Удлиненные рекомбинантные полипептиды и содержащие их композиции

УДЛИНЕННЫЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим биологически активные белки,сшитые с удлиненным рекомбинантным полипептидом (XTEN), к изолированным нуклеиновым кислотам, кодирующим композиции, и векторам и клеткам-хозяевам, их содержащим, и к способам применения таких композиций при лечении заболеваний, связанных с уровнем глюкозы, болезней обмена веществ, нарушений свертывания крови и нарушений и состояний, связанных с гормоном роста. Данное изобретение было выполнено при поддержке правительственного гранта на инновационные исследования для малого бизнеса 2R44GM079873-02, присужденного Национальными институтами здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на изобретение. Перекрестная ссылка на родственные заявки Данная заявка претендует на приоритет предварительных заявок США 61/149669 от 3 февраля 2009 г.; 61/268193 от 8 июня 2009 г.; 61/185112 от 8 июня 2009 г.; 61/236493 от 24 августа 2009 г.; 61/236836 от 25 августа 2009 г.; 61/243,707 от 18 сентября 2009 г.; 61/245490 от 24 сентября 2009 г.; 61/280955 от 10 ноября 2009 г.; 61/280956 от 10 ноября 2009 г. и 61/281109 от 12 ноября 2009 г., все в стадии рассмотрения, описание которых целиком включено сюда в качестве ссылок. Уровень техники Биологически активные белки, включая используемые в качестве терапевтических средств, в типичном случае являются нестабильными молекулами, имеющими короткий срок годности, в особенности при приготовлении в виде водных растворов. Кроме того, многие биологически активные пептиды и белки обладают ограниченно растворимостью или агрегируют во время получения их в рекомбинантном виде, что требует применения сложных методик солюбилизации и рефолдинга. Для изменения свойств таких белков к ним могут присоединять различные химические полимеры. Особый интерес представляют гидрофильные полимеры, обладающие гибкими конформациями и хорошо гидратируемые в водных растворах. Часто применяемых полимером является полиэтиленгликоль (ПЭГ). Такие полимеры характеризуются большим соотношением гидродинамических радиусов к молекулярной массе (Kubetzko S. etal. (2005) Mol Pharmacol, 68: 1439-54) и могут обеспечивать улучшение фармакокинетических свойств. В зависимости от места прикрепления, полимеры склонны к образованию ограниченных взаимодействий с белком, к которому они прикреплены, таким образом, что модифицированный полимером белок сохраняет свои важные функции. Однако химическая конъюгация полимеров с белками требует применения сложных многостадийных способов. В типичном случае, перед проведением стадии химической конъюгации необходимо получить и очистить белковый компонент. Кроме того, стадия конъюгации может приводить к образованию смесей гетерогенных продуктов, которую необходимо разделять, что приводит существенным потерям продукта. В качестве альтернативы, такие смеси можно использовать как готовый фармацевтический продукт, но их трудно стандартизировать. Примерами являются некоторые имеющиеся в настоящее время на рынке продукты пегилированного интерферона-альфа, которые используют в виде смесей (Wang В. L. et al. (1998) J Submicrosc Cytol Pathol, 30: 503-9; Dhalluin C. et al. (2005) Bioconjug Chem, 16: 504-17). Воспроизводимое получение и определение параметров таких смесей затруднено, так как они содержат изомеры со сниженной терапевтической активностью или вовсе без такой активности. Фрагменты альбуминов и иммуноглобулинов, такие как области Fc, использовали для конъюгации с другими биологически активными белками, при этом результат был непредсказуем в отношении увеличения периода полувыведения или иммуногенности. К сожалению, домен Fc не способен эффективно сворачиваться в ходе рекомбинантной экспрессии и склонен к образованию нерастворимых преципитатов, называемых тельцами включения. Необходимо солюбилизировать эти тельца включения и ренатурировать функционально активный белок. Этот способ является трудоемким, неэффективным и дорогостоящим, требующим проведения дополнительных стадий и часто применения сложных методик очистки. Таким образом, имеется существенная потребность в композициях и способах, которые могут улучшить биологические, фармацевтические, терапевтические свойства и/или свойства безопасности биологически активного белка. Сущность изобретения Настоящее изобретение направлено на создание композиций и посвящено способам, которые могут быть применены для улучшения биологических, фармацевтических, терапевтических свойств и/или свойств безопасности биологически активных белков. Композиции и методы, в частности, применимы для улучшения фармакокинетических свойств, таких как период полувыведения, и увеличения времени нахождения биологически активного белка в пределах терапевтического окна, а также упрощения способа получения и фармацевтических свойств, таких как растворимость, такого биологически активного белка. В частности, настоящее изобретение посвящено фармацевтическим композициям, содержащим химерные белки, и их применениям для лечения заболеваний, нарушений или состояний. Конкретное заболевание, которое подвергают лечению, будет зависеть от выбора биологически активных белков. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения композиции и способы применимы для лечения метаболических и сердечно-сосудистых заболеваний (включая в качестве неограничивающих примеров глюкозо- или инсулин-зависимые заболевания), нарушений свертываемости крови и геморрагических нарушений и нарушений, связанных с функцией гормона роста. С одной стороны, настоящее изобретение направлено на создание композиций удлиненных рекомбинантных полипептидов (XTEN), которые, будучи присоединенными к биологически активному белку,улучшают фармакокинетические свойства и/или повышают растворимость и стабильность образующегося химерного белка, при этом сохраняя или усиливая общую биологическую и/или терапевтическую ак-1 020843 тивность биологически активного белка. Такие композиции могут найти применение для лечения определенных заболеваний, нарушений или состояний, как описано в данном документе. Образующийся химерный белок может обладать улучшенным профилем безопасности и позволять производить менее частое введение дозы, что, в свою очередь, может привести к улучшению соблюдения режима лечения пациентом. Настоящее изобретение также направлено на создание полинуклеотидов, кодирующих XTEN и химерные белки, состоящие из биологически активных белков, сшитых с XTEN, а также полинуклеотидов, комплементарных полинуклеотидам, кодирующим XTEN и химерные белки, состоящие из биологически активных белков, сшитых с XTEN. С другой стороны, настоящее изобретение направлено насоздание композиций удлиненных рекомбинантных полипептидов (XTEN), применимых в качестве компонентов для создания химерного белка,которые могут быть сшиты с биологически активными белками (ВР) с образованием мономерных химерных белков BPXTEN. В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение направлено на создание изолированных удлиненных рекомбинантных полипептидов (XTEN), состоящих из более чем от примерно 400 до примерно 3000 аминокислотных остатков, при этом XTEN отличается тем, что суммарное содержание остатков глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р) составляет более чем около 80%, или около 85%, или около 90%, или около 95%, или около 96%, или около 97%, или около 98%, или около 99% от всей аминокислотной последовательности XTEN, последовательность XTEN в значительной степени является не повторяющейся, последовательность XTEN не содержит предсказанные эпитопы Т-клеток при ее анализе с использованием алгоритма TEPITOPE, при этом предсказание с помощью алгоритма TEPITOPE эпитопов в последовательности XTEN основано на выставлении оценки -5, или -6, или -7, или -8, или -9, или более, последовательность XTEN образует структуру, более чем на 90%, или более чем на 91%, или более чем на 92%, или более чем на 93%, или более чем на 94%, или более чем на 95%, или более чем на 96%, или более чем на 96%, или более чем на 98%,или более чем на 99% представляющую собой статистический клубок, согласно алгоритму GOR, и последовательность XTEN содержит менее 2% альфа-спиралей и 2% бета-слоев, согласно алгоритму ЧоуФасмана. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание XTEN, состоящих из более чем от примерно 400 до примерно 3000 аминокислотных остатков, при этом XTEN отличается тем, что суммарное содержание остатков аспарагина и глутамина составляет менее 10% от всей аминокислотной последовательности XTEN, суммарное содержание остатков метионина и триптофана составляет менее 2% от всей аминокислотной последовательности XTEN, последовательность XTEN содержит менее 5% аминокислотных остатков с положительным зарядом, последовательность XTEN образует структуру, более чем на 90% представляющую собой статистический клубок, согласно алгоритму GOR,и последовательность XTEN содержит менее 2% альфа-спиралей и 2% бета-слоев, согласно алгоритму Чоу-Фасмана. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание XTEN, состоящих из более чем от примерно 400 до примерно 3000 аминокислотных остатков, при этом XTEN отличается тем, что не менее примерно 80%, или не менее примерно 90%, или не менее примерно 91%, или не менее примерно 92%, или не менее примерно 93%, или не менее примерно 94%, или не менее примерно 95%,или не менее примерно 96%, или не менее примерно 97%, или не менее примерно 98%, или не менее примерно 99% последовательности XTEN состоит из неперекрывающихся мотивов последовательности,при этом каждый мотив последовательности содержит от примерно 9 до примерно 14 аминокислотных остатков и при этом последовательность любых двух соседних аминокислотных остатков встречается не более двух раз в каждом мотиве последовательности, мотивы последовательности состоят из от четырех до шести типов аминокислотных остатков, выбранных из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина(Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р), и XTEN улучшает фармакокинетические свойства биологически активного белка при присоединении к биологически активному белку, при этом фармакокинетические свойства оценивают измерением терминального периода полувыведения биологически активного белка, введенного субъекту, в сравнении с XTEN, соединенным с биологически активным белком и введенным субъекту в сопоставимой дозе. В некоторых вариантах вышеизложенных воплощений ни один тип аминокислот не составляет более 30% последовательности XTEN. В других вариантах вышеизложенных воплощений XTEN может иметь последовательность, в которой любые три соседних остатка не могут быть представлены идентичной аминокислотой, если только эта аминокислота не является серином, причем в последнем случае сериновыми остатками могут являться не более трех соседних аминокислот. В других вариантах вышеизложенных воплощений последовательность XTEN имеет оценку подпоследовательностей менее 10, или 9, или 8, или 7, или 6. В других вариантах вышеизложенных воплощений не менее примерно 80%, или примерно 90%, или примерно 95%, или примерно 96%, или примерно 97%, или примерно 98%, или примерно 99%, или 100% последовательности XTEN состоит из неперекрывающихся мотивов последовательности, при этом каждый мотив последовательности содержит 12 аминокислотных остатков. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения последовательность XTEN состоит из неперекры-2 020843 вающихся мотивов последовательности, при этом мотивы последовательности выбраны из одной или нескольких последовательностей, приведенных в табл. 1. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения улучшенные фармакокинетические свойства полученного химерного белка включают увеличение терминального периода полувыведения не менее чем примерно в два раза, или не менее чем примерно в три раза, или не менее чем примерно в четыре раза, или не менее чем примерно в пять раз, или не менее чем примерно в шесть раз, или не менее чем примерно в восемь раз, или не менее чем примерно в десять раз. В некоторых случаях улучшение фармакокинетических свойств отражено тем фактом, что концентрации в крови сохраняются в пределах терапевтического окна для химерного белка в течение данного периода не менее чем примерно в два раза, или не менее чем примерно в три раза, или не менее чем примерно в четыре раза, или не менее чем примерно в пять раз, или не менее чем примерно в шесть раз, или не менее чем примерно в восемь раз,или не менее чем примерно в десять раз дольше, по сравнению с соответствующим ВР, не связанным сXTEN. Увеличение периода полувыведения и времени нахождения в пределах терапевтического окна могут сделать возможным менее частое введение дозы и использование меньших количеств химерного белка (в моль-эквивалентах), вводимого субъекту, по сравнению с соответствующим ВР, не связанным сXTEN. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения режим введения терапевтически эффективной дозы привел к увеличению времени не менее чем в два раза, или не менее чем в три раза, или не менее чем в четыре раза, или не менее чем в пять раз, или не менее чем в шесть раз, или не менее чем в восемь раз, или не менее чем в 10 раз между двумя последовательными пиками Cmax и/или впадинамиCmin, содержания в крови химерного белка, по сравнению с соответствующим ВР, не входящим в состав химерного белка и вводимым субъекту с применением сопоставимого режима дозировки. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения не менее примерно 80%, не менее примерно 85%, не менее примерно 90%, не менее примерно 95%, или примерно 99% XTEN содержит мотивы, выбранные из одной или нескольких последовательностей, приведенных в табл. 1. В другом варианте воплощения настоящего изобретения XTEN демонстрирует не менее примерно 80%, или не менее примерно 90%, или не менее примерно 91%, или не менее примерно 92%, или не менее примерно 93%, или не менее примерно 94%, или не менее примерно 95%, или не менее примерно 96%, или не менее примерно 97%, или не менее примерно 98%, или не менее примерно 99%, или 100% идентичности своей последовательности, выбранной из табл. 2. В некоторых случаях XTEN повышает термостабильность биологически активного белка при присоединении к биологически активному белку, при этом термостабильность определяют измерением сохранения биологической активности после воздействия температуры примерно 37 С в течение не менее чем примерно 7 дней у биологически активного белка в сравнении с XTEN, присоединенным к биологически активному белку. В одном из вариантов вышеизложенных воплощений настоящего изобретения период сохранения биологической активности увеличивался на не менее чем примерно 50%, не менее чем примерно 60%, не менее чем примерно 70%, не менее чем примерно 80%, не менее чем примерно 90%, не менее чем примерно 100%, или примерно 150%, не менее чем примерно 200%, не менее чем примерно 300%, или примерно 500%, по сравнению с ВР, не связанными с XTEN-компонентом XTEN. С другой стороны, изобретение направлено на создание изолированных химерных белков, содержащих XTEN по любому из вышеизложенных воплощений, соединенных с биологически активным белком (ВР). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения ВР химерного белка демонстрирует не менее примерно 80%, или не менее примерно 90%, или не менее примерно 91%, или не менее примерно 92%, или не менее примерно 93%, или не менее примерно 94%, или не менее примерно 95%,или не менее примерно 96%, или не менее примерно 97%, или не менее примерно 98%, или не менее примерно 99%, или 100% идентичности своей последовательности таковой, выбранной из табл. 3-8. В другом варианте воплощения вышеизложенного изобретения изолированный химерный белок дополнительно содержит вторую последовательность XTEN, при этом сумма нарастающим итогом аминокислотных остатков в последовательности XTEN более чем от примерно 400 до примерно 3000 остатков. В некоторых случаях изолированный химерный белок с XTEN по одному из вышеизложенных воплощений содержит ВР, при этом ВР представлен пептидом, регулирующим уровень глюкозы. В одном из вариантов воплощения вышеизложенного изобретения пептид, регулирующий уровень глюкозы, является эксендином-4. В другом варианте воплощения вышеизложенного изобретения пептид, регулирующий уровень глюкозы, является глюкагоном. В других случаях изолированный химерный белок содержит ВР, при этом ВР является метаболически активным белком. В одном из вариантов воплощения вышеизложенного изобретения метаболически активный белок является IL-1ra. В других случаях изолированный химерный белок содержит ВР, при этом ВР является фактором свертывания крови. В одном из вариантов воплощения вышеизложенного изобретения фактор свертывания крови является фактором IX. В другом варианте воплощения вышеизложенного изобретения фактор свертывания крови является фактором VII. В других случаях изолированный химерный белок содержит ВР, при этом ВР является гормоном роста. