Микробиологический способ производства спирта

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА СПИРТА Изобретение относится к производству спиртов путем микробной ферментации, в частности к производству спиртов путем микробной ферментации субстратов, содержащих CO. Более конкретно, оно относится к способам производства спиртов из соответствующих им кислот в присутствии субстрата, содержащего CO. В конкретных вариантах осуществления реакцию ферментации с продуцированием кислоты или кислот и необязательно спирта или спиртов подвергают пертурбации таким образом, что по меньшей мере часть одной или нескольких кислот превращается в спирт. Симпсон Шон Деннис, Колле Кристоф,Тран Пхуонг Лоан, Ал-Синави Бакир,Форстер Ричард Ллуэллин Сидни, Роуэ Мэттью Джеймс, Чань Гэри, Махар Келли Мари (NZ), Фун Дженнифер Монь Е (US)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЛАНЗАТЕК НЬЮ ЗИЛЕНД ЛИМИТЕД (NZ) Область изобретения Настоящее изобретение относится к производству спиртов путем микробиологической ферментации, в частности к производству спиртов путем микробиологической ферментации веществ, содержащих монооксид углерода CO. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам производства спиртов из соответствующих им кислот. Уровень изобретения Спирты применяются во многих отраслях промышленности, включающих парфюмерное и фармацевтическое производство и топливную промышленность. Например, в мире быстро растет значение этанола и бутанола в качестве основных видов жидкого транспортного топлива. Общеизвестны способы производства различных спиртов. Производство технического спирта осуществляют в основном с использованием синтеза, основанного на нефтехимических процессах. Однако также можно применять ферментацию с использованием микроорганизмов (микробиологическую ферментацию) для производства спиртов, например биотоплива, и указанный способ становится все более популярным. Биотопливо для транспортных средств является привлекательной заменой бензину и быстро проникает на рынки топлива в качестве низкоконцентрированных смесей. Биотопливо, полученное из природных растительных источников, экологически более рационально, чем топливо, полученное из ископаемых ресурсов (например, бензин), и использование такого биотоплива позволяет сократить уровень так называемого ископаемого углекислого газа (CO2), который выходит в атмосферу в результате сгорания топлива. Кроме того, можно локализовать производство биотоплива во многих географических регионах,и это сможет уменьшить зависимость от импортирования ископаемых энергетических ресурсов. Спирты,подходящие для использования в качестве биотоплива, включают, среди прочего, этанол, бутанол и 2,3 бутандиол. Этанол быстро становится основным в мире жидким транспортным топливом с высоким содержанием водорода. Мировое потребление этанола в 2005 году составляло приблизительно 12,2 миллиардов галлонов (46,18 миллиардов литров). В будущем также предполагается резкий рост мирового рынка производства топливного этанола в силу повышенного интереса к этанолу в Европе, Японии, США и в ряде развивающихся стран. Например, в США этанол используют для производства Е 10, который представляет собой 10%-ную смесь этанола в бензине. Этанольный компонент в смесях Е 10 действует в качестве окисляющего агента,улучшая эффективность сгорания и сокращая выброс в воздух загрязняющих веществ. В Бразилии этанол удовлетворяет примерно 30% потребности в транспортном топливе в двух аспектах, как в качестве окисляющего агента в смеси с бензином, так и в чистом виде в качестве топлива. В Европе экологические факторы, связанные с последствиями выброса парниковых газов (ВПГ), также стали стимулом для утверждения целевых обязательств по потреблению рационального транспортного биотоплива в государствах - членах Европейского союза. В качестве топлива в двигателе внутреннего сгорания также можно использовать бутанол. Бутанол в несколько раз ближе к бензину, чем этанол. С возрастанием интереса к производству и применению экологически рациональных видов топлива повысилась заинтересованность в биологических способах получения бутанола (часто называемого биобутанолом). Бутанол можно производить посредством микробиологической ферментации биомассы из зерновых культур, например из сахарной свеклы, зерна,пшеницы и сахарного тростника. Однако на стоимость исходного углеводного сырья влияет значение указанных зерновых культур как продуктов питания для человека или кормов для животных, и во всех географических регионах культивирование содержащих крахмал или сахарозу зерновых культур для производства бутанола экономически нерационально. Поэтому представляет интерес разработка технологии превращения в топливный бутанол более дешевых и/или более богатых углеродом источников. Было показано, что анаэробные бактерии, например бактерии рода Clostridium, продуцируют этанол из CO, CO2 и Н 2 посредством биохимического пути ацетилкоэнзима А (KoA). Например, разные штаммыClostridium ljungdahlii, которые продуцируют этанол из газов, описаны в патентах WO 00/68407,ЕР 117309, патентах США 5173429, 5593886 и 6368819, в патентах WO 98/00558 и WO 02/08438. Также известно, что бактерия Clostridium autoethanogenum sp продуцирует этанол из газов (Abrini et al., Archivesof Microbiology. 161, p. 345-351 (1994. Однако производство этанола с использованием микроорганизмов путем ферментации газов обычно сопровождается параллельным продуцированием ацетата и/или уксусной кислоты. Поскольку часть доступного углерода превращается не в этанол, а в ацетат/уксусную кислоту, производство этанола с использованием таких способов ферментации может быть менее подходящим по эффективности. Также может возникать проблема утилизации отходов, за исключением возможности использования в некоторых других целях побочных продуктов, таких как ацетат/уксусная кислота, с использованием микроорганизмов ацетат/уксусная кислота превращается в метан, что потенциально способствует выбросу парниковых газов (ВПГ). Также при использовании обычных способов ферментации могут быть получены другие побочные продукты, такие как масляная кислота/бутират. Кроме того, биологические способы ферментации с обычным использованием дрожжей или бактерий могут быть ограничены производством одного или двух спиртов, где конкретный микроорганизм способен к продуцированию из субстрата, на котором он растет (например, из углевода или газа, содержащего монооксид углерода). Если желательно получение другого спирта, может потребоваться другой микроорганизм. Во многих случаях отсутствует источник бактерий, способных продуцировать желаемый спирт. Поэтому представляет интерес разработка технологии превращения в желаемые продукты, такие как топливный бутанол, более дешевых и/или более богатых углеродом источников, таких как органические кислоты. Способы превращения кислот в соответствующие им спирты с использованием микроорганизмов были описаны ранее: патент США 4851344; White and Simon, Arch. Microbiol. (1992), 158: 81-84; Huber etal., Arch. Microbiol. (1995), 164: 110-118. Однако указанные в них способы также имеют ряд недостатков. Например, в этих способах необходимо использовать химические медиаторы, многие из которых являются токсичными и/или дорогостоящими. Дополнительно, в этих способах используются клеточные экстракты или выделенные клетки, представляющие собой покоящиеся клетки, которые необходимо центрифугировать и ресуспендировать в буфере до превращения кислот в спирты. Указанные стадии обработки являются трудоемкими и увеличивают риск воздействия на микроорганизмы кислорода, риск лизиса или другого повреждения. Настоящее изобретение рассматривает способы получения полезных спиртов путем анаэробной бактериальной ферментации, в которых решены проблемы некоторых недостатков известных в данной области техники способов, или, по меньшей мере, обеспечивает полезный выбор для общества. Сущность изобретения В одном широком аспекте изобретение относится к способу превращения кислоты в соответствующий ей спирт путем использования метаболически активных бактерий, растущих на субстрате, который содержит монооксид углерода и/или водород. В конкретных вариантах осуществления способ включает:a) культивирование в биореакторе одного или нескольких штаммов бактерий - карбоксидотрофов в присутствии субстрата, содержащего CO, для продуцирования одной или нескольких кислот и необязательно одного или нескольких спиртов;b) пертурбацию микробной культуры таким образом, что по меньшей мере одна кислота превращается по меньшей мере в один спирт. Обычно по меньшей мере одна часть кислоты или кислот, полученной на стадии (а), превращается в спирт или спирты на стадии (b). Дополнительно или альтернативно, в биореактор можно добавлять дополнительную кислоту во время стадии (а) и/или стадии (b) и превращать ее по меньшей мере в один спирт. В определенных вариантах осуществления пертурбация микробной культуры включает одно или несколько из следующего: изменение pH жидкой питательной среды, содержащей микробную культуру; изменение окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) жидкой питательной среды, содержащей микробную культуру; добавление одной или нескольких кислот в биореактор; добавление одного или нескольких восстанавливающих агентов в биореактор; изменение концентрации CO в жидкой питательной среде, содержащей микробную культуру; изменение парциального давления CO в биореакторе, в котором субстрат, содержащий CO, является газообразным. В конкретных вариантах осуществления стадия изменения концентрации CO включает повышение концентрации CO в жидкой питательной среде по меньшей мере на 1 ммоль. В другом широком аспекте изобретение относится к способу производства спирта, при этом указанный способ включает, по меньшей мере, следующие стадии:(a) культивирование в биореакторе одного или нескольких бактериальных штаммов в присутствии субстрата, содержащего монооксид углерода;(b) добавление кислоты в биореактор, когда один или несколько бактериальных штаммов находятся в фазе конверсии, для производства спирта соответствующей кислоты,где полученный спирт не является спиртом, который один или несколько бактериальных штаммов способны продуцировать при выращивании на указанном субстрате в отсутствие указанной кислоты. В конкретных вариантах осуществления приведенных выше аспектов способ осуществляют в отсутствие медиатора. В одном варианте осуществления две или более кислот добавляют в биореактор для производства двух или нескольких соответствующих спиртов. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько бактерий представляют собой бактерии,которые способны задействовать путь альдегида оксиредуктазы (AOR) для восстановления кислоты до соответствующего ей спирта. Подходящие бактерии включают виды родов Clostridia, Moorella,Eubacteria, Acetobacteria, Butyribacterium и Desulfobacterium. В конкретном варианте осуществления бактерией является Clostridium autoethanogenum. Обычно кислота представляет собой монокарбоновую или дикарбоновую кислоту. В конкретных вариантах осуществления кислоту выбирают из уксусной, пропионовой, н-масляной, н-валериановой,н-капроновой и бензойной кислот. В конкретных вариантах осуществления получаемый спирт выбирают из этанола, 1-пропанола,1-бутанола, 1-пентанола, 1-гексанола и бензилового спирта. В другом широком аспекте изобретение относится к способу производства бутанола, при этом указанный способ включает, по меньшей мере, следующие стадии:(a) культивирование в биореакторе одного или нескольких бактериальных штаммов, которые адаптированы для продуцирования спирта, отличного от бутанола, в присутствии субстрата, содержащего монооксид углерода;(b) получение бутанола путем добавления бутирата в биореактор, при этом один или несколько бактериальных штаммов активно продуцируют спирт, отличный от бутанола. В другом широком аспекте изобретение относится к способу производства бутанола, при этом указанный способ включает, по меньшей мере, следующие стадии:(a) культивирование в биореакторе одного или нескольких бактериальных штаммов, которые адаптированы для продуцирования этанола, в присутствии субстрата, содержащего монооксид углерода;(b) получение бутанола путем добавления бутирата в биореактор, при этом один или несколько бактериальных штаммов активно продуцируют этанол. В другом широком аспекте изобретение относится к способу производства спирта, при этом указанный способ включает, по меньшей мере, следующие стадии:(b) добавление в биореактор кислоты в момент, когда Clostridium autoethanogenum находится в фазе конверсии, для получения спирта соответствующей кислоты,где полученный спирт не является спиртом, который способен продуцировать Clostridiumautoethanogenum при выращивании на указанном субстрате в отсутствие указанной кислоты. В предпочтительном широком аспекте изобретение относится к способу производства бутанола,при этом указанный способ включает, по меньшей мере, следующие стадии:(b) добавление в биореактор бутирата в момент, когда Clostridium autoethanogenum находится в фазе конверсии, для получения бутанола. Способы настоящего изобретения обычно осуществляют в отсутствие медиатора. В конкретных вариантах осуществления добавленную к биореактор кислоту согласно способам настоящего изобретения получают путем микробиологической ферментации субстрата, содержащего монооксид углерода. В некоторых вариантах осуществления бактерии культивируют в жидких средах в отсутствие дрожжевого экстракта и/или пептона. В одном варианте осуществления средой является LM23 или LM33 согласно дальнейшему описанию настоящего изобретения. В другом широком аспекте изобретение относится к способу производства одного или нескольких спиртов, при этом указанный способ включает, по меньшей мере, следующие стадии:(a) ферментацию субстрата в первом биореакторе для получения одного или нескольких кислот;(b) культивирование одного или нескольких бактериальных штаммов во втором биореакторе в присутствии субстрата, содержащего монооксид углерода;(с) введение одной или нескольких кислот со стадии (а) во второй биореактор в тот момент, когда один или нескольких бактериальных штаммов находятся в сольвентогенной фазе, для получения спиртов, соответствующих одной или нескольким кислотам,где полученный спирт не является спиртом, который способны продуцировать один или несколько бактериальных штаммов при выращивании на указанном субстрате в отсутствие указанной кислоты. В конкретных вариантах осуществления способа отсутствует медиатор. В некоторых вариантах осуществления один или несколько бактериальных штаммов во втором биореакторе представляют собой штаммы, указанные выше в настоящем изобретении. В другом аспекте изобретение относится к способу производства спиртов посредством анаэробной бактериальной ферментации кислоты в биореакторе в присутствии субстрата, содержащего CO. В одном варианте осуществления субстрат имеет такую концентрацию CO, которая способствует превращению кислоты в спирт. В одном варианте осуществления концентрация CO является выше достаточной пороговой концентрации настолько, что это способствует превращению кислоты в спирт. Значение концентрации CO при ферментации выше этой достаточной пороговой концентрации уменьшает производство кислоты или препятствует ему и/или уменьшает или препятствует росту микроогранизмов, что способствует превращению кислоты в спирт. В одном варианте осуществления субстрат имеет концентрацию CO в среде ферментации по меньшей мере приблизительно 2,5 ммоль/л. В одном варианте осуществления концентрация CO составляет по меньшей мере приблизительно 2,75 ммоль/л. В одном варианте осуществления концентрация CO составляет по меньшей мере приблизительно 3 ммоль/л. В одном варианте осуществления концентрация составляет по меньшей мере приблизительно 3,5 ммоль/л. После изучения настоящего раскрытия специалисты в данной области техники смогут оценить, что существует множество способов повышения растворимости CO в среде ферментации, которые включают, но без ограничения, варианты температурных значений и/или добавление солюбилизирующих агентов, таких как масла. При осуществлении настоящего изобретения можно использовать такие способы,если необходимо или желательно получить конкретную концентрацию CO в среде ферментации. В одном варианте осуществления содержащий CO субстрат является газообразным субстратом, и количество растворенного в среде ферментации CO пропорционально парциальному давлению CO при ферментации. В этой связи можно достигать достаточной пороговой концентрации в среде ферментации путем повышения парциального давления CO. В одном варианте осуществления рассматривается такой газообразный субстрат, в котором парциальное давление CO составляет по меньшей мере приблизительно 37 фунтов/кв.