Способ модификации некрахмального углеводного материала

СПОСОБ МОДИФИКАЦИИ НЕКРАХМАЛЬНОГО УГЛЕВОДНОГО МАТЕРИАЛА Способ модификации материала, содержащего некрахмальный углевод, включающий контактирование указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, с полипептидом,который обладает пероксидазной активностью и который является: а) полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 55% гомологией с аминокислотной последовательностью, изложенной в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 SEQ ID NO: 8, или b) полипептидом,кодируемым полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 55% гомологией с нуклеотидной последовательностью, изложенной в любой из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды с 1 по 1473 SEQ ID NO: 7.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способам модификации материала, содержащего некрахмальный углеводный материал, для увеличения восприимчивости такого материала к ферментативной деградации, для деградации такого материала и для получения сахара или сахаров из такого материала с помощью пероксидазных ферментов. Изобретение также относится к применению пероксидазных ферментов в таких способах. Предшествующий уровень техники Углеводы являются наиболее распространенными органическим соединениями на земле. Однако многие из этих углеводов депонируются в сложных полимерах, включая крахмал (основной запасающий углевод в семенах и зернах), и агрегатах углеводов и лигнина, известных как лигноцеллюлоза. Основными углеводными компонентами лигноцеллюлозы являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектины. Эти сложные полимеры часто упоминаются под общим названием лигноцеллюлоза. Биопревращение возобновляемой лигноцеллюлозной биомассы в поддающийся ферментации сахар,который впоследствии ферментируется с получением спирта (например, этанола), в качестве альтернативы жидкому топливу привлекло интенсивное внимание исследователей после 1970 годов, когда из-за снижения добычи нефти ОПЕК разразился нефтяной кризис. В течение последних двух десятилетий этанол широко используется в качестве топлива для автомобилей в виде 10% смеси с бензином (в США) или в неразбавленном виде (в Бразилии). Совсем недавно применение Е 85, 85% этанольной смеси было осуществлено специально для приложений чистого города. Важность топливного биоэтанола будет расти параллельно с ростом цен на нефть и постепенным истощением ее источников. Кроме того, поддающиеся ферментации сахара применяются для получения пластмасс, полимеров и другой биопродукции и эта отрасль, как ожидается, будет в существенной степени расти, тем самым увеличивая спрос на распространенные дешевые ферментируемые сахара, которые могут быть использованы в качестве сырья вместо сырья на основе нефти. Депонирование таких больших количеств углеводов в растительной биомассе обеспечивает изобильный источник потенциальной энергии в виде как пятиуглеродных, так и шестиуглеродных сахаров,которые могут быть применены во множестве промышленных и сельскохозяйственных процессов. Однако огромный энергетический потенциал этих углеводов в настоящее время используется недостаточно,поскольку эти сахара блокированы в сложных полимерах и, следовательно, не являются легко доступными для ферментации. Способы, с помощью которых получают сахара из растительной биомассы,обеспечат изобильный, экономически конкурентоспособный источник ферментируемого сырья для химических соединений, пластмасс и топлива. Несмотря на продолжающиеся в последние несколько десятилетий исследования, имеющие своей целью понимание ферментативной деградации лигноцеллюлозной биомассы и производство целлюлазы,желательным остается обнаружение или создание высокоактивных целлюлаз и гемицеллюлаз. Также было бы весьма желательно, создать высокоэффективные ферментные композиции, способные осуществлять быструю и эффективную биодеградацию лигноцеллюлозных материалов. Кроме того, как правило, для получения свободной целлюлозы для последующего превращения в ферментируемые сахара используются химико-механические процессы. Такие химико-механические процессы требуют дорогих реакционных сосудов и являются энергоемкими. Более того, предварительная химическая обработка, происходящая при высоких температурах и экстремальных значениях рН, не является совместимой с известными деградирующими целлюлозу ферментами. Более того, эти реакции производят соединения, которые должны быть удалены до осуществления ферментации. Как результат,процессы химической предобработки в настоящее время проводятся в реакционных сосудах, отдельных от тех, в которых идет деградация целлюлозы, и должны проходить до деградации целлюлозы. Таким образом, требуются способы, которые являются более совместимыми с процессом деградации целлюлозы, не требуют высокой температуры и давления, не образуют токсичных отходов и требуют меньше энергии. Сущность изобретения Авторы показали, что пероксидазы из Marasmius scorodonius могут помогать целлюлазам высвобождать большие количества сахара из лигноцеллюлозного сырья, чем может быть высвобождено в случае отсутствия указанных пероксидаз. Поэтому в соответствии с изобретением предлагается способ модификации материала, содержащего некрахмальный углевод, включающий контактирование указанного материала, содержащего некрахмальный углевод с полипептидом, который обладает пероксидазной активностью и который является: а) полипептидом, содержащим последовательность, изложенную в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6; или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8, или функциональным эквивалентом или фрагментом указанного пептида; илиNO: 5; нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7; или функциональным эквивалентом или фрагментом указанного пептида, таким образом, чтобы модифицировать указанный материал, содержащий некрахмальный углевод. Изобретение также обеспечивает: способ для увеличения восприимчивости к ферментативной деградации материала, содержащего некрахмальный углевод, включающий контактирование указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, с полипептидом, который обладает пероксидазной активностью и который является:a) полипептидом, содержащим последовательность, изложенную в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8, или функциональным эквивалентом или фрагментом указанного пептида; илиb) полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, содержащим последовательность, изложенную в любой из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды 58 до 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7, или функциональным эквивалентом или фрагментом указанного пептида,с тем, чтобы посредством этого увеличить восприимчивость к ферментативной деградации материала, содержащего некрахмальный углевод; способ деградации материала, содержащего некрахмальный углевод, включающий:(i) модифицирование указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, или увеличение восприимчивости к ферментативной деградации указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, с помощью способа, описанного выше; и(ii) контактирование модифицированного таким образом материала, содержащего некрахмальный углевод, с целлюлазой, и/или гемицеллюлазой, и/или пектиназой,с тем, чтобы посредством этого деградировать материал, содержащий некрахмальный углевод; способ деградации материала, содержащего некрахмальный углевод, включающий контактирование указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, с:(i) полипептидом, который обладает пероксидазной активностью и который является:a) полипептидом, содержащим последовательность, изложенную в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8, или функциональным эквивалентом или фрагментом указанного пептида; илиNO: 5; нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7; или функциональным эквивалентом или фрагментом указанного полипептида; и(ii) целлюлазой, и/или гемицеллюлазой, и/или пектиназой,с тем, чтобы посредством этого получить сахар или сахара из материала, содержащего некрахмальный углевод, включающий:(i) модифицирование указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, или увеличение восприимчивости к ферментативной деградации указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, с помощью способа, описанного выше;(ii) контактирование модифицированного таким образом материала, содержащего некрахмальный углевод, с целлюлазой, и/или гемицеллюлазой, и/или пектиназой,с тем, чтобы посредством этого получить сахар или сахара из материала, содержащего некрахмальный углевод; и способ для получения сахара или сахаров из материала, который содержит некрахмальный углеводный материал, включающий контактирование указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, с:(i) полипептидом, который обладает пероксидазной активностью и который является:a) полипептидом, содержащим последовательность, изложенную в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8, или функциональным эквивалентом или фрагментом указанного пептида; илиNO: 5; нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7; или функциональным эквивалентом или фрагментом указанного полипептида; и(i) целлюлазой, и/или гемицеллюлазой, и/или пектиназой,таким образом, чтобы получить сахар или сахара из материала, содержащего некрахмальный углевод. Способ изобретения в том виде, в котором он изложен выше, может быть осуществлен так, чтобы полипептид, обладающий пероксидазной активностью, контактировал с некрахмальным углеводным материалом, в течение, до или после стадии предварительной обработки (или фактически использовался в качестве стадии предварительной обработки). Таким образом, способ изобретения может быть улучшенным способом предварительной обработки, поскольку применение полипептида, обладающего пероксидазной активностью, в ходе, перед или после предварительной обработки, может привести к уменьшению применения химических веществ и/или энергии в такой предварительной обработке. Условия такой предварительной обработки могут быть более совместимыми с условиями, при которых проходит дальнейшая деградация некрахмального углевода. Изобретение также обеспечивает способ для приготовления продукта ферментации, включающий: а) деградацию некрахмального углеводного материала или получение сахара или сахаров из некрахмального углеводного материала с помощью способа, описанного выше; иb) ферментацию полученного материала с тем, чтобы посредством этого получить продукт ферментации. Также изобретение относится к применению полипептида, обладающего пероксидазной активностью, как описано выше, для применения в способе для модификации материала, содержащего некрахмальный углевод; увеличение восприимчивости материала, содержащего некрахмальный углевод к ферментативной деградации; или получение сахара или сахаров из материала, содержащего некрахмальный углевод. Изобретение относится к применению полипептида, обладающего пероксидазной активностью,как описано выше, в способе предварительной обработки материала, содержащего некрахмальный углевод. Изобретение также обеспечивает способ для приготовления продукта ферментации, включающий:a) деградацию некрахмального углеводного материала или получение сахара или сахаров из некрахмального углеводного материала в соответствии со способом, описанным выше; иb) ферментацию полученного материала с тем, чтобы посредством этого получить продукт ферментации. Также изменение относится к применению полипептида, обладающего пероксидазной активностью,как определено в данном документе, для применения в способе для модификации некрахмального углевода; увеличения восприимчивости к ферментативной деградации некрахмального углеводного материала; деградации некрахмального углеводного материала или для получения сахара или сахаров из некрахмального углеводного материала. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показано образование коричневатых продуктов реакции гваякола с MsP 1 + Н 2 О 2 (1) по сравнению с термоинактивированным контролем + Н 2 О 2 (2). На фиг. 2 представлена хроматограмма ВЭЖХ-ДМД (195 нм) экстрактов лигнина ("organosolv"),полученных с активнойили с термоинактивированнойMsP1 и Н 2 О 2. На фиг. 3 представлена хроматограмма ВЭЖХ с испарительным детектором светорассеяния экстрактов лигнина ("organosolv"), полученных с активнойили с термоинактивированнойMsP1 и сin situ образованием Н 2 О 2. На фиг. 4 показаны активности лакказы и пероксидазы в погруженных культурах М. scorodonius(ПероксидазаЛакказа); среда А, среда В, среда С, среда D. На фиг. 5 показано изоэлектрофокусирование с окраской серебром и АБТС соответственно. 1 дорожка: контрольные белки; дорожки 2-7 (окраска серебром) и 8-13 (окраска ABTS): среда А, дни 2-7; 1417 дорожки (окраска АБТС): среды A-D, 11 день; дорожка 18; SNS среда, 11 день. На фиг. 6 показана индукция активностей лакказы и пероксидазы в погруженных культурах М.scorodonius. SNS среда: Лакказа , пероксидаза ; SNS, дополненная лигнином: Лакказа , пероксидаза ; среда D, дополненная кукурузной соломой: Лакказа , пероксидаза . На фиг. 7 показана активность -глюкозидазы в погруженных культурах М. scorodonius, дополненных кукурузной соломой; среда А, среда В, среда С, среда D. На фиг. 8 показана эстеролитическая активность погруженных культур М. scorodonius. На фиг. 9 показано изоэлектрофокусирование с окрашиванием активности для визуализации эстеролитической активности; 1 дорожка: среда В, 7 день; 2 дорожка: среда D, 7 день; 3 дорожка: среда В, 10 день; 4 дорожка: среда D, 10 день; 5 дорожка: среда В, 14 день; 6 дорожка: среда D, 14 день. На фиг. 10 показано высвобождение сахаров глюкозы из кукурузной соломы, выраженное как процент глюкозы кукурузной соломы dm, что определялось посредством анализа восстанавливающих сахаров. Краткое описание списка последовательностейSEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность MsPl из Marasmius scorodonius. На позиции 20/21 находится последовательность отщепления сигнального пептида. Соответственно, аминокислоты с 21 по 513 представляют собой последовательность зрелого белка MsP1.SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность MsP2 из Marasmius scorodonius. На позиции 19/20 находится последовательность отщепления сигнального пептида. Соответственно, аминокислоты с 20 по 510 представляют собой последовательность зрелого MsP1.SEQ ID NO: 5 представляет собой нуклеотидную последовательность, примененную для экспрессииSEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность MsP1 из Marasmius scorodonius, экспрессированную в A. niger.SEQ ID NO: 7 представляет собой нуклеотидную последовательность, примененную для экспрессииSEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность MsP2 из Marasmius scorodonius, экспрессированную в A. niger. Подробное описание изобретения По всему настоящему описанию и в сопровождающих пунктах формулы изобретения слова "содержать", "включать" и вариации, такие как "содержит", "содержащий", "включая" и "включающий" должны толковаться включительно. Т.