2,PRAME и/или MageA3, для производства лекарственного средства для лечения пациента, подверженного рецидиву опухоли, экспрессирующей CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, причем пациент для лечения отобран на основе измерения статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/илиMageA3 любым из способов согласно изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе. Также предлагается композиция, содержащая CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, для применения для лечения пациента, подверженного рецидиву опухоли, экспрессирующей CTAG1B, CTAG2, PRAME и/илиMageA3, причем пациент для лечения отобран на основе измерения статуса метилирования генаCTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 любым из способов согласно изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе. Подробное описание изобретения Изобретение относится к анализу для определения присутствия и/или количества метилированного или неметилированного гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 в ДНК-содержащем образце. Для разработки этого анализа было необходимо идентифицировать области, чувствительные к метилированию, в гене CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, и разработать конкретные олигонуклеотиды, которые могут отличать неметилированные формы гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 от метилированных форм таких генов. Соответственно, в первом аспекте в настоящем изобретении предлагается олигонуклеотид, праймер или зонд, содержащий или по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Эти олигонуклеотиды применимы для определения статуса метилирования представляющего интерес гена. Олигонуклеотиды могут служить в качестве праймеров и/или зондов. В некоторых вариантах олигонуклеотиды выявляют неметилированную форму гена. В некоторых вариантах эти олигонуклеотиды содержат структуру шпильки, которая описана в настоящем документе, представлены последовательностью SEQ ID NO: 43. Такие предпочтительные олигонуклеотиды содержат, по существу состоят или состоят из нуклеотидных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39,41 или 61 для выявления неметилированной формы гена. Термины гены или представляющий интерес ген согласно изобретению предпочтительно означают гены CTAG1B, и/или CTAG2, и/или PRAME, и/или MageA3.CTAG1B является обозначением гена, утвержденным Комитетом по номенклатуре генов HUGO. Ген локализован в Х-хромосоме (положение Xq28) и последовательность гена представлена под номерами доступа U87459 и NM001327. Единый идентификационный номер гена ENSG00000184033. Ген кодирует раково-тестикулярный антиген 1B [Homo sapiens]. CTAG1B часто взаимозаменяемо называютCTAG1B, или CTAG, или CTAG1, или NY-ESO-1, или ESO1, или LAGE-2, или LAGE2B,все указанные названия использованы в настоящем документе. Гипометилирование указанного гена может быть связано с развитием раковых заболеваний, таких как меланома, рак легкого (включая НМРЛ),рак предстательной железы или рак яичника, например.CTAG2 является обозначением гена, утвержденным Комитетом по номенклатуре генов HUGO. Ген локализован в Х-хромосоме (положение Xq28) и последовательность гена указана под номером доступа AJ012833. Единый идентификационный номер гена ENSG00000126890. Ген кодирует раковотестикулярный антиген 2 [Homo sapiens]. CTAG2 часто взаимозаменяемо называют CTAG2, илиCAMEL, или ESO2, или LAGE-1, или LAGE-2b, или MGC3803, или MGC138724, все указанные названия использованы в настоящем документе. Гипометилирование указанного гена может быть связано с развитием раковых заболеваний, таких как меланома, рак легкого (включая НМРЛ), рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак головы и шеи, рак яичника, рак шейки матки, рак прямой и ободочной кишки, карцинома пищевода или печеночноклеточная карцинома.PRAME является обозначением гена, утвержденным Комитетом по номенклатуре генов HUGO. Ген локализован в хромосоме 22 (положение 22q11.22) и последовательность гена указана под номерами доступа U65011 и NM206953. Единый идентификационный номер гена ENSG00000185686. Ген кодирует антиген, преимущественно экспрессируемый в меланоме [Homo sapiens]. PRAME часто взаимозаменяемо называют МАРЕ или OIP4; все приведенные названия использованы в настоящем документе. Гипометилирование указанного гена может быть связано с развитием раковых заболеваний, таких как рак шейки матки, рак предстательной железы, рак легкого, рак яичника, рак молочной железы или плоскоклеточная карцинома головы и шеи.MAGEA3 и MAGEA6 являются обозначениями генов, утвержденными Комитетом по номенклатуре генов HUGO. Ген MAGEA3 локализован в хромосоме X (положение q28) и последовательность гена указана под номерами доступа NM005362 и ENSG00000197172. Ген MAGE-А 3 кодирует семейство антигенов меланомы А, 3. Ген MAGEA6 локализован в Х-хромосоме (положение q28). MAGE-А 3 часто взаимозаменяемо называют MAGE-3 или MAGEA3. Подобным образом MAGE-A6 часто взаимозаменяемо называют MAGE-6 или MAGEA6; все указанные названия использованы в настоящем документе. Гипометилирование указанных генов может быть связано с развитием раковых заболеваний, таких как, например, меланома или рак легкого (включая НМРЛ). Динуклеотиды CpG, чувствительные к метилированию, обычно сконцентрированы в областях промоторов и/или экзонов и/или интронов генов человека. В некоторых вариантах осуществления статус метилирования гена оценивают, определяя уровни метилирования в области промотора, интрона, экзона 1 и/или экзона 2 гена. Промотор представляет собой область выше стартового сайта транскрипции(TSS), простирающуюся примерно на 10 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 1 т.п.н., 500 п.н. или от 150 до 300 п.н. отTSS. Когда распространение CpG в области промотора довольно незначительно, то уровни метилирования можно оценивать в областях интронов и/или экзонов. Областью, используемой для оценки, может быть область, которая содержит последовательности как интрона, так и экзона и, следовательно, перекрывает обе области. Термин состояние метилирования или статус метилирования относится к присутствию или отсутствию 5-метилцитозина (5-mCyt) в одном или множестве динуклетидов CpG в последовательности ДНК. Гиперметилирование определяют как увеличение уровня метилирование выше нормальных уровней. Таким образом, термин относится к аномальному метилированию цитозина (5-mCyt) в конкретных сайтах CpG в гене, часто в области промотора. Нормальные уровни метилирования могут быть определены посредством измерения уровня метилирования, например, в нераковых клетках. Гипометилирование относится к пониженному присутствию 5-mCyt в одном или множестве динуклеотидов CpG в последовательности ДНК (тестируемого образца ДНК) по сравнению с количеством 5-mCyt, обнаруженным в соответствующих динуклеотидах CpG в нормальной последовательности ДНК (найденным в подходящем образце). Опять же, нормальные уровни метилирования могут быть определены посредством измерения уровня метилирования, например, в нераковых клетках. В соответствии с настоящим изобретением гипометилирование гена CTAG1B, CTAG2 и/или PRAME (или в некоторых аспектах MageA3) является показателем повышенной экспрессии этого ассоциированного с опухолью антигена гена, которая является надежным показателем наличия рака. Во втором аспекте изобретение относится к способу определения присутствия и/или количества метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце, предусматривающему стадию осуществления контакта ДНК-содержащего образца по меньшей мере с одним олигонуклеотидом, содержащим, по существу состоящим или состоящим из любой из нуклеотидных последовательностейSEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Способ предпочтительно предусматривает дополнительную стадию оценки того, является ли ген метилированным или неметилированным. Оценка может зависеть от того, связывается ли олигонуклеотид стабильно с ДНК в ДНК-содержащем образце, как обсуждается в настоящем документе. Методы оценки статуса метилирования основаны на разных подходах. Можно применять любую подходящую методику, в которой используют олигонуклеотиды согласно изобретению. В одном варианте осуществления в подходах к выявлению мотивов метилированных динуклеотидов CpG используют реагент, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с образованием определяемых модифицированных остатков. Реагент не модифицирует метилированные остатки цитозина и, таким образом, позволяет отличать неметилированные молекулы нуклеиновой кислоты от метилированных молекул в способе на последующем этапе, который предпочтительно может предусматривать амплификацию нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления реагент может действовать,-7 021100 избирательно дезаминируя неметилированные остатки цитозина. Следовательно, после воздействия регентом неметилированная ДНК содержит другую нуклеотидную последовательность, отличающуюся от последовательности соответствующей метилированной ДНК. Дезаминирование цитозина приводит к появлению остатка урацила, который обладает такими же свойствами спаривания, как тимин, и, следовательно, имеет другое поведение при спаривании оснований, отличающееся от поведения цитозина. Такой способ позволяет отличать метилированные остатки цитозина от неметилированных. В обычно применяемых методиках оценки различий по последовательности используют олигонуклеотидные праймеры. Возможны два способа конструирования праймеров. Во-первых, могут быть сконструированы праймеры, которые сами по себе не охватывают все возможные сайты метилирования ДНК. Изменения последовательности в сайтах дифференциального метилирования локализованы между двумя участками связывания праймеров, и визуализация изменения последовательности требует дополнительных стадий анализа. Во-вторых, могут быть сконструированы праймеры, которые специфично гибридизуются либо с метилированным, либо с неметилированным вариантов исходной обрабатываемой последовательности. После гибридизации может быть осуществлена реакция амплификации и продукты амплификации проанализированы с использованием любой системы регистрации, известной в данной области техники. Присутствие продукта амплификации указывает, что праймер гибридизовался с ДНК. Специфичность праймера свидетельствует о том, была ли модифицирована ДНК или нет, что, в свою очередь, указывает, была ли ДНК метилирована или нет. Если существует достаточная область комплементарности, например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 нуклеотидов, с мишенью, то праймер также может содержать дополнительные остатки нуклеотидов, которые не мешают гибридизации, но могут быть полезны для других манипуляций. Примерами таких других остатков могут быть участки расщепления эндонуклеазами рестрикции, участки для связывания лиганда или для связывания фактора или линкеры или повторы, или остатки, необходимые в целях визуализации. Олигонуклеотидные праймеры могут не быть или быть такими, что они являются специфичными по отношению к модифицированных метилированным остаткам. Предпочтительные олигонуклеотиды для применения в качестве праймеров содержат, по существу состоят или состоят из любой из нуклеотидных последовательностейSEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 или 61. Следующим и часто дополнительным путем для того, чтобы отличить модифицированную нуклеиновую кислоту от немодифицированной, является использование олигонуклеотидных зондов. Такие зонды могут гибридизоваться непосредственно с модифицированной нуклеиновой кислотой или с дополнительными продуктами модифицированной нуклеиновой кислоты, такими как продукты, полученные при амплификации. В основанных на зондах анализах используют гибридизацию олигонуклеотидов с конкретными последовательностями и последующую регистрацию гибрида. Также могут иметь место дополнительные стадии очистки перед регистрацией продукта амплификации, например, стадия преципитации. Олигонуклеотидные зонды можно метить с использованием любой системы регистрации, известной в данной области техники. Такие системы включают без ограничения флуоресцирующие остатки,меченые радиоактивными изотопами остатки, биолюминесцентные остатки, люминесцентные остатки,хемилюминесцентные остатки, ферменты, субстраты, рецепторы или лиганды. Олигонуклеотиды для применения в качестве зондов могут содержать, по существу состоять или состоять из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Предпочтительный олигонуклеотидный зонд предпочтительно содержит, по существу состоит или состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 28,30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 и 61. Термин олигонуклеотидный праймер в настоящем документе используют взаимозаменяемо с термином праймер. Подобным образом олигонуклеотидный зонд в настоящем документе используют взаимозаменяемо с термином зонд. В предпочтительных вариантах осуществления статус метилирования гена (или его части, особенно островков CpG) определяют, используя специфичную по отношению к метилированию ПЦР (MSP). Методика MSP известна специалистам в данной области техники. В способе MSP ДНК может быть амплифицирована с использованием пары праймеров, сконструированных таким образом, чтобы отличать неметилированную ДНК от метилированной ДНК, пользуясь различиями в последовательностях после обработки бисульфитом натрия (Herman J.