дюйм. В другом варианте осуществления парциальное давление CO составляет по меньшей мере приблизительно 47 фунтов/кв.дюйм (1 фунт/кв.дюйм=6,89103 Па). Согласно способам настоящего изобретения в биореактор можно вводить дополнительную кислоту и превращать ее в спирт. В разных вариантах осуществления изобретения способ включает стадию поглощения и восстановления одного или нескольких спиртов, полученных путем ферментации. В другом аспекте изобретение относится к способу производства спиртов и/или кислот, при этом указанный способ включает анаэробную ферментацию первого субстрата в биореакторе для получения одного или нескольких продуктов, включающих спирты и/или кислоты; и в котором второй субстрат,который содержит CO, добавляют в желаемый момент времени таким образом, что увеличивается выработка спирта, например этанола, по отношению к кислоте, например к ацетату. В одном варианте осуществления добавление второго содержащего CO субстрата приводит к тому,что при превращении в спирт по меньшей мере части кислоты получаемая концентрация растворенногоCO в ходе такой ферментации является достаточной пороговой концентрацией или выше нее. В одном варианте осуществления первый субстрат также включает CO; однако способ не ограничен такими вариантами осуществления. Например, в некоторых вариантах осуществления первый субстрат может включать один или несколько углеводов или пируват. Подходящие углеводы могут включать, но без ограничения, целлюлозу, гидролизат целлюлозы, крахмал, гидролизат крахмала, глюкозу, фруктозу,ксилозу, арабинозу или лактозу. В некоторых вариантах осуществления углевод представляет собой фруктозу или ксилозу. В других вариантах осуществления первый субстрат может содержать CO2 и/или Н 2 или любые другие компоненты, подходящие для получения кислот и/или спиртов путем ферментации. В разных вариантах осуществления способ включает стадию поглощения и восстановления одного или нескольких спиртов, полученных путем ферментации. В другом аспекте изобретение относится к способу производства спиртов и/или кислот, при этом указанный способ включает следующие стадии:(a) введение содержащего CO субстрата в первой концентрации в биореактор, который содержит культуру одного или нескольких микроорганизмов; и(b) анаэробная ферментация культуры в биореакторе для получения одного или нескольких продуктов, включающих спирты и/или кислоты из указанного субстрата,при этом концентрацию введенного в биореактор субстрата необязательно можно повышать в желаемый момент времени таким образом, что увеличивается выработка спиртов по сравнению с кислотами. В разных вариантах осуществления повышение концентрации субстрата приводит к тому, что по меньшей мере часть кислоты превращается в спирт, и/или можно повышать концентрацию субстрата выше достаточной пороговой концентрации, при этом по меньшей мере часть кислоты превращается в спирт. В разных вариантах осуществления способ включает стадию поглощения и восстановления одного или нескольких продуктов, полученных путем ферментации. В другом аспекте изобретение относится к способу производства спиртов и/или кислот, при этом указанный способ включает следующие стадии:(a) введение содержащего CO газообразного субстрата при первом значении парциального давления CO в биореактор, который содержит культуру одного или нескольких микроорганизмов; и(b) анаэробная ферментация культуры в биореакторе для получения одного или нескольких продуктов, включающих спирты и/или кислоты, из указанного субстрата,где парциальное давление CO необязательно можно повышать в желаемый момент времени таким образом, что увеличивается выработка этанола по сравнению с ацетатом. В одном варианте осуществления способ включает контроль роста микроорганизмов и/или контроль концентрации одного или нескольких продуктов и/или контроль концентрации CO, при этом можно увеличивать желаемый продукт и/или концентрацию CO, парциальное давление CO. В одном варианте осуществления парциальное давление CO можно увеличивать выше чем 27 фунтов/кв.дюйм. В разных вариантах осуществления повышение парциального давления CO приводит к тому, что по меньшей мере часть кислоты превращается в спирт, и/или можно увеличивать парциальное давление CO выше достаточного порога, при этом по меньшей мере часть кислоты превращается в спирт. В разных вариантах осуществления способ включает стадию поглощения и восстановления спирта,полученного путем ферментации. Согласно другому аспекту изобретение относится к способу регуляции роста микроорганизмов и/или выработки кислоты, и указанный способ включает следующие стадии:(a) введение газообразного субстрата, который содержит CO при первом значении парциального давления CO, в биореактор, содержащий культуру одного или нескольких микроорганизмов; и(b) анаэробная ферментация культуры в биореакторе для получения одного или нескольких продуктов, включающих этанол и/или уксусную кислоту, из указанного субстрата,при этом парциальное давление CO можно повышать в желаемый момент времени таким образом, чтобы происходило уменьшение или значительное торможение роста микроорганизмов и/или выработка кислоты. В разных вариантах осуществления повышение парциального давления CO приводит к превращению в спирт по меньшей мере части кислоты и/или можно повышать парциальное давление CO выше достаточного порога, при этом по меньшей мере часть кислоты превращается в спирт. В одном варианте осуществления с помощью уменьшения парциального давления CO можно увеличивать/облегчать (или повторно запускать) рост микроорганизмов и/или выработку кислоты. В разных вариантах осуществления способ включает стадию поглощения и восстановления спирта,полученного путем ферментации. В другом аспекте изобретение относится к способу регуляции выработки спирта, при этом указанный способ включает следующие стадии:(a) введение газообразного субстрата, содержащего CO, при первом значении парциального давления CO, в биореактор, который содержит культуру одного или нескольких микроорганизмов;(b) анаэробная ферментация культуры в биореакторе для получения из указанного субстрата одного или нескольких продуктов, включающих этанол и/или уксусную кислоту;(c) повышение парциального давления CO выше достаточного порога, таким образом, что по меньшей мере часть кислоты превращается в этанол; и(d) необязательно, последующее уменьшение парциального давления CO ниже порога с тем, чтобы способствовать росту микроорганизмов и выработке кислоты. В разных вариантах осуществления производство спирта и кислоты и/или рост микроорганизмов можно контролировать в течение всего процесса ферментации и/или повторять по меньшей мере один раз стадии (с) и (d). Варианты осуществления изобретения находят конкретное применение при ферментации кислот в присутствии газообразного субстрата, содержащего CO. Указанный субстрат может содержать газ, полученный в качестве побочного продукта в процессе производства. В некоторых вариантах осуществления способ производства выбирают из группы, состоящей из производства продуктов черных металлов, производства продуктов цветных металлов, способов очистки нефти, газификации биомассы, газификации угля, производства электроэнергии, производства технического углерода, производства аммиака, производства метанола и производства кокса. В одном варианте осуществления изобретения газообразным субстратом является синтез-газ. В одном варианте осуществления газообразный субстрат содержит газ,получаемый при прокате стали. В субстрате, содержащем CO, обычно будет содержаться основная часть CO, например по меньшей мере приблизительно от 20 до приблизительно 100% объема CO, от 40 до 95% объема CO, от 40 до 60% объема CO и от 45 до 55% объема CO. В конкретных вариантах осуществления субстрат содержит приблизительно 25%, или приблизительно 30%, или приблизительно 35%, или приблизительно 40%, или приблизительно 45%, или приблизительно 50%, или приблизительно 55%, или приблизительно 60% объема CO. Также могут подходить субстраты с более низкими концентрациями CO, например 6%, в частности, при одновременном наличии Н 2 и CO2. В разных вариантах осуществления ферментацию проводят с использованием культуры одного или нескольких штаммов карбоксидотрофических бактерий. В разных вариантах осуществления карбоксидотрофические бактерии выбирают из бактерий Clostridium, Moorella, Oxobacter, Peptostreptococcus,Acetobacterium, Eubacterium или Butyribacterium. В одном варианте осуществления карбоксидотрофической бактерией является Clostridium autoethanogenum. Способы настоящего изобретения можно применять для производства любого из ряда спиртов,включающих, но без ограничения, этанол и/или бутанол, путем анаэробной ферментации кислот в присутствии субстратов, в частности газообразных субстратов, содержащих монооксид углерода. Способы по изобретению можно также применять для аэробной ферментации, для анаэробной или аэробной фер-5 019266 ментации других продуктов, включающих, но без ограничения, изопропиловый спирт, и для ферментации субстратов, отличных от углеродсодержащих газов. Настоящее изобретение может также включать части, элементы и признаки, приведенные или указанные в описании настоящего изобретения, по отдельности или все вместе, в любой или во всех комбинациях двух или нескольких из указанных частей, элементов или признаков, и в случае, если в настоящем описании приведены конкретные целые числа, имеющие известные эквиваленты в области техники,к которой относится настоящее изобретение, подразумевается, что такие известные эквиваленты включены в настоящее изобретение в качестве отдельно установленных показателей. Краткое описание чертежей Дальнейшее описание сделает очевидными приведенные и другие аспекты настоящего изобретения,которое следует рассматривать во всех его новых аспектах, и описание приведено только посредством примера, со ссылкой на сопровождающие фигуры, на которых показано: Фиг. 1. Превращение бутирата в бутанол с использованием C.autoethanogenum во флаконах с сывороткой. Исходные условия: активная культура C.autoethanogenum, продуцирующая ацетат (4,7 г/л) и этанол(1,2 г/л) с pH 5,5, свободное пространство: избыточное давление 95% CO в CO2 составляет 25 фунтов/кв.дюйм (1 фунт/кв.дюйм=6,89103 Па). Конечные условия: pH 6,35, ацетат (4,7 г/л), этанол (3,2 г/л), свободное пространство: избыточное давление 14 фунтов/кв.дюйм. Фиг. 2. Эффект добавления формиата в культуру одного производственного цикла Clostridiumautoethanogenum, которая продуцирует ацетат и минимум этанола. Раствор формиата добавляли в точке времени t=0 и t=30 мин (примерно), и затем непрерывно в течение 60 мин (примерно). Фиг. 3. Эффект добавления ацетата в непрерывную культуру Clostridium autoethanogenum, продуцирующую этанол, в количестве приблизительно 6 г/л/день и ацетат 1 г/л/день. Добавление ацетатаautoethanogenum, продуцирующую ацетат и этанол. Клеточную рециркуляцию начинали примерно на 2 ч, затем доводили pH до 5,9 примерно 3 дня. После изменения pH поглощался ацетат и вырабатывалось повышенное количество этанола. Фиг. 5. Система, включающая биореактор для роста и биореактор для превращения согласно конкретным вариантам осуществлениям изобретения. Фиг. 6. Система, включающая множество биореакторов для роста и биореактор для превращения согласно конкретным вариантам осуществлениям изобретения. Вариант или варианты осуществления изобретения Далее следует описание настоящего изобретения, включая разные варианты его осуществления,приведенные в общих чертах. Раскрытие настоящего изобретения дополнительно показано в разделе"Примеры", в котором приведены экспериментальные данные, подтверждающие изобретение, конкретные примеры аспектов изобретения и иллюстративные примеры способов осуществления изобретения. Продукты, включающие кислоты и спирты, можно производить с использованием микробной культуры из субстрата, содержащего CO. Согласно способам изобретения пертурбация микробной культуры неожиданно приводит к поглощению кислот с сопутствующей продукцией спиртов микробной культурой. Предполагается, что данный результат может быть обусловлен, по меньшей мере, наличием в ферментационном бульоне части кислоты, которая прямым или опосредованным путем восстановлена до спирта, в частности этанола. Это может приводиться как "конверсионная фаза" реакции ферментации. Согласно способам изобретения с использованием пертурбации микробной культуры реакцию ферментации можно переключать от фазы продукции (или роста), в которой стимулируется микробный рост и продуцируются спирты и/или кислоты, к фазе конверсии. Доказано, что по меньшей мере часть микробной культуры может пребывать в фазе продукции, в то время как по меньшей мере часть находится в фазе конверсии. Однако при пертурбации по меньшей мере часть микробной культуры в фазе продукции переключается на фазу конверсии, и, таким образом,увеличивается выработка спиртов относительно кислот. В конкретном варианте осуществления наблюдается полное чистое поглощение кислоты или кислот и выработка спирта или спиртов. Согласно одному варианту осуществления изобретения этанол продуцируется путем микробной ферментации при пертурбации микробной культуры, продуцирующей такой продукт или продукты, как ацетат и необязательно этанол, из субстрата, содержащего CO. По меньшей мере часть CO можно превращать в кислоты и/или спирты после пертурбации, но большая часть этанола продуцируется микробиологическим восстановлением уксусной кислоты/ацетата ("конверсия"). Существует множество примеров реакций ферментации с использованием субстрата, содержащегоCO, для продуцирования спиртов и/или кислот, в которых спирты и кислоты продуцируются одновременно. Однако в таких примерах по соотношению продуктов кислота (т.е. уксусная кислота/ацетат) обычно превалирует по сравнению со спиртом (этанолом). В другом варианте осуществления изобретения конкретные условия ферментации могут способствовать продукции спирта по сравнению с продук-6 019266 цией кислоты. В таких условиях дополнительная кислота, добавленная в биореактор, с использованием микробной культуры может превращаться в соответствующий спирт. Например, к реакции ферментации можно добавлять такие кислоты, как масляная кислота, и превращать их в спирты, например в бутират. Согласно способам изобретения неожиданно было выявлено отсутствие необходимости использования медиатора, например метилвиологена, чтобы способствовать превращению кислоты или кислот в спирт или спирты. Фактически, было обнаружено, что метилвиологен имеет отрицательный эффект на выработку бутанола с использованием C.autoethanogenum. Это противоречит сообщениям о необходимости медиатора для микробиологической конверсии кислот в соответствующие им спирты. Без связи с какой-либо конкретной теорией предполагается, что превращение кислот в спирты с использованием Clostridium autoethanogenum согласно изобретению происходит посредством биохимического пути с вовлечением фермента альдегида оксиредуктазы (AOR). AOR представляет собой уникальный вольфрамсодержащий фермент, способный к восстановлению неактивированных карбоновых кислот до альдегидов. Альдегид может в дальнейшем восстанавливаться до спирта посредством альдегиддегидрогеназ. AOR представляет собой важную ветвь сольвентогенного пути. Выявлено решающее значение вольфрамового кофактора для активности фермента. Указанные ферменты можно обнаружить в ферментативных микроорганизмах, таких как Clostridium, Desulfitobacterium и Pyrococcus. Альдегидоксиредуктазы с наилучшими характеристиками принадлежат Pyrococcus furiosus, геном которых содержит пять из четырех описанных AOR. Первый AOR бактерии P.furiosus имеет широкий диапазон субстратов, но преимущественно альдегиды, полученные из аминокислот. Его кристаллическая структура показала присутствие участка связывания вольфрама на основе молибдоптерина. Второй AOR, глицеральдегид-3-фосфат-ферредоксиноксиредуктаза (GFOR), только утилизирует глицеральдегид-3-фосфат,и третий AOR, формальдегид-ферредоксиноксиредуктаза (FOR), предпочтительно задействует альдегиды с одним-тремя углеродами. Четвертый AOR под наименованием WOR5 имеет широкий диапазон субстратов. AOR были также выделены из Clostridium formicoaceticum и thermoaceticum. Бактерии Clostridium autoethanogenum содержат два предполагаемых AOR, гены которых примерно на 56% идентичны генам AOR P.furiosus и примерно на 80% генам Clostridium botulinum. Отмечено значительное отличие генов AOR C.autoethanogenum от последовательности наиболее близкородственной бактерии Clostridium kluyveri, в геноме которой не содержатся гены AOR и спирт продуцируется посредством ацетил-СоА. Установлено, что полученные результаты могут быть использованы при производстве любого спирта из соответствующей ему кислоты путем использования Clostridium autoethanogenum или любой другой бактерии, способной задействовать путь AOR. Таким образом, в самом широком аспекте настоящее изобретение относится к способу превращения кислоты в соответствующий ей спирт с использованием микробной культуры. В конкретных вариантах осуществления микробная культура превращает кислоту в спирт в присутствии субстрата, содержащегоCO и/или Н 2. Определения Если не указано иное, везде в настоящем описании используются следующие термины, имеющие следующие определения. Используемый в настоящем описании термин "фаза конверсии" предназначен для обозначения периода времени, в течение которого бактерии ферментируют одну или несколько кислот для получения одного или несколько спиртов. Обычно по меньшей мере часть бактериального пула будет находиться в этой фазе. Однако активная продукция спирта не является обязательной для всего бактериального пула. Фаза конверсии характеризуется наличием содержания спирта в ферментационном бульоне. Термины "пертурбировать", "пертурбация" и т.