Оптимизация экспрессии парвовирусных белков rep и cap в клетках насекомых
Номер патента: 20969
Опубликовано: 31.03.2015
Авторы: Баккер Андре Кристиан, Нордман Ивет, Херменс Вильхельмус Теодорус Йоханнес Мария Кристиан
Формула / Реферат
1. Способ получения рекомбинантного парвовирусного вириона, включающий стадии:
(a) получение клетки насекомого, содержащей одну или несколько конструкций нуклеиновых кислот, содержащих
(i) нуклеотидную последовательность, содержащую трансген, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью парвовирусного инвертированного концевого повтора;
(ii) первую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один из белков Rep78 и Rep68, которая функционально связана с первым промотором, способным управлять экспрессией белка Rep в клетке насекомого;
(iii) вторую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок парвовируса, которая функционально связана со вторым промотором, который способен управлять экспрессией капсидного белка в клетке насекомого;
(b) культивирование клетки, определенной в пункте (а), в условиях, подходящих для экспрессии Rep и капсидного белка; и
(c) необязательно выделение рекомбинантного парвовирусного вириона;
причем первая и вторая кассеты экспрессии присутствуют в одной конструкции нуклеиновой кислоты,
в котором отношение экспрессии белка Rep к экспрессии капсидного белка регулируется одним или несколькими из следующих путей:
первый промотор имеет такую же силу или является более сильным, чем второй промотор;
присутствие большего количества и/или более сильных энхансерных элементов в первой кассете экспрессии по сравнению со второй кассетой экспрессии;
нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный белок Rep, имеет более высокий индекс адаптации кодонов по сравнению с нуклеотидной последовательностью, кодирующей капсидный белок;
оптимизация температуры для парвовирусного белка Rep и/или
варианты белков Rep с одной или несколькими заменами, инсерциями и/или делециями в аминокислотной последовательности по сравнению с соответствующим белком Rep дикого типа, и при этом замена, инсерция и/или делеция аминокислот приводят к повышению активности функции Rep, которое оценивают с помощью выявления повышенной продукции AAV в клетках насекомых.
2. Способ по п.1, в котором нуклеотидная последовательность по пункту (iii) содержит открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3.
3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором нуклеотидная последовательность по пункту (ii) содержит только одну открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Rep78 и Rep68.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3, или открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Rep78 и Rep68, не содержат искусственного интрона.
5. Способ по п.4, в котором ни открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3, и/или ни открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Rep78 и Rep68, не содержат искусственного интрона.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первый промотор или второй промотор выбран из группы, состоящей из промотора PolH, промотора р10, основного промотора, индуцируемого промотора, промотора Е1 или промотора deltaE1.
7. Способ по п.6, в котором первый промотор выбран из группы, состоящей из промотора PolH, промотора р10 или основного промотора, и в котором вторым промотором является промотор deltaE1 или промотор Е1.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первая кассета экспрессии содержит по меньшей мере один бакуловирусный энхансерный элемент и/или по меньшей мере один элемент, отвечающий на экдизон.
9. Способ по п.8, в котором энхансерный элемент выбран из группы, состоящей из hr1, hr2, hr3, hr4 и hr5.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность ITR парвовируса, парвовирусный белок Rep и/или парвовирусный белок Сар происходят из аденоассоциированного вируса (AAV).
11. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая первую и вторую кассеты экспрессии, которые определены в любом из пп.1-10, в которой
(a) первым промотором является промотор р10, а вторым промотором является промотор PolH или 4xHsp27 EcRE+минимальный промотор Hsp70;
(b) первым промотором является 4xHsp27 EcRE+минимальный промотор Hsp70, а вторым промотором является промотор PolH;
(c) первым промотором является промотор PolH, а вторым промотором является промотор p10, deltaE1 или Е1;
(d) первым промотором является промотор PolH, а вторым промотором является промотор deltaE1 или Е1;
(e) первым промотором является промотор р10, а вторым промотором является промотор deltaE1 или промотор Е1 или
(f) первым промотором является промотор PolH, и вторым промотором является промотор PolH,
и при этом первая кассета экспрессии необязательно содержит энхансерный элемент.
12. Клетка насекомого, включающая конструкцию нуклеиновой кислоты, определенную в любом из пп.1-10.
13. Набор, содержащий (а) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую первую и вторую кассеты экспрессии, которые определены в любом из пп.1-10; и (b) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт множественного клонирования для трансгена, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью инвертированного концевого повтора парвовируса, причем трансген функционально связан с промотором, способным управлять экспрессией трансгена в клетке-хозяине.
Текст
ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ПАРВОВИРУСНЫХ БЕЛКОВ Rep И Cap В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ Настоящее изобретение относится к улучшенной продукции рекомбинантных парвовирусных вирионов в клетках насекомых. В частности, изобретение относится к усовершенствованному способу получения рекомбинантных парвовирусных вирионов в клетках насекомых, при котором соотношение заполненные/пустые парвовирусные вирионы повышено. Изобретение также относится к получению парвовирусных векторов, которые можно применять в генной терапии,и к улучшению экспрессии вирусных белков Rep, что повышает продуктивность парвовирусных векторов. Баккер Андре Кристиан, Херменс Вильхельмус Теодорус Йоханнес Мария Кристиан, Нордман Ивет (NL) Медведев В.Н. (RU) Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к получению парвовирусных векторов, в частности к получению рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (rAAV) в клетках насекомых, к бакуловирусным экспрессирующим векторам, содержащим конструкцию согласно изобретению, и к клетке, содержащей такой бакуловирусный экспрессирующий вектор. Уровень техники Бакуловирусная система экспрессии хорошо известна для применения в качестве эукариотического клонирующего и экспрессирующего вектора (King, L. A. and R. D. Possee, 1992, "The baculovirus expression system", Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., et al., 1992. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. New York; W. H. Freeman). Наряду с другими преимуществами бакуловирусной системы экспрессии ее преимуществом является то, что экспрессированные белки почти всегда растворимы, подвергаются правильному фолдингу и биологически активны. Дополнительными преимуществами являются высокие уровни экспрессии белка, более быстрое продуцирование, пригодность для экспрессии крупных белков и пригодность для крупномасштабного получения. Однако в случае крупномасштабного или непрерывного получения гетерологичных белков с использованием бакуловирусный системы экспрессии в биореакторах с клетками насекомых большие трудности создает нестабильность уровней продуцирования, также известная как эффект пассажа. Такой эффект, по меньшей мере, частично является следствием рекомбинации между повторяющимися гомологичными последовательностями в бакуловирусной ДНК. Бакуловирусную систему экспрессии также успешно применяли для получения рекомбинантных векторов на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) (Urabe et al., 2002, Hum. Gene Ther. 13: 19351943; US 6723551 и US 20040197895). AAV можно считать одним из наиболее многообещающих вирусных векторов для генной терапии человека. AAV обладает способностью эффективно инфицировать делящиеся, а также не делящиеся клетки человека, вирусный геном AAV интегрируется в один хромосомный сайт в геноме клеток-хозяев, и что наиболее важно, даже несмотря на то что AAV присутствует в организме многих людей, он никогда не был ассоциирован ни с каким заболеванием. С точки зрения таких преимуществ рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV) проходит оценку в клинических испытаниях генной терапии гемофилии В, злокачественной меланомы, кистозного фиброза, гиперлипопротеинемии типа I и других заболеваний. Чтобы преодолеть проблемы, связанные с системами продуцирования млекопитающих, в случаеAAV Urabe с соавторами (2002, выше) разработали систему получения AAV в клетках насекомых. Для получения AAV в клетках насекомых были необходимы некоторые модификации, чтобы добиться правильной стехиометрии трех капсидных белков AAV (VP1, VP2 и VP3) на основе сочетания поочередного использования двух акцепторных сайтов сплайсинга и субоптимального использования кодона инициации ACG для VP2, который не точно репродуцируется клетками насекомых. Чтобы имитировать точную стехиометрию капсидных белков в клетках насекомых, Urabe с соавторами (2002, выше) используют конструкцию, которая транскрибируется в одну полицистронную матричную РНК, которая способна экспрессировать все три белка VP без необходимости в сплайсинге, и где расположенный выше других по ходу транскрипции инициирующий кодон заменен субоптимальным инициирующим кодоном ACG. В публикации WO 2007/046703 описано дополнительное повышение инфекционности полученных с помощью бакуловирусов rAAV-векторов, основанное на получении с использованием оптимизации стехиометрии капсидных белков AAV, которые продуцируются в клетках насекомых. Для экспрессии белков Rep AAV в системе экспрессии AAV в клетках насекомых, которая исходно разработана Urabe с соавторами (2002, выше), используют рекомбинантную бакуловирусную конструкцию, которая несет две независимых единицы экспрессии Rep (одну для Rep78 и одну для Rep52), каждая из которых находится под контролем отдельного промотора клеток насекомых, промоторов IE1 иPolH, соответственно. Однако Kohlbrenner с соавторами (2005, Mol. Ther. 12: 1217-25; WO 2005/072364) сообщили, что бакуловирусная конструкция для экспрессии двух белков Rep, которую использовалиUrabe с соавторами, страдает присущей ей нестабильностью. Благодаря расщеплению двух ориентированных в виде палиндрома генов Rep в исходном векторе, разработанном Urabe, и конструированию двух отдельных бакуловирусных векторов для экспрессии Rep52 и Rep78, Kohlbrenner с соавторами(2005, выше) повысили стабильность вектора при пассажах. Однако, несмотря на согласованную экспрессию Rep78 и Rep52 с двух независимых конструкций бакуловирус-Rep в клетках насекомых на протяжении по меньшей мере 5 пассажей, выход вектора rAAV в 5-10 раз ниже по сравнению с исходной конструкцией бакуловирус-Rep, созданной Urabe с соавторами (2002, выше). В заявке WO 2007/148971 указано, что авторы настоящего изобретения значительно повысили стабильность продуцирования вектора rAAV в клетках насекомых с использованием одной кодирующей последовательности для белков Rep78 и Rep52, при этом использовали субоптимальный инициирующий кодон для белка Rep78, который частично пропускается сканирующими рибосомами, что обеспечивает возможность того, что инициация трансляции далее также происходит ниже в кодоне инициации белкаRep52. В международной заявке на выдачу патента WO 2007/084773 описан способ получения rAAV в клетках насекомых, при этом продуцирование инфекционных вирусных частиц повышено посредством добавления VP1 к VP2 и VP3. Добавление может быть осуществлено введением в клетку насекомого капсидного вектора, содержащего нуклеотидные последовательности, экспрессирующие VP1, VP2 иVP3, и, кроме того, введением в клетку насекомого нуклеотидных последовательностей, экспрессирующих VP1, которые могут быть либо в одном и том же капсидном векторе, либо в другом векторе. Однако все еще существует необходимость в дальнейших усовершенствованиях крупномасштабного (коммерческого) получения парвовирусных векторов в клетках насекомых. Таким образом, целью настоящего изобретения являются средства и способы, которые обеспечивают стабильное получение парвовирусных векторов с высоким выходом (крупномасштабное), и получение, результатом которого является повышенное соотношение полные/пустые частицы (т.е. большая доля заполненных частиц). Сущность изобретения Изобретение относится к способу получения рекомбинантного парвовирусного вириона. Применение такого способа может обеспечить возможность получения таких вирионов с повышенным титром. Применение способа альтернативно или дополнительно может обеспечить возможность получения более высокой доли заполненных частиц, т.е. более благоприятного соотношения заполненных/пустых частиц или суммарных/заполненных частиц. Изобретение относится к способу получения рекомбинантного парвовирусного вириона, включающему следующие стадии:(a) получения клетки насекомого, содержащей одну или несколько конструкций нуклеиновых кислот, содержащих(i) нуклеотидную последовательность, содержащую трансген, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью парвовирусного инвертированного концевого повтора;(ii) первую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Rep парвовируса, которая функционально связана с первым промотором, который способен управлять экспрессией белка Rep в клетках насекомых;(iii) вторую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок парвовируса, которая функционально связана со вторым промотором, который способен управлять экспрессией капсидного белка в клетках насекомых;(c) необязательно извлечения рекомбинантного парвовирусного вириона; причем первая и вторая кассеты экспрессии присутствуют в одной конструкции нуклеиновой кислоты, и при этом первая и вторая кассеты экспрессии, когда они присутствуют в эквимолярном количестве в клетках насекомых, дают отношение уровня мРНК, кодирующей белок Rep, к уровню мРНК, кодирующей капсидный белок, составляющее по меньшей мере 0,5, которое определяют с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией во временной точке в интервале от 24 до 72 чпосле трансфекции. Изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей первую и вторую кассеты экспрессии, которые определены выше, при этом(a) первым промотором является промотор p10, а вторым промотором является промотор PolH или 4xHsp27 EcRE+минимальный промотор Hsp70;(b) первым промотором является 4xHsp27 EcRE+минимальный промотор Hsp70, а вторым промотором является промотор PolH;(c) первым промотором является промотор PolH, а вторым промотором является промотор p10, deltaE1 или Е 1;(d) первым промотором является промотор PolH, а вторым промотором является промотор deltaE1 или Е 1;(e) первым промотором является промотор р 10, а вторым промотором является промотор deltaE1 или промотор Е 1; или(f) первым промотором является промотор PolH, а вторым промотором является промотор PolH,и при этом первая кассета экспрессии необязательно содержит энхансерный элемент; клетке насекомого, которая определена выше; и набору, содержащему(b) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт множественного клонирования для трансгена, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью инвертированного концевого повтора парвовируса, и такой трансген функционально связан с промотором, способным управлять экспрессией трансгена в клеткехозяине. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показано схематичное представление конструирования pVD118(new). На фиг. 2 показано схематичное представление конструирования pVD118(new)+HR1. На фиг. 3 показано схематичное представление конструирования pVD165. На фиг. 4 показано схематичное представление конструирования pVD165+HR1. На фиг. 5 показано схематичное представление конструирования pVD165 + 4xEcRE1 CAP. На фиг. 6 показано схематичное представление конструирования pVD165 + 4xEcRE Rep78. На фиг. 7 показано схематичное представление конструирования pVD165 + deltaIE1 CAP. На фиг. 8 показано схематичное представление конструирования deltaIE1 Cap + pPolh Rep(pVD190). На фиг. 9 показано схематичное представление конструирования p10Cap + pPolh Rep. На фиг. 10 показано схематичное представление конструирования pVD194. На фиг. 11 А показан Вестерн-блот-анализ белков Сар и Rep, экспрессированных с Bac.VD194, через три дня после инфекции с использованием соотношений бакуловирусов 1:1 и 5:1(C=Bac.VD88:Bac.VD84:Bac.VD43 5:1:1, соответственно). На фиг. 11 В показаны титры вирусов в случае тех же самых получений, которые проанализированы на фиг. 11 А. Описание изобретения Определения В используемом в настоящем описании смысле термин "функционально связан" относится к связыванию полинуклеотидных (или полипептидных) элементов с возникновением в результате функциональной взаимосвязи. Нуклеиновая кислота "функционально связана", когда она помещена в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, последовательность регуляции транскрипции функционально связана с кодирующей последовательностью, если она влияет на транскрипцию кодирующей последовательность. "Функционально связаны" означает, что связанные последовательности ДНК обычно являются смежными последовательностями, и, в том случае, когда необходимо связать две области, кодирующие белки, являются смежными и находятся в рамке считывания."Последовательность регуляции экспрессии" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию нуклеотидной последовательности, с которой она функционально связана. Последовательность регуляции экспрессии "функционально связана" с нуклеотидной последовательностью, когда последовательность регуляции экспрессии контролирует и регулирует транскрипцию и/или трансляцию нуклеотидной последовательности. Таким образом, последовательность регуляции экспрессии может включать промоторы, энхансеры, участки внутренней посадки рибосомы (IRES), терминаторы транскрипции, стартовый кодон перед геном, кодирующим белок, сигнал сплайсинга интронов и стоп-кодоны. Подразумевается, что термин "последовательности регуляции экспрессии" включает как минимум последовательность, присутствие которой в конструкции влияет на экспрессию, а также может включать дополнительные предпочтительные компоненты. Например, лидерные последовательности и последовательности партнеров при слиянии являются последовательностями регуляции экспрессии. Термин также может включать конструирование последовательности нуклеиновой кислоты так, чтобы нежелательные потенциальные кодоны инициации в рамке и вне рамки были удалены из последовательности. Термин также может включать конструирование последовательности нуклеиновой кислоты так,чтобы нежелательные потенциальные сайты сплайсинга были удалены. Термин включает последовательности или последовательности полиаденилирования (рА), которые управляют добавлением поли-Ахвоста, т.е. цепочки из остатков аденина, на 3'-конце мРНК, такие последовательности называют поли-Апоследовательностями. Также может быть сконструирована последовательность регуляции экспрессии для повышения стабильности мРНК. Последовательности регуляции экспрессии, которые влияют на стабильность транскрипции и трансляции, например, промоторы, а также последовательности, которые влияют на трансляцию, например последовательности Козака, в клетках насекомых известны. Последовательности регуляции экспрессии могут иметь такую природу, что способны модулировать нуклеотидную последовательность, с которой они функционально связаны, так чтобы получить более низкие уровни экспрессии или более высокие уровни экспрессии. В используемом в настоящем описании смысле термин "промотор" или "последовательность регуляции транскрипции" относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует, регулируя транскрипцию одной или нескольких кодирующих последовательностей, и расположен выше по направлению транскрипции от сайта инициации транскрипции кодирующей последовательности и структурно идентифицируется по наличию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и любых других последовательностей ДНК, включая без ограничения сайты связывания факторов транскрипции, сайты связывания белка репрессора и белка активатора и любые другие последовательности нуклеотидов, которые, как известно специалисту в данной области, действуют прямо или опосредованно, регулируя количество транскрипции с промотора. "Конститутивный" промотор представляет собой промотор, который является активным в большинстве тканей в случае большинства физиологических условий и условий, связанных со стадией развития. "Индуцируемый" промотор пред-3 020969 ставляет собой промотор, который регулируется физиологическими условиями или в зависимости от стадии развития, например, в результате использования химического индуктора. "Тканеспецифичный" промотор активен только в конкретных типах тканей или клеток."Идентичность последовательностей" и "сходство последовательностей" можно определить посредством выравнивания двух пептидных или двух нуклеотидных последовательностей, используя алгоритмы глобального или локального выравнивания в зависимости от длины двух последовательностей. Последовательности сходной длины предпочтительно выравнивают, используя алгоритмы глобального выравнивания (например, алгоритм Нидлмана-Вунша), которые оптимально выравнивают последовательности по всей длине, тогда как последовательности с существенно различающейся длиной предпочтительно выравнивают, используя алгоритм локального выравнивания (например, алгоритм СмитаВатермана). Затем последовательности могут быть названы "по существу, идентичными" или "по существу, сходными", когда они (при оптимальном выравнивании с использованием, например, программGAP или BESTFIT с параметрами по умолчанию) имеют, по меньшей мере, некоторую минимальную идентичность последовательностей в процентах (которая определена ниже). В программе GAP используется алгоритм глобального выравнивания Нидлмана и Вунша для выравнивания двух последовательностей по всей длине (полной длине), максимизирующий количество совпадений и минимизирующий количество пробелов. Глобальное выравнивание соответственно используют для определения идентичности последовательностей, когда две последовательности имеют сходные длины. В общем, используют параметры GAP по умолчанию, при этом штраф за пропуск = 50 (нуклеотиды)/8 (белки) и штраф за удлинение пропуска = 3 (нуклеотиды)/2 (белки). В случае нуклеотидов используемой по умолчанию матрицей является матрица nwsgapdna, и в случае белков используемой по умолчанию матрицей является матрица Blosum62 (Henikoff and Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Выравнивание последовательностей и оценка идентичности последовательностей в процентах могут быть осуществлены с использованием компьютерных программ, таких как пакет программ GCG Wisconsin, версия 10.3, доступный из AccelrysInc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA, или с использованием компьютерной программы из открытого источника, такой как программа "needle" (использующая глобальный алгоритм Нидлмана-Вунша) или программа "water" (использующая локальный алгоритм Смита-Ватермана) в EmbossWIN, версия 2.10.0, с использованием таких же параметров, как параметры, указанные для GAP выше,или с использованием установок по умолчанию (как для "needle", так и для "water", и как выравнивания и белков, и ДНК, штраф за открытие пропуска по умолчанию равен 10,0, и штраф за удлинение пропуска по умолчанию равен 0,5; матрицами подсчета по умолчанию являются Blossum62 для белков и DNAFull для ДНК). Когда последовательности имеют, по существу, разные общие длины, предпочтительны локальные выравнивания, такие как выравнивания с использованием алгоритма Смита-Ватермана. Альтернативно, сходство или идентичность в процентах можно определить в результате поиска в общедоступных базах данных использованием таких алгоритмов, как FASTA, BLAST и т.д. Нуклеотидные последовательности, кодирующие парвовирусные белки Cap и/или Rep согласно изобретению, также могут быть определены по их способности гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 20, 22, 24 и 1-4, соответственно, в умеренных или предпочтительно в жестких условиях гибридизации. Условия жесткости гибридизации в настоящем описании определяют как условия, которые позволяют последовательности нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере около 25, предпочтительно около 50 нуклеотидов, 75 или 100 и более предпочтительно около 200 или более нуклеотидов гибридизоваться при температуре, составляющей примерно 65 С, в растворе, содержащем примерно 1 М соль,предпочтительно в 6SSC или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу, и промывку при 65 С в растворе, содержащем примерно 0,1 М соль или соль в меньшей концентрации, предпочтительно в 0,2SSC или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу. Предпочтительно гибридизацию осуществляют в течение ночи, т.е. по меньшей мере в течение 10 ч, и предпочтительно промывку осуществляют в течение по меньшей мере 1 ч, используя по меньшей мере две замены раствора для промывки. Такие условия, как правило, обеспечивают возможность специфичной гибридизации последовательностей, имеющих примерно 90% или большую идентичность последовательностей. Умеренные условия в данном случае определяют как условия, которые позволяют последовательностям нуклеиновых кислот длиной по меньшей мере 50 нуклеотидов, предпочтительно примерно 200 или более нуклеотидов гибридизоваться при температуре около 45 С в растворе, содержащем примерно 1 М соль, предпочтительно в 6SSC или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу, и промывку при комнатной температуре в растворе, содержащем примерно 1 М соль, предпочтительно в 6SSC или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу. Предпочтительно гибридизацию осуществляют в течение ночи, т.е. в течение по меньшей мере 10 ч, и предпочтительно промывку осуществляют в течение по меньшей мере 1 ч, используя по меньшей мере две замены раствора для промывки. Такие условия, как правило, обеспечивают возможность специфичной гибридизации последовательностей, имеющих идентичность последовательностей до 50%. Специалист в данной области сможет модифицировать такие условия гибридизации, чтобы специфично идентифицировать последовательности,-4 020969 идентичность которых варьирует в диапазоне 50-90%."Вектор" представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты (обычно ДНК или РНК), которая служит для переноса последовательности нуклеиновой кислоты-пассажира (т.е. ДНК или РНК) в клеткухозяина. Три общих типа векторов включают плазмиды, фаги и вирусы. Предпочтительно вектор является вирусом. Векторы, которые содержат и промотор, и сайт клонирования, в котором полинуклеотид может быть функционально связан, хорошо известны в данной области. Такие векторы способны к транскрипции РНК in vitro или in vivo и являются коммерчески доступными из таких источников, как Stratagene (La Jolla, Calif.) и Promega Biotech (Madison, Wis.). Чтобы оптимизировать экспрессию и/или транскрипцию in vitro, может быть необходимым удаление, добавление или изменение 5/- и/или 3'нетранслируемых частей клонов, чтобы исключить дополнительные, потенциально неподходящие альтернативные кодоны инициации трансляции или другие последовательности, которые могут мешать или снижать экспрессию либо на уровне транскрипции, либо на уровне трансляции. Альтернативно, консенсусные сайты связывания с рибосомой могут быть встроены непосредственно с 5'-стороны от стартового кодона, чтобы усилить экспрессию."Вирусный вектор" относится к вектору, содержащему некоторые или все следующие компоненты: вирусные гены, кодирующие генный продукт, регуляторные последовательности и последовательности для упаковки вирусов."Парвовирусный вектор" определяют как рекомбинантно полученный парвовирус или парвовирусную частицу, которая содержит полинуклеотид, который необходимо доставить в клетку-хозяина, либоin vivo, либо ex vivo, либо in vitro. Примерами парвовирусных векторов являются, например, аденоассоциированные вирусные векторы. В настоящем описании конструкция парвовирусного вектора относится к полинуклеотиду, содержащему вирусный геном или его часть и трансген. Адаптация нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, к использованию кодонов клетки-хозяина может быть выражена в виде индекса адаптации кодонов (CAI). Индекс адаптации кодонов в данном случае определяют как меру относительной адаптации использования кодонов гена по отношению к использованию кодонов высокоэкспрессируемых генов в конкретной клетке или организмехозяине. Относительная адаптация (w) каждого кодона представляет собой отношение использования каждого кодона к использованию наиболее широко встречаемого кодона для той же самой аминокислоты. Индекс CAI определяют как геометрическое среднее таких значений относительной адаптации. Исключаются несинонимические кодоны и кодоны терминации (зависимые от генетического кодона). Диапазон значений CAI составляет от 0 до 1, при этом более высокие значения свидетельствуют о более высокой доле широко используемых кодонов (см. Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 11: 1281-1295; также см.: Jansen et al., 2003, Nucleic Acidas Res. 31 (8): 2242-51). Термин "репортер" (или репортерный ген или белок) главным образом используют по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей видимые маркерные белки, такие как зеленый флуоресцирующий белок (GFP), eGFP, другие флуоресцирующие белки, люцифераза, секретируемая щелочная фосфатаза (SEAP), GUS и тому подобные, а также маркеры nptII и тому подобные. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к применению парвовирусов, в частности депендовирусов, таких как инфекционный AAV человека или обезьяны, и их компонентов (например, парвовирусного генома),для использования в качестве векторов для введения и/или экспрессии нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих, предпочтительно клетках человека. В частности, изобретение относится к повышению продуктивности таких парвовирусных векторов в случае продуцирования в клетках насекомых. Продуктивность в таком контексте охватывает повышение продуцируемых титров и улучшение качества полученного продукта, например, получение продукта, который имеет улучшенное соотношение суммарные/заполненные (мера количества частиц, которые содержат нуклеиновую кислоту). То есть конечный продукт может иметь повышенную долю заполненных частиц, при этом термин "заполненная" подразумевает, что частица содержит нуклеиновую кислоту. Вирусы семейства Parvoviridae представляют собой небольшие ДНК-вирусы. Семейство Parvoviridae можно разделить на два подсемейства: Parvovirinae, которые инфицируют позвоночных, и Densovirinae, которые инфицируют беспозвоночных, включая насекомых. Представители подсемейства Parvovirinae в настоящем описании называют парвовирусами, и они включают род депендовирусов. Как можно определить, исходя из названия такого рода, представители депендовирусов уникальны в том, что обычно они требуют совместной инфекции с хелперным вирусом, таким как аденовирус или вирус герпеса для продуктивной инфекции в культуре клеток. Род депендовирусов включает AAV, который обычно инфицирует человека (например, серотипы 1, 2, 3 А, 3 В, 4, 5 и 6) или приматов (например, серотипы 1 и 4), и родственные вирусы, которые инфицируют других теплокровных животных (например, аденоассоциированные вирусы коров, собак, лошадей и овец). Дополнительная информация о парвовирусах и других представителях Parvoviridae описана (см. Kenneth I. Berns "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", глава 69 в Fields Virology (3d Ed. 1996. Для удобства настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано и описано в настоящем описании со ссылкой на AAV. Однако следует понимать, что изобретение не ограничено AAV, и в равной мере может быть применено к другим парвовирусам. Геномная организация всех известных серотипов AAV очень сходна. Геном AAV представляет собой линейную однонитевую молекулу ДНК, которая имеет длину меньше чем примерно 5000 нуклеотидов. Инвертированные концевые повторы (ITR) фланкируют уникальные кодирующие нуклеотидные последовательности для неструктурных белков репликации (Rep) и структурных белков (VP). Белки VP(VP1, -2 и -3) образуют капсид. Концевые 145 нуклеотидов являются самокомплементарными и организованы таким образом, что может быть образован энергетически стабильный внутримолекулярный дуплекс, образующий Т-образную шпильку. Такие структуры в виде шпилек функционируют в качестве начала репликации вирусной ДНК, служат в качестве праймеров для клеточного комплекса ДНКполимеразного комплекса. После инфекции wtAAV в клетки млекопитающих гены Rep (т.е. Rep78 иRep52) экспрессируются с промотора Р 5 и промотора Р 19, соответственно, и оба белка Rep выполняют функцию в репликации вирусного генома. Событие сплайсинга в ORF Rep фактически приводит к экспрессии четырех белков Rep (т.е. Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40). Однако было показано, что не подвергнутые сплайсингу мРНК, кодирующие белки Rep78 и Rep52,в клетках млекопитающих достаточны для продуцирования вектора AAV. Также в клетках насекомых белки Rep78 и Rep52 достаточны для продуцирования вектора AAV."Рекомбинантный парвовирусный вектор или AAV-вектор" (или "вектор rAAV") в настоящем описании относится к вектору, содержащему одну или несколько представляющих интерес полинуклеотидных последовательностей, представляющих интерес генов или "трансгенов", которые фланкированы по меньшей мере одной последовательностью инвертированного концевого повтора (ITR) парвовируса илиAAV. Предпочтительно трансген (трансгены) фланкирован/фланкированы ITR, по одному с каждой стороны трансгена (трансгенов). Такие векторы rAAV могут быть реплицированы и упакованы в инфекционные вирусные частицы в клетке-хозяине насекомого, которая экспрессирует продукты генов rep и capAAV (т.е. белки Rep и Cap AAV). Когда вектор rAAV включен в более крупную конструкцию нуклеиновой кислоты (например, в хромосому или в другой вектор, такой как плазмида или бакуловирус, используемый для клонирования или трансфекции), такой вектор rAAV обычно называют "провектором", который может быть "спасен" в результате репликации и капсидирования при наличии функций упаковкиAAV и необходимых хелперных функций. Изобретение относится к способу получения рекомбинантного парвовирусного (rAAV) вириона,содержащего рекомбинантный парвовирусный (rAAV) вектор, в клетке насекомого. В первом аспекте изобретение относится к способу получения рекомбинантного парвовирусного вириона, включающему стадии (а) получения клетки насекомого, содержащей одну или несколько конструкций нуклеиновых кислот, содержащих (i) нуклеотидную последовательность, содержащую трансген, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью парвовирусного инвертированного концевого повтора; (ii) первую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Rep парвовируса, которая функционально связана с первым промотором, который способен управлять экспрессией белка Rep в клетках насекомых; (iii) вторую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок парвовируса, которая функционально связана со вторым промотором, который способен управлять экспрессией капсидного белка в клетках насекомых; (b) культивирования клетки, определенной в пункте (а), в условиях, подходящих для экспрессии Rep и капсидного белка; и (с) необязательно извлечения рекомбинантного парвовирусного вириона. Предпочтительно в клетке насекомого первая и вторая кассеты экспрессии присутствуют в одной конструкции нуклеиновой кислоты. Предпочтительно первая и вторая кассеты экспрессии в том случае, когда они присутствуют в эквимолярном количестве в клетке насекомого, обеспечивают отношение уровня мРНК, кодирующей белок Rep, к уровню мРНК, кодирующей капсидный белок, составляющее по меньшей мере примерно 0,5,по меньшей мере примерно 0,75, по меньшей мере примерно 1,0, по меньшей мере примерно 1,5, по меньшей мере примерно 2,0, по меньшей мере примерно 5,0 или по меньшей мере примерно 10,0. Уровни мРНК, кодирующих Rep и капсид, предпочтительно определяют с использованием количественной ПЦР с обратной транскрипцией, Нозерн-блота или других способов количественной оценки РНК, известных в данной области. Предпочтительно такое соотношение уровней мРНК, кодирующих Rep и капсид, продуцируется в клетках насекомых во временной точке от 24, 30, 36, 40, 44 или 46 ч после трансфекции до 72, 66, 60, 54,52 или 50 ч после трансфекции. Более предпочтительно такое соотношение уровней мРНК, кодирующихRep и капсид, продуцируется в клетках насекомых по меньшей мере примерно через 48 ч плюс/мин 2 или 1 ч после трансфекции. Альтернативно предпочтительно первая и вторая кассеты экспрессии в том случае, когда они присутствуют в эквимолярных количествах в клетке насекомого, обеспечивают отношение уровня белка Rep к уровню капсидного белка, составляющеепо меньшей мере примерно 0,5, по меньшей мере примерно 0,75, по меньшей мере примерно 1,0, по меньшей мере примерно 1,5, по меньшей мере примерно 2,0, по меньшей мере примерно 5,0 или по меньшей мере примерно 10,0. Уровни белка Rep и капсидного белка предпочтительно определяют с использованием эталонных антител против белка Rep и капсидного белка в количественном иммуноанализе (например, ELISA или количественный Вестерн-блот). Предпочтительно такое соотношение уровней Rep и капсидного белка продуцируется в клетках насекомых во временной точке от 24, 30, 36, 40, 44 или 46 ч после трансфекции до 72, 66, 60, 54, 52 или 50 ч после трансфекции. Более предпочтительно такое соотношение уровней белка Rep и капсидного белка продуцируется в клетках насекомых через 48 ч плюс/минус 2 или 1 ч после трансфекции. Подходящими эталонными антителами для количественной оценки уровней белка Rep и капсидного белка AAV являются, например, анти-AAV-rep моноклональные антитела мыши, клон 303.9, или анти-AAV VP1/VP2/VP3 моноклональные антитела мыши, клон В 1, который можно получить из PROGEN Biotechnik GmbH. В способе согласно изобретению первая и вторая кассеты экспрессии присутствуют в одной конструкции нуклеиновой кислоты. Одно из преимуществ присутствия обеих кассет экспрессии в одной конструкции нуклеиновой кислоты заключается в том, что трансфицированные клетки насекомых будут экспрессировать оба белка, белок Rep и капсидный белок. Только экспрессия обоих белков, белка Rep и капсидного белка, в клетке насекомого будет приводить к образованию парвовирусных вирионов. Другое преимущество заключается в том, что можно регулировать минимальное требуемое соотношение экспрессии белка Rep и экспрессии капсидного белка в том случае, когда первая и вторая кассеты экспрессии находятся в одной конструкции. Один из вариантов осуществления изобретения состоит в том, что другая конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Rep, также может присутствовать в клетке. В способе согласно изобретению нуклеотидная последовательность первой кассеты экспрессии по п. (ii) предпочтительно может содержать только одну открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующиепо меньшей мере один из белков Rep78 и Rep 68. То есть белок или белки Rep будут кодироваться одной открытой рамкой считывания, а не двумя или более открытыми рамками считывания. Иначе говоря, первая кассета экспрессии, как правило, не будет иметь двух или более отдельных открытых рамок считывания, кодирующих один и тот же или разные белкиRep. Однако, во избежание сомнений, одна открытая рамка считывания может быть способна кодировать более одного белка, например, два, три или четыре белка. Все сказанное выше может быть в равной мере применимо к белкам VP1, VP2 и VP3, т.е. два или все такие белки могут легко кодироваться одной открытой рамкой считывания. Обычно в способе согласно изобретению по меньшей мере одна открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3, или по меньшей мере одна открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Rep78 и Rep68, не содержит искусственного интрона (или последовательности, полученной из искусственного интрона). То есть, по меньшей мере, открытые рамки считывания, используемые для кодирования белков Rep или VP, не будут содержать искусственный интрон. Под искусственным интроном подразумевают интрон, который не может встречаться в природе в последовательностях Rep или Сар аденоассоциированных вирусов, например, интрон, который был сконструирован для того, чтобы обеспечить функциональный сплайсинг в клетке насекомого. Следовательно, искусственный интрон в данном контексте охватывает интроны клетки насекомого дикого типа. Кассета экспрессии согласно изобретению может содержать нативную укороченную последовательность интрона (под нативной подразумевают последовательность, встречающуюся в природе у аденоассоциированного вируса), подразумевают, что такие последовательности не подпадают под определение значения искусственного интрона, которое приведено в настоящем описании. В изобретении одним из возможных вариантов является вариант, когда ни открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3,и/или ни открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Rep78 и Rep68, не содержат искусственного интрона. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, содержащая трансген, также находится в той же самой конструкции нуклеиновой кислоты, что и первая и вторая кассеты экспрессии. Преимущество такого расположения заключается в том, что все трансфицированные клетки содержат каждую из трех нуклеотидных последовательностей, которые необходимы для получения парвовирусных вирионов. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что чем выше соотношение белокRep/капсидный белок, тем выше соотношение заполненный вирион/пустой вирион. Термин "заполненный вирион" относится к вирионной частице, которая содержит парвовирусный вектор. Термин "пустой вирион" относится к вирионной частице, которая не содержит парвовирусный вектор. В предпочтительном варианте осуществления изобретения отношение количества заполненных вирионов к пустым вирионам составляет по меньшей мере 1:100, более предпочтительно по меньшей мере 1:10 и еще более предпочтительно по меньшей мере 1:1. Еще более предпочтительно пустые вирионы не могут быть выявлены, и наиболее предпочтительно пустые вирионы отсутствуют. Специалисту в данной области будет понятно, как определить отношение заполненных вирионов к пустым вирионам, например, путем деления количества копий гена на (суммарное количество копий капсида - количество геномный копий), так как на вирион будет присутствовать только одна геномная копия. Наоборот, чем выше соотношение белок Rep/капсидный белок, тем меньше соотношение количество пустых вирионов/суммарное количество вирионов (т.е. заполненные + пустые вирионы). Специалисту будет понятно, как определить такие соотношения. Например, соотношение пустые вирионы/суммарные капсиды можно определить путем деления количества геномных копий (т.е. число геномных копий) на суммарное количество парвовирусных частиц (т.е. число парвовирусных частиц), при этом количество геномных копий в мл измеряют с помощью количественной ПЦР, а суммарное количество парвовирусных частиц в мл измеряют с использованием ферментного иммуноанализа, например, доступного из Progen. В предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение количество пустых вирионов/суммарное количество вирионов составляет меньше чем 100:1, более предпочтительно меньше чем 10:1, и еще более предпочтительно меньше чем 1:1. Еще более предпочтительно пустые вирионы не могут быть выявлены, и наиболее предпочтительно пустые вирионы отсутствуют. В предпочтительном варианте отношение экспрессии белка Rep к экспрессии капсидного белка регулируется одним или несколькими из следующего: (а) первый промотор имеет такую же силу или является более сильным, чем второй промотор, что определяют по экспрессии репортерного гена (например,люциферазы или SEAP) или с использованием Нозерн-блота; (b) присутствие большего количества и/или более сильных энхансерных элементов в первой кассете экспрессии по сравнению со второй кассетой экспрессии; (с) нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный белок Rep, имеет более высокий индекс адаптации кодонов по сравнению с нуклеотидной последовательностью, кодирующей капсидный белок; (d) оптимизация температуры парвовирусного белка Rep; и/или (е) варианты белковRep с одним или несколькими изменениями в аминокислотной последовательности по сравнению с соответствующим белком Rep дикого типа, и при этом одно или несколько изменений аминокислот приводит к повышению активности функции Rep, которое оценивают с помощью выявления повышенной продукции AAV в клетках насекомых. Способы создания, селекции и/или скрининга вариантов белков Rep с повышенной активностью функции Rep, которую оценивают с помощью выявления повышенной продукции AAV в клетках насекомых, могут быть разработаны посредством адаптации к клеткам насекомых способов, описанных в US 20030134351 для получения вариантов белков Rep с повышенной функцией,имеющих отношение к продукции AAV в клетках млекопитающих. В настоящем описании подразумевается, что варианты белков Rep с одним или несколькими изменениями в аминокислотной последовательности по сравнению с соответствующим белком Rep дикого типа включают белки Rep с одной или несколькими аминокислотными заменами, инсерциями и/или делециями в аминокислотной последовательности варианта по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующего белка Rep дикого типа. Первый промотор, который имеет такую же силу или является более сильным, чем второй промотор, означает, что в случае большего количества нуклеотидных последовательностей, кодирующих белокRep, чем нуклеотидных последовательностей, кодирующих капсидный белок, можно использовать промотор такой же силы, так как экспрессия белка Rep затем будет повышена по сравнению с экспрессией капсидного белка, тогда как в случае сходных количеств нуклеотидных последовательностей, кодирующих Rep и кодирующий капсидный белок, можно использовать более сильный промотор для экспрессии белка Rep, чем для экспрессии капсидного белка. Сила промотора может быть определена по экспрессии,которую получают в условиях, которые применяются в способе согласно изобретению. В предпочтительном варианте первый промотор или второй промотор выбран из группы, состоящей из промотораPolH, промотора р 10, основного промотора белка, индуцируемого промотора или промотора deltaE1 или промотора Е 1 или любого другого промотора позднего или очень позднего бакуловирусного гена. Более предпочтительно первый промотор выбран из группы, состоящей из промотора PolH, промотора р 10 или основного промотора белка, и при этом вторым промотором является промотор deltaE1 или промотор Е 1 или любой другой промотор раннего или позднего бакуловирусного гена. Предпочтительно первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор р 10, а вторым промотором является промотор PolH или 4xHsp27 EcRE + минимальный промотор Hsp70. В другом варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является 4xHsp27 EcRE + минимальный промотор Hsp70, а вторым промотором является промотор PolH. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор PolH, а вторым промотором является промотор р 10, deltaE1 или E1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промоторPolH, а вторым промотором является промотор deltaE1 или Е 1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор р 10, а вторым промотором является промотор deltaEl или Е 1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор PolH, а вторым промотором является промотор PolH. Наиболее предпочтительно первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор PolH, а вторым промотором является промотор deltaE1. Термин "энхансерный элемент" или "энхансер" предназначен для определения последовательности,которая усиливает активность промотора (т.е. увеличивает скорость транскрипции последовательности,-8 020969 расположенной ниже промотора), которая в противоположность промотору не обладает промоторной активностью и которая обычно может функционировать независимо от положения по отношению к промотору (т.е. выше или ниже промотора). Энхансерные элементы хорошо известны в данной области. Неограничивающими примерами энхансерных элементов (или их частей), которые можно использовать в настоящем изобретении, являются энхансеры и энхансерные элементы бакуловирусов, обнаруженные в клетках насекомых. Предпочтительно энхансерный элемент усиливает в клетке экспрессию мРНК гена, с которым промотор функционально связан по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 100% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 200% по сравнению с экспрессией мРНК гена в отсутствие энхансерного элемента. Экспрессию мРНК можно определить, например, с использованием количественной ОТ-ПЦР. В настоящем изобретении предпочтительно использование энхансерного элемента, чтобы усилить экспрессию белка Rep парвовируса. Таким образом, в следующем предпочтительном варианте первая кассета экспрессии содержит по меньшей мере один бакуловирусный энхансерный элемент и/или по меньшей мере один отвечающий на экдизон элемент. Предпочтительно энхансерный элемент выбран из группы, состоящей из hr1, hr2, hr3, hr4 и hr5. Оптимизация кодонов парвовирусного белка Rep более подробно обсуждается ниже. Оптимизация температуры для парвовирусного белка Rep относится к использованию оптимального условия как по отношению к клетке насекомого, которая будет расти, так и по отношению к функционированию Rep. Белок Rep, например, может быть оптимально активным при 37 С, тогда как клетка насекомого может оптимально расти при 28 С. Температура, при которой активен белок Rep и при которой клетка насекомого растет, может составлять 30 С. В предпочтительном варианте оптимизированная температура составляет более 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 С и/или менее 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30 или 29 С. Как будет понятно специалисту в данной области, соотношение заполненный вирион/пустой вирион также может быть улучшено при ослабленной экспрессии Cap, например, с помощью более слабого промотора, по сравнению с умеренной-высокой экспрессией Rep. Предпочтительно конструкция нуклеиновой кислоты согласно изобретению представляет собой вектор, совместимый с клеткой насекомого. Термин "совместимый с клеткой насекомого вектор" или"вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к продуктивной трансформации или трансфекции насекомого или клетки насекомого. Примерами биологических векторов являются плазмиды, линейные молекулы нуклеиновых кислот и рекомбинантные вирусы. Можно использовать любой вектор, при условии, что он совместим с клеткой насекомого. Вектор может интегрировать в геном клеток насекомых, но присутствие вектора в клетках насекомых не обязательно является постоянным, и примерами также являются временные эписомные векторы. Векторы могут быть введены любыми известными способами, например, в результате химической обработки клеток, электропорации или инфекции. В предпочтительном варианте вектором является бакуловирус, вирусный вектор или плазмида. В более предпочтительном варианте вектором является бакуловирус, т.е. конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой экспрессирующий бакуловирусный вектор. Экспрессирующие бакуловирусные векторы и способы их применения описаны (см., например, в Summers and Smith, 1986. A Manual ofFreeman and Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; US 4745051; US 2003148506 и WO 03/074714). Количество конструкций нуклеиновой кислоты, используемых в клетках насекомых для получения рекомбинантного парвовирусного (rAAV) вектора, в изобретении не ограничено. Например, одна, две,три или более отдельных конструкций могут быть использованы для получения rAAV в клетках насекомых согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении. Если используют две конструкции, то одна конструкция может содержать нуклеотидную последовательность, содержащую трансген, который фланкирован по меньшей мере одной последовательностью ITR парвовируса, тогда другая конструкция может содержать первую и вторую кассеты экспрессии. Если используют три конструкции, то одна конструкция может содержать нуклеотидную последовательность, содержащую трансген, которая фланкирована по меньшей мере одной последовательностью ITR парвовируса, другая конструкция может содержать первую и вторую кассеты экспрессии, и еще одна конструкция может содержать дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Rep, необязательно оптимизированную по кодонам, AT-оптимизированную или GC-оптимизированную, чтобы минимизировать или предотвратить рекомбинацию, как описано далее. Нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусные белки Rep, в настоящем описании означает нуклеотидную последовательность, кодирующую неструктурные белки Rep, которые необходимы и достаточны для получения парвовирусного вектора в клетках насекомых, такие как белки Rep78 или Rep68 и/или Rep52 или Rep40. Парвовирусную нуклеотидную последовательность предпочтительно получают из депендовируса, более предпочтительно из аденоассоциированного вируса (AAV) человека или обезьян и наиболее предпочтительно из AAV, который обычно инфицирует человека (например,серотипов 1, 2, 3 А, 3 В, 4, 5 и 6) или приматов (например, серотипов 1 и 4). Пример нуклеотидной последовательности, кодирующей парвовирусные белки Rep, приведен в последовательности SEQ ID NO: 5,которая изображает часть геномной последовательности AAV серотипа-2, кодирующей белки Rep. Последовательность, кодирующая Rep78, включает нуклеотиды 11-1876, и последовательность, кодирующая Rep52, включает нуклеотиды 683-1876, также изображенные отдельно в SEQ ID NO: 5 и 7. Понятно,что точные молекулярные массы белков Rep78 и Rep52, а также точные положения кодонов инициации трансляции у разных парвовирусов могут отличаться. Однако специалисту в данной области будет понятно, как идентифицировать соответствующее положение в нуклеотидной последовательности других парвовирусов, отличных от AAV-2. В предпочтительном варианте первая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность парвовирусного белка Rep52 или 40, и/или нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность парвовирусного белка Rep7 8 или 68. Предпочтительно парвовирусные белки Rep являются белками Rep аденоассоциированного вируса (AAV). В предпочтительном варианте изобретение относится к клетке насекомого, которая содержит не более одного типа нуклеотидной последовательности, содержащей одну открытую рамку считывания,кодирующую парвовирусный белок Rep. Предпочтительно одна открытая рамка считывания кодирует один или несколько парвовирусных белков Rep, более предпочтительно открытая рамка считывания кодирует все парвовирусные белки Rep, наиболее предпочтительно открытая рамка считывания кодирует полноразмерный белок Rep78, с которой предпочтительно в клетках насекомых могут быть экспрессированы по меньшей мере два белка Rep52 и Rep78. В данном случае понятно, что клетка насекомого может содержать более одной копии нуклеотидной последовательности одного типа, например, в многокопийном эписомном векторе, но такие копии являются множественными копиями, по существу, одной и той же молекулы нуклеиновой кислоты или, по меньшей мере, молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность Rep, например, молекул нуклеиновых кислот,которые отличаются друг от друга только вследствие вырожденности генетического кода. Наличие только одного типа молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей парвовирусные белки Rep, позволяет избежать рекомбинации между гомологичными последовательностями, которые могут присутствовать в разных типах векторов, содержащих последовательности Rep, что может приводить к появлению дефектных конструкций, экспрессирующих Rep, и влиять на (стабильность) уровни продукции парвовирусов в клетках насекомых. В альтернативном варианте осуществления изобретения первая кассета экспрессии содержит более одной нуклеотидной последовательности, кодирующей парвовирусный белок Rep. Предпочтительно нуклеотидная последовательность по п. (ii) содержит открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Rep78 и Rep68. Предпочтительно нуклеотидные последовательности являются последовательности одного и того же серотипа. Более предпочтительно нуклеотидные последовательности отличаются друг от друга тем, что они могут быть либо оптимизированы по кодонам, либо АТ-оптимизированы, либо GC-оптимизированы, чтобы минимизировать или предотвратить рекомбинацию. Предпочтительно первая кассета экспрессии содержит две нуклеотидных последовательности, кодирующих парвовирусный белок Rep, т.е. первую нуклеотидную последовательность и вторую нуклеотидную последовательность. Предпочтительно различие между первой и второй нуклеотидными последовательностями, кодирующими общие аминокислотные последовательности парвовирусного белка Rep, максимизированы (т.е. идентичность нуклеотидов минимизирована) благодаря одному или несколькими из следующих изменений: а) изменение отклонения от равномерности использования кодонов в первой нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность парвовирусного Rep; b) изменение отклонения от равномерности использования кодонов во второй нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность парвовирусного Rep; с) изменение содержания GC в первой нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность; и d) изменение содержаний GC во второй нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность. Оптимизация кодонов может быть осуществлена на основе использования кодонов клетки насекомого, применяемой в способе согласно изобретению, предпочтительно Spodoptera frugiperda, информацию о котором можно найти в базе использования кодонов (см., например,http://www.kazusa.or.jp/codon/). Подходящие компьютерные программы для оптимизации кодонов доступны специалисту (см., например, Jayaraj et al., 2005, Nucl. Acids Res. 33(9): 3011-3016; и в Интернете). Альтернативно, оптимизации можно осуществлять вручную, используя такую же базу данных использования кодонов. Нуклеотидная последовательность первой кассеты экспрессии, кодирующая парвовирусный белокRep52, может быть определена как нуклеотидная последовательность а) которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6;b) которая имеет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-5;c) комплементарная нить которой гибридизуется с последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты по п. (а) или (b);d) нуклеотидные последовательности, последовательность которых отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по п. (с) вследствие вырожденности генетического кода. Нуклеотидная последовательность первой кассеты экспрессии, кодирующей парвовирусный белокRep78, может быть определена как нуклеотидная последовательностьa) которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8;b) которая имеет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью в положениях 11-1876 последовательности SEQc) комплементарная нить которой гибридизуется с последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты по п. (а) или (b);d) нуклеотидные последовательности, последовательности которых отличаются от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по п. (с) вследствие вырожденности генетического кода. Предпочтительно нуклеотидная последовательность кодирует парвовирусные белки Rep, которые необходимы и достаточны для продукции парвовирусного вектора в клетках насекомых. Исключение возможных ложных сайтов инициации трансляции в последовательностях, кодирующих белки Rep, отличных от сайтов инициации трансляции Rep78 и Rep52, других парвовирусов будет понятно специалисту в данной области, также как исключение предполагаемых сайтов сплайсинга, которые могут распознаваться в клетках насекомых. В предпочтительном варианте кодон инициации трансляции парвовирусного белка Rep78 представляет собой субоптимальный кодон инициации. Субоптимальный кодон инициации предпочтительно представляет собой кодон инициации, который влияет на частичное "перепрыгивание" экзонов. В настоящем описании подразумевают, что частичное перепрыгивание экзонов означает, что по меньшей мере часть рибосом не инициирует трансляцию в субоптимальном кодоне инициации белка Rep78, но будет инициировать трансляцию в кодоне инициации дальше ниже по течению, при этом предпочтительно кодон инициации, расположенный дальше ниже по течению, представляет собой кодон инициации белка Rep52. Субоптимальный кодон инициации предпочтительно вызывает частичное перепрыгивание экзона при экспрессии нуклеотидной последовательности в клетке насекомого. Предпочтительно субоптимальный кодон инициации вызывает частичное перепрыгивание экзона в клетке насекомого так,что приводит к получению в клетках насекомых молярного отношения Rep78 к Rep52 в диапазоне от 1:10 до 10:1, от 1:5 до 5:1 или от 1:3 до 3:1, предпочтительно примерно через 20-40 ч после инфекции,более предпочтительно примерно через 30-40 ч после инфекции, при использовании бакуловирусной экспрессии. Молярное соотношение Rep78 и Rep52 можно определить с помощью Вестерн-блоттинга,предпочтительно используя моноклональное антитело, которое узнает общий эпитоп Rep78 и Rep52, или используя, например, мышиное анти-Rep-антитело (303.9, Progen, Germany; в разведении 1:50). Термин "субоптимальный кодон инициации" в настоящем описании относится не только к трехнуклеотидному кодону инициации как таковому, но также к его контексту. Следовательно, субоптимальный кодон инициации может состоять из "оптимального" кодона ATG в субоптимальном контексте, например, в контексте, отличном от контекста согласно Козаку. Однако более предпочтительными являются субоптимальные кодоны инициации, в которых трехнуклеотидный кодон инициации сам по себе является субоптимальным, т.