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 Sep 3; 93(18): 9821-6 и WO 97/46705). Конкретным примером методики MSP является способ, названный количественной MSP в режиме реального времени (QMSP), который позволяет проводить надежную количественную оценку метилированной ДНК в режиме реального времени. Способы, осуществляемые в режиме реального времени, как правило, основаны на непрерывном оптическом мониторинге процесса амплификации и использовании флуоресцентно меченых реагентов,включение которых в продукт можно количественно оценить и количественная оценка которых является показателем количества копий этой последовательности в матрице. Таким меченым реагентом может быть флуоресцирующий краситель, который предпочтительно связывает двухцепочечную ДНК и флуо-8 021100 ресценция которого значительно повышается при связывании двухцепочечной ДНК. Альтернативно,можно использовать меченые праймеры и/или меченые зонды. Они находят конкретное применение в хорошо известных и коммерчески доступных методиках амплификации в режиме реального времени,таких как TAQMAN, MOLECULAR BEACONS, AMPLIFLUOR и SCORPION DzyNA и т.д. Часто такие способы в режиме реального времени используют вместе с полимеразной цепной реакцией(ПЦР). В методике TaqMan используют линейные гидролитические олигонуклеотидные зонды, которые содержат флуоресцирующий краситель и гасящий краситель. При возбуждении возбужденный флуоресцирующий краситель передает энергию на расположенную рядом молекулу гасящего красителя, а не флуоресцирующего (принцип FRET). Зонды TaqMan отжигаются с внутренними областями ПЦРпродукта и расщепляются экзонуклеазной активностью полимеразы, когда она реплицирует матрицу. При этом прекращается активность гасителя, и репортерный краситель начинает испускать флуоресценцию, которая увеличивается в каждом цикле пропорционально степени расщепления зонда. Молекулярные маяки также содержат флуоресцирующий и гасящий красители, но они сконструированы так, что их структура принимает форму шпильки, если они находятся свободно в растворе, при этом приводя оба красителя в непосредственную близость так, что происходит резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET). Когда маяк гибридизуется с мишенью на стадии отжига, шпилька линеаризуется, и оба красителя (донор и акцептор/гаситель) расходятся. Усиление флуоресценции, регистрируемой от донора, будет коррелировать с количеством имеющегося ПЦР-продукта. В случае зондов-скорпионов специфичное для последовательности праймирование и регистрацию ПЦР-продукта осуществляют, используя один олигонуклеотид. Зонд-скорпион поддерживает конфигурацию стебель-петля в негибридизованном состоянии и между флуорофором и гасителем происходитFRET. 3'-Часть стебля также содержит последовательность, которая комплементарна продукту удлинения праймера. Такая последовательность связана с 5'-концом специфичного праймера неамплифицируемым мономером. После удлинения праймера скорпиона специфичная последовательность зонда способна связываться со своим комплементом в удлиненном ампликоне, при этом раскрывая петлю шпильки, отдаляя друг от друга флуорофор и гаситель и обеспечивая сигнал флуоресценции. В анализе Heavymethyl праймирование является специфичным для метилирования, но такую специфичность обеспечивают неудлиняемые олигонуклеотидные блокаторы, а не сами праймеры. Блокаторы связываются с обработанной бисульфитом ДНК специфичным по отношению к метилированию образом, и сайты из связывания перекрывают сайты связывания праймера. Когда блокатор связывается,праймер не может связываться, и поэтому ампликон не образуется. Heavymethyl можно использовать в сочетании с регистрацией в режиме реального времени. Системы кПЦР и кОТ-ПЦР Plexor используют преимущество специфичного взаимодействия между двумя модифицированными нуклеотидами, чтобы осуществлять количественный ПЦР-анализ. Один из ПЦР-праймеров содержит флуоресцирующую метку рядом с остатком изо-dC на 5'-конце. Второй ПЦР-праймер не метят. Реакционная смесь содержит дезоксинуклеотиды и изо-dGTP, модифицированный гасителем дабцилом. Дабцил-изо-dGTP предпочтительно включается в положение, комплементарное остатку изо-dC. Включение дабцил-изо-dGTP в указанное положение приводит к гашению флуоресцирующего красителя на комплементарной цепи и снижению флуоресценции, что обеспечивает возможность количественной оценки во время амплификации. В случае таких множественных реакций используют пары праймеров с разными флуорофорами для каждой последовательности-мишени. Таким образом, олигонуклеотиды, содержащие, по существу состоящие или состоящие из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63, можно применять в качестве праймеров или зондов в вышеупомянутых способах определения статуса метилирования представляющего интерес гена. В предпочтительном варианте изобретение относится к способу определения присутствия и/или количества представляющего интерес метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце в режиме реального времени, предусматривающему(a) осуществление контакта/обработки ДНК-содержащего образца реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с образованием определяемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;(b) амплификацию по меньшей мере части представляющего интерес метилированного или неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, по меньшей мере один праймер из которой конструируют так, чтобы он связывался только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК, соответственно, после обработки реагентом, причем по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Представляющим интерес геном в способах согласно изобретению предпочтительно является генCTAG1B, CTAG2, MageA3 и/или PRAME. Предпочтительно по меньшей мере один праймер в паре праймеров представляет собой праймер, содержащий структуру стебель-петля, несущую донорный и акцепторный остаток пары для молекулярного переноса энергии, расположенные так, что в отсутствие амплификации акцепторный остаток гасит флуоресценцию, испускаемую донорным остатком (при возбуждении), а во время амплификации структура стебель-петля нарушается и при этом разделяет донорный и акцепторный остатки в достаточной степени, чтобы получить регистрируемый сигнал флуоресценции. Сигнал можно регистрировать в режиме реального времени, получая показание присутствия представляющего интерес метилированного или неметилированного гена. Праймер в паре праймеров,который содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностейSEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 44, 61, 62 или 63, предпочтительно несет структуру стебель-петля. В некоторых вариантах определяют количество генных копий метилированного или неметилированного гена. В данном случае способ, описанный в настоящем документе, предпочтительно предусматривает следующую дополнительную стадию:(с) количественная оценка результатов регистрации в режиме реального времени по сравнению со стандартной кривой для представляющего интерес метилированного или неметилированного гена с получением выходных данных о количестве генных копий. Предпочтительно стадия (с) дополнительно характеризуется тем, что амплификацию считают достоверной, если значение порогового цикла меньше или равно 40. Для таких генов, как ген CTAG1B, CTAG2, MageA3 и/или PRAM, регистрация неметилированного варианта гена может иметь первостепенное значение. Способы согласно изобретению позволяют регистрировать присутствие представляющего интерес метилированного или неметилированного гена в образце в режиме реального времени. Так как способы согласно изобретению являются количественными способами, то (относительные) количества метилированной или неметилированной формы представляющего интерес гена также могут быть определены по мере протекания реакции. Однако, не обязательно использовать способы, осуществляемые в режиме реального времени. Могут быть осуществлены анализы только для того, чтобы выявить, присутствует ли ДНК-мишень в образце или нет. В способах регистрации амплификации в конечной точке используют такие же методики,которые широко используют для ПЦР в режиме реального времени. Таким образом, способы согласно изобретению могут включать способ определения присутствия и/или количества представляющего интерес метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце в конечной точке. Таким образом, изобретение относится к способу определения присутствия и/или количества представляющего интерес метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце (в конечной точке), предусматривающему(a) осуществление контакта и/или обработку ДНК-содержащего образца реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с получением определяемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;(b) амплификацию по меньшей мере части представляющего интерес метилированного или неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, из которых по меньшей мере один праймер сконструирован так, чтобы он связывался только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК, соответственно, после обработки реагентом, причем по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Как указано выше, представляющим интерес геном в способах согласно изобретению предпочтительно является CTAG1B, CTAG2, MageA3 и/или PRAME. Предпочтительно по меньшей мере один праймер в паре праймеров представляет собой праймер, содержащий структуру стебель-петля, несущую донорный и акцепторный остаток пары для молекулярного переноса энергии, обладающие свойствами, которые описаны в настоящем документе. Праймер в паре праймеров, который содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63, предпочтительно несет структуру стебель-петля. Для генов CTAG1B, CTAG2, MageA3 и/или PRAM определение неметилированного варианта гена может иметь первостепенное значение. Праймеры, содержащие, по существу состоящие или состоящие из любой из нуклеотидных последовательностей SE QID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 или 61, были сконструированы в целях выявления неметилированной ДНКCTAG1B, CTAG2 и/или PRAME после обработки реагентом. Отсутствие неметилированного гена является показателем присутствия метилированного гена. В том случае когда требуется количество генных копий метилированного или неметилированного- 10021100 гена, способ может предусматривать дополнительную стадию(с) количественный анализ результатов регистрации по сравнению со стандартной кривой для представляющего интерес метилированного или неметилированного гена с получением выходных данных о количестве генных копий. Все варианты осуществления изобретения применимы в случае аспектов изобретения, относящихся к результатам в конечной точке, и, таким образом, применимы с соответствующими поправками. В анализах в конечной точке можно использовать устройство для регистрации флуоресценции на планшетах или другое оборудование, подходящее для определения флуоресценции в конце амплификации. Способы согласно изобретению наиболее предпочтительно представляют собой способы ex vivo или in vitro, осуществляемые на любом подходящем (ДНК-содержащем) тестируемом образце. Однако, в одном варианте осуществления способ также может предусматривать стадию получения образца. Тестируемый образец является ДНК-содержащим образцом, в частности ДНК-содержащим образцом, содержащим представляющий интерес ген. Способы согласно изобретению можно применять для диагностики заболевания, в частности, когда (известно, что) метилирование представляющего интерес гена связано с частотой заболевания. ДНК-содержащий образец может включать любой подходящий образец ткани или жидкость организма. Предпочтительно тестируемый образец получают из организма человека. В случае применений,связанных с раковыми заболеваниями, образец может включать образец ткани, взятый из ткани, которая предположительно является злокачественной, или из репрезентативной жидкости организма. Гипометилирование гена CTAG1B, CTAG2, MageA3 и/или PRAME ассоциировано с раком легкого,и, следовательно, изобретение может быть применимо в случае рака легкого. Таким образом, в одном варианте тестируемый образец, используемый в способах согласно изобретению, содержащий генCTAG1B, CTAG2, MageA3 и/или PRAME, предпочтительно содержит клетки легкого или нуклеиновую кислоту (молекулы) из клеток легкого. Наиболее предпочтительно образец представляет собой образец фиксированной формалином, залитой парафином (FFPE) ткани. Существует два типа рака легкого: немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) и мелкоклеточный рак легкого (МРЛ). Названия просто описывают тип клетки, обнаруженной в опухолях. Тестируемый образец предпочтительно содержит клетки или нуклеиновую кислоту из немелкоклеточной карциномы легкого (НМРЛ). НМРЛ включает в себя плоскоклеточную карциному, аденокарциному и крупноклеточную карциному, и на его долю приходится около 80% случаев рака легкого. В предпочтительном варианте осуществления, когда раком является НМРЛ,образец представляет собой образец ткани легкого или образец слюны или образец сыворотки. НМРЛ трудно поддается лечению, а имеющиеся способы лечения направлены на достижение цели продления жизни, насколько это возможно, и облегчение симптомов заболевания. НМРЛ является наиболее распространенным типом рака легкого и ассоциирован с неблагоприятными исходами. Гипометилирование гена CTAG1B, CTAG2, MageA3 и/или PRAME также связано с меланомой, и,таким образом, изобретение может быть применимо к меланоме. Меланома представляет собой пигментированное, поверхностное образование, которое было хорошо определено в гистопатологическом отношении. Меланомы в ранней фазе радиального роста (RGP) могут внедряться в эпидермис и сосочковый слой дермы, но не способны к метастазированию; резекция на такой стадии приводит к почти полному излечению. Последующая фаза вертикального роста (VGP) означает переход в более агрессивную стадию, которая способна к метастазированию. Таким образом, изменения в экспрессии генов, происходящие при переходе RGP/VGP, представляют большой интерес. Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления следующий предпочтительный тестируемый образец, используемый в способах согласно изобретению, содержит клетки меланомы или нуклеиновую кислоту из клеток меланомы. Предпочтительно тестируемый образец получают из кожного очага. Гипометилирование гена CTAG1B, CTAG2, MageA3 и/или PRAME также связано с раком молочной железы, и, следовательно, изобретение может быть применимо в случае рака молочной железы. Существует две основных группы рака молочной железы: неинвазивная карцинома и инвазивная карцинома. К неинвазивным карциномам относится лобулярная карцинома in situ и протоковая карцинома in situ. К сожалению, раковые заболевания молочной железы часто прорастают через базальную мембрану, и примерно в 95% случаев рак молочной железы представляет собой инфильтрующие или инвазиивные карциномы. Наиболее распространенным типом инвазивного рака молочной железы (около 75%) является инвазивная протоковая карцинома, возникающая в млечных протоках и проникающая через стенки протоков. Инвазивная лобулярная карцинома возникает в молочных железах, и на ее долю приходится от 10 до 15% инвазивных раковых заболеваний молочной железы. Менее распространенные типы инвазивного рака молочной железы включают следующие типы: воспалительный рак молочной железы, рак соска Педжета, медуллярную карциному, муцинозную карциному, филлоидную опухоль и тубулярную карциному. Редко (примерно 1%) в молочных железах развиваются саркомы (рак соединительной ткани). У людей могут развиваться тот или иной или сочетание инвазивного и неинвазивного рака молочной железы. Таким образом, в дополнительных вариантах следующий предпочтительный тестируемый образец, используемый в способах согласно изобретению, содержит клетки молочной железы или молекулы нуклеиновой кислоты из клеток молочной железы. Наиболее предпочтительно тестируемый образец по- 11021100 лучают из ткани молочной железы. Другие ДНК-содержащие образцы для применения в способах согласно изобретению включают образцы для диагностических, прогностических или индивидуализированных медицинских применений. Такие образцы могут быть получены, например, из хирургических образцов, таких как биоптаты или тонкоигольные пунктаты, из залитых парафином тканей, из замороженных образцов опухолевых тканей,из свежих образцов опухолевых тканей или из свежей или замороженной жидкости организма. Неограничивающими примерами являются цельная кровь, костный мозг, спинномозговая жидкость, перитонеальная жидкость, плевральная жидкость, лимфа, сыворотка, плазма, моча, хилус, экскременты, эякулят,мокрота, сосочковый аспират, слюна, образцы мазков, образцы смывов ободочной кишки и образцы щеточной биопсии. Ткани и жидкости организма могут быть собраны с использованием любого подходящего способа, множество таких способов хорошо известно в данной области техники. Оценка залитого парафином образца может быть осуществлена непосредственно или на срезе ткани. Термины образец, образец, полученный от пациента и образец пациента используют взаимозаменяемо, и термины предназначены для обозначения ДНК-содержащих образцов, полученных от пациента, которые описаны выше. Способы согласно изобретению могут быть осуществлены на очищенных или неочищенных ДНКсодержащих образцах. Однако в предпочтительном варианте осуществления перед стадией (а) (стадией обработки реагентом) или в качестве предварительной стадии ДНК выделяют/экстрагируют/очищают из ДНК-содержащего образца. Можно использовать любую подходящую методику выделения ДНК. Примеры способов очистки можно найти в стандартных публикациях, таких как Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Third Edition), Sambrook and Russell (см., в частности, приложение 8 и главу 5 в указанной публикации). В одном предпочтительном варианте очистка заключается в преципитации ДНК спиртом. Предпочтительные спирты включают этанол и изопропанол. Подходящими способами очистки также являются способы, основанные на преципитации солью. Таким образом, в одном конкретном варианте способ очистки ДНК включает в себя использование высокой концентрации соли для осаждения примесей. Соль может содержать, по существу состоять или состоять, например, из ацетата калия и/или ацетата аммония. Способ может дополнительно предусматривать стадии удаления осажденных примесей с последующим извлечением ДНК с использованием преципитации спиртом. В альтернативном варианте осуществления способ очистки ДНК основан на использовании органических растворителей для экстракции примесей из клеточных лизатов. Таким образом, в одном варианте осуществления способ включает в себя использование фенола, хлороформа и изоамилового спирта для экстракции ДНК. Используют подходящие условия, чтобы гарантировать, что примеси отделены в органическую фазу и что ДНК осталась в водной фазе. В дополнительных наборах используют магнитные шарики, мембраны на основе диоксида кремния и т.д. Такие наборы хорошо известны в данной области техники и коммерчески доступны. В способах согласно изобретению можно использовать набор для очистки ДНК PUREGENE. В предпочтительных вариантах осуществления таких способов очистки экстрагированную ДНК извлекают, используя преципитацию спиртом, такую как преципитация этанолом или изопропанолом. Получение фиксированной формалином, залитой парафином (FFPE) опухолевой ткани является обычным способом консервации опухолевой ткани в клинических центрах. Такие FFPE-залитые образцы требуют стадии удаления парафина перед экстракцией ДНК. В предпочтительном варианте осуществления образцы FFPE-тканей или материал образца, иммобилизованный на предметных стеклах, сначала депарафинизируют обработкой ксилолом. Период контакта с ксилолом должен быть достаточным, чтобы обеспечить возможность контакта и взаимодействия ксилола с образцом. В более предпочтительном варианте осуществления FFPE-образцы депарафинизируют в 100%-м ксилоле в течение примерно 2 ч. Указанную стадию можно повторить еще раз, чтобы гарантировать полную депарафинизацию. После обработки ксилолом образцы регидратируют, используя 70%-й этанол. Способы согласно изобретению в соответствующих случаях также могут предусматривать (также перед стадией (а) или в качестве предварительной стадии) количественную оценку выделенной/экстрагированной/очищенной ДНК в образце. Количественная оценка ДНК в образце может быть осуществлена любыми подходящими способами. Количественная оценка нуклеиновых кислот может быть, например, основана на использовании спектрофотометра, флуориметра или УФ-трансиллюминатора. Примеры подходящих способов описаны в стандартных публикациях, таких как Molecular Cloning - A LaboratoryManual (Third Edition), Sambrook and Russell (см., в частности, приложение 8 в указанной публикации). В предпочтительном варианте осуществления для количественной оценки ДНК можно использовать такие наборы, как набор для количественной оценки днДНК Picogreen, распространяемый Molecular Probes,Invitrogen. Способы согласно изобретению могут быть основаны на использовании реагента, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с образованием определяемых модифицированных остатков. Способ действия реагента уже был объяснен. В предпочтительном варианте осуществления реагент, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в- 12021100 ДНК с образованием определяемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина, содержит, по существу состоит или состоит из бисульфитного реагента(Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992 89: 1827-1831). В данной области техники известно несколько бисульфитсодержащих реагентов, и подходящие наборы для осуществления реакции дезаминирования коммерчески доступны (такие как набор для метилирования ДНК EZ от Zymo Research). Особенно предпочтительный реагент для применения в способах согласно изобретению содержит, по существу состоит или состоит из бисульфита натрия. После обработки ДНК в образце реагентом необходимо выявить различие в нуклеотидной последовательности, обусловленное воздействием реагента. Выявление осуществляют, используя методику амплификации нуклеиновой кислоты. Как уже указано, функционально значимое метилирование чаще всего ассоциировано с областями промоторов. В частности, так называемые островки CpG характеризуются относительно высокой частотой встречаемости остатков CpG и часто расположены вблизи стартового сайта транскрипции гена. В случае некоторых генов, таких как, например, MAGE-3, распространение CpG в области промотора довольно редко. В таком случае в отношении метилирования можно оценивать области интронов и экзонов генов. Существуют различные компьютерные программы, позволяющие идентифицировать островки CpG в представляющем интерес гене. Соответственно, способы согласно изобретению могут предусматривать амплификацию по меньшей мере части метилированного или неметилированного представляющего интерес гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров. Как обсуждалось выше, поскольку представляющие интерес остатки, статус метилирования которых необходимо исследовать, обычно встречаются в ограниченных островках CpG и/или в области промотора и/или в областях интронов и/или в областях экзонов представляющего интерес гена, то пара праймеров обычно амплифицирует только часть гена (в данной области), а не полностью ген. Любая подходящая часть гена может быть амплифицирована способами согласно изобретению при условии, что продукт амплификации можно регистрировать в качестве надежного показателя присутствия представляющего интерес гена. Особенно легко регистрируемыми продуктами амплификации являются продукты размером примерно от 50 до 250 п.н. Еще более предпочтительно амплификация с использованием по меньшей мере одной пары праймеров для амплификации представляющего интерес метилированного или неметилированного гена дает продукт амплификации размером примерно от 100 до 200 п.н. или от 50 до 100 п.н. Это особенно важно для образцов ткани, особенно залитых парафином образцов, когда обычно получают ДНК ограниченного качества, и могут требоваться ампликоны меньшего размера. В предпочтительном варианте осуществления регистрируемый продукт амплификации содержит, по меньшей мере, любую из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 62 и 63. Предпочтительно получают продукт амплификация размером (приблизительно) 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100,101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144,145, 146, 147, 148, 149 или 150 п.н. По меньшей мере один праймер в паре праймеров и предпочтительно оба праймера конструируют так, чтобы они связывались только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК после обработки реагентом. Таким образом, праймер действует, позволяя отличать метилированный ген от неметилированного благодаря спариванию оснований либо только с метилированной формой гена(который остается немодифицированным после обработки реагентом), либо с неметилированной формой гена (который модифицируется реагентом) в зависимости от применения способов. Поэтому праймер должен охватывать по меньшей мере один сайт метилирования в представляющем интерес гене. Предпочтительно праймер связывается с областью гена, включающей в себя по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 сайтов метилирования. Наиболее предпочтительно праймер конструируют так, чтобы он связывался с последовательностью, в которой все остатки цитозина в парах CpG на участке связывания праймера метилированы или не метилированы - т.