е. эти слова призваны передать идею возможного включения других элементов или целых, специально не перечисленных, там, где позволяет контекст. В данном документе, к примеру, "элемент" может обозначать один элемент или более чем один элемент. Настоящее изобретение относится к применению полипептидов, обладающих пероксидазной активностью. Эти полипептиды могут применяться для модификации материала, содержащего некрахмальный углевод (также называемый в данном документе не содержащий крахмал материал). Материал,который содержит некрахмальный углевод, является одним из тех, что содержит, состоит из или содержит в значительной степени один или несколько некрахмальных углеводов. Такой некрахмальный углевод может быть целлюлозой, гемицеллюлозой или пектином/пектиновым веществом. Углевод в данном контексте включает все сахариды, например полисахариды, олигосахариды, дисахариды или моносахариды. Полипептид, обладающий пероксидазной активностью, примененный в соответствии с изобретением, может модифицировать материал, содержащий некрахмальный углевод,химической или физической модификацией такого материала. Химическая модификация материала, содержащего некрахмальный углевод, может привести к деградации такого материала, например к гидролизу, окислению или другим химическим модификациям, таким как результат действия лиазы. В ином случае модификация может сделать материал, содержащий некрахмальный углевод, более восприимчивым к ферментативной деградации, например, ферментом, известным своей способностью деградировать некрахмальный углевод (например, лигноцеллюлозу), такой как целлюлаза, и/или гемицеллюлаза, и/или пектиназа. Целлюлаза может содержать одну или несколько эндоцеллюлазных, экзоцеллюлазных или гликозидазных активностей. Иначе говоря, материал, содержащий некрахмальный углевод, может быть модифицирован так, чтобы некрахмальный углеводный компонент материала становился более восприимчивым к деградации ферментом, который может деградировать некрахмальный углевод. Соответственно, изобретение относится к способу модификации материала, содержащего некрахмальный углевод, включающий контактирование указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, с полипептидом, обладающим пероксидазной активностью, как это описано в данном документе. Такая модификация может сделать материал, содержащий некрахмальный углеводный материал, более восприимчивым к ферментативной деградации (в частности, сделать некрахмальный углеводный компонент материала более восприимчивым к ферментативной деградации). Соответственно, изобретение относится к способу увеличения восприимчивости материала, содержащего некрахмальный углевод,к ферментативной деградации, включающий контактирование указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, с полипептидом, обладающим пероксидазной активностью, как это описано в данном документе. Под "более восприимчивым к ферментативной деградации" понимается то, что материал, содержащий некрахмальный углевод (в частности, некрахмальный углеводный компонент) при контактировании с полипептидом пероксидазы, как описано в данном документе, будет деградирован в большей степени ферментом, способным осуществить такую деградацию, по сравнению с ситуацией, когда материал не контактирует с таким полипептидом пероксидазы. Способ изобретения может быть способом предварительной обработки. Иначе говоря, может быть проведен способ предварительной обработки материала, содержащего некрахмальный углевод, который включает применение полипептида, обладающего пероксидазной активностью. Таким образом, способ изобретения может быть проведен таким образом, чтобы энергетический и/или химический выход в ходе предварительной обработки был бы меньше, чем в противоположном случае. Изобретение дополнительно относится к способам, в которых осуществляется способ, описанный выше, т.е. модификация материала, содержащего некрахмальный углевод, или приведение такого материала в более восприимчивое к ферментативной деградации состояние, с последующей и/или сопровождающей деградацией ферментом, который может деградировать материал, содержащий некрахмальный углевод (в частности, некрахмальный углеводный компонент материала). Как правило, деградация такого материала, содержащего некрахмальный углевод, будет происходить в большей степени или более быстро, чем деградация материала, содержащего некрахмальный углевод, не контактировавшего с описанной в данном документе пероксидазой. Соответственно, изобретение предусматривает способ деградации материала, содержащего некрахмальный углевод, включающий: контактирование указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, с описанной в данном документе пероксидазой, т.е. модификацию указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, или увеличение восприимчивости такого материала к ферментативной деградации с помощью способа, описанного в данном документе; и контактирование модифицированного таким образом материала, содержащего некрахмальный углевод, с ферментом, который деградирует указанный материал, содержащий некрахмальный углевод. Такой фермент будет, как правило,ферментом, который способен деградировать некрахмальный углеводный компонент материала, например, целлюлазой, и/или гемицеллюлазой, и/или пектиназой. Таким образом, может быть деградирован материал, содержащий некрахмальный углевод (например, некрахмальный углеводный компонент). Деградация материала, содержащего некрахмальный углевод, как правило, будет в результате давать один или несколько сахаров. Как правило, один сахар или по меньшей мере один из сахаров будет ферментируемым. Таким образом, изобретение предусматривает способ деградации материала, содержащего некрахмальный углевод, включающий контактирование указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, с пероксидазой, как описано в данном документе, т.е. модификацию указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, или увеличение восприимчивости такого материала к ферментативной деградации с помощью способа, описанного в данном документе; и контактирование модифицированного таким образом материала, содержащего некрахмальный углевод, ферментом, который деградирует указанный материал, содержащий некрахмальный углевод. Такой фермент будет, как правило, ферментом, который способен деградировать некрахмальный углеводный компонент материала, например,целлюлазой, и/или гемицеллюлазой, и/или пектиназой. Таким образом, один или несколько сахаров могут быть получены из материала, содержащего некрахмальный углевод. В способах изобретения применяемый полипептид может быть полипептидом, который обладает пероксидазной активностью, например, выделенным полипептидом с последовательностью, соответствующей любой из последовательностей с SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 или функциональному эквиваленту либо фрагменту такого полипептида. Последовательности с SEQ ID NO: 6 и 8 представляют собой последовательности зрелых полипептидов (MsP1 и MsP2 соответственно) из Marasmius scorodonius, обладающих пероксидазной активностью. Удивительно, но MsP1 и MsP2 не являются аналогичными известным магниевым пероксидазам и лигнинпероксидазам, но при этом демонстрируют большую гомологию с группой пероксидаз "DyP-type"SEQ ID NO: 2 и 4, однако, демонстрируют полноразмерные последовательности MsP1 и MsP2, включая сигнальные последовательности. Сайт отщепления сигнального пептида в последовательности с SEQ IDNO: 2 находится в позиции 20/21, а в последовательности с SEQ ID NO: 4 в позиции 19/20. Соответственно, полипептид, примененный в изобретении и основанный на последовательностях с SEQ ID NO: 2 или 4 будет, как правило, содержать последовательности, представленные аминокислотами с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2 или аминокислотами с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4 или может быть функциональным эквивалентом либо фрагментом такого полипептида. Полипептид для применения в изобретении, например выделенный полипептид, может быть получен путем экспрессии полинуклеотида, содержащего последовательность, представленную в любой из последовательностей с SEQ ID NO: 1,3, 5 или 7 или вектора, содержащего указанный полинуклеотид в подходящей клетке-хозяине, например в Aspergillus niger. Полипептид для применения в изобретении может быть функциональным эквивалентом либо фрагментом такого полипептида. В свете того факта, что последовательности с SEQ ID NO: 1 и 3 содержат части, кодирующие сигнальный полипептид, полипептид по изобретению может быть кодирован полинуклеотидом, содержащим последовательность, представленную в нуклеотидах с 61 по 11539 последовательности с SEQ IDNO: 1 или нуклеотидах с 58 по 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3. Полипептид для применения в изобретении может быть функциональным эквивалентом либо фрагментом такого полипептида. Термин "полипептид(ы), обладающий пероксидазной активностью" здесь и далее обозначает полипептид ЕС 1.11.1., который, как правило, будет способен катализировать реакцию образования:H2A (донор электронов) + Н 2 О 22H2O + A Полипептид, обладающий пероксидазной активностью, может иметь пероксид водорода в качестве своего оптимального субстрата, в ином случае полипептид, обладающий пероксидазной активностью,может быть более активным с органическим гидропероксидом, таким как липидный пероксид. Полипептид, обладающий пероксидазной активностью, может содержать гем-кофактор в своем активном сайте,или редокс-активный цистеин или селеноцистеиновый остаток. В способе или в применении изобретения может применяться очищенный полипептид. Полипептиды, описанные в настоящем документе и подходящие для применения в способе изобретения, включают полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, описанными в данном документе. Особенно предпочтительным является полипептид, содержащий последовательность, изложенную в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6; или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8, или в функциональном эквиваленте или в фрагменте любого из этих пептидов. Химерные белки, содержащие полипептид, описанный в данном документе, также могут быть применены в способе изобретения. Способы для изготовления полипептидов, которые могут быть применены в способе изобретения,описаны в данном документе. Описанное в данном документе является полинуклеотидами, содержащими нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется, предпочтительно в очень жестких условиях, с обратно комплементарной полинуклеотиду последовательностью, которая имеет последовательность, соответствующую любой из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ IDNO: 5 или нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7. Такие нуклеиновые кислоты, которые можно применять для обеспечения полипептидов, подходящих для применения в изобретении, могут содержать последовательность, которая обладает по меньшей мере около 55%, предпочтительно по меньшей мере около 65%, более предпочтительно по меньшей мере около 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере около 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% идентичностью последовательности относительно последовательности, изложенной в любой из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 до 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды 1 в 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7. В более предпочтительном воплощении такой полинуклеотид или полипептид, кодируемый таким полинуклеотидом, может быть получен из гриба, предпочтительно из мицелиального гриба, например изDikarya, например из Basidiomycota, например из Agaricomycotina, например из Agaricomycetidae, например из Agaricales, например из Trichomataceae, в частности из рода Marasmius, например из Marasmiusscorodonius. Подходящий полинуклеотид может быть получен из гриба, разрушающего лесную подстилку. Такой полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8, или в функциональном эквиваленте или в фрагменте указанного пептида. Такой полинуклеотид может кодировать по меньшей мере один функциональный домен полипептида, содержащего последовательность, представленную аминокислотами с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислотами с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислотами с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислотами с 1 по 491 последовательности с SEQID NO: 8, или в функциональном эквиваленте или фрагменте такого пептида. В предпочтительном воплощении способ изобретения осуществляется с помощью пероксидазного фермента, кодируемого геном, содержащим последовательность, соответствующую любой из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7. В другом предпочтительном воплощении осуществляется изобретение, где пероксидазный фермент кодируется полинуклеотидом, так что аминокислотная последовательность содержит любую из перечисленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 до 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8,или вариант или фрагмент любого из этих полипептидов. Полинуклеотид, дающий в результате полипептид, подходящий для применения в изобретении,может содержать кодирующую последовательность, которая кодирует полипептиды, описанные в данном документе, предпочтительно является полинуклеотидной последовательностью, содержащей любую из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7. Описанные в данном документе полинуклеотиды могут быть внедрены в векторы для экспрессии полипептида, которые могут быть применены в способе изобретения. В таком векторе полинуклеотидная последовательность, кодирующая пероксидазу, может быть функционально связана с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии кодируемой аминокислотной последовательности в подходящей клетке-хозяине, такой как бактерия или мицелиальный гриб, такой как Marasmius, например М. scorodonius или Aspergillus, например A. niger или A.oryzae. Полипептид, подходящий для применения в изобретении, может быть получен рекомбинантно в клетке-хозяине, которая содержит гетерологичный или гомологичный полинуклеотид, описанный в данном документе. В такой клетке может быть значительно увеличена экспрессия пероксидазы или активность пероксидазы. Как правило, такие клетки способны производить функциональную пероксидазу,соответствующую изобретению, предпочтительно клетки способны сверхэкспрессировать пероксидазу,например штамм Aspergillus, содержащий повышенное количество копий гена, кодирующего такую пероксидазу. Изобретение предусматривает применение выделенного полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, изложенную в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности сSEQ ID NO: 7, в соответствующем хозяине. Также в настоящем изобретении может быть применен пептид или полипептид, содержащий функциональный эквивалент или фрагмент такого пептида. Термин "полипептид" и "олигопептид" рассматриваются как синонимы (как это обычно признается), и каждый термин может быть использован взаимозаменяемо в зависимости от контекста для обозначения цепи по меньшей мере из двух аминокислот, связанных пептидильной связью. Слово "полипептид" используется здесь для цепей, содержащих больше чем 7 аминокислотных остатков. Олигопептидные и полипептидные формулы и последовательности в данном описании пишутся слева направо и в направлении от N-конца к С-концу. Используемый здесь однобуквенный аминокислотный код широко известен в данной области и может быть найден в Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989). Под "выделенным" полипептидом или белком понимается полипептид или белок, удаленный из своей естественной среды. Например, рекомбинантно-продуцируемые полипептиды и белки, продуцируемые к хозяйских клетках, рассматриваются как выделенные в целях изобретения, если являются естественными или рекомбинантными полипептидами, которые были в значительной степени очищены любым подходящим методом, таким как, например, метод одностадийной очистки, описанный в работеSmith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988). Полипептид, описанный в данном документе, обладающий пероксидазной активностью, или его функциональный эквивалент или фрагмент, может быть извлечен и очищен из культуры рекомбинантных клеток хорошо известными способами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом,экстракцию кислотой, анионную или катионную обменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, гидроксилапатитную хроматографию и лектиновую хроматографию. Наиболее предпочтительно, если для очистки используется высокоэффективная жидкостная хроматография ("ВЭЖХ"). Полипептиды для применения в настоящем изобретении включают естественно очищенные продукты, продукты процедур химического синтеза, а также продукты, полученные рекомбинантными методами из прокариотических или эукариотических хозяев, включая, например, клетки бактерий, дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от используемого в процедуре рекомбинантного получения хозяина полипептиды настоящего изобретения могут быть гликозилированы или не гликозилированы. Кроме того, полипептиды изобретения в некоторых случаях также могут включать инициирующий модифицированный остаток метионина, как результат опосредованных хозяином процессов. Термины "функциональный эквивалент" и "функциональный вариант" используются здесь взаимозаменяемо. Функциональные эквиваленты пероксидазы, кодируемые полинуклеотидами, описанными в данном документе, являются выделенными полинуклеотидами, которые кодируют полипептид, который демонстрирует пероксидазную активность, как правило, по меньшей мере, примерно такую же или лучшую пероксидазную активность по меньшей мере одного из пероксидазных полипептидов, определенных в данном документе (т.е. полипептидов, содержащих последовательность, изложенную в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8). Функциональным эквивалентом пероксидазного полипептида является полипептид, который демонстрирует пероксидазную активность, как правило, по меньшей мере, такую же или более лучшую пероксидазную активность, по меньшей мере, чем у одного из пероксидазных полипептидов, определенных в данном документе (т.