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения изолированный химерный белок может быть менее иммуногенным, по сравнению с биологически активным белком, не соединенным с XTEN,-3 020843 при этом иммуногенность определяют измерением продукции антител IgG, селективно связывающихся с биологически активным белком после введения сопоставимых доз субъекту. Химерный белок, содержащий XTEN и ВР по вышеизложенным воплощениям, может содержать спейсерную последовательность между XTEN и ВР, при этом спейсерная последовательность включает от примерно 1 до примерно 50 аминокислотных остатков, которые необязательно составляют последовательность для расщепления. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения последовательность для расщепления чувствительна к расщеплению протеазой. Неограничивающие примеры такой протеазы включают фактор XIa, фактор XIIa, калликреин, фактор VIIa, фактор IXa, фактор Ха, тромбин,эластазу-2, гранзим В, ММР-12, ММР-13, ММР-17 или ММР-20, TEV, энтерокиназу, протеазу риновируса 3 С и сортазу А. В некоторых случаях химерный белок создан таким образом, что он имеет сниженную аффинность связывания с целевым рецептором соответствующего ВР, по сравнению с соответствующим ВР, не находящимся в составе химерного белка. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения химерный белок демонстрирует связывание с целевым рецептором ВР в диапазоне примерно 0,01-30%, или от примерно 0,1 до примерно 20%, или от примерно 1 до примерно 15%, или от примерно 2 до примерно 10% от способности к связыванию соответствующего ВР, не находящегося в составе химерного белка. В родственном воплощении настоящего изобретения химерный белок со сниженной аффинностью может иметь сниженный клиренс, опосредованный рецепторами, и соответственное увеличение периода полувыведения на не менее чем примерно 50%, или не менее чем примерно 60%, или не менее чем примерно 70%, или не менее чем примерно 80%, или не менее чем примерно 90%, или не менее чем примерно 100%, или не менее чем примерно 150%, или не менее чем примерно 200%, или не менее чем примерно 300%, или не менее чем примерно 500%, по сравнению с соответствующим ВР, не находящимся в составе химерного белка. В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение направлено на создание изолированного химерного белка, который демонстрирует не менее примерно 80%, или не менее примерно 90%, или не менее примерно 91%, или не менее примерно 92%, или не менее примерно 93%, или не менее примерно 94%, или не менее примерно 95%, или не менее примерно 96%, или не менее примерно 97%, или не менее примерно 98%, или не менее примерно 99%, или 100% идентичности своей последовательности таковой, выбранной из табл. 40-44. В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение направлено на создание композиций, содержащих химерный белок, при этом химерный белок включает по крайней мере первый ВР, содержащий последовательность, обладающую не менее чем примерно 80% идентичностью последовательности,или 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью последовательности относительно последовательности из любой из табл. 3-8, при этом ВР соединен с одним или несколькими удлиненными рекомбинантными полипептидами (XTEN), каждый из которых содержит более чем от примерно 100 до примерно 3000 аминокислотных остатков, предпочтительнее более чем от примерно 400 до примерно 3000 аминокислотных остатков, имеет в существенной степени неповторяющуюся последовательность, при этом суммарное содержание остатков глицина (G), аланина (А), серина(S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р) составляет более чем около 80%, или около 85%, или около 90%, или около 95%, или около 96%, или около 97%, или около 98%, или около 99% от всей аминокислотной последовательности XTEN. Компонент XTEN в составе BPXTEN может не содержать предсказанного эпитопа Т-клеток согласно анализу с использованием алгоритма TEPITOPE, при этом предсказание с помощью алгоритма TEPITOPE эпитопов в последовательности XTEN основано на выставлении оценки -7 или более, или -8 или более, или -9 или более. Компонент XTEN в составе BPXTEN может иметь последовательность более чем на 80%, или около 85%, или около 90%, или около 91%,или около 92%, или около 93%, или около 94%, или около 95%, или около 96%, или около 97%, или около 98%, или около 99% представляющую собой статистический клубок, согласно алгоритму GOR; и последовательность XTEN может содержать менее 2% альфа-спиралей и 2% бета-слоев, согласно алгоритму Чоу-Фасмана. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение направлено на создание химерных белков BPXTEN, при этом введенный субъекту BPXTEN вызывает увеличение терминального периода полувыведения для BPXTEN, по сравнению с соответствующим ВР, не находящимся в составе химерного белка, с увеличением терминального периода полувыведения не менее чем примерно в два раза, или не менее чем примерно в три раза, или не менее чем примерно в четыре раза, или не менее чем примерно в пять раз, или не менее чем примерно в шесть раз, или не менее чем примерно в семь раз, или не менее чем примерно в восемь раз, или не менее чем примерно в девять раз, или не менее чем примерно в десять раз, или не менее чем примерно в 15 раз, или не менее чем примерно в 20 раз или более, по сравнению с соответствующим ВР, не находящимся в составе химерного белка. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение направлено на создание химерных белков BPXTEN, при этом BPXTEN демонстрирует повышение растворимости не менее чем в три раза, или не менее чем примерно в четыре раза, или не менее чем примерно в пять раз, или не менее чем примерно в шесть раз, или не менее чем примерно в семь раз, или не менее чем примерно в восемь раз, или не ме-4 020843 нее чем примерно в девять раз, или не менее чем примерно в десять раз, или не менее чем примерно в 15 раз, или не менее чем в 20 раз, или не менее чем в 40 раз, или не менее чем в 60 раз в физиологических условиях, по сравнению с ВР, не находящимся в составе химерного белка. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения химерные белки BPXTEN демонстрируют повышенную кажущуюся молекулярную массу, согласно данным эксклюзионной хроматографии,по сравнению с фактической молекулярной массой, при этом кажущаяся молекулярная масса равна не менее чем примерно 100 кДа, или не менее чем примерно 150 кДа, или не менее чем примерно 200 кДа,или не менее чем примерно 300 кДа, или не менее чем примерно 400 кДа, или не менее чем примерно 500 кДа, или не менее чем примерно 600 кДа, или не менее чем примерно 700 кДа, при фактической молекулярной массе каждого ВР-компонента химерного белка менее чем примерно 25 кДа. Соответственно химерный белок BPXTEN может иметь кажущуюся молекулярную массу, которая примерно в 4 раза выше, или примерно в 5 раз выше, или примерно в 6 раз выше, или примерно в 7 раз выше, или примерно в 8 раз выше, чем фактическая молекулярная масса химерного белка. В некоторых случаях изолированный химерный белок по вышеизложенным воплощениям демонстрирует в физиологических условиях коэффициент кажущейся молекулярной массы более чем примерно 4, или примерно 5, или примерно,или примерно 7, или примерно 8. Настоящее изобретение направлено на создание BPXTEN с различными конфигурациями, при этом ВР сохраняет по крайней мере часть биологической активности соответствующего ВР, не связанного сXTEN. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения BPXTEN содержит ВР, связанный сXTEN в конфигурации согласно формуле I где независимо для каждого случая ВР является биологически активным белком, как описано выше;S является спейсерной последовательностью, включающей от 1 до примерно 50 аминокислотных остатков, которая может необязательно содержать последовательность для расщепления (как описано выше); х равен либо 0, либо 1; и XTEN является удлиненным рекомбинантным полипептидом (как описано в этом документе). Это воплощение имеет, в частности, полезность в случаях, когда ВР требует присутствия свободного N-конца для проявления требуемой биологической активности, или в случаях, когда присоединение С-конца ВР к химерному белку снижает биологическую активность и требуется снизить биологическую активность и/или побочные эффекты введенного BPXTEN. В другом варианте воплощения конфигурации BPXTEN настоящее изобретение направлено на создание химерного белка с конфигурацией по формуле II (компоненты те же, что описаны выше): Это воплощение, в частности, применимо в случаях, когда ВР требует присутствия свободного Сконца для проявления требуемой биологической активности, или в случаях, когда присоединение Nконца ВР к химерному белку снижает биологическую активность и требуется снизить биологическую активность и/или побочные эффекты введенного BPXTEN. С другой стороны, настоящее изобретение направлено на создание изолированных химерных белков BPXTEN, содержащих две молекула ВР и, необязательно, содержащих второй XTEN и/или спейсерную последовательность, при этом химерный белок имеет конфигурацию, выбранную из формулы III,формулы IV и формулы V: где независимо для каждого случая ВР является биологически активным белком, как описано выше;S является спейсерной последовательностью, включающей от 1 до примерно 50 аминокислотных остатков, которая необязательно содержит последовательность для расщепления; w равна либо 0, либо 1; х равен либо 0, либо 1; у равен либо 0, либо 1; z равна либо 0, либо 1; и XTEN является удлиненным рекомбинантным полипептидом (как описано в этом документе), при этом сумма нарастающим итогом аминокислотных остатков в XTEN более чем от 400 до примерно 3000. С другой стороны, настоящее изобретение направлено на создание изолированных химерных белков, содержащих одну молекулу ВР и две молекулы XTEN и, необязательно, одну или две спейсерные последовательности, при этом химерный белок имеет конфигурацию по формуле VI: где независимо для каждого случая ВР является биологически активным белком; S является спейсерной последовательностью, включающей от 1 до примерно 50 аминокислотных остатков, которая необязательно содержит последовательность для расщепления; w равна либо 0, либо 1; х равен либо 0, либо 1; у равен либо 0, либо 1; z равна либо 0, либо 1; и XTEN является удлиненным рекомбинантным полипептидом (как описано в этом документе), при этом сумма нарастающим итогом аминокислотных остатков в XTEN более чем от 400 до примерно 3000. Таким образом, химерный белок может быть создан с различными конфигурациями, в порядке следования от N- к С-концу, компонентов ВР, XTEN, необязательных спейсерных последовательностей, включая в качестве неограничивающих примеров XTEN-BP,-5 020843XTEN-BP-S-BP. Выбор конфигурации может, как описано в этом документе, придавать определенные фармакокинетические, физико-химические или фармакологические свойства. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения химерные белки BPXTEN по формулам I, II, III, IV или V, или VI,описанным выше, обладают биологической активностью, составляющей не менее примерно 40%, или не менее примерно 50%, или не менее примерно 60%, или не менее примерно 70%, или не менее примерно 80%, или не менее примерно 90%, или не менее примерно 95% от биологической активности ВР, не находящегося в составе химерного белка. В другом варианте воплощения настоящего изобретения химерные белки BPXTEN по формулам I, II, III, IV или V связываются с теми же рецепторами или лигандами,что и соответствующий исходный биологически активный белок, не связанный ковалентно с химерным белком. Настоящее изобретение направлено на создание изолированных нуклеиновых кислот, содержащих полинуклеотидную последовательность, выбранную из (а) полинуклеотида, кодирующего химерный белок по любому из вышеизложенных воплощений, или (б) полинуклеотида, комплементарного полинуклеотиду по пункту (а). В одном из вышеизложенных вариантов воплощения настоящего изобретения изолированная нуклеиновая кислота содержит полинуклеотидную последовательность, которая не менее чем на 80% идентична, или примерно на 85%, или не менее чем на примерно 90%, или примерно 91%,или примерно 92%, или примерно 93%, или примерно 94%, или примерно 95%, или примерно 96%, или примерно 97%, или примерно 98%, или от примерно 99 до примерно 100% идентична (а) полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, выбранный из табл. 40- 44; или (б) полинуклеотиду, комплементарному полинуклеотиду по пункту (а). Настоящее изобретение направлено на создание экспрессионных векторов, содержащих нуклеиновую кислоту по любому из воплощений, описанных выше в данном параграфе. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения вышеупомянутый экспрессионный вектор дополнительно содержит рекомбинантную регуляторную последовательность,присоединенную к полинуклеотидной последовательности таким образом, чтобы было возможно выполнение ее функций. В другом варианте воплощения настоящего изобретения полинуклеотидная последовательность вышеупомянутых экспрессионных векторов соединена в той же рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим сигнальную последовательность, определяющую секрецию, которая может быть прокариотической сигнальной последовательностью. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения сигнальная последовательность, определяющая секрецию, выбрана из сигнальных последовательностей OmpA, DsbA и PhoA. Настоящее изобретение направлено на создание клетки-хозяина, которая может содержать экспрессионный вектор, описанный в предшествующем параграфе. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения клетка-хозяин является прокариотической клеткой. В другом варианте воплощения настоящего изобретения клетка-хозяин является Е. coli. В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение направлено на создание фармацевтических композиций, содержащих химерный белок по любому из вышеизложенных воплощений и по крайней мере один фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание наборов, содержащих упаковочный материал и по крайней мере первый контейнер, содержащий фармацевтическую композицию по вышеизложенному воплощению и этикетку с указанием фармацевтической композиции и условий хранения и использования и лист с инструкциями по восстановлению и /или введению фармацевтических композиций пациенту. Настоящее изобретение дополнительно направлено на применение фармацевтических композиций,содержащих химерный белок по любому из вышеизложенных воплощений, в приготовлении лекарственного средства для лечения болезненных состояний у субъекта, нуждающегося в таком лечении. В одном из вышеизложенных вариантов воплощения настоящего изобретения заболевание, нарушение или состояние, предусматривающее введение описанной выше фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в этом. В одном из вышеизложенных вариантов воплощения настоящего изобретения заболевание, нарушение или состояние выбрано из диабета 1 типа, диабета 2 типа, ожирения, гипергликемии,гиперинсулинемии, пониженной продукции инсулина, инсулинорезистентности, синдрома X, гибернирующего миокарда или диабетической кардиомиопатии, избыточного аппетита, недостаточного насыщения, нарушения обмена веществ, глюкагоном, синдрома поликистоза яичников, дислипидемии, гибернирующего миокарда, недостаточности экскреции натрия с мочой, повышенного содержания калия в моче,состояний или нарушений, ассоциированных с токсической гиперволемией, диабетической кардиомиопатией и нейродегенеративными процессами в сетчатке. В некоторых случаях фармацевтическая композиция может быть введена подкожно, внутримышечно или внутривенно. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения фармацевтическую композицию вводят в терапевтически эффективной дозе. В некоторых вышеизложенных случаях терапевтически эффективная доза приводит к увеличению времени нахождения в пределах терапевтического окна для химерного белка, по сравнению с соответствующим ВР, не находящимся в составе химерного белка и введенным субъекту в сопоставимой дозе. Увеличение времени нахождения в пределах терапевтического окна может происходить не менее чем в три раза, по сравнению с соответствующим ВР, не находящимся в составе химерного белка, или в каче-6 020843 стве альтернативы, не менее чем в четыре раза, или в пять раз, или в шесть раз, или в семь раз, или в восемь раз, или в девять раз, или не менее чем в 10 раз, или не менее чем в 20 раз, по сравнению с соответствующим ВР, не находящимся в составе химерного белка. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа лечения заболевания, нарушения или состояния, включающего введение фармацевтической композиции, описанной выше, субъекту с применением многократных последовательных доз фармацевтической композиции, введенной с применением режима терапевтически эффективной дозы. В одном из вышеизложенных вариантов воплощения настоящего изобретения режим введения терапевтически эффективной дозы может приводить к увеличению времени не менее чем в три раза, или в качестве альтернативы, не менее чем в четыре раза, или в пять раз, или в шесть раз, или в семь раз, или в восемь раз, или в девять раз, или не менее чем в 10 раз, или не менее чем в 20 раз между двумя последовательными пиками Cmax и/или впадинами Cmin содержания в крови химерного белка, по сравнению с соответствующим ВР химерного белка, не входящим в состав химерного белка и вводимым субъекту с сопоставимым режимом дозировки. В другом варианте вышеизложенного воплощения настоящего изобретения введение химерного белка приводит к сравнимому улучшению по крайней мере одного измеряемого параметра при применении менее частых дозировок или более низкой суммарной дозировки в молях химерного белка фармацевтической композиции, в сравнении с соответствующим(и) компонентом(ами) биологически активного белка, не входящего в состав химерного белка и вводимого субъекту с применением терапевтически эффективного режима. Параметр может быть выбран из содержания глюкозы натощак, пробы на переносимость перорального приема глюкозы, пикового изменения содержания послеобеденной глюкозы относительно исходного уровня, HA1c, потребляемой калорийности, насыщения, скорости опустошения желудка, секреции инсулина, периферической чувствительности к инсулину, ответа на введение инсулина,массы бета-клеток, массы тела, протромбинового времени, времени кровотечения, тромбинантитромбинового III комплекса (ТАТ), D-димера, частоты эпизодов кровотечения, скорости оседания эритроцитов (СОЭ), С-реактивного белка, плотности костей, мышечной массы, кровяного давления,триглицеридов плазмы, холестерина ЛВП, холестерина ЛНП, частоты заболевания ангиной и минутного сердечного выброса. С другой стороны, настоящее изобретение направлено на создание способа улучшения свойства биологически активного белка, включая стадию присоединения биологически активного белка к XTEN по любому из вышеизложенных воплощений для достижения свойства, отличающегося тем, что (а) терминальный период полувыведения биологически активного белка, соединенного с XTEN длиннее, в сравнении с терминальным периодом полувыведения биологически активного белка, не соединенного сXTEN; (б) срок годности биологически активного белка, соединенного с XTEN длиннее, в сравнении со сроком годности биологически активного белка, не соединенного с XTEN, при этом срок годности оценивают по сохранению биологической активности по прошествии определенного интервала времени по сравнению с образцом на исходном уровне; (в) растворимость в физиологических условиях биологически активного белка, соединенного с XTEN выше, в сравнении с растворимостью биологически активного белка, не соединенного с XTEN; (г) продукция антител IgG, селективно связывающих биологически активный белок, соединенный с XTEN, при введении субъекту снижена, в сравнении с продукцией IgG при введении субъекту биологически активного белка, не соединенного с XTEN, в сопоставимой дозе; и/или (д) время нахождения в пределах терапевтического окна биологически активного белка, соединенного с XTEN, при введении субъекту дольше, в сравнении с биологически активным белком, не соединенным с XTEN и введенным субъекту. Включение в качестве ссылок Все публикации, патенты и заявки на патент, указанные в данном описании изобретения, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы для каждой индивидуальной публикации, патента или заявки на патент было специфично и индивидуально указано, что она включена посредством ссылки. Краткое описание фигур Свойства и преимущества изобретения могут быть дополнительно объяснены с помощью ссылки на следующее детальное описание и сопутствующие фигуры, которые устанавливают далее иллюстративные воплощения. На фиг. 1 в схематическом виде представлены примеры химерного белка BPXTEN (фиг. 1A-G), все изображены в ориентации от N- к С-концу. На фиг. 1 А представлены две различные конфигурации химерных белков BPXTEN (100), каждый из которых включает один биологически активный белок (ВР) и один XTEN, и в первом из них молекула XTEN (102) присоединена к С-концу ВР (103), а во втором молекула XTEN присоединена к N-концу ВР (103). На фиг. 1 В представлены две различные конфигурации химерных белков BPXTEN (100), каждый из которых включает один ВР, одну спейсерную последовательность и один XTEN, и в первом из них молекула XTEN (102) присоединена к С-концу спейсерной последовательности (104) и спейсерная последовательность присоединена к С-концу ВР (103), а во втором - молекула XTEN присоединена к N-концу спейсерной последовательности (104) и спейсерная последовательность присоединена к N-концу ВР (103). На фиг. 1 С представлены две различные конфигу-7 020843 рации химерных белков BPXTEN (101), каждый из которых включает две одинаковые молекулы ВР и одну молекулу XTEN, и в первом из них молекула XTEN присоединена к С-концу первого ВР, а этот ВР присоединен к С-концу второго ВР, а во втором представлена противоположная ориентация, в которойXTEN присоединен к N-концу первого ВР, а этот ВР присоединен к N-концу второго ВР. На фиг. 1D представлены две различные конфигурации химерных белков BPXTEN (101), каждый из которых включает две одинаковые молекулы ВР, одну спейсерную последовательность и одну молекулу XTEN, и в первом из них молекула XTEN присоединена к С-концу спейсерной последовательности, спейсерная последовательность присоединена к С-концу первого ВР, который присоединен к С-концу второго ВР, а во втором представлена противоположная ориентация, в которой XTEN присоединен к N-концу спейсерной последовательности, спейсерная последовательность присоединена к N-концу первого ВР, а этот ВР присоединен к N-концу второго ВР. На фиг. 1E представлены две различные конфигурации химерных белков BPXTEN (101), каждый из которых включает две молекулы единичного ВР, одну спейсерную последовательность и одну молекулу XTEN, и в первом из них молекула XTEN присоединена к Сконцу первого ВР, первый ВР присоединен к С-концу спейсерной последовательности, которая присоединена к С-концу второй молекулы ВР, а во втором представлена противоположная конфигурация, в которой XTEN присоединена к N-концу первого ВР, который присоединен к N-концу спейсерной последовательности, которая, в свою очередь, присоединена к N-концу второй молекулы ВР. На фиг. 1F представлены две различные конфигурации химерных белков BPXTEN (105), каждый из которых включает две одинаковые молекулы ВР и две одинаковые молекулы XTEN, и в первом из них первая молекулаXTEN присоединена к С-концу первого ВР, который присоединен к С-концу второго XTEN, который присоединен к С-концу второй молекулы ВР, а во втором представлена противоположная конфигурация,в которой XTEN присоединена к N-концу первого ВР, который присоединен к N-концу второго XTEN,который присоединена к N-концу второй молекулы ВР. На фиг. 1G представлена конфигурация (106) из одного ВР с двумя XTEN, присоединенными к N- и С-концам ВР. На фиг. 2 представлены схематические изображения примеров полинуклеотидных конструкций(фиг. 2A-G) генов BPXTEN, которые кодируют соответствующие полипептиды BPXTEN, приведенные на фиг. 1; все изображены в ориентации от 5'- к 3'- концу. В этих иллюстративных примерах гены кодируют химерные белки BPXTEN с одним ВР и XTEN (100); или двумя ВР, одной спейсерной последовательностью и одним XTEN (201); двумя ВР и двумя XTEN (205) или одним ВР и двумя XTEN (206). На данных изображениях полинуклеотиды кодируют следующие компоненты: аминокислотные последовательности XTEN (202), ВР (203) и спейсера, который может включать последовательность для расщепления (204), причем все последовательность соединены в одной рамке считывания. На фиг. 3 представлено схематическое изображение примера мономерного BPXTEN, на который действует присутствующая эндогенно протеаза, и иллюстрация способности мономерного химерного белка или продуктов реакции связываться целевым рецептором на поверхности клетки с последующей передачей сигнала в клетку. На фиг. 3 А представлен химерный белок BPXTEN (101), в котором ВР (103) и XTEN (102) соединены спейсерной последовательностью, содержащей последовательность для расщепления (104), причем последняя чувствительна к протеазе ММР-13 (105). На фиг. 3 В показаны продукты реакции свободного ВР, спейсерной последовательности и XTEN. На фиг. 3 С представлено взаимодействие продуктов реакции свободного ВР (103) или химерного белка BPXTEN (101) с целевыми рецепторами (106) к ВР на поверхности клетки (107). В этом случае необходимое связывание с рецептором происходит, когда у ВР имеется свободный С-конец, что очевидно из связывания свободного ВР (103) с рецептором, в то время как нерасщепленный химерный белок не связывается с рецептором прочно. На фиг. 3D демонстрируется, что свободный ВР (103), с высокой аффинностью связывания, остается связанным с рецептором (106), в то время как интактный BPXTEN (101) диссоциирует от рецептора. На фиг. 3 Е показан связанный ВР, который был интернализирован в эндосому (108) внутри клетки (107), что иллюстрирует опосредованный рецептором клиренс связанного ВР и запуск сигналинга (109), изображенного в виде точек в цитоплазме. На фиг. 4 представлена блок-схема характерных стадий сборки, производства и оценки XTEN. На фиг. 5 представлена блок-схема характерных стадий сборки полинуклеотидной конструкции BPXTEN, кодирующей химерный белок. Индивидуальные олигонуклеотиды 501 отжигают в мотивы последовательностей 502, такие как мотив для кодирования 12 аминокислот ("12-мер"), которые далее лигируют с олигонуклеотидом, содержащим сайты рестрикции для BbsI и KpnI 503. Дополнительные мотивы последовательностей из библиотеки отжигают с 12-мером до достижения необходимой длины генаXTEN 504. Ген XTEN клонируют в вектор с "лишним" фрагментом. Вектор кодирует Flagпоследовательность 506, за которой следуют последовательность со стоп-кодоном, фланкированная сайтами для BsaI, BbsI и KpnI 507, и ген эксендина-4 508, что в результате дает ген 500, кодирующий химеру BP-XTEN для внедрения в комбинацию BPXTEN. На фиг. 6 представлена блок-схема характерных стадий сборки гена, кодирующего химерный белок, содержащий биологически активный белок (ВР) и XTEN, его экспрессии и извлечения в виде химерного белка и его оценки в качестве кандидатного продукта BPXTEN. На фиг. 7 схематически представлено конструирование экспрессионных векторов IL-lraXTEN с применением различных технологических стратегий. На фиг. 7 А представлен экспрессионный вектор,кодирующий XTEN, присоединенный к 3'-концу последовательности, кодирующей биологически активный белок IL-1ra. Обратите внимание, что для данного вектора не требуется присутствие дополнительных лидерных последовательностей. На фиг. 7 В изображен экспрессионный вектор, кодирующий XTEN,присоединенный к 5'-концу последовательности, кодирующей IL-1ra с лидерной последовательностьюCBD и сайтом для расщепления протеазой TEV. На фиг. 7 С изображен тот же экспрессионный вектор,что и на фиг. 7 В, в котором сайты CBD и процессинга TEV были заменены на оптимизированную Nконцевую лидерную последовательность (NTS). На фиг. 7D изображен экспрессионный вектор, содержащий последовательность, кодирующую NTS, XTEN, последовательность, кодирующую IL-1ra, а затем- вторую последовательность, кодирующую XTEN. На фиг. 8 представлены результаты анализа экспрессии для указанных конструкций, включающих последовательности GFP и XTEN. Экспрессирующие культуры анализировали с применением флуоресцентного спектрофотометра для прочтения многолуночных планшетов (возбуждение при 395 нм, испускание при 510 нм) с целью определения количества присутствующего репортерного белка GFP. Результаты, представленные в виде диаграммы "ящик с усами", показывают, что в то время как медианные уровни экспрессии были приближенно равны половине от уровней экспрессии "эталонного" N-концевого вспомогательного домена CBD, самые удачные клоны из библиотек были намного ближе к эталонам,свидетельствуя о том, что дальнейшая оптимизация вокруг этих последовательностей была оправданна. Результаты также демонстрируют, что библиотеки, начинающиеся с аминокислот МА, имели лучший уровень экспрессии, чем таковые, начинающиеся с ME (см. пример 14). На фиг. 9 представлены три рандомизированные библиотеки, использованные для третьего и четвертого кодонов в N-концевых последовательностях клонов из LCW546, LCW547 и LCW552. Были сконструированы библиотеки с третьим и четвертым остатками, модифицированные таким образом, чтобы в этих позициях присутствовали все комбинации приемлемых кодонов XTEN, как указано. С целью включения всех приемлемых кодонов XTEN для каждой библиотеки были сконструированы девять пар олигонуклеотидов, кодирующих 12 аминокислот, которые имели различные кодоны для третьего и четвертого остатков и были отожжены и лигированы в вектор с "лишним" фрагментом pCW0551 после его расщепления ферментами рестрикции NdeI/BsaI (Stuffer-XTENAM875-GFP), а затем трансформированы в компетентные клетки Е. coli BL21Gold(DE3) для получения клонов трех библиотек LCW0569 (последовательности ID1708 и 1709), LCW0570 (последовательности ID1710 и 1711) и LCW0571(последовательности ID1712 и 1713). На фиг. 10 представлена гистограмма повторного испытания 75 клонов, показавших наилучший результат, после этапа оптимизации, проведенного как описано в примере 15 для флуоресцентного сигналаGFP, в сравнении с эталонной конструкцией CBDAM875. Результаты свидетельствовали, что несколько клонов теперь показывали результат лучше, чем эталонные клоны, как видно из фиг. 10. На фиг. 11 представлена схема комбинаторного подхода, примененного для объединения предпочтений по оптимизации кодонов для двух областей N-концевых 48 аминокислот. С помощью данного подхода были созданы новые 48-меры на N-концах белка XTEN для оценки оптимизации экспрессии, и это привело к образованию лидерных последовательностей, что может быть решением для экспрессии белков XTEN в случаях, когда XTEN расположен со стороны N-конца ВР. На фиг. 12 представлен гель ДСН-ПААГ, подтверждающий экспрессию в предпочтительных клонах, полученных в ходе экспериментов по оптимизации N-концевых кодонов XTEN, в сравнении с эталонными клонами с XTEN, содержащим лидерные последовательности CBD на N-концах последовательностей конструкций. На фиг. 13 представлен гель ДСН-ПААГ с образцами, полученными в ходе испытаний стабильности химерного белка XTENAE864, соединенного с N-концом GFP (см. пример 21). GFP-XTEN инкубировали в плазме яванского макака и лизате клеток почки крысы в течение периода до 7 дней при 37 С. Кроме того, оценивали GFP-XTEN, введенный яванским макакам. Образцы отбирали во временных точках 0, 1 и 7 дней и анализировали ДСН-ПААГ с последующей детекцией с применением вестерн-анализа и детекции антителами против GFP. На фиг. 14 представлены два образца 2 и 10 мкг готового очищенного белка IL-1ra, сшитого сXTENAE864, подвергнутые невосстанавливающему ДСН-ПААГ, как описано в примере 23. Результаты демонстрируют, что композиция IL-1raXTEN была извлечена в ходе этого процесса, и имеет примерную молекулярную массу около 160 кДа. На фиг. 15 представлен результат типичного анализа методом эксклюзионной хроматографии, проведенного как описано в примере 23. Калибровочные стандарты, указанные пунктирной линией, включают маркеры тироглобулин (70 кДа), бычий гамма-глобулин (158 кДа), овальбумин куриного яйца (44 кДа), миоглобин лошади (17 кДа) и витамин В 12 (1,35 кДа). Содержащий компоненту BPXTEN химерный белок, представленный IL-1ra, сшитым с XTENAM875, обозначен сплошной линией. Данные показывают, что кажущаяся молекулярная масса конструкции BPXTEN существенно выше, чем ожидается для глобулярного белка (что видно при сравнении со стандартными белками, разделенными в ходе того же анализа), и конструкция имеет кажущуюся молекулярную массу существенно выше, чем определяет-9 020843 ся ДСН-ПААГ (данные не приведены). На фиг. 16 представлен обращенно-фазовый анализ с С 18 очищенного IL-1raXTENAM875. Результат, выраженный в поглощении относительно времени, демонстрирует чистоту готового продукта химерного белка. На фиг. 17 представлены результаты анализа связывания с рецептором IL-1, показанные на графике как функция концентрации IL-1ra-XTENAM875 или IL-1ra с получением изотермы связывания. Для оценки аффинности связывания каждого химерного белка с рецептором IL-1 данные по связыванию были выровнены по сигмоидальной кривой доза-ответ. В результате выравнивания данных определили ЕС 50 (концентрацию IL-1ra или IL-1ra-XTEN, при которой сигнал равен половине от максимального) для каждой конструкции, как описано в примере 23. Использованная в качестве негативного контроля конструкция XTENAM875-hGH показала отсутствие связывания в условиях эксперимента. На фиг. 18 показан полученный в ходе изучения термостабильности ДСН-ПААГ, на котором проведено сравнение IL-1ra с BPXTEN, представленным IL-1ra, сшитым с XTENAM875, как описано в примере 23. Образцы IL-1ra и IL-1ra, сшитого с XTEN, инкубировали при 25 и 85 С в течение 15 мин,после чего все нерастворимые белки быстро удаляли центрифугированием. После этого растворимую фракцию анализировали ДСН-ПААГ, как показано на фиг. 18, и показали, что только IL-1ra-XTEN оставался растворимым после нагревания, в противоположность ему, рекомбинантный IL-1ra (без XTEN в качестве партнера для сшивки) полностью осаждался после нагревания. На фиг. 19 представлены результаты анализа связывания с рецептором IL-1ra, проведенного на образцах, показанных на фиг. 19. Как описано в примере 23, рекомбинантный IL-1ra, который был полностью денатурирован при тепловой обработке, сохранял менее 0,1% своей активности связывания с рецептором после тепловой обработки. Однако IL-1ra, сшитый с XTEN, сохранял приблизительно 40% своей активности связывания с рецептором. На фиг. 20 представлен фармакокинетический профиль (концентрации в плазме) после однократных доз подкожно для трех различных композиций BPXTEN, представленных IL-1ra, сшитым с различными последовательностями XTEN, которые по раздельности вводили подкожно яванским макакам, как описано в примере 24. На фиг. 21 представлены результаты измерения массы тела в ходе фармакодинамических и метаболических испытаний с применением комбинации из двух химерных белков; т.