е. с полностью метилированной или полностью неметилированной последовательностью. Однако, если только один или несколько сайтов метилирования являются функционально значимыми, праймер может быть сконструирован так, чтобы он связывался с последовательностью-мишенью, в которой только такие остатки должны быть метилированы (остаются в виде цитозина) или неметилированы (превращаются в урацил) для того, чтобы происходило эффективное связывание. Другие (не являющиеся функционально значимыми) потенциальные сайты метилирования можно полностью обойти посредством конструирования подходящего праймера, или могут быть сконструированы праймеры, которые независимо связываются с учетом статуса метилирования таких менее значимых сайтов (например, благодаря включению смеси остатков G и А в соответствующее положение в последовательность праймера). Соответственно, продукт амплификации ожидается только в том случае,если присутствовала метилированная или неметилированная форма представляющего интерес гена в исходном ДНК-содержащем образце. Дополнительно или альтернативно, подходящим может быть случай,когда по меньшей мере один праймер в паре праймеров связывается только с последовательностью не- 13021100 метилированной ДНК после обработки реагентом, а другой праймер связывается только с метилированной ДНК после обработки - например, когда ген содержит функционально важные сайты, которые метилированы и отделены от функционально важных сайтов, которые неметилированы. Предпочтительно по меньшей мере один праймер в паре праймеров представляет собой праймер,содержащий структуру стебель-петля или шпильку, несущую донорный и акцепторный остаток пары для молекулярного переноса энергии. Такой праймер по необходимости является или не является праймером, который отличает метилированную ДНК от неметилированной ДНК. Праймер расположен так,что в отсутствие амплификации акцепторный остаток гасит флуоресценцию, испускаемую донорным остатком при возбуждении. Таким образом, перед амплификацией или в отсутствие амплификации, направляемой праймером, структура стебель-петля или шпилька остается интактной. Флуоресценцию,испускаемую донорным остатком, эффективно принимает акцепторный остаток, что приводит к гашению флуоресценции. Во время амплификации конфигурация структуры стебель-петля или шпилька изменяется. В частности, после того, как праймер включается в продукт амплификации и, в частности, в двухцепочечную ДНК (особенно во время второго раунда амплификации), структура стебель-петля или шпилька нарушается. Такое изменение структуры разделяет донорный и акцепторный остатки на достаточное расстояние, так что акцепторный остаток больше не способен эффективно гасить флуоресценцию, испускаемую донорным остатком. Таким образом, донорный остаток генерирует регистрируемый сигнал флуоресценции. Такой сигнал регистрируют в реальном времени, получая показатель количества генных копий представляющего интерес метилированного или неметилированного гена. Таким образом, в способах согласно изобретению можно использовать олигонуклеотиды для амплификации нуклеиновых кислот, которые метят определяемыми метками, используя метки молекулярного переноса энергии (МЕТ). Праймеры содержат донорный и/или акцепторный остаток пары МЕТ и включаются в амплифицированный продукт реакции амплификация, так что амплифицированный продукт содержит как донорный, так и акцепторный остаток пары МЕТ. Когда амплифицированный продукт является двухцепочечным, пара МЕТ, включенная в амплифицированный продукт, может быть на одной и той же цепи или, когда амплификация представляет собой тройную амплификацию, на противоположных цепях. В некоторых случаях, когда полимераза, используемая при амплификации, обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью, один из остатков пары МЕТ может быть отщеплен, по меньшей мере, от некоторой популяции амплифицированного продукта под действием экзонуклеазной активности. Такая экзонуклеазная активность не вредна для способов амплификации согласно изобретению. Способы согласно изобретению, которые обсуждаются в настоящем документе, могут быть адаптированы ко многим способам амплификации последовательностей нуклеиновой кислоты, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), тройную амплификацию и другие системы амплификации. В предпочтительном варианте осуществления МЕТ представляет собой резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), при котором олигонуклеотиды метят донорным и акцепторным остатками,причем донорным остатком является флуорофор, и акцепторный остаток может быть флуорофором, так что энергия флуоресценции, испускаемой донорным остатком, поглощается акцепторным остатком. Акцепторный остаток может быть гасителем. Таким образом, праймером для амплификации является праймер в виде шпильки, который содержит как донорный, так и акцепторный остатки и имеет такую конфигурацию, что акцепторный остаток гасит флуоресценцию донора. Когда праймер включается в продукт амплификации, его конфигурация изменяется, гашение прекращается, и флуоресценция донорного остатка может быть зарегистрирована. Способы согласно изобретению позволяют выявлять продукт амплификации без предварительного отделения не включившихся олигонуклеотидов. Кроме того, способы позволяют непосредственно выявлять продукт амплификации благодаря включению меченого олигонуклеотида в продукт. В предпочтительном варианте осуществления способы согласно изобретению также включают в себя определение экспрессии эталонного гена. Эталонные гены важны для того, чтобы можно было проводить сравнение между разными образцами. В результате подбора подходящего гена, который, как полагают, стабильно и гарантированно экспрессируется в разных сравниваемых образцах, регистрация амплификации эталонного гена вместе с представляющим интерес геном учитывает вариабельность среди образцов, например, вариабельность по количеству вводимого материала, эффективности ферментов,разрушению образцов и т.д. Эталонный ген в идеальном случае должен в присутствии достаточного количества вводимой ДНК быть геном, который константно экспрессируется в образцах в условиях испытания. Таким образом, результаты, полученные для представляющего интерес гена, могут быть нормализованы относительно соответствующего количества копий эталонного гена. Подходящие эталонные гены для настоящего изобретения включают гены -актина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы(GAPDH), рибосомной РНК, таких как ген рибосомной РНК 18S, и ген РНК-полимеразы II (Radonic A. etal., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004 Jan 23; 313(4): 856-62). В особенно предпочтительном варианте осуществления эталонным геном является ген -актина.- 14021100 Таким образом, способы согласно изобретению могут дополнительно характеризоваться амплификацией по меньшей мере части эталонного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, причем по меньшей мере одним праймером в паре праймеров является праймер, содержащий структуру стебель-петля, обладающую указанными выше свойствами. Любая походящая часть эталонного гена может быть амплифицирована способами согласно изобретению при условии, что продукт амплификации можно регистрировать в качестве надежного показателя присутствия эталонного гена. Особенно легко регистрируемыми продуктами амплификации являются продукты размером примерно от 50 до 250 п.н. Еще более предпочтительно амплификация с использованием по меньшей мере одной пары праймеров для амплификации эталонного гена дает продукт амплификации размером примерно от 50 до 150 п.н. Это особенно важно в случае образцов ткани, особенно залитых парафином образцов, когда обычно получают ДНК ограниченного качества. В вариантах осуществления, в которых эталонный ген включают в способы согласно изобретению,способы дополнительно могут характеризоваться тем, что стадия способов, на которой осуществляют количественную оценку результатов регистрации (в реальном времени) по сравнению со стандартной кривой для представляющего интерес метилированного или неметилированного гена, также предусматривает количественную оценку результатов регистрации в режиме реального времени эталонного гена по сравнению со стандартной кривой для эталонного гена, чтобы в каждом случае получить данные о выходе количества генных копий, и необязательно дополнительно предусматривает нормализацию результатов путем деления количества генных копий представляющего интерес метилированного или неметилированного гена на количество генных копий эталонного гена. Опять же, способы могут отличаться тем, что амплификацию считают достоверной, когда значение порогового цикла меньше или равно 40. Для амплификации по меньшей мере части эталонного гена обычно используют по меньшей мере одну пару праймеров. Предпочтительно по меньшей мере одним праймером в паре праймеров является праймер, содержащий структуру стебель-петля, несущую донорный и акцепторный остаток пары молекулярного переноса энергии, как в случае представляющего интерес гена. Способ действия такой структуры во время амплификации объясняется выше. Праймеры в виде шпилек для применения в способах согласно изобретению наиболее предпочтительно представляют собой праймеры, которые описаны в патенте США 6090552 и Европейском патенте 0912597, содержание которых включено в настоящее описание в полном объеме. Такие праймеры коммерчески известны как праймеры Amplifluor. Таким образом, в особенно предпочтительном варианте осуществления праймер, содержащий структуру стебель-петля, используемый для амплификации части представляющего интерес гена и/или эталонного гена, содержит, по существу состоит или состоит из следующих непрерывно следующих друг за другом последовательностей в порядке от 5'- к 3'концу:(а) первой нуклеотидной последовательности длиной примерно от 6 до 30 нуклеотидов, причем нуклеотид в указанной первой нуклеотидной последовательности помечен первым остатком, выбранным из донорного остатка и акцепторного остатка пары для молекулярного переноса энергии, причем донорный остаток при возбуждении испускает флуоресценцию при одной или нескольких конкретных длинах волн, а акцепторный остаток поглощает и/или гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанным донорным остатком;(b) второй одноцепочечной нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 3-20 нуклеотидов;(c) третьей нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 6-30 нуклеотидов, причем нуклеотид в указанной третьей нуклеотидной последовательности метят вторым остатком, выбранным из указанного донорного остатка и указанного акцепторного остатка, и указанный второй остаток является представителем указанной группы, которым не помечена указанная первая нуклеотидная последовательность, причем указанная третья нуклеотидная последовательность комплементарна в обратном порядке указанной первой нуклеотидной последовательности, так что может образовываться дуплекс между указанной первой нуклеотидной последовательностью и указанной третьей нуклеотидной последовательностью таким образом, что указанные первый остаток и второй остаток оказываются рядом друг с другом, так что когда донорный остаток возбуждается и испускает флуоресценцию, акцепторный остаток поглощает и гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанным донорным остатком; и(d) находящейся на 3'-конце праймера четвертой одноцепочечной нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 8-40 нуклеотидов, которая содержит на своем 3'-конце любую из нуклеотидных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 62 и 63 (и таким образом способной праймировать синтез полимеразой нуклеиновых кислот нуклеотидной последовательности, комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, содержащей часть метилированной или неметилированной ДНК гена); причем когда указанной дуплекс не образуется, указанный первый остаток и указанный второй остаток раз- 15021100 делены на такое расстояние, которое предотвращает молекулярный перенос энергии между указанным первым и вторым остатком. В особенно предпочтительном варианте осуществления донорный остаток и акцепторный остаток образуют пару для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). Молекулярный перенос энергии (МЕТ) представляет собой процесс, при котором энергия нерадиоактивно переходит от донорной молекулы к акцепторной молекуле. Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) является формой MET. FRET возникает благодаря определенным свойствам некоторых химических соединений; при возбуждении под действием конкретных длин волн света они испускают свет (т.е. они флуоресцируют) с другой длиной волны. Такие соединения называют флуорофорами. В случае FRET энергия нерадиоактивно передается на длинное расстояние (10-100 ) между донорной молекулой, которая является флуорофором, и акцепторной молекулой. Донор поглощает фотон и нерадиоактивно передает такую энергию акцептору (Frster, 1949, Z. Naturforsch. A4: 321-327; Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211: 353-388). Когда два флуорофора, спектры возбуждения и эмиссии которых перекрываются, находятся близко друг к другу, возбуждение одного флуорофора будет заставлять его испускать свет с длинами волн, которые поглощаются вторым флуорофором и которые стимулируют второй флуорофор, в свою очередь, заставляя его флуоресцировать. Другими словами, энергия возбужденного состояния первого (донорного) флуорофора передается благодаря индуцированному резонансом диполь-дипольному взаимодействию на находящийся рядом второй (акцепторный) флуорофор. В результате время жизни донорной молекулы уменьшается и его флуоресценция гасится, тогда как интенсивность флуоресценции акцепторной молекулы увеличивается и деполяризуется. Когда энергия возбужденного состояния донора переносится на акцептор, не являющийся флуорофором, флуоресценция донора гасится без последующего испускания флуоресценции акцептором. В таком случае акцептор функционирует как гаситель. И гасители, и акцепторы могут быть использованы в настоящем изобретении. Пары молекул, которые могут осуществлять резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), называют парами FRET. Чтобы происходил перенос энергии, донорная и акцепторная молекулы обычно должны находиться в тесной близости друг с другом (до 70-100 A) (Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211: 353-388; Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300-334). Эффективность переноса энергии быстро снижается с увеличением расстояния между донорной и акцепторной молекулами. Согласно Frster (1949, Z. Naturforsch. A4:321-327) эффективность переноса энергии пропорциональна D10-6, где D означает расстояние между донором и акцептором. Фактически это означает, что FRET может наиболее эффективно происходит до достижения расстояний около 70 . Молекулы, которые обычно используют в FRET, обсуждаются в отдельном разделе. Является ли флуорофор донором или акцептором, определяется его спектрами возбуждения и испускания и флуорофором, с которым он составляет пару. Например, FAM наиболее эффективно возбуждается светом с длиной волны 488 нм и испускает спектр света от 500 до 650 нм с максимумом испускания 525 нм. FAM является подходящим донорным флуорофором для применения с JOE, TAMRAh ROX (каждый из которых имеет максимум возбуждения при 514 нм). В одном особенно предпочтительном варианте осуществления указанным донорным остатком является