е. полипептидов, содержащих последовательность, изложенную в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8). Функциональный белок или полипептидный эквивалент может содержать одну или несколько замен, вставок или делеций по сравнению с полипептидом, содержащим последовательность, изложенную в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности сSEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8. Функциональный белок или полипептидный эквивалент могут содержать только консервативные замены одной или нескольких аминокислот по сравнению с таким полипептидом. Замена, вставка или делеция будут осуществляться в отношении, как правило, несущественной аминокислоты. Несущественная аминокислота является остатком, который может быть заменен в любой из указанных последовательностей без фактического изменения биологической функции полипептида. Например,предсказано, что аминокислотные остатки, которые являются консервативными среди пероксидазных белков, описанных в данном документе, особенно не поддаются замене. Более того, аминокислоты, консервативные среди пероксидазных белков, описанных в данном документе, и других пероксидаз вероятно вообще не поддаются изменению. Термин "консервативная замена" предназначен для указания замены, в которой аминокислотный остаток заменяется на аминокислотный остаток, обладающий похожей боковой цепью. Эти семейства известны в данной области и включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин,аргинин и гистидин), с кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), с незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин,треонин, тирозин, цистеин), с неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), с бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан и гистидин). Функциональный нуклеотидный эквивалент может, как правило, содержать мутации, если сравнивать с полинуклеотидом, содержащим последовательность, изложенную в любой из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ ID NO: 5; или нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7. Как правило, такие мутации будут молчащими мутациями или мутациями, которые не изменяют биологическую функцию кодируемого полипептида. Соответственно, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид белка пероксидазы, который содержит последовательность, изложенную в аминокислотах с 21 по 513 последовательности сSEQ ID NO: 2; аминокислотах с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислотах с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислотах с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8, и который содержит изменения в аминокислотных остатках, которые являются несущественными для определенной биологической активности, могут быть применены для получения фермента для применения в изобретении. Функциональный вариант или функциональный эквивалент полипептида пероксидазы будет отличаться по аминокислотной последовательности от любой из последовательностей, специально описанных в данном документе, и еще будет сохранять по меньшей мере одну биологическую активность такого полипептида. В одном воплощении молекула выделенной нуклеиновой кислоты, подходящая для получения полипептида для применения в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или большую идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности, изложеннойSEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8. Такой полипептид может быть функциональным эквивалентом или функциональным вариантом, подходящим для применения в изобретении. Например, руководство, касающееся того, как сделать фенотипически молчащие аминокислотные замены, приводится в работе Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-1310 (1990), в которой авторы указывают на то, что существуют два основных подхода для изучения переносимости аминокислотной последовательности к изменению. Первый способ основан на процессе эволюции, при которой мутации либо принимаются, либо отклоняются естественным отбором. Во втором подходе применяют генную инженерию для введения аминокислотных замен в специфические позиции клонированного гена и отбор или скрининг для идентификации последовательностей, которые поддерживают функциональность. Как утверждают авторы, эти исследования показали, что белки удивительно устойчивы к аминокислотным заменам. Авторы также указывают, какие изменения способны быть пермиссивными в некоторых позициях белка. Например, для большинства скрытых аминокислотных остатков требуются неполярные боковые цепи, тогда как малое число признаков поверхностных боковых цепей являются консервативными. Другие такие фенотипически молчащие замены описаны в работе Bowie et al., выше и в процитированных в ней источниках. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующая пероксидазный белок, как описано в данном документе, может быть создана путем введения одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций в кодирующие последовательности полинуклеотида, содержащего любую из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7, так, что одна или несколько аминокислотных замен, делеций или вставок вводятся в кодируемый белок. Такие мутации могут быть внедрены стандартными методами, такими как сайт-направленный и ПЦР-опосредованный мутагенез. Термин "функциональные эквиваленты" также охватывает ортологи описанных в данном документе пероксидазных белков MsP1 или Msp2 из М. scorodonius. Ортологи пероксидазных белков MsP1 илиMsp2 из М. scorodonius являются белками, которые могут быть выделены из других штаммов или видов и обладают похожей или идентичной биологической активностью, в частности пероксидазной активностью. Такие ортологи могут быть легко идентифицированы сравнением аминокислотной последовательности, которая является, по существу, гомологичной любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 до 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8. Определенный здесь термин "фактически гомологичный" относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное число идентичных или эквивалентных (например, с похожей боковой цепью) аминокислот или нуклеотидов относительно второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, так чтобы первая и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности имели общий домен. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые содержат общий домен, имеющий по меньшей мере около 55%,предпочтительно по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, более предпочтительно по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98% или по меньшей мере около 99% или больше идентичности определяются в данном документе как в достаточной степени идентичные. Также нуклеиновые кислоты, кодирующие других членов пероксидазного семейства, которые, таким образом, имеют нуклеотидную последовательность, которая отличается от последовательностей,описанных в данном документе, могут быть подходящими для получения фермента, подходящего для применения в изобретении. Более того, нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные в данном документе пероксидазные белки из различных видов, которые таким образом имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от тех, что описаны в данном документе, также являются подходящими для применения в изобретении. Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие вариантам (например, естественным аллельным вариантам) и гомологичные ДНК пероксидаз, описанных в данном документе, могут быть выделены на основе их гомологии к этим нуклеиновым кислотам, путем использования их или их подходящих фрагментов, в качестве гибридизационного зонда в соответствии со стандартными методами гибридизации предпочтительно в очень жестких условиях гибридизации. В дополнение к встречающимся в естественных условиях аллельным вариантам последовательности пероксидазы, описанной в данном документе, специалист будет способен понять, что изменения могут быть введены мутациями в нуклеотидные последовательности, что тем самым приведет к изменениям в аминокислотной последовательности белка пероксидазы без существенного изменения функции белка. В изобретении могут быть применены улучшенные пероксидазные белки. Улучшенные пероксидазные белки и белки, в которых по меньшей мере одна биологическая активность, в частности пероксидазная активность, улучшается по сравнению с полипептидом, содержащим последовательность, изложенную в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8. Такие белки могут быть получены путем введения случайных мутаций по всей или по части последовательности, кодирующей такой белок, например, путем насыщающего мутагенеза, после чего полученные в результате мутанты можно экспрессировать рекомбинантно и проверять на биологическую активность. Например,предшествующий уровень техники предусматривает стандартные тесты для измерения ферментативной активности пероксидаз и, следовательно, улучшенные белки могут быть легко отобраны. В предпочтительном воплощении белок пероксидазы, подходящий для применения в изобретении,имеет аминокислотную последовательность, соответствующую любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8. В другом воплощении полипептид пероксидазы, по существу, является гомологичным такой аминокислотной последовательности и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность такого полипептида, например пероксидазную активность, но отличается в аминокислотной последовательности из-за естественной изменчивости или мутагенеза, как описано выше. В дополнительном предпочтительном воплощении белок пероксидазы, подходящий для применения в изобретении, содержит аминокислотную последовательность, кодируемую фрагментом нуклеиновой кислоты, способным гибридизоваться с последовательностью, обратнокомплементарной нуклеотидной последовательности, содержащей любую из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 до 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ IDNO: 7, предпочтительно в очень жестких условиях гибридизации. Соответственно, полипептид пероксидазы, примененный в способах, описанных в данном документе, является белком, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или большую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ IDNO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8, который сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность указанного полипептида, как правило, пероксидазную активность. Функциональные эквиваленты описанного в данном документе белка также могут быть идентифицированы, например, скринингом комбинаторных библиотек мутантов, например укороченных мутантов, белка изобретения на предмет пероксидазной активности. В одном воплощении неоднородная библиотека вариантов образуется путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновых кислот. Смешанная библиотека вариантов может быть получена, например, ферментативным лигированием смеси синтетических олигонуклеотидов в последовательности генов так, чтобы образовать вырожденный набор возможных белковых последовательностей, экспрессирующихся в виде отдельных полипептидов, или,наоборот, в виде набора более больших химерных белков (например, для фагового дисплея). Существуют различные способы, которые могут быть использованы для создания библиотек возможных вариантов описанных в данном документе полипептидов из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Методы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в данной области (см., например, Narang (1983), Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984), Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984), Science 198:1056; Ike et al. (1983), Nucleic Acid Res. 11:477). Кроме того, библиотеки фрагментов последовательности, кодирующей полипептид изобретения,могут быть использованы для создания смешанной популяции полипептидов для скрининга с последующим отбором вариантов. Например, библиотека фрагментов кодирующей последовательности может быть получена следующим образом: обработкой двухцепочечного ПЦР-фрагмента кодирующей последовательности интереса нуклеазами в условиях, в которых внесение однонитевого разрыва происходит только один раз на молекулу; денатурацией двухцепочечной ДНК; ренатурацией ДНК для образования двухцепочечной ДНК, в которую могут включаться смысловые/антисмысловые пары из разных продуктов с одноцепочечным разрывом; удалением одноцепочечной части из преобразованных дуплексов с помощью обработки S1 нуклеазой; и лигированием полученной в результате библиотеки фрагментов в экспрессирующий вектор. С помощью этого способа может быть получена экспрессирующая библиотека, которая кодирует N-концевые и внутренние фрагменты белка интереса различных размеров. В данной области известно несколько способов для скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, сделанных с помощью точечных мутаций или укорачиванием, и для скрининга библиотек кДНК для поиска генных продуктов, обладающих особыми свойствами. Наиболее широко используемые способы (которые поддаются масштабированию до уровня анализа с высокой пропускной способностью для скринирования больших генных библиотек), как правило, включают клонирование генной библиотеки в реплицирующиеся экспрессирующие вектора, трансформацию подходящих клеток полученной в результате библиотеки векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, при которых обнаружение требуемой активности облегчает выделение вектора, кодирующего искомый ген. Сайт-направленный множественный рекурсивный мутагенез (Recursive ensemble mutagenesis (REM, метод, который повышает частоту встречаемости функциональных мутантов в библиотеках, может быть использован в сочетании с тестами скрининга для выявления вариантов белка изобретения (Arkin and Yourvan (1992), Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993), Protein Engineering 6(3): 327-331). В дополнение к кодирующим пероксидазу последовательностям, описанным в данном документе,специалисту в данной области будет очевидно, что в данной популяции могут существовать полиморфизмы последовательности ДНК, которые могут привести к изменению в аминокислотной последовательности пероксидазных белков. Такие генетические полиморфизмы могут существовать в клетках из различных популяций или в популяции из-за естественной аллельной изменчивости. Аллельные варианты могут также включать функциональные эквиваленты. Функциональный эквивалент, кодирующий последовательность, подходящую для применения в изобретении, может быть получен с помощью меченного зонда, который содержит выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует всю или часть последовательности, соответствующую любой из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ ID NO: 5; нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7 или варианту любой из них; скрининг библиотеки нуклеотидных фрагментов с меченным зондом в условиях, которые позволяют гибридизовать зонд с фрагментами нуклеиновых кислот в библиотеке, с тем, чтобы посредством этого сформировать дуплексы нуклеиновых кислот и получить полноразмерную последовательность гена из фрагментов нуклеиновой кислоты в любом меченном дуплексе, для получения гена, связанного с указанной кодирующей последовательностью. В одном воплощении полинуклеотид пероксидазы, полезный для получения полипептида для применения в изобретении, может содержать последовательность, имеющую по меньшей мере 55%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более идентичность последовательности относительно любой из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ IDNO: 5, или нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7 или обратно комплементарной последовательности любой из них. Пероксидазный полипептид, полезный для применения в изобретении, может содержать последовательность, имеющую по меньшей мере 55%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более идентичность последовательности с любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности с SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8. Настоящее изобретение относится к способам, в которых применяют полинуклеотиды, кодирующие пероксидазные ферменты, которые содержат аминокислотную последовательность, соответствующую любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 последовательности с SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 последовательности с SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 последовательности сSEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1 по 491 последовательности с SEQ ID NO: 8, или функциональному эквиваленту или фрагменту такого полипептида. Последовательности, имеющие SEQ ID NO: 5 и SEQ IDNO: 7 (кодирующие пероксидазы), являются оптимизированными версиями изначально выделенных генов, в которых происходила кодоновая оптимизация. Кодоновая оптимизация может быть применена в соответствии со способами, известными специалистам в данной области, и является особенно подходящей для улучшенной экспрессии гена в клетке-хозяине. Также подходящими для образования фермента для применения в изобретении являются полинуклеотиды, содержащие последовательность, способную гибридизоваться в жестких условиях, предпочтительно в очень жестких условиях с последовательностью, обратно комплементарной любой из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 последо- 11019352 вательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7. Преимущественно, такие полинуклеотиды могут быть получены из грибов, предпочтительно мицелиальных грибов, в частности из Marasmius scorodonius. Использованные здесь термины "ген" или "рекомбинантный ген" относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК, которые включают открытую рамку считывания, кодирующую белок, например, обесцвечивающий (отбеливающий) фермент из М. scorodonius. Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Кроме того, ген относится к определенной здесь выделенной молекуле нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты, полезная для получения полипептида, подходящего для применения в способе настоящего изобретения, такая как описана в данном документе, может быть выделена с помощью стандартных молекулярно-биологических методов и предоставленной здесь информации о последовательности. Например, при использовании всей или части последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей одну или несколько из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7, в качестве гибридизационного зонда, с помощью стандартной гибридизации и методов клонирования могут быть выделены молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением (например, как описано в руководстве Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Более того, молекула нуклеиновой кислоты, охватывающая все или часть любой из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 последовательности с SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 последовательности с SEQ ID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 последовательности с SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды с 1 по 1473 последовательности с SEQ ID NO: 7, может быть выделена полимеразной цепной реакцией(ПЦР) с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе информации об этой последовательности. Подходящая нуклеиновая кислота по изобретению может быть амплифицирована с помощью кДНК, мРНК или в ином случае, с помощью геномной ДНК, в качестве матрицы и с помощью подходящих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартными методами амплификации ПЦР. Нуклеиновая кислота, амплифицированная таким образом, может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована анализом последовательности ДНК. Более того, олигонуклеотиды, соответствующие или поддающиеся гибридизации с описанной в данном документе нуклеотидной последовательностью, могут быть получены с помощью стандартных синтетических методов, например, с помощью автоматического синтезатора ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты, полезная для получения полипептида, подходящего для применения в способе изобретения, может содержать молекулу нуклеиновой кислоты, которая является обратно комплементарной нуклеотидной последовательности, описанной в данном документе или функциональный эквивалент этих последовательностей. Молекула нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной другой нуклеотидной последовательности, является последовательностью, которая достаточно комплементарна другой нуклеотидной последовательности, такой, которая может гибридизоваться с другой нуклеотидной последовательностью, тем самым образуя стабильный дуплекс. Один аспект изобретения относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид, подходящий для применения в способе изобретения, или его функциональных эквивалент, такой как биологически активный фрагмент или домен, а также к молекулам нуклеиновой кислоты, достаточным для применения в качестве гибридизационных зондов, для идентификации молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид по изобретению и к фрагментам таких молекул нуклеиновой кислоты,подходящим для применения в качестве праймеров ПЦР для амплификации или мутирования молекул нуклеиновой кислоты."Выделенный полинуклеотид" или "выделенная нуклеиновая кислота" представляет собой молекулу ДНК или РНК, которая непосредственно не граничит с обеими кодирующими последовательностями,с которыми она непосредственно граничит (с одной с 5' конца и с одной с 3' конца) в естественном окружении в геноме организма, из которого данная молекула извлечена. Таким образом, нуклеиновая кислота включает некоторые или все 5' концевые некодирующие последовательности (например, промотор), которые непосредственно граничат с кодирующей последовательностью. Термин, следовательно, включает, например, рекомбинантную ДНК, которая вставлена в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или в вирус, или в геномную ДНК прокариотического или эукариотического организма, или которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК, или фрагмента геномной ДНК, полученной ПЦР или обработкой эндонуклеазами рестрикции). Термин также включает рекомбинантную ДНК,которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, который фактически не содержит клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды (когда произво- 12019352 дится методами рекомбинантных ДНК), или химическими предшественниками или другими химическими веществами (если молекула синтезирована химически). Более того, "выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты" представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, не существующий в природе как фрагмент, и который не может быть обнаружен в естественном состоянии. Использованные здесь термины "полинуклеотид" или "молекула нуклеиновой кислоты" предназначены для включения молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК), молекулы РНК (например,мРНК) и аналогов ДНК или РНК, полученных с помощью аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием олигонуклеотидных аналогов или производных (например, инозина или фосфоротиоатных нуклеотидов). Такие олигонуклеотиды могут быть использованы, например, для подготовки нуклеиновых кислот, которые имеют измененные способности спаривания оснований или повышенную устойчивость к нуклеазам. Предоставленная в данном документе информация о последовательностях не должна истолковываться узко из-за подразумеваемого включения ошибочно идентифицированных оснований. Раскрытые в данном документе специфические последовательности могут легко применяться для выделения полного гена из гриба, в частности из М. scorodonius, который, в свою очередь, легко может быть подвергнут дополнительному анализу последовательности, посредством которого идентифицируются ошибки секвенирования. Если не указано иное, в данном документе все нуклеотидные последовательности, определенные секвенированием молекулы ДНК, были определены с помощью автоматического секвенатора ДНК, а все аминокислотные последовательности полипептидов, кодируемые молекулами ДНК, были найдены теоретически путем трансляции последовательностей ДНК, определенных выше. Следовательно, как известно в данной области, для любой последовательности ДНК, определенной таким автоматическим подходом, любая нуклеотидная последовательность, определенная в данном документе, может содержать некоторое количество ошибок. Степень идентичности нуклеотидной последовательности, определенной автоматической системой, как правило, составляет по меньшей мере около 90%, более характерно по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 99,9% относительно реальной нуклеотидной последовательности секвенируемой молекулы ДНК. Реальная последовательность может быть более точно определена другими подходами, включая хорошо известные в данной области способы ручного секвенирования ДНК. Как это известно в данной области, единичная вставка или делеция в определенной нуклеотидной последовательности по сравнению с реальной последовательностью будет приводить к смещению рамки при трансляции нуклеотидной последовательности, так что спрогнозированная аминокислотная последовательность, кодируемая определенной нуклеотидной последовательностью, будет полностью отличаться от аминокислотной последовательности, реально кодируемой секвенируемой молекулой ДНК, начиная с точки такой вставки или делеции. Специалист в данной области способен определить такие ошибочно идентифицированные основания и знает как исправить такие ошибки. Термины "гомология" или "процент идентичности", "идентичность последовательностей" и т.п. используются в данном документе взаимозаменяемо. Для цели данного изобретения здесь определяется для определения степени идентичности последовательностей двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, где последовательности выравниваются для оптимального сравнения (например, разрывы могут быть внесены в последовательность первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности для оптимального выравнивания со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Такое выравнивание может быть проведено по всей длине сравниваемых последовательностей. В ином случае выравнивание может быть проведено на более коротком участке, например, длиной около 20, около 50, около 100 или более остатков нуклеиновых кислот или аминокислот. Затем сравниваются аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных позициях или нуклеотидных позициях. Если позиция в первой последовательности занята тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и в соответствующей позиции второй последовательности, то молекулы являются идентичными по этой позиции. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных позиций совместно используемых последовательностями (т.е. % идентичности = числу идентичных позиций/общее число позиций (т.е. перекрывающихся позиций)100). Предпочтительно, если две последовательности имеют одинаковую длину. Две последовательности могут сравниваться по всей их длине. Специалист в данной области будет осведомлен о факте того, что для определения гомологии между двумя последовательностями доступно несколько программ. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть осуществлено с помощью математического алгоритма. В предпочтительном воплощении идентичность последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями определяется с помощью алгоритма Нидлмана и Вунша (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970, который включен в программу "GAP" программного пакета "GCG" (доступного по адресу http://www.accelrys.com/solutions/bioinformatician/), с помощью либо матрицы "Blossom 62", либо мат- 13019352 рицы "РАМ 250", и с массой разрыва 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и массой длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалист поймет, что все эти различные параметры дадут несколько различающиеся результаты, но общий процент идентичности двух последовательностей не изменится значительно при использовании различных алгоритмов. В другом воплощении идентичность последовательности двух нуклеотидов определяется с помощью программы GAP из программного пакета GCG, с помощью матрицы "NWSgapdna.CMP", с массой разрыва 40, 50, 60, 70 или 80 и массой длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом воплощении процент идентичности двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей определяют с помощью алгоритма Е. Meyers и W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989) который включен в программу "ALIGN" (версия 2.0) (доступной по адресу: http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) с помощью таблицы масс остатков "РАМ 120",штрафом за длину делеции 12 и штрафом за внесение делеции 4. В ином случае идентичность последовательностей между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями может быть определена с помощью, например, алгоритма Е. Meyers и W.Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989) который был включен в программу "ALIGN" (version 2.0) (доступно по запросу ALIGN Query с помощью данных о последовательностях на сервере "Genestream" в IGH, Монпелье, Франция, http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) с помощью таблицы масс остатков "РАМ 120" с штрафом за длину делеции 12 и штрафом за внесение делеции 4. Последовательности нуклеиновых кислот и белков настоящего изобретения могут дополнительно использоваться в качестве "последовательности запроса" для осуществления поиска в публичных базах данных, например, для выявления других членов семейства или родственных последовательностей. Такие поиски могут быть осуществлены с помощью программ "NBLAST" и "XBLAST" (версия 2.0)Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. Нуклеотидный поиск "BLAST" может быть осуществлен с помощью программы "BLASTN" для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот ZFX по изобретению. Поиск "BLAST" с помощью транслированной нуклеотидной последовательности в белковых базах данных может быть осуществлен с помощью программы "BLASTX" для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных транслированному гену ZFX по изобретению. В ином случае для сравнения белковых последовательностей с помощью белковых баз данных может быть использована программа "BLASP" с матрицей "Blosum 62", ожидаемым порогом = 10, длиной "слова" = 3, штрафом за существование делеции = 11, и штрафом за продолжение делеции = 1. При использовании программ "BLAST" могут использоваться параметры по умолчанию соответствующих программ (например, "BLASTX", "BLASTP" и "BLASTN"). Для соответствующей информации о гомологичном поиске в публичных базах данных см. домашнюю страницу Национального центра биотехнологической информации по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Алгоритмы BLASTP и BLASTN могут применяться для расчета идентичности последовательностей или для расстановки последовательностей (таких как идентификация эквивалента или соответствующих последовательностей, например, при их настройках по умолчанию). Программное обеспечение для осуществления анализов "BLAST" общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм включает, вопервых, идентификацию пар последовательностей с наибольшей бальной оценкой (HSP) путем определения коротких слов длиной W в последовательности запроса, которые либо совпадают или удовлетворяют некоторому пороговому баллу Т с положительной оценкой, либо соответствуют слову такой же длины в последовательности базы данных. Т называют пороговым баллом соседних слов. Эти изначальные совпадения соседних слов действуют в качестве затравки для начальных поисков, для того чтобы найти содержащие их HSP. Совпадения слов распространяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности по мере увеличения кумулятивной балльной оценки выравнивания. Распространение совпадений слова в каждом направлении останавливается, когда кумулятивный балл выравнивания падает ниже величины X от его максимального достигнутого значения; кумулятивный балл достигает нуля или ниже, из-за накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательным баллом; либо же достигается конец последовательности. Параметры алгоритма "BLAST" W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе "BLASTN" для сравнения ДНК-ДНК по умолчанию применяются длина "слова" (W) 11, ожидание (Е) 10 и сравнение обоих цепей. В программе"BLASTP" для сравнения белок-белок по умолчанию применяются длина "слова" (W) 3, матрица балльной оценки "BLOSUM62", штраф за существование делеции 11, штраф за продолжение делеции 1, и ожидание (Е) 10. Алгоритм "BLAST" осуществляет статистический анализ схожести между двумя последовательностями. Одно измерение схожести обеспеченное алгоритмом "BLAST" заключается в определении наименьшей суммарной вероятности P(N), которая обеспечивает представление о вероятности, посредством которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями будет происходить случайно. Например, последовательность считается похожей на другую последовательность, если наименьшая суммарная вероятность в сравнении первой последовательности со второй последовательностью меньше чем около 1, предпочтительно меньше чем около 0,1, наиболее предпочтительно меньше чем около 0,01 и наиболее предпочтительно меньше чем около 0,001. Также пептидный мотив может быть использован для идентификации генов, которые кодируют белки, содержащие этот пептидный мотив. Также вместо одного пептидного мотива для идентификации генов, кодирующих белки, содержащие пептидные мотивы, может применяться комбинация двух или нескольких мотивов. Если идентифицируются один или несколько пептидных мотивов, кодирующих специфические пролин-специфичные протеазы, то, таким образом, с помощью одного или комбинации нескольких таких пептидных мотивов становится возможным идентификация генов, кодирующих пролин-специфичные протеазы. Пролин-специфичные протеазы применяются в качестве примера того, как такие гены могут быть идентифицированы, но описанные способы являются общеупотребимыми. Пептидный мотив может быть применен для поиска в транслированных ДНК последовательностях из банка данных ДНК или в белковых последовательностях из банка данных белковых последовательностей с помощью программы, подобной "Patscan" (http://www- unix.mcs. anl.gov/compbio/PatScan/HTML/). Аминокислотная последовательность должна быть введена в специальном формате, который