е, эффективность комбинации глюкагона, сшитого с Y288 (Gcg-XTEN), и эксендина-4, сшитого с АЕ 864 (Ex4-XTEN), в индуцированной диетой модели ожирения у мышей (см. описание эксперимента в примере 26). Диаграмма демонстрирует изменение массы тела у мышей с индуцированным диетой ожирением в течение 28 дней непрерывного введения лекарственного средства. Представленные значения представляют собой среднее +/стандартная ошибка среднего для 10 животных на группу (20 животных в группе, которой вводили плацебо). На фиг. 22 представлены результаты измерения содержания глюкозы натощак в ходе фармакодинамических и метаболических испытаний с применением одиночных химерных белков и комбинаций из двух химерных белков BPXTEN; т.е, глюкагона, сшитого с Y288 (Gcg-XTEN), и эксендина-4, сшитого с АЕ 864 (Ex4-XTEN), в индуцированной диетой модели ожирения у мышей (см. описание эксперимента в примере 26). Группы были следующими: Гр. 1 Носитель Трис; Гр. 2 Ех 4-АЕ 576, 10 мг/кг; Гр. 3 Ех 4 АЕ 576, 20 мг/кг, Гр. 4 Носитель, 50% ДМСО; Гр. 5 Эксенатид, 30 мкг/кг/день; Гр. 6 Эксенатид, 30 мкл/кг/день + Gcg-Y288 20 мкг/кг; Гр. 7 Gcg-Y288,20 мкг/кг; Гр. 8 Gcg-Y288,40 мкг/кг; Гр. 9 Ех 4-АЕ 576 10 мг/кг + Gcg-Y288 20 мкг/кг; Гр. 10 Gcg-Y288 40 мкг/кг + Ех 4-АЕ 576 20 мг/кг. Диаграмма демонстрирует изменение содержания глюкозы в крови натощак у мышей с индуцированным диетой ожирением в течение 28 дней непрерывного введения лекарственного средства. Представленные значения представляют собой среднее +/-стандартная ошибка среднего для 10 животных на группу (20 животных в группе,которой вводили плацебо). На фиг. 23 представлен фармакокинетический профиль (концентрации в плазме) у яванских макаков после однократных доз различных композиций GFP, сшитого с неструктурированными полипептидами различной длины, вводимыми либо подкожно, либо внутривенно, как описано в примере 20. Композиции были представлены GFP-L288, GFP-L576, GFP-XTEN-AF576, GFP-Y576 и XTENAD836-GFP. Образцы крови анализировали через различные временные интервалы после инъекции и измеряли концентрацию GFP в плазме с помощью метода ELISA, применяя поликлональные антитела против GFP для улавливания и биотинилированные препараты тех же поликлональных антител для детекции. Результаты представлены в виде зависимости концентрации в плазме от времени (ч) после введения дозы и демонстрируют, в частности, существенное повышение периода полувыведения у XTENAD836-GFP, композиции с самой длинной последовательностью XTEN. Конструкция с самой короткой последовательностью,GFP-L288, имела самый короткий период полувыведения. На фиг. 24 представлен спектр кругового дихроизма в ближней УФ-области спектра для Ex4XTENAE864, полученный как описано в примере 30. На фиг. 25 представлены результаты по фармакокинетике Ех 4-АЕ 864, введенного яванским макакам подкожно и внутривенно (см. описание эксперимента в примере 27). На фиг. 26 представлены ре- 10020843 зультаты аллометрического масштабирования по предсказанию ответа человека на Ex4-XTENAE864 на основании экспериментальных результатов, полученных для животных, т.е. мышей, крыс, яванских макаков и собак. На фиг. 26 А представлена зависимость показателей терминального периода полувыведения от массы тела, с предсказанным Т 1/2 для человека равным 139 ч. Фиг. 26 В представлена зависимость показателей клиренса лекарственного средства от массы тела, с предсказанной скоростью клиренса для человека, равной 30 мл/ч. На фиг. 26 С представлена зависимость показателей объма распределения от массы тела, с предсказанным значением для человека равным 5970 мл. На фиг. 27 представлены результаты анализа in vitro на культуре клеток активности глюкагона, со сравнением глюкагона и глюкагона, сшитого с Y288 (см. описание эксперимента в примере 31). На фиг. 28 представлены результаты анализа in vitro на культуре клеток активности GLP-1, со сравнением эксендина-4 из двух коммерческих источников (закрашенные треугольники) и эксендина-4, сшитого с Y288 (закрашенные квадраты), при использовании необработанных клеток (закрашенные ромбы) в качестве негативного контроля (см. описание эксперимента в примере 31). ЕС 50 указана пунктирной линией. На фиг. 29 демонстрируется влияние тепловой обработки на стабильность hGH и AM864-hGH. На фиг. 29 А представлен гель ДСН-ПААГ для двух препаратов, обработанных при 25 и 80 С в течение 15 мин, а на фиг. 29 В представлено в процентах соответствующее значение активности связывания с рецептором для образца, обработанного при 80 С относительно образца, обработанного при 25 С. На фиг. 30 представлены результаты анализа аффинности связывания in vitro hGH-АМ 864 (кружки) и AM864-hGH (перевернутые треугольники) с hGHR-Fc. Немодифицированный рекомбинантный hGH(квадраты) показан для сравнения. На фиг. 31 представлены результаты анализа аффинности связывания in vitro химерного белка гормона роста с последовательностями XTEN, присоединенными к N- и С-концам hGH, в сравнении с немодифицированным hGH, связанным с hGHR-Fc. Кажущиеся значения ЕС 50 для каждого соединения приведены для AE912hGHAE144 (кружки) и немодифицированного рекомбинантного hGH (квадраты). На фиг. 32 представлены фармакокинетические данные для четырех химерных белков hGH BTXEN,введенных крысам подкожно, в сравнении с немодифицированным рекомбинантным hGH. На фиг. 33 представлены профили распределения концентрации для трех конструкций hGH XTEN после подкожного введения яванским макакам. На фиг. 34 показаны эффекты введения hGH или AM864-hGH в указанных дозах на массу тела в модели крыс с гипофизэктомией. Результаты демонстрируют сохранение биологической активности конструкций BPXTEN, эквивалентной по эффективности таковой hGH, но при менее частых введениях дозы. На фиг. 35 показаны сравнительные эффекты введения плацебо, hGH и AM864-hGH на рост хряща в большеберцовой эпифизарной пластинке в модели крыс с гипофизэктомией, продемонстрированные на гистологических поперечных срезах большой берцовой кости через 9 дней лечения (группы были теми же, что на фиг. 34). На фиг. 36 в схематическом виде представлены примеры FIX и химерных белков FIX-XTEN. На фиг. 36 А показана доменная архитектура нативного FIX с гамма-карбоксиглутаматным доменом, доменами EGF1 и EGF2, активационным пептидом и протеазным доменом. Стрелки указывают сайты расщепления в составе домена активационного пептида. На фиг. 36 В показана молекула FIX с полипептидомXTEN, присоединенным к С-концу, и указан сайт протеолитического расщепления с высвобождениемXTEN. На фиг. 37 приведены несколько примеров конфигураций FIX-XTEN и ассоциированных сайтов расщепления протеазами. На фиг. 37 А представлен FIX-XTEN с двумя сайтами протеолитического расщепления (стрелки), расположенными в пределах XTEN, проксимально относительно FIX-компонента химерного белка. На фиг. 37 В представлен FIX-XTEN, который может быть активирован автокаталитически, с высвобождением XTEN. На фиг. 37 С представлены конфигурации FIX-XTEN, при этом XTEN интегрирован между различными доменами FIX. На фиг. 37D представлен FIX-XTEN, при этом XTENчасть внедрена в активационный пептид, в результате чего XTEN высвобождается при протеолитической активации FIX. На фиг. 37 Е представлен FIX-XTEN, содержащий множественные последовательностиXTEN, внедренные между различными доменами. На фиг. 37F представлен FIX-XTEN, при этом XTEN внедрен внутри домена FIX. На фиг. 37G представлен FIX-XTEN, при этом XTEN присоединен к Сконцу FIX и содержит множественные сайты расщепления в области N-конца XTEN. На фиг. 38 приведена схема высвобождения XTEN из FIX-XTEN. FIX-XTEN с ассоциированнымXTEN обладает повышенным периодом полувыведения, но является в основном неактивной пролекарственной формой. После протеолитического расщепления по сайтам высвобождения XTEN (стрелки) компонент FIX может быть активирован коагуляционным каскадом, но имеет короткий период полувыведения. На фиг. 39 приведена схема коагуляционного каскада, демонстрирующая внешний и внутренний пути. На фиг. 40 продемонстрирована стратегия подхода к разработке FIX-XTEN с применением распо- 11020843 ложения экзона в гене, кодирующем FIX, с примерами сайтов для вставки XTEN между границами экзонов, указанных стрелками. На фиг. 41 А приведена схема трех типичных конструкций FIX-XTEN: AC296, АС 299 и АС 300. Стрелками в последовательности FIX указан сайт активации FIX. Дополнительная стрелка в АС 299 и АС 300 указывает сайт высвобождения XTEN. На фиг. 41 В представлен вестерн-блот белков АС 296,АС 299 и АС 300 после обработки тромбином, на котором видно, в обведенной окружностью области, чтоFIX был высвобожден от остатка XTEN, и находится в позиции, схожей с таковой позитивного контроляFIX с левой стороны вестерн-блота. На фиг. 42 схематически представлено конструирование экспрессионного вектора pCW0590 для FIX-XTEN содержащего ген FIX-XTEN. На фиг. 43 А приведена схема полипептидной цепи непроцессированного FIX, которая является продуктом экспрессии, и полипептидная цепь зрелого FIX, после посттрансляционного расщепления в области N-конца, которое происходит во время секреции FIX. На фиг. 8 В представлена вспомогательная схема FIXa, демонстрирующая порядковые номера остатков удаленного активационного пептида в непроцессированной и зрелой формах. На фиг. 44 представлена схема, демонстрирующая последовательность FIX-XTEN - конструкцииFIX-CFXIa-AG864 (последовательность ID : 1819), расщепление пре-FXIa и фрагменты 1, 2, 3 и 4 (последовательности ID1820-1823, соответственно, в порядке появления), образующиеся после протеолитического расщепления и активации до FIXa. На фиг. 45 представлен график результатов количественного определения FVII, с профилями реакции для различных концентраций стандартов FVII и профилем реакции FVII-XTEN. Результаты количественного определения FVII-XTEN приведены в табл. под графиком. На фиг. 46 представлена карта плазмиды экспрессионного вектора pCW0590, содержащего генFVII-XTEN. На фиг. 47 показаны результаты анализа методом эксклюзионной хроматографии образцов конструкции глюкагон-XTEN в сравнении со стандартами белков с известной молекулярной массой, с графическим представлением результатов в виде зависимости поглощения от объема удерживания. Конструкции глюкагон-XTEN представляют собой 1) глюкагон-Y288; 2) глюкагон-Y144; 3) глюкагон-Y72 и 4) глюкагон-Y36. Результаты демонстрируют повышение кажущейся молекулярной массы с увеличением длины остатка XTEN. Детальное описание изобретения Перед описанием воплощений настоящего изобретения необходимо дать пояснение, что такие воплощения приводятся только в качестве примеров, и что при практическом применении изобретения могут быть использованы различные воплощения, альтернативные воплощениям изобретения, описанным в этом документе. Различные модификации, изменения и замены будут понятными для специалиста в данной области, не выходя из сферы и области применения настоящего изобретения. Если не указано иначе, все технические и научные термины, использованные в этом документе,имеют те же значения, что являются общепринятыми в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения возможно применение способов и материалов, схожих или эквивалентных описываемым в этом документе, пригодные способы и материалы описаны ниже. В случае возникновения конфликтов в качестве контроля будет служить описание изобретения патента, включая определения. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не являются ограничивающими. Различные модификации, изменения и замены будут понятными для специалиста в данной области, не выходя из сферы и области применения настоящего изобретения. Определения При использовании в этом документе, следующие термины имеют приписываемые им значения, если не указано иное. При использовании в описании изобретения и формуле изобретения формы единственного числа включают соответствующие формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Например, термин "клетка" включает множество клеток, а также их смеси. Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в этом документе как взаимозаменяемые и относятся к полимерам аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, может включать модифицированные аминокислоты и может прерываться остатками, не относящимися к аминокислотам. Термины также относятся к полимеру аминокислот, который был модифицирован, например, в результате образования дисульфидных связей, гликозилирования, присоединения липидов, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой манипуляции, такой как конъюгация с компонентом, выступающим в качестве метки. При использовании в этом документе термин "аминокислота" относится к природным и/или не природным, или синтетическим, аминокислотам, включая в качестве неограничивающих примеров глицин и оптические D- и L-изомеры, а также аналоги аминокислот и пептидомиметики. Для обозначения аминокислот используются стандартные однобуквенные или трехбуквенные сокращения. Термин "природная L-аминокислота" означает оптические L-изомерные формы глицина (G), про- 12020843 лина (Р), аланина (А), валина (V), лейцина (L), изолейцина (I), метионина (М), цистеина (С), фенилаланина (F), тирозина (Y), триптофана (W), гистидина (Н), лизина (K), аргинина (R), глутамина (Q), аспарагина (N), глутаминовой кислоты (Е), аспарагиновой кислоты (D), серина (S) и треонина (Т). Термин "не природного происхождения", применительно к последовательностям при использовании в этом документе, означает полипептидные или полинуклеотидные последовательности, которые не имеют копий среди последовательностей дикого типа, или природного происхождения, обнаруженных у млекопитающих, не комплементарны им и не обладают высокой степенью гомологии с ними. Например,полипептид не природного происхождения может иметь не более 9, 98, 95, 90, 80, 70, 60, 50% или даже менее идентичности аминокислотной последовательности относительно природной последовательности,при их соответствующем выравнивании. Термины "гидрофильный" и "гидрофобный" относятся к степени аффинности субстанции в отношении воды. Гидрофильная субстанция обладает сильной аффинностью к воде, проявляя склонность растворяться в воде, смешиваться с водой или смачиваться водой, в то время как гидрофобная субстанция в значительной мере лишена аффинности к воде, имея склонность отталкивать и не впитывать воду и проявляя склонность не растворяться в воде, или не смешиваться с водой или не смачиваться водой. Аминокислоты могут быть охарактеризованы на основании их гидрофобности. Было разработано несколько шкал. В качестве примера может служить шкала, разработанная Levitt M. et al., J Mol Biol (1976) 104:59, которая приведена в перечне в Норр, ТР et al., Proc Natl Acad Sci USA (1981) 78:3824. Примерами"гидрофильных аминокислот" являются аргинин, лизин, треонин, аланин, аспарагин и глутамин. Особый интерес представляют гидрофильные аминокислоты аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота и серин и глицин. Примерами "гидрофобных аминокислот" являются триптофан, тирозин, фенилаланин, метионин, лейцин, изолейцин и валин."Фрагментом" называется укороченная форма нативного биологически активного белка, которая сохраняет по крайней мере часть терапевтической и/или биологической активности. "Вариантом" называется белок с последовательностью, гомологичной нативному биологически активному белку, который сохраняет по крайней мере часть терапевтической и/или биологической активности биологически активного белка. Например, вариантный белок может быть не менее чем на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен по аминокислотной последовательности референсному биологически активному белку. При использовании в этом документе термин "остаток биологически активного белка" включает белки,модифицированные преднамеренно, например, путем сайт-направленного мутагенеза, инсерций, или посредством случайных мутаций."Клетка-хозяин" относится к индивидуальной клетке или культуре клеток, которые могут служить или служили реципиентом для рассматриваемых векторов. Клетки-хозяева включают потомков единичной клетки-хозяина. Потомки не обязательно являются полностью идентичными (по морфологии или по геномной ДНК полного хромосомного набора) исходной родительской клетке, вследствие естественных,случайных или преднамеренных мутаций. Клетка-хозяин включает клетки, трансфецированные m vivo вектором по настоящему изобретению. "Изолированный", при использовании для описания различных полипептидов, описанных здесь, означает полипептид, которые был идентифицирован и выделен и/или извлечен из компонента его природного окружения. Загрязняющими компонентами его природного окружения являются материалы, которые в типичном случае препятствовали бы диагностическим или терапевтическим применениям полипептида, и которые могут включать ферменты, гормоны и другие растворенные вещества белковой или небелковой природы. Как очевидно для специалиста в данной области, полинуклеотид, пептид, полипептид, белок, антитело или их фрагменты не природного происхождения не требуют проведения "изолирования", в отличие от их аналогов природного происхождения. Кроме того, "концентрированный", "выделенный" или "разбавленный" полинуклеотид, пептид, полипептид,белок, антитело или их фрагменты отличаются от их аналогов природного происхождения тем, что их концентрация или количество молекул на единицу объема обычно выше, чем таковые и аналогов природного происхождения. В общем случае, полипептид, полученный рекомбинантными методами и экспрессированный в клетке-хозяине, считается "изолированным"."