п., используемые в настоящем изобретении в отношении микробной культуры, включают любое проведенное изменение, которое прямо или косвенно влияет на микробную культуру. Изменения в отношении микробной культуры включают изменения рабочих условий ферментации, таких как pH, концентрация CO, ОВП, или изменение композиции жидкой питательной среды, содержащей культуру. Термин "микробная культура" и т.п., используемый в настоящем изобретении, включает по меньшей мере один микроорганизм, расположенный в и/или на питательной среде, подходящей для стимуляции роста и/или продукции метаболитов. В настоящем описании указано, что "спирт, произведенный" согласно способу изобретения не является спиртом, который способен продуцировать один или несколько бактериальных штаммов при выращивании на субстрате в отсутствие соответствующей кислоты. Однако следует понимать, что согласно приведенным способам могут производиться дополнительные продукты, например кислота или спирт,который бактерии ферментируют из субстрата, на котором их культивируют. "Спирт, произведенный" согласно приведенному способу может называться "первичным спиртом" или "первичным продуктом", и любые дополнительные продукты называются "побочными продуктами". Использование понятия "первичный" не должно подразумевать конкретное содержание продукта по сравнению с побочными продуктами. Понятие "окислительно-восстановительный медиатор или медиаторы" и подобное, используемое в настоящем изобретении, относится к электронному челноку, который действует как обратимый донор электронов и/или акцептор электронов. Медиаторы включают виологеновые красители (такие как метилвиологен), антрахинон и другие хиноновые красители, трифенилметановые красители, фталоцианины,метилидиновые красители, пирроловые красители, порфириновые красители, птеридины, птеридоны,флавины и металлокомплексы вторичных групп VI, VII и VIII. Использование терминов "кислота", "кислоты" и подобных, в отношении добавления "кислоты" к культуре или в биореактор согласно изобретению, необходимо рассматривать широко, включая любые монокарбоновые и дикарбоновые кислоты. Дополнительно, ссылка на добавление "кислоты или кислот" должна включать ссылку на эквивалентную соль или смесь соли и кислоты. Аналогично, в настоящем описании должны присутствовать ссылки на конкретные кислоты, включающие ссылку на эквивалентные соли (например, масляная кислота и бутират), и наоборот. Молекулярное соотношение кислоты и карбоксилата в ферментационном бульоне зависит от pH данной системы. Примеры кислот включают уксусную кислоту, пропионовую кислоту, н-масляную кислоту, н-валериановую кислоту, н-капроновую кислоту и бензойную кислоту. Термин "биореактор" включает устройство для ферментации, состоящее из одного или нескольких резервуаров и/или колонок или схемы расположения трубопроводов, который включает резервуарный реактор с непрерывным перемешиванием (CSTR), реактор иммобилизированных клеток (ICR), реактор с орошаемым слоем (TBR), барботажную колонку, газлифтный биореактор, мембранный реактор, такой как мембранный биореактор с системой полых волокон (HFMBR), статический смеситель или другой резервуар или другое устройство, подходящие для контакта газ-жидкость. Согласно дальнейшему описанию в некоторых вариантах осуществления биореактор может содержать первый реактор для роста и второй реактор для ферментации. Также в отношении добавления в биореактор или в реакцию ферментации одного или нескольких углеводов необходимо подразумевать,что указанное добавление включает добавление или в один, или в оба указанных реактора в необходимых случаях. Понятие "субстраты, содержащие монооксид углерода" включает любой твердый, жидкий или газообразный материал, содержащий CO, который можно вводить в биореактор для ферментации. Понятие"газообразные субстраты, содержащие монооксид углерода" включает любой газ, который содержит монооксид углерода. Газообразный субстрат обычно содержит значительную часть CO по объему, например, такую как по меньшей мере приблизительно от 15 до приблизительно 95% объема CO. Понятие "концентрация растворенного CO" включает количество CO, находящегося в бульоне/среде ферментации, в зависимости от объема. Понятие "парциальное давление CO" и подобное включает относительное давление на систему, которое оказывает CO в газообразном субстрате, включающем CO и необязательно дополнительные газы. Выражение "пороговая концентрация", "достаточная пороговая концентрация" и т.п. можно определять количественно, но эти показатели могут варьировать в разных условиях ферментации, например при использовании разных микроорганизмов; термин включает значение концентрации или диапазон концентрации, при которой происходит переключение микроорганизма от преимущественного продуцирования спирта и/или кислоты из субстрата к продуцированию спирта и потреблению кислоты в течение продолжительного периода. Если в контексте не указано иное, в понятия "ферментация", "способ ферментации" или "реакция ферментации" и подобные, используемые в настоящем изобретении, входит как фаза роста, так и фаза биосинтеза продукта из процесса, охватывающего рост/и или биосинтез продукта с использованием микроорганизма. Согласно способам изобретения продукты, включающие кислоты и спирты, производят путем микробной ферментации из субстрата, который содержит CO, например из газообразного субстрата, содержащего CO. В конкретных вариантах осуществления изобретения активно растущая микробная культура,продуцирующая такие продукты, как кислоту или кислоты и необязательно спирт или спирты, может подвергаться пертурбации таким образом, что по меньшей мере часть микробной культуры поглощает одну или несколько кислот и продуцирует один или несколько соответствующих спиртов. Это может произойти в результате того, что по меньшей мере часть кислоты, присутствующей в ферментационном бульоне, прямо или косвенно восстанавливается до спирта, в частности этанола. Указанное явление может называться "фазой конверсии" реакции ферментации. Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения реакцию ферментации можно переключать от фазы, по существу, продукции, в которой стимулируется рост микроорганизмов и продуцируются спирты и/или кислоты, к фазе конверсии, в которой повышается концентрации CO в реакции ферментации. В других вариантах осуществления изобретения по меньшей мере часть активно растущей культуры может продуцировать спирт или спирты, и пертурбация включает добавление одной или нескольких кислот к культуре таким образом, что по меньшей мере часть одной или нескольких кислот превращается в один или несколько спиртов. В общем, способы настоящего изобретения включают, по меньшей мере, следующее:(а) культивирование в биореакторе одного или нескольких штаммов бактерий в присутствии субстрата, содержащего монооксид углерода, для производства одной или нескольких кислот и необяза-8 019266 тельно одного или нескольких спиртов; и(b) пертурбацию культивируемых бактерий таким образом, что по меньшей мере одна кислота превращается по меньшей мере в один спирт. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере часть кислоты, продуцированной бактериями во время стадии (а), превращается в соответствующий спирт на стадии (b). Однако в конкретных вариантах осуществления в биореактор можно добавлять дополнительную кислоту или кислоты таким образом, что по меньшей мере часть добавленной кислоты или кислот превращается в спирт или спирты на стадии (b). В таких вариантах осуществления полученный спирт может быть не тем спиртом, который один или несколько бактериальных штаммов могут продуцировать при выращивании на субстрате в отсутствие кислоты. Способ предпочтительно осуществляют без медиатора. В конкретном варианте осуществления способ включает, по меньшей мере, следующие стадии:a) культивирование в биореакторе одного или нескольких бактериальных штаммов в присутствии субстрата, содержащего монооксид углерода, при этом бактерии продуцируют спирт или спирты;b) добавление кислоты к культивируемым бактериям в момент, когда по меньшей мере часть культуры находится в фазе конверсии, для получения спирта. Существует ряд примеров реакций ферментации с использованием субстратов, которые содержатCO, для производства спиртов и/или кислот, в которых спирты и кислоты производятся одновременно. Однако в таких примерах в соотношении продуктов обычно превалирует кислота (а именно, уксусная кислота/ацетат) по сравнению со спиртом (этанолом). Подходящие способы пертурбации для переключения микробной культуры от фазы продукции к фазе конверсии включают, но без ограничения, изменение pH и/или ОВП ферментационной среды; изменение концентрации CO в ферментационном бульоне (специалистам в данной области техники известны многие способы достижения таких изменений в зависимости от способа ферментации, которые включают изменение композиции газа, изменение давления газа, изменение скорости потока газа, изменение скорости перемешивания в реакторе CSTR); добавление восстанавливающего агента; добавление одной или нескольких кислот. Соответственно, в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения пертурбация микробной культуры включает одно или несколько из следующего: изменение pH жидкой питательной среды, содержащей микробную культуру; изменение ОВП жидкой питательной среды, содержащей микробную культуру; добавление одной или нескольких кислот в биореактор; добавление одного или нескольких восстанавливающих агентов в биореактор; изменение концентрации CO в жидкой питательной среде, содержащей микробную культуру; изменение парциального давления CO в биореакторе, при этом содержащий CO субстрат является газообразным. Приведенное далее описание сосредоточено на конкретных вариантах осуществления изобретения,однако предполагается возможность применения изобретения в производстве альтернативных спиртов из соответствующих им кислот. Примеры спиртов включают этанол, 1-пропанол, 1-бутанол, 1-пентанол, 1 гексанол и бензиловый спирт. Примеры соответствующих кислот включают, соответственно, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, н-масляную кислоту, н-валериановую кислоту, н-капроновую кислоту и бензойную кислоту. Примеры дополнительных спиртов, которые можно производить согласно изобретению, включают спирты, применяемые в парфюмерном, фармацевтическом производстве и в топливной промышленности. Дополнительно, способ по изобретению можно осуществлять с использованием бактерий, отличных от C.autoethanogenum; например, можно задействовать виды бактерий родов Clostridia, Moorella,Eubacteria, Acetobacteria, Butyribacterium и Desulfobacterium. Более конкретно, можно использовать бактерии Clostridium ljungdahlii, Clostridium aceticum, Clostridium formicaceticum, Moorella thermoacetica,Moorella thermoautotrophica, Eubacterium limosum, Acetobacterium woodii, Butyribacteriummethylotrophicum и Desulfobacterium autotrophicum. Некоторые варианты осуществления изобретения адаптированы для использования газовых потоков, создаваемых при производстве посредством одного или нескольких способов. Такие способы включают способы изготовления стали, в частности способы, производящие газовый поток с высоким содержанием CO или с содержанием CO выше заданного уровня (т.е. 5%). Согласно таким вариантам осуществления предпочтительно используют карбоксидотрофические бактерии для производства кислот и/или спиртов, в частности этанола или бутанола, в одном или нескольких биореакторах. Специалистам в данной области техники после изучения настоящего раскрытия будет очевидна возможность применения изобретения в разных отраслях производства или при отводе отработанных газов, что включает применение в транспортных средствах с двигателем внутреннего сгорания. Также, изучив настоящее раскрытие, специалистам в данной области техники будет очевидна возможность применения изобретения в других реакциях ферментации, включающих реакции с использованием тех же или других микроорганизмов. Таким образом, область настоящего изобретения не считается ограниченной конкретными вариантами осуществления и/или описанными вариантами применения, и ее необходимо рассматривать в более широком смысле; например, источник газового потока не является ограничивающим фактором, за исключением случаев, когда его компонент можно использовать для подачи в реакцию ферментации. Изобретение обладает особенной полезностью для улучшения общего поглощения углерода и/или продукции этанола и других спиртов из газообразных субстратов, таких как автомобильные выхлопные газы и промышленные топливные газы, которые содержат большой объем CO. Ферментация. Способы производства этанола и других спиртов из газообразных субстратов широко известны. Примеры способов включают способы, описанные, например, в патентах WO 2007/117157,WO 2008/115080, патентах США 6340581, 6136577, 5593886, 5807722 и 5821111, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. Известно, что ряд анаэробных бактерий способны осуществлять ферментацию CO до спиртов,включающих н-бутанол и этанол, и до кислот, таких как уксусная кислота, и подходят для использования в способе настоящего изобретения. Примеры таких бактерий, которые могут подходить для использования в настоящем изобретении, включают бактерии из рода Clostridium, такие как штаммы Clostridium(WO 2008/028055) и Clostridium autoethanogenum (Abrini et al., Archives of Microbiology. 161: 345-351). Другие подходящие бактерии включают бактерии из рода Moorella, которые включают Moorella spHUC22-1 (Sakai et al., Biotechnology Letters. 29: 1607-1612), и бактерии из рода Carboxydothermus(Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. et al. (1991), Systematic and Applied Microbiology. 