описан на вэбсайте. Другой способ, который может быть осуществлен, заключается в применении последовательности мотива для поиска в транслированных последовательностях ДНК из банка данных ДНК или в белковых последовательностях из банка данных белковых последовательностей с помощью программы, подобнойhttp://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/. Для этой программы мотив вводится в поле поиска в так называемом формате "Prosite", а в базах данных разыскивается наличие мотива в белковой последовательности или в последовательности транслированной ДНК. Этот способ может быть применен для идентификации грибных генов, которые кодируют полезные специфичные к пролину протеазы. Гены, которые идентифицируются с помощью одного из этих способов, могут быть транслированы в белковые последовательности с помощью программ, известных специалистам в данной области, и могут быть проверены на предмет наличия в них сигнальной последовательности на их N-концах. Для обнаружения сигнальной последовательности специалист может применять программу подобную(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Нахождение белковой последовательности, которая содержит как консенсусные последовательности, так и предсказанную сигнальную последовательность, дает большое преимущество для промышленного производства такого фермента. Последовательности, нуклеотиды и полипептиды, определенные таким образом, могут подходить для применения в способе изобретения. Использованный в данном документе термин "гибридизующийся" предназначен для описания условий гибридизации и отмывки, в которых нуклеотидные последовательности, обладающие степенью гомологии друг с другом по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, более предпочтительно по меньшей мере около 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере около 98%, или более предпочтительно по меньшей мере около 99%, как правило, остаются гибридизованными друг с другом. Предпочтительным, нелимитирующим примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6 Х хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при температуре около 45 С, с последующей одной или несколькими отмывками в 1SSC, 0,1% ДСН при температуре 50 С, предпочтительно при температуре 55 С, предпочтительно при температуре 60 С и еще более предпочтительно при температуре 65 С. Очень жесткие условия включают, например, гибридизацию при температуре 68 С, в 5 х SSC/5X растворе Денхардта/1,0% ДСН и отмывку в 0,2SSC/0,1% ДСН при комнатной температуре. В ином случае отмывка может быть осуществлена при температуре 42 С. Квалифицированный специалист будет иметь представления какие условия применить для условий жесткой и очень жесткой гибридизации. Дополнительные указания в отношении таких условий легко доступны в данной области, например, в Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al.(eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John WileySons, N.Y.). Конечно, полинуклеотид, который гибридизуется только с polyA-последовательностью (такой как на 3'концевом poly(A) участке мРНК) или с комплементарным фрагментом из Т (или Y) остатков, не будет включен в полинуклеотид по изобретению, использованный для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты по изобретению, поскольку такой полинуклеотид будет гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей поли(А) участок или комплементарную ему последовательность (к примеру, практически любой клон двухцепочечной кДНК). В типичном подходе, могут скринироваться библиотеки кДНК, сконструированные из других организмов, например из мицелиальных грибов, в частности из видов рода Marasmius, для получения дополнительных полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, которые могут применяться в изобретении. Например, штаммы Marasmius могут скринироваться на предмет поиска гомологичных пероксидазных полинуклеотидов, с помощью нозерн-блот анализа. При обнаружении транскриптов гомологичных полинуклеотидам по изобретению из РНК выделенной из соответствующего штамма могут быть сконструированы кДНК-библиотеки, с применением стандартных методов, хорошо известных специалистам в данной области. В ином случае библиотека общей геномной ДНК может скринироваться с помощью зонда, гибридизующегося с полинуклеотидом пероксидазы, как описано в данном документе. Гомологичные генные последовательности могут быть выделены, например, путем проведения ПЦР с помощью двух пулов вырожденных олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе нуклеотидных последовательностей, изложенных в данном документе. Матрицей для реакции может быть кДНК, полученная обратной транскрипцией мРНК, приготовленной из известных или предполагаемых штаммов, экспрессирующих полинуклеотид по изобретению. Продукт ПЦР может быть субклонирован и секвенирован для гарантии того, что амплифицированные последовательности представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты новой пероксидазы,или ее функционального эквивалента. Затем ПЦР-фрагмент может быть использован для выделения полноразмерного клона кДНК различными известными способами. Например, амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скринирования библиотеки кДНК на основе бактериофагов или космид. В ином случае меченный фрагмент может быть использован для скринирования геномной библиотеки. Технология ПЦР также может быть использована для выделения полноразмерных последовательностей кДНК из других организмов. Например, может быть выделена РНК, следуя стандартным процедурам, из соответствующего клеточного или тканевого источника. Реакция обратной транскрипции может быть осуществлена на РНК с помощью олигонуклеотидного праймера специфичного большей частью к 5' концу амплифицированного фрагмента для праймирования синтеза первой цепи. Полученный гибрид РНК/ДНК затем может быть "снабжен хвостом" (например, из гуанинов) с помощью стандартной реакции терминальной трансферазы, гибрид может быть гидролизован РНазой Н,после чего может быть начат синтез второй цепи (например, с помощью поли-С праймера). Таким образом, могут быть легко выделены кДНК последовательности, находящиеся выше амплифицированного фрагмента. Для обзора эффективных стратегий клонирования, см., например, Sambrook et al., выше; Ausubel et al., выше. Вектор, предпочтительно экспрессирующий вектор, может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую белок пероксидазы, описанный в данном документе, или его функциональный эквивалент. Использованный здесь термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой они связаны. Один тип вектора является "плазмидой", которая представляет собой кольцевой, замкнутый фрагмент двухцепочечной ДНК, с которым могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые вектора проявляют способность к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные вектора млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом, реплицируются вместе с хозяйским геномом. Более того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. В данном документе такие вектора называются "экспрессирующими векторами". В общем, экспрессирующие вектора, используемые в методах рекомбинантных ДНК, часто представлены в виде плазмид. Термины "плазмида" и "вектор" в данном документе могут быть использованы взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако изобретение имеет целью включить другие формы экспрессирующих векторов, таких как вирусные вектора (например, репликативно-дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют аналогичные функции. Рекомбинантные экспрессирующие векторы, описанные в данном документе, содержат нуклеиновую кислоту, в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает что рекомбинантный экспрессирующий вектор включает одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе используемых для экспрессии клеток-хозяев, которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая должна быть экспрессирована. В рекомбинантном экспрессирующем векторе, "функционально связанный" означает, что нуклеотидная последовательность интереса связана с регуляторной последовательностью(ями) таким образом, который позволяет экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в и in vitro системе транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, когда вектор вводится в клетку-хозяина). Термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигнал полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Регуляторные последовательности включают те последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во множестве типов клеток-хозяев и те, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в некоторых клетках-хозяевах (например,тканеспецифичные регуляторные последовательности). Специалисту в данной области следует понимать, что конструирование экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как, например,выбор трансформируемой клетки-хозяина, желаемый уровень экспрессии белка и т.п. Такие экспрессирующие векторы могут быть введены в клетки-хозяева, с тем, чтобы получить белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, описанными в данном документе. Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут быть сконструированы для экспрессии пероксидазных белков в прокариотических и эукариотических клетках. Например, пероксидазные белки могут экспрессироваться в грибных клетках, бактериальных клетках, таких как E.coli, клетках насекомых (с помощью бакуловирусных экспрессирующих векторов), дрожжевых клетках, грибных клетках и клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева дополнительно обсуждаются в книге Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, СА (1990). В ином случае рекомбинантный экспрессирующий вектор может транскрибироваться и транслироваться in vitro, например с помощью регуляторных последовательностей Т 7-промотора и Т 7-полимеразы. Соответственно, векторы, которые могут быть использованы для получения полезного в настоящем изобретении полипептида, включают векторы, полученные на основе хромосом, эписом и вирусов, например векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевой эписомы, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы коровьей оспы,аденовирусы, вирусы оспы-дефтерита птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы и векторы, полученные на основе их комбинаций, например те, что получены из генетических элементов плазмид и бактериофагов, такие как космиды и фагемиды. ДНК-вставка должна быть функционально связана с подходящим промотором, например, таким какPL-промотор фага лямбда, промоторы E.coli lac, trp и tac, ранний и поздний промоторы SV40 и промоторы ретровирусных LTR. Другие подходящие промоторы будут известны специалисту в данной области. В конкретном воплощении предпочтительными являются те промоторы, которые способны задавать высокий уровень экспрессии пероксидаз в прокариотах или мицелиальных грибах. Такие промоторы известны в данной области. Экспрессирующие конструкции могут содержать сайты для инициации и терминации транскрипции и, в транскрибируемой области, сайт связывания с рибосомой для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых конструкциями, будет включать инициирующий трансляцию триплет AUG в начале и кодон терминации в соответствующей позиции в конце транслируемого полипептида. Векторная ДНК может быть внедрена в прокариотические или эукариотические клетки с помощью обычных методов трансфекции и трансформации. Использованные здесь термины "трансформация" и"трансфекция" предназначены для обозначения множества признанных в данной области способов внедрения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включая коприципитацию с фосфатом кальция и хлоридом кальция, DEAE-декстран опосредованную трансфекцию, трансдукцию,инфекцию, липофекцию, катионную, опосредованную липидами, трансфекцию или электропорацию. Подходящие способы для трансформации или трансфекции клеток-хозяев могут быть найдены в Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring(1986) и в других лабораторных руководствах. Известно, что при стабильной трансфекции клеток млекопитающих, в зависимости от экспрессирующего вектора, и используемого способа трансфекции, только малая часть клеток может интегрировать чужеродную ДНК в свой геном. В целях идентификации и отбора этих интегрантов, ген, который кодирует селективный маркер (например, ген устойчивости к антибиотику), как правило, вводится в клетки-хозяева вместе с геном интереса. Предпочтительные селективные маркеры включают те, которые придают устойчивость к лекарственным соединениям, таким как G418, гидромицин и метатрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селективный маркер, может быть введена в клетку-хозяина в том же, кодирующем полипептид пероксидазы, векторе, или может быть введена в отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфецированные вводимой нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы отбором по лекарственному средству (например, клетки, которые имеют внедренный селективный маркерный ген,будут выживать, в то время как другие клетки будут умирать). Экспрессия белков в прокариотах часто проводится в E.coli с векторами, содержащими конститутивный или индуцируемый промоторы, управляющие экспрессией либо химерных либо нехимерных белков. Химерные векторы добавляют ряд аминокислот к кодируемому в них белку, например, к Nконцу рекомбинантного белка. Такие химерные вектора, как правило, служат трем целям: 1) повышению экспрессии рекомбинантного белка; 2) повышению растворимости рекомбинантного белка; 3) помощи в очистке рекомбинантного белка в качестве лиганда для аффинной очистки. Часто в химерных экспрессирующих векторах, на стыке химерного функционального компонента и рекомбинантного белка вводится сайт протеолитического гидролиза, для того чтобы можно было отделить рекомбинантный белок от химерного функционального компонента с последующей очисткой химерного белка. Такие ферменты и их распознаваемые родственные последовательности включают фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. Как уже отмечалось, экспрессирующие векторы предпочтительно будут содержать селекционные маркеры. Такие маркеры включают дигидрофолатредуктазу или устойчивость к неомицину для культуры эукариотических клеток и устойчивость к тетрациклину или ампициллину для культивируемых Е.coli и других бактерий. Типичные примеры подходящих хозяев включают бактериальные клетки, такие как Е.coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; грибные клетки, такие как дрожжи; клетки насекомых,такие как S2 из Drosophila и Sf9 из Spodoptera; клетки животных, такие как СНО, COS и меланомы Боуэса; и растительные клетки. Соответствующие культуральные среды и условия для вышеописанных хозяйских клеток известны в данной области. Среди векторов предпочтительных для применения в бактериях векторы pQE70, pQE60 и PQE-9 отptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 от "Pharmacia". К предпочтительным эукариотическим векторам относятся PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZT1 и pSG от "Stratagene"; и pSVK3, pBPV, pMSG иpSVL от "Pharmacia". Другие подходящие векторы будут очевидны для специалиста. К известным бактериальным промоторам для применения в настоящем изобретении относятся промоторы Е.coli lacl и lacZ, промоторы Т 3 и Т 7, промотор gpt, промоторы lambda PR, PL и промотор trp,промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промоторы SV40, промоторы ретровирусных LTR,например из вируса саркомы Рауса (RSV) и металлотеиновые промоторы, например, промотор мышиного металлотионеина-I. Транскрипция ДНК, кодирующей полипептиды настоящего изобретения, высшими эукариотами может быть повышена путем включения в вектор энхансерной последовательности. Энхансеры являютсяcis-действующими элементами ДНК, обычно около от 10 до 300 п.н., которые действуют, повышая транскрипционную активность промотора в данном типе клеток-хозяев. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, который находится на поздней стороне от точки начала репликации (100-270 п.н.), энхансер цитомегаловирусного промотора, энхансер полиомы на поздней стороне от точки начала репликации,и энхансеры аденовируса. Для секреции транслированного белка в просвет эндоплазматического ретикулюма, в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду, в экспрессирующийся ген может быть внедрен соответствующий сигнал. Сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду или могут быть гетерологичными сигналами. Полипептид может экспрессироваться в модифицированной форме, такой как химерный белок, и может включать не только сигналы секреции, но также и дополнительные гетерологичные функциональные области. Таким образом, например, область дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, может быть добавлена к N-концу полипептида для улучшения стабильности и устойчивости в хозяйской клетке, в процессе очистки и в процессе последующих обработки и хранения. Также для облегчения очистки к полипептиду могут быть добавлены пептидные функциональные компоненты. Также описанными в данном документе являются клетки, например трансформированные клеткихозяева или рекомбинантные клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, подходящий для применения в способе изобретения. "Трансформированная клетка" или"рекомбинантная клетка" является клеткой, в которую (или в предшественник которой) вводится посредством методов рекомбинантных ДНК нуклеиновая кислота, описанная в данном документе. Включены как прокариотические, так и эукариотические клетки, например бактерии, грибы, дрожжи и т.