Изолированный" полинуклеотид или кодирующая полипептид нуклеиновая кислота или другая кодирующая полипептид нуклеиновая кислота является молекулой нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в природном источнике кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты. Молекула изолированной кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты находится в форме или окружении, отличных от тех, которые характерны для нее в природе. Следовательно, молекулы изолированной кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты отличны от специфичных молекул кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты, существующих в природных клетках. Однако молекула изолированной кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты включает молекулы кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты, содержащиеся в клетках, которые обычно экспрессируют полипептид, при этом, например, молекула нуклеиновой кислоты имеет хромосомное или экстрахромосомное расположение, отличное от такового в природных клетках."Химерный" белок содержит по крайней мере один сшитый полипептид, включающий участки в положении последовательности, отличном от того, что встречается в природе. Эти участки могут в норме присутствовать в разных белках и быть соединены вместе в химерном полипептиде; или они могут в норме присутствовать в одном и том же белке, но им может быть придано новое расположение в химерном полипептиде. Химерный бело может быть создан, например, с применением химического синтеза,или путем создания и трансляции полинуклеотида, в котором участки пептида закодированы в требуемом соотношении. "Конъюгированный", "присоединенный", "сшитый", "сшивка" используются в этом документе как взаимозаменяемые. Эти термины относятся к соединению вместе двух или более химических элементов или компонентов любым способом, включая химическую конъюгацию или рекомбинантный способ. Например, промотор или энхансер, функционально присоединенный к кодирующей последовательности, если он оказывает влияние на транскрипцию последовательности. В общем смысле,"функционально присоединенный" означает, что соединенные последовательности ДНК расположены рядом друг с другом и находятся в одной рамке считывания. "Сшивка в одной рамке считывания" относится к соединению двух или более открытых рамок считывания (ОРС) с образованием непрерывной более длинной ОРС таким образом, что в ней сохраняется правильная рамка считывания исходных ОРС. Таким образом, образующийся рекомбинантный химерный белок является единичным белком, содержащим два или более сегмента, которые соответствуют полипептидам, кодируемым исходными ОРС (при этом данные сегменты в норме не соединены таким образом в природе). В контексте полипептидов, "линейная последовательность" или "последовательность" -это порядок расположения аминокислот полипептиде в направлении от амино - к карбоксильному концу, в котором остатки, соседствующие друг с другом в последовательности, являются смежными в первичной структуре полипептида. "Частичной последовательностью" называют линейную последовательность части полипептида, про которую известно, что она содержит дополнительные остатки в одном или обоих направлениях."Гетерологичный" означает происходящий от объекта, генотипически отличного от того объекта, с которым происходит сравнение. Например, глицин-богатая последовательность, извлеченная из природной кодирующей ее последовательности и функционально присоединенная к кодирующей последовательности, отличной от природной последовательности, является гетерологичной глицин-богатой последовательностью. Термин "гетерологичный" применительно к полинуклеотиду, полипептиду означает,что полинуклеотид или полипептид происходит от объекта, генотипически отличного от того объекта, с которым происходит сравнение. Термины "полинуклеотиды", "нуклеиновые кислоты", "нуклеотиды" и"олигонуклеотиды" применяются как взаимозаменяемые. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, как дезоксирибонуклеотидов, так и рибонуклеотидов, или их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут выполнять любую функцию, известную или не известную. Неограничивающими примерами полинуклеотидов могут служить: кодирующие или некодирующие области гена или фрагмента гена, локусы (локус), определенные в ходе анализа сцепления, экзоны, интроны, матричная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомная РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированная ДНК с любой последовательностью, изолированная РНК с любой последовательностью, зонды на основе нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. В случае их присутствия модификации структуры нуклеотидов могут вноситься до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может прерываться компонентами не нуклеотидной природы. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с метящим компонентом. Термин "комплементарный полинуклеотиду" обозначает полинуклеотидную молекулу, имеющую комплементарную последовательность оснований и обратную ориентацию относительно референсной последовательности, которая может гибридизоватъся с референсной последовательностью в совершенный дуплекс."Рекомбинантный" применительно к полинуклеотиду означает, что полинуклеотид является продуктом различных комбинаций этапов in vitro клонирования, рестрикции и/или лигирования и других методик, которые приводят к образованию конструкции, которая потенциально может быть экспрессирована в клетке-хозяине. Термины "ген" или "фрагмент гена" используются в этом документе как взаимозаменяемые. Они относятся к полинуклеотиду, содержащему не менее одной открытой рамки считывания, который способен кодировать определенный белок после его транскрипции и трансляции. Ген или фрагмент гена может быть представлен геномной ДНК или кДНК, если полинуклеотид содержит не менее одной открытой рамки считывания, которая может захватывать целую кодирующую область или ее сегмент. "Химерный ген" - это ген, составленный из не менее чем двух гетерологичных полинуклеотидов, соединенных друг с другом."Гомология" или "гомологичный" относится к сходству последовательностей или взаимозаменяемости двух или более полинуклеотидных последовательностей или двух или более полипептидных последовательностей. При использовании программ, таких как BestFit, для определения идентичности последовательностей, сходства или гомологии между двумя различными аминокислотными последова- 14020843 тельностями, могут быть использованы установки по умолчанию или соответствующая матрица замен,например, blosum45 или blosum80, может быть выбрана для оптимизации оценки идентичности, сходства или гомологии. Предпочтительно, гомологичными считают полинуклеотиды, которые гибридизуются в жестких условиях, описанных в этом документе, и имеют не менее 70%, предпочтительно не менее 80%,более предпочтительно не менее 90%, более предпочтительно не менее 95%, более предпочтительно не менее 97%, более предпочтительно не менее 98% или даже более предпочтительно не менее 99% идентичности последовательности. Термины "жесткие условия" или "жесткие условия гибридизации" включают указание условий, при которых полинуклеотид будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью в определяемо большей степени, чем с другими последовательностями (например, не менее чем в 2 раза относительно фоновых значений). В общем случае, жесткость гибридизации выражается, в частности, с указанием температуры и концентрации соли, при которых проводится этап отмывки. В типичном случае, жестким условиями будут условия, при которых концентрация соли составляет менее примерно 1,5 М ионов Na,обычно концентрация примерно от 0,01 до 1,0 М ионов Na (или другой соли) при рН от 7,0 до 8,3, и температура равна не менее примерно 30 С для коротких полинуклеотидов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и не менее примерно 60 С для длинных полинуклеотидов (например, длиннее 50 нуклеотидов) например, "жесткие условия" могут включать гибридизацию в 50% формамиде, 1 М NaCl, 1% ДСН при 37 С, и три отмывки в течение 15 мин каждая в 0,1SSC/1% ДСН при 60-65 С. Альтернативно, могут быть использованы температуры около 65, 60, 55 или 42 С. Концентрация SSC может изменяться от примерно 0,1 до 2SSC, в присутствии примерно 0,1% ДСН. Такие температуры отмывки в типичном случае выбирают так, чтобы они были примерно на 5-20 С ниже, чем точка теплового плавлениядля специфичной последовательности при заданной ионной силе и рН. Tm - это температура (при заданной ионной силе и рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизуется с зондом с образованием совершенного дуплекса. Равенство для вычисления Tm и условий для гибридизации нуклеиновых кислот хорошо известны и могут быть найдены в Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview N.Y.; конкретно см. том 2 и главу 9. В типичном случае для блокирования неспецифичной гибридизации используют блокирующие реагенты. Такие блокирующие реагенты включают, например, фрагментированную и денатурированную ДНК спермы лосося в концентрации примерно 100-200 мкг/мл. Органические растворители, такие как формамид в концентрации примерно 35-50% по объему, также могут быть использованы при определенных обстоятельствах, например, для гибридизации РНК:ДНК. Полезные модификации этих условий отмывки будут совершенно очевидны для специалиста в данной области. Термины "процент идентичности" или "% идентичности" применительно к полинуклеотидным последовательностям означает процент совпадения остатков у не менее чем двух полинуклеотидных последовательностей, выровненных с применением стандартного алгоритма. Такой алгоритм может вставлять, в стандартной и воспроизводимой манере, в сравниваемые последовательности пропуски для оптимизации выравнивания между двумя последовательностями и достижения тем самым более значимого сравнения двух последовательностей. Процент идентичности может быть определен по всей длине заданной полинуклеотидной последовательности, например, определенной конкретным ID номером последовательности, или может быть определен на более коротком участке, например, по длине фрагмента,выбранного из более длинной, заданной полинуклеотидной последовательности, например, фрагмента длиной не менее 45, не менее 60, не менее 90, не менее 120, не менее 150, не менее 210, или не менее 450 последовательных остатков. Размеры длин приведены только в качестве примера, и при этом понимается, что любая длина фрагмента, соответствующая последовательностям, указанным в этом документе, в табл., на фигурах или листинге последовательностей, может быть использована для описания длины, для которой может быть пределен процент идентичности."Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" в отношении полипептидных последовательностей, идентифицированных в этом документе, определяется как процент аминокислотных остатков в анализируемой последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам второй, референсной, полипептидной последовательности или ее части, после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, в случае необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может быть достигнуто различными способами, относящимся к специальным знаниям, например, применяя общедоступное компьютерной программное обеспечение, такое как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерительного выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Процент идентичности может быть определен по всей длине заданной полипептидной последовательности, например, определенной конкретным ID номером последовательности, или может быть определен на более коротком участке, например, по длине фрагмента, выбранного из более длинной, заданной полипептидной последовательности, например, фрагмента длиной не менее 15, не менее 20, не менее 30, не менее 40, не менее 50, не менее 70, или не менее 150 последовательных остатков. Размеры длин приведены только в качестве примера, и при этом понимается, что любая длина фрагмента, соответствующая последовательностям, указанным в этом документе, в таблице, на фигурах или листинге последовательностей, может быть использована для описания длины, для которой может быть пределен процент идентичности. Термин "без повторяемости" при использовании в этом документе в контексте полипептида относится к отсутствию или ограниченной степени внутренней гомологии в последовательности пептида или полипептида. Термин "в существенной степени неповторяющийся" может означать, например, что имеется мало или не имеется вообще случаев наличия четырех соседних аминокислот в последовательности,которые являются аминокислотами идентичного типа, или что полипептид имеет оценку подпоследовательностей (определенную ниже) 10 или менее, или что отсутствует паттерн в прядке расположения, отN- к С-концу, мотивов последовательности, которые составляют последовательность полипептида. Термин "повторяемость" при использовании в этом документе в контексте полипептида относится к степени внутренней гомологии в последовательности пептида или полипептида. В противоположность вышеописанному, "повторяющаяся" последовательность может содержать множество идентичных копий коротких аминокислотных последовательностей. Например, полипептидная рассматриваемая последовательность может быть разделена на n-мерные последовательности, и может быть подсчитано количество идентичных последовательностей. Высоко повторяющиеся последовательности содержат большую фракцию идентичных последовательностей, в то время как неповторяющиеся последовательности содержат мало идентичных последовательностей. В контексте полипептида последовательность может содержать множество копий более коротких последовательностей заданной или вариабельной длины, или мотивов, в которых мотивы сами имеют неповторяющиеся последовательности, делая полноразмерный полипептид в существенной степени неповторяющимся. Длина полипептида, в пределах которой определяется отсутствие повторяемости, может варьировать от 3 аминокислот до примерно 200 аминокислот,от примерно до примерно 50 аминокислот, или от примерно 9 до примерно 14 аминокислот. "Повторяемость" применительно к контексту полинуклеотидных последовательностей означает степень внутренней гомологии в пределах последовательности, такую как, например, частота встречаемости идентичных нуклеотидных последовательностей заданной длины. Повторяемость можно оценить, например, путем анализа частоты встречаемости идентичных последовательностей."Вектором" называют молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно самореплицирующуюся в соответствующей клетке-хозяине, которая переносит вставленную молекулу нуклеиновой кислоты в и/или между клетками-хозяевами. Термин включает векторы, которые служат преимущественно для вставки ДНК или РНК в геном клетки, реплицируемые векторы, которые служат преимущественно для репликации ДНК или РНК, и экспрессионные векторы, которые служат для транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Сюда также относятся векторы, которые обеспечивают более одной из вышеперечисленных функций. "Экспрессионным вектором" называют полинуклеотид, который, при внедрении в подходящую клетку-хозяина, может быть транскрибирован и транслирован в полипептид(ы). "Система экспрессии" обычно означает подходящую клетку-хозяина, содержащую экспрессионный вектор, которая может функционировать с образованием требуемого продукта экспрессии. "Устойчивость к деградации в сыворотке" применительно к полипептиду означает способность полипептидов противостоять деградации в крови или ее компонентах, в которую в типичном случае вовлечены протеазы сыворотки или плазмы. Устойчивость к деградации в сыворотке может быть измерена при объединении белка с сывороткой или плазмой человека (или мыши, крысы, обезьяны, по обстановке), в типичном случае на временной диапазон, кратный дням (например, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 дней), в типичном случае при примерно 37 С. Образцы, соответствующие этим временным точкам, могут быть разделены в ходе исследования на вестерн-блоте, и белки детектируются с применением антител. Антитела могут быть специфичными к метке в составе белка. Если белок демонстрирует единичную полосу на вестерн-блоте, при этом размер белка идентичен размеру инъецированного белка, то деградации не происходит. В этом приведенном в качестве примера способе временная точка, в которой 50% белка деградировано, согласно вестерн-блоту или эквивалентной методике, является периодом полувыведения в результате деградации в сыворотке или "периодом полувыведения из сыворотки" данного белка. Термин "t1/2" при использовании в этом документе означает терминальный период полувыведения, вычисленный как ln(2)/Kel. Kel - это константа терминальной скорости элиминации, вычисленная по линейной регрессии терминальной линейной части кривой зависимости логарифма концентрации от времени. Период полувыведения в типичном случае означает время, необходимое для того, чтобы половина количества введенной субстанции,депонированной в живом организме, было метаболизировано или элиминировано в результате нормальных биологических процессов. Термины "t1/2", "терминальный период полувыведения", "период полувыведения" и "период полувыведения из циркуляции" используются в этом документе как взаимозаменяемые."