флуоресцеин или его производное, а указанным акцепторным остатком является дабцил. Предпочтительно производное флуоресцеина содержит, по существу состоит или состоит из 6-карбоксифлуоресцеина. Метки МЕТ могут быть связаны в любой подходящей точке праймеров. В особенно предпочтительном варианте осуществления донорный и акцепторный остатки расположены на комплементарных нуклеотидах в структуре стебель-петля, так чтобы когда структура стебель-петля интактна, остатки находились в тесной физической близости друг к другу. Однако праймеры согласно изобретению можно метить остатками в любом положении, эффективно обеспечивающем возможность MET/FRET между соответствующими донором и акцептором в отсутствие амплификации и разделение донора и акцептора после того, как праймер включается в продукт амплификации. Последовательность структуры стебель-петля или шпилька не зависит от нуклеотидной последовательности гена-мишени (представляющего интерес гена или эталонного гена), так как она не связывается с ней. Соответственно, могут быть сконструированы универсальные последовательности структуры стебель-петля или шпилька, которые затем могут быть объединены со специфичным для последовательности праймером, чтобы облегчить регистрацию в режиме реального времени представляющей интерес последовательности. Основное требование к последовательности заключается в том, чтобы последовательность образовывала структуру стебель-петля/шпилька, которая является стабильной в отсутствие амплификации (и, следовательно, обеспечивает эффективное гашение). Таким образом, специфичная для последовательности часть праймера связывается с матричной цепью и направляет синтез комплементарной цепи. Следовательно, праймер становится частью продукта амплификации в первом раунде амплификации. Когда комплементарная цепь синтезируется, амплификация происходит вдоль структуры стебель-петля/шпилька. При этом происходит разделение молекул флуорофора и гасителя,приводя к генерированию флуоресценции по мере протекания амплификации. Структура стебель-петля предпочтительно находится на 5'-конце специфичной для последова- 16021100 тельности части праймера, используемого для амплификации. Как указано выше, такую детекторную последовательность обычно метят парой FRET. Предпочтительно один остаток из пары FRET находится по направлению, вблизи или на 5'-конце последовательности, а другой остаток находится по направлению, вблизи или на 3'-конце последовательности, так что когда структура стебель-петля или шпилька остается интактной, эффективно происходит FRET между двумя остатками. Как подробно описано в экспериментальном разделе, праймеры необходимо тщательно выбирать,чтобы гарантировать чувствительность и специфичность способов согласно изобретению. Соответственно, особенно предпочтительным праймером для применения при определении статуса метилирования гена является праймер, содержащий, по существу состоящий или состоящий из нуклеотидной последовательности, указанной в видеSEQ ID NO: 4 и 8 представляют собой последовательности прямого праймера (смыслового праймера), комплементарные подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности CTAG1B.SEQ ID NO: 12, 16 и 20 представляют собой последовательности прямого праймера (смыслового праймера), комплементарные подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности CTAG2.SEQ ID NO: 24, 28, 32, 36 и 40 представляют собой последовательности прямого праймера (смыслового праймера), комплементарные подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности PRAME.SEQ ID NO: 43 представляет собой последовательность структуры в виде шпильки.SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33 и 37 содержат последовательность структуры в виде шпильки и последовательность SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 и 40, соответственно.SEQ ID NO: 2 и 6 представляют собой последовательность обратного праймера (антисмыслового праймера), комплементарную подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности промотора CTAG1B.SEQ ID NO: 10, 14 и 18 представляют собой последовательность обратного праймера, комплементарную подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности промотора CTAG2.SEQ ID NO: 22, 26, 30, 34 и 38 собой представляют последовательность обратного праймера, комплементарную подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности промотора PRAME.SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35 и 39 содержат последовательность структуры в виде шпильки и последовательность SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34 и 38.SEQ ID NO 42 и 44: представляют собой последовательности прямого и обратного праймера, комплементарные подвергнутой превращению с использованием бисульфита метилированной последовательности гена -актина.SEQ ID NO: 41 содержит последовательность структуры в виде шпильки и последовательность SEQSEQ ID NO: 63 представляет собой последовательность прямого праймера (смыслового праймера),комплементарную подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности MageA3.SEQ ID NO: 61 содержит последовательность структуры в виде шпильки и последовательность SEQSEQ ID NO: 62: представляет собой последовательность обратного праймера, комплементарную подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательностиMageA3. Как подробно описано в экспериментальном разделе, выявлена наилучшая согласованность уровней экспрессии и метилирования CTAG2 для анализов, в которые включали праймеры с любой из последовательностей SEQ ID NO: 9-12 и SEQ ID NO: 21-20. Как подробно описано в экспериментальном разделе, выявлена наилучшая согласованность уровней экспрессии и метилирования PRAME в анализах, в которых включали праймеры с любой из последовательностей SEQ ID NO: 21-40. Таким образом, в другом варианте осуществления предпочтительный праймер, связывающийся с областью CTAG2, содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 9-12 и SEQ ID NO: 21-20. Предпочтительный праймер, связывающийся с областью PRAME, содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 21-40. Продукты амплификации, образованные с использованием разных анализов гипометилирования,имели следующие последовательности: Эти последовательности локализованы в CpG-богатых островках соответствующих генов. Соответственно, изобретение, кроме того, относится к олигонуклеотидам, праймерам и/или зондам, состоящим или комплементарным частям подвергнутых превращению с использованием бисульфита нуклеотидных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 или 55. Часть праймера, состоящая или комплементарная частям подвергнутой превращению с использованием бисульфита последовательности гена CTAG1B, CTAG2 и/или PRAME, предпочтительно имеет длину менее 30 п.н.; предпочтительно 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 или 17 п.н. Таким образом, специфичная для CTAG1B, CTAG2 и/или PRAME часть такого предпочтительного праймера предпочтительно имеет длину от 28 до 16 п.н., или от 27 до 17 п.н. Таким образом, праймер может содержать любую последовательность из 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 или 17 следующих друг за другом оснований, состоящую или комплементарную подвергнутым превращению с использованием бисульфита последовательностям. Любой один или оба праймера (в паре праймеров) могут быть помечены или могут быть синтезированы так, чтобы они содержали структуру типа стебля-петли, или шпильки, несущую донорный и акцепторный остаток, предпочтительно на 5'-конце, как подробно обсуждается выше. В предпочтительном варианте осуществления один или оба праймера метят или синтезируют так, чтобы они содержали предпочтительно на 5'-конце структуру типа стебель-петля, содержащую, по существу состоящую или состоящую из нуклеотидной последовательности, указанной ниже- 20021100 Такую детекторную последовательность обычно метят парой FRET. Предпочтительно один остаток из пары FRET находится по направлению, вблизи или на 5'-конце последовательности, а другой остаток находится по направлению, вблизи или на 3'-конце последовательности, так что, когда структура стебель-петля или шпилька остается интактной, эффективно происходит FRET между двумя остатками. В особенно предпочтительном варианте осуществления структуру стебель-петля или шпилька,особенно нуклеиновую кислоту, содержащую, по существу состоящую или состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1, метят на 5'-конце, используя FAM, а на 3'-конце, используя дабцил. Другие предпочтительные сочетания обсуждаются в настоящем документе, и такое обсуждение применимо в данном случае с соответствующими изменениями. Указанные праймеры составляют отдельные аспекты настоящего изобретения. Дополнительные характеристики таких праймеров суммированы в подробном описании (в экспериментальной части) ниже. Следует отметить, что в настоящем изобретении могут использованы варианты олигонуклеотидов, праймеров и зондов (последовательностей). В частности, могут быть добавлены дополнительные фланкирующие последовательности, например, чтобы при необходимости повысить специфичность связывания или образования структуры стебель-петля. Варианты последовательностей предпочтительно имеют по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность нуклеотидной последовательности с нуклеотидными последовательностями праймеров и/или зондов, указанных в SEQ ID NO: 1-42 и SEQ ID NO: 44, 60, 61 и 62. Праймеры и структуры типа шпилек в подходящем случае могут содержать синтетические аналоги нуклеотидов или могут быть основаны, например, на ДНК, РНК или ПНК или их смесях. Подобным образом в соответствующих случаях могут быть использованы альтернативные флуоресцирующие донорные и акцепторные остатки/пары FRET. В дополнение к мечению флуоресцирующими донорными и акцепторными остатками праймеры могут содержать модифицированные олигонуклеотиды и другие дополнительные группы и метки, при условии, что не нарушается функциональность в качестве праймера и/или структуры стебель-петля/шпилька в способах согласно изобретению. В случае каждой пары праймеров по меньшей мере один праймер метят донорным и акцепторным остатком пары для молекулярного переноса энергии, расположенными так, что в отсутствие амплификации акцепторный остаток гасит флуоресценцию, испускаемую донорным остатком (после возбуждения), а во время амплификации структура стебель-петля нарушается, и при этом донорный и акцепторный остатки отделяются на достаточное расстояние, чтобы обеспечить регистрируемый сигнал флуоресценции, который регистрируют в реальном времени, получая показатель количества генных копий гена. Предпочтительно указанной донорный остаток и указанной акцепторный остаток представляют собой пару FRET. В одном варианте указанный донорный остаток и указанный акцепторный остаток выбраны из 5-карбоксифлуоресцеина или 6 карбоксифлуоресцеина (FAM), 2'7'-диметокси-4'5'-дихлоро-6-карбоксифлуоресцеина (JOE), родамина, 6 карбоксиродамина (R6G), N,N,N'-тетраметил-6-карбоксиродамина (TAMRA), 6-карбокси-Х-родамина (ROX),5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфоновой кислоты (EDANS), антраниламида, кумарина, производных хелата тербия, малахитовой зелени, реактивного красного 4, дабцила, тетраметилродамина, пиренбутирата,эозина нитротирозина, этидия и техасского красного. В следующем варианте указанный донорный остаток выбран из флуоресцеина, 5-карбоксифлуоресцеина или 6-карбоксифлуоресцеина (FAM), родамина, 5-(2'аминоэтил)аминонафталин-1-сульфоновой кислоты (EDANS), антраниламида, кумарина, производных хелата тербия, малахитовой зелени и реактивного красного 4, а указанный акцепторный остаток выбран из дабцила,родамина, тетраметилродамина, пиренбутирата, эозина нитротирозина, этидия и техасского красного. Предпочтительно указанным донорным остатком является флуоресцеин или его производное, а указанным акцепторным остатком является дабцил, наиболее предпочтительно донорным остатком является 6 карбоксифлуоресцеин. Другие предпочтительные сочетания, особенно в мультиплексном контексте, обсуждаются в настоящем документе, и такие сочетания также предусмотрены в указанных аспектах изобретения. Изобретение также относится к наборам, которые можно применять для осуществления способов согласно изобретению. Наборы могут включать любой из предпочтительных признаков, указанных в связи с различными способами (и применениями) согласно изобретению, описанными в настоящем документе. Таким образом, изобретение относится к набору для регистрации присутствия и/или количества представляющего интерес метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце,включающему в себя по меньшей мере одну пару праймеров согласно изобретению. Предпочтительно набор содержит пару праймеров согласно изобретению для определения присутствия и/или количества неметилированного и/или метилированного гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 и пару праймеров для определения присутствия и/или количества эталонного гена, в частности -актина. Таким образом, набор может содержать пары праймеров, включающие в себя праймер, содержащий, по существу состоящий или состоящий из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,38, 39, 40, 41, 42, 44, 60, 61 или 62. Предпочтительно по меньшей мере один праймер в каждой паре праймеров метят с использованием подходящей структуры типа стебель-петля или шпилька, чтобы- 21021100 облегчить регистрацию в реальном времени, как обсуждается выше (приведенное обсуждение применимо и в данном случае с соответствующими изменениями). Наиболее предпочтительно по меньшей мере один праймер в каждой