14: 254-260). Дополнительные примеры включают бактерии Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, RuminococcusCritical Reviews in Biotechnology, 2006. Vol. 26, p. 41-65). Дополнительно, подразумевается, что в настоящем изобретении могут быть использованы другие карбоксидотрофические анаэробные бактерии, о чем известно специалистам в данной области техники. Также очевидно, что изобретение может быть применимо к смешанной культуре двух или более бактерий. Одним примером микроорганизма, подходящего для использования в настоящем изобретении, является Clostridium autoethanogenum. В одном варианте осуществления Clostridium autoethanogenum представляет собой штамм Clostridium autoethanogenum с идентифицирующими характеристиками, депонированный в немецком Центре коллекции биологических материалов (DSMZ) под идентификационным номером депозита 19630. В другом варианте осуществления Clostridium autoethanogenum представляет собой Clostridium autoethanogenum с идентифицирующими характеристиками в DSMZ и идентификационным номером депозита DSMZ 10061. Можно проводить культивирование бактерий, используемых в способах настоящего изобретения,применяя любое количество способов, известных в данной области техники для культивирования и ферментации субстрата с использованием анаэробных бактерий. В разделе "Примеры" ниже представлены примеры методик. В качестве дополнительного примера можно применять способы ферментации с использованием газообразных субстратов, описанные в общем в следующих публикациях: (i) K.T. Klasson,et al. (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5: 145-165;Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160; все из которых включены настоящее описание посредством ссылки. Ферментацию можно осуществлять в любом подходящем биореакторе, таком как резервуарный реактор с непрерывным перемешиванием (CSTR), реактор иммобилизированных клеток (ICR), газлифтный биореактор, барботажная колонка (BCR), мембранный биореактор, такой как мембранный биореактор с системой полых волокон (HFMBR) или реактор с орошаемым слоем (TBR). Также в некоторых вариантах осуществления изобретения такой биореактор может содержать первый реактор для роста, в котором культивируют микроорганизмы, и второй реактор для ферментации, в который подается ферментационный бульон из ростового реактора, и в котором вырабатывается основная часть продукта ферментации(например, этанол и ацетат). В некоторых вариантах осуществления, в которых субстрат является газообразным, может быть желательным проведение фазы или фаз продукции и/или конверсии при повышенном давлении, которое может составлять, по меньшей мере, несколько атмосфер. В работе таких систем будет использоваться биореактор, адаптированный к воздействию высокого давления. Многие типы биореакторов можно адаптировать к воздействию высокого давления; примером такого биореактора является реактор BuchiAUTOKLAV. В некоторых вариантах осуществления изобретения биореактор может содержать первый ростовой реактор, в котором культивируют микроорганизмы и необязательно продуцируются кислоты, и второй ферментационный реактор, в который подается бульон из ростового реактора и в котором производится дополнительный, если не основной, спиртовой продукт ферментации (например, этанол). Как отмечено выше, можно использовать ферментационный биореактор высокого давления. Согласно разным вариантам осуществления изобретения источником углерода для реакции ферментации является содержащий CO газообразный субстрат. Субстрат может содержать CO из отработанного газа, получаемого в виде побочного продукта производственного процесса, или из некоторых других источников, например из автомобильных выхлопных газов. В некоторых вариантах осуществления производственный процесс выбирают из группы, состоящей из производства продуктов из черного металла, например проката стали, производства продуктов из цветных металлов, способов очистки нефти,газификации биомассы, газификации угля, производства электроэнергии, производства технического углерода, производства аммиака, производства метанола и производства кокса. В этих вариантах осуществления содержащий CO субстрат можно забирать из производственного процесса перед его выбросом в атмосферу, используя при этом любой удобный способ. В зависимости от композиции субстрата, содержащего CO, перед введением его в ферментацию также может быть желаемой его обработка для удаления каких-либо нежелательных примесей, например частиц пыли. Например, газообразный субстрат можно фильтровать или очищать с применением известных способов. Альтернативно, содержащий CO субстрат можно получать посредством газификации биомассы. Процесс газификации включает частичное сжигание биомассы при ограниченном поступлении воздуха или кислорода. Получаемый газ обычно содержит в основном CO и H2, при минимальных объемах CO2,метана, этилена и этана. Например, можно превращать в газ побочные продукты из биомассы, полученные во время экстракции и обработки пищевых продуктов, таких как сахар из сахарного тростника, или крахмал из кукурузы или зерновых культур, или побочные продукты из непищевой биомассы, образуемые в лесной промышленности, для производства содержащего CO газа, подходящего для использования в настоящем изобретении. Содержащий CO субстрат обычно будет содержать CO как основную часть объема, например по меньшей мере приблизительно от 20 до приблизительно 100% объема CO, от 40 до 95% объема CO, от 40 до 60% объема CO и от 45 до 55% объема CO. В конкретных вариантах осуществления субстрат содержит приблизительно 25%, или приблизительно 30%, или приблизительно 35%, или приблизительно 40%,или приблизительно 45%, или приблизительно 50%, или приблизительно 55%, или приблизительно 60% объема CO. Подходящими также могут быть субстраты, имеющие более низкие концентрации CO, например 6%, в особенности при одновременном наличии Н 2 и CO2. Содержание какого-либо количества водорода в субстрате не является обязательным, однако присутствие Н 2 не должно препятствовать формированию продукта согласно способам изобретения. В конкретных вариантах осуществления присутствие водорода приводит к общему улучшению эффективности производства спирта. Например, в конкретных вариантах осуществления в субстрате может содержаться Н 2:CO в соотношении приблизительно 2:1, или 1:1, или 1:2. В других вариантах осуществления поток субстрата содержит низкие концентрации Н 2, например менее 5%, или менее 4%, или менее 3%, или менее 2%, или менее 1%, или, по существу, не содержит водорода. Субстрат может также содержать некоторое количество CO2, например приблизительно от 1 до приблизительно 80% объема CO2, или от 1 до приблизительно 30% объема CO2. Обычно монооксид углерода добавляют в реакцию ферментации в газообразном состоянии. Однако способы по изобретению не ограничены добавлением субстрата в указанном состоянии. Например, монооксид углерода может представлять собой жидкость. Например, жидкость можно насыщать монооксидом углерода, содержащим газ, и такую жидкость добавлять в биореактор. Это может достигаться с использованием стандартной методики. В качестве примера, с этой целью можно использовать дисперсионный генератор микропузырьков (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobicfermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology. Vol. 101, Number 3/October, 2002). В одном варианте осуществления изобретения продукты производят путем ферментации первого субстрата и второго субстрата. В одном конкретном варианте осуществления изобретения производство спиртов и/или кислот будет осуществляться при наличии первого субстрата, такого как пируват или углевод, например фруктозы или ксилозы, и второго субстрата, такого как субстрат, содержащий CO. Пертурбация ферментации вызывает превращение в спирты (этанол) по меньшей мере части кислот (уксусной кислоты/ацетата). При рассмотрении настоящего раскрытия следует понимать, что существует множество примеров углеводов, известных в данной области техники, которые подходят для ферментации, и множество примеров вариантов способов, применяемых для ферментации углеводного субстрата, возможных для использования в способах по изобретению. В качестве примера подходящие субстраты могут включать, но без ограничения, моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза, олигосахариды, такие как сахароза или лактоза, полисахариды, такие как целлюлоза или крахмал. Все указанные углеводные субстраты (и их смеси) подходят для использования в разных вариантах осуществления настоящего изо- 11019266 бретения, однако углеводные субстраты, которые можно применять более широко, включают глюкозу,фруктозу, ксилозу и сахарозу (и их смеси). Специалистам в данной области техники при изучении настоящего раскрытия следует учитывать,что ферментируемые сахара, подходящие для применения в способах настоящего изобретения, можно получать из целлюлозной и лигноцеллюлозной биомассы посредством процессов предварительной обработки и сахарообразования, как описано, например, в опубликованной патентной заявке США 2007/0031918. Биомассой называют любой целлюлозный или лигноцеллюлозный материал, и она включает материалы, содержащие целлюлозу, и необязательно дополнительно содержащие гемицеллюлозу,лигнин, крахмал, олигосахариды и/или моносахариды. Биомасса включает, но без ограничения, биоэнергетические зерновые культуры, сельскохозяйственные остатки, муниципальные твердые отходы, промышленные твердые отходы, шлам бумажного производства, садовые отходы, лесные и лесопромышленные отходы. В одном варианте осуществления изобретения в качестве необязательных источников углерода и энергии для ферментации используют коммерчески доступную фруктозу или ксилозу. Следует понимать, что для осуществления роста бактерий и ферментации CO в продукт, в дополнение к газообразному субстрату, содержащему CO, в биореактор необходимо подавать подходящую жидкую питательную среду. Питательная среда будет содержать достаточно витаминов и минералов, чтобы допустить рост используемых микроорганизмов. В данной области техники известны анаэробные среды,подходящие для ферментации этанола, с применением CO в качестве единственного источника углерода. Например, подходящие среды описаны в патентах США 5173429 и 5593886 и патентах WO 02/08438,WO 2007/115157 и WO 2008/115080, приведенных выше. В настоящем изобретении рассматривается новая среда, обладающая повышенной эффективностью для поддержания роста микроорганизмов и/или производства спирта в способе ферментации. Более подробное описание указанной среды приведено ниже. Чтобы происходила желаемая ферментация (например, от CO до этанола), ее желательно проводить в подходящих условиях. Условия рассматриваемой реакции включают давление, температуру, скорость потока газа, скорость потока жидкости, pH среды, окислительно-восстановительный потенциал среды,скорость перемешивания (при использовании резервуарного реактора непрерывного перемешивания),уровень инокуляции, максимальные концентрации газообразного субстрата, гарантирующие, что CO в жидкой фазе не станет ограничением, и максимальные концентрации продукта, чтобы избежать ингибирования продукта. Подходящие условия описаны в патентах WO 02/08438, WO 07/117157 иWO 08/115080. Оптимальные условия реакции частично будут зависеть от конкретно используемого микроорганизма. Однако, в общем, предпочтительно проводить ферментацию при давлении выше давления окружающей среды. Работа при высоком давлении позволяет значительно увеличить скорость перехода CO из газовой фазы в жидкую фазу, в которой микроорганизм может поглощать CO в качестве источника углерода для продуцирования этанола. Это, в свою очередь, означает, что можно уменьшать время нахождения (определяемое как объем жидкости в биореакторе, деленный на скорость потока входящего газа),когда в биореакторах поддерживается не атмосферное давление, а высокое давление. Также, поскольку данная скорость превращения от CO до продукта частично зависит от времени нахождения субстрата и достижение желаемого времени нахождения, в свою очередь, диктует необходимый объем биореактора, при этом использование герметичных систем может значительно уменьшать необходимый объем биореактора и, следовательно, капитальные затраты на оборудование для ферментации. Согласно примерам, приведенным в патенте США 5593886, возможно уменьшение объема реактора с линейной зависимостью от повышения рабочего давления реактора, т.е. объем биореакторов, работающих при давлении 10 атм, должен составлять только одну десятую объема биореакторов, которые работают при давлении в 1 атм. Преимущества проведения ферментации газа в этанол при высоком давлении также были описаны в других источниках. Например, в патенте WO 02/08438 описана ферментация газа в этанол, проводимая под давлением 30 и 75 фунтов/кв.дюйм с получением этанола на выходе 150 и 369 г/л/день соответственно. При этом по полученным данным, в примерах ферментации, проводимых при атмосферном давлении с использованием сходных сред и композиций поступающего газа, вырабатывалось от 10 до 20 раз меньше этанола на 1 л/день. Также желательно иметь такую скорость введения газообразного субстрата, содержащего CO, которая гарантирует, что концентрация CO в жидкой фазе не станет ограничением. Это обусловлено возможными последствиями ограничения количества CO, когда в таких условиях, например, этанольный продукт поглощается культурой. В конкретных вариантах осуществления изобретения этанол производят микробной ферментацией при пертурбации системы в закрытых резервуарах. В ряде приведенных в изобретении примерах ферментации pH является неконтролируемым, и при превращении кислоты в спирт pH увеличивается. В таких примерах происходит увеличение pH примерно до 6,5, что может иметь ингибирующий эффект на превращение; специалистам в данной области техники будет очевидно, что способы изобретения могут включать контроль pH в ферментационной среде. Регенерация продукта. В результате ферментации согласно способам изобретения получают ферментационный бульон, содержащий желаемый продукт (такой как этанол и/или бутанол) и/или один или несколько побочных продуктов (таких как ацетат и бутират), а также бактериальные клетки в питательной среде. Продукты реакции ферментации можно регенерировать с использованием известных способов. Примеры способов включают способы, описанные в патентах WO 07/117157, WO 08/115080, патентах США 6340581, 6136577, 5593886, 5807722 и 5821111. Однако кратко и только в качестве примера можно регенерировать этанол из ферментационного бульона такими способами, как фракционная дистилляция или выпаривание и экстрактивная ферментация. При дистилляции этанола из ферментационного бульона получают азеотропную смесь этанола и воды (т.е. 95% этанола и 5% воды). Впоследствии можно получать безводный этанол с использованием технологии молекулярного сита для обезвоживания этанола, которая также известна в данной области техники. Методики экстрактивной ферментации охватывают использование смешиваемого с водой растворителя, который обладает низким риском токсичности для ферментирующего микроорганизма, для регенерации этанола из разведенного ферментационного бульона. Например, при этом варианте способа экстракции возможным для использования растворителем является олеиловый спирт. Олеиловый спирт непрерывно поступает в биореактор, вследствие чего данный растворитель поднимается, образуя в биореакторе верхний слой, который непрерывно экстрагируется и подается через центрифугу. Затем воду и клетки легко отделяют от олеилового спирта и возвращают в биореактор, при этом содержащий большое количество этанола растворитель подается в устройство мгновенного испарения. Большую часть этанола выпаривают и конденсируют, при этом олеиловый спирт не является летучим и регенерируется для повторного использования в ферментации. Ацетат, который получают в реакции ферментации в качестве побочного продукта, можно также регенерировать из ферментационного бульона, используя известные в данной области техники способы. Например, можно использовать адсорбционную систему, в которую входит фильтр с активированным углем. В этом случае предпочтительно сначала удалить из ферментационного бульона микробные клетки, используя подходящее устройство для сепарации. В данной области техники известно множество основанных на фильтрации способов создания бесклеточного ферментационного бульона для регенерации продукта. Бесклеточный пермеат, содержащий этанол и ацетат, затем пропускают через колонку,содержащую активированный уголь, для адсорбции ацетата. Активированный уголь легко адсорбирует ацетат в кислотной форме (уксусную кислоту), в отличие от солевой формы (ацетат). Поэтому предпочтительно, чтобы перед прохождением ферментационного бульона через колонку с активированным углем его значение pH было снижено приблизительно менее чем до 3, для превращения основной части ацетата в форму уксусной кислоты. Уксусную кислоту, адсорбированную на активированный уголь, можно регенерировать элюированием, используя известные в данной области техники способы. Например, для элюирования связанного ацетата можно использовать этанол. В некоторых вариантах осуществления для элюирования ацетата можно использовать этанол, непосредственно