Коэффициент кажущейся молекулярной массы" или "кажущаяся молекулярная масса" являются связанными терминами, относящимися к мере относительного повышения или понижения кажущейся молекулярной массы, проявляемого конкретной аминокислотной последовательностью. Кажущуюся молекулярную массу определяют с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) и схожих методов в сравнении со стандартами глобулярных белков и выражают в единицах "кажущийся кДа". Коэффициент кажущейся молекулярной массы равен соотношению между кажущейся молекулярной массой и фактической молекулярной массой; последнюю прогнозируют путем сложения, исходя из аминокислотного состава, расчетной молекулярной массы каждого типа аминокислот в составе."Гидродинамический радиус" или "радиус Стокса" - это эффективный радиус (Rh, нм) молекулы в растворе, измеренный при допущении, что она является телом, перемещающимся сквозь раствор и преодолевающим вязкость раствора. В воплощениях настоящего изобретения показатели гидродинамического радиуса XTEN химерных белков коррелируют с "коэффициентом кажущейся молекулярной массы", который является в большей мере интуитивно понятным показателем. "Гидродинамический радиус" белка влияет на его скорость диффузии в водном растворе, а также на его способность мигрировать в гелях, построенных из макромолекул. Гидродинамический радиус белка определяют по его молекулярной массе, а также по его структуре, включая форму и компактизацию. Способы определения гидродинамического радиуса хорошо известны специалистам в данной области, например, применение эксклюзионной хроматографии (SEC), как описано в патентах США 6406632 и 7294513. Большинство белков обладают глобулярной структурой, которая является самой компактной трехмерной структурой, которой может обладать белок, с самым маленьким гидродинамическим радиусом. Некоторые белки приобретают случайную и открытую, неструктурированную или "линейную" конформацию и в результате имеют намного больший гидродинамический радиус, по сравнению с типичными глобулярными белками со схожей молекулярной массой."Физиологические условия" означают набор условий в живой клетке-хозяине, а также условия in vitro, включая температуру, концентрацию солей, рН, которые воспроизводят условия, существующие в живом субъекте. Был установлен ряд физиологически пригодных условий для применения в исследованиях in vitro. В общем случае, физиологический буфер содержит физиологическую концентрацию соли и подведенный до нейтрального показателя рН в интервале от примерно 6,5 до примерно 7,8, и предпочтительно от примерно 7,0 до примерно 7,5. Список различных физиологических буферов приведен в Sambrook et al. (1989). Физиологически пригодная температура находится в диапазоне от примерно 25 до примерно 38 С и предпочтительно от примерно 35 до примерно 37 С."Реакционно-способная группа" - это химическая структура, которая может присоединяться ко второй реакционноспособной группе. Примерами реакционноспособных групп являются аминогруппы, карбоксильные группы, сульфгидрильные группы, гидроксильные группы, альдегидные группы, азидные группы. Некоторые реакционно-способные группы могут быть активированы для облегчения соединения со второй реакционно-способной группой. Примерами активации являются реакция карбоксильной группы с карбодиимидом, конверсия карбоксильной группы в активированную эфирную или конверсия карбоксильной группы в азидную функциональную группу."Агент контролируемого высвобождения", "агент замедленного высвобождения", "композиция с отложенным высвобождением" или "агент длительного высвобождения" используются как взаимозаменяемые словосочетания для обозначения агента, способного увеличивать длительность высвобождения полипептида по изобретению, по сравнению с длительностью высвобождения в случае, когда полипептид вводят в отсутствие агента. Различные воплощения настоящего изобретения могут иметь различные скорости высвобождения, что приводит к различным терапевтическим количествам. Термины "антиген", "целевой антиген" или "иммуноген" используются в этом документе как взаимозаменяемые для обозначения структуры или детерминанты связывания, с которыми связывается или к которым имеет специфичность фрагмент антитела или лекарственное средство на основе фрагмента антитела. Термин "полезная нагрузка" при использовании в этом документе обозначает белковую или пептидную последовательность, которая обладает биологической или терапевтической активностью; аналог фармакофора в случае малых молекул. Полезные нагрузки включают в качестве неограничивающих примеров цитокины, ферменты, гормоны, факторы крови и ростовые факторы. Полезная нагрузка может дополнительно содержать генетически соединенные или химически конъюгированные остатки, такие как химиотерапевтические агенты, противовирусные вещества, токсины или контрастные агенты. Эти конъюгированные остатки могут быть соединены к остальной части полипептида через линкер, который может быть расщепляемым или не расщепляемым. Термин "антагонист" при использовании в этом документе обозначает любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность нативного полипептида, описанного в этом документе. Способы идентификации антагонистов полипептида могут включать объединение нативного полипептида с кандидатной молекулой антагониста и измерение детектируемых изменений одной или нескольких биологических активностей, в норме ассоциированных с нативным полипептидом. В контексте настоящего изобретения антагонисты могут включать белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, антитела или любые другие молекулы, которые снижают эффект биологически активного белка. Термин "агонист" используется в самом широком смысле и включает любую мо- 17020843 лекулу, которая воспроизводит биологическую активность нативного полипетида, описанного в этом документе. Подходящие молекулы агонистов, в частотности, включают выступающие в роли агонистов антитела или фрагменты антител, фрагменты или варианты аминокислотной последовательности нативных полипептидов, пептиды, малые органические молекулы и т.д. Способы идентификации агонистов нативного полипептида могут включать объединение нативного полипептида с кандидатной молекулой агониста и измерение детектируемых изменений одной или нескольких биологических активностей, в норме ассоциированных с нативным полипептидом."Активность" при использовании для целей настоящего документа означает действие или эффект компонента химерного белка, согласующуюся с таковым соответствующего нативного биологически активного белка, при этом "биологическая активность" относится к биологической функции или эффектуin vitro или in vivo, включая в качестве неограничивающих примеров связывание с рецептором, антагонистическую активность, агонистическую активность или клеточный или физиологический ответ. При использовании в этом документе "лечение" или "облегчение тяжести симптомов" или "уменьшение интенсивности симптомов" являются взаимозаменяемыми в этом документе. Эти термины обозначают подход для получения полезных или желаемых результатов, включая в качестве неограничивающих примеров терапевтическую пользу и/или профилактическую пользу. Под терапевтической пользой понимают избавление или уменьшение интенсивности основного нарушения, лечение которого проводится. Кроме того, терапевтическая польза достигается при избавлении или уменьшении интенсивности одного или нескольких физиологических симптомов, ассоциированных с основным нарушением,таким образом, что у субъекта наблюдается улучшение, несмотря на то, что субъект может продолжать находиться под воздействием основного нарушения. С целью получения профилактической пользы композиции могут быть введены субъекту с риском развития определенного заболевания, или субъекту, сообщающему об одном или нескольких физиологических симптомах заболевания, даже если, возможно,диагноз этого заболевания поставлен не был."Терапевтический эффект", при использовании в этом документе, означает физиологический эффект, включая в качестве неограничивающих примеров вылечивание, смягчение, уменьшение интенсивности симптомов или предотвращение заболевания человека или других животных, или улучшение иными способами физического или психического благополучия человека или животных, вызванные химерным полипептидом по изобретению, отличные от способности индуцировать продукцию антител против антигенного эпитопа, входящего в состав биологически активного белка. Определение терапевтически эффективного количества находится в компетенции специалистов в данной области, особенно с учетом подробного изобретения, предоставленного в этом документе. Термины "терапевтически эффективное количество" и "терапевтически эффективная доза", при использовании в этом документе, обозначают количество биологически активного белка, находящегося отдельно или в составе композиции химерного белка, которое способно обладать детектируемым, полезным эффектом на любой симптом, аспект, измеряемый параметр или характеристики болезни или состояния при введении субъекту в разовой или многократных дозах. Такой эффект необязательно должен быть абсолютно полезным. Термин "терапевтически эффективный режим дозировки", при использовании в этом документе,обозначает график последовательно вводимых доз биологически активного белка, находящегося отдельно или в составе композиции химерного белка, при этом дозы вводятся в терапевтически эффективных количествах для достижения длительного полезного эффекта на любой симптом, аспект, измеряемый параметр или характеристики болезни или состояния.I) Общие методики Практическое осуществление настоящего изобретения требует применения, если не указано иначе,стандартных методик иммунологии, биохимии, химии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии, геномики и рекомбинантных ДНК, которые относятся к специальным знаниям. См. Sambrook J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001; "Current protocols in molecular biology", F. M. Ausubel et al. eds.,1987; the series "Methods in Enzymology," Academic Press, San Diego, CA.; "PCR 2: a practical approach", M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R.edition, John WileySons, Somerset, NJ, 2000, содержание которых целиком включено сюда в качестве ссылок.II) Удлиненные рекомбинантные полипептиды Настоящее изобретение направлено на создание композиций, содержащих удлиненные рекомбинантные полипептиды ("XTEN" или "XTENs"). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения XTEN являются в общем случае полипептидами с увеличенной длиной, имеющими не природного происхождения, в существенной степени не повторяющиеся последовательности, которые состоят в основном из малых гидрофильных аминокислот, при этом у последовательности в низкой степени выражена или отсутствует вторичная или третичная структура при физиологических условиях. Особенностью изобретения является то, что в нем описаны композиции полипептидов XTEN, являющиеся полезными партнерами для сшивки, которые могут быть присоединены к биологически активным белкам ("ВР"), с образованием химерных белков BPXTEN (например, мономерные химерные белки). XTENs могут быть полезны в качестве партнеров химерных белков, так как они могут придавать определенные химические и фармацевтические свойства при сшивке с биологически активным белком с образованием химерного белка. Такие желаемые свойства включают в качестве неограничивающих примеров улучшение фармакокинетических параметров и характеристик растворимости, а также другие свойства, описанные ниже. Такие композиции химерных белков могут найти применение для лечения определенных заболеваний, нарушений или состояний, как описано в данном документе. При использовании в этом документе "XTEN" специфически исключает антитела или фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела, Fc-фрагменты легкой цепи или тяжелой цепи. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения XTEN являются длинными полипептидами, содержащими более чем от примерно 100 до примерно 3000 аминокислотных остатков, предпочтительно более чем от 400 до примерно 3000 остатков при применении в виде единичной последовательности, и суммарно содержащими более чем от примерно 400 до примерно 3000 аминокислотных остатков при применении более одного XTEN в химерном белке или конъюгате. В других случаях, когда не требуется повышение периода полувыведения химерного белка, но когда желательно повышение растворимости или иного физико-химического свойства партнера для сшивки, представленного биологически активным белком, последовательность XTEN короче чем 100 аминокислотных остатков, такая как примерно 9, или примерно 84, или примерно 72, или примерно 60, или примерно 48, или примерно 36 аминокислотных остатков, может быть внедрена в композицию химерного белка с ВР для того, чтобы изменить это свойство. Выбор критериев для XTEN, которые будут присоединены к биологически активным белкам для создания обладающих признаками изобретения химерных белков, обычно связан с характерными признаками физико-химических свойств и конформационной структуры XTEN, которые могут быть, в свою очередь, применены для придания улучшенных фармацевтических и фармакокинетических свойств химерным белкам. XTEN по настоящему изобретению могут проявлять одно или несколько из следующих полезных свойств: конформационная гибкость, повышенная растворимость в водной среде, высокая степень устойчивости к протеазам, низкая иммуногенность, низкое сродство к рецепторам клеток млекопитающих и увеличенные гидродинамические (или Стокса) радиусы; свойства, которые могут сделать их особенно полезными в качестве партнеров для получения химерных белков. Неограничивающие примеры свойств химерных белков, содержащих ВР, которые могут быть усилены XTEN, включают повышение общей растворимости и/или метаболической стабильности, пониженную чувствительность к протеолизу, пониженную иммуногенность, пониженную скорость всасывания при подкожном или внутримышечном введении и улучшенный фармакокинетические свойства, такие как терминальный период полувыведения и площадь под кривой (AUC), замедленное всасывание после подкожной или внутримышечной инъекции )по сравнению с ВР, не сшитым с XTEN), такое, что значение Cmax ниже, что может, в свою очередь, приводить к снижению нежелательных эффектов ВР, что, все в целом, может приводить к увеличению периода времени, в течение которого химерный белок состава BPXTEN, введенный субъекту, остается в пределах терапевтического окна, по сравнению с соответствующим компонентом ВР, не сшитым с XTEN. Специалистам в соответствующей области известны различные способы и аналитические методики для определения физико-химических свойств белков, таких как композиции химерных белков, содержащие обладающие признаками изобретения XTEN; к свойствам относятся вторичная или третичная структура, растворимость, агрегация белков, свойства плавления, загрязнение и содержание воды. Такие методы включают аналитическое центрифугирование, ЭПР, ионообменную ВЭЖХ, эксклюзионную ВЭЖХ, обращеннофазовую ВЭЖХ, рассеяние света, капиллярный электрофорез, круговой дихроизм, дифференциальную сканирующую калориметрию, флуоресценцию, ионообменную ВЭЖХ, эксклюзионную ВЭЖХ, ИК, ЯМР, рамановскую спектроскопию, рефрактометрию и спектрометрия УФ/видимой части спектра. Дополнительные методы описаны в Arnau et al., Prot Expr and Purif (2006) 48,1-13. Применение этих способов к изобретению будет находиться в компетенции специалиста в данной области. В типичном случае, компоненты XTEN химерных белков созданы так, чтобы они вели себя в физиологических условиях как денатурированные пептидные последовательности, несмотря на увеличенную длину полимера. Термин "денатурированный" описывает состояние пептида в растворе, которое характеризуется большой конформационной свободой основной цепи пептида. Большинство пептидов и белков принимают денатурированную конформацию в присутствии высоких концентраций денатурирующих агентов или при повышенной температуре. Пептиды в денатурированной конформации обладают, например, характерным спектром кругового дихроизма (КД) и характеризуются отсутствием взаимодействий дальнего порядка, согласно данным ЯМР. "Денатурированная конформация" и "неструктурированная конформация" используются в этом документе как синонимы. В некоторых случаях настоящее изобретение направлено на