паре праймеров содержит структуру типа стебель-петля или шпилька, которая содержит, по существу состоит или состоит из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQID NO: 43. Структуру типа стебель-петля метят подходящим донорным и акцепторным остатком, как обсуждается в настоящем документе (приведенное обсуждение применимо и в данном случае с соответствующими изменениями). Как указано выше, дополнительные характеристики праймеров согласно изобретению суммированы в подробном описании (в экспериментальной части) ниже. В настоящем изобретении могут быть использованы варианты таких последовательностей, которые обсуждаются в настоящем документе. В соответствующих случаях могут быть использованы альтернативные флуоресцирующие донорные и акцепторные остатки/пары FRET, которые обсуждаются в настоящем документе. В одном варианте осуществления набор согласно изобретению дополнительно содержит реагент,который модифицирует неметилированный цитозин, который обсуждается в настоящем документе(предпочтительнее, чем метилированные остатки цитозина, которые защищены). Такой реагент применим для того, чтобы отличать метилированные остатки цитозина от неметилированных. В предпочтительном варианте осуществления реагент содержит бисульфит, предпочтительно бисульфит натрия. Такой реагент способен превращать неметилированные остатки цитозина в урацил, тогда как метилированные остатки цитозина остаются без превращения. Такое различие по остатку можно использовать для того, чтобы отличать метилированную нуклеиновую кислоту от неметилированной в используемом далее способе, таком как ПЦР с использованием праймеров, которые отличают цитозин от урацила (цитозин спаривается с гуанином, тогда как урацил спаривается с аденином). Как обсуждается при описании способов согласно изобретению, могут быть использованы подходящие контроли, действующие в качестве контроля качества в случае таких способов. Соответственно, в одном варианте осуществления набор согласно изобретению дополнительно содержит, по существу состоит или состоит из одной или нескольких контрольных молекул нуклеиновой кислоты, статус метилирования которых известен. Такие (одна или несколько) контрольных молекул нуклеиновой кислоты могут включать обе нуклеиновых кислоты, которые заведомо являются или обработаны так, чтобы были метилированными, и/или молекулы нуклеиновых кислоты, которые заведомо являются или обработаны так, чтобы они были неметилированными. Одним из примеров подходящего внутреннего эталонного гена, который, как правило, не метилирован, но который может быть обработан так, чтобы он был метилированным, является ген -актина. Наборы согласно изобретению могут дополнительно включать подходящие буферы и другие реагенты для осуществления заявленных способов согласно изобретению. Таким образом, приведенное обсуждение, относящееся к способам согласно изобретению, применимо с соответствующими изменениями и в данном случае и для краткости не повторяется. В одном варианте осуществления набор согласно изобретению дополнительно содержит, по существу состоит или состоит из буферов для амплификации нуклеиновой кислоты. Набор также дополнительно содержит, по существу состоит или состоит из ферментов, которые катализируют амплификацию нуклеиновой кислоты. Таким образом, набор также дополнительно может содержать, по существу состоять или состоять из подходящей полимеразы для амплификации нуклеиновой кислоты. Примерами являются полимеразы семейства А и семейства В, такие как Taq, Pfu, Vent и т.д. Различные компоненты набора могут быть упакованы по отдельности в свои отделения или в подходящем случае могут, например, храниться вместе. Набор также может содержать соответствующие инструкции по применению, которые могут быть,например, напечатаны на отдельном листе или включены в упаковку набора. Инструкции могут облегчить применение наборов согласно изобретению с использованием соответствующих устройств для регистрации амплификации в реальном времени или в конечной точке, некоторые из которых коммерчески доступны. Последняя стадия способов согласно изобретению, осуществляемых в режиме реального времени,заключается в количественной оценке результатов регистрации в реальном времени по сравнению со стандартной кривой для представляющего интерес метилированного или неметилированного гена и необязательно эталонного гена (если его используют). Стандартные кривые могут быть получены с использованием набора стандартов. Каждый стандарт содержит известное количество копий или известную концентрацию представляющего интерес гена и/или эталонного гена, в зависимости от ситуации. Обычно значение флуоресценции исходного уровня можно считать фоновой флуоресценцией. Например, в одном варианте осуществления используют компьютерную программу Sequence Detection System (SDS). В такой компьютерной программе по умолчанию установлен фоновый диапазон циклов от 3 до 15 для реакции амплификации до регистрации продуктов амплификации. Затем определяют пороговое значение флуоресценции на уровне статистического значимого значения выше фона. Обычно порог устанавливают на уровне 10 стандартных отклонений выше фоновой флуоресценции. Соответствующая компьютер- 22021100 ная программа предлагается вместе с устройством для осуществления реакций амплификации в реальном времени. Компьютерная программа автоматически вычисляет фоновые и пороговые значения для реакции. Затем может быть определено значение порогового цикла (Ct) для каждого стандарта. Значение порогового цикла равно количеству циклов, необходимых для достижения порогового уровня амплификации. Таким образом, чем больше начальная концентрация стандарта гена в реакционной смеси, тем меньше количество циклов, необходимых для достижения конкретного выхода амплифицированного продукта. График Ct против log10 известного начального количества копий набора стандартных ДНК дает прямую линию. Полученный график представляет собой стандартную кривую. Таким образом, значение Ct для амплификации представляющего интерес гена и эталонного гена, в случае его использования,может быть интерполировано с использованием соответствующей стандартной кривой, чтобы определить количество копий в ДНК-содержащем образце. Таким образом, выходными данными, получаемыми в способе, являются данные о количестве генных копий как для представляющего интерес гена, так и для эталонного гена. Результаты могут быть нормализованы делением количества генных копий представляющего интерес метилированного или неметилированного гена на количество генных копий эталонного гена. В предпочтительном варианте осуществления используют систему для быстрой ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7900 НТ для осуществления способов согласно изобретению. Предпочтительно используют компьютерную программу SDS, предпочтительно включающую в себя подходящий алгоритм, такой как алгоритм Auto CT для автоматического генерирования фоновых и пороговых значений для отдельных детекторов. Хотя в способах согласно изобретению может быть использована любая подходящая методика амплификации, наиболее предпочтительно амплификацию осуществляют, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Таким образом, хотя ПЦР является предпочтительным способом амплификации,для того, чтобы вводить модификации в основную методику, такую как гнездовая ПЦР, в объем изобретения также могут быть включены эквиваленты. Примеры включают без ограничения методики изотермальной амплификации, такие как NASBA, 3SR, ТМА и тройная амплификация, все указанные методики хорошо известны в данной области техники, а подходящие реагенты коммерчески доступны. Другие подходящие способы амплификации включают без ограничения лигазную цепную реакцию (LCR) (Barringer et al., 1990), MLPA, избирательную амплификацию полинуклеотидных последовательностеймишеней (патент США 6410276), праймируемую консенсусной последовательностью полимеразную цепную реакцию (патент США 4437975), методику инвазивного расщепления (Third Wave Technologies, Madison, WI), методику замещения цепи, произвольно праймируемую полимеразную цепную реакцию (WO 90/06995) и амплификацию со смещением одноцепочечного разрыва (WO 2004/067726). Способы ПЦР в реальном времени согласно изобретению, как правило, предусматривают стадии снижения температуры, чтобы обеспечить возможность для отжига праймера, повышения температуры для удлинения праймера, повышения температуры для денатурации и снижения температуры для сбора данных. В одном конкретном варианте осуществления стадию сбора данных осуществляют при температуре примерно от 56 до 63 С, наиболее предпочтительно примерно при 57 или 62 С, так как было показано, что такая температура обеспечивает максимально чувствительное определение и максимально специфичные результаты, как обсуждается в разделе примеров. В конкретном варианте температурный профиль полимеразной цепной реакции включает от 40 до 50 повторов, предпочтительно примерно 45 повторов цикла(a) примерно 50 С в течение примерно 2 мин,(b) примерно 95 С в течение примерно 10 мин,(c) примерно 95 С в течение примерно 15 с,(d) примерно 57 С в течение примерно 1 мин. Предпочтительная схема реакции, которая, как показано, позволяет получать специфичные и чувствительные результаты в способах согласно изобретению, представляет собой следующую схему: стадия 1: 50 С в течение 2 мин, стадия 2: 95 С в течение 10 мин; стадия 3: 95 С в течение 15 с, 57 С в течение 30 с, 57 С в течение 30 с (= плато-сбор данных) в ходе 45 повторов. Способы согласно изобретению можно применять для выявления более одного представляющего интерес гена в одной и той же реакции. С использованием нескольких специфичных наборов праймеров может быть осуществлена амплификация нескольких нуклеиновых кислот-мишеней в одной и той же реакционной смеси. Такой режим называется мультиплексным. В предпочтительном варианте осуществления один или оба праймера для каждой мишени могут быть праймерами в виде шпилек, мечеными флуоресцирующим остатком и остатком для гашения, которые образуют пару FRET. Амплификация нескольких нуклеиновых кислот-мишеней требует использования разных флуоресцирующих донорных и/или акцепторных остатков с разными длинами волн эмиссии для мечения разных наборов праймеров. В ходе регистрации и анализа после амплификации реакционную смесь освещают и регистрируют при каждой конкретной длине волны, характерной для каждого набора праймеров, используемых в реакции. Таким образом, можно определить, какие конкретные ДНК-мишени в смеси амлифицированы и мечены. В конкретном варианте осуществления используют две или более пар праймеров для амплификации раз- 23021100 ных соответствующих последовательностей-мишеней. Таким образом, может быть определено присутствие и/или количество панели представляющих интерес метилированных/неметилированных генов в одном ДНК-содержащем образце. Мультиплексный режим также можно использовать в контексте регистрации как представляющего интерес гена, так и эталонного гена в одной и той же реакции. Опять же, праймеры, меченые соответствующими различимыми донорными и/или акцепторными остатками, позволяют различать сигналы, генерируемые при амплификации представляющего интерес гена и эталонного гена, соответственно. В одном варианте осуществления используют универсальный гаситель вместе с подходящими донорными флуорофорами, каждый из которых имеет отличный от других максимум длин волн эмиссии. Особенно предпочтительным гасителем является дабцил. Вместе с дабцилом в качестве гасителя каждый из следующих флуорофоров может быть использован для обеспечения мультиплексного режима: кумарин (максимум эмиссии 475 нм), EDANS (491 нм), флуоресцеин (515 нм), люциферовый желтый (523 нм), BODIPY (525 нм), эозин (543 нм), тетраметилродамин (575 нм) и техасский красный (615 нм) (Tyagiet al., Nature Biotechnology, vol. 16, Jan 1998; 49-53). Другие предпочтительные сочетания обсуждаются в настоящем документе. В альтернативном варианте осуществления ДНК-содержащий образец может быть разделен, и способы согласно изобретению осуществляют на подходящих частях образца, чтобы получить результаты для прямого сравнения. Таким образом, когда выявляют оба гена - представляющий интерес ген и эталонный ген, образец может быть разделен на две части, обрабатываемые разными путями, чтобы обеспечить регистрацию амплификации представляющего интерес гена в реальном времени в одной части образца и регистрацию амплификации эталонного гена в реальном времени в другой части образца. Образец может быть еще дополнительно разделен, чтобы при необходимости обеспечить возможность проведения подходящих контрольных реакций. Преимущество такой схемы заключается в том, что может быть использована универсальная пара FRET для мечения каждой пары праймеров и исключается требование регистрировать эмиссию в определенном диапазоне длин волн. Однако, такой способ основан на исходном получении достаточного образца, чтобы образец можно было разделить. Хотя можно использовать любой подходящий объем реакции, в одном конкретном варианте осуществления общий объем реакции для стадии амплификации составляет примерно от 10 до 40 мкл, болеее предпочтительно примерно от 10 до 30 мкл, наиболее предпочтительно около 12 мкл. В одном аспекте олигонуклеотиды, праймеры или зонды, пары праймеров, наборы или способы согласно настоящему изобретению применяют для диагностики рака или предрасположенности к раку,причем присутствие неметилированного (или гипометилированного) CTAG1B, CTAG2, PRAME и/илиMageA3 в образце является показателем наличия рака или предрасположенности к раку. Таким образом,настоящее