полученный способом ферментации. Поскольку температура кипения этанола составляет 78,8C и температура кипения уксусной кислоты 107C, можно легко разделять этанол и ацетат друг от друга, используя способ на основе летучести, такой как дистилляция. Другие способы регенерации ацетата из ферментационного бульона также известны в данной области техники и могут применяться в способах настоящего изобретения. Например, в патентах США 6368819 и 6753170 описана система растворителя и сорастворителя, которую можно использовать для экстракции уксусной кислоты из ферментационных бульонов. Аналогично примеру с системой на основе олеилового спирта, описанной для экстракционной ферментации этанола, в системах, описанных в патентах США 6368819 и 6753170, рассмотрены не смешиваемый с водой растворитель/сорастворитель,который можно смешивать с ферментационным бульоном как в присутствии ферментирующих микроорганизмов, так и без них, для экстракции продукта уксусной кислоты. Затем из бульона путем дистилляции выделяют растворитель/сорастворитель, содержащий продукт - уксусную кислоту. Затем можно применять вторую стадию дистилляции для очистки уксусной кислоты из системы растворитель/сорастворитель. Продукты реакции ферментации (например, этанол и ацетат) можно регенерировать из ферментационного бульона путем непрерывного удаления части бульона из ферментационного биореактора, сепарацией микробных клеток из бульона (что удобно путем фильтрации) и регенерацией одного или нескольких продуктов из бульона одновременно или последовательно. В случае с этанолом, его можно удобно регенерировать дистилляцией, и ацетат можно регенерировать адсорбцией на активированном угле, используя описанные выше способы. Сепарированные микробные клетки предпочтительно возвращают в ферментационный биореактор. Бесклеточный пермеат, остающийся после удаления этанола и ацетата, также предпочтительно возвращают в ферментационный биореактор. В бесклеточный пермеат можно добавлять дополнительные питательные вещества (например, витамины В) для восполнения пи- 13019266 тательной среды перед ее возвращением в биореактор. Также при регулировании pH бульона, как описано выше, для повышения адсорбции уксусной кислоты на активированный уголь необходимо повторное регулирование pH до уровня, сходного с уровнем pH бульона в ферментационном биореакторе, перед его возвращением в биореактор. Далее следует более подробное описание изобретения со ссылкой на примеры, не ограничивающие его объем. Превращение кислоты или кислот в спирт или спирты. В конкретном широком аспекте изобретение относится к способу превращения кислоты или кислот в соответствующий спирт или спирты, с использованием микробной культуры. В конкретных вариантах осуществления микробная культура превращает кислоту в спирт в присутствии субстрата, содержащегоCO и/или H2. Согласно способам изобретения можно подвергать пертурбации микробную культуру, содержащую одну или несколько карбоксидотрофических бактерий, таким образом, что микробная культура превращает кислоту или кислоты в спирт или спирты. Способы изобретения могут быть использованы в ряде реакций микробной ферментации, в которых задействован CO в качестве исходного субстрата, и продуцируется одна или несколько кислот и/или спиртов. Например, согласно способам изобретения можно проводить реакции ферментации для производства ацетата, бутирата, пропионата, капроата, этанола,пропанола и бутанола. Способы по изобретению также можно применять в производстве водорода. Указанные продукты могут быть произведены, например, путем ферментации с использованием карбоксидотрофических микроорганизмов рода Moorella, Clostridia, Ruminococcus/Peptostreptococcus, Acetobacterium, Eubacterium, Butyribacterium, Oxobacter, Methanosarcina и Desulfotomaculum. В конкретных вариантах осуществления микробная культура содержит ацетогенные бактерии, такие как Clostridium autoethanogenum, которые обычно используют содержащий CO субстрат для производства продуктов, включающих ацетат и/или этанол. В таких вариантах осуществления микробную культуру можно выращивать в желаемых условиях в ферментационном бульоне, чтобы стимулировать рост и продукцию ацетата. Фаза роста (или продукции) ацетогенных бактерий обычно связана с увеличением клеточного материала (накопление биомассы) и продукцией ацетата, при небольшой сопутствующей продукции спирта или при отсутствии такой продукции. В конкретных вариантах осуществления изобретения микробную культуру подвергают пертурбации таким образом, что кислоты в ферментационном бульоне превращаются в соответствующие спирты (например, ацетат в этанол и/или бутират в бутанол). Превращение кислот в спирты можно называть фазой конверсии. В конкретных вариантах осуществления изобретения микробную культуру можно подвергать пертурбации таким образом, что кислоты, продуцируемые культурой во время фазы продукции, превращаются в спирты. Дополнительно или альтернативно, можно проводить пертурбацию микробной культуры таким образом, что в спирты превращаются кислоты, полученные не в культуре во время фазы продукции. Например, спирты, не вырабатываемые микробной культурой (такие как пропионат, бутират, валерат, гексаноат, изовалерат, 2-метилбутират), можно добавлять в ферментационный бульон и превращать в соответствующие спирты. В одном варианте осуществления изобретения кислоту сначала вводят или добавляют в реакцию ферментации перед фазой конверсии или во время нее. Кислоту необязательно можно добавлять однократно, или периодически, или непрерывно на протяжении желаемого периода времени. Количество кислоты, добавляемой в биореактор, может варьировать. Однако авторы настоящего изобретения рассматривают добавление кислоты в количестве, которое обеспечивает концентрацию приблизительно от 0,1 до 100 г кислоты в 1 л ферментационного бульона. Более предпочтительным является добавление кислоты в количестве, которое дает концентрацию приблизительно от 0,1 до 50 г/л или от 1 до 20 г/л. Дополнительные примеры соответствующих уровней содержания кислоты, добавляемой к бактериальной культуре, будут приведены в разделе "Примеры" настоящего описания. Кислоту можно добавлять в биореактор порциями, периодически или непрерывным образом. В одном варианте осуществления кислоту добавляют периодически или непрерывным образом, чтобы поддерживать концентрацию кислоты в биореакторе в пределах указанного выше диапазона. Кислоту можно добавлять в биореактор в любом подходящем виде, включающем композиции, содержащие кислоту и один или несколько других компонентов, носители или разбавители. В одном варианте осуществления кислоту предпочтительно получают и добавляют в биореактор в виде стокового раствора с забуференным pH 5,5. Используемые в изобретении кислоты можно производить любым из числа известных способов,включающих микробную ферментацию. В одном варианте осуществления кислоты производят путем микробной ферментации на субстратах, которые содержат, например, углеводы или монооксид углерода. Кислоты предпочтительно производят микробной ферментацией на субстрате, содержащем монооксид углерода, более предпочтительно на газообразном субстрате, содержащем монооксид углерода. Примеры бактерий, задействованных в производстве кислот, включают полезные для этих целей бактерии из родовClostridia, Moorella и Ruminococcus, Eubacteria, Butyribacterium, Oxobacter и Acetobacteria. В предпочтительных вариантах осуществления бактерии выбирают из следующих: Clostridium autoethanogenum,- 14019266Clostridium ljungdahlii, Clostridium aceticum, Clostridium formicaceticum, Clostridium tetanomorhhum,Clostridium carboxidivorans, Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus productus,Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Oxobacter pfenningii и Acetobacterium woodii. Специалисты в данной области смогут легко определить дополнительные бактерии для использования в производстве кислот, применяемых в настоящем изобретении. Специалистам в данной области техники, в особенности имеющим отношение к представленной в настоящем описании информации, будут понятны способы микробиологической ферментации для производства кислот, применяемых в изобретении. Однако в качестве примера, можно производить бутират из газов, содержащих монооксид углерода, как описано авторами Grethlein et al., 1991 (Journal ofFermentation and Bioengineering, vol 72, No 1, 58-60). В одном варианте осуществления изобретения способ представляет собой периодический или непрерывный процесс, который связывает производство желаемой кислоты путем микробной ферментации с последующим применением этой кислоты для производства соответствующего ей спирта согласно способам, описанным выше в настоящем изобретении. В этом варианте осуществления способ включает, по меньшей мере, следующие стадии: (а) ферментацию субстрата в первом биореакторе (предпочтительно субстрата, содержащего монооксид углерода, более предпочтительно газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода) для производства одной или нескольких кислот; (b) культивирование во втором биореакторе одного или нескольких бактериальных штаммов в присутствии субстрата, содержащего монооксид углерода; и (с) введение одной или нескольких кислот со стадии (а) во второй биореактор в момент, когда один или несколько бактериальных штаммов находятся в конверсионной фазе для производства спиртов, соответствующих одной или нескольким кислотам. В родственном варианте осуществления бактерии могут поступать в первый и/или второй биореактор из дополнительных ростовых реакторов. В конкретных вариантах осуществления бактерии культивируют в присутствии субстрата, содержащего монооксид углерода, однако в альтернативных вариантах осуществления бактерии сначала можно выращивать до желаемой плотности на альтернативном субстрате, например на субстрате, содержащем сахар или другие углеводы. Затем можно переносить бактерии на субстрат, содержащий монооксид углерода, для превращения кислот в соответствующие им спирты. Такой вариант можно осуществлять в двух реакторных системах, как описано выше. Для производства спиртов и/или кислот можно применять реакции ферментации, в которых задействованы смешанные субстраты, например углевод и газообразный субстрат, содержащий CO. Согласно способам изобретения при пертурбации таких ферментационных реакций поглощается по меньшей мере часть кислоты и увеличивается выработка спирта. Согласно способам настоящего изобретения спирты и/или кислоты можно производить микробной ферментацией альтернативного субстрата, такого как углеводы. В заданный момент времени или при накоплении избыточного количества кислоты в биореактор можно добавлять CO и необязательно подвергать дополнительной пертурбации реакцию ферментации, чтобы превратить по меньшей мере часть кислоты в спирт. Следует понимать, что для поддержки роста и конверсии бактерий, задействованных согласно изобретению, в биореактор необходимо подавать подходящую питательную среду. Специалисты в данной области техники легко определят среду для использования в настоящем изобретении. Однако, в общем,питательная среда будет содержать витамины, минералы и металлы, достаточные, чтобы допустить рост бактерий на субстратах, содержащих CO. В частности, среда будет включать один или несколько металлов, способствующих активности ферментов, которые могут быть вовлечены в превращение кислот в соответствующие им спирты, например CODH (CO-дегидрогеназа) и ферменты AOR. В одном варианте осуществления изобретения питательные среды не содержат ни триптон, ни дрожжевой экстракт. Анаэробные среды, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают среды с рецептуройLM23 и LM33, описанные в разделе "Примеры". Для поддержания роста и образования продукта можно использовать единственный тип среды, но следует понимать, что в способе по изобретению можно задействовать более одной среды. Например,если в способе используются отдельные реакторы для роста и ферментации, можно применять одну среду в ростовом реакторе и другую среду в ферментационном реакторе. Культивирование бактерий желательно следует проводить в соответствующих условиях, позволяющих превращать кислоты в спирты. Условия реакции, которые необходимо учитывать, включают давление, температуру, скорость потока газа, скорость потока жидкости, pH среды, окислительновосстановительный потенциал среды, скорость перемешивания (при использовании резервуарного реактора с непрерывным перемешиванием), уровень инокуляции, максимальные концентрации газообразного субстрата, которые гарантируют, что CO в жидкой фазе не станет ограничением, и максимальные концентрации продукта, чтобы избежать ингибирования продукта. Примеры условий приведены в разделе"Примеры" настоящего описания. Оптимальные условия реакции частично будут зависеть от используемых бактерий и спирта, который будет произведен. Также желательно, чтобы скорость введения содержащего CO субстрата служила гарантией, что концентрация CO в жидкой фазе не станет ограничением. Это обусловлено возможными последствиями ограничения количества CO, и в таких условиях продукт или продукты поглощаются культурой. Специалистам широкого профиля после изучения настоящего раскрытия будет понятно, что можно изменять ряд условий или параметров ферментации для осуществления пертурбации микробной культуры таким образом, чтобы по меньшей мере часть микробной культуры переключать от фазы продукции к конверсионной фазе. Например, можно изменять параметры ферментации таким образом, что кислоты превращаются в спирты с использованием микробной культуры. Подходящие варианты пертурбации для переключения микробной культуры от фазы продукции к конверсионной фазе включают: изменение pH и/или ОВП ферментационной среды; изменение концентрации CO в ферментационном бульоне (существует множество способов достижения такого изменения в зависимости от способа ферментации, включающих изменение газовой композиции, изменение давления газа, изменение скорости потока газа, изменение скорости перемешивания в реакторе CSTR); добавление восстанавливающего агента; добавление одной или нескольких кислот. Таким образом, специалисту в данной области техники будут очевидны подходящие способы достижения желаемой пертурбации и дополнительные способы пертурбации микробной культуры согласно способам изобретения. В этой связи несколько примеров способов описаны в разделе "Примеры" ниже в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления изобретения добавление одной или нескольких кислот к ферментационному бульону обеспечивает подходящую пертурбацию по меньшей мере части микробной культуры, для ее переключения от фазы продукции к конверсионной фазе. Например, к активно растущей и продуцирующей ацетат и спирты микробной культуре можно добавлять ацетат, и культура превращает в этанол по меньшей мере часть добавленного ацетата. В одном варианте осуществления изобретения можно добавлять дополнительный ацетат к реакции ферментации, в которой происходит непрерывное продуцирование спирта и ацетата со скоростью приблизительно 15 г/л/день. Следовательно, превращение ацетата в этанол в культуре будет происходить со скоростью от 6 до 15 г/л/день. В альтернативном варианте осуществления добавление дополнительных кислот может сочетаться по меньшей мере с одним другим параметром пертурбации, например с изменением концентрации CO в ферментационном бульоне или добавлением восстанавливающего агента. Согласно способам изобретения можно использовать любой подходящий восстанавливающий агент, однако в качестве примера, к реакции ферментации можно добавлять соли дитионитов (например,дитионит натрия), соли сульфидов (например, сульфид натрия) или цистеин и необязательно дополнительную кислоту или кислоты таким образом, что по меньшей мере часть микробной культуры переключается от фазы продукции к конверсионной фазе, и, таким образом, кислоту или кислоты превращаются в соответствующий спирт или спирты. В конкретных вариантах осуществления сульфид натрия добавляют в реакцию ферментации, в которой продуцируется преимущественно ацетат, таким образом, что по меньшей мере часть ацетата превращается в этанол. Специалисты в данной области техники смогут определить количество восстанавливающего агента, необходимого для достаточной пертурбации системы,в целях преобразования кислоты в спирты. Однако в качестве примера, можно добавлять восстанавливающий