создание последовательностей XTEN, которые, при физиологических условиях, могут напоминать денатурированные последовательности, в значительной степени лишенные вто- 19020843 ричной структуры. В других случаях последовательности XTEN могут быть в существенной степени лишены вторичной структуры в физиологических условиях. "В значительной степени лишенные", при использовании в данном контексте, означает, что менее чем 50% аминокислотных остатков XTEN в последовательности XTEN вовлечены во вторичную структуру, согласно измерениям или определению способами, описанными в этом документе. "В существенной степени лишены" при использовании в данном контексте, означает, что менее чем примерно 60%, или примерно 70%, или примерно 80%, или примерно 90%, или примерно 95%, или не менее чем примерно 99% аминокислотных остатков XTEN в последовательности XTEN не вовлечены во вторичную структуру, согласно измерениям или определению способами, описанными в этом документе. Разнообразные способы были разработаны в данной области для проведения различий между наличием и отсутствием вторичной и третичной структур в данном полипептиде. В частности, вторичную структуру можно определить спектрофотометрически, например, методом спектроскопии кругового дихроизма в дальней УФ области спектра (190-250 нм). Элементы вторичной структуры, такие как альфаспираль и бета-слой, каждый вызывает в КД спектре изменения с характерными формой и амплитудой. Вторичная структура также может быть предсказана для полипептидной последовательности с помощью определенных компьютерных программ или алгоритмов, таких как широко известные алгоритм ЧоуФасмана (Chou, P. Y., et al. (1974) Biochemistry, 13: 222-45) алгоритм Гарнье-Остгуторпа-Робсонаamino acid sequence. Methods Enzymol 266:540-553), как описано в публикации заявки на патент США 20030228309 А 1. Для данной последовательности алгоритмы могут предсказать, существует ли у них какая-либо или не существует никакой вторичной структуры, что выражается в виде суммы и/или процентной доле остатков последовательности, которые формируют, например, альфа-спирали или бетаслои, или процентной доли остатков последовательности, для которых предсказано образование конформации статистического клубка (у которой отсутствует вторичная структура). В некоторых случаях последовательности XTEN, применяемые в обладающих признаками изобретения композициях химерных белков, могут иметь процентную долю альфа-спиралей в интервале от 0% до менее чем примерно 5%, согласно алгоритму Чоу-Фасмана. В других случаях последовательностиXTEN, применяемые в композициях химерных белков, могут иметь процентную долю бета-слоев в интервале от 0% до менее чем примерно 5%, согласно алгоритму Чоу-Фасмана. В некоторых случаях последовательности XTEN, применяемые в композициях химерных белков, могут иметь процентную долю альфа-спиралей в интервале от 0% до менее чем примерно 5% и процентную долю бета-слоев в интервале от 0% до менее чем примерно 5%, согласно алгоритму Чоу-Фасмана. В предпочтительных воплощениях последовательности XTEN композиций химерных белков будут иметь процентную долю альфаспиралей менее чем примерно 2% и процентную долю бета-слоев менее чем примерно 2%. В других случаях последовательности XTEN, применяемые в композициях химерных белков, могут иметь высокий показатель процентной доли статистического клубка, согласно алгоритму GOR. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения последовательность XTEN может состоять на не менее чем примерно 80%, более предпочтительно не менее чем примерно 90%, более предпочтительно не менее чем примерно 91%, более предпочтительно не менее чем примерно 92%, более предпочтительно не менее чем примерно 93%, более предпочтительно не менее чем примерно 94%, более предпочтительно не менее чем примерно 95%, более предпочтительно не менее чем примерно 96%, более предпочтительно не менее чем примерно 97%, более предпочтительно не менее чем примерно 98%, более предпочтительно не менее чем примерно 99%, из статистического клубка, согласно алгоритму GOR. 1. Неповторяющиеся последовательности Последовательности XTEN композиций по изобретению могут быть в существенной степени неповторяющимися. В общем случае, повторяющиеся аминокислотные последовательности имеют склонность к агрегации или образованию структур более высокого порядка, примером чего служат природные повторяющиеся последовательности, такие как коллагены и лещиновые молнии, или образовывать контакты, что приводит к кристаллическим или псевдокристаллическим структурам. В противоположность этому низкая склонность неповторяющихся последовательностей к агрегации делает возможным создание длинных последовательностей XTEN с относительно низкой частотой заряженных аминокислот,которые бы с большой вероятностью агрегировали, если бы последовательности были, наоборот, повторяющимися. В типичном случае, химерные белки BPXTEN содержат последовательности XTEN длиной более чем от примерно 100 до примерно 3000 аминокислотных остатков, предпочтительно более чем от 400 до примерно 3000 остатков, при этом последовательности являются в существенной степени неповторяющимися. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения последовательности XTEN могут содержать более чем от примерно 100 до примерно 3000 аминокислотных остатков, предпочтительно более чем от 400 до примерно 3000 аминокислотных остатков, среди которых нет трех соседних аминокислот в последовательности, которые являются аминокислотами идентичного типа, если только аминокислота не является серином, в случае чего не должно быть более трех смежных сериновых аминокислотных остатков. В вышеизложенном воплощении последовательность XTEN являлась бы в существенной степени неповторяющейся. Степень повторяемости полипептида или гена может быть вычислена с помощью компьютерных программ или алгоритмов или иными известными в данной области способами. Повторяемость в полипептидной последовательности может, например, быть оценена путем определения того, сколько раз более короткая последовательность данной длины встречается в полипептиде. Например, полипептид длиной 200 аминокислотных остатков содержит 192 перекрывающиеся последовательности из 9 аминокислот (или 9-мерных "рамок") и 1983-мерных рамок, но число уникальных 9-мерных или 3-мерных последовательностей будет зависеть от количественной характеристики повторяемости в пределах последовательности. Может быть рассчитана оценка (в дальнейшем "оценка подпоследовательности"), которая отражает степень повторяемости подпоследовательности в целой полипептидной последовательности. В контексте настоящего изобретения "оценка подпоследовательности" означает суммарное количество раз,когда каждая уникальная 3-мерная рамка встречается в последовательности полипептида из 200 следующих друг за другом аминокислот, поделенное на общее число уникальных 3-мерных подпоследовательностей в пределах последовательности из 200 аминокислот. Примеры таких оценок подпоследовательностей из первых 200 аминокислот повторяющихся и неповторяющихся полипептидов представлены в примере 73. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение направлено на создание BPXTEN, каждый из которых содержит XTEN, при этом XTEN может иметь оценку подпоследовательности менее 12, более предпочтительно менее 10, более предпочтительно менее 9, более предпочтительно менее 8, более предпочтительно менее 7, более предпочтительно менее 6, более предпочтительно менее 5. В воплощениях, описанных выше в данном параграфе, XTEN с оценкой подпоследовательности менее примерно 10 (т.е., 9, 8, 7 и т.д.) был бы "в существенной степени неповторяющимся". Свойство отсутствия повторяемости у XTEN могут придавать химерным белкам с ВР большую степень растворимости и меньшую склонность к агрегации, по сравнению с полипептидами, имеющими повторяющиеся последовательности. Эти свойства могут облегчать приготовление содержащих XTEN фармацевтических препаратов, имеющих крайне высокие концентрации лекарственного вещества, в некоторых случаях превосходящие 100 мг/мл. Кроме того, полипептидные последовательности XTEN по воплощениям разработаны с низкой степенью внутренней повторяемости для того, чтобы снизить или в существенной степени избавиться от иммуногенности при введении млекопитающим. Полипептидные последовательности, состоящие из коротких повторяющихся мотивов, в основном ограниченных тремя аминокислотами, такими как глицин, серин и глутаминовая кислота, могут приводить к относительно высоким титрам антител при введении млекопитающим, несмотря на отсутствие предсказанных эпитопов Т-клеток в этих последовательностях. Это может быть вызвано повторяющейся природой полипептидов, так как было показано, что иммуногены с повторяющимися эпитопами, включая агрегаты белков,поперечно-сшитые иммуногены и повторяющиеся углеводы, являются высоко иммуногенными и могут,например, приводить к поперечной сшивке рецепторов В-клеток, вызывая активацию В-клеток. (Johansson J., et al. (2007) Vaccine, 25 :1676-82; Yankai Z., et al (2006) Biochem Biophys Res Commim, 345:1365-71;Hsu С. Т. et al. (2000) Cancer Res, 60:3701-5); Bachmann MF, et al. Eur J Immunol. (1995) 25(12):3445-3451). 2. Примеры мотивов последовательностей Настоящее изобретений включает XTEN, которые содержат множество единиц более коротких последовательностей, или мотивов, при этом аминокислотные последовательности мотивов являются неповторяющимися. При разработке последовательностей XTEN было обнаружено, что критерий неповторяемости может быть соблюден, несмотря на применение подхода "строительных блоков" с использованием библиотеки мотивов последовательностей, которые мультимеризуются с созданием последовательности XTEN. Таким образом, хотя последовательность XTEN может состоять из множества единиц всего четырех различных типов мотивов последовательности, так как сами мотивы в основном состоят из неповторяющихся аминокислотных последовательностей, общая последовательность XTEN является в существенной степени неповторяющейся. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения XTEN может иметь неповторяющуюся последовательность длиной более чем от примерно 100 до примерно 3000 аминокислотных остатков,предпочтительно более чем от 400 до примерно 3000 остатков, при этом не менее чем примерно 80%,или не менее чем примерно 85%, или не менее чем примерно 90%, или не менее чем примерно 95%, или не менее чем примерно 97%, или примерно 100% последовательности XTEN состоит из не перекрывающихся мотивов последовательности, при этом каждый мотив содержит от примерно 9 до 36 аминокислотных остатков. В других воплощениях не менее примерно 80%, или не менее примерно 85%, или не менее примерно 90%, или не менее примерно 95%, или не менее примерно 97%, или примерно 100% последовательности XTEN состоит из неперекрывающихся мотивов последовательности, при этом каждый мотив содержит от 9 до 14 аминокислотных остатков. В других воплощениях не менее примерно 80%,или не менее примерно 85%, или не менее примерно 90%, или не менее примерно 95%, или не менее примерно 97%, или примерно 100% последовательности компонента XTEN состоит из неперекрывающихся мотивов последовательности, при этом каждый мотив содержит 12 аминокислотных остатков. В этих воплощениях предпочтительным является, чтобы мотивы последовательности были составлены в основном из малых гидрофильных аминокислот, так, чтобы целая последовательность имела свойства неструктурированной, гибкой структуры. Примерами аминокислот, которые могут быть включены вXTEN, являются, например, аргинин, лизин, треонин, аланин, аспарагин, глутамин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, серин и глицин. В результате испытаний переменных параметров, таких как оптимизация кодонов, сборка полинуклеотидов, кодирующих мотивы последовательности, экспрессия белка, распределение заряда и растворимость экспрессированного белка, вторичная и третичная структура, было выявлено, что композиции XTEN, которые улучшали характеристики, в основном содержат остатки глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролита (Р), при этом последовательности созданы так, что являются в существенной степени неповторяющимися. В предпочтительном воплощении последовательности XTEN содержат в основном от четырех до шести типов аминокислот, выбранных из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глугаминовой кислоты (Е) и пролина (Р), которые собраны во в существенной степени неповторяющуюся последовательность, которая имеет длину более чем от примерно 100 до примерно 3000 аминокислотных остатков,предпочтительно более чем от 400 до примерно 3000 остатков. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения XTEN могут иметь последовательность длиной более чем от примерно 100 до примерно 3000 аминокислотных остатков, предпочтительно более чем от 400 до примерно 3000 остатков,при этом не менее 80% последовательности состоит из не перекрывающихся мотивов последовательности, где каждый мотив содержит от 9 до 36 аминокислотных остатков, при этом каждый мотив состоит из от 4 до 6 типов аминокислот, выбранных из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р), и где содержание аминокислоты любого типа в полноразмерномXTEN не превышает 30%. В других вариантах воплощения настоящего изобретения не менее примерно 90% последовательности XTEN состоит из не перекрывающихся мотивов последовательности, при этом каждый мотив содержит от 9 до 36 аминокислотных остатков, при этом каждый мотив состоит из от 4 до 6 типов аминокислот, выбранных из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р), и при этом содержание аминокислоты любого типа в полноразмерном XTEN не превышает 30%. В других вариантах воплощения настоящего изобретения не менее примерно 90% последовательности XTEN состоит из не перекрывающихся мотивов последовательности, при этом каждый мотив содержит 12 аминокислотных остатков, включая от 4 до 6 типов аминокислот, выбранных из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р), и при этом содержание аминокислоты любого типа в полноразмерном XTEN не превышает 30%. В других воплощениях настоящего изобретения не менее чем от примерно 90%, или примерно 91%, или примерно 92%,или примерно 93%, или примерно 94%, или примерно 95%, или примерно 96%, или примерно 97%, или примерно 98%, или примерно 99% до 100% последовательности XTEN состоит из неперекрывающихся мотивов последовательности, при этом каждый мотив содержит 12 аминокислотных остатков, включающих глицин (G), аланин (А), серин (S), треонин (Т), глутаминовую кислоту (Е) и пролин (Р), и где содержание аминокислоты любого типа в полноразмерном XTEN не превышает 30%. В других воплощениях настоящего изобретения XTEN содержат неповторяющиеся последовательности длиной более чем от примерно 100 до примерно 3000 аминокислотных остатков, предпочтительно более чем от 400 до примерно 3000 аминокислотных остатков, при этом не менее примерно 80%, или не менее примерно 90%, или примерно 91%, или примерно 92%, или примерно 93%, или примерно 94%, или примерно 95%,или примерно 96%, или примерно 97%, или примерно 98%, или примерно 99% последовательности состоит из неперекрывающихся мотивов последовательности длиной от 9 до примерно 14 аминокислотных остатков, при этом мотивы состоят из от 4 до 6 типов аминокислот, выбранных из глицина (G), аланина(А), серина (S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р), и при этом последовательность из любых двух соседних аминокислотных остатков в любом мотиве встречается не более двух раз в мотиве последовательности. В других воплощениях настоящего изобретения не менее примерно 90%, или примерно 91%, или примерно 92%, или примерно 93%, или примерно 94%, или примерно 95%, или примерно 96%, или примерно 97%, или примерно 98%, или примерно 99%, последовательности XTEN состоит из неперекрывающихся мотивов последовательности длиной 12 аминокислотных остатков, при этом мотивы состоят из от 4 до 6 типов аминокислот, выбранных из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р), и при этом последовательность из любых двух соседних аминокислотных остатков в любом мотиве последовательности встречается не более двух раз в мотиве последовательности. В других воплощениях настоящего изобретения не менее примерно 90%, или примерно 91%, или примерно 92%, или примерно 93%, или примерно 94%, или примерно 95%, или примерно 96%, или примерно 97%, или примерно 98%, или примерно 99%, последовательности XTEN состоит из неперекрывающихся мотивов последовательности длиной 12 аминокислотных остатков, при этом мотивы состоят из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р), и при этом последовательность из любых двух соседних аминокислотных остатков в любом мотиве последовательности встречается не более двух раз в мотиве последовательности. В других воплощениях настоящего изобретения XTEN состоят из мотивов последовательности длиной 12 аминокислот, при этом аминокислоты выбраны из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р), и при этом последовательность из любых двух соседних аминокислотных остатков в любом мотиве последовательности встречается не более двух раз в мотиве последовательности, и при этом содержание аминокислоты любого типа в