п. Примерами подходящих клеток-хозяев являются, например, Microcystis, Lepista, например L. irina,Cyathus, например С. pallidus, Ganoderma, например G. applanatum, Ischnoderma, например I. benzoinum,Marasmius, например М. scorodonius, Trametes, например Т. suaveolens или Т. versicolor, Cryptococcus,например С. laurentii, Hypomyces, например H. odoraius или Phaffia, например P. rhodozyma, Phanerochaete, например P. chrysosporium, Lentinula, например L. edodes, Coprinus, например С. cinereus, Gloeophyllum, например G. trabeum, Ophiostoma, например О. piliferum, Aspergillus, например A. niger, A. oryzae, A. nidulans, Thermomyces, например Т. lanuginosa, Sporotrichum, например S. thermophile, Aureobasidium, например A. pullulans, Amorphotheca, например A. resinae, Leucosporidium, например L. scottii,Cunninghamella, например С. elegans. Особенно предпочтительными являются клетки из мицелиальных грибов, в частности изAspergillus, например из Aspergillus oryzae или Aspergillus niger, и Marasmius, например Marasmius scorodonius, или клетки из дрожжей, таких как Pichia, например из Pichia pastoris, или клеток из бактерий. Клетки-хозяева могут быть выбраны таким образом, чтобы модулировать экспрессию внедренных последовательностей или чтобы модифицировать и процессировать генный продукт специфическим,требуемым способом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессирование (например,гидролиз) белковых продуктов могут облегчать оптимальное функционирование белка. Различные клетки-хозяева обладают характерными и специфичными механизмами для пост-трансляционной обработки и модификации белков и генных продуктов. Соответствующие клеточные линии или хозяйские системы,хорошо знакомые специалистам в области молекулярной биологии и/или микробиологии, могут быть выбраны для обеспечения требуемой и корректной модификации и обработки продуцируемого чужеродного белка. С этой целью могут использоваться эукариотические хозяйские клетки, которые обладают клеточной машинерией для правильного процессирования первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева хорошо известны в данной области. Клетки-хозяева также включают, в частности, клеточные линии млекопитающих, такие как СНО,VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3 Т 3, WI38, и клеточные линии хороидного сплетения. При необходимости, полипептид по изобретению может быть получен посредством стабильно трансфецированной клеточной линии. Множество векторов, подходящих для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, доступно широкому кругу лиц, способы для конструирования таких клеточных линий также публично известны, например из Ausubel et al. (выше). В способе изобретения полипептид изобретения контактирует с материалом, содержащим некрахмальный углевод. Полипептид может быть добавлен в виде выделенного или очищенного фермента, препарата фермента или продуцироваться in situ микроорганизмом, способным продуцировать указанный фермент. Препарат фермента может быть получен из различных источников, например из растений, животных и микроорганизмов. Предпочтительно препарат фермент получают из микроорганизма, поскольку микроорганизмы позволяют получить фермент в промышленном масштабе контролируемым образом. Препарат фермента, полученный из микроорганизма, может быть получен классическими процессами ферментации выбранного микробного штамма или ферментацией микроорганизма, который сверхэкспрессирует фермент. Микроорганизм может быть бактерией, грибом или дрожжами. Примерами подходящих микроорганизмов являются, например, Microcystis, Lepista, например L. irina, Cyathus, например С. pallidus,Ganoderma, например G. applanatum, Ischnoderma, например I. benzoinum, Marasmius, например М. scorodonius, Trametes, например Т. suaveolens или Т. versicolor, Cryptococcus, например С. laurentii, Hypomyces,например Н. odoratus или Phaffia, например P. rhodozyma, Phanerochaete, например Р. chrysosporium, Lentinula, например L. edodes, Coprinus, например С. cinereus, Gloeophyllum например G. trabeum, Ophiostoma, например О. piliferum, Aspergillus, например A. niger, A. oryzae, A. nidulans, Thermomyces, например Т. lanuginosa, Sporotrichum, например S. thermophile, Aureobasidium, например A. pullulans, Amorphotheca, например A. resinae, Leucosporidium, например L. scottii, Cunninghamella, например С. elegans. Способы изобретения могут быть осуществлены так, чтобы полипептид добавлялся в виде препарата фермента, полученного из или продуцируемого in situ растением, например растением кукурузы, растением риса, растением сахарного тростника, растением пшеницы и растением ячменя. Материалом, содержащим некрахмальный углевод и подходящим для модификации полипептидом изобретения, как правило, является лигноцеллюлоза. Основными полисахаридами, содержащими различные лигноцеллюлозные остатки, которые могут рассматриваться как потенциальный возобновляемый источник сырья, являются целлюлоза (глюканы), гемицеллюлозы (ксиланы, гетероксиланы и ксилоглюканы). Кроме того, некоторые гемицеллюлозы могут присутствовать в виде глюкоманнанов, например,сырье, полученное из древесины. Ферментативный гидролиз этих полисахаридов на растворимые сахара,например глюкозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, сахарозу, фруктозу, маннозу, рамнозу, рибозу, Dгалактоуроновую кислоту и другие гексозы и пентозы происходит под действием различных ферментов,действующих совместно. Кроме того, пектины и другие пектиновые субстанции, такие как арабинаны,могут составлять значительную долю сухой массы обычной клеточной стенки тканей недревесного растения (от около четверти до половины сухой массы может приходиться на пектины). В способе изобретения материал, содержащий некрахмальный углевод, может быть в форме лигноцеллюлозы, т.е. лигноцеллюлозного "субстрата", или "биомассы", или "сырья". Охватывается любой материал, содержащий целлюлозу, гемицеллюлозу, лигнин, белок и углеводы, такие как крахмал и сахар."Биомасса" включает первичную биомассу и/или непервичную биомассу, такую как сельскохозяйственная биомасса, коммерческая органика, строительный и городской мусор, твердые бытовые отходы, макулатура и садовые отходы. Общие формы биомассы включают деревья, кустарники и травы, пшеницу,пшеничную солому, жмых сахарного тростника, кукурузу, листовую обертку початков кукурузы, зерна кукурузы, включая волокно из зерен, продукты и побочные продукты перемалывания зерна, такого как кукуруза (включая мокрый и сухой помол), а также твердые бытовые отходы, макулатуру и садовые отходы. "Смешанная биомасса" является любой смесью или смесью первичной и непервичной биомассы,предпочтительно имеющей от около 5 до около 95% по массе непервичной биомассы. "Сельскохозяйственная биомасса" включает ветки, кусты, тростники, кукурузу и листовую обертку початков кукурузы,энергетические культуры, леса, фрукты, цветы, зерно, травянистые культуры, листья, кору, иголки, бревна, корни, саженцы, древенистые культуры с коротким оборотом, кустарники, просо, деревья, овощи,виноград, и твердую и мягкую древесины (не включая древесину с вредными материалами). Кроме того,сельскохозяйственная биомасса включает материалы органических отходов, образованных в ходе сельскохозяйственных процессов, включая фермерскую и лесоводческую активности, особенно включая древесные отходы лесного хозяйства. Сельскохозяйственная биомасса может быть отдельно любой из вышеизложенных или смесью любой их комбинации. Биомасса, богатая крахмалом, сахаром или белками, такая как кукуруза, зерно, фрукты и овощи, как правило, потребляется в пищу. С другой стороны, биомасса, богатая целлюлозой, гемицеллюлозой и лигнином, не является легко гидролизуемой и, в первую очередь, используется для продукции из древесины и бумаги, в качестве топлива или, как правило, выбрасываются. В общем, субстратом является имеющее высокое содержание лигноцеллюлозы, включая кукурузную солому, рисовую солому, сено,жмых сахарного тростника и другую сельскохозяйственную биомассу, просо, отходы лесного хозяйства,щепу тополя, щепу сосны, опилки, садовые отходы и т.п., включая любую комбинацию субстрата. В способе изобретения материал, содержащий некрахмальный углевод, контактирует с полипептидом пероксидазы, как описано в данном документе. Материал, содержащий некрахмальный углевод, затем может контактировать с ферментом, который разрушает, например продуцирует, сахара из указанно- 19019352 го некрахмального углевода, содержащегося в материале. Кроме того, в способе изобретения могут применяться вспомогательные полипептиды. Такие полипептиды могут быть ферментами. Вспомогательные полипептиды могут применяться одновременно с, до или после применения полипептида пероксидазы, описанного в данном документе. Вспомогательный полипептид может действовать так, чтобы дополнительно модифицировать материал, содержащий некрахмальный углевод, или так, чтобы дополнительно увеличивать восприимчивость к ферментативной деградации указанного материала, содержащего некрахмальный углевод. Вспомогательный фермент может действовать так, чтобы дополнительно увеличивать эффект полипептида пероксидазы, как описано в данном документе. Вспомогательный полипептид может увеличивать активность фермента, разрушающего некрахмальный углевод. Вспомогательный полипептид может при контактировании с биомассой в реакции увеличивать активность и/или увеличивать восприимчивость фермента, разрушающего некрахмальный углевод (например, целлюлазы). Вспомогательный фермент может реагировать в том же сосуде, что и полипептид пероксидазы, описанный в данном документе, и/или в том же сосуде, что и фермент, разрушающий некрахмальный углевод (например, целлюлаза). Хотя понятно, что в качестве вспомогательных ферментов могут функционировать множество различных классов ферментов, в частности, вспомогательными ферментами могут быть ферменты следующих классов (но не ограничены ими): амилазы, протеазы, липазы, глюкоуронидазы или оксиредуктазы. Полипептиды, например ферменты, подходящие для применения в способе изобретения, могут состоять из ферментов:(1) полученных от коммерческих поставщиков;(3) сложной жидкой питательной среды (такой, которая получается в результате роста микробного штамма в среде, когда штаммы секретируют ферменты в среды);(4) клеточных лизатов штаммов растущих в (3);(5) растительного материала, экспрессирующего ферменты, способные деградировать лигноцеллюлозу. Следует признать, что может быть использована любая комбинация ферментов (примененного в дополнение к описанной здесь пероксидазе). Ферменты могут быть использованы отдельно или в смеси включая, но не ограничивая этим, по меньшей мере, целлюлазу; по меньшей мере, гемицеллюлазу; по меньшей мере, пектиназу. Иначе говоря, способ изобретения может быть осуществлен в случае, в котором применяется целлюлаза, например эндоцеллюлаза, и/или экзоцеллюлаза, и/или -глюкозидаза. Следует понимать, что, как описано выше, ферментная смесь может состоять из членов каждого из этих классов, нескольких членов одного ферментного класса (например, двух или нескольких гемицеллюлаз), или из любой комбинации этих ферментных классов (например, протеазы, экзоцеллюлазы и эндоцеллюлазы; или экзоксиланазы и липазы). В данном документе целлюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать целлюлозу. Полипептид, который способен деградировать целлюлозу, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения целлюлозы на более мелкие единицы, либо частично, например, в целлодекстрины, либо полностью в глюкозные мономеры. Целлюлаза по изобретению при контактировании может дать смешанную популяцию олигосахаридов и сахарных мономеров. Такая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза. В данном документе гемицеллюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать гемицеллюлозу. Иначе говоря, гемицеллюлаза может быть способна деградировать или модифицировать одно или несколько из представленных соединений: ксилан, глюкуроноксилан, арабиноксилан, глюкоманнан и ксилоглюкан. Полипептид, который способен деградировать гемицеллюлозу, является ферментом, который способен катализировать процесс разрушения гемицеллюлозы на более мелкие полисахариды, либо частично, например, на олигосахариды, либо полностью на мономеры сахара, например гексозный или пентозный сахарные мономеры. Гемицеллюлаза по изобретению,при контактировании, может дать смешанную популяцию олигосахаридов и сахарных мономеров. Такая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза. В данном документе, пектиназа является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать пектин. Полипептид, который способен деградировать пектин является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения пектина на более мелкие единицы, либо частично, например, в олигосахариды, либо полностью в сахарные мономеры. Пектиназа по изобретению при контактировании может дать смешанную популяцию олигосахаридов и сахарных мономеров. Такая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза."Целлюлаза" включает как экзогидролазы, так и эндогидролазы, которые способны распознавать в качестве субстратов целлюлозу, или продукты, получающиеся в результате разрушения целлюлозы. Целлюлаза включает смеси ферментов, которые включают эндоглюказаназы, целлобиогидролазы, глюкозидазы или любые из этих ферментов вместе или в комбинации с другими активностями. Организмы,продуцирующие целлюлозодеградирующую активность, часто продуцируют множество ферментов с различными субстратными специфичностями. Таким образом, штамм, идентифицированный как гидролизующий целлюлозу, может быть описан как обладающий целлюлазой, когда на самом деле несколько ферментных типов могут вносить вклад в активность. Например, коммерческие препараты "целлюлазы" часто являются смесями нескольких ферментов, таких как активности эндоглюканазы, экзоглюканазы и глюкозидазы. Таким образом, "целлюлаза" в данном документе включает смеси таких ферментов, и включает коммерческие препараты, способные деградировать целлюлозу, а также культуральную надосадочную жидкость или клеточные экстракты, демонстрирующие целлюлозодеградирующую активность, или действуя на продукты гидролиза деградации целлюлозы, например, целлотриозу или целлобиозу."1,4Dглюканцеллобиогидролаза", или "целлюлоза 1,4 целлобиозидаза", или "целлобиозилаза" включает ферменты, которые гидролизуют 1,4D-гликозидные связи в целлюлозе и целлотетраозе, высвобождая целлобиозу из восстановленных или не восстановленных концов цепей. Ферменты в группе ЕС 3.2.1.91 включают эти ферменты, такие как СВН 1 и СВН 2."-глюкозидаза", или "глюкозидаза", или "-D-глюкозидглюкогидролаза", или "целлобиаза" ЕС 3.2.1.21 включает ферменты, которые высвобождают молекулы глюкозы, в качестве продукта их каталитического действия. Эти ферменты распознают в качестве субстратов олигомеры глюкозы, такие как целлобиоза (димер глюкозы, связанный -1,4-связями) или целлотриоза (тример глюкозы, связанный 1,4-связями). Как правило, они гидролизуют концевую, невосстановленную -D-глюкозу, с высвобождением -D-глюкозы. "Эндоглюканаза", или "1,4D-глюкан-4-глюканогидролаза", или "-1,4 эндоцеллюлаза", или "эндоцеллюлаза", или "целлюлаза" ЕС 3.2.1.4 включает ферменты, которые расщепляют полимеры глюкозы, соединенные -1,4-связями. Субстраты, на которые действуют эти ферменты,включают целлюлозу и модифицированные целлюлозные субстраты, такие как карбоксиметилцеллюлоза, RBB-целлюлоза и т.п. EG1, EG2, EG3, EG4, EG5, EG6 и EG7 подпадают под этот класс ферментов."Гемицеллюлаза" или "ксиланаза" включают как экзогидролитические и эндогидролитические ферменты, которые способны распознавать и гидролизовать гемицеллюлозу, или продукты, полученные в результате разрушения гемицеллюлозы, в качестве субстратов. В однодольных, где гетероксиланы являются принципиальной составляющей гемицеллюлозы, комбинация эндо-1,4 ксиланазы (ЕС 3.2.1.8) и D-ксилозидазы (ЕС 3.2.1.37) может быть применена для разрушения гемицеллюлозы в ксилозу. Дополнительные, расщепляющие разветвленные структуры, ферменты способны гидролизовать другие сахарные компоненты (арабинозу, галактозу, маннозу), которые расположены в точках разветвления в структуре гемицеллюлозы. Дополнительные ферменты способны гидролизовать связи, образованные между гемицеллюлозными сахарами (в частности, арабинозой) и лигнином."Эндоксиланаза", или "1,4 эндоксиланаза", или "1,4D-ксиланксиланогидролаза", или (ЕС 3.2.1.8) включает ферменты, которые гидролизуют полимеры ксилозы, связанные посредством -1,4 связей. Эндоксиланазы могут быть применены для гидролиза геммицеллюлозного компонента лигноцеллюлозы, а также очищенных ксилановых субтстратов. "Экзоксиланаза", или "-ксилозидаза", или "ксилан-1,4 ксилозидаза", или "1,4D-ксиланксилогидралаза", или "ксилобиаза", или "экзо-1,4-ксилозидаза" (ЕС 3.2.1.37) включает ферменты, которые гидролизуют последовательные остатки Dксилозы на невосстановленном конце ксилановых полимеров. "Арабиноксиланаза", или "глюкуроноарабиноксиланэндо-1,4 ксиланаза", или "фераксанэндоксиланаза" включают ферменты, которые гидролизуют -1,4-ксилозильные связи в некоторых ксилановых субстратах."Гемицеллюлаза" в изобретении также включает ферменты, которые гидролизуют эфирные связи(эстераза, ЕС 3.1.1) между единицами ксилозы ксиланового полимера и ацетильными группами (ацетилксиланэстераза. ЕС 3.1.1.6 и ЕС 3.1.1.72) или между арабинозильными группами и фенольными составляющими, такими как феруловая кислота (ферулоилэстераза, ЕС 3.1.1.73) и -кумаровой кислотой (кумароилэстераза, ЕС 3.1.1-). Гемицеллюлаза в изобретении также включает -L-арабинофуранозидазу (ЕС 3.2.1.55), которая удаляет арабинозный заместитель из ксиланового каркаса. Соответственно, в изобретении могут применяться "-N-арабинофуранозидаза", "арабинозидаза", "-арабинозидаза", "-L-арабинозидаза", "арабинофуранозидаза", "полисахаридL-арабинофуранозидаза", "-L-арабинофуранозидгидролаза","арабинозидаза", "-L-арабинаназа" или "-L-арабинофуранозидарабинофураногидролаза"."Пектиназа" в изобретении включает любое вещество, которое может гидролизовать пектин или пектиновое вещество. Композиция изобретения может содержать любую пектиназу, например эндополигалактуроназу, пектинметилэстеразу, эндогалактаназу, бета-галактозидазу, пектинацетилэстеразу, эндо- 21019352 пектинолиазу, пектатлиазу, альфа-рамнозидазу, экзо-галактуроназу, экзполиглактуронатлиазу, рамноглактуронангидролазу, рамногалактуронанлиазу, рамногалактуронанацетилэстеразу, рамногалактуронангалактуроногидролазу и ксилогалактуроназу. В данном документе эндополигалактуроназа (ЕС 3.2.1.15) является любым полипептидом, который способен катализировать случайный гидролиз 1,4D-галактозидуроновые связи в пектате и других галактуронанах. Этот фермент может также называться полигалактуроназа, пектиндеполимераза, пектиназа, эндополигалактуроназа, пектолаза, пектингидролаза, пектинполигалактуроназа, поли 1,4 галактуронидгликангидролаза,эндогалактуроназа; эндо-D-галактуроназа или поли(1,4Dгалактуронид)гликангидролаза. В данном документе пектинметилэстераза (ЕС 3.1.1.11) является любым ферментом, который способен катализировать реакцию: пектин +n H2O = n метанол + пектат. Фермент может быть также известен как пектинэстераза, пектиндеметоксилаза, пектинметоксилаза, пектинметилэстераза, пектаза, пектиноэстераза или пектинпектилгидролаза. В данном документе эндогалактаназа (ЕС 3.2.1.89, ЕС 3.2.1.90) является ферментом, который способен катализировать эндогидролиз 1,4 галактозидных связей в арабиногалактанах. Фермент может быть также известен как арабиногалактанэндо-1,4 галактрозидаза, эндо-1,4 галактаназа, галактаназа,арабиноглактаназа или арабиногалактан-4D-галактаногидролаза. В данном документе пектинацетилэстераза определяется как любой фермент, который обладает ацетилэстеразной активностью, которая катализирует деацетилирование ацетильных групп на гидроксильных группах остатков GalUA пектина. В данном документе эндопектинлиазой (ЕС 4.2.2.10) является любой фермент, способный катализировать элиминирующее расщепление (14)D-галактуронанметилового эфира для получения олигосахаридов с 4-деокси-6-О-метилD-галакт-4-энуронозиловых группами на их невосстановленных концах. Фермент может быть также известен как пектинлиаза, пектин-trans-элиминаза; эндопектинлиаза,полиметилгалактуроновая трансэлиминаза, пектинметилтрансэлиминаза, пектолиаза, PL, PNL, PMGL или (14)-6-О-метилD-галактуронанлиаза. В данном документе пектатлиаза (ЕС 4.2.2.2) является любым ферментом, способным катализировать элиминирующее расщепление (14)D-галактоуронана с тем, чтобы дать олигосахариды с 4 деоксиD-галакт-4-энуронозиловых группами на их невосстановленных концах. Фермент может также быть известен как полигалактуроновая трансэлиминаза, трансэлиминаза пектиновой кислоты, полигалактуронатлиаза, эндопектинметилтрансэлиминаза, пектаттрансэлиминаза, эндогалактуронаттрансэлиминаза, лиаза пектиновой кислоты, пектиновая лиаза, лиаза а-1,4-D-эндополигалактуроновой кислоты,PGA-лиаза, РРаза-N, лиаза эндо 1,4-полигалактуроновой кислоты, лиаза полигалактуроновой кислоты,пектин-trans-элиминаза,trans-элиминаза полигалактуроновой кислоты или(14)Dгалактуронанлиаза. В данном документе альфарамнозидаза (ЕС 3.2.1.40) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз концевых невосстановленных остатков -L-рамнозы в -L-рамнозидах или, в ином случае, в рамногалактоуронане. Этот фермент может быть также известен как -Lрамнозидаза Т, -L-рамнозидаза N или -L-рамнозидрамногидролаза. В данном документе экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.82) является любым полипептидом, который способен гидролизовать пектиновую кислоту из невосстановленного конца, высвобождая дигалактуронат. Фермент также может быть известен как экзо-полигалактуронозидаза, экзополигалактуронозидаза или экзополигалактуранозидаза. В данном документе экзогалактуроназой (ЕС 3.2.1.67) является любой полипептид, способный катализировать: (1,4D-галактуронид)n + Н 2 О = (1,4D-галактуронид)n-i + D-галактуронат. Фермент может быть также известен как 1,4 галактуронидаза,экзополигалактуроназа,поли(галакуронат)гидролаза, экзо-D-галактуроназа, экзо-D-галактуронаназа, экзополи-D-галактуроназа или поли(1,4D-галактуронид)галактуроногидролаза. В данном документе экзополигалакуронатлиазой (ЕС 4.2.2.9) является любой полипептид, способный катализировать элиминирующее расщепление 4-(4-дезоксиD-галакт-4-энуронозил)-Dгалактуронат от восстановленного конца пектата, т.е. деэстерифицированного пектина. Этот фермент может быть известен как пектатдисахаридлиаза, пектатэкзолиаза, трансэлиминаза экзопектиновой кислоты, экзопектатлиаза, trans-элиминаза экзополигалактуроновой кислоты, РАТЕ, экзо-РАТЕ, экзо-PGL или(14)D-галактуронан-восстановленный конец-дисахаридлиаза. В данном документе рамногалактуронангидролазой является любой полипептид, который способен гидролизовать связь между галактозилуроновой кислотой и рамнопиранозилом любым эндо-способом в строго переменных рамногалактуронановых структурах, состоящих из дисахарида [(1,2-альфа-Lрамноил-(1,4)-альфа-галактозилуроновой]кислоты. В данном документе рамногалактоуронанлиазой является полипептид, который является любым полипептидом, который способен расщеплять связи -L-Rhap-(14)D-GalpA эндо-способом в рамно- 22019352 галактоуронане посредством бета-элиминации. В данном документе рамногалактоуронанацетилэстеразой является любой полипептид, который катализирует деацетилирование каркаса перемежающихся остатков рамнозы и галактуроновой кислоты в рамногалактуронане. В данном документе рамногалактоуронангалактуроногидролазой является любой полипептид, который способен гидролизовать экзо-способом галактуроновую кислоту из невосстановленного конца строго перемежающейся структуры рамногалактуронана. В данном документе ксилогалактуроназой является любой полипептид, который действует на ксилогалактуронан посредством расщепления -ксилозозамещенного каркаса из галактуроновой кислоты эндо- способом. Данный фермент также может быть известен как ксилогалактуронангидролаза. В данном документе -L-арабинофуранозидазой (ЕС 3.2.1.55) является любой полипептид, который способен действовать на -L-арабинофуранозиды, -L-арабинаны содержащие (1,2) и/или (1,3)- и/или(1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалктаны. Этот фермент может также называться -Nарабинофуранозидаза, арабинофуранозидаза или арабинозидаза. В данном документе эндо-арабинозидазой (ЕС 3.2.1.99) является любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,5 арабинофуранозидных связей в 1,5-арабинанах. Фермент может быть также известен как эндоарабиназа, арабинанэндо-1,5L-араибнозидаза, эндо-1,5Lарабинаназа, эндо 1,5-арабаназа; эндоарабаназа или 1,5L-арабинан-1,5L-арабинаногидролаза."Протеаза" включает ферменты, которые гидролизуют пептидные связи (пептидазы), а также ферменты, которые гидролизуют связи между пептидами и другими составляющими, такими как сахара(гликопептидазы). Множество протеаз характеризуются в соответствии с ЕС 3.4, а являющиеся подходящими для применения в изобретении включены в данный документ посредством ссылки. Некоторые специфичные типы протеаз включают цистеиновые протеазы, включая пепсин, папаин, и сериновые протеазы, включая химотрипсины, карбоксипептидазы и металлоэндопептидазы."Липаза" включает ферменты, которые гидролизуют липиды, жирные кислоты, и ацилглицериды,включая фосфоглицериды, липопротеины, диацилглицерины и т.п. В растениях липиды используются в качестве структурных компонентов для ограничения потери воды и патогенных инфекций. Эти липиды включают воски, полученные из жирных кислот, а также кутин и суберин."Глюкуронидаза" включает ферменты, которые катализируют гидролиз -глюкуронозида с получением спирта и глюкуроната. Множество глюкуронидаз было охарактеризовано и подходит для применения в изобретении, например глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.31), гиалуроно-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.36), глюкуронозил-дисульфглюкозамин глюкуронидаза (3.2.1.56), глицирризинатглюкуронидаза (3.2.1.128) или -D-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139)."Оксидоредуктазой" является любой фермент, который катализирует перенос электронов с одной молекулы (восстановителя, также называемого водородом или донором электронов) на другой (окислитель, также называемый водородом или акцептором электронов), например, является фермент, относящийся к ЕС 1. Примером такого фермента, который может быть применен в способе изобретения, является глюкозооксидаза (ЕС 1.1.3.4), т.е. фермент, который катализирует окисление бета-D-глюкозы в Dглюконо-1,5-лактон. В описанном выше способе комбинация ферментов может быть использована либо одновременно,либо отдельно, либо последовательно, для действия, например, на лигноцеллюлозный субстрат или растительную биомассу, выступая в качестве сырья, с тем чтобы преобразовать этот сложный субстрат в простые сахара и олигосахариды для получения этанола или другого полезного продукта. Соответственно, другой аспект изобретения включает способы, которые используют смеси ферментов, как описано выше, либо одновременно, либо отдельно, либо последовательно, необязательно вместе с дополнительными ферментами или с физическими обработками, такими как температура, и рН для превращения лигноцеллюлозной растительной биомассы в сахара и олигосахариды. Ферментные комбинации или физические обработки могут быть проведены одновременно или последовательно или отдельно. Ферменты могут быть получены экзогенно из микроорганизмов, дрожжей, грибов, бактерий или растений, затем выделены и добавлены к лигноцеллюлозному сырью. В ином случае ферменты продуцируют, но не выделяют, и среда ферментации с сырой клеточной массой или растительный материал (такой как кукурузная солома) и т.п. добавляют в сырье. В ином случае сырая клеточная масса или среда для продуцирования фермента или растительный материал могут быть обработаны для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавление антимикробных средств), после чего их добавляют к сырью. Эти сырые ферментные смеси могут включать организм, продуцирующий фермент. В ином случае фермент может быть получен при ферментации, в которой используется сырье (такое как,кукурузная солома) для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы). Таким образом, растения, которые продуцируют ферменты, могут служить в качестве лигноцеллюлозного сырья и могут добавляться в лигноцеллюлозное сырье. Хотя вспомогательные ферменты обсуждались в качестве смеси, следует признать, что ферменты могут быть добавлены последовательно, где температура, рН, и другие условия могут быть изменены для увеличения активности каждого индивидуального фермента. В ином случае для ферментной смеси могут быть определены оптимальные рН и температура. Полипептид изобретения может быть применен до, в то же самое время или после стадии(ий) предварительной обработки. Полипептид изобретения может, в ином случае, или в дополнение, применяться в комбинации с ферментом, деградирующим некрахмальный углевод (таким как целлюлаза). Соответственно, полипептид, как описано в данном документе, может применяться как часть протокола предварительной обработки, таким образом снижая химические и/или энергетические затраты по сравнению с обычным протоколом предварительной обработки. Полипептид, как описано в данном документе, может применяться как часть протокола осахаривания. Применение полипептида может позволить снизить количество применяемого фермента деградирующего некрахмальный углевод или может позволить снизить время, необходимое для проведения процесса. Способ изобретения может быть осуществлен, т.е. может быть осуществлена реакция с субстратом,содержащим некрахмальный углевод, в мягких условиях, которые не включают обработку сильным нагреванием или кислотой, как это происходит в настоящее время при преобразовании биомассы с помощью биореакторов. Полипептид пероксидазы, описанный в данном документе, можно применять одновременно, отдельно или последовательно с одним или несколькими другими полипептидами или ферментами, описанными в данном документе. Например, ферменты можно инкубировать при около 25 С, около 30 С, около 35 С, около 37 С,около 40 С, около 45 С, около 50 С, или около 55 С. Т.е. их можно инкубировать при температуре от около 20 до около 70 С, в буферах с ионной силой от низкой до средней и при нейтральном рН. Под"средней ионной силой" понимается буфер, который имеет около 200 миллимолярную (мМ) или меньшую концентрацию ионов для какого-либо одного ионного компонента. рН может быть в диапазоне от около рН 2,5, около рН 3,0, около рН 3,5, около рН 4,0, около рН 4,5, около рН 5,0, около рН 5,5, около рН 6, около рН 6,5, около рН 7, около рН 7,5, около рН 8,0, до около рН 8,5. Как правило, диапазон рН будет от около рН 3,0 до около рН 9,0. Инкубация ферментных комбинаций, описанных в данном документе, т.