агент в концентрации от 0,005 до 10 мМ или от 0,05 до 1 мМ. В конкретных вариантах осуществления изобретения в дополнение к восстанавливающему агенту добавляют окислительновосстановительный медиатор, такой как метилвиологен. Добавление окислительно-восстановительного медиатора имеет отрицательный эффект, таким образом, согласно конкретным вариантам осуществления изобретения способ превращения кислоты или кислот в спирт или спирты предпочтительно проводят в отсутствие окислительно-восстановительного медиатора. В другом варианте осуществления изобретения в реакцию ферментации добавляют формиат для переключения микробной культуры от фазы продукции к конверсионной фазе. В конкретных вариантах осуществления изобретения в микробную культуру можно добавлять от 2 до 5 г/л формиата таким образом, что вырабатываемый культурой во время фазы продукции ацетат превращается в этанол. В конкретных вариантах осуществления формиат можно добавлять со скоростью приблизительно 3-6 г/л/день таким образом, что по меньшей мере часть продуцируемого культурой ацетата превращается в этанол. В другом варианте осуществления изобретения микробную культуру можно подвергать пертурбации путем изменения pH и/или ОВП (открытый окислительно-восстановительный потенциал) ферментационной среды, содержащей микробную культуру, таким образом, что кислота или кислоты превращаются в спирт или спирты. Специалистам в данной области техники будут очевидны средства и/или способы изменения pH и/или ОВП ферментационной среды. Однако в качестве примера можно регулировать pH жидкой питательной среды, содержащей микробную культуру, с использованием кислоты (например, хлористо-водородной кислоты, серной кислоты или уксусной кислоты) или субстрата (например, гидроксида натрия). Аналогично, можно регулировать ОВП вместе с pH или независимо путем добавления восстанавливающих агентов. В конкретном варианте осуществления pH жидкой питательной среды, который поддерживают на уровне 5,5, увеличивают до 5,9 путем добавления гидроксида натрия таким образом, что ацетат, выраба- 16019266 тываемый в фазе продукции, превращается в этанол. При изменении pH окислительновосстановительный потенциал среды уменьшался приблизительно от -430 до -470 мВ. В другом варианте осуществления изобретения повышение концентрации CO в биореакторе переключает по меньшей мере часть микробной культуры от фазы продукции к конверсионной фазе. В некоторых вариантах осуществления микробную культуру помещают в жидкую питательную среду в биореактор с перемешиванием, например CSTR. Считается, что по причине низкой растворимости CO концентрация CO в жидкой питательной среде при высокой плотности клеток (например, от 0,5 до 5 г/л) приближается к нолю, поскольку микробная культура поглощает CO примерно с той же скоростью, с которой CO переносится в раствор. Концентрацию CO в жидкой питательной среде можно увеличивать путем повышения парциального давления CO согласно закону Генри. Таким образом, согласно конкретным вариантам осуществления изобретения микробную культуру подвергают пертурбации путем повышения парциального давления CO в биореакторе. Согласно одному варианту осуществления изобретения этанол производят путем микробной ферментации при увеличении концентрации CO в ферментационной среде. По меньшей мере часть CO можно превращать в кислоты и/или спирты во время указанной конверсионной фазы, но большая часть этанола может продуцироваться путем микробного восстановления уксусной кислоты/ацетата. Признано,что некоторые реакции ферментации можно проводить при высоком парциальном давлении CO. Таким образом, для увеличения концентрации CO в ферментационной среде можно повышать парциальное давление CO по меньшей мере на 15 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 20 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 25 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 30 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 35 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 40 фунтов/кв.дюйм, чтобы осуществлять превращение кислоты или кислот в спирт или спирты. В одном варианте осуществления изобретения значительная часть кислоты в ферментационном бульоне превращается в спирт. В некоторых вариантах осуществления изобретения повышение концентрации CO приводит к превращению в спирт по меньшей мере 60% кислоты, доступной в ферментационном бульоне. В других вариантах осуществления по меньшей мере 70% кислоты превращается в спирт. В других вариантах осуществления по меньшей мере 80% кислоты превращается в спирт. В конкретных вариантах осуществления изобретения парциальное давление CO увеличено примерно на 15,9 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 20 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 30 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 40 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 50 фунтов/кв.дюйм таким образом, что кислоты превращаются в соответствующие спирты. Предполагается, что в таких вариантах осуществления согласно закону Генри концентрация CO в жидкой питательной среде будет составлять по меньшей мере 1 ммоль, или по меньшей мере 1,2 ммоль, или по меньшей мере 1,4 ммоль, или по меньшей мере 1,6 ммоль, или по меньшей мере 1,8 ммоль, или по меньшей мере 2,2 ммоль, или по меньшей мере 2,6 ммоль, или по меньшей мере 3,2 ммоль. В некоторых вариантах осуществления изобретения кислоты превращаются в соответствующие спирты с примерной скоростью по меньшей мере 12 г/л/день, или по меньшей мере 14 г/л/день, или по меньшей мере 16 г/л/день, или по меньшей мере 18 г/л/день, или по меньшей мере 20 г/л/день, или по меньшей мере 22 г/л/день, или по меньшей мере 24 г/л/день в период после пертурбации (например, до 1 ч, или до 2 ч, или до 3 ч, или до 5 ч после пертурбации). В конкретных вариантах осуществления в присутствии водорода в дополнение к CO скорость превращения кислоты в спирт увеличивается до 25 г/л/день, или до 26 г/л/день, или до 27 г/л/день после пертурбации. Однако скорость превращения со временем замедляется таким образом, что в некоторых вариантах осуществления в течение реакции ферментации может продолжаться накопление кислоты или кислот (например, ацетата). Повышение концентрации (или парциального давления) CO согласно способам изобретения способствует продукции кислоты и росту микроорганизмов. Однако при повышении концентрации CO (или парциального давления) выше достаточной пороговой концентрации продукция кислоты и/или микробный рост в значительной степени ингибируются. В этой связи согласно способам изобретения можно регулировать рост микроорганизмов и/или продукцию кислоты путем добавления CO. Таким образом, изобретение описывает средство контроля производства путем микробной ферментации CO продуктов, включающих спирты и/или кислоты, при котором при накоплении избытка кислоты в ферментационном бульоне можно повышать концентрациюCO выше пороговой концентрации, чтобы преобразовать по меньшей мере часть кислоты в спирт. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу производства спиртов путем анаэробной бактериальной ферментации кислоты. В одном варианте осуществления способ включает, по меньшей мере, стадию анаэробной ферментации кислоты в присутствии содержащего CO субстрата,предпочтительно содержащего CO газообразного субстрата, в котором концентрация CO выше достаточной пороговой концентрации. В одном варианте осуществления изобретения этанол получают путем микробной ферментации уксусной кислоты/ацетата, при этом концентрация CO в ферментационной среде превышает достаточную пороговую концентрацию. В одном варианте осуществления присутствует субстрат, содержащий CO,таким образом, что концентрация CO в ферментационной среде превышает пороговую концентрацию по меньшей мере примерно на 2,5 ммоль/л. В других вариантах осуществления концентрация CO превышает порог по меньшей мере примерно на 2,75 ммоль/л, по меньшей мере примерно на 3 ммоль/л или по меньшей мере примерно на 3,5 ммоль/л. В одном варианте осуществления изобретения содержащий CO субстрат является газообразным, и газообразный субстрат представлен таким образом, что парциальное давление CO составляет по меньшей мере приблизительно 37 фунтов/кв.дюйм. В одном варианте осуществления парциальное давлениеCO составляет по меньшей мере приблизительно 47 фунтов/кв.дюйм. В другом варианте осуществления рассмотрен способ производства спиртов и/или кислот, при этом указанный способ включает анаэробную ферментацию первого субстрата в биореакторе для производства одного или нескольких продуктов, включающих спирты и/или кислоты; в котором второй содержащий CO субстрат можно добавлять в желаемый момент времени таким образом, что увеличивается продукция этанола относительно ацетата. Второй содержащий CO субстрат представлен таким образом, что концентрация CO превышает достаточную пороговую концентрацию. В таких условиях увеличивается продукция спирта при поглощении кислот, и CO может оставаться, по существу, не прореагировавшим. В одном варианте осуществления изобретения первый субстрат содержит CO; однако способ не ограничен таким вариантом осуществления. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения первый субстрат может включать пируват или один или несколько углеводов. Один или несколько углеводов могут представлять собой, например, но без ограничения, целлюлозу, гидролизат целлюлозы,крахмал, гидролизат крахмала, глюкозу, фруктозу, ксилозу, арабинозу или лактозу. В одном варианте осуществления углеводом является фруктоза или ксилоза. Альтернативно, первый субстрат может содержать CO2 и/или Н 2 или любые другие компоненты,подходящие для производства кислот и/или спиртов путем ферментации. В дополнительном варианте осуществления изобретения рассмотрен способ производства спиртов и/или кислот, при этом способ включает, по меньшей мере, следующие стадии:(a) введение содержащего CO субстрата в первой концентрации в биореактор, в котором находится культура одного или нескольких микроорганизмов; и(b) анаэробная ферментация культуры для производства одного или нескольких продуктов, включающих спирты и/или кислоты, из указанного субстрата,при этом концентрацию субстрата, поступающего в биореактор, необязательно можно увеличивать в желаемый момент времени таким образом, что увеличивается продукция спиртов относительно кислот. В одном варианте осуществления субстрат представлен на стадии (а) таким образом, что концентрация CO в ферментационной среде находится ниже достаточной пороговой концентрации. В момент повышения концентрации CO можно обеспечивать наличие субстрата, при этом концентрация CO превышает достаточную пороговую концентрацию. В дополнительном варианте осуществления изобретения способ включает, по меньшей мере, следующие стадии:(a) введение содержащего CO газообразного субстрата при первом значении парциального давления CO в биореактор, в котором находится культура одного или нескольких микроорганизмов; и(b) анаэробная ферментация культуры для производства одного или нескольких продуктов, включающих этанол и/или уксусную кислоту, из указанного субстрата,где парциальное давление CO необязательно можно повышать в желаемый момент времени таким образом, что увеличивается продукция этанола относительно ацетата. В конкретных вариантах осуществления продукцию спирта и кислоты и/или рост микроорганизмов подвергают контролю на протяжении процесса ферментации. В таких условиях ферментацию можно легко менять от продукции, по существу, кислоты до продукции, по существу, спирта, если это необходимо или желательно. В разных вариантах осуществления стадии (с) и (d) в процессе ферментации можно повторять, чтобы поддерживать оптимальные условия для производства спирта. Для превращения кислоты или кислот в спирт или спирты согласно способам изобретения можно использовать промышленные отработанные газы, содержащие CO, например отработанный газ сталелитейного производства. Дополнительно, также можно использовать не содержащие CO газы, которые содержат H2, чтобы превращать кислоту или кислоты в спирт или спирты согласно способам изобретения. Изобретение также обеспечивает средство, позволяющее чередовать фазу продукции и фазу конверсии путем изменения концентрации CO, для переключения от фазы продукции к фазе конверсии и наоборот. Например, как показано в примерах, увеличение концентрации CO выше пороговой концентрации приводит к потреблению значительной части уксусной кислоты, доступной в ферментационном бульоне, при сопутствующем увеличении продукции этанола. Снижение концентрации CO ниже пороговой концентрации может способствовать росту микроорганизмов и продукции кислоты, что наблюдается в фазе продукции. Например, конкретная реакция ферментации может работать при желаемом парциальном давлении CO и продуцировать продукты, включающие кислоту или кислоты. В подходящий момент времени или при конкретной концентрации кислоты (такой как до 20 г/л, или до 30 г/л, или до 40 г/л, или до 50 г/л) можно проводить пертурбацию микробной культуры таким образом, что кислота или кислоты превращается в спирт. Согласно способам изобретения можно повышать парциальное давление CO по меньшей мере на 15 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 20 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 25 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 30 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 35 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 40 фунтов/кв.дюйм таким образом, что кислота или кислоты превращаются в спирт или спирты. После конверсии можно снижать парциальное давление по меньшей мере на 15 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 20 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 25 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 30 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 35 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере на 40 фунтов/кв.