изобретение относится к наборам, способам и праймерам для диагностики рака или предрасположенности к раку. Определение диагностика в используемом в настоящем документе смысле включает в себя скрининг в отношении наличия заболевания или стадии, предваряющей заболевание, идентификацию заболевания или стадии, предваряющей заболевание, мониторинг прохождения стадий и состояния и развития заболевания, проверку на предмет рецидива заболевания после лечения и мониторинг успешности конкретного лечения. Тесты также могут иметь прогностическое значение, и такой прогноз включен в определение термина диагностика. Прогностическое значение тестов можно использовать в качестве маркера возможной чувствительности к раку или в качестве маркера прогрессирования рака. Следовательно,пациенты группы риска могут быть идентифицированы до того, как появится возможность манифестации самого заболевания в виде симптомов, которые можно идентифицировать у пациента. В предпочтительном варианте осуществления рак выбран из рака легкого, меланомы или рака молочной железы. В предпочтительном варианте осуществления в способах и анализах для диагностики используют по меньшей мере один олигонуклеотид, содержащий, включающий в себя, по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, или 8 в случае маркера CTAG1B. В способах и анализах для диагностики используют по меньшей мере один олигонуклеотид, содержащий, включающий в себя, по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 в случае маркера CTAG2. В способах и анализах для диагностики используют по меньшей мере один олигонуклеотид, содержащий, включающий в себя, по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 в случае маркера PRAME. В предпочтительном варианте осуществления для диагностики рака или предрасположенности к раку используют олигонуклеотиды, содержащие, включающие в себя, по существу состоящие или состоящие из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,39 и 40, и выявляют неметилированную форму гена. Тестирование может быть осуществлено с диагностической целью или вместе с терапевтической схемой. Анализы ОТ-ПЦР, в которых устанавливают прогностическое значение экспрессии CTAG1B,- 24021100CTAG2 и/или PRAME в случае НМРЛ, рака молочной железы или меланомы, находят применение в отборе пациентов, подходящих для лечения иммунотерапевтическим средством на основе CTAG1B,CTAG2, PRAME и/или MageA3. Авторы настоящего изобретения показали, что анализ, разработанный для выявления неметилированного CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров или наборов согласно изобретению, может надежно классифицировать образцы как образцы, экспрессирующие CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3. Результат определения статуса метилирования, полученный в тесте гипометилирования, хорошо согласуется с результатами, полученными с использованием существующего ОТ-ПЦР-теста для регистрацииCTAG1B, CTAG2 и/или PRAME, который осуществляют с использованием образцов РНК. Когда используют образцы, например, тонкоигольный биоптат немелкоклеточного рака легкого,для которых количественная ОТ-ПЦР оказывается сложной, экспрессия белка, выявляемая благодаря определению статуса метилирования гена MageA3, становится полезной альтернативой. Соответственно,тест на метилирование имеет клиническое применение. Таким образом, все способы согласно изобретению можно применять на образцах тонкоигольных биоптатов. В конкретных вариантах осуществления определяют статус метилирования гена MAGE-A3. Такие образцы, как указано выше, не подходят для осуществления альтернативных способов регистрации экспрессии (MAGE-А 3). Такие образцы могут содержать только небольшое количество клеток и, следовательно, содержат низкие уровни ДНК. Например, такие образцы могут обеспечить только примерно от 70 до 150 мкг вводимой ДНК, используемой в каждом анализе. Как показано в примере 4, способы согласно изобретению эффективны при использовании образцов тонкоигольных биоптатов. В следующем аспекте изобретение относится к способу прогнозирования вероятности успешного лечения рака у субъекта, предусматривающему(a) осуществление контакта/обработки ДНК-содержащего образца, полученного от субъекта, реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с получением определяемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;(b) амплификацию по меньшей мере части неметилированного гена CTAG1B, CTAG2 и/илиPRAME с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, из которых по меньшей мере один праймер сконструирован для связывания только с последовательностью неметилированной ДНК, соответственно, после обработки реагентом, причем по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 60 и 61;(c) определение статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3; причем присутствие неметилированного CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 в образце указывает, что вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим средством на основе CTAG1B,CTAG2, PRAME и/или MageA3 выше, чем в случае, когда не выявляют или выявляют более низкие уровни неметилированного гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3. Стадия (с) заключается в выявлении того, образовался ли продукт амплификации. Выявление продукта амплификации (с использованием любого подходящего способа, который обсуждается в настоящем документе) свидетельствует о присутствии неметилированного или гипометилированного CTAG1B,CTAG2, PRAME и/или MageA3 в образце. Конечно, также применима обратная ситуация и, таким образом, способы согласно изобретению могут быть аналогичным образом использованы для того, чтобы определить, существует ли возможная резистентность или возможно ли безуспешное лечение с использованием иммунотерапевтического средства CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 - отсутствие неметилированного CTAG1B, CTAG2,PRAME и/или MageA3 в образце свидетельствует о том, что вероятно будет иметь место резистентность к лечению и/или что лечение вероятно будет безуспешным. Праймеры, специфичные для метилированной ДНК, также могут быть использованы в дополнительных способах в некоторых вариантах. Способы согласно изобретению также могут быть применимы для выбора подходящего курса лечения пациента - присутствие неметилированного CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 свидетельствует о том, что иммунотерапевтические средства CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 могут быть введены с пользой, тогда как отсутствие или низкий уровень неметилированного CTAG1B, CTAG2,PRAME и/или MageA3 свидетельствует, что иммунотерапевтические средства противопоказаны. Обсуждение, приведенное в отношении олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов согласно изобретению, применимо к настоящему аспекту с соответствующими изменениями, и,следовательно, все варианты осуществления рассматриваются как подходящие для данного аспекта изобретения. Термин вероятность успешного лечения означает вероятность того, что лечение рака с использованием любого одного или нескольких из перечисленных терапевтических средств, предпочтительно иммунотерапевтических средств CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, или композиции, содержащей CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3, будет успешным.- 25021100 Резистентность определяют как пониженную вероятность того, что лечение рака с использованием любого одного из указанных иммунотерапевтических средств будет успешным и/или что будет необходима более высокая доза для достижения терапевтического эффекта. Гипометилирование CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 может быть связано с некоторыми типами раковых заболеваний. Соответственно, в конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу выявления предрасположенности или наличия рака молочной железы, рака легкого,включая НМРЛ, или меланомы в образце, включающему в себя определение статуса метилирования генаCTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов,пар праймеров, наборов или способов согласно изобретению, причем выявление неметилированногоCTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 в образце является показателем предрасположенности или наличия рака, и в частности меланомы, рака легкого, включая немелкоклеточную карциному легкого(НМРЛ), или рак молочной железы. В следующем варианте осуществления опухоль или рак выбраны из рака предстательной железы, рака яичника, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака головы и шеи, включая карциному пищевода, рака шейки матки, рака прямой и ободочной кишки, плоскоклеточной карциномы, рака печени, множественной миеломы и рака прямой и ободочной кишки. В следующем аспекте предлагается способ выявления присутствия позитивной по CTAG1B,CTAG2, PRAME и/или MageA3 опухоли, предусматривающий определение статуса метилирования генаCTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 в образце с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описанных в настоящем документе, причем присутствие неметилированного CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 является показателем присутствия позитивной по CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 опухоли. Тестирование может быть осуществлено с диагностической целью или вместе с терапевтической схемой. Тестирование также можно использовать для определения того, какую терапевтическую или профилактическую схему использовать для пациента, и использовать для контроля за эффективностью терапевтической схемы. Соответственно, изобретение дополнительно относится к способу идентификации и/или отбора пациента, подходящего для лечения иммунотерапевтическим средством на основе CTAG1B, CTAG2,PRAME и/или MageA3, предусматривающему определение статуса метилирования гена CTAG1B,CTAG2, PRAME и/или MageA3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описанных в настоящем документе, причем если генCTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 не метилирован, то субъекта идентифицируют и/или отбирают для лечения иммунотерапевтическим средством на основе CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3. Альтернативно, если ген не метилирован, субъекта предпочтительно не отбирают для лечения иммунотерапевтическим средством на основе CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3. В родственном аспекте изобретение относится к способу прогнозирования вероятности успешного лечения рака, предусматривающему определение статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описанных в настоящем документе, причем если ген не метилирован,то вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим средством на основе CTAG1B, CTAG2,PRAME и/или MageA3 выше, чем в том случае, если ген метилирован. Альтернативно, отсутствие неметилированного CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 в образце свидетельствует, что вероятность резистентности к лечению иммунотерапевтическим средством на основе CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 выше, чем в том случае, когда ген не метилирован. Таким образом, выявление метилированного гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 (или отсутствие выявления гипометилированного гена) свидетельствует, что вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим средством является низкой. Таким образом, популяция пациентов может быть отобрана для лечения на основе статуса метилирования их гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3. Такой отбор ведет к намного более целенаправленной и индивидуализированной форме терапии и, следовательно, приводит к повышенной доле успешных попыток лечения, так как пациенты будут подвергаться лечению лекарственными средствами,которые с наиболее высокой вероятностью окажутся эффективными. В следующем родственном аспекте изобретение относится к способу выбора подходящей схемы лечения рака, предусматривающему определение статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 в образце от пациента с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описанных в настоящем документе, причем, если ген не метилирован,иммунотерапевтическое средство (в частности, иммунотерапевтические средства CTAG1B, CTAG2,PRAME и/или MageA3) выбирают для лечения. Альтернативно, если ген не метилирован, лечение иммунотерапевтическим средством противопоказано. Также предлагается способ лечения рака у субъекта, предусматривающий введение иммунотерапевтического средства, причем субъект был отобран для лечения на основе измерения статуса метилирования гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 любым из способов согласно изобретению или с- 26021100 использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе. Предпочтительно в случае всех различных аспектов, описанных в настоящем документе, выявление неметилированного гена CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3 соответствует повышенному уровню белка CTAG1B, CTAG2, PRAME и/или MageA3. Иммунотерапевтические средства CTAG1B, CTAG2, MAGE-A3 и/или PRAME, применимые в настоящем изобретении, включают композиции на основе CTAG1B, CTAG2, MAGE-A3 и/или PRAME. Примерами композиций, содержащих CTAG1B, CTAG2, MAGE-А 3 и/или PRAME, являются композиции, содержащие полноразмерные CTAG1B, CTAG2, MAGE-А 3 или PRAME, почти полноразмерныеCTAG1B, CTAG2, MAGE-А 3 и/или PRAME и фрагменты CTAG1B, CTAG2, MAGE-A3 или PRAME,например, пептиды CTAG1B, CTAG2, MAGE-А 3 или PRAME. Примеры пептидов, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают следующие пептиды MAGE-A3 Белок MAGE может быть полноразмерным