е. не является кодоном ATG. В настоящем описании подразумевают, что субоптимальный означает, что кодон является менее эффективным в инициации трансляции в случае во всем остальном идентичного контекста по сравнению с нормальным кодоном ATG. Предпочтительно эффективность субоптимального кодона составляет менее 90, 80, 60, 40 или 20% от эффективности нормального кодона ATG в случае во всем остальном идентичного контекста. Способы сравнения относительной эффективности инициации трансляции известны специалисту. Предпочтительные субоптимальные кодоны инициации могут быть выбраны из ACG, TTG, CTG и GTG. Более предпочтительным является ACG. Нуклеотидную последовательность, кодирующую парвовирусные белки Rep, в настоящем описании понимают как нуклеотидную последовательность, кодирующую неструктурные белки Rep, которые необходимы и достаточны для продукции парвовирусного вектора в клетках насекомых, например белкиRep78 и Rep52. Также возможна замена других ATG в последовательности с другим кодоном, кодирующим метионин так, чтобы уменьшить вероятность инициации трансляции с таких ATG. Различные модификации кодирующей нуклеотидной последовательности, которая определена вы- 11020969 ше, включая, например, парвовирусные последовательности дикого типа, для правильной экспрессии в клетках насекомых осуществляют, применяя хорошо известные методики генетического конструирования, такие как методики, описанные, например, в Sambrook and Russell (2001) ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork). Другие различные модификации кодирующих областей, которые могут увеличивать выход кодируемых белков, известны специалисту в данной области. Такие модификации входят в объем настоящего изобретения. В настоящем описании подразумевается, что нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный капсидный (Сар) белок, содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие один или несколько из трех парвовирусных капсидных белков, VP1, -2 и -3. Парвовирусная нуклеотидная последовательность предпочтительно получена из депендовируса, более предпочтительно из аденоассоциированного вируса (AAV) человека или обезьяны (AAV) и наиболее предпочтительно из AAV, который обычно инфицирует людей (например, серотипы 1, 2, 3 А, 3 В, 4, 5 и 6) или приматов (например, серотипы 1 и 4). Примеры нуклеотидной последовательности, кодирующей парвовирусные капсидные белки, приведены в SEQ ID NO: 20, 22 и 24. В предпочтительном варианте нуклеотидная последовательность по п. (iii) содержит открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белкиVP1, VP2 и VP3. Последовательности, кодирующие капсидные белки, могут присутствовать в различных формах. Например, можно использовать отдельные кодирующие последовательности для каждого из капсидных белков VP1, -2 и -3, при этом каждая кодирующая последовательность функционально связана с последовательностями регуляции экспрессии для экспрессии в клетке насекомого. Однако более предпочтительно вторая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, включающую одну открытую рамку считывания, кодирующую все три капсидных белка парвовируса (AAV): VP1, VP2 и VP3, при этом кодон инициации для трансляции капсидного белка VP1 представляет собой субоптимальный кодон инициации, который не является кодоном ATG, который, например, описан в Urabe et al.(2002, выше) и в WO 2007/046703. Субоптимальным кодоном инициации для капсидного белка VP1 может быть кодон, который определен выше для белка Rep78. Более предпочтительные субоптимальные кодоны инициации для капсидного белка VP1 могут быть выбраны из ACG, TTG, CTG и GTG, из которых CTG и GTG являются наиболее предпочтительными. Нуклеотидная последовательность, входящая в состав второй кассеты экспрессии, для экспрессии капсидных белков, может дополнительно содержать одну или несколько модификаций, которые описаны в WO 2007/046703. Специалисту в данной области известны различные дополнительные модификации кодирующих областей VP, которые могут либо увеличивать выход VP и вириона или вызывают другие требуемые эффекты, такие как измененный тропизм или сниженная антигенность вириона. Такие модификации входят в объем настоящего изобретения. В предпочтительном варианте экспрессия VP1 увеличена по сравнению с экспрессией VP2 и VP3. Экспрессия VP1 может быть увеличена за счет пополнения VP1 посредством введения в клетку насекомого одного вектора, содержащего нуклеотидные последовательности для VP1, как описано в WO 2007/084773. В контексте изобретения подразумевают, что "по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность инвертированного концевого повтора парвовируса" означает палиндромную последовательность,содержащую в основном комплементарные, симметрично расположенные последовательности, также называемые областями "А", "В" и "С". ITR функционирует в качестве начала репликации, сайта, играющего "цис"-роль в репликации, т.е. сайта узнавания для транс-действующих белков репликации, таких как, например, Rep78 (или Rep68), которые узнают палиндром и специфичные последовательности, являющиеся внутренними по отношению к палиндрому. Одним исключением с точки зрения симметрии последовательности ITR является область "D" ITR. Она является уникальной (не имеющей комплемента в пределах одного ITR). Образование разрывов однонитевой ДНК происходит в месте соединения между областями А и D. В указанном месте инициируется синтез новой ДНК. Область D обычно находится с одной стороны от палиндрома и обеспечивает направленность к стадии репликации нуклеиновой кислоты. Парвовирус, реплицирующийся в клетке млекопитающего, обычно имеет две последовательностиITR. Однако можно сконструировать ITR так, чтобы сайты связывания были на обеих нитях областей А,и области D были расположены симметрично, по одной с каждой стороны палиндрома. На двунитевой кольцевой матрице ДНК (например, плазмиде), репликация нуклеиновой кислоты, осуществляемая с помощью Rep78 или Rep68, происходит в обоих направлениях, и один ITR достаточен для парвовирусной репликации кольцевого вектора. Таким образом, одна нуклеотидная последовательность ITR может быть использована в контексте настоящего изобретения. Однако предпочтительно используют два или другое четное количество стандартных ITR. Наиболее предпочтительно используют две последовательностиITR. Предпочтительным парвовирусным ITR является ITR AAV. По причинам безопасности желательным может быть конструирование рекомбинантного парвовирусного (rAAV) вектора, который не способен к дальнейшему размножению после начального введения в клетку в присутствии второго AAV. Такой механизм безопасности для ограничения нежелательного размножения вектора у реципиента можно обеспечить с использованием rAAV с химерным ITR, который описан в US 2003148506. Термин "фланкирована" по отношению к последовательности, которая фланкирована другим элементом (элементами), в данном описании указывает на наличие одного или нескольких фланкирующих элементов выше и/или ниже, т.е. с 5'- и/или 3'-стороны относительно последовательности. Термин"фланкирована" не предназначен для указания того, что последовательности обязательно являются непрерывными. Например, могут существовать промежуточные последовательности между нуклеиновой кислотой, кодирующей трансген, и фланкирующим элементом. Последовательность, которая "фланкирована" двумя другими элементами (например, ITR), показывает, что один элемент расположен с 5'-стороны от последовательности, а другой расположен с 3'стороны от последовательности; однако между ними могут присутствовать промежуточные последовательности. В предпочтительном варианте нуклеотидная последовательность по п. (i) фланкирована с любой стороны нуклеотидными последовательностями инвертированного концевого повтора парвовируса. В вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, содержащая трансген(кодирующий представляющий интерес генный продукт), которая фланкирована по меньшей мере одной последовательностью ITR парвовируса, предпочтительно включается в геном рекомбинантного парвовирусного (rAAV) вектора, продуцируемого в клетках насекомых. Предпочтительно трансген кодирует представляющий интерес генный продукт для экспрессии в клетке млекопитающего. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, содержащая трансген, фланкирована двумя нуклеотидными последовательностями ITR парвовируса (AAV), и при этом трансген расположен между двумя нуклеотидными последовательностями ITR парвовируса (AAV). Предпочтительно нуклеотидная последовательность,кодирующая представляющий интерес генный продукт (для экспрессии в клетке млекопитающего), будет включена в рекомбинантный парвовирусный (rAAV) вектор, продуцируемый в клетках насекомых,если она расположена между двумя стандартными ITR или расположена с любой стороны от ITR, сконструированного с двумя областями D. Последовательности AAV, которые могут быть использованы в настоящем изобретении для получения рекомбинантного AAV-вириона в клетках насекомых, могут быть получены из генома AAV любого серотипа. В общем, серотипы AAV имеют геномные последовательности со значительной гомологией на уровне аминокислот и нуклеиновых кислот, обеспечивают идентичный набор генетических функций,продуцируют вирионы, которые являются, по существу, физически и функционально эквивалентными, и реплицируются и подвергаются сборке посредством практически идентичных механизмов. Геномные последовательности разных серотипов AAV и обзор сходства геномов (см., например, в GenBank, номер доступа U89790; GenBank, номер доступа J01901; GenBank, номер доступа AF043303; GenBank, номер доступа AF085716; Chlorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir. 45:555-64); Chlorini et al. (1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge et al. (1998, J. Vir. 72:309-319) и Wu et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47. Серотипы AAV 1, 2, 3, 4 и 5 являются предпочтительным источником нуклеотидных последовательностей AAV для применения в контексте настоящего изобретения. Предпочтительно последовательности ITR AAV для применения в контексте настоящего изобретения получают из AAV1, AAV2 и/или AAV4. Подобным образом, последовательности, кодирующие Rep (Rep78/68 и Rep52/40), предпочтительно получают из AAV1, AAV2 и/или AAV4. Однако последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2, и VP3, для применения в контексте настоящего изобретения могут быть взяты из любого из известных 42 серотипов, более предпочтительно из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6,AAV7, AAV8 или AAV9 или недавно разработанных AAV-подобных частиц, полученных, например, с использованием методики перетасовки капсидов и библиотек капсидов AAV, или с использованием недавно сконструированных, разработанных или выделенных ITR. Последовательности Rep AAV и ITR являются особенно консервативными у большинства серотипов. Например, белки Rep78 различных серотипов идентичны более чем на 89%, и суммарная идентичность нуклеотидных последовательностей на уровне генома между AAV2, AAV3A, AAV3B и AAV6 составляет около 82% (Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol, 73(2): 939-947). Кроме того, известно, что последовательности Rep и ITR многих серотипов AAV эффективно перекрестно комплементируют (т.е. функционально заменимы) соответствующие последовательности других серотипов при получении частицAAV в клетках млекопитающих. В US 2003148506 сообщается, что последовательности Rep AAV и ITR также эффективно перекрестно комплементируют другие последовательности Rep AAV и ITR в клетках насекомых. Известно, что белки VP AAV определяют клеточную тропность вириона AAV. Последовательности, кодирующие белок VP, значительно менее консервативны, чем белки и гены Rep разных серотиповAAV. Способность последовательностей Rep и ITR перекрестно комплементировать соответствующие последовательности других серотипов позволяет получать псевдотипированные частицы rAAV, содержащие капсидные белки одного серотипа (например, AAV3) и последовательности Rep и/или ITR другого серотипа AAV (например, AAV2). Такие псевдотипированные частицы rAAV составляют часть настоящего изобретения. Модифицированные последовательности "AAV" также можно использовать в контексте настоящего изобретения, например, для получения векторов rAAV в клетках насекомых. Такие модифицированные последовательности, например, включая последовательности, имеющие по меньшей мере примерно 70%,- 13020969 по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или большую идентичность нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей (например, последовательность, имеющую примерно 75-99% идентичность по нуклеотидной последовательности) с ITR, Rep или VP AAV1, AAV2, AAV3,AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 или AAV9, можно использовать вместо последовательностей ITR,Rep или VP AAV дикого типа. Несмотря на сходство во многих отношениях с другими серотипами AAV, AAV5 отличается от других серотипов AAV человека и обезьян больше, чем другие известные серотипы человека и обезьян. В связи с этим продукция rAAV5 может отличаться от продукции других серотипов в клетках насекомых. В том случае, когда способы согласно изобретению применяют для получения rAAV5, предпочтительно в одной или нескольких конструкциях, содержащих (вместе в случае наличия более одной конструкции) нуклеотидную последовательность, содержащую ITR AAV5, нуклеотидная последовательность содержит последовательность, кодирующую Rep AAV5 (т.е. нуклеотидная последовательность содержитRep78 AAV5). Такие последовательности ITR и Rep при необходимости могут быть модифицированы,чтобы получить эффективную продукцию векторов rAAV5 или псевдотипированных rAAV5 в клетках насекомых. Например, стартовый кодон последовательностей Rep может быть модифицирован, сайты сплайсинга VP могут быть модифицированы или исключены, и/или стартовый кодон VP1 и соседние нуклеотиды могут быть модифицированы, чтобы улучшить продукцию векторов rAAV5 в клетках насекомых. Таким образом, нуклеотидная последовательность, содержащая трансген, который определен в настоящем описании выше, может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один "представляющий интерес генный продукт", для экспрессии в клетке млекопитающих, расположенную так, чтобы она была включена в рекомбинантный парвовирусный (rAAV) вектор, реплицируемый в клетках насекомых. В контексте изобретения подразумевают, что особенно предпочтительной клеткой млекопитающего, в которой необходимо экспрессировать "представляющий интерес генный продукт", является клетка человека. Может быть включена любая нуклеотидная последовательность для более поздней экспрессии в клетке млекопитающего, трансфицированной рекомбинантным парвовирусным (rAAV) вектором, продуцируемым согласно настоящему изобретению. Нуклеотидная последовательность, например, может кодировать белок, она может экспрессировать агент РНК-и, т.