полноразмерном XTEN не превышает 30%. В вышеизложенных воплощениях, описанных выше в данном параграфе, последовательности XTEN являлись бы в существенной степени неповторяющимися. В некоторых случаях настоящее изобретение направлено на создание композиций, включающих неповторяющуюся последовательность XTEN длиной более чем от примерно 100 до примерно 3000 аминокислотных остатков, предпочтительно более чем от 400 до примерно 3000 остатков, при этом не менее чем от примерно 80%, или не менее примерно 90%, или примерно 91%, или примерно 92%, или примерно 93%, или примерно 94%, или примерно 95%, или примерно 96%, или примерно 97%, или примерно 98%, или примерно 99% до примерно 100% последовательности состоит из множества единиц двух или более неперекрывающихся мотивов последовательности, выбранных из аминокислотных последовательностей из табл. 1. В некоторых случаях XTEN содержит неперекрывающиеся мотивы последовательности, в которых от примерно 80%, или не менее примерно 90%, или примерно 91%, или примерно 92%,или примерно 93%, или примерно 94%, или примерно 95%, или примерно 96%, или примерно 97%, или примерно 98%, или примерно 99% до примерно 100% последовательности состоит из двух или более неперекрывающихся последовательностей, выбранных из семейства с одним мотивом из табл. 1, что дает в результате последовательность "семейства", в которой последовательность в целом сохраняется в существенной степени неповторяющейся. Соответственно, в этих воплощениях последовательность XTEN моет включать множество единиц неперекрывающихся мотивов последовательности из семейства мотивов AD, или семейства мотивов АЕ, или семейства мотивов AF, или семейства мотивов AG, или семейства мотивов AM, или семейства мотивов AQ, или семейства мотивов ВС, или семейства мотивов BD из последовательностей в табл. 1. В других случаях XTEN содержит последовательности мотивов из двух или более семейств мотивов из табл. 1. Таблица 1. Мотивы последовательностей XTEN длиной 12 аминокислот и семейства мотивов Обозначает отдельные последовательности мотивов, которые, при применении совместно с различными перестановками, дают "последовательность семейства" В других случаях композиция BPXTEN может включать неповторяющуюся последовательность XTEN длиной более чем от примерно 100 до примерно 3000 аминокислотных остатков,предпочтительно более чем от 400 до примерно 3000 остатков, при этом не менее чем от примерно 80%,или не менее примерно 90%, или примерно 91%, или примерно 92%, или примерно 93%, или примерно 94%, или примерно 95%, или примерно 96%, или примерно 97%, или примерно 98%, или примерно 99% до примерно 100% последовательности состоит из неперекрывающихся мотивов последовательности длиной 36 аминокислот, выбранных из одной или нескольких полипептидных последовательностей из табл. 12-15. В тех воплощениях, где в компоненте XTEN химерного белка BPXTEN менее 100% его аминокислот представлены от четырех до шести аминокислотами, выбранными из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р), или менее 100% последовательности состоит из мотивов последовательности из табл. 1 или полипептидных последовательностей из табл. 12-15,или имеется менее 100% идентичности последовательности с XTEN из табл. 2, другие аминокислотные остатки могут быть выбраны из любой из 14 природных L-аминокислот. Другие аминокислоты могут быть распределены по всей последовательности XTEN, могут быть расположены внутри или между мотивами последовательности, или могут быть сконцентрированы в виде одного или нескольких участков последовательности XTEN. В тех случаях, когда XTEN-компонент BPXTEN содержит аминокислоты,отличные от глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутаминовой кислоты (Е) и пролина (Р),предпочтительно, чтобы аминокислоты не являлись гидрофобными остатками и не изменяли бы существенно вторичную структуру компонента XTEN. Таким образом, в предпочтительном воплощении вышеизложенного, компонент XTEN химерного белка BPXTEN, содержащий другие аминокислоты, помимо глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глугаминовой кислоты (Е) и пролина (Р), имел бы последовательность с менее чем 5% остатков, участвующих в формировании альфа-спиралей и бетаслоев, согласно алгоритму Чоу-Фасмана, не менее чем на 90% представлял бы собой статистический клубок, согласно алгоритму GOR. 3. Длина последовательности В частности, изобретение включает композиции BPXTEN, содержащие полипептиды XTEN с последовательностями увеличенной длины. Настоящее изобретение использует открытие, что увеличение длины неповторяющихся, неструктурированных полипептидов усиливает неструктурированную природуXTEN и биологические и фармакокинетические свойства химерных белков, содержащих XTEN. Как более полно описано в примерах, пропорциональное увеличение длины XTEN, даже если оно создано фиксированным порядком расположения повторов мотивов последовательности единичного семейства (например, четыре мотива АЕ из табл. 1), может дать последовательность с более высокой процентной долей структуры статистического клубка, согласно алгоритму GOR, по сравнению с более короткимиXTEN. Кроме того, было обнаружено, что увеличение длины неструктурированного полипептидного партнера для сшивки может, как описано в примерах, привести к формированию химерного белка с диспропорциональным увеличением терминального периода полувыведения, по сравнению с химерными белками с неструктурированными полипептидными партнерами с меньшей длиной. Неограничивающие примеры XTEN, предлагаемых для включения в BPXTEN по изобретению, представлены в табл. 2. Соответственно, настоящее изобретение направлено на создание композиций BPXTEN, где длина последовательности XTEN химерного белка(ов) более чем от примерно 100 до примерно 3000 аминокислотных остатков, и в некоторых случаях более чем от 400 до примерно 3000 аминокислотных остатков, при этомXTEN придает улучшенные фармакокинетические свойства BPXTEN, по сравнению с полезными нагрузками, не сшитыми с XTEN. В некоторых случаях последовательности XTEN композиций BPXTEN по настоящему изобретению могут иметь длину примерно 100, или примерно 144, или примерно 288,или примерно 401, или примерно 500, или примерно 600, или примерно 700, или примерно 800, или примерно 900, или примерно 1000, или примерно 1500, или примерно 2000, или примерно 2500, или вплоть до примерно 3000 аминокислотных остатков. В других случаях последовательности XTEN могут иметь длину примерно от 100 до 150, примерно от 150 до 250, примерно от 250 до 400, от 401 до примерно 500,примерно от 500 до 900, примерно от 900 до 1500, примерно от 1500 до 2000 или от примерно 2000 до примерно 3000 аминокислотных остатков. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретенияBPXTEN может содержать последовательность XTEN, при этом последовательность демонстрирует не менее чем примерно 80% идентичность по последовательности или в других случаях 81, 82, 83, 84, 85,86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность по последовательности относительно XTEN, выбранному из табл. 2. В некоторых случаях последовательность XTEN создана для оптимизированной экспрессии в виде N-концевого компонента BPXTEN. В одном из вышеизложенных вариантов воплощения настоящего изобретения последовательность XTEN обладает не менее чем 90% идентичностью по последовательности относительно последовательности АЕ 912 или АМ 923. В другом случае вышеизложенного варианта воплощения настоящего изобретения XTEN имеет N-концевые остатки,описанные в примерах 14-17. В других случаях химерный белок BPXTEN может содержать первую и вторую последовательность XTEN, при этом сумма нарастающим итогом остатков в последовательностиXTEN более чем от примерно 400 до примерно 3000 аминокислотных остатков. В вышеизложенных воплощениях настоящего изобретения химерный белок BPXTEN может содержать первую и вторую последовательность XTEN, при этом каждая последовательность демонстрирует не менее чем примерно 80% идентичность по последовательности, или, в других случаях, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92%, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность по последовательности относительно как минимум первого или, дополнительно, второго XTEN, выбранных из табл. 2. Примеры применения в композицииBPXTEN более чем одного XTEN включают в качестве неограничивающих примеров конструкции сXTEN, сшитым как с N-, так и с С-концами как минимум одного ВР. Как более полно описано ниже, настоящее изобретение направлено на создание способов, в которых BPXTEN создается путем выбора длины XTEN с целью придания целевого периода полувыведения химерному белку, вводимому субъекту. В общем случае, более длинные XTEN, внедренные в композиции BPXTEN, приводят к более длинному периоду полувыведения, по сравнению с более короткими XTEN. Однако в другом варианте воплощения настоящего изобретения химерные белки BPXTEN могут быть созданы так, что будут включать XTEN с большей длиной, которая выбрана с целью снижения скоростей системного всасывания после подкожного или внутримышечного введения субъекту. В таких случаях Cmax снижен, по сравнению с сопоставимой дозой ВР, не сшитого с XTEN, посредством этого внося вклад в способность композиции сохранять BPXTEN в пределах терапевтического окна. Таким образом, XTEN придает введенномуBPXTEN свойство препарата пролонгированного действия, помимо других физико-химических свойств,описанных в этом документе. Таблица 2. Полипептиды XTEN 4. Суммарный заряд В других случаях полипептиды XTEN могут иметь свойства неструктурированной молекулы, приданные внедрением аминокислотных остатков с суммарным зарядом и/или снижением доли гидрофобных аминокислот в последовательности XTEN. Общий суммарный заряд и плотность суммарного заряда могут контролироваться путем изменения содержания заряженных аминокислот в последовательностяхXTEN. В некоторых случаях плотность суммарного заряда XTEN в составе композиций моет быть выше+0,1 или ниже -0,1 заряда/остаток. В других случаях суммарный заряд XTEN может составлять примерно 0%, примерно 1%, примерно 2%, примерно 3%, примерно 4%, примерно 5%, примерно 6%, примерно 7%, примерно 8%, примерно 9%, примерно 10%, примерно 11%, примерно 12%, примерно 13%, примерно 14%, примерно 15%, примерно 16%, примерно 17%, примерно 18%, примерно 19%, или примерно 20% или более. Так как большинство тканей и поверхностей в организме человека или животного имеют отрицательный суммарный заряд, последовательности XTEN могут быть созданы так, что они будут иметь отрицательный суммарный заряд с целью минимизации неспецифических взаимодействий между содержащими XTEN композициями и различными поверхностями, такими как кровеносные сосуды, здоровые ткани или различные рецепторы. Не следуя какой-то определенной теории, XTEN может принимать открытые конформации благодаря электростатическому отталкиванию между отдельными аминокислотами полипептида XTEN, из которых каждая несет высокий отрицательный суммарный заряд, и которые распределены по последовательности полипептида XTEN. Такое распределение отрицательного суммарного заряда в удлиненных последовательностях XTEN может приводить к неструктурированной конформации, которая, в свою очередь, может приводить к эффективному увеличению гидродинамического радиуса. Соответственно, в одном из вариантов воплощения настоящее изобретение направлено на создание XTEN, в которых последовательности XTEN могут содержать примерно 8, 10, 15, 20, 25 или даже примерно 30% глутаминовой кислоты. XTEN композиции по настоящему изобретению в общем случае не содержит или содержит в малом количестве положительно заряженные аминокислоты. В некоторых случаях XTEN может содержать менее чем примерно 10% аминокислотных остатков с положительным зарядом, или менее чем примерно 7%, или менее чем примерно 5%, или менее чем примерно 2% аминокислотных остатков с положительным зарядом. Однако изобретение предполагает конструкции, где ограниченное количество аминокислот с положительным зарядом, таких как лизин, может быть внедрено вXTEN для обеспечения конъюгации между эпсилон-аминогруппой лизина и реакционно-способной группой пептида, линкерного мостика, или реакционноспособной группой лекарственного вещества или малой молекулы, которые необходимо конъюгироватъ с остовом XTEN. В вышеизложенном воплощении может быть сконструирован химерный белок, который содержит XTEN, биологически активный белок, а также химиотерапевтический агент, применимый для лечения метаболических заболеваний или нарушений, при этом максимальное количество молекул агента, внедренных в компонент XTEN, определяется количеством лизинов или других аминокислот с реакционноспособными боковыми цепями (например, цистеина), внедренных в XTEN. В некоторых случаях последовательность XTEN может содержать заряженные остатки, разделенные другими остатками, такими как серин или глицин, что может приводить к улучшенным свойствам при экспрессии или очистке. В зависимости от суммарного заряда, XTEN рассматриваемых композиций может иметь изоэлектрическую точку (pI), равную 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 или даже 6,5. В предпочтительных воплощениях XTEN будет иметь изоэлектрическую точку от 1,5 до 4,5. В этих воплощениях XTEN, внедренный в композицию химерного белка BPXTEN по настоящему изобретению имел бы отрицательный суммарный заряд в физиологических условиях, что может способствовать неструктурированной конформации и снижению связывания компонента XTEN с белками и тканями млекопитающих. Так как гидрофобные аминокислоты могут влиять на структуру полипептида, настоящее изобретение предусматривает, что содержание гидрофобных аминокислот в XTEN будет в типичном случае менее чем 5%, или менее чем 2%, или менее чем 1% гидрофобных аминокислот от состава. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения содержание аминокислот метионина и триптофана в компоненте XTEN химерного белка BPXTEN в типичном случае менее 5%, или менее 2% и наиболее предпочтительно менее 1%. В другом варианте воплощения настоящего изобретения XTEN будет иметь последовательность, которая содержит менее 10% аминокислотных остатков с положительным зарядом, или менее примерно 7%, или менее примерно 5%, или менее примерно 2% аминокислотных остатков с положительным зарядом, в которой суммарное содержание остатков метионина и триптофана будет менее 2% и суммарное содержание остатков аспарагина и глутамина будет менее 10% от всей последовательности XTEN. 5. Низкая иммуногенность С другой стороны, настоящее изобретение направлено на создание композиций, где последовательности XTEN обладают низкой степенью иммуногенности или в существенной мере не иммуногенны. Несколько факторов могут способствовать низкой иммуногенности XTEN, например, неповторяющаяся последовательность, неструктурированная конформация, высокая степень растворимости, низкая степень или отсутствие аугоагрегации, малое количество или отсутствие протеолитических сайтов в последовательности и малое количество или отсутствие эпитопов в последовательности XTEN. Конформационные эпитопы образуются областями поверхности белка, которые состоят из множества дискретных аминокислотных последовательностей белкового антигена. Правильный фолдинг белка сближает эти последовательности с образованием хорошо структурированных пространственных конфигураций, или эпитопов, которые могут быть распознаны как "чужеродные" гуморальной иммунной системой организма-хозяина, что приведет к продукции антител к белку или запуску клеточноопосредованного иммунного ответа. В последнем случае на иммунный ответ индивидуума на белок в большой степени влияет распознавание эпитопов Т-клетками, которое является функцией специфичности связывания пептидов аллотипа HLA-DR этого индивидуума. Контакт комплекса МНС класса II и пептида с родственным Т-клеточным рецептором на поверхности Т-клетки, совместно с перекрестным связыванием определенных других рецепторов, таких как молекула СЕМ, может индуцировать активированное состояние Т-клетки. Активация приводит к высвобождению цитокинов, которые дополнительно активируют другие лимфоциты, такие как В-клетки, к продукции антител или активируют Ткиллерные клетки в ходе полного клеточного иммунного ответа. Способность пептида связываться с конкретной молекулой МНС класса II для презентации на поверхности АПК (антиген-презентирующей клетки) зависит от ряда факторов; самый важный из них - первичная последовательность. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения более низкая степень иммуногенности может быть достигнута созданием последовательности XTEN, которая устойчива к процессингу антигена в антигенпрезентирующих клетках, и/или выбором последовательности, которая не связывается прочно с рецепторами МНС. Настоящее изобретение направлено на создание химерных белков BPXTEN с в существенной степени неповторяющимися полипептидами XTEN для снижения связывания с рецепторами МНС II,а также для исключения образования эпитопов для Т-клеточного рецептора и связывания антигена, что в результате приведет к низкой степени иммуногенности. Избегание иммуногенности частично является прямым результатом конформационной гибкости последовательностей XTEN; т.е., отсутствия вторичной