е. полипептида пероксидазы и фермента, деградирующего некрахмальный углевод, например, в условиях, изложенных выше, может привести к высвобождению или освобождению сахара из субстрата, например из лигноцеллюлозы. Количество высвобожденного сахара может составлять по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или более от имеющегося сахара. Обработка ферментом, деградирующим не углевод, может происходить в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 6 до около 120 ч, предпочтительно от около 12 до около 72 ч, более предпочтительно от около 24 до 48 ч. Может быть применена стадия предварительной обработки, включающая инкубацию с ферментом или с ферментной смесью. Стадия предварительной обработки может быть осуществлена при различных температурах, но предпочтительным является, если предварительная обработка происходит при температуре наиболее подходящей для тестируемой ферментной смеси или для прогнозируемого ферментного оптимума тестируемых ферментов. Температура предварительной обработки может находиться в диапазоне от около 10 до 80 С, от около 20 до около 80 С, от 30 до около 70 С, от около 40 до около 60 С, от около 37 до около 50 С, предпочтительно от около 37 до около 80 С, более предпочтительно около 50 С. При отсутствии данных о температурном оптимуме, предпочтительнее вначале осуществлять реакции предварительной обработки при 37 С, а затем при более высокой температуре, такой как 50 С. рН смеси предварительной обработки может находиться в диапазоне от около 2,0 до около 10,0, но предпочтительно от около 3,0 до около 7,0, более предпочтительно от около 4,0 до около 6,0, еще более предпочтительно от около 4,5 до около 5. Опять же, рН может быть скорректирована для максимизации активности и может корректироваться при добавлении фермента. Сравнение результатов анализов этого теста позволит кому-либо модифицировать способ для лучшего соответствия проходящим тестирование ферментам. Реакция предварительной обработки может длиться в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 6 до около 120 ч, предпочтительно от около 6 до около 48 ч, более предпочтительно от около 6 до около 24 ч, наиболее предпочтительно в течение около 6 ч. Если в предварительной обработке применяется полипептид пероксидазы изобретения, то это может позволить использовать мягкие условия, описанные выше, и может позволить избежать применения обработки сильным нагреванием или кислотой, как это происходит в настоящее время при преобразовании биомассы с помощью биореакторов. Способ изобретения для получения сахара или сахаров, как правило, является процессом преобразования сложного углевода, такого как лигноцеллюлоза, в сахара, предпочтительно ферментируемые сахара. Такой процесс может называться "осахариванием". Соответственно, способ изобретения может давать в результате освобождение одного или нескольких гексозных и/или пентозных сахаров, таких как один или несколько из перечисленного: глюкозы, ксилозы, арабинозы, галактозы, D-галактуроновой кислоты, маннозы, рамнозы, сахарозы и фруктозы. Поддающиеся ферментации сахара могут быть преобразованы в полезные продукты ферментации с дополнительными позитивными характеристиками, не ограничивающие примеры которых включают аминокислоты, витамины, лекарства, добавки к кормам для животных, химические продукты тонкого органического синтеза, химическое сырье, пластмассы, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту и этанол, включая топливный этанол. Конкретные продукты с дополнительными положительными характеристиками, которые могут быть получены способами изобретения, включают, но не ограничиваются ими, биотопливо (включая этанол, бутанол и биогаз); молочную кислоту; пластмассы; химические продукты тонкого органического синтеза; органические кислоты, в том числе лимонную кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту,итаконовую кислоту и малеиновую кислоту; 3-гидроксипропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3-пропандиол; этилен, глицерин; растворитель; добавки к кормам для животных, лекарства, такие как -лактамные антибиотики или цефалоспорины; витамины, аминокислоты, такие как лизин, метионин, триптофан, треонин, и аспарагиновую кислоту; промышленные ферменты, такие как протеазы, целлюлазы, амилазы, глюканазы, лактазы, липазы, лиазы, оксидоредуктазы, трансферазы или ксиланазы и химическое сырье. Соответственно, изобретение обеспечивает способ для приготовления продукта ферментации,включающий:a) деградацию некрахмального углевода, например, получение сахара или сахаров из некрахмального углевода с помощью способа, описанного выше; иb) ферментацию полученного материала, с тем чтобы получить продукт ферментации. Продуктом ферментации может быть аминокислота, витамин, лекарство, добавка к кормам для животных, химические продукты тонкого органического синтеза, химическое сырье, пластмассы, этанол,включая топливный этанол (под термином "этанол" понимается включение этилового спирта или смесей этилового спирта и воды). Более специфические продукты ферментации включают молочную кислоту, 3 гидроксипропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, янтарную кислоту, лимонную кислоту, аминокислоту, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, -лактамный антибиотик или цефалоспорин. Способ для получения продукта ферментации может необязательно содержать извлечение продукта ферментации. Такой процесс в соответствии может быть проведен в аэробных или анаэробных условиях. Предпочтительно, если способ проводится в микроаэрофильных условиях или условиях с ограниченным кислородом. Процесс анаэробной ферментации в данном документе определен как процесс ферментации, запускаемый в отсутствии кислорода или в котором фактически не потребляется кислород, предпочтительно менее чем 5, 2,5 или 1 ммоль/л/ч, и в котором органические молекулы служат как донорами электронов,так и акцепторами электронов. Процесс ферментации при ограничении кислорода является процессом, в котором потребление кислорода ограничивается переносом кислорода из газа в жидкость. Степень ограничения кислорода определяется количеством и композицией входящего потока газа, а также актуальными свойствами перемешивания/переноса массы в используемом для ферментации оборудовании. Предпочтительно, если процесс проводится в условиях с ограниченным кислородом, и скорость потребления кислорода составляет по меньшей мере 5,5, более предпочтительно по меньшей мере 6, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 ммоль/л/ч. Изобретение также обеспечивает применение полипептида, обладающего пероксидазной активностью, так как описано в данном документе, для применения в способе для деградации лигнина. В таком применении по изобретению лигнин может быть в форме лигноцеллюлозы. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Следующие примеры иллюстрируют изобретение. Пример 1. Разрушение пероксидазами, полученными из Marasmius scorodonius, лигнинового модельного соединения. 2-Метоксифенол (гваякол), вератриловый спирт, феруловая кислота и кумаровая кислота служили низкомолекулярными лигниновыми модельными соединениями. 2 мМ каждого субстрата инкубировали с 1,5 мкл ферментного раствора и 15 мкл Н 2 О 2 (20 мМ) в натрий-ацетатном буфере (50 мМ, общий объем образца 1,5 мл, рН 6,0, 27 С). Через 60 мин добавляли другие 15 мкл Н 2 О 2 и останавливали реакцию через 2 ч. Коричневатый цвет наблюдали с гваяколом (см. фиг. 1) и феруловой кислотой. Никаких визуально наблюдаемых изменений не происходило в образцах с кумаровой кислотой и вератриловым спиртом."Lignin organosolv" (коричневый порошок, Sigma-Aldrich) использовали для оценки эффектаMsP1 на нерастворимый высокомолекулярный лигнин. 2,5 мг "lignin organosolv" смешивали с 20 мкл раствора MsP1 (либо активного, либо инактивированного тепловой обработкой) в натрий-ацетатном буфере (50 мМ, рН 3-6, общий объем образца 1,5 мл) и 100 мкл раствора пероксида водорода (20 мМ). Другие 100 мкл раствора пероксида водорода добавляли через 60 мин. Общее время реакции составляло 120 мин (инкубация при 27 С на ротационном шейкере). Твердое вещество удаляли центрифугированием и надосадочную жидкость подвергали ВЭЖХ-анализу. Используемые колонки были от Polymer laboratories PL aquagel-OH MIXED и PL aquagel-OH 20, УФ-детекцию осуществляли при 195 нм. Поскольку лигниновый материал нерастворим в воде, надосадочная жидкость образцов с термоинактивированными ферментами оставалась бесцветной. Когда использовали активный фермент, в надосадочной жидкости наблюдали окраску от красной до коричневатой. Высокомолекулярные соединения, высвобожденные обработкой ферментом, отслеживали посредством гель-фильтрации (см. фиг. 2). Для непрерывного получения Н 2 О 2 применяли глюкоза/глюкозаоксидазную систему. 500 мг лигнина (organosolv), 4 мл MsPl, 20 ммоль глюкозы и 10 мкл (10 Ед.) глюкозооксидазы инкубировали в 216 мл натрий-ацетатного буфера (50 мМ, рН 6,0) в течение 24 ч и 140 об/мин при комнатной температуре. Надосадочные жидкости отделяли посредством центрифугирования и анализировали с помощью ВЭЖХ(детекция ДМД и по испарительному светорассеянию). Была зафиксирована значительная солюбилизация изначально нерастворимого материала (см. фиг. 3). После запуска анализа твердые вещества центрифугировали и сушили. Если применяли термоинактивированную пероксидазу, то наблюдали потерю массы сухого осадка, составляющую 2,5%. С активной пероксидазой потери составили 7,3%. Таким образом, в результате активности фермента лигнин частично растворился. Пример 2. Химический анализ кукурузной соломы. Химическую композицию кукурузной соломы характеризовали определением азота по Кьельдалю(белок), экстракцией по Сокслету (липиды), анализом с орцинол-серной кислотой (углеводы) и методом с ацетилбромидом (лигнин) (таблица). Композиция кукурузной соломы Параметр Кукурузная солома Пример 3. Секретом Marasmius scorodonius. Для описания характеристик внеклеточных ферментов, вовлеченных в естественный процесс деградации лигнина, М. scorodonius выращивали в погруженных культурах с использованием кукурузной соломы в качестве источника углерода и азота. Предварительные культуры выращивали в 100 мл стандартного раствора (SNS), а для основной культуры использовали четыре различные среды: Среда А: глюкоза (1,00%)KH2PO4(0,15%) дрожжевой экстракт (0,20%) раствор микроэлементов 1,0 млL-1. Среда В: как среда А, но без глюкозы. Среда С: как среда А, но без дрожжевого экстракта. Среда D: как среда А, но с 0,4% Твин-80 вместо глюкозы. Основные культуры инокулировали 20 мл предварительных культур. Образцы отбирали из культуральных надосадочных жидкостей (в зависимости от скорости роста грибного мицелия) и анализировали секретом посредством ферментных анализов и электрофоретических методов. Лакказы и пероксидазы. Активности лакказы и пероксидазы количественно оценивали с помощью АБТС-анализа, с и без добавления Н 2 О 2 соответственно (см. фиг. 4). Наибольшие пероксидазные активности наблюдали в культурах, выращенных без глюкозы (среда В и D). Окрашенные по активности гели изоэлектрофокусирования указывали на присутствие типов ферментов лакказ (pi 4,5) и пероксидаз (pi 3,7) (см. фиг. 5). Поскольку полосы активности в культурах, выращенных на SNS, не наблюдались, то можно считать, что эти ферменты индуцируются возобновляемым материалом "кукурузной соломой". По сравнению с культуральным ростом в SNS дополненной лигнином (0,1%) высокую пероксидазную активность также детектировали в культурах, содержащих кукурузную солому в среде D (см. фиг. 6). Пептидазы. Только очень низкие пептидазные активности детектировали в культурах, дополненных кукурузной соломой.-Глюкозидазы. 4-нитрофенолD-глюкозид служил в качестве субстрата для количественной оценки глюкозидазной активности в погруженных культурах М. scorcdonius. После гидролиза количественно определяли концентрацию 4-нитрофенола посредством спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой частях спектра при =400 нм (см. фиг. 7). На 16 день культивирования, активности по-прежнему росли в средах В, С и D. Эстеразы. Эстеролитическую активность количественно оценивали с помощью нитрофенол бутирата в качестве субстрата (см. фиг. 8). С помощью окраски активности с помощью "fast Blue SB" и 1-нафтилацетата, эстеролитическую активность визуализировали непосредственно на геле изоэлектрофокусирования (см. фиг. 9). Пример 4. Высвобождение ферментируемых сахаров из кукурузной соломы. Субстрат из кукурузной соломы, применявшийся в гидролитических экспериментах, предварительно обрабатывали в соответствии со следующим протоколом: перемалывание (1 мм); размачивание (5 г кукурузной соломы + 117 мл воды, 1 ч); нагревание (микроволновая печь, 700 Вт, 3 мм); отмывка (800 мл воды); сушка. После этого 50 мг предварительно обработанной кукурузной соломы диспергировали в 1,5 мл натрий-ацетатного буфера (50 мМ, рН 3,5) и добавляли 6 Ед. MsP1, и 7.5 Ед. целлюлазы (Trichodermareesei, Sigma C8546). Активность целлюлазы определяли с помощью 1% раствора 2 гидроксиэтилцеллюлозы в 0,5 М натрий-ацетатном буфере. В одну смесь кукурузной соломы Н 2 О 2 (общее количество 3,2 мкмоль) добавляли периодически, в другую смесь Н 2 О 2 не добавляли. Оба образца инкубировали при 30 С и в срок образцы взяли на анализ содержания глюкозных мономеров. Содержание глюкозных мономеров определяли с помощью анализа восстанавливающих сахаров Нельсона Шомоди. На фиг. 10 высвобождение глюкозного мономера представлено как процент от сухого вещества кукурузной соломы как для активной MsP1 (включая добавление Н 2 О 2), так и для неактивной MsP1 (без добавления Н 2 О 2). Ясно показано, что активная MsP1 в инкубационной смеси в результате дает дополнительную глюкозу, высвобождаемую из кукурузной соломы с помощью целлюлазы из Trichoderma. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ модификации лигноцеллюлозного материала, который включает контактирование указанного лигноцеллюлозного материала с полипептидом, который обладает пероксидазной активностью и который является:a) полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 55% гомологией с аминокислотной последовательностью, изложенной в любой из представленных: аминокислоты с 21 по 513 из SEQ ID NO: 2; аминокислоты с 20 по 510 из SEQ ID NO: 4; аминокислоты с 1 по 493 из SEQ ID NO 6 или аминокислоты с 1 по 491 из SEQ ID NO: 8, илиb) полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность,которая обладает по меньшей мере 55% гомологией с нуклеотидной последовательностью, изложенной в любой из представленных: нуклеотиды с 61 по 1539 из SEQ ID NO: 1; нуклеотиды с 58 по 1530 из SEQID NO: 3; нуклеотиды с 1 по 1479 из SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды с 1 по 1473 из SEQ ID NO: 7,при температуре от около 20 до около 70 С, при рН от около 2,0 до около 10,0 и в течение от около 6 до около 120 ч. 2. Способ по п.1, в котором модификация увеличивает восприимчивость лигноцеллюлозного материала к ферментативной деградации. 3. Способ производства сахара или сахаров из лигноцеллюлозного материала, который включает следующие стадии:(i) предобработку лигноцеллюлозного материала, например химическую обработку; физическую обработку, такую как температурная или ферментативная деградация;(ii) модификацию указанного лигноцеллюлозного материала способом по п.1 или 2;(iii) контактирование модифицированного таким образом лигноцеллюлозного материала с одной или несколькими целлюлазами и/или одной или несколькими гемицеллюлазами и/или одной или несколькими пектиназами при температуре от около 20 до около 70 С, рН от около 2,5 до около 8,5 и в течение периода времени от около 6 до около 120 ч. 4. Способ по п.3, в котором полипептид, обладающий пероксидазной активностью, контактирует с материалом, содержащим некрахмальный углевод, в течение, перед или после стадии предварительной обработки. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором полипептид, обладающий пероксидазной активностью, контактирует с лигноцеллюлозным материалом в комбинации со вспомогательным ферментом, где вспомогательный фермент дополнительно модифицирует указанный материал, содержащий некрахмальный углевод, или увеличивает восприимчивость указанного материала, содержащего некрахмальный углевод, к ферментативной деградации. 6. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором полипептид, обладающий пероксидазной активностью, кодируется полинуклеотидом, полученным из Marasmius scorodonius. 7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором лигноцеллюлозным материалом является садовый грунт, чапаррель, отходы лесопильного производства, городские древесные отходы, городские отходы, отходы лесозаготовок, отходы, полученные при прореживании леса, деревянистые культуры с коротким циклом, индустриальный мусор, пшеничная солома, овсяная солома, рисовая солома, ячменная солома, ржаная солома, льняная солома, соевая шелуха, рисовая шелуха, рисовая солома, кукурузный глютеновый корм, овсяная шелуха, сахарный тростник, кукурузная солома, стебли кукурузы, стержни кукурузных початков, кукурузная шелуха, бородач, трипсакум, лисохвост, свекловичный жом, мякоть цитрусовых плодов, семенные оболочки, целлюлозосодержащие отходы животных, настриг с лужаек,хлопок, морские водоросли, деревья, кустарники, травы, пшеница, пшеничная солома, жмых сахарного тростника, кукуруза, листовые обертки початков кукурузы, стержни кукурузных початков, кукурузные зерна, волокна из зерен, продукты и побочные продукты помола злаков мокрым или сухим способом,твердые городские отходы, макулатура, садовые отходы, травянистый материал, сельскохозяйственные отходы, отходы лесного хозяйства, твердые городские отходы, пульпа, отходы бумажного производства,ветки, кустарники, тростники, кукуруза, кукурузная шелуха, энергетическая сельскохозяйственная культура, лесоматериал, фрукты, цветы, зерно, трава, травянистые культуры, листья, кора, иглы, бревна, корни, саженцы, кусты, просо, деревья, овощи, фруктовая кожура, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничная крупка, овсяная шелуха, твердое или мягкое дерево, материал органических отходов, полученный в ходе сельскохозяйственного процесса, или древесные отходы лесного хозяйства, или комбинации любого из двух или нескольких из них. 8. Способ приготовления продукта ферментации, включающий:a) разрушение лигноцеллюлозного материала согласно способу по любому из пп.3 или 4 в сахар или сахара иb) ферментацию полученного материала,с получением таким образом продукта ферментации, включая аминокислоты, витамины, лекарственные средства, добавки к кормам для животных, продукты тонкого химического синтеза, химическое исходное сырье, пластики, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту и этанол, включая топливный этанол. 9. Способ по п.8, в котором продукт ферментации является этанолом, бутанолом, молочной кислотой, 3-гидроксипропионовой кислотой, акриловой кислотой, уксусной кислотой, янтарной кислотой, лимонной кислотой, яблочной кислотой, фумаровой кислотой, итаконовой кислотой, аминокислотой, 1,3 пропан-диолом, этиленом, глицерином, бутанолом, антибиотиком бета-лактамной группы и цефалоспорином.