е. молекулу РНК, которая способна к интерференции РНК, такую как, например, sh-PHK (короткая шпилечная РНК) или si-PHK (короткая интерферирующая РНК) . "si-PHK" означает короткую интерферирующую РН, которая представляет собой двунитевую РНК небольшой длины, которая не является токсичной в клетках млекопитающих (Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494-98; Caplen et al., 2001, Proc. Natl. Acad. ScL USA 98: 9742-47). В предпочтительном варианте нуклеотидная последовательность, содержащая трансген, может включать две кодирующих нуклеотидных последовательности, каждая из которых кодирует один представляющий интерес генный продукт, для экспрессии в клетке млекопитающего. Каждая из двух нуклеотидных последовательностей, кодирующих представляющий интерес продукт, локализована так, чтобы она была включена в рекомбинантный парвовирусный (rAAV) вектор, реплицируемый в клетках насекомых. Представляющим интерес продуктом для экспрессии в клетке млекопитающего может быть терапевтический генный продукт. Терапевтический генный продукт может представлять собой полипептид или молекулу РНК (si-PHK), или другой генный продукт, который при экспрессии в клетке-мишени обеспечивает требуемый терапевтический эффект, такой как, например, удаление нежелательной активности, например, удаление инфицированной клетки, или комплементация генетического дефекта, например, вызывающего недостаточность ферментативной активности. Примерами терапевтических полипептидных генных продуктов являются CFTR, фактор IX, липаза липопротеидов (LPL, предпочтительно LPL S447X; см. WO 01/00220), аполипопротеид А 1, уридиндифосфатглюкуронозилтрансфераза (UGT), белок, взаимодействующий с регулятором ГТАазы, пигментозного ретинита (RP-GRIP) и цитокины или интерлейкины, подобные, например, IL-10, порфобилиногендезаминаза (PBGD), нейротрофический фактор, такой как нейротрофический фактор, полученный из линии глиальных клеток (GDNF), и аланин:гликосилат-аминотрансфераза (AGT). Альтернативно или дополнительно в качестве другого генного продукта нуклеотидная последовательность, содержащая трансген, который определен в настоящем описании выше, может дополнительно включать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который служит в качестве маркерного белка для оценки трансформации и экспрессии клеток. Подходящими маркерными белками для такой цели являются, например, флуоресцирующий белок GFP, и селектируемые маркерные гены тимидинкиназы HSV (для селекции на среде HAT), бактериальной гигромицин В-фосфотрансферазы(для селекции на гигромицине В), аминогликозидфосфотрансферазы Tn5 (для селекции на G418) и дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для селекции на метотрексате), CD20, ген низкоаффинного фактора роста нервов. Источники для получения таких маркерных генов и способы их применения описаны в публикации Sambrook and Russel, выше. Кроме того, нуклеотидная последовательность, содержащая трансген,который определен в настоящем описании выше, может включать дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который может служить в качестве надежного механизма,- 14020969 который позволяет устранять у субъекта клетки, трансдуцированные рекомбинантным парвовирусным(rAAV) вектором согласно изобретению, если это необходимо. Такая нуклеотидная последовательность,часто называемая суицидным геном, кодирует белок, который способен превращать пролекарство в токсичное вещество, которое способно убивать трансгенные клетки, в которых экспрессируется белок. Подходящими примерами таких суицидных генов являются, например, ген цитозиндезаминазы Е. coli или один из генов тимидинкиназы вируса простого герпеса, цитомегаловируса и вируса ветрянкиопоясывающего лишая, и в таком случае можно использовать ганцикловир в качестве пролекарства для того, чтобы вызвать гибель трансгенных клеток у субъекта (см., например, Clair et al., 1987, Antimicrob.Agents Chemother. 31: 844-849). В другом варианте одним из представляющих интерес генных продуктов может быть белок AAV. В частности, белок Rep, такой как Rep78 или Rep68, или его функциональный фрагмент. Нуклеотидная последовательность, кодирующая Rep78 и/или Rep68, в том случае, если она присутствует в геноме рекомбинантного парвовирусного (rAAV) вектора согласно изобретению и экспрессируется в клетке млекопитающего, трансдуированной вектором, обеспечивает возможность интеграции рекомбинантного парвовирусного (rAAV) вектора в геном трансдуцированной клетки млекопитающего. Экспрессия Rep78 и/или Rep68 в rAAV-трансдуцированной или инфицированной клетке млекопитающего может обеспечивать преимущество для определенных применений рекомбинантного парвовирусного (rAAV) вектора,создавая возможность долговременной или постоянной экспрессии любого другого представляющего интерес генного продукта, введенного в клетку с помощью вектора. В рекомбинантных парвовирусных (rAAV) векторах согласно изобретению по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность(ти), кодирующая представляющий интерес генный продукт, для экспрессии в клетке млекопитающего, предпочтительно функционально связана по меньшей мере с одной совместимой с клеткой млекопитающего последовательностью регуляции экспрессии, например, с промотором. В данной области известно много таких промоторов (см. Sambrook and Russel, 2001, выше). Можно использовать конститутивные промоторы, которые широко экспрессируются во многих типах клеток, такие как промотор CMV. Однако более предпочтительны промоторы, которые являются индуцируемыми, тканеспецифичными, специфичными для типа клеток или специфичными для клеточного цикла. Например, в случае специфичной для печени экспрессии промотор может быть выбран из промотора 1-антитрипсина (ААТ), промотора глобулина, связывающего тиреоидный гормон, промотор альбумина, промотор LPS (связывающего тироксин глобулина), гибридный промотор HCR-ApoCII, гибридный промотор HCR-hAAT, промотор ААТ, промотор в сочетании с энхансерным элементом гена альбумина мыши (Ealb) и промотор аполипопротеида Е. Другими примерами являются промотор E2F для экспрессии, избирательной для опухоли, и в частности экспрессии, избирательной для неврологических клеточных опухолей (Parr et al., 1997, Nat. Med. 3: 1145-9), или промотор IL-2 для применения в мононуклеарных клетках крови (Hagenbaugh et al., 1997, J. Exp. Med.; 185: 2101-10).AAV способен инфицировать ряд клеток млекопитающих (см., например, Tratschin et al. (1985, Mol.Cell Biol. 5: 3251-3260) и Grimm et al. (1999, Hum. Gene Ther. 10: 2445-2450). Однако трансдукция AAV синовиальных фибробластов человека значительно более эффективна, чем в сходных мышиных клетках,Jennings et al., Arthritis Res, 3: 1 (2001), и клеточная тропность AAV у разных серотипов разная. См., например, публикацию Davidson et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 3428-3432), в которой обсуждаются различия среди AAV2, AAV4 и AAV5 в отношении тропизма к клеткам ЦНС млекопитающих и эффективности трансдукции. В предпочтительном варианте клеткой-хозяином согласно изобретению является любая клетка млекопитающего, которая может быть инфицирована парвовирусным вирионом,например, но без ограничения, мышечная клетка, клетка печени, нервная клетка, глиальная клетка и эпителиальная клетка. В предпочтительном варианте клеткой-хозяином согласно изобретению является клетка человека. Предпочтительно в конструкции нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный белок Rep и/или парвовирусный капсидный белок, функционально связана с последовательностями регуляции экспрессии для экспрессии в клетке насекомого. Такие последовательности регуляции экспрессии, по меньшей мере, будут включать промотор, который активен в клетках насекомых. При практическом осуществлении изобретения можно применять способы экспрессии чужеродных генов в клеткаххозяевах насекомых, известные специалисту в данной области. Методика молекулярного конструирования и экспрессии полипептидов в клетках насекомых описана, например, в Summers and Smith, 1986 (AStation Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. В Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97152; King, L. A. and R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual,New York; W. H. Freeman and Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; US 4745051; US 2003148506 и WO 03/074714). Подходящими промоторами для транскрипции нуклеотидных последовательностей, находящихся в первой и второй конструкции соглас- 15020969 но изобретению, являются, например, промоторы полиэдрина (PolH), p10, p35, IE-I или IE-1 и дополнительные промоторы, описанные в указанных выше ссылках. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая, по меньшей мере, первую и/или вторую кассеты экспрессии, дополнительно может содержать последовательность регуляции экспрессии, которая включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9 или нуклеотидную последовательность, по существу гомологичную SEQ ID NO: 9, выше кодона инициации нуклеотидной последовательности, кодирующей парвовирусный белок Rep, и/или кодона инициации нуклеотидной последовательности, кодирующей парвовирусный капсидный белок VP1. Последовательностью, обладающей значительной степенью идентичности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9, которая будут помогать увеличивать экспрессию парвовирусного белка Rep, является, например, последовательность, которая обладает по меньшей мере 60, 70, 80 или 90% идентичностью с нуклеотидной последовательностью SEQ IDNO: 9. Клетка насекомого может представлять собой любую клетку, которая подходит для продукции гетерологичных белков. Предпочтительно клетка насекомого обеспечивает возможность репликации бакуловирусных векторов, и ее можно поддерживать в культуре. Более предпочтительно клетка насекомого также обеспечивает репликацию рекомбинантных парвовирусных векторов, включая векторы rAAV. Например, используемой клеточной линией может быть линия клеток Spodoptera frugiperda, линии клетокDrosophila или линии клеток комара, например, линии клеток, полученных из Aedes albopictus. Предпочтительными клетками или клеточными линиями насекомых являются клетки видов насекомых, которые чувствительны к бакуловирусной инфекции, включая, например, S2 (CRL-1963, АТСС), Se301,SeIZD2109, SeUCRl, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-I, Tn368, HzAm1, Ha2302, Hz2E5, High Five(Invitrogen, CA, USA) и expresSF+ (US 6103526; Protein Sciences Corp., CT, USA). Предпочтительной клеткой насекомого согласно изобретению является клетка насекомого для получения рекомбинантных парвовирусных векторов. Способом согласно изобретению одна или несколько конструкций нуклеиновых кислот могут быть стабильно интегрированы в геном клетки насекомого. Специалисту в данной области известно, как стабильно ввести нуклеотидную последовательность в геном насекомого и как идентифицировать клетку,имеющую такую нуклеотидную последовательность в геноме. Включение в геном может быть осуществлено, например, с помощью применения вектора, содержащего нуклеотидные последовательности, высоко гомологичные областям генома насекомого. Применение специфичных последовательностей, таких как транспозоны, является другим путем введения нуклеотидной последовательности в геном. Условия выращивания клеток насекомых в культуре и получения гетерологичных продуктов в клетках насекомых в культуре хорошо известны в данной области и описаны, например, в цитированных выше ссылках по молекулярному конструированию клеток насекомых (см. также WO 2007/046703). В предпочтительном варианте способа согласно изобретению рекомбинантный парвовирусный вирион извлекают. Извлечение предпочтительно включает стадию аффинной очистки рекомбинантного парвовирусного (rAAV) вектора (содержащие его вирионов) с использованием анти-AAV-антитела,предпочтительно иммобилизованного антитела. Анти-AAV-антителом предпочтительно является моноклональное антитело. Особенно подходящим антителом является одноцепочечное антитело верблюдовых или его фрагмент, например, антитело, получаемое от верблюдов или лам (см., например, Muyldermans, 2001, Biotechnol. 74: 277-302). Антителом для аффинной очистки rAAV предпочтительно является антитело, которое специфично связывает эпитоп на капсидном белке AAV, при этом предпочтительно эпитоп представляет собой эпитоп, который присутствует на капсидном белке у более чем одного серотипа AAV. Например, антитело может быть получено или выбрано на основе специфичного связывания с капсидом AAV2, но в то же время он также может специфично связываться с капсидами AAV1, AAV3 иAAV5. Во втором аспекте изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей одну или несколько кассет экспрессии согласно изобретению, которые определены в настоящем описании выше. В предпочтительном варианте конструкция нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит первую и вторую кассету экспрессии согласно изобретению и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты по п. (i). Предпочтительно первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор р 10, а вторым промотором является промотор PolH или 4xHsp27 EcRE + минимальный промотор Hsp70. Более предпочтительно первый промотор функционально связан с энхансером,предпочтительно энхансером HR1. В другом варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является 4xHsp27 EcRE + минимальный промотор Hsp70, а вторым промотором является промотор PolH. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор PolH, а вторым промотором является промотор р 10, deltaE1 или Е 1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор PolH, а вторым промотором является промотор deltaE1 или Е 1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор р 10, а вторым промотором является промотор deltaE1 или Е 1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промоторPolH, а вторым промотором является промотор PolH. В следующих вариантах любое другое сочетание первого промотора и второго промотора является частью изобретения. Первый промотор может быть выбран из группы, состоящей из промотора PolH, промотора р 10, основного промотора белка, индуцируемого промотора или промотора deltaE1 или промотора Е 1 или любого другого промотора позднего или очень позднего бакуловирусного гена. Второй промотор может быть выбран из группы, состоящей из промотора PolH, промотора р 10, основного промотора белка, индуцируемого промотора или промотора deltaEl или Е 1 или любого другого промотора позднего или очень позднего бакуловирусного гена. Более предпочтительно первый промотор выбран из группы, состоящей из промотора PolH, промотора р 10 или основного промотора белка, и при этом вторым промотором является промотор deltaE1 или промотор Е 1 или любой другой промотор раннего или позднего бакуловирусного гена. В предпочтительном варианте первая кассета экспрессии, находящаяся в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению, содержит энхансерный элемент, который определен выше. В третьем аспекте изобретение относится к клетке насекомого, которая определена выше. В четвертом аспекте изобретение относится к набору, содержащему (а) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую первую и вторую кассеты экспрессии, которые определены выше; и (b) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт множественного клонирования для трансгена, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью инвертированного концевого повтора парвовируса, и такой трансген функционально связан с промотором, способным управлять экспрессией трансгена в клетке-хозяине. В предпочтительном варианте конструкция нуклеиновой кислоты (b) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью инвертированного концевого повтора парвовируса, и такой трансген функционально связан с промотором, способным управлять экспрессией трансгена в клетке-хозяине. Набор может дополнительно содержать клетки насекомых и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую хелперные функции бакуловируса для экспрессии в клетках насекомых. В следующем аспекте изобретение относится к партии парвовирусных вирионов, полученных описанными выше способами согласно изобретению. Термин "партия парвовирусных вирионов" в настоящем описании означает все парвовирусные вирионы, которые получают в одном и том же раунде продуцирования, необязательно в одной емкости с клетками насекомых. В предпочтительном варианте партия парвовирусных вирионов согласно изобретению имеет соотношение заполненные вирионы/суммарные вирионы, которое описано выше, и/или соотношение заполненные вирионы/пустые вирионы, которое описано выше. В настоящем документе и в формуле изобретения глагол "содержать" и его сочетания используют в не ограничивающем смысле для обозначения того, что элементы, следующие после слова включены, но элементы, специально не указанные, не исключены. Кроме того, указание элемента с использованием грамматической формы единственного числа не исключает вероятность того, что присутствует больше одного элемента, если контекст ясно не диктует, что присутствует один и только один из элементов. Таким образом, форма единственного числа обычно означает "по меньшей мере один". Следующие далее примеры иллюстрируют изобретение. Примеры Пример 1 1.1 Материалы и способы 1.1.1 Создание рекомбинантного бакуловируса Были созданы следующие конструкции. 1.1.1.1 Конструирование pVD118(new)pVD1118(new) является контрольным вектором, содержащим кассету экспрессии, включающую нуклеотидную последовательность Rep78 под контролем промотора р 10, и кассету экспрессии, включающую нуклеотидную последовательность генов Сар под контролем промотора полиэдрина (PolH или рРН). pVD118(new) конструировали, как показано на фиг. 1. Перед созданием конечной плазмидыpVD118(new) конструировали предшественники pFastBac Dual Rep78/ACG и pVD118 (партия 1). Коротко, плазмиду REP-ACG/PSC (заявка на выдачу патента WO 2007148971; также называемую в настоящем описании pVD88) pVD88 расщепляли SpeIXbaI и выступающие 5'-концы делали тупыми. Фрагмент длиной 2057 п.н. выделяли из агарозного геля, очищали и лигировали в линеаризованную SmaI плазмидуpFastBac Dual (Invitrogen), получая pFastBac Dual Rep78/ACG. Затем указанную плазмиду расщеплялиBstZ17I и SnaBI и фрагмент p10Rep78/ACG длиной 2537 п.н. выделяли и лигировали в BstZ17Iлинеаризованную pVD84, создавая pVD118 (партия 1). Однако ориентация кассеты экспрессииNheIBlpI. После затупления выступающих 5'-концов фрагмент вектора длиной 12431 п.н. выделяли и очищали из геля. Затем очищенный фрагмент длиной 2057 п.н. из REP-ACG/PSC лигировали в вектор, и смесью для трансформации трансформировали химически комптенетные клетки ТОР 10 (Invitrogen), и клетки высевали на чашки, содержащие ампициллин. Осуществляли рестрикционный анализ с использованием NaeISacI ДНК, выделенной из культур минипрепаративным способом. Правильные клоны давали фрагменты размером 2204 и 12292 п.н. 1.1.1.2. Конструирование pVD118(new) + HR1pVD118(new) + HR1 представляет собой такой же вектор, как pVD118, с добавлением энхансераhr1, который расположен между р 10 и промотором полиэдрина, и его конструировали, как показано на фиг. 2. Коротко, ПЦР, осуществляемая на вирусной ДНК AcMNPV (Protein Sciences Corporation, Meriden,USA) с использованием праймеров HR1-Fw 5'-gtatacgtatgacactatcgatgttgac-3' (SEQ ID NO: 10) и HR1-Rv 5'gtatacqatcqattattgctccaatactag-3' (SEQ ID NO: 11), приводила к получению продукта длиной 904 п.н., который клонирован в векторе pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). После расщепления BstZ17I фрагмент длиной 898 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор pVD118(new), который был расщепленBstZ17I и дефосфорилирован. Контрольные расщепления ферментами SpeIEcoNI приводили к образованию фрагментов длиной 1269 и 14125 п.н. 1.1.1.3 Конструирование pVD84 (+p10 Rep) (=pVD165)pVD165 представляет собой контрольный вектор, содержащий кассету экспрессии, включающую нуклеотидную последовательность Rep78, в которой стартовый кодон был мутирован с получением кодона ACG, под контролем промотора р 10, и кассету экспрессии, включающую нуклеотидную последовательность генов Сар под контролем промотора PolH. Кассеты экспрессии расположены в плазмиде в противоположном направлении. pVD165 конструировали, как показано на фиг. 3. Коротко, ПЦР, осуществляемая на pVD118(new) с использованием праймеров поли-А Fw 5'-agatctgtagtggctatggcagggc-3' (SEQID NO: 12) и p10 Rv 5'-agatctcccgggacggacctttaattcaacccaac-3' (SEQ ID NO: 13), приводила к получению продукта длиной 2566 п.н., который клонировали в векторе pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). После расщепления BglII фрагмент длиной 2541 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор pVD84, который был расщеплен BglII и дефосфорилирован. Контрольные расщепления правильных клонов SpeIXbaI приводили к образованию фрагментов длиной 1269 и 11810 п.н. 1.1.1.4 Конструирование pVD165 + HR1pVD165 + HR1 представляет собой такой же вектор, как pVD165, с добавлением энхансера hr1 ниже промотора р 10, и его конструировали, как показано на фиг. 4. Коротко, ПЦР, осуществляемая на вирусной ДНК AcMNPV с использованием праймеров HRl-Fw 5'-gtatacgtatgacact atcgatgttgac-3' (SEQ ID NO: 10) и HR1-Rv 5'-gtatacgatcgattattgctccaatactag-3' (SEQ ID NO: 11), приводила к получению продукта длиной 904 п.н., который клонировали в векторе pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). После расщепления BstZ17I фрагмент длиной 898 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор pVD165, который был расщеплен SmaI и дефосфорилирован. Контрольные расщепления правильных клонов с использованиемClaI приводили к образованию фрагментов длиной 875, 1184, 4160 и 9180 п.н. 1.1.1.5. Конструирование pVD165 с индуцируемым промотором выше САР (pVD165 + 4xEcREpVD 165 + 4xEcRE CAP подобен pVD165, но содержит индуцируемый промотор вместо промотора полиэдрина (рРН). pVD165 + 4xEcRE CAP конструировали, как показано на фиг. 5. Коротко, индуцируемый промотор, который содержит 4 последовательно расположенных EcRE, минимальный промоторEcoNI фрагмент длиной 375 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор pVD165, который расщепляли BstZ17I и EcoNI. Контрольные расщепления правильных клонов PmeIEcoRV приводили к образованию фрагментов длиной 2554 и 12116 п.н. 1.1.1.6. Конструирование pVD165 с индуцируемым промотором выше Rep (pVD165 + 4xEcREpVD165 + 4xEcRE Rep78 подобен pVD165, но содержит индуцируемый промотор вместо промотораp10. pVD165 + 4xEcRE Rep78 конструировали, как показано на фиг. 6. Коротко, синтезировали индуцируемый промотор, который состоит из 4 последовательно расположенных EcRE и минимального промотора Hsp70, и лигировали в pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). После расщепления BstZ17I и SpeI фрагмент длиной 290 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор pVD165, который был расщеплен SmaI и SpeI. Контрольные расщепления правильных клонов SpeIBglII приводили к образованию фрагментов длиной 298, 2376 и 11954 п.н. 1.1.1.7. Конструирование конструкции pVD190 (deltaIE1 Cap + pPolh Rep)DeltaIE1 Cap + pPolh Rep подобен pVD165, но содержит промотор deltaIE1 вместо промотора рРН и промотор pPolH вместо промотора p10. DeltaIE1 Cap + pPolh Rep конструировали, как показано на фиг. 7 и 8. Для этого конструировали вектор-предшественник следующим образом. ПЦР, осуществляемая наpFBPSLR (Urabe et al. Human gene therapy 2002; 13(16): 1935-1943) с использованием праймеров BstZl7IdeltaIE1 Fw: 5'-ggtccgtatacgacgataacgccgttggtggcg-3' (SEQ ID NO: 14) и AflII-delta IE1 Rv: 5'cgacttaagacggcgaattctgcagatggc-3' (SEQ ID NO: 15), приводила к получению продукта длиной 181 п.н., кото- 18020969 рый клонировали в векторе pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). После расщепления BstZ17IAflII фрагмент длиной 165 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор pVD165 + 4xEcRE CAP, который расщепляли BstZ17I и AflII. Полученная в результате плазмида представляла собой плазмиду pVD165 + deltaIE1 CAP, и контрольное расщепление BstZ17IAflII должно приводить к образованию фрагментов длиной 165 и 14374 п.н. Затем промотор полиэдрина клонировали перед кассетой экспрессии Rep в pVD165+ deltaIE1 CAP. Для этого осуществляли ПЦР с использованием праймеров SmaI-pPolh Fw: 5'tctcccgggagatcatggagataattatgataac-3' (SEQ ID NO: 16) и SpeI-pPolh Rv: 5'- gttactagtgagctcgtcgac-3' (SEQ IDNO: 17) на pVD88. При этом получали ПЦР-продукт длиной 198 п.н., который клонировали в вектореpCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). После расщепления SpeISmaI фрагмент длиной 188 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор pVD165 + deltaIE1 Cap, который был расщеплен SpeI и SmaI. В итоге получали конструкцию pVD165 + deltaIE1 CAP. 1.1.1.8 Конструирование конструкции p10-Cap-pPolh-Rep Конструкция р 10 Сар + pPolhRep подобна конструкции delta-IE1-Cap-pPolh-Rep, но содержит промотор р 10 вместо промотора delta-IEl перед кассетой экспрессии Сар, и ее конструировали, как показано на фиг. 9. ПЦР, осуществляемая на pFastBac Dual с использованием праймеров BstZ17I-p10 Fw: 5'agtatacggacctttaattcaac-3' (SEQ ID NO: 18) и AflII-p10 Rv: 5'-cgacttaagagcgggccgctttcgaatc-3' (SEQ ID NO: 19), приводила к получению продукта длиной 171 п.н., который клонировали в векторе pCRII-bluntTOPO (Invitrogen). После расщепления BstZ17IAflII фрагмент длиной 160 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в конструкцию delta-IE1-Cap-pPolh-Rep, которая была расщеплена BstZ17I и AflII. 1.1.1.9 Конструирование pVD194 (Rep78/CTG(delta ATG Сначала конструировали rep-плазмиду со стартовым кодоном CTG без каких-либо внутренних сайтов ATG посредством синтеза необходимого гена в соответствии с последовательностью, указанной вSEQ ID NO: 31. Затем ген rep делетировали из плазмиды pVD88, используя ферменты рестрикции RsrII иXbaI. Затем синтезированный ген лигировали в плазмиду pVD88, используя сайты рестрикции RsrII иXbaI, получая pVD195. Затем pVD195 расщепляли BglII, получая фрагменты длиной 9297 и 2231 п.н. Затем выступающие 5'-концы заполняли фрагментом Кленова и затем расщепляли, используя SexAI. При этом получали фрагменты длиной 9297, 1372 и 859 п.н. Затем выделяли фрагмент 859 п.н. Необходимый вектор создавали, расщепляя pVD165 ферментом SpeI, получая линейный фрагмент длиной 14501 п.н. Выступающие 5'-концы заполняли фрагментом Кленова и затем расщепляли, используя SexAI, с получением фрагментов 13600 и 901 п.н. Выделяли фрагмент длиной 13600 п.н. Фрагмент BglII(Кленов)SexAI длиной 859 п.н. затем лигировали в pVD165 (SpeI(Кленов)SexAI), получая pVD194 (см. фиг. 10). Контрольное расщепление SexAIXmaI должно приводить к образованию фрагментов длиной 13435 п.н. и 1029 п.н. 1.1.1.10. Конструирование pVD84 Чтобы превратить стартовый сайт бакуловирусного вектора экспрессии pFBAAV1VPm11 (Urabe etal., 2002, Hum. Gene Ther. 13: 1935-1943) из ACG в GTG, осуществляли ПЦР, используя следующие праймеры. Последовательность прямого праймера содержит сайт BamHI (АМТ праймер 169; SEQ ID NO: 29) 5'- TTAGGATCCTGTTAAGGTGGCTGCCGACGG-3' Последовательность обратного праймера содержит сайт StuI (АМТ праймер 158; SEQ ID NO: 30) 5'-GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC-3' Осуществляли ПЦР с использованием праймеров 169 и 158, и продукт ПЦР (250 п.н.) очищали,используя набор для очистки продуктов ПЦР (Qiagen, партия 11879372), и разрезали ферментами рестрикции BamHI и StuI. Бакуловирусный экспрессирующий вектор также расщепляли ферментами BamHI и StuI. После дефосфорилирования вектора с использованием SAP (Promega, партия 17501504),вставку (Сар со стартовым сайтом GTG) и вектор очищали в геле. После лигирования вектора и вставки осуществляли трансформацию химически компетентных клеток DH5 (Invitrogen, партия 1241753), и клетки высевали штрихом на чашки с LB, содержащие ампициллин. ДНК pVD63 (Сар/стартовый сайтGTG) очищали и исследовали в отношении идентичности, используя анализ последовательностей BaseClear и рестрикцию. Чтобы клонировать ген Сар со стартовым сайтом GTG в бакуловирусном экспрессирующем вектореpPSC10 (Protein Sciences), его вырезали из pVD63 ферментами SmaI и AvrII и лигировали в дефосфорилированный экспрессирующий вектор, который был разрезан EcoRV и XbaI. Затем смесью для лигирования трансформировали химически компетентные клетки DH10 (Invitrogen, партия 1268527), и клетки высевали штрихом на чашки с LB-ампициллином. После минипрепаративного выделения ДНК с использованием набора QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, партия 12180218), один минипрепарат (клон 13) отбирали на основе рестрикционного анализа с использованием SphI. ДНК такого клона (pVD84) очищали с помощью набора SNAP midiprep (Invitrogen, партия раствора 1256921 и партия колонки 1259367). Идентичность pVD84 проверяли с использованием анализа последовательности вблизи стартового кодона, осуществляемого с помощью BaseClear, и рестрикционным анализом с использованием ферментов BamHI и SphI (SEQ ID NO: 28). 1.1.1.11. Получение рекомбинантного бакуловируса Рекомбинантные Вас.VD118(new),Вас.VD118(new)+HR1,Bac.VD165,Bac.VD165+HRl,Вас.VD165+4xEcRE CAP, Bac.VD165+4xEcRE Rep78, Bac.VD190 и Bac.VD194 (p0) создавали, используя систему Protein Sciences (Protein Sciences Corporation, Meriden, USA). Рекомбинантный бакуловирус амплифицировали при разведении 1:100 в 2106 клеток SF+ в мл. Через три дня после инфекции клетки осаждали центрифугированием и извлекали надосадок, содержащий вирус. Амплификацию следующих пассажей осуществляли таким же образом. 1.1.2 Получение rAAV Партии rAAV получали согласно Urabe et al., 2002 (выше) с тем исключением, что использовали два рекомбинантных бакуловируса вместо трех. Один бакуловирус нес экспрессирующую конструкцию под контролем промотора CMV и фланкированную ITR AAV. Другой бакуловирус представлял собой бакуловирус Rep-Cap, который нес две кассеты экспрессии, одну для гена репликации AAV и одну для капсида AAV. Экспрессия гена репликации или гена капсида под контролем индуцируемого промотора регулируется добавлением 0,001-1 мкМ понастерона А в культуральную среду. Разные эксперименты по получению rAAV1 осуществляли, используя исходные культуры бакуловируса Bac.VD43 p5, содержащего трансген LPL под контролем промотора CMV, и разные пассажи (р 3, р 4 или р 5) бакуловирусовRep/Cap. В каждом эксперименте в качестве контроля использовали стандартную продукцию rAAV1(Bac.VD88:Bac.VD84:Bac.VD43 в соотношении 5:1:1). 