дюйм таким образом, что возобновляется продукция ацетата. Указанный процесс можно повторять, чтобы предотвратить накопление ацетата и повысить концентрацию спирта. В альтернативных вариантах осуществления микробная культура может превращать кислоту или кислоты в спирт или спирты в течение до 1 ч, или до 2 ч, или до 3 ч, или до 5 ч после пертурбации. Впоследствии, при адаптации культуры к повышенному парциальному давлению CO и/или потреблению CO,таким образом, что концентрация CO уменьшается, происходит обратное переключение культуры на продукцию кислоты. Установлено, что после нескольких циклов увеличивается содержание спирта, тогда как концентрация кислоты остается низкой, например меньше 20 г/л, или меньше 30 г/л, или меньше 40 г/л, или меньше 50 г/л. Система из двух (или нескольких) биореакторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно проводить реакции ферментации в две или несколько стадий в системе, которая может содержать ростовой (или производственный) реактор, в котором культивируют микроорганизмы и необязательно производятся кислоты, и конверсионный реактор, в который подается бульон из ростового реактора, и пертурбацию выполняют таким образом, что полученные или добавляемые кислоты превращаются в спирты. Как отмечено выше, можно использовать ферментационный биореактор высокого давления. Фиг. 5 показывает ферментационную систему 100, содержащую ростовой биореактор 1, в котором можно адаптировать условия ферментации, чтобы способствовать накоплению микробной биомассы или росту микроорганизмов и/или выработке кислоты. Например, можно адаптировать условия, такие как компоненты жидкой питательной среды, скорость подачи питательных веществ, рабочее давление, рабочий pH, содержание и концентрацию субстрата, скорость подачи субстрата, скорость перемешивания в биореакторе (если его применяют) и плотность клеток, чтобы способствовать росту микроорганизмов и/или выработке кислоты. Примеры условий, обеспечивающих устойчивое состояние микробной биомассы и выработку кислоты, представлены в разделе "Примеры". Субстрат, подаваемый в ростовой биореактор 1, можно выбрать из описанных ранее субстратов,однако в конкретных вариантах осуществления субстратом является углевод или CO, или субстрат представляет собой комбинацию углевода и CO. Жидкую питательную среду можно, по существу, оставлять в ростовом биореакторе 1 в течение такого времени, пока микробная биомасса и/или кислоты не достигли желаемого уровня содержания и/или желаемой скорости производства. Микробную биомассу и/или производство кислоты в ростовом биореакторе можно регулярно или непрерывно контролировать средствами, известными в данной области техники. Кроме того, условия в ростовом биореакторе можно адаптировать для поддержания, по существу,оптимальных условий для роста и/или производства кислоты. Специалист в данной области техники сможет оценить, что при некоторых условиях в ростовом биореакторе также можно производить спирт. Однако в конкретных вариантах осуществления основным продуктом в ростовом биореакторе будет кислота или кислоты. В момент достижения желаемого уровня содержания или скорости биомассы и/или кислоты, по меньшей мере часть кислоты и необязательно по меньшей мере часть микробной биомассы можно перемещать с использованием подходящих трубок из ростового реактора 1 в конверсионный реактор 2, непрерывно или в желаемые моменты времени. Например, при желаемой концентрации кислоты в ростовом биореакторе 1, например по меньшей мере 5 г/л, или по меньшей мере 10 г/л, или по меньшей мере 20 г/л, или по меньшей мере 30 г/л, или по меньшей мере 40 г/л, или по меньшей мере 50 г/л, или по меньшей мере 60 г/л, или по меньшей мере 70 г/л, или по меньшей мере 80 г/л, или по меньшей мере 90 г/л, или по меньшей мере 100 г/л часть жидкой питательной среды, содержащей указанные кислоты и необязательно микробную биомассу, можно переносить в конверсионный биореактор 2, в котором микробную культуру можно подвергать пертурбации таким образом, что кислоты превращаются в спирты. Жидкая питательная среда, выходящая из ростового биореактора 1, будет обычно заменяться новой жидкой питательной средой, чтобы обеспечить подходящие условия для устойчивого состояния биомассы и/или производства кислоты. Концентрацию кислоты в ростовом биореакторе 1 необходимо поддерживать ниже уровня, при котором возникает ингибирование конкретного микроорганизма. В конкретных вариантах осуществления изобретения содержащий CO субстрат поступает в конверсионный биореактор 2 таким образом, что концентрация CO в жидкой питательной среде составляет по меньшей мере приблизительно 2,5 ммоль/л, или по меньшей мере приблизительно 2,75 ммоль/л, или по меньшей мере приблизительно 3 ммоль/л, или по меньшей мере приблизительно 3,5 ммоль/л. В конкрет- 19019266 ных вариантах осуществления содержащий CO субстрат является газообразным и может быть представлен таким образом, что парциальное давление CO составляет по меньшей мере приблизительно 27 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере приблизительно 37 фунтов/кв.дюйм, или по меньшей мере приблизительно 47 фунтов/кв.дюйм. Потребление кислоты и/или производство спирта в конверсионном биореакторе 2 можно контролировать регулярно или непрерывно известными в данной области техники средствами. В момент достижения желаемой концентрации спирта в жидкой питательной среде, такой как по меньшей мере 5 г/л,или по меньшей мере 10 г/л, или по меньшей мере 20 г/л, или по меньшей мере 30 г/л, или по меньшей мере 40 г/л, или по меньшей мере 50 г/л, или по меньшей мере 60 г/л, или по меньшей мере 70 г/л, или по меньшей мере 80 г/л, или по меньшей мере 90 г/л, или по меньшей мере 100 г/л, часть жидкой питательной среды, содержащей указанные спирты, можно перемещать в устройство 3 регенерации продукта. Необходимо поддерживать концентрацию спирта в конверсионном биореакторе ниже уровня, при котором происходит ингибирование микробной культуры, используемой для производства спирта. В одном варианте осуществления изобретения микроорганизм, культивируемый и растущий в ростовом биореакторе 1, является карбоксидотрофическим микроорганизмом, таким как описано выше, и условия оптимизируют для роста микроорганизмов и/или производства кислоты. Второй микроорганизм(также карбоксидотрофический микроорганизм) может поступать в конверсионный биореактор 2, и условия оптимизируют для производства спирта. Микробная культура, поступающая в ростовой и конверсионный биореакторы, может быть одинаковой или разной. Однако в конкретном варианте осуществления поступающий в оба биореактора микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum. В некоторых вариантах осуществления изобретения ростовой биореактор 1 включает систему клеточной рециркуляции, в которой по меньшей мере часть микробной биомассы можно удалять из жидкой питательной среды, выходящей из ростового биореактора, и возвращать в ростовой биореактор 1. Это способствует накоплению биомассы в ростовом реакторе 1. Альтернативно, микробную биомассу не удаляют из жидкой питательной среды, выходящей из ростового реактора, но переносят непосредственно в конверсионный биореактор 2. В конкретных вариантах осуществления рост микробной культуры и выработка в ней кислот происходит в ростовом реакторе 1. По меньшей мере часть этой же микробной культуры непрерывно или периодически переносят в конверсионный биореактор 2, вместе с кислотами в жидкой питательной среде, при этом условия в конверсионном биореакторе 2 (например, высокая концентрация CO) способствуют продукции спирта указанной микробной культурой. Можно регулировать время нахождения жидкой питательной среды в ростовом биореакторе 1, чтобы оптимизировать накопление биомассы и/или производство кислоты. Например, накопление биомассы может быть желательным при запуске, и можно уменьшать скорость потока жидкой питательной среды,входящей и выходящей из ростового биореактора 1, чтобы увеличить время нахождения среды в ростовом биореакторе 1 и, таким образом, дать возможность достигнуть желаемого содержания или скорости биомассы и/или кислоты. Когда продукция биомассы и/или кислоты приближается или достигает желаемого уровня или скорости, можно уменьшать время нахождения жидкости путем увеличения скорости потока жидкой питательной среды из ростового биореактора 1 в конверсионный биореактор 2. В некоторых вариантах осуществления контролируют уровни микробной биомассы и/или кислоты, и можно адаптировать время нахождения, чтобы достигнуть, по существу, устойчивого состояния концентрации кислоты. Кроме того,также можно регулировать условия для достижения в ростовом биореакторе 1 желаемого состояния устойчивой концентрации кислоты по меньшей мере 5 г/л, или по меньшей мере 10 г/л, или по меньшей мере 20 г/л, или по меньшей мере 30 г/л, или по меньшей мере 40 г/л, или по меньшей мере 50 г/л, или по меньшей мере 60 г/л, или по меньшей мере 70 г/л, или по меньшей мере 80 г/л, или по меньшей мере 90 г/л, или по меньшей мере 100 г/л. Для эффективного производства спирта можно также регулировать время нахождения жидкой питательной среды в конверсионном биореакторе 2. Например, жидкую питательную среду можно подавать непрерывно с постоянной скоростью, и можно подбирать объем жидкой питательной среды в конверсионном биореакторе 2, чтобы обеспечить время нахождения, подходящее для достижения желаемого превращения спирта. В конкретных вариантах осуществления изобретения скорость выработки спирта в фазе конверсии спирта при повышенной концентрации CO превышает скорость роста и/или продукции кислоты. В этой связи конверсионный биореактор 2 может быть, по существу, меньше, чем ростовой биореактор 1, что приведет к значительному уменьшению времени нахождения жидкости в конверсионном биореакторе 2. После рассмотрения настоящего раскрытия специалистам в данной области техники будут понятны подходящие или желаемые конфигурации для каждого биореактора, однако в конкретном варианте осуществления порции жидкой питательной среды, содержащей микробную культуру, кислоту и необязательно спирт, поступают во второй резервуар, сконструированный в виде поршневого проточного биореактора. Парциальное давление CO может быть повышено в поршневом проточном резервуаре, с тем,чтобы порция жидкой питательной среды, проходящая через кислоту или кислоты, превращалась в спирт или спирты. Специалистам в данной области техники будут очевидны средства поддержания потока через биореактор, например статические миксеры. Кроме того, биореактор может включать дополнительные средства доставки субстрата, чтобы поддерживать необходимую и/или желаемую концентрацию CO в биореакторе. В другом варианте осуществления производственный биореактор содержит по меньшей мере одну микробную культуру, и конверсионный биореактор содержит по меньшей мере одну микробную культуру. Поскольку ферментационный бульон, содержащий кислоту или кислоты и/или спирт или спирты,может проходить из производственного биореактора в конверсионный реактор и из конверсионного биореактора до регенерации продукта, соответствующие микробные культуры, по существу, задерживаются в каждом биореакторе с использованием системы клеточной рециркуляции. В таких вариантах осуществления микробные культуры могут быть разными, если культура в производственном биореакторе продуцирует кислоту или кислоты, и культура в конверсионном биореакторе превращает кислоту или кислоты в спирт или спирты. В конкретных вариантах осуществления микробная культура в конверсионном биореакторе превращает кислоту или кислоты в спирт или спирты при повышенном парциальном давлении CO. В некоторых вариантах осуществления полученную в других ферментационных и/или производственных процессах кислоту или кислоты можно добавлять в конверсионный биореактор, если желательно превращение в спирт или спирты. В другом варианте осуществления изобретения рассматривается ферментационная система, которая содержит множественные ростовые биореакторы, скомпонованные для подачи в единственный конверсионный биореактор жидкой питательной среды, содержащей кислоты и необязательно микробную биомассу. Например, согласно фиг. 6 ферментационная система 101 содержит первый и второй ростовые биореакторы 1 а и 1b, и конфигурация каждого из них предусматривает выработку кислоты или кислот. Жидкая питательная среда, содержащая кислоты и необязательно биомассу из ростовых биореакторов 1 а и 1b, может подаваться в конверсионный биореактор 2 для производства спирта. Альтернативно, конфигурация первого ростового биореактора 1 а может предусматривать быстрое накопление биомассы (например, при большом времени нахождения жидкости), тогда как второй ростовой биореактор 1b скомпонован для оптимального производства кислоты (например, малое время нахождения жидкости). Показатели времени нахождения жидкости каждого из ростовых биореакторов 1 а и 1b соответственно можно адаптировать для поддержания оптимальных условий производства спирта во всей системе. В вариантах осуществления, включающих множество ростовых биореакторов, можно полностью закрывать один или несколько ростовых биореакторов в течение какого-либо периода (например, для обслуживания), не оказывая, по существу, неблагоприятного влияния на производство спирта. Примеры Приготовление среды Среду с pH 5,5 готовили следующим образом. Все компоненты за исключением цистеина-HCl смешивали в 400 мл дистиллированной воды. Указанный раствор делали анаэробным путем нагревания до кипения и оставляли для охлаждения до комнатной температуры в постоянном потоке газа 95% CO, 5%CO2. После охлаждения добавляли цистеин-HCl и доводили pH до 5,5 перед доведением его объема до 1000 мл; анаэробность поддерживали в течение экспериментов. Бактерии. Бактерии Clostridium autoethanogenum получали из немецкого Центра коллекции биологических материалов (DSMZ). Номер доступа указанных бактерий DSMZ 10061. Альтернативно, использовали бактерии Clostridium autoethanogenum, депонированные в немецком Центре коллекции биологических материалов (DSMZ) с присвоенным номером доступа 19630. Непрерывная ферментация в резервуарном реакторе с непрерывным перемешиванием (CSTR)(обычные условия установки). В пятилитровый биореактор помещали 4,9 л среды LM23 или LM33, приготовленной, как описано выше. Газ переключали на 95% CO, 5% CO2 при атмосферном давлении перед инокуляцией 100 мл культуры Clostridium autoethanogenum. В начале культивирования биореактор выдерживали при 37C при перемешивании 200 об/мин. Во время фазы роста перемешивание ускоряли до 400 об/мин. pH доводили до 5,5 и поддерживали автоматическим добавлением 5 М NaOH. В биореактор непрерывно добавляли свежую анаэробную среду, чтобы поддерживать заданные уровни биомассы и ацетата в биореакторе. Периодическая ферментация под давлением в сывороточном флаконе. Стерильные сывороточные флаконы трижды продували газом, содержащим CO (см. примеры композиций), и затем помещали при пониженном давлении -5 фунтов/кв.дюйм. (-3,45104 Па). 50 мл активной культуры, содержащей биомассу, ацетат и следы этанола, под атмосферным давлением переносили непосредственно из непрерывного биореактора в сывороточный флакон объемом 234 мл. Затем свободное пространство 204 мл заполняли содержащим CO газом до необходимого избыточного давления. Использовали инкубатор с мешалкой и поддерживали температуру реакции 37C. Плотность клеток. Для определения плотности клеток в этих экспериментах измеряли поглощательную способность образцов при 600 нм (спектрофотометром) и определяли сухую массу путем вычисления согласно опубликованным методикам. Содержание метаболитов оценивали с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и в ряде случаев газовой хроматографии (ГХ). ВЭЖХ. Использовали ВЭЖХ серии HPLC System Arilent 1100. Мобильная фаза: 0,0025 н. серная кислота. Скорость потока и давление: 0,800 мл/мин. Колонка: Alltech 10 А;в каталоге 9648, 1506,5 мм, размер частиц 5 мкм. Температура колонки: 60C. Детектор: индекс преломления. Температура детектора: 45C. Способ приготовления образцов. 400 мкл образца и 50 мкл 0,15 М ZnSO4 и 50 мкл 0,15 М Ва(О)2 вводили в пробирки Эппендорфа. Пробирки центрифугировали в течение 10 мин при 12000 об/мин при 4C. 200 мкл супернатанта переносили в пробирку ВЭЖХ, и 5 мкл вводили в инструмент ВЭЖХ. Газовая хроматография. Газовый хроматограф HP серии 5890 II с пламенно-ионизационным детектором. Капиллярная колонка GC: EC1000-Alltech EC1000 30 м 0,25 мм 0,25 мкм. Газовый хроматограф работал в сплитрежиме с общим потоком водорода 50 мл/мин с продувочным потоком 5 мл (разделение потока 1:10),давление на входе в колонку 10 фунтов/кв.дюйм, в результате линейная скорость составляла 45 см/с. Температурный режим начинали при 60C, поддерживали в течение 1 мин, затем доводили до 215C со скоростью 30C/мин, затем выдерживали в течение 2 мин. Температура инжектора составляла 210C и температура детектора 225C. Способ приготовления образца. Образец 500 мкл центрифугировали в течение 10 мин при 12000 об/мин при 4C. 100 мкл супернатанта переносили в пробирку ГХ, содержащую 200 мкл воды и 100 мкл внутреннего стандартного раствора для введения (10 г/л пропан-1-ола, 5 г/л изомасляной кислоты, 135 мМ хлористо-водородной кислоты). 1 мкл раствора вводили в инструмент ГХ. Пример 1. Превращение органической кислоты в соответствующий спирт. Пример 1 А. Превращение масляной кислоты в бутанол в реакторе CSTR. Восьмилитровый реактор заполняли 7200 мл среды LM23 и выдерживали в автоклаве в течение 30 мин при 121C. При остывании среду орошали N2. Газ переключали на 95% CO, 5% CO2 перед инокуляцией 160 мл культуры Clostridium autoethanogenum. В начале культивирования биореактор выдерживали при 37C при перемешивании 200 об/мин. Во время фазы роста перемешивание ускоряли до 500 об/мин. Доводили pH до 5,5 и поддерживали его автоматическим добавлением 5M NaOH. В активно растущую культуру непосредственно добавляли раствор н-бутирата, который содержал 20 г масляной кислоты, забуференной до pH 5,5. Образцы ферментационного бульона отбирали через 0, 24 и 48 ч после добавления масляной кислоты (см. табл. 1). Таблица 1 Превращение 20 г н-бутирата в 1-бутанол в 8 л культуры С.autoethanogenum, продуцирующей ацетат и этанол, в биореакторе, при поддержании pH 5,5. Исходные условия: активная культура C.autoethanogenum, продуцирующая ацетат (8,3 г/л) и этанол (5,4 г/л), pH 5,5 и орошение газом, содержащим 95% CO в CO2 Пример 1 В. Превращение ацетата и бутирата в соответствующие спирты. Сывороточные флаконы были подготовлены согласно вышеупомянутой методике. После стабилизации роста микроорганизмов (связанного с выработкой ацетата и небольшого количества этанола) в сывороточный флакон добавляли следующие соединения в 50 мл активной культуры: 1 мл раствора дитионита натрия 10 г/л, 2 мл раствора н-масляной кислоты 100 г/л (pH доводили до 5,5 5 М гидроксидом натрия). Газовую фазу заменяли смесью 95% CO,5% газа CO2 при избыточном давлении 25 фунтов/кв.