MAGE-А 3 или может содержать почти полный фрагмент MAGE3, например, аминокислоты 3-314 MAGE3 (всего 312 аминокислот), или другие фрагментыMAGE-A3, в которых от 1 до 10 аминокислот делетированы из N-конца и/или С-конца белка MAGE-A3. В одном варианте осуществления белок, фрагмент или пептид CTAG1B, CTAG2, MAGE-А 3 и/илиPRAME могут быть связаны с белком, являющимся партнером по слиянию. Примеры антигенов, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают следующие антигены: CTAG1B, CTAG2 и/или PRAME. В качестве примера подходящие пептиды CTAG1B включают пептиды с мотивами связывания сHLA-A2, такие как пептиды 157-167, 157-165 и 155-163, которые описаны (см. публикации Jager et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(22): 12198-12203 (2000. Пептиды CTAG1B могут включать один или несколько эпитопов МНС класса 1 или класса 2, например, эпитопы, известные как A31, DR1, DR2, DR4,DR7, DP4, В 35, В 51, Cw3, Cw6 и А 2 (см. WO 2008/089074). В качестве примера пептиды PRAME могут включать пептиды с мотивами связывания с HLA-A2,такие как пептиды LYVDSLFFL, ALYVDSLFFL, VLDGLDVLL, SLYSFPEA и SLLQHILGL (см. Quintarelli et al., Blood, 1 September 2008, vol. 112, No. 5, pp. 1876-1885). Пептиды PRAME могут включать один или несколько эпитопов МНС класса 1 или класса 2. В качестве примера пептиды CTAG2 могут включать ELVRRILSR, MLMAQEALAFL,SLLMWITQC, LAAQERRVPR, которые описаны (см. публикацию Sun et al. Cancer Immunology, Immunotherapy, vol. 55, Number 6/June, 2006). Белок, фрагмент или пептид CTAG1B, CTAG2, MAGE-A3 и/или PRAME и белок, являющийся партнером по слиянию, могут быть химически конъюгированы или могут быть экспрессированы в виде рекомбинантного слитого белка. В варианте осуществления, в котором антиген и партнер экспрессированы в виде рекомбинантного слитого белка, такое слияние может обеспечить повышенные уровни продуцирования в системе экспрессии по сравнению с неслитым белком. Таким образом, белок, являющийся партнером по слиянию, может помогать в предоставлении Т-хелперных эпитопов (иммунологический белок, являющийся партнером по слиянию), предпочтительно Т-хелперных эпитопов, узнаваемых в организме человека, и/или помогать в экспрессии белка (экспрессии энхансерного белка) на более высоких уровнях, чем в случае нативного рекомбинантного белка. В одном варианте осуществления белком, являющимся партнером в слиянии, могут быть оба белка - иммунологический белок-партнер по слиянию и белок-партнер, усиливающий экспрессию. В одном варианте осуществления изобретения иммунологический белок, являющийся партнером по слиянию, который можно использовать, получают из белка D, поверхностного белка грамотрицательной бактерии Haemophilus influenza В (WO 91/18926) или его производного. Производное белка D может содержать первую 1/3 белка или приблизительно первую 1/3 белка. В одном варианте первые N-концевые 109 остатков белка D могут быть использованы в качестве партнера по слиянию, чтобы обеспечить антиген CTAG1B, CTAG2, MAGE-A3 и/или PRAME дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и повысить уровень экспрессии в E. coli (следовательно, действуя также в качестве энхансера экспрессии). В альтернативном варианте производное белка D может содержать 100-110 первых Nконцевых аминокислот или приблизительно 100-110 первых N-концевых аминокислот. В одном варианте белок D или его производное могут быть липидизированы, может быть использован липопротеид D: ли- 27021100 пидный хвост может обеспечивать оптимальную презентацию антигена антигенпрезентирующим клеткам. В альтернативном варианте белок D или его производное не липидизированы. Последовательность секреции или сигнальная последовательность белка D относится примерно к аминокислотам 1-16, 17,18 или 19 встречающегося в природе белка. В одном варианте последовательность секреции или сигнальная последовательность белка D относится к 19 N-концевым аминокислотам белка D. В одном варианте осуществления последовательность секреции или сигнальная последовательность включена в Nконец белка D, являющегося партнером по слиянию. В используемом в настоящем документе смысле первая треть (1/3), первые 109 аминокислот и первые 100-110 N-концевых аминокислот относятся к аминокислотам последовательности белка D, расположенным сразу после последовательности секреции или сигнальной последовательности. Аминокислоты 2-K и 3-L сигнальной последовательности необязательно могут быть заменены аминокислотами 2-М и 3-D. В одном варианте осуществления антиген для иммунотерапии может быть слит с белком D в форме таких конструкций, как белок D - CTAG1B - His или белок D - CTAG2 - His или белок D - PRAME - His или белок D - MAGE-А 3 - His. Такой слитый белок может содержать сигнальную последовательность белка D, аминокислоты 1-109 белка D, антиген для иммунотерапии (который может быть представлен полноразмерной последовательностью или частичной последовательностью белка), спейсер и полигистидиновый хвост (His), который может облегчать очистку слитого белка в ходе процесса очистки, напримерi) состоящая из 18 остатков сигнальная последовательность и первые 109 N-концевых остатков белка D;ii) два несвязанных остатка (метионин и аспарагиновая кислота);v) семь остатков гистидина. Часть белка D, которая может быть использована, предпочтительно не содержит последовательности секреции или сигнальной последовательности. В некоторых вариантах белок, являющийся партнером по слиянию, содержит аминокислоты Met-Asp-Pro на N-конце или в области N-конца последовательности слитого белка и не содержит последовательности секреции или сигнальной последовательности белка D. Например, белок, являющийся партнером по слиянию, может содержать или состоять примерно или точно из 17-127, 18-127, 19-127 или 20-127 аминокислот белка D. В качестве примера подходящие антигена PRAME, основанные на слияниях белков с белком D,описаны в WO 2008/087102, и указанный документ включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В другом варианте осуществления иммунным белком-партнером по слиянию может быть белок, известный как LytA, или полученный из него белок. LytA получают из Streptococcus pneumoniae, который синтезирует N-ацетил-L-аланинамидазу, амидазу LytA (кодируемую геном LytA (Gene, 43 (1986), p. 265272, аутолизин которого специфично разрушает некоторые связи в пептидогликановом остове. Сконцевой домен белка LytA ответственен за аффинность к холину или к некоторым аналогам холина,таким как DEAE. Указанное свойство было использовано для разработки плазмид Е. coli, экспрессирующих C-LytA, применимых для экспрессии слитых белков. Описана очистка гибридных белков, содержащих фрагмент C-LytA на своем аминоконце (Biotechnology: 10, (1992) p. 795-798). В одном варианте может быть использована С-концевая часть молекулы. Может быть использована повторяющаяся часть молекулы LytA, встречающаяся на С-конце, начиная с остатка 178. В одном варианте осуществления часть LytA может включать в себя остатки 188-305. Другие партнеры по слиянию включают неструктурный белок вируса гриппа, NS1 (гемагглютинин). В одном варианте осуществления используют 81 N-концевую аминокислоту NS1, хотя можно использовать разные фрагменты при условии, что они содержат Т-хелперные эпитопы. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антиген для применения в иммунотерапии может содержать дериватизованный свободный тиол. В одном варианте осуществления настоящего изобретения белок MAGE-А 3 может содержать дериватизованный свободный тиол. Такие антигены описаны в WO 99/40188. В частности, можно использовать карбоксиамидированные или карбоксиметилированные производные. Антигены для иммунотерапии можно использовать в сочетании с другими иммунотерапевтическими антигенами в форме слияния или в смеси. Например, CTAG1B можно применять в виде слияния сCTAG2 или его фрагментом (см. документ WO 2008/089074, который включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме). Сочетания иммунотерапевтических средств либо в виде слитых белков, либо в виде смесей включают, например, любое сочетание из 2 или более CTAG1B, CTAG2, PRAME или MAGE3, хотя изобретение не ограничено указанными конкретными антигенами, и можно использовать любой иммунотерапевтический антиген. В качестве примера, антигены MAGE-3, например, были описаны как подходящие для приготовления в сочетании с NY-ESO-1 (см. документ WO 2005/105139, который включен в настоящий- 28021100 документ посредством ссылки в полном объеме). В следующем варианте осуществления иммунотерапевтические средства для применения в настоящем изобретении могут содержать молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую иммунотерапевтический белок, фрагмент или пептид или слитый белок, которые описаны в настоящем документе. В одном варианте настоящего изобретения последовательности могут быть встроены в подходящий экспрессирующий вектор и использованы для ДНК/РНК-вакцинации. Микробные векторы, экспрессирующие нуклеиновую кислоту, также могут быть использованы в качестве вектора, доставляющего иммунотерапевтические средства. Примеры подходящих вирусных векторов включают системы, основанные на ретровирусах, лентивирусах, аденовирусах, аденоассоциированных вирусах, вирусах герпеса, включая вирус простого герпеса, альфа-вирусах, поксвирусах, таких как птичий поксвирус и вирус осповакцины. Методики переноса генов с использованием таких вирусов известны специалистам в данной области техники. Ретровирусные векторы, например, можно использовать для стабильной интеграции полинуклеотида согласно изобретению в геном хозяина, хотя такая рекомбинация не является предпочтительной. Дефектные по репликации аденовирусные векторы, напротив, сохраняются в виде эписом и поэтому обеспечивают временную экспрессию. Векторы, способные управлять экспрессией в клетках насекомых (например, бакуловирусные векторы), в клетках человека, дрожжах и бактериях, можно использовать для получения определенных количеств белка, кодируемого полинуклеотидами согласно настоящему изобретению, например, для использования в качестве субъединичных вакцин или в иммуноанализах. В предпочтительном варианте осуществления аденовирусом, используемым в качестве живого вектора, является дефектный по репликации аденовирус обезьян. Обычно такие вирусы содержат делецию Е 1 и могут расти на линиях клеток, которые трансформированы геном Е 1. Предпочтительными аденовирусами обезьян являются вирусы, выделенные из организма шимпанзе. В частности, С 68 (также известный как Pan 9) (см. патент США 6083716) и Pan 5, 6 и Pan 7 (WO 03/046124) являются предпочтительными для применения в соответствии с настоящим изобретением. Такие векторы могут быть подвергнуты обработке, чтобы встроить гетерологичный ген согласно изобретению так, чтобы мог быть экспрессирован генный продукт. Применение, получение и производство таких рекомбинантных аденовирусных векторов подробно описано в WO 03/046142. Обычные методики рекомбинации для получения последовательностей нуклеиновых кислот и получение экспрессирующих векторов описаны (см. Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor, 1982-1989). В случае основанных на белках композиций белки согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены либо растворенными в жидкой форме, либо в лиофилизированной форме. Каждая доза для человека может содержать от 1 до 1000 мкг белка. В одном варианте доза может содержать 30-300 мкг белка. Композиция для иммунотерапии, которая описана в настоящем документе, может дополнительно содержать адъювант для вакцины и/или иммуностимулирующий цитокин или хемокин. Таким образом,термин иммунотерапевтическое средство, используемый в настоящем документе, может охватывать все композиции для иммунотерапии, которые описаны в настоящем документе, включая подходящие адъюванты. Подходящие вакцинные адъюванты для применения в соответствии с настоящим изобретением коммерчески доступны, такие как, например, неполный адъювант и полный адъювант Фройнда (DifcoBeecham, Philadelphia, PA); соли алюминия, такие как гель гидроокиси алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; дериватизованные катионами или анионами полисахариды; полифосфазены; биоразрушаемые микросферы; монофосфориллипид А и квил А. Цитокины, такие как GM-CSF или интерлейкин 2, 7 или 12, и хемокины также можно использовать в качестве адъювантов. В одном варианте осуществления адъювант может содержать сочетание монофосфориллипида А,такого как 3-де-О-ацетилированный монофосфориллипид A (3D-MPL), с солью алюминия. Альтернативно, адъювант может содержать 3D-MPL или другие лиганды toll-подобного рецептора 4 (TLR4), такие как аминоалкилглюкозаминидфосфаты, которые описаны в WO 98/50399, WO 01/34617 и WO 03/065806. Другим адъювантом, который можно использовать, является сапонин, например, QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), который можно применять отдельно или в сочетании с другими адъювантами. Например, в одном варианте предлагается сочетание монофосфориллипида А и производного сапонина, такое как сочетание QS21 и 3D-MPL, которое описано в WO 94/00153, или композиция, в которой QS21 гасится холестерином, как описано в WO 96/33739. Другие подходящие препараты содержат эмульсию типа масло в воде и токоферол. В одном варианте осуществления адъювант содержитQS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии типа масло в воде, как описано в WO 95/17210. Другие адъюванты для применения в соответствии с настоящим изобретением могут содержать антагонисты TLR9, такие как неметилированные олигонуклеотиды, содержащие CpG, в которых динуклео- 29