1.1.3. Определение соотношение заполненные/суммарные частицы AAV Чтобы определить отношение количества заполненных к суммарному количеству капсидов, количество геномных копий (gc) делили на общее количество частиц AAV. Количество gc/мл измеряли в количественном ПЦР-анализе, и суммарное количество частиц AAV определяли с использованием иммуноферментного анализа Progen (см. ниже). Для реакции количественной ПЦР использовали основную смесь для ПЦР SYBR Green (Applied Biosystems,4309155) согласно инструкциям производителя (общий объем 25 мкл; программа ПЦР: 10 мин 95 С, 40 циклов 15 с 95 С и 1 мин 60 С), используя следующие наборы праймеров: Соотношение сравнивают с соотношением, полученным в стандартных условиях продуцирования при использовании объемного соотношения 5:1:1 Вас.Rep, Вас.Сар и Bac.ITR. 1.1.4. Вестерн-блот-анализ Через три дня после продуцирования rAAV клетки лизировали добавлением 0,1 V лизирующего 10 трис-буфера (1,5 М NaCl, 0,5 М трис, 0,01 М MgCl, 1% тритон Х-100, рН 8,5, стерилизованный фильтрованием) и инкубировали на льду в течение 30 мин. Свободную ДНК и РНК разрушали инкубацией с бензоназой при 37 С в течение 15 мин. Клеточный лизат центрифугировали (1900g; 15 мин; 4 С). К образцу надосадка добавляли буфер для образцов NuPAGE LDS (4, Invitrogen) и наносили на 4-12% бистрис-гель (120 В). Белки с помощью блоттинга переносили на мембрану PVDF (BioRad) в течение 30 мин, 10 В (полусухой блоттинг). Осуществляли Вестерн-иммнохимический анализ, блокируя мембрану блокирующим буфером Superblock-PBS (PIERCE) и затем инкубируя с мышиными анти-Rep-антителами(303.9, Progen, Germany; разведение 1:50) и кроличьими антителами против Ig мыши - HRP (DAKO, разведение 1:500). Белки Rep визуализировали с помощью хемилюминесцентного окрашивания, используя субстрат для Вестерн-блоттинга lumi-light plus (Roche). 1.1.5. ELISA суммарных частиц rAAV1 Общее количество частиц rAAV1 (tp), полученное при каждом продуцировании, определяли с помощью набора для ELISA с титрованием AAV1 (Progen, Heidelberg, Germany), и определение осуществляли согласно протоколу, прилагаемому к набору производителем, за исключением того, что все образцы и контроли предварительно разбавляли в неочищенной массе лизата (CLB). Коротко, CLB получали посредством сбора клеток expressSF+спустя три дня, добавляя 10 лизирующий буфер и инкубируя в течение 1 ч при 28 С. После обработки бензоназой в течение 1 ч при 37 С лизат центрифугировали при 1900g, и надосадок хранили при 4 С. Чтобы определить общее количество частиц rAAV1 в неочищенном лизате каждой популяции, образцы предварительно разбавляли 50 раз в CLB, указанное разведение было начальным разведением. Затем осуществляли дополнительные разведения в 250, 1250 и 6250 раз в CLB. Стандартную линию также разбавляли в CLB. Образцы при получении Bac.VD190 разбавляли только 50 и 100 раз вследствие низких уровней экспрессии капсидных белков. 1.1.6. Анализы суммарных частиц с использованием ВЭЖХ Неизвестные штаммы AAV-1 инъецировали в систему ВЭЖЖХ, получая пик на хроматограмме. Такой пик можно интегрировать с помощью компьютерной программы Chemstation, и он представляет суммарное количество инъецированных частиц. Концентрированную культуру AAV-1 титровали в отношении количества суммарных частиц в мл с помощью электронной микроскопии и использовали в способе. Используя такой стандарт в качестве калибровочного, вычисляли количество суммарных частиц в неизвестном образце. Кроме того, при инъекции конкретного количества геномных копий (которое примерно представляет количество заполненных частиц) в диапазоне стандарта можно оценить соотношение заполненных и пустых частиц. 1.2. Результаты Соотношение заполненные/пустые частицы AAV улучшается в случае применения основанной на двух бакуловирусах системе, в частности, с высокой экспрессией белка Rep и умеренной экспрессией белка Сар Подробно исследовали три конструкции, pVD165, pVD190 и pVD194. Чтобы определить соотношение заполненные/пустые частицы rAAV1, продуцируемых с использованием Bac.VD165, концентрацию суммарных частиц в неочищенных лизатах определяли в двух независимых экспериментах. Результаты таких экспериментов ELISA и соответствующие соотношения суммарные/заполненные частицы показаны в табл. 1. Таблица 1. Соотношение суммарные/заполненные rAAV1, полученные с использованием бакуловирусного штамма Bac.VD165. Концентрацию суммарных частиц определяли с помощью ELISA суммарных частиц AAV1. Концентрацию заполненных частиц определяли с помощью количественной ПЦР. Соотношения суммарные/заполненные частицы можно сравнивать только с контролем, полученным в том же самом эксперименте Соотношение суммарные/заполненные частицы в случае продуцирования 1:1 в обоих экспериментах было в 1,6 раз лучше по сравнению с контролем. Для продуцирования 5:1 соотношение суммарные/заполненные частицы в 2,1 и 1,4 раза лучше по сравнению с контролем. В заключение, соотношение суммарные/заполненные частицы улучшается в случае частиц rAAV1, получаемых с использованиемBac.VD165. В Bac.VD190 кассета экспрессии Сар находится под контролем слабого промотора IE1. Это может приводить к более низкой экспрессии капсида, чем в случае продуцирования, осуществляемого с использованием других Rep/Cap-бакуловирусов или в контрольной ситуации, поскольку во всех указанных условиях экспрессия Cap индуцируется сильным промотором полиэдрина. Чтобы проверить такую гипотезу, определяли концентрацию суммарных частиц из двух разных экспериментов, осуществляемых с использованием Bac.VD190. Результаты показаны в табл. 2. Таблица 2. Соотношение суммарные/заполненные rAAV1, получаемых с использованием бакуловирусного штамма Bac.VD190. Концентрацию суммарных частиц определяли с использованием ELISA суммарных частиц AAV1. Концентрацию заполненных частиц определяли с помощью количественной ПЦР. Соотношения суммарные/заполненные частицы можно сравнивать только с контролем, получаемым в том же самом эксперименте Результаты получения 1 (табл. 2) показывают, что соотношения суммарные/заполненные частицы, полученные при продуцировании 1:1 и 5:1, были в 114 и 8 раз лучше по сравнению с контролем, соответственно. При получении 2 соотношение суммарные/заполненные частицы в 1,4 раза ниже или в 1,4 раза выше для продуцирования 1:1 или 5:1. В заключение, соотношение суммарные/заполненные частицы, по-видимому, также улучшается в случае частиц rAAV1, продуцируемых с использованием В случае Bac.VD194 осуществляли Вестерн-блот-анализ, чтобы определить экспрессию Rep и Сар. Соответственно через три дня после инфекции клеток с использованием 2 разных соотношений бакуловирусов (т.е. 1:1 и 9:1, при соотношении 5:1:1 для контроля из трех компонентов) лизаты клеток собирали и подвергали Вестерн-блот-анализу. Как показано на фиг. 11 А, экспрессия Сар была низкой при продуцировании с использованием соотношения бакуловирусов 1:1, но продуцирование с использованием соотношения 9:1 было сравнимым с трехкомпонентным контролем. Однако в случае продуцирования при соотношениях 1:1 и 9:1 экспрессия Rep сильно снижалась по сравнению с трехкомпонентным контролем. Однако на фиг. 11 В показано, что продуцирование вируса выше в случае получения с использованием Bac.VD194. Тот факт, что продуцирование выше, хотя экспрессия Сар ниже, свидетельствует о более предпочтительном соотношении суммарные/заполненные частицы. И снова можно сделать вывод,что двухкомпонентная система с эквимолярными количествами Rep и Сар, и особенно с высокой экспрессией Rep и умеренной экспрессией Сар, приводит к более низкому соотношению суммарные/заполненные частицы (т.е. в к более высокому процентному содержанию заполненных частиц). Пример 2 Материалы и способы В три встряхиваемых колбы (все колбы культивировали при 28 С перед инфекцией) высевали инокулят Р 5: 4 мл Bac.VD43, 4 мл Bac.VD84 и 20 мл Bac.VD88. Встряхиваемые флаконы инкубировали на протяжении 72-часового продуцирования вирусов при трех разных температурах (26, 28 и 30 С). Лизирующую обработку в случае всех встряхиваемых флаконов осуществляли в 1 инкубаторе со встряхиванием, используя 0,9% (об./об.) тритон Х-100. После добавления лизирующего буфера встряхиваемые колбы инкубировали в течение 30 мин при заданной температуре 28 С, добавляли бензоназу (16 мкл на 400 мл) и встряхиваемые колбы инкубировали в течение 1 ч при заданной температуре 37 С. После обработки бензоназой все встряхиваемые колбы выдерживали в течение ночи при 29 С для клиренса вирусов и затем хранили при 4 С максимум в течение 3 суток. Из каждого инкубатора со встряхиванием 200 мл неочищенной лизированной массы обрабатывали на аффинной колонке объемом 1 мл, используя расход 1 мл/мин. После промывки продукт элюировали,используя PBS, pH 3,5. Результаты Текущий подсчет клеток во встряхиваемых флаконах, используемых для температурного исследования, показан в табл. 1. Повышение температуры коррелирует со снижением общей концентрации клеток и жизнеспособности во время сбора. Жизнеспособность, получаемая при 28 С, сравнима с результатами, получаемыми с использованием системы биореактора Wave. Таблица 1. Текущий подсчет клеток при получении во встряхиваемых колбах Результаты тестирования неочищенной лизированной массы и элюатов из встряхиваемых колб показаны в табл. 2. Таблица 2. Соотношение суммарные/заполненные частицы rAAV, продуцированные при разных температурах Обсуждение и выводы Повышение температуры во время продуцирования rAAV в клетках SF+ незначительно увеличивает общее количество продуцируемых частиц rAAV, но в большйе степени увеличивает количество продуцируемых заполненных, приводя к снижению соотношения суммарные/заполненные частицы. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения рекомбинантного парвовирусного вириона, включающий стадии:(a) получение клетки насекомого, содержащей одну или несколько конструкций нуклеиновых кислот, содержащих(i) нуклеотидную последовательность, содержащую трансген, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью парвовирусного инвертированного концевого повтора;(ii) первую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один из белков Rep78 и Rep68, которая функционально связана с первым промотором,способным управлять экспрессией белка Rep в клетке насекомого;(iii) вторую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок парвовируса, которая функционально связана со вторым промотором, который способен управлять экспрессией капсидного белка в клетке насекомого;(b) культивирование клетки, определенной в п.(а), в условиях, подходящих для экспрессии Rep и капсидного белка; и(c) необязательно выделение рекомбинантного парвовирусного вириона; причем первая и вторая кассеты экспрессии присутствуют в одной конструкции нуклеиновой кислоты, и в котором отношение экспрессии белка Rep к экспрессии капсидного белка регулируется одним или несколькими из следующих путей: первый промотор имеет такую же силу или является более сильным, чем второй промотор; присутствие большего количества и/или более сильных энхансерных элементов в первой кассете экспрессии по сравнению со второй кассетой экспрессии; нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный белок Rep, имеет более высокий индекс адаптации кодонов по сравнению с нуклеотидной последовательностью, кодирующей капсидный белок; оптимизация температуры для парвовирусного белка Rep и/или варианты белков Rep с одной или несколькими заменами, инсерциями и/или делециями в аминокислотной последовательности по сравнению с соответствующим белком Rep дикого типа, и при этом замена, инсерция и/или делеция аминокислот приводят к повышению активности функции Rep,которое оценивают с помощью выявления повышенной продукции AAV в клетках насекомых. 2. Способ по п.1, в котором нуклеотидная последовательность по п.(iii) содержит открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3. 3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором нуклеотидная последовательность по п.(ii) содержит только одну открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Rep78 и Rep68. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3, или открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Rep78 и Rep68, не содержат искусственного интрона. 5. Способ по п.4, в котором ни открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3, и/или ни открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Rep78 и Rep68,- 23020969 не содержат искусственного интрона. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первый промотор или второй промотор выбран из группы, состоящей из промотора PolH, промотора р 10, основного промотора, индуцируемого промотора, промотора Е 1 или промотора deltaE1. 7. Способ по п.6, в котором первый промотор выбран из группы, состоящей из промотора PolH,промотора р 10 или основного промотора, и в котором вторым промотором является промотор deltaE1 или промотор Е 1. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первая кассета экспрессии содержит по меньшей мере один бакуловирусный энхансерный элемент и/или по меньшей мере один элемент, отвечающий на экдизон. 9. Способ по п.8, в котором энхансерный элемент выбран из группы, состоящей из hr1, hr2, hr3, hr4 и hr5. 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность ITR парвовируса, парвовирусный белок Rep и/или парвовирусный белок Сар происходят из аденоассоциированного вируса (AAV). 11. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая первую и вторую кассеты экспрессии, которые определены в любом из пп.1-10, в которой(a) первым промотором является промотор р 10, а вторым промотором является промотор PolH или 4xHsp27 EcRE+минимальный промотор Hsp70;(b) первым промотором является 4xHsp27 EcRE+минимальный промотор Hsp70, а вторым промотором является промотор PolH;(c) первым промотором является промотор PolH, а вторым промотором является промотор p10, deltaE1 или Е 1;(d) первым промотором является промотор PolH, а вторым промотором является промотор deltaE1 или Е 1;(e) первым промотором является промотор р 10, а вторым промотором является промотор deltaE1 или промотор Е 1 или(f) первым промотором является промотор PolH, и вторым промотором является промотор PolH,и при этом первая кассета экспрессии необязательно содержит энхансерный элемент. 12. Клетка насекомого, включающая конструкцию нуклеиновой кислоты, определенную в любом из пп.1-10. 13. Набор, содержащий (а) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую первую и вторую кассеты экспрессии, которые определены в любом из пп.1-10; и (b) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт множественного клонирования для трансгена, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью инвертированного концевого повтора парвовируса, причем трансген функционально связан с промотором, способным управлять экспрессией трансгена в клетке-хозяине.
МПК / Метки
МПК: C12N 5/10, C07K 14/015, C12N 15/864, C12N 7/04, C12N 15/85
Метки: насекомых, парвовирусных, белков, оптимизация, клетках, экспрессии
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-20969-optimizaciya-ekspressii-parvovirusnyh-belkov-rep-i-cap-v-kletkah-nasekomyh.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Оптимизация экспрессии парвовирусных белков rep и cap в клетках насекомых</a>
Предыдущий патент: Ингаляторное лекарственное средство
Следующий патент: Способ изготовления токосъемника для опорной шины и опорная шина
Случайный патент: Твердая разовая пероральная фармацевтическая дозированная форма саквинавирмезилата и способ ее изготовления