дюйм. После дополнения кислоты отбирали 1 мл образца для количественного определения метаболитов в разные точки времени (см. табл. 2). Таблица 2 Превращение н-бутирата в 1-бутанол с использованием культуры С.autoethanogenum, продуцирующей ацетат и этанол, в сывороточном флаконе при pH 5,5 в присутствии или в отсутствие 0,8 мМ метилвиологена (MB). Исходные условия: активная культура C.autoethanogenum, продуцирующая ацетат (4,7 г/л) и этанол (1,2 г/л), pH 5,5, свободное пространство: избыточное давление 95% CO в CO2 25 фунтов/кв.дюйм Присутствие медиатора метилвиологена значительно тормозит превращение н-бутирата в н-бутанол (табл. 2). Кроме того, масляная кислота стехиометрически превращается в бутанол (фиг. 1). Эти результаты показывают ряд значительных преимуществ по сравнению с ранее опубликованными способами для микробиологического превращения кислот в соответствующие им спирты. Например,здесь впервые показано, что для производства спиртов можно задействовать Clostridium autoethanogenum(С.auto), которые ранее считались неспособными к продукции спиртов при стандартных условиях ферментации. Бактериальные клетки не следует собирать перед добавлением кислоты для продукции желаемого спирта; превращение кислоты в спирт проводят непосредственно в культуральной среде. Это значительно сокращает обработку клеток, снижает риск повреждения клетки, которое может быть вызвано центрифугированием и ресуспендированием, и риск подмешивания кислорода. Превращение не требует использования медиатора, такого как метилвиологен. Фактически, обнаружено, что добавление метилвиологена ингибирует или, по меньшей мере, уменьшает скорость превращения кислот в спирты. Такие медиаторы часто бывают токсичными. Преимуществом устранения потребности в медиаторе является сокращение работы с токсичными веществами и снижение затрат, связанных с производством спиртов. По меньшей мере, в случае C.autoethanogenum бактериальные клетки можно сохранять при одинаковом pH и температуре во время фазы роста и фазы конверсии кислоты в спирт (37C и pH 5,5). Это упрощает процесс и уменьшает риск шока для клеток. Дополнительно, добавление кислоты во время фазы конверсии бактерии и способность клеток продолжать потреблять монооксид углерода и продуцировать ацетат и этанол (например), в то время, когда в них происходит преобразование добавленных кислот в соответствующие спирты, обеспечивает способ,в котором можно одновременно производить ряд ценных продуктов. Пример 1C. Превращение разных кислот в соответствующие спирты. Сывороточные флаконы подготавливали согласно описанному выше. При этом в пустой флакон добавляли 5 мл водного раствора кислоты и доводили pH до 5,5 с использованием NaOH. Перед инокуляцией добавляли дитионат натрия (0,5 мл водного раствора 10 г/л) или цистеин (1 мл водного раствора 6,25 г/л). В каждом сывороточном флаконе создавали избыточное давление 30 фунтов/кв.дюйм газа 95%CO и инкубировали при 37C при постоянном встряхивании. Образцы ферментационного бульона отбирали через 72 ч (см. табл. 3). Таблица 3 Превращение разных кислот в соответствующие спирты с использованием Как отмечено выше, можно использовать Clostridium autoethanogenum для превращения ряда кислот в соответствующие им спирты в присутствии восстанавливающего агента. Это также является особенно важным, поскольку известно, что указанные выше кислоты и спирты не являются природно продуцируемыми метаболитами С.auto. Пример 2. Влияние концентрации восстанавливающего агента на продукцию спирта. Пример 2A. Влияние концентрации дитионита натрия на продукцию спирта Сывороточные флаконы подготавливали согласно описанному выше. При этом перед инокуляцией добавляли дитионат натрия (10 г/л водного раствора). В каждом сывороточном флаконе создавали избыточное давление 30 фунтов/кв.дюйм газа 70% CO, 15% CO2, 14% N2, 1% Н 2 и инкубировали при 37C при постоянном встряхивании. Образцы ферментационного бульона отбирали через 48 ч (см. табл. 4). Таблица 4 Превращение ацетата в этанол при разных концентрациях дитионита натрия с использованием Clostridium autoethanogenum Результаты показывают, что превращение кислоты в спирт происходит при широком диапазоне концентраций восстанавливающего агента, при этом его оптимальная концентрация составляет приблизительно 2 г/л. Пример 2B. Влияние концентрации сульфида натрия на продукцию спирта. Стерильные сывороточные флаконы объемом 234 мл продували 100% газообразным N2, затем добавляли 50 мл среды (LM33) согласно приведенной выше методике, затем выдерживали в автоклаве при 121C в течение 20 мин. Среду восстанавливали раствором Cr(II) (приблизительно 0,4 мМ) и добавляли водный раствор сульфида натрия. В сывороточные флаконы инокулировали 2,5 мл активно растущей культуры Clostridium autoethanogenum из биореактора непрерывного действия. Свободное пространство объемом 184 мл продували три раза газом 70% CO, 1% Н 2, 15% CO2 и 14% N2 и создавали пониженное давление -14 фунтов/кв.дюйм, чтобы удалить фоновый N2, затем заполняли газом 70% CO, 1% Н 2, 15%CO2 и 14% N2 до давления 30 фунтов/кв.дюйм. Поддерживали температуру реакции 37C. Образцы отбирали с интервалами, после забора образцов продували свободное пространство и восстанавливали давление до 30 фунтов/кв.дюйм (см. табл. 5). Таблица 5 Превращение ацетата в этанол при разных концентрациях сульфида натрия с использованием Clostridium autoethanogenum. Примечание: эксперименты с сывороточными флаконами с разными концентрациями сульфида натрия проводили дважды, представлены средние значения Результаты указывают, что, несмотря на наличие короткой фазы задержки, связанной с незначительным увеличением концентрации ацетата, в каждом из флаконов, содержащих сульфид натрия, ацетат превращается в спирт в течение времени эксперимента. Пример 3. Влияние парциального давления CO. Пример 3 А. Влияние парциального давления CO на продукцию спирта. Сывороточные флаконы подготавливали согласно описанному выше. В каждом сывороточном флаконе создавали избыточное давление от 30 до 40 или 50 фунтов/кв.дюйм с использованием 95% CO в газовой смеси CO2 и инкубировали при 37C при постоянном встряхивании. Образцы ферментационного бульона отбирали через 18 ч (см. табл. 4). Таблица 6 Влияние разных показателей избыточного давления в свободном пространстве на метаболизм газообразного субстрата,содержащего 95% CO в CO2 при культивировании С.autoethanogenum в сывороточном флаконе при pH 5,5 через 18 ч ферментации. Исходные условия: непрерывная культура С.autoethanogenum,содержащая 3,3 г/л ацетата и 0,0 г/л этанола при pH 5,5 В сосудах биореактора при давлении от 30 до 40 фунтов/кв.дюйм получали приблизительно 2 г/л ацетата и 0,6 г/л этанола, и падение давление в свободном пространстве составляло приблизительно 17 фунтов/кв.дюйм. Это указывает, что для продукции ацетата использовано значительное количествоCO. К удивлению, при давлении 50 фунтов/кв.дюйм потреблялось приблизительно 3 г/л ацетата и получено 2,6 г/л этанола. Результаты указывают, что существует оптимальное пороговое парциальное давле- 25019266 ние CO, при котором превращение ацетата в спирт происходит в течение продолжительного периода. Поскольку концентрация CO пропорциональна парциальному давлению CO, результаты указывают, что существует пороговая достаточная концентрация CO, при которой С.auto превращает кислоты в спирты. Однако нужно отметить, что системы с более низким давлением также могут превращать кислоты в спирт, но по мере убывания CO превалирует продукция ацетата. Дополнительно, в условиях значительного истощения CO (или Н 2) культура может повторно потреблять спирт для продуцирования ацетата(см. пример 4). Пример 3B. Влияние парциального давления CO на продукцию спирта. На основе показанных результатов проводили сходную ферментацию с использованием аналогичного газообразного субстрата со средой, дополненной разными источниками углерода. Сывороточные флаконы подготавливали согласно описанному выше. В каждом сывороточном флаконе создавали избыточное давление от 40 или 50 фунтов/кв.дюйм абс. с использованием 95% CO в газовой смеси CO2 и инкубировали при 37C при постоянном встряхивании. Контрольный биореакторный сосуд (А) оставляли без добавления, тогда как в другие сосуды добавляли некоторое количество фруктозы (В), ксилозы (С) или пирувата (D). Эти сосуды инкубировали при 37C при постоянном встряхивании. Показатели концентрации метаболитов и биомассы, а также избыточное давление в свободном пространстве и pH измеряли в начале ферментации и через 40 ч. Результаты при 40 фунтах на кв.дюйм абс. показаны в табл. 7,результаты при 50 фунтах на кв.дюйм абс. - в табл. 8. Таблица 7 Метаболизм при избыточном давлении 40 фунтов/кв.дюйм абс. газообразного субстрата, содержащего 95% CO в CO2, при культивировании C.autoethanogenum в сывороточном флаконе при pH 5,5 через 40 ч ферментации. Исходные условия: непрерывная культура C.autoethanogenum с уровнем разведения = 0,04 ч-1, непрерывный поток газообразного субстрата, содержащего 95% CO в CO2 (отсутствие избыточного давления), продуцирование ацетата и этанола при pH 5,5. Данные концентрации ацетата, этанола, фруктозы,ксилоза, пирувата приведены в г/л. Биомассу рассчитывали как 1 г сухой массы клеток на 1 л. Избыточное давление газа в свободном пространстве приведено в фунтах/кв.дюйм Во всех сосудах биореактора при 40 фунтах/кв.дюйм абс. во всех тестированных в изобретении условиях было получено приблизительно 3,5 г/л ацетата и незначительное количество этанола. Понижение давления в свободном пространстве составляло приблизительно 17 фунтов/кв.дюйм. Это указывает, что значительная часть CO потреблялась для продукции ацетата. pH уменьшался приблизительно на 0,9 до 4,6 единиц. Во всех случаях наблюдался минимальный рост микроорганизмов. Таблица 8 Метаболизм при избыточном давлении 50 фунтов/кв.дюйм абс. газообразного субстрата, содержащего 95% CO в CO2, при культивировании C.autoethanogenum в сывороточном флаконе при pH 5,5 через 40 ч ферментации. Исходные условия: непрерывная культура C.autoethanogenum с уровнем разведения = 0,04 ч-1, непрерывный поток газообразного субстрата, содержащего 95% CO в CO2 (отсутствие избыточного давления), продукция ацетата и этанола при pH 5,5. Данные концентрации ацетата, этанола, фруктозы, ксилоза, пирувата приведены в г/л. Биомассу рассчитывали как 1 г сухой массы клеток на 1 л. Избыточное давление газа в свободном пространстве приведено в фунтах/кв.дюйм Во всех сосудах биореактора при 50 фунтах/кв.дюйм абс. во всех тестированных выше условиях было получено более 3 г/л этанола. Существует выраженная корреляция между поглощением ацетата и продукцией этанола. Потребление ацетата/продукция этанола происходит таким способом, что на каждый моль поглощенного ацетата был произведен примерно 1 моль этанола (табл. 9). Однако добавочный углевод (или пируват) поглощался в значительной степени и уменьшался уровень биомассы, что оценивали по оптической плотности. В каждом случае падение давления в свободном пространстве было ниже 10 фунтов/кв.дюйм. Во всех случаях pH увеличивался примерно от 0,9 до 6,4. Таблица 9 Молярные соотношения для периодической ферментации при избыточном давлении 35 фунтов/кв.дюйм на основе результатов,показанных в табл. 2 и 3 Данное количество поглощенного ацетата/исходного ацетата (строка 1), т.е. по меньшей мере 50% и в некоторых случаях более чем 75% ацетата, присутствующего в ферментационном бульоне, потребляется при повышенном давлении. Данное количество произведенного этанола/исходного ацетата (строка 2),т.е. по меньшей мере 60% и в некоторых случаях по меньшей мере 80%, потребляемой кислоты замещается спиртом. По данным произведенного этанола/поглощенного ацетата (строка 3), существует выраженная корреляция между количеством потребляемого в процессе ферментации ацетата и произведенным спиртом. Теоретический уровень CO, растворенного в среде при избыточном давлении в свободном пространстве 40 и 50 фунтов/кв.дюйм абс., рассчитан в табл. 10 на основе закона Генри. Таблица 10 Вычисление концентрации растворенного CO в среде при разных показателях избыточного давления в свободном пространстве газообразного субстрата,содержащего 95% CO в CO2. Константа Генри для CO в воде при температуре 298 К составляет 1052,6 латммол-1 Представленные выше результаты показывают, что существует значение парциального давленияCO, выше которого происходит значительное изменение метаболизма C.autoethanogenum от продукции ацетата и биомассы из субстрата CO до превращения по меньшей мере части ацетата в этанол. Таким образом, при парциальном давлении CO ниже 37 фунтов/кв.дюйм ацетат и биомасса являются основными продуктами метаболизма газа CO, pH становится кислым, и ингибируется дальнейший рост. Если парциальное давление CO выше 37 фунтов/кв.дюйм, выявлено ингибирование роста биомассы и продукции ацетата, и происходит потребление ацетата. Кроме того, производство этанола происходит с незначительным потреблением CO. В то же время растет pH до достижения 6,5, при этом обнаружено значительное ингибирование бактерий и останавливается превращение ацетата в этанол. Не обнаружено какого-либо значимого влияния фруктозы, ксилозы или пирувата при тестированной концентрации. Пример 3C. Влияние парциального давления CO на продукцию спирта. Сывороточные флаконы подготавливали согласно описанному выше. Избыточное давление указанного газа в каждом сывороточном флаконе составляло 25 фунтов/кв.дюйм (40 фунтов/кв.дюйм), инкубацию проводили при 37C при постоянном встряхивании. Образцы ферментационного бульона отбирали с интервалами 1, 3 и 5 ч (см. табл. 11). Таблица 11 Превращение ацетата в спирт при разных показателях парциального давления CO с использованием Clostridium autoethanogenum через 5 ч Результаты указывают, что достаточным пороговым парциальным давлением CO, в котором кислоты превращаются в спирты, является давление менее 20 фунтов/кв.дюйм абс. В коротких временных рамках реакции (см. примеры 3 А-3 С) ацетат превращается в спирт, по существу, стехиометрически при всех тестированных показателях парциального давления CO. Соответственно, парциальное давление CO выше 20 фунтов/кв.дюйм абс. является достаточным,чтобы С.auto превращали кислоты в спирты. Пример 4. Влияние газовой композиции. Пример 4A. Влияние чистого газа на превращение ацетата в этанол. Сывороточные флаконы подготавливали согласно описанному выше. Избыточное давление указанного газа в каждом сывороточном флаконе составляло 25 фунтов/кв.дюйм (40 фунтов/кв.дюйм), инкубацию проводили при 37C при постоянном встряхивании. Образцы ферментационного бульона отбирали с интервалами 1, 3 и 5 ч (см. табл. 12). Таблица 12 Превращение ацетата в этанол с использованием Clostridium autoethanogenum с использованием альтернативных газовых композиций Результаты ясно указывают на необходимость газа-восстановителя, такого как CO или H2, чтобы С.auto превращали кислоты в спирты. Предполагается, что вместо CO можно использовать водород, поскольку метаболический путь от кислот до спиртов включает ферменты гидрогеназы. Дополнительно предполагается, что H2 является подходящим источником энергии для превращения кислот в спирты,однако для биосинтеза и/или производства ацетата необходим источник углерода, а также источник энергии, и Н 2 не будет полноценным источником. Пример 4B. Влияние газовой композиции на продукцию этанола. Сывороточные флаконы подготавливали согласно описанному выше. При этом перед инокуляцией во флаконы вводили раствор масляной кислоты, забуференный до pH 5,5 водным NaOH. Начальные концентрации в точке времени t=0 составляли 6,7 г/л ацетата и 0,8 г/л бутирата (в отсутствие этанола или бутанола). Образцы ферментационного бульона отбирали через 24 ч (см. табл. 13). Таблица 13 Превращение кислот в спирты при разных значениях парциального давления CO с использованием Clostridium autoethanogenum в присутствии и в отсутствие водорода Кислоты, такие как масляные и уксусные, можно превращать в спирты, включающие этанол и бутанол, в присутствии субстратов со смесью CO/Н 2. Очевидно, что в отсутствие Н 2 увеличенное парциальное давление CO улучшает общее превращение. Таким образом, присутствие Н 2